FACULTEIT WETENSCHAPPEN VOORGELEGD TOT HET...

FACULTEIT WETENSCHAPPEN

SCRIPTIE VOORGELEGD TOT HET BEHALEN VAN DE GRAAD VAN LICENTIAAT IN DE BIOTECHNOLOGIE

Academiejaar 2004‐2005

Biodiversiteit van aërobe sporenvormers uit rauwe melk afkomstig van biologische en conventionele melkveebedrijven

An Coorevits

Promotor: Prof. Dr. Paul De Vos Co‐promotor: Dr. Marc Heyndrickx

Begeleiders: ‐ Drs. Joachim Vandroemme ‐ Drs. Valerie De Jonghe

Vakgroep Fysiologie, Biochemie en Microbiologie Laboratorium voor Microbiologie

Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek, Departement voor de Kwaliteit van Dierlijke Producten.

Dankwoord Eén jaar, twee labo’s. Dat betekent dubbel zoveel mensen die hun steen(tje) hebben bijgedragen om deze thesis tot een goed einde te brengen, dubbel zoveel mensen die ik wil bedanken. Mijn oprechte dank gaat uit naar mijn promotor, Prof. Dr. P. De Vos om mij de mogelijkheid te bieden deze thesis aan het Laboratorium voor Microbiologie te maken. Ook Dr. M. Heyndrickx dank ik van harte om mede het promotorschap op zich te nemen en mij de mogelijkheid te bieden het eerste deel van m’n praktisch werk uit te voeren aan het Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek, Departement voor de Kwaliteit van Dierlijke Producten. Dr. J. Heyrman en Valérie De Jonghe wil ik bedanken voor de uitstekende begeleiding gedurende het volledige jaar. Joa, ik apprecieer enorm wat je allemaal voor m’n thesis gedaan hebt. Elke versie van m’n thesis in de maak heb je met evenveel grondigheid en enthousiasme ;o) gelezen en verbeterd, waarvoor mijn oprechte dank. Liesbeth, Caroline, Kim, Bram, Petra, Jessy en alle andere mensen van beide labo’s: bedankt voor de toffe sfeer en de tips. Tenslotte wil ik familie en vrienden bedanken, in de eerste plaats m’n ouders. Zij hebben dit immers mogelijk gemaakt voor mij.

Inhoud I. Inleiding 1

II. Literatuurstudie 3

II.1. Melk en melkkwaliteit 3

II.1.1. Belang van melk in de voedingsindustrie 3

II.1.2. Kwaliteit van de rauwe melk 4

II.1.3. Melk en microbiologie 6

II.1.4. Methodes om de melk te vrijwaren van bacteriën 8

II.2. Het genus Bacillus (sensu lato) 10

II.2.1. Inleiding tot polyfasische taxonomie 10

II.2.1.1. Genotypische methodes 10

II.2.1.1.1. Bepalen van de basensamenstelling van het DNA 11

II.2.1.1.2. DNA‐DNA‐hybridisatiestudies 11

II.2.1.1.3. 16S rRNA‐sequentiesimilariteit 11

II.2.1.1.4. DNA‐fingerprinttechnieken 12

II.2.1.2. Fenotypische methodes 12

II.2.2. Taxonomische geschiedenis van het genus Bacillus 13

II.2.3. Bespreking van het genus Bacillus en enkele verwante genera 17

II.2.3.1. Kenmerken van het genus Bacillus (sensu stricto) 17

II.2.3.2. Kenmerken van het genus Paenibacillus 17

II.2.3.3. Kenmerken van het genus Brevibacillus 18

II.2.3.4. Kenmerken van het genus Virgibacillus 19

II.2.3.5. Kenmerken van het genus Ureibacillus 19

II.2.3.6. Kenmerken van het genus Geobacillus 20

II.2.4. De endospore 21

II.2.4.1. Bouw 22

II.2.4.2. Ontkieming 22

II.2.4.3. Antibiotica 22

II.2.5. Sporenvormers in de zuivelindustrie 23

II.2.5.1. Bederf van de melk 24

II.2.5.2. Verstoring van verdere verwerkingsprocessen 24

II.2.5.3. Productie van toxines 25

II.3. Het species Bacillus cereus 26

II.3.1. Taxonomie van de ‘Bacillus cereus groep’ 26

II.3.2. Bacillus cereus in de zuivelindustrie 27

II.3.2.1. Insleep in de melk 27

II.3.2.2. Invloed van Bacillus cereus op de melk 27

II.3.2.2.1. Het emetische toxine 28

II.3.2.2.2. Het diarree toxine 28

II.4. Biologische versus conventionele melkveebedrijven 29

II.5. Bespreking van gebruikte karakteriseringstechnieken 31

II.5.1. FAME(fatty acid methyl ester)‐analyse 31

II.5.2. Rep‐PCR 32

III. Materiaal en methoden 35

III.1. Uittesten van de isolatieprocedure 35

III.1.1. Cultuurbodems 35

III.1.1.1. Principe 35

III.1.1.2. Gebruikte media en reagentia 35

III.1.1.3. Gebruikte stammen 37

III.1.1.4. Werkwijze 37

III.1.1.4.1. β‐galactosidase‐activiteit 38

III.1.1.4.2. Lipase‐activiteit 38

III.1.1.4.3. Fosfolipase‐activiteit 38

III.1.1.4.4. Caseïnehydrolase‐activiteit 39

III.1.2. Melkafbraak 39



III.1.2.3. Gebruikte stam 40


III.1.3. Visualiseren van de kolonies met zuren 41



III.1.3.3. Gebruikte stammen 41


III.2. Isolatie van de aërobe sporenvormers uit melk 42

III.2.1. Inleiding 42

III.2.2. Gebruikte media en reagentia 42

III.2.3. Werkwijze 42

III.2.4. Schematisch overzicht van de werkwijze voor de verwerking van 1 staal 44

III.2.5. Oppikken van de isolaten en uitzuivering 45

III.3. Identificatie van de isolaten 46

III.3.1. Voorbereiding 46


III.3.1.2. Benodigdheden 46


III.3.2. FAME‐ fatty acid methyl ester analysis 47



III.3.2.3. Gebruikte stam 48


III.3.3. Rep‐PCR 52

III.3.3.1. DNA‐isolatie 52

III.3.3.1.1. Principe 52

III.3.3.1.2. Reagentia 53

III.3.3.1.3. Werkwijze 53

III.3.3.2. Kwaliteitscontrole van het geïsoleerde DNA 54




III.3.3.3. Concentratie‐ en zuiverheidsbepaling van het DNA 56



III.3.3.4. Rep‐PCR 57



III.3.3.5. Agarosegel‐elektroforese van de rep‐PCR‐producten 58




IV. Resultaten en bespreking 61

IV.1. Uittesten van de isolatieprocedure 61

IV.1.1. Cultuurbodems 61

IV.1.1.1. β‐galactosidase‐activiteit 61

IV.1.1.2. Lipase‐activiteit 62

IV. 1.1.3. Fosfolipase‐activiteit 62

IV.1.1.4. Caseïnehydrolase‐activiteit 63

IV.1.2. Melkafbraak 65

IV.1.3. Visualiseren van de kolonies met zuren 65

IV.2. Isolatie van de aërobe sporenvormers uit melk 66

IV.2.1. Totaal kiemgetal 66

IV.2.2. Totaal sporengetal 67

IV.2.3. Overzicht van de geïsoleerde stammen 67

IV.2.3.1. Bespreking van de tabellen 10 tot 17 68

IV.3. Identificatie 71

IV.3.1. FAME‐identificatie 71

IV.3.1.1. Bespreking van het dendrogram 74

IV.3.1.2. Enkele vergelijkingen 78

IV.3.1.2.1. Belang van de temperatuur 78

IV.3.1.2.2. Het effect van de melkafbraak 78

IV.3.1.2.3. Vergelijking biologisch vs. conventioneel bedrijf 79

IV.3.2. Rep‐PCR 80

IV.3.2.1. REP‐PCR 80

IV.3.2.2. (GTG)5‐PCR 82

V. Samenvatting en besluit 84

VI. Referenties 86

Appendix I

Appendix II

Appendix III

I. Inleiding

Deze scriptie kadert binnen het IWT‐project: “Invloed van de bedrijfsvoering op de schadelijke aërobe sporenvormende bacteriële flora in rauwe melk: biologische versus conventionele melkveehouderij”. De aanleiding tot dit project is de problemen die men in de zuivelindustrie ondervindt van aërobe sporenvormers, waarvan de meeste behoren tot het genus Bacillus. Deze groep van bacteriën is metabolisch heel divers en de vertegenwoordigers ervan zijn in staat om zich in sterk verschillende milieus te handhaven. Hoewel hun primaire niche de bodem is, kunnen ze zich via de spore, een zeer resistente structuur, makkelijk verspreiden. Het is dan ook niet verwonderlijk dat ze teruggevonden worden in tal van milieus waaronder rauwe melk. Ze komen daarin terecht via verschillende bronnen zoals het veevoeder, de bodem en feces. In de zuivelindustrie zal men de bacteriën aanwezig in de melk via een hittebehandeling verwijderen. Een voorbeeld van zo’n hittebehandeling is pasteurisatie waarbij rauwe melk gedurende een half uur wordt verhit bij 62 à 63°C of gedurende 15 seconden bij 72°C (Grappin and Beuvier, 1998). De sporenvormers kunnen die pasteurisatie echter overleven. Sporenvormers zijn nadelig voor de zuivelindustrie: ze veroorzaken bederf van de melk en de daarvan afgeleide zuivelproducten. Bovendien kunnen ze, door productie van toxines, een gevaar voor de volksgezondheid betekenen. Hoewel naar bepaalde species, zoals Bacillus cereus, al uitgebreid onderzoek is verricht, zijn nog veel van die sporenvormers onbekend omdat de courante fenotypische testen niet toelaten de biodiversiteit van het genus Bacillus volledig weer te geven. Ook is het mogelijk dat door recente evoluties in de landbouwmethodes, bijvoorbeeld import van buitenlands veevoeder, tot nog toe ongekende Bacillus species in de melk terechtkomen. Meer informatie over de kenmerken en de oorsprong van de aërobe sporenvormers in melk is van fundamenteel belang om hun contaminatie te beperken en de kwaliteit van de melkproducten te verbeteren (Vaerewijck et al., 2001). Het is reeds duidelijk dat verschillende factoren een rol spelen bij de insleep van de sporen in de rauwe melk. Zo heeft men aangetoond dat de sporen van Bacillus cereus voornamelijk afkomstig zijn van de bodem en dat het aantal ervan varieert met de seizoenen (Christiansson et al., 1998). Het hoogste aantal sporen van B. cereus werd teruggevonden in de late zomer, herfst (Philips and Griffiths, 1986). Ook is gebleken dat de huisvesting van de koeien van belang is: koeien die buiten grazen hebben een groter aantal sporen van Bacillus cereus in hun melk dan koeien die op stal staan (Slaghuis et al., 1997). Via het veevoeder kunnen ook sporen van bepaalde Bacillus species, waaronder B. sporothermodurans (Vaerewijck et al., 2001) in de rauwe melk terechtkomen. Het is dan ook waarschijnlijk dat de bedrijfsvoering, die voor veel van deze factoren bepalend is, invloed zal hebben op de bacteriële flora van de rauwe melk.

In deze scriptie wordt het effect van de bedrijfsvoering, namelijk de conventionele en de biologische melkveehouderij, op de aërobe sporenflora onderzocht. Dit zal in 2 stappen gedaan worden: 1) isolatie en screening van de aërobe sporenvormers uit rauwe melk van beide

bedrijfstypes, 2) polyfasisch taxonomisch onderzoek van de bekomen isolaten. In een volgende fase van het project zal de negatieve invloed van de bacteriën op de melk nader bestudeerd worden. Dit zal eveneens in twee stappen gebeuren: 1) karakterisering van de mogelijke schadelijke effecten van elk isolaat, 2) ontwikkelen van snelle en specifieke real‐time PCR(polymerase chain reaction)‐testen om snellere detectie van schadelijke taxa toe te laten. In deze scriptie wordt de bacteriële populatie van 4 biologische en 4 conventionele melkveebedrijven vergeleken. De sporenvormers zullen uit de melk worden geïsoleerd en vervolgens zal een eerste screening van de isolaten gebeuren door middel van FAME‐analyse (fatty acid methyl ester analysis). Verdere karakterisering van de isolaten wordt verkregen via rep‐PCR dat zal toelaten om genetisch zeer nauw verwante isolaten te onderscheiden. Aan de hand van deze resultaten zou men al een eerste beeld moeten kunnen vormen van de verschillen in de bacteriële flora in melk geproduceerd door biologische en door conventionele melkveebedrijven.

II. Literatuurstudie

II.1. Melk en melkkwaliteit

II.1.1. Belang van melk in de voedingsindustrie

Melk is, samen met afgeleide zuivelproducten zoals kaas en yoghurt, een basisproduct in de dagelijkse voeding van de mens. Het is dan ook een bijna compleet voedingsmiddel (Testaankoop, 2004). In Tabel 1 wordt de samenstelling van de melk weergegeven.

Tabel 1. Samenstelling van melk (Shearer et al., 1992).

Water 84‐90%

Vet 2‐6%

Proteïnes 3‐4%

Lactose 4‐5%

Mineralen <1%

De vetten in de melk zijn een bron van energie, van essentiële vetzuren en van vet‐oplosbare vitamines (A, D, E en K). De melkproteïnen worden opgedeeld in de caseïnes en de weiproteïnen (de caseïnes slaan neer als de pH daalt tot 4.6, weiproteïnen blijven in die omstandigheden in oplossing). Die melkproteïnen bevatten het merendeel van de noodzakelijke aminozuren die we zelf niet kunnen aanmaken (Otter, 2003). Lactose is het belangrijkste suiker in de melk en is mede van belang voor het instandhouden van de microflora in het spijsverteringskanaal. Lactose wordt in de dunne darm door het enzym lactase afgebroken tot glucose en galactose, waarna deze monosacchariden worden opgenomen via actief transport. Er zijn echter mensen die lactose‐intolerant zijn. Zij produceren niet genoeg lactase waardoor het lactose in de dunne darm fermenteert, wat gepaard gaat met gasvorming, krampen en diarree. Het is mogelijk de melk vooraf te behandelen met lactase waardoor ook mensen met een lactose‐intolerantie melk en afgeleide producten kunnen consumeren (Beers et al., 2005). Een ander voorbeeld van suikerintolerantie is glucose‐galactose malabsorptie. Mensen die hieraan lijden, kunnen de monosacchariden glucose en galactose niet opnemen uit de dunne darm omdat het actief transportsysteem ontbreekt. De symptomen van deze suiker‐intolerantie zijn krampen en diarree. Deze mensen zijn verplicht glucose en galactose in hun dieet te vermijden. Een suiker die ze wel kunnen opnemen, via passief transport, is fructose (Beers et al., 2005).

Melk is tevens een voorname bron van mineralen zoals fosfor, magnesium, kalium, zink en calcium (Roginski et al., 2003). Melk en de daarvan afgeleide zuivelproducten zijn dus voedingsmiddelen die een belangrijke bijdrage leveren tot een gezonde en evenwichtige voeding (Roginski et al., 2003). Er wordt dan ook veel belang besteed aan de kwaliteit van de melk en de afgeleide producten waarbij een goede kwaliteit van het uitgangsproduct, rauwe melk, van primair belang is.

II.1.2. Kwaliteit van de rauwe melk

De rauwe melk in Vlaanderen wordt gecontroleerd door het Melkcontrolecentrum –Vlaanderen VZW. In het ‘protocol voor de officiële bepaling van de kwaliteit en de samenstelling van de melk geleverd aan kopers’ staat precies beschreven hoe een officieel melkstaal wordt genomen, hoe het vervoerd wordt en hoe het vervolgens geanalyseerd wordt. De kwaliteit van de rauwe melk wordt bepaald aan de hand van 6 parameters: kiemgetal, celgetal, vriespunt, filtratie, ontsmettingsmiddelen en remstoffen.

Het kiemgetal is het totaal aantal bacteriële cellen per ml melk. Het celgetal slaat op het aantal eukaryote cellen per ml melk. Deze waarde kan hoog zijn; wanneer de koe bv. lijdt aan een uierinfectie kunnen er veel leukocyten in de melk voorkomen. Het vriespunt wordt gemeten om te bepalen of er al dan niet water aan de melk is toegevoegd. Extra water zal het vriespunt immers doen stijgen (Roginski et al., 2003). Filtratie is een test waarbij de melk gefilterd wordt om na te gaan of er vuildeeltjes op de filtermembraan achterblijven. Deze test wordt soms ook zichtbare zuiverheidsbepaling genoemd. Ontsmettingsmiddelen die gebruikt worden om de uier en de melkwinningsapparatuur te reinigen, mogen niet aanwezig zijn in de rauwe melk, en ook remstoffen (= antibiotica) mogen er niet in teruggevonden worden.

Voor elk van deze 6 parameters zijn er specifieke testen ontworpen. De resultaten die bekomen worden met die testen moeten voldoen aan vastgelegde normen, die beschreven staan in Tabel 2, evenals het vastgelegde aantal analyses van elke parameter per maand of per jaar. Indien een melkveebedrijf één van die normen niet haalt, krijgt het strafpunten opgelegd. Die strafpunten worden vertaald in een boete (lagere prijs per liter geleverde melk) of een leveringsverbod, naargelang de ernst van de ‘overtreding’.

Tabel 2. Overzicht van de kwaliteitscontrole (MCC‐Vlaanderen).

Parameter Norm Strafpunten Aantal analyses

Kiemgetal ≤ 105 cellen/ml Vanaf 1 tot 8 2 per maand

Celgetal ≤ 4x105 cellen/ml Vanaf 1 tot 8 4 per maand

Vriespunt ≤ ‐0.53°C 1 1 per maand

Zichtbaar vuil (filtratie) < 0.5 mg/l 2 1 per maand

Ontsmettingsmiddelen afwezig 2 4 per jaar

Remstoffen afwezig Leveringsverbod indien 4

maal ongunstig op een jaar

4 per jaar

Met dit controlesysteem probeert men de kwaliteit van de rauwe melk te verzekeren, en verdere verwerkingsproblemen te vermijden.

Voor het onderwerp van deze scriptie, bacteriën in melk, is voornamelijk de eerste parameter van belang: het kiemgetal. Rauwe melk wordt gecontamineerd met bacteriën die afkomstig zijn van verschillende bronnen. De voornaamste zijn bodem en feces, maar ook voeder, gras, stalstro en de melkinstallatie spelen een belangrijke rol in de inbreng van bacteriën (te Giffel et al., 1995). Het is onmogelijk te vermijden dat bacteriën in de melk terechtkomen. Wel kan men proberen hun aantal te beperken door hygiënisch te werken. Een laag kiemgetal bevordert de kwaliteit van de melk waardoor ze makkelijker kan verwerkt worden, de houdbaarheid verlengd wordt en de garantie op een gezond eindproduct verhoogt (Rombaut et al., 2002). In Vlaanderen wordt de melk aanvaard als kwaliteitsvol indien het kiemgetal lager is dan 100000. In AA‐melk, die onderhevig is aan strengere eisen dan gewone consumptiemelk, mag het kiemgetal zelfs niet hoger liggen dan 50000 (Rombaut et al., 2002). In de praktijk wordt bij de meerderheid van de melkveebedrijven een veel lager kiemgetal (grootte‐orde: 10000 cellen/ml) teruggevonden zoals blijkt uit Fig. 1 (MCC‐Vlaanderen).

Fig. 1. Verloop van het gemiddelde kiemgetal in Vlaanderen (MCC‐Vlaanderen).

II.1.3. Melk en microbiologie

De bacteriën die het vaakst in rauwe melk worden teruggevonden, zijn Gram‐negatieve psychrotrofen. Psychrotrofe bacteriën hebben groeioptima tussen 0 en 20°C. Daarnaast zijn er ook mesofielen met groeioptima tussen 20 en 45°C, thermofielen met groeioptima tussen 40 en 70°C en hyperthermofielen met groeioptima tussen 65 en 115°C (Madigan et al., 2000). Een overzicht wordt gegeven in Fig. 2.

Fig. 2. Temperatuur/groeisnelheid‐relaties voor typische psychrofielen, mesofielen, thermofielen en 2 types

hyperthermofielen (Madigan et al., 2000).

De Gram‐negatieve bacteriën in de melk behoren tot de genera Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Chromobacterium en Flavobacterium. Hoewel leden van het genus Pseudomonas meestal slechts 10% van de totale populatie Gram‐negatieven in de melk vertegenwoordigen, zijn ze toch belangrijk op het gebied van bederf van de melk (Cempíroková, 2002). Pseudomonaden komen wijd verspreid in de natuur voor: de bodem, water, planten en dieren zijn hun natuurlijke habitats. Hoewel deze micro‐organismen worden afgedood door de gangbare hittebehandelingen, ondervindt men er toch problemen mee in de zuivelindustrie. Ze produceren immers extracellulaire hitteresistente hydrolytische enzymen, die zelfs na het hitteprocédé sommige melkcomponenten kunnen afbreken en zo bederf veroorzaken (Rajmohan et al., 2002). Het is dus belangrijk om 1) te vermijden dat er veel psychrotrofe Gram‐negatieve bacteriën in de melk terechtkomen en 2) dat de tijd tussen het melken en de hittebehandeling van de melk zo kort mogelijk wordt gehouden. In die tussentijd wordt de melk koel bewaard; de psychrotrofen kunnen echter goed gedijen bij deze lagere temperaturen. Ze krijgen de kans om extracellulaire enzymen te produceren die de hittebehandeling overleven en de melk kunnen bederven (Dogan et al., 2002). Naast Gram‐negatieve psychrotrofen bevinden er zich ook Gram‐positieve bacteriën in de rauwe melk, behorend tot de genera Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus en Microbacterium (Cempíroková, 2002). Daarvan omvatten de genera Bacillus en Clostridium sporenvormers. Zij vormen een probleem in de zuivelketen omdat hun sporen de gangbare verhittingsprocessen overleven. Het genus Bacillus omvat de (facultatief) aëroben terwijl het genus Clostridium de strikt anaëroben omvat. In dit laatste genus zitten enkele belangrijke pathogene species, zoals C. botulinum en C. perfringens. C. botulinum produceert een neurotoxine dat botulisme veroorzaakt, een ziekte met soms dodelijke afloop. C. perfringens kan verantwoordelijk zijn voor voedselinfecties met als symptomen diarree en ernstige buikpijn (Brown, 2000).

0°C 50°C 100°C

Gro

eisn

elhe

id

4°C

39°C

60°C

88°C 106°C

psychrofiel

mesofiel

thermofiel

hyperthermofiel

Temperatuur

II.1.4. Methodes om de melk te vrijwaren van bacteriën

Om de bacteriën in de melk af te doden zal men gebruik maken van hittebehandelingen. Hierdoor wordt de houdbaarheid van de melk verlengd en kan men het beschouwen als een veilig en gezond product. Men onderscheidt (Roginski et al., 2003): ‐ thermisatie: 65°C gedurende 15 à 20 seconden. Deze behandeling doodt voornamelijk de

psychrotrofe bacteriën en gaat vooraf aan de pasteurisatie wanneer deze laatste niet onmiddellijk kan plaatsvinden.

‐ Pasteurisatie: ofwel batch‐pasteurisatie (62‐63°C gedurende 30 à 35 minuten), ofwel ‘high‐temperature‐short‐time’‐pasteurisatie (15 seconden bij 72°C) (Grappin and Beuvier, 1998). Hierdoor worden nagenoeg alle vegetatieve cellen afgedood.

‐ UHT‐behandeling: staat voor ‘ultra heat treatment’ of ‘ultra high temperature’. De melk wordt gedurende enkele seconden blootgesteld aan een temperatuur van 135 tot 142°C (Pettersson et al., 1996). Daarna wordt de melk onder aseptische omstandigheden steriel verpakt. Dit procédé doodt alle vegetatieve cellen, alsook de meeste sporen.

‐ Sterilisatie: is een twee‐staps‐proces waarbij de melk eerst een UHT‐behandeling ondergaat en in flessen wordt verpakt. Nadien worden die flessen in een sterilisatietoren gedurende 15 à 20 minuten verhit tot een temperatuur van 115 à 120°C ofwel gedurende 20 à 40 minuten aan een temperatuur van 109 tot 115°C (Pettersson et al., 1996). Dit proces doodt eveneens alle vegetatieve cellen alsook de meeste sporen. De natuurlijke samenstelling van de melk ondergaat door de sterilisatie echter een verandering, wat resulteert in een gewijzigde smaak die niet door iedereen wordt geapprecieerd.

Men dacht dat geen enkele bacterie een UHT‐behandeling kon overleven tot in 1985 voor het eerst sporenvormers werden ontdekt die dit wel kunnen door productie van zeer hitteresistente sporen (Hammer et al., 1996). Twee voorbeelden van zulke sporenvormers zijn Bacillus sporothermodurans, een in 1996 nieuw beschreven species (Pettersson et al., 1996), en waarschijnlijk Paenibacillus lactis, een species dat in 2004 werd beschreven (Scheldeman et al., 2004). Uit een onderzoek van Scheldeman et al. (2004) bleek dat de diversiteit van potentieel zeer hitteresistente sporenvormers nog grotendeels onbekend is. In dat onderzoek werden de sporenvormers geïsoleerd uit melk die gedurende 30 minuten aan een temperatuur van 100°C werd blootgesteld.

In een UHT‐behandeling wordt gebruik gemaakt van hogere temperaturen. Het is niet zo dat alle zeer hitteresistente sporenvormers, die 30 minuten bij 100°C kunnen overleven, automatisch ook aan een UHT‐behandeling zullen weerstaan. Omdat de kennis over de in rauwe melk voorkomende sporenvormers nog ontoereikend is, is het niet duidelijk of en welk bederf ze eventueel kunnen veroorzaken en of ze een gevaar vormen voor de volksgezondheid. Het is dus noodzakelijk deze ongekende bacteriën te karakteriseren zodat men gepast en snel kan reageren op eventuele problemen in de zuivelindustrie ten gevolge van die sporenvormers.

In België wordt voornamelijk melk verkocht die een UHT‐behandeling of sterilisatie heeft ondergaan. Deze melk is lang houdbaar (enkele maanden) en hoeft niet gekoeld bewaard te worden. Dit in tegenstelling tot gepasteuriseerde melk, die minder lang houdbaar (enkele weken) is en wel gekoeld moet bewaard worden (Testaankoop, okt. 2004). Om afgeleide producten van melk te maken, zoals bv. kaas en yoghurt, vertrekt men van gepasteuriseerde of rauwe melk. In dit project wordt de melk verhit gedurende 10 minuten bij 80°C (dit pasteurisatieproces wordt algemeen gebruikt in laboratoria) om voor alle sporenvormers te selecteren, zowel deze die commerciële pasteurisatie overleven als deze die aan een UHT‐behandeling kunnen weer‐staan.

II.2. Het genus Bacillus (sensu lato)

II.2.1. Inleiding tot polyfasische taxonomie

Taxonomie is de wetenschap die zich bezighoudt met de classificatie van organismen in groepen, die men taxa noemt. Men onderscheidt drie gedeeltes (Vandamme et al., 1996):

‐ de classificatie: ordening van organismen in taxa op basis van similariteit, ‐ nomenclatuur: naamgeving van die organismen en taxa, ‐ identificatie: bepalen in welke taxon een nieuw organisme thuishoort.

Het species is de basisunit in de bacteriële taxonomie en wordt fylogenetisch gedefinieerd als een groep stammen, inclusief de typestam, die 70% of meer DNA‐DNA‐verwantschap hebben met 5°C of minder ΔTm (Wayne et al., 1987). Tm is de smelttemperatuur van de hybride, ΔTm is het verschil in Tm in graden Celsius tussen de homologe en heterologe hybriden die gevormd zijn onder standaardcondities. In polyfasische taxonomie zal men taxonomisch relevante data, die verkregen worden via verschillende karakterisatietechnieken (zowel fenotypische als genotypische), integreren om tot een consensus in de classificatie van bacteriën te komen. De huidige mening in bacteriële taxonomie is immers dat de classificatie van bacteriën zoveel mogelijk de natuurlijke verwantschappen moet weergeven. Hierna worden enkele courante karakteriseringstechnieken besproken.

II.2.1.1. Genotypische methodes

Deze technieken zijn gebaseerd op de nucleïnezuren (DNA en RNA) van bacteriën en domineren tegenwoordig in de taxonomie. Enkele voorbeelden van genotypische technieken zijn (Vandamme et al., 1996):

‐ bepalen van basensamenstelling van het DNA, ‐ DNA‐DNA‐hybridisatiestudies, ‐ 16S rRNA‐sequentiesimilariteit, ‐ DNA‐fingerprinttechnieken (bvb. rep‐PCR).

II.2.1.1.1. Bepalen van de basensamenstelling van het DNA

Determinatie van het molair procent guanosine + cytosine is één van de klassieke genotypische methodes en maakt deel uit van de standaardbeschrijving van bacteriële taxa. De variatie binnen een species moet kleiner zijn dan 3% en binnen een genus moet de variatie kleiner dan 10% blijven (Stackebrandt et al., 1993).

II.2.1.1.2. DNA‐DNA‐hybridisatiestudies

In bovenstaande definitie van een species (Wayne et al., 1987) is reeds vermeld dat het percentage DNA‐DNA‐verwantschap gebruikt wordt voor het afbakenen van een species. Het percentage DNA‐binding (De Ley et al., 1970), de DNA‐DNA‐hybridisatiewaarde of de relatieve bindingsratio (Brenner et al., 1969; Grimont et al., 1980; Popoff et al., 1980) zijn een indirecte parameter van de sequentiesimilariteit tussen twee volledige genomen.

II.2.1.1.3. 16S rRNA‐sequentiesimilariteit

Het is tegenwoordig algemeen aanvaard dat ribosomaal RNA uiterst geschikt is om fylogenetische verwantschappen te bestuderen. Het is immers in alle bacteriën aanwezig, is functioneel constant en bevat naast heel sterk geconserveerde gebieden ook variabele regio’s (Woese, 1987; Schleifer et al., 1989; Stackebrandt et al., 1994). De verschillende bacteriële rRNA’s worden aangeduid als 5S, 16S en 23S.

Het belang van rRNA‐sequenties als taxonomische merkers is aangetoond bij bacteriën, waar 16S en/of 23S sequentie‐analyses de fylogenetische verwantschappen gedefinieerd hebben (Vandamme et al., 1996).

Stackebrandt en Goebel (1994) stelden dat organismen die meer dan 97% rRNA‐sequentiesimilariteit vertonen tot eenzelfde species kunnen behoren. DNA‐DNA‐hybridisatie is echter nodig om dit definitief aan te tonen.

De sterk geconserveerde regio’s van de rRNA‐moleculen worden gebruikt om de relaties tussen ver verwante taxa te onderzoeken, terwijl de meer variabele gebieden gebruikt worden om onderscheid te maken op genus‐ en speciesniveau (Goebel et al., 1987).

II.2.1.1.4. DNA‐fingerprinttechnieken

DNA‐gebaseerde fingerprinttechnieken worden gebruikt om stammen te groeperen op speciesniveau of om species onder te verdelen in verschillende subtypes (Vandamme et al., 1996).

Dankzij de introductie van de PCR‐methode groeide het aantal mogelijke toepassingen van DNA‐gebaseerde fingerprinttechnieken. PCR‐gebaseerde typeringsmethoden zijn universeel toepasbaar, eenvoudig en snel. Een voorbeeld is rep‐PCR dat in deze scriptie gebruikt wordt.

II.2.1.2. Fenotypische methodes

Deze technieken zijn gebaseerd op morfologische, fysiologische en biochemische eigenschappen van bacteriën. Hoewel genotypische methodes momenteel domineren, worden de fenotypische testen nog vaak gebruikt in laboratoria. Door integratie van data afkomstig van meerdere fenotypische testen, kan men immers informatie afleiden omtrent het genoom van de bacteriën.

Chemotaxonomische testen:

de term chemotaxonomie verwijst naar het gebruik van analytische methodes voor het bepalen van chemische componenten van de cel om bacteriën te classificeren. Veel gebruikte technieken zijn FAME‐ en proteïne‐analyse.

In Fig. 3 wordt de taxonomische resolutie van courante karakteriseringstechnieken weergegeven.

In II.5. volgt een bespreking van de karakteriseringstechnieken die in deze scriptie gebruikt worden.

Fig. 3. Taxonomische resolutie van karakteriseringstechnieken (Vandamme et al., 1996).

II.2.2. Taxonomische geschiedenis van het genus Bacillus

In de microbiologie zorgt de classificatie voor een opdeling in verschillende taxa. Een species omvat meerdere stammen. Gelijkaardige species worden gegroepeerd in een genus. Genera zijn op hun beurt een onderdeel van families, ordes, klassen en phyli (Claus and Fritze, 1989). Het genus Bacillus wordt in volgende taxa gegroepeerd: domein Bacteria, phylum Firmicutes, klasse Bacilli, orde Bacillales, familie Bacillaceae, genus Bacillus (Garrity et al., 2003). Het genus werd in 1872 door Cohn benoemd, die de naam van het in 1835 ontdekte Vibrio subtilis wijzigde in Bacillus subtilis (dit is het typespecies van het genus Bacillus). De oorspronkelijke definitie van het genus was: staafvormige bacteriën die in filamenten groeien. Later, toen de endospore werd ontdekt, bepaalde men dat endosporenvorming een specifiek kenmerk was van het genus (dit wil niet zeggen dat alleen de species behorend tot het genus Bacillus endosporen produceren, wel dat alle vertegenwoordigers van het genus Bacillus sporen moesten kunnen vormen). Nog later werd het genus gedefinieerd als alle aërobe, staafvormige sporenvormers (Claus and Fritze, 1989). Vroeger kon men zich enkel baseren op fenotypische testen om nieuw ontdekte bacteriën een naam en een plaats te geven in een bepaald taxon. Deze blijken echter totaal ontoereikend om de diversiteit van het genus Bacillus vast te leggen. Vanaf de jaren 1980 echter kwam er met behulp van nieuwe moleculaire technieken een kentering in de classificatie van bacteriën. Vanaf toen kon men op een uitgebreide schaal

Restriction fragment length polymorphism (RFLP)Low frequency restriction fragment analysis (LFRFA, PFGE)RibotypingDNA amplification (AFLP, AP-PCR, rep-PCR, DAF, RAPD, ARDRA)

Phage and bacteriocin typingSerological (monoclonal, polyclonal) techniquesZymograms (multilocus enzyme polymorphism)Total cellular protein electrophoretic patternsDNA-DNA hybridizations% G+CtDNA-PCRChemotaxonomic markers (polyamines, quinones)Cellular fatty acid fingerprinting (FAME)Cell wall structurePhenotype (classical, API, Biolog...)rRNA sequencingDNA probesDNA sequencing

Taxonomic resolution of techniques StrainSpecies

GenusFamily

gebruik maken van genotypische kenmerken om de natuurlijke verwantschap of fylogenie tussen bacteriën aan te tonen. Uit de verschillen in het genomisch G+C‐gehalte (meer dan 30%, terwijl men 10% aanvaardt als de toegelaten variatie binnen één genus (Priest, 1993)) tussen de verschillende Bacillus species, werd duidelijk dat het oorspronkelijke genus Bacillus eigenlijk niet langer als één genus kon blijven bestaan. In 1991 bepaalden Ash en medewerkers de rRNA‐sequenties van de kleine subunit van het ribosoom van 51 species behorend tot het genus Bacillus. Uit een vergelijkende analyse van die 16S rRNA‐sequenties bleek dat het genus Bacillus kon opgedeeld worden in 5 fylogenetisch aparte clusters. In Fig. 4 wordt een overzicht geschetst van die 5 clusters op basis van rRNA‐sequenties. Deze indeling van het genus Bacillus in 5 16S rRNA‐clusters is in veel gevallen een basis geweest voor de opsplitsing van het genus in meerdere genera. Verder onderzoek naar de 16S rRNA/DNA‐sequenties bevestigden de heterogeniteit van het genus. Uiteindelijk werden verschillende groepen van species die voordien tot het genus Bacillus werden gerekend, ondergebracht in nieuwe genera (Fritze, 2004). Ook werden tal van nieuwe genera opgericht om nieuw ontdekte species in onder te brengen (Wisotzeky et al., 1992; Shida et al., 1996; Heyndrickx et al., 1998; Fortina et al., 2001; Nazina et al., 2001; Scheldeman et al., 2004).

Fig. 4. Evolutionaire afstandsboom die de fylogenetische heterogeniteit van het genus Bacillus aantoont (afgeleid van Ash et al., 1991; niet alle species zijn weergegeven).

Een overzicht van genera van aërobe sporenvormers, gebaseerd op 16S rRNA/DNA‐sequentiegelijkenissen, wordt gegeven in Tabel 3. Daaruit wordt duidelijk dat de orde Bacillales zowel families bevat met sporenvormers (in vet gedrukt) als met niet‐sporenvormers. Zelfs in één familie kunnen sporenvormende en niet‐sporenvormende genera samen voorkomen. Het is nog niet duidelijk of bij deze niet‐sporenvormers de genen nodig voor sporulatie ontbreken, of dat ze niet tot expressie komen (Fritze, 2004).

Al die nieuwe genera en het oorspronkelijke genus Bacillus worden samen benoemd als ‘Bacillus sensu lato’. Het genus Bacillus zelf is dan ‘Bacillus sensu stricto’.

Voor dit project wordt met aërobe sporenvormers gewerkt, dus ‘Bacillus sensu lato’.

GROEP 2

B. insolitus

B. sphaericus B. licheniformisB. subtilisB. amyloliquefaciens

B. pumilus

B. cereus/B.anthracisB. thuringiensis

B. medusa

B. mycoidesB. coagulans

GROEP 1

B. megaterium

B. circulans

B. lentus

B. pantothenticus

B. amylolyticus

B. pabuli

B. polymyxa

B. macerans

B. pulvifaciens

B. larvae

B. gordonae

B. alveiGROEP 3

B. laterosporus

B. brevis

B. alcalophilusB. kaustophilus

B. stearothermophilus

GROEP 4

GROEP 5

Tabel 3. Systematische positie van Gram‐positieve aërobe sporenvormers (Fritze, 2004).

Systematic position No. Of species/subspecies

Domain Bacteria

Phylum BXIII. Firmicutes phy.nov.

Class III. Bacilli

Order I. Bacillales

Family I. Bacillaceae

Genus I. Bacillus 88/2

Genus II. Amphibacillus 3

Genus III. Anoxybacillus 3

Genus IV. Exiguobacterium

Genus V. Filobacillus 1

Genus VI. Geobacillus 10

Genus VII. Gracilibacillus 2

Genus VIII. Halobacillus 5

Genus IX. Jeotgalibacillus 1

Genus X. Lentibacillus 1

Genus XI. Marinibacillus 1

Genus XII. Oceanobacillus 1

Genus XIII. Paraliobacillus 1

Genus XIV. Saccharococcus

Genus XV. Salibacillus ‐

Genus XVI. Ureibacillus 2

Genus XVII. Virgibacillus 7

Family II. Alicyclobacillaceae

Genus I. Alicyclobacillus 8/2

Genus II. Pasteuria 3

Genus IIII. Sulfobacillus 3

Family III. Caryophanaceae

Genus I. Caryophanon

Family IV. Listeriaceae

Genus I. Listeria

Genus II. Brochotrix

Family V. Paenibacillaceae

Genus I. Paenibacillus 45/2

Genus II. Ammoniphilus 2

Genus III. Aneurinibacillus 3

Genus IV. Brevibacillus 11

Genus V. Oxalophagus

Genus VI. Thermicanus

Genus VII. Thermobacillus 1

Family VI. Planococcaceae

Genus I. Planococcus

Genus II. Filibacter

Genus III. Kurthia

Genus IV. Planomicrobium

Genus V. Sporosarcina 3

Family VII. Sporolactobacillaceae

Genus I. Sporolactobacillus 5/2

Genus II. Marinococcus

Family VIII. Staphylococcaceae

Genus I. Staphylococcus

Genus II. Gemella

Genus III. Jeotgalicoccus

Genus IV. Macrococcus

Genus V. Salinicoccus

Family IX. Thermoactinomycetaceae

Genus I. Thermoactinomyces 6

Family X. Turicibacteraceae

Genus I. Turicibacter

II.2.3. Bespreking van het genus Bacillus en enkele verwante genera

II.2.3.1. Kenmerken van het genus Bacillus (sensu stricto)

Het genus Bacillus (rRNA‐groep 1 van Ash et al., 1991) is een uitgebreid genus, gekenmerkt door een zeer grote metabolische diversiteit waardoor ze zich, in combinatie met het vermogen tot sporenvorming, kunnen handhaven in tal van milieus. Het is dan ook niet verwonderlijk dat deze groep van bacteriën wijd verspreid is. De meeste species binnen het genus Bacillus zijn Gram‐positief, hoewel dit bij sommige stammen kan veranderen in bepaalde omstandigheden (bv. bij het verouderen); men spreekt dan van Gram‐variabel. Ze kunnen zich voortbewegen met gebruik van peritriche flagellen. Hun celgrootte varieert van 0.5 x 1.2 µm tot 2.5 x 10 µm. Ze zijn strikt (of soms facultatief) aëroob, staafvormig en meestal catalase‐positief (Holt et al., 1994). De species die behoren tot het genus Bacillus, worden algemeen aanzien als veilige (= niet‐pathogene) organismen; uitzonderingen zijn B. anthracis en B. cereus die pathogeen zijn voor de mens, alsook B. thuringiensis en andere insectpathogenen (Harwood, 1989). De bacilli worden gebruikt in de industrie voor de grootschalige productie van hydrolytische enzymen en antibiotica (zie II.2.4.3) alsook in wetenschappelijk onderzoek, waar ze hun nut bewijzen als organisme geschikt voor genetische manipulaties (net als E. coli, maar dat is een Gram‐negatief organisme) (Harwood, 1989).

II.2.3.2. Kenmerken van het genus Paenibacillus

In 1991 had Ash het oorspronkelijke genus Bacillus opgedeeld in 5 fylogenetisch aparte clusters (Ash et al., 1991). De derde cluster werd in 1993 beschreven als het nieuwe genus Paenibacillus (Ash et al., 1993). Sinds 1993 tot 2004 is het genus uitgebreid van 11 naar 45 species (Daane et al, 2002; Fritze, 2004). Getransfereerde species zijn deze die behoorden tot de ‘Bacillus polymyxa groep’, onder andere B. polymyxa, B. alvei, B. macerans en B. pulvifaciens. Ook species buiten de ‘B. polymyxa groep’ werden getransfereerd zoals bv. B. larvae, B. amylolyticus, B. pabuli en B. validus (Heyndrickx et al., 1996). Deze laatste drie werden vroeger aanzien als één species, nl. B. circulans, tot Nakamura in 1984 drie nieuwe species beschreef (Nakamura et al., 1984). De species die behoren tot het genus Paenibacillus delen volgende kenmerken: de cellen zijn staafvormig, zijn Gram‐positief, Gram‐negatief of Gram‐variabel en bewegen zich voort met behulp van peritriche flagellen (Fig. 5).

Fig. 5. Peritriche flagellen bij Bacillus‐achtigen (Daane et al., 2002).

Het zijn facultatief anaërobe of strikt aërobe micro‐organismen. Ze zijn goed aangepast aan variabele milieus en men kan ze dan ook overal terugvinden. Er zijn reeds Paenibacillus species geïsoleerd uit de bodem, water, feces, voedsel, veevoeder en planten (Daane et al., 2002; Kanzawa et al., 1995). Bijna alle species zijn catalase‐positief (uitzonderingen: P. larvae subsp. larvae en P. larvae subsp. pulvifaciens). Ze kunnen onderscheiden worden van de andere aërobe sporenvormers op basis van 16S rRNA‐sequenties. De typestam is P. polymyxa (Shida et al., 1997). Een species in het genus Paenibacillus waarvan het belang in de zuivelindustrie reeds is aangetoond, is P. lactis. Dit micro‐organisme komt onder andere voor in rauwe melk en is waarschijnlijk in staat om een UHT‐behandeling te overleven en zo de houdbaarheid van de melk te beïnvloeden (Scheldeman et al., 2004).

II.2.3.3. Kenmerken van het genus Brevibacillus

Het species Bacillus brevis (rRNA‐groep 4) werd voor het eerst beschreven in 1900 door Migula (Nakamura, 1993). Doordat sommige stammen van dit species gramicidine kunnen produceren was de belangstelling van wetenschappers groot (Nakamura, 1991). Er werd dan ook een groot aantal stammen geïsoleerd. Veel van die stammen weken echter sterk af van het typespecies en de definitie van het species werd onduidelijk. Op basis van het G+C‐gehalte van het genoom, alsook met behulp van fenotypische en chemotaxonomische gegevens werd besloten het species Bacillus brevis op te splitsen in 10 species (Nakamura, 1993; Shida et al., 1995; Shida et al., 1996). De ‘Bacillus brevis groep’ bestond uit B. brevis, B. agri, B. centrosporus, B. choshinensis, B. parabrevis, B. reuszeri, B. formosus, B. borstelensis, B. laterosporus en B. thermoruber. Deze groep species werd in 1996 heringedeeld in een nieuw genus Brevibacillus (Shida et al., 1996).

Kenmerken van het genus Brevibacillus: de cellen zijn staafvormig, Gram‐positief of Gram‐variabel en bewegen zich voort door middel van peritriche flagellen. Ze hebben een grootte variërend van 0.7‐0.9 op 3‐5 µm. Bijna alle species zijn strikt aëroob, enkel B. laterosporus is facultatief anaëroob. Ze zijn catalase‐positief en kunnen onderscheiden worden van andere aërobe sporenvormers op basis van 16S rRNA‐sequenties. De typestam is Brevibacillus brevis.

II.2.3.4. Kenmerken van het genus Virgibacillus

In de rRNA‐groep 1 (Bacillus sensu stricto), bepaald door Ash (Ash et al., 1991) was met behulp van de genomische karakteriseringstechniek ARDRA, ‘amplified rDNA restriction analysis’ (Heyndrickx et al., 1998) een aparte cluster te onderscheiden. Die cluster bevatte stammen van het species Bacillus pantothenticus. Omdat die stammen zo duidelijk een aparte cluster vormden in de rRNA‐groep 1 werden ze bij een nieuw genus ingedeeld, namelijk Virgibacillus (Heyndrickx et al., 1998). Ondertussen zijn al zeven Virgibacillus species beschreven.

Kenmerken van het nieuwe genus: de cellen zijn beweeglijk, Gram‐positief en staafvormig; soms vormen ze kettingen. Hun grootte varieert van 0.5‐0.7 op 2‐5 µm. De species behorend tot dit genus zijn facultatief anaëroob en catalase‐positief. Het typespecies is Virgibacillus pantothenticus. Het nieuwe genus kan onderscheiden worden van de andere aërobe sporenvormende genera met behulp van courante fenotypische testen, zoals biochemische testen met de ‘API 20E strip’ en koolhydraat testen met de ‘API 50CH gallery’ (Heyndrickx et al., 1998).

II.2.3.5. Kenmerken van het genus Ureibacillus

Bacillus thermosphaericus was een thermofiel species binnen het genus Bacillus. Het werd in 1995 geïsoleerd uit stadslucht in het zuiden van Finland (Andersson et al., 1995). De habitat is echter nog niet gekend. In 2001 werd besloten het species in een nieuw genus, Ureibacillus, te plaatsen. Dit gebeurde op basis van enkele eigenschappen die B. thermosphaericus duidelijk onderscheidt van de overige Bacillus species: Gram‐negatief, urease‐activiteit, strikt aëroob, geen suikermetabolisme, unieke structuur van het peptidoglycaan in de celwand, uniek vetzuurpatroon (Fortina et al., 2001).

Kenmerken van het nieuw beschreven genus Ureibacillus: beweeglijke, Gram‐negatieve cellen (0.5‐0.7 x 1‐6 µm), alleen of in ketens. De species zijn aëroob en thermofiel. De similariteit tussen de vertegenwoordigers van dit genus op basis van 16S rRNA‐sequentie‐analyse is hoger dan 98%. Het typespecies is Ureibacillus thermosphaericus (Fortina et al., 2001).

II.2.3.6. Kenmerken van het genus Geobacillus

De rRNA‐groep 5, bepaald door Ash et al. (1991), is een fenotypisch en fylogenetisch coherente groep van thermofiele bacteriën. Op basis van fysiologische eigenschappen, vetzuuranalyse, DNA‐DNA‐hybridisatiestudies en 16S rRNA‐sequentie‐analyses werd duidelijk dat deze rRNA‐cluster te grote verschillen vertoont met de andere Bacillus species om nog tot eenzelfde genus gerekend te worden. In 2001 werd dan ook het nieuwe genus Geobacillus beschreven (Nazina et al., 2001).

De kenmerken van het genus Geobacillus zijn: staafvormige, endosporenvormende, Gram‐positieve cellen, ofwel alleen ofwel in korte kettingen. De cellen zijn eventueel mobiel met peritriche flagellen en Gram‐positief. Ze hebben een variabele koloniemorfologie en grootte, zijn aëroob of facultatief anaëroob en groeien bij temperaturen tussen 37 en 75°C met een optimum bij 55 – 65°C. Het pH‐optimum ligt tussen 6 en 8.5. De meeste species produceren catalase. Het typespecies is Geobacillus stearothermophilus. Vertegenwoordigers van het genus komen wijd verspreid voor in de natuur (Nazina et al, 2001).

II.2.4. De endospore

De endospore is een overlevingsstructuur die heel resistent is tegen hitte, uitdroging, straling en chemicaliën (Brown, 2000). Ze wordt in ongunstige omstandigheden (bv. tekort aan voedsel, ongeschikte pH) gevormd en kan gedurende vele jaren in een slapende toestand blijven om dan in gunstige omstandigheden snel (enkele uren) te ontkiemen tot een vegetatieve cel. De spore wordt gevormd in de vegetatieve cel, vandaar dat men spreekt van een endospore.

Fig. 6. Bouw van een endospore (Todar, 2005).

II.2.4.1. Bouw

In Fig. 6 wordt de bouw van een endospore voorgesteld. De spore wordt omgeven door twee celmembranen (afkomstig van de moedercel), waartussen zich enkele beschermende sporenwanden vormen. De binnenste sporenwand is de cortex, die bestaat uit een zeer dikke laag van mucopeptiden en bescherming biedt tegen de hoge druk die in de spore ontstaat ten gevolge van het lage watergehalte (tijdens de sporevorming wordt er water onttrokken aan de prespore, waardoor deze resistenter wordt tegen hitte). De buitenste sporenwand is de sporenmantel. Die bestaat uit een keratine‐achtig eiwit dat zorgt dat de spore resistent is tegen chemicaliën. Eventueel is de sporenmantel nog omgeven door een exosporium. Typisch voor Bacillus sporen zijn grote hoeveelheden dipicolinezuur in de sporenwand, een stof die in vegetatieve cellen niet voorkomt en mee verantwoordelijk is voor de hitteresistentie van de spore (Todar, 2005).

II.2.4.2. Ontkieming

Sporen die in een gunstig milieu terechtkomen, gaan niet zomaar ontkiemen. Daartoe moeten ze eerst geactiveerd worden; dit kan gebeuren door een hitteschok of een lage pH. Bij de ontkieming worden cortex en sporenmantel afgebroken, start eiwit‐ en DNA‐synthese en wordt een nieuwe celwand gevormd. Met andere woorden, de spore groeit volledig uit tot een vegetatieve cel (Todar, 2005).

II.2.4.3. Antibiotica

Meestal gaat de sporulatie gepaard met de productie van antibiotica (bv. bacitracine, polymyxine, gramicidine), hoewel deze stoffen geen essentiële rol spelen in dit proces. Hun functie lijkt eerder andere micro‐organismen te doden of te inhiberen, waardoor de sporulerende bacteriën zelf als het ware wat meer ademruimte krijgen (Priest, 1989).

II.2.5. Sporenvormers in de zuivelindustrie

De problemen die men in de zuivelindustrie ondervindt van de aanwezigheid van sporenvormers, hebben meerdere oorzaken (Andersson et al., 1995).

‐ Men kan praktisch niet vermijden dat bacteriën, waaronder sporenvormers, in de melk terechtkomen. Bacillus cereus bv. heeft een zeer groot aanpassings‐vermogen waardoor dit species in zeer veel verschillende milieus kan overleven. De besmettingsbronnen van de melk zijn dan ook divers: water, de uier, de bodem, lucht, feces, het voeder maar ook in de melkwinningsapparatuur worden sporen teruggevonden (Meer et al., 1991). Ook al heerst er op het zuivelbedrijf een strenge hygiëne, dan nog zullen er sporenvormers in de melk terechtkomen, juist omdat ze zo algemeen verspreid zijn.

‐ Die sporenvormers kunnen niet worden afgedood door middel van de gangbare verhittingsprocessen zoals pasteurisatie. De niet‐sporenvormers worden wel vernietigd, waardoor de sporenvormers na de hittebehandeling geen concurrentie meer ondervinden.

‐ Sommige species (bv. B. cereus) produceren zeer hydrofobe sporen, die zich kunnen vasthechten aan de metaaloppervlaktes van de melkwinningsapparatuur. Die sporen zijn daar heel moeilijk van te verwijderen en kunnen elke nieuwe lading melk opnieuw besmetten (Husmark and Rönner, 1990).

De zuivelindustrie werkt met gekoelde productieketens, waardoor automatisch geselecteerd wordt voor psychrofiele en psychrotolerante sporenvormers. Door recente evoluties in de verwerkingsmechanismen is de periode tussen het melken en het verhitten van de melk langer geworden. In die periode wordt de melk gekoeld bewaard en psychrotrofen krijgen hierdoor meer kans om te groeien. Ook zijn de pasteurisatietemperaturen hoger geworden, waardoor meer sporen geactiveerd worden. Verder is door een betere hygiëne postcontaminatie na hittebehandeling beperkter, waardoor de sporenvormers minder concurrentie ondervinden. Door deze wijzigingen in de zuivelindustrie is het belang van psychrotrofe sporenvormers nog toegenomen (Meer et al., 1991).

De schadelijke effecten van sporenvormers situeren zich op drie vlakken: ‐ ze kunnen bederf van de melk veroorzaken, ‐ ze kunnen de verdere verwerkingsprocessen verstoren, ‐ door productie van toxines kunnen sommige species een gevaar vormen voor de

volksgezondheid.

II.2.5.1. Bederf van de melk

Net als sommige Gram‐negatieve species produceren veel aërobe sporenvormers hydrolytische extracellulaire enzymes. Die enzymes breken verschillende melkcomponenten af, wat resulteert in een afwijkende smaak en structuur. Niet alleen in de melk zelf maar ook in afgeleide producten zoals yoghurt, melkpoeders, pap en pudding, kunnen afwijkingen optreden door die enzymatische werking (Meer et al., 1991). Proteasen breken de melkeiwitten af, waardoor de melk een bittere en rotte smaak krijgt. Ook de structuur van de melk ondergaat wijzigingen door die protease‐activiteit. Zo kan gepasteuriseerde melk stremmen, een fenomeen dat bekend staat als ‘sweet curdling’. UHT‐behandelde melk kan geleiachtig worden (Haryani et al., 2003). Lipasen breken het vet in de melk af. Daardoor krijgt deze een fruitachtige en ranzige smaak. Sommige aërobe sporenvormers, bv. Bacillus cereus, produceren lecithinase, een fosfolipase dat lecithine afbreekt. Lecithine bevindt zich in de membranen die de vetbolletjes omgeven in de melk. Door hydrolyse van lecithine worden de membranen gebroken, waardoor de vetemulsie wordt verstoord. Dit kan men zien aan klonters die op het melkoppervlak drijven. Dit ‘defect’ in de melk wordt ‘bitty cream’ genoemd (Meer et al., 1991).

II.2.5.2. Verstoring van verdere verwerkingsprocessen

Een duidelijk voorbeeld hiervan vindt men terug in de kaasbereiding. Kaas wordt bereid van rauwe of gepasteuriseerde melk (Grappin and Beuvier, 1998). Veel Bacillus species die pasteurisatie overleven, kunnen fermentatief groeien in melk (aceton‐butanolfermentatie). Ze fermenteren lactaat tot butyraat en acetaat; in deze reactie worden ook de gassen H2 en CO2 gevormd (Ternström et al., 1993; Madigan et al., 2000). Het is reeds gekend dat deze gasproductie bij anaërobe sporenvormers, zoals Clostridium species, scheurvorming van de kaas veroorzaakt. Het zogenaamde ‘laat los’ effect (Klijn et al., 1995), is als voorbeeld weergegeven in Fig. 7.

Fig. 7. De 2 bovenste kazen vertonen het ‘laat los’ effect veroorzaakt door Clostridium

tyrobutyricum, de 2 onderste niet (Klijn et al., 1995).

Voor aërobe sporenvormers die eventueel facultatief anaëroob kunnen groeien, is hier echter nog geen onderzoek naar verricht. Naast die fermentatieve groei zijn veel species van het genus Bacillus denitrificeerders. Dit doet het effect van toegevoegd nitraat/nitriet bij de kaasbereiding teniet. Dat nitraat en nitriet heeft een inhiberend effect op de groei van Clostridium species (Ternström et al., 1993).

II.2.5.3. Productie van toxines

Sommige sporenvormers vormen een gevaar voor de volksgezondheid door de productie van toxines. Het species B. cereus bijvoorbeeld is volgens het WHO (World Health Organization) verantwoordelijk voor 5 à 10% van alle voedselvergiftigingen (McGuiggan et al., 2002). Ook van andere Bacillus species, zoals B. subtilis en B. licheniformis, is reeds gekend dat ze voedselvergiftigingen kunnen veroorzaken (Schmitz, 2002).

Aangezien Bacillus cereus een belangrijk pathogeen species is in de zuivelindustrie wordt het hier meer in detail besproken.

II.3. Het species Bacillus cereus

II.3.1. Taxonomie van de ‘Bacillus cereus groep’

De ‘Bacillus cereus groep’ omvat zes nauw verwante species: B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides en B. weihenstephanensis (Bavykin et al., 2004).

Vijf van die species hebben een belangrijke invloed op de mens, drie in negatieve zin en twee in positieve zin. B. anthracis en B. cereus zijn gekende pathogenen van zoogdieren, waaronder ook de mens. B. weihenstephanensis groeit bij zeer lage temperaturen (4°C) waardoor dit species problemen veroorzaakt bij koel bewaard voedsel (Mayr et al., 1999; Páĉová et al., 2003). B. thuringiensis is zeer nuttig als biologisch insecticide en B. mycoides bevordert de groei van planten (Cherif et al.; 2003).

De species van de ‘Bacillus cereus groep’ zijn zeer nauw verwant aan elkaar. Dit wordt duidelijk aangetoond door de 16S rRNA‐sequentiesimilariteit (zelfs groter dan 99%) (Ash et al., 1991; Bavykin et al., 2004). Traditioneel worden de species van elkaar onderscheiden op basis van morfologische, fysiologische en immunologische gegevens. Er zijn echter problemen met deze vorm van classificatie. Zo wordt B. thuringiensis bijvoorbeeld onderscheiden van B. cereus door de productie van een proteïnekristal dat schadelijk is voor insecten. De informatie voor dit proteïnekristal bevindt zich op een plasmide (Turnbull et al., 2002). Dit plasmide kan waarschijnlijk echter uitgewisseld worden met een ander species, bijvoorbeeld B. cereus (Bavykin et al., 2004). B. mycoides wordt gekenmerkt door een rhizoïde koloniemorfologie. Onder bepaalde omstandigheden echter, kan B. mycoides deze typische kolonievorm verliezen waardoor dit species niet meer te onderscheiden valt van B. cereus (Bavykin et al., 2004).

Het is dus heel moeilijk om deze species van elkaar te onderscheiden, zowel op fenotypisch als op genotypisch niveau. Toch is een duidelijke classificatie nodig gezien de impact die de species hebben op de menselijke activiteiten (Cherif et al., 2003). Recent zijn er studies verschenen waarin beschreven wordt dat een eenduidig onderscheid tussen de species van de ‘Bacillus cereus groep’ zou kunnen gemaakt worden op basis van rep‐PCR‐fingerprintpatronen (Kim et al., 2001; Cherif et al., 2003); ook 16S rRNA‐sequenties zouden in bepaalde regio’s toch voldoende variatie bevatten om de verschillende species te herkennen (Bavykin et al., 2004).

II.3.2. Bacillus cereus in de zuivelindustrie

II.3.2.1. Insleep in de melk

In bovenstaande is reeds vermeld dat lucht, bodem, gras, stro (bedding van in de stallen), veevoeder (hooi, silage, krachtvoer en bieten), drinkwater, feces en de uiers van de koeien mogelijke contaminatiebronnen van rauwe melk zijn. Daarvan zijn de voornaamste bronnen voor B. cereus de bodem en feces (te Giffel et al., 1995; Christiansson et al., 1998). Net als alle andere aërobe sporenvormers kan B. cereus pasteurisatie overleven. De melk kan echter ook na pasteurisatie gecontamineerd worden met B. cereus sporen die aanwezig zijn in de zuivelfabriek (Meer et al., 1991).

Er blijkt een seizoenale variatie te zitten in het aantal Bacillus cereus sporen die in de rauwe melk terechtkomen met een maximum in de zomer/late herfst (Christiansson et al., 1998). Dit staat in correlatie met de bevindingen van Slaghuis et al. (1997): in de graasperiode (zomer) is er een groter aantal sporen van B. cereus in de rauwe melk terug te vinden dan wanneer de koeien op stal staan (winter). Bacillus cereus wordt traditioneel beschouwd als een mesofiel maar recente studies tonen aan dat veel B. cereus stammen ook psychrotroof zijn (Páĉová et al., 2003).

II.3.2.2. Invloed van Bacillus cereus op de melk

In II.2.4 staan de problemen vermeld die men in de zuivelindustrie ondervindt door aërobe sporenvormers. Hier zal dieper worden ingegaan op de productie van toxines door B. cereus. Men onderscheidt bij B. cereus twee duidelijk verschillende vormen van voedselvergiftiging: het diarree‐type en het emetische type (Tabel 4).

Tabel 4. Vergelijking tussen twee types voedselvergiftiging veroorzaakt door B. cereus (Granum and Lund, 1997).

Diarree‐type Emetisch type Infectieve dosis 105‐107 cellen/g voedsel 105‐108 cellen/g voedsel Plaats van de toxineproductie Dunne darm van de gastheer In het voedsel Type toxine Peptiden Cyclisch peptide Incubatieperiode 8 à 16 u 0.5 à 5 u Duur van de ziekte 12 ‐ 24 u 6 ‐ 24 u

Symptomen Buikpijn, waterige diarree, soms gepaard met misselijkheid

Misselijkheid, braken

Voedsel Vlees, soep, groenten, puddingen, sauzen, melk en melkproducten

Gebakken en gekookte rijst, pasta en noodles

II.3.2.2.1. Het emetische toxine Het emetische toxine cereulide is een exotoxine dat wordt gevormd in het voedsel voordat het wordt gegeten. Cereulide bestaat uit een ringstructuur van drie repeats van 4 amino‐ en oxyzuren: [cyclo(D‐O‐Leu‐D‐Ala‐L‐O‐Val‐L‐Val) 3]. Het cereulide is heel hitteresistent en ongevoelig voor pH‐schommelingen en proteasen (Granum and Lund, 1997; Agata et al., 2001).

II.3.2.2.2. Het diarree toxine Dit is een enterotoxine en wordt door B. cereus geproduceerd in de gastheer, meer bepaald in de dunne darm. Er zijn 5 verschillende types enterotoxines van B. cereus gekend; hun eigenschappen worden samengevat in Tabel 5 (Granum and Lund, 1997; in ’t Veld et al., 2000; Phelps et al., 2002).

Tabel 5. Enterotoxinen geproduceerd door B. cereus (Granum, 2002). Toxine Grootte Voedselvergiftiging

Haemolysine BL (Hbl) 3 componenten Waarschijnlijk Nonhaemolytic enterotoxin (Nhe) 3 componenten Ja Enterotoxin T (BceT) 1 component, 41 kDa ? Enterotoxin FM (EntFM) 1 component, 45 kDa ? Cytotoxin K (Cyt K) 1 component, 34 kDa ja, 3 doden

II.4. Biologische versus conventionele melkveebedrijven

In het project waarbinnen deze thesis kadert, worden biologische melkveebedrijven vergeleken met conventionele. Deze verschillende manieren van bedrijfsvoering hebben mogelijks een invloed op de sporenflora in de rauwe melk.

In België heeft de biologische landbouw een enorme opmars gekend in de periode van 1987 tot 2001: van 109 biologische bedrijven (waarvan 72 in Vlaanderen) naar 694 (waarvan 253 in Vlaanderen). Dit is echter nog altijd maar 1.47% van het totale aantal landbouwbedrijven in België. De laatste jaren is er eerder een stagnatie van het aantal biologische landbouwbedrijven (Statistics Belgium, 2005). In 2003 waren er 233 biologisch landbouwbedrijven in Vlaanderen en daarvan zijn er 23 biologische melkveebedrijven. Deze laatste vormen de coöperatie ‘Biomelk Vlaanderen’. De biomelk wordt opgehaald door een zelfstandige melkophaler en 60% ervan wordt vervoerd naar het zuivelbedrijf MIK in Kruishoutem, op dit ogenblik de enige Vlaamse biomelkerij. 30% van de biomelk wordt geleverd aan het conventionele melkveebedrijf Olympia in Herfelingen. De overige 10% van de melk wordt op de boerderij zelf verwerkt tot hoeveproducten of wordt aan de kaasmakerij in Passendale verkocht (Vilt, 2005).

In de biologische landbouw wordt gestreefd naar een natuurlijk evenwicht tussen plant, dier en bodem. Om dit doel te bereiken is er een algemene Europese reglementering opgesteld (Integra, 2005). Daarvan zijn twee punten van belang in verband met dit project:

1) biologische landbouw is grondgebonden en

2) er mogen slechts een beperkt aantal dieren per oppervlakte‐eenheid gehouden worden.

Het eerste punt is van betekenis voor het veevoeder. Koeien van biologische melkveebedrijven mogen namelijk enkel gevoederd worden met biologisch geteeld voeder. Dit bestaat voor 95% uit inheemse biolandbouwgewassen. Onder strikte voorwaarden is ook een beperkte hoeveelheid conventioneel voeder toegestaan (Integra, 2005).

In de conventionele veeteelt zal men veelal gebruik maken van geïmporteerd voeder, waarin dus ook exotische gewassen zoals maniok, citruspulp en kokosnotenmeel verwerkt kunnen zijn. Dit brengt met zich mee dat er ongekende sporenvormers, afkomstig van het buitenland, in het voeder aanwezig kunnen zijn en vandaar uit in de melk terechtkomen.

Er werd immers reeds aangetoond dat voeder een contaminatiebron van sporen in rauwe melk kan zijn (Vaerewijck et al., 2001).

Het tweede punt, een beperkt aantal dieren per oppervlakte‐eenheid, zal naar alle waarschijnlijkheid een rol spelen bij de bevuiling van de uier. Veel dieren op een klein oppervlak betekent grotere bevuiling van de bodem met feces. Daardoor kunnen de uiers sneller vervuild raken, wat misschien zijn invloed zal hebben op het aantal bacteriën in de melk. Er is immers reeds aangetoond dat ook bodem en feces belangrijke contaminatiebronnen zijn (te Giffel et al., 1995; Christiansson et al., 1998).

II.5. Bespreking van gebruikte karakteriseringstechnieken

II.5.1. FAME(fatty acid methyl ester)‐analyse

Net als alle andere cellulaire levensvormen hebben bacteriën een cytoplasmamembraan die voor ongeveer 50% uit lipiden bestaat. De membraanlipiden zijn een diverse groep van moleculen (glycerolesters) die gebruikt kunnen worden voor de identificatie en classificatie van micro‐organismen. Microbiële vetzuren vertonen een grote variabiliteit die onder andere wordt bepaald door de ketenlengte, het aantal dubbele bindingen en de positie(s) ervan en de aard van de zijketen(s) (Vandamme et al., 1996). FAME‐analyse is een chemotaxonomische karakteriseringstechniek die gebaseerd is op de analyse van de vetzuursamenstelling van de membranen van bacteriën. Het is een snelle methode waarbij de gemethyleerde vetzuursamenstelling van een ongekend isolaat gas‐chromatografisch wordt bepaald. De identiteit van het isolaat wordt bekomen door het opgemeten spectrum zowel kwalitatief als kwantitatief te vergelijken met de spectra van de commerciële MIDI‐databank (Microbial ID Inc., Newark). Er zijn echter een aantal beperkingen aan deze FAME‐analyse.

‐ De vetzuursamenstelling van bacteriën is o.a. afhankelijk van het groeimedium, de groeitemperatuur en de groeiperiode. Deze parameters moeten bijgevolg sterk gestandaardiseerd worden om tot reproduceerbare resultaten te komen (Stead et al., 1992).

‐ De taxonomische resolutie van FAME is afhankelijk van het taxon dat bestudeerd wordt. Sommige taxa hebben voldoende diversiteit in vetzuursamenstelling om tot op speciesniveau te worden ingedeeld, bij andere kan slechts een onderscheid tot op genusniveau worden gemaakt (Vandamme et al., 1996). Bacillus sensu lato is een groep waarbinnen geen onderscheid tot op speciesniveau kan gemaakt worden met FAME‐analyse, wel tot op het niveau van speciesgroepen (Kämpfer, 1993).

‐ Het aantal referentiespectra dat in de commerciële MIDI‐databank is opgenomen en waarmee de spectra van de onbekenden kunnen vergeleken worden, is beperkt.

De naamgevingen door FAME van de onbekende isolaten die in deze thesis worden geanalyseerd (< Bacillus sensu lato) zijn dus niet altijd correct, zeker niet tot op speciesniveau.

Er zijn 2 redenen waarom deze screeningsmethode hier dan toch wordt aangewend.

‐ FAME‐analyse levert een eerste indeling van de isolaten op, die reeds een beeld van de bacteriële populatiesamenstelling van een staal kan weergeven. Bovendien kan deze indeling aangewend worden om de verdere identificatie van de isolaten efficiënter uit te voeren.

‐ Van de onbekende isolaten uit de melk wordt het vetzuurspectrum niet alleen vergeleken met de commerciële MIDI‐databank maar ook met de interne

vetzuurdatabank van het Laboratorium voor Microbiologie ‐ Gent. Zo kan onrechtstreeks misschien een juister beeld van de identiteit van de onbekende isolaten gevormd worden dan met het MIDI‐identificatiesysteem alleen mogelijk is.

II.5.2. Rep‐PCR

Verspreid in het bacteriële genoom van diverse bacteriële species bevinden zich repetitieve DNA‐sequenties bv. REP(repetitive extragenic palindromic)‐, ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)‐ en (GTG)5‐sequenties (Versalovic et al., 1991).

Deze repetitieve sequenties kunnen gebruikt worden als efficiënte bindingsplaatsen voor specifieke primers in een PCR‐reactie. Zo kunnen fingerprints geproduceerd worden van het bacteriële genoom (de Bruijn et al., 1996; Herman et al., 1997; Van Belkum et al., 1998).

De PCR‐reactie

PCR is een in vitro, cyclisch en exponentieel toenemend DNA‐amplificatieproces. Op korte tijd is het mogelijk een grote hoeveelheid van een specifiek DNA‐fragment te synthetiseren, uitgaande van

‐ een kleine hoeveelheid dubbelstrengig DNA template, ‐ 2 oligonucleotiden (primers) die complementair zijn aan de uiteinden van het te

amplificeren DNA‐fragment, ‐ deoxynucleotidetrifosfaten en ‐ een thermostabiel DNA‐polymerase.

Klassiek bestaat de PCR‐reactie uit drie stappen bij verschillende temperaturen.

‐ Denaturatie: de dubbelstrengige template DNA wordt gescheiden in 2 enkelstrengen bij een temperatuur van 94°C.

‐ ‘Annealing’: de temperatuur wordt verlaagd tot 55 à 70°C (de temperatuur is primer‐specifiek) zodat de primers kunnen binden met de enkelstrengen.

‐ Synthese: verlenging van de primers vanaf hun 3’‐OH‐uiteinde door aanbouw van nucleotiden door het DNA‐polymerase.

Deze 3 stappen worden cyclisch herhaald, zo’n 30 tot 35 keer. Iedere nieuw gesynthetiseerde streng bevat ook een bindingsplaats voor een primer en wordt dus zelf ook gerepliceerd. Er treedt een exponentiële toename van identieke DNA‐fragmenten op. In Fig. 8 wordt een schematisch overzicht van de PCR‐reactie gegeven.

Target DNA

denaturatie

primer annealing

elongatie

denaturatie en annealing

repetitieve PCR cycli

1ste cyclus

2de cyclus

Fig. 8. Schematische voorstelling van de 3 stappen in een PCR-reactie.

5’

3’

III. Materiaal en Methoden

III.1. Uittesten van de isolatieprocedure

III.1.1. Cultuurbodems

III.1.1.1. Principe

Tijdens de isolatie van de aërobe sporenvormers uit melk werd gebruik gemaakt van een nutriëntrijke bodem en van enkele electieve bodems. Met electieve bodems konden enzymatische eigenschappen van de bacteriën aangetoond worden door middel van een specifiek groeipatroon. Die cultuurbodems werden vooraf uitgetest en geoptimaliseerd voor het bekomen van specifieke groeipatronen en apart te onderscheiden kolonies.

III.1.1.2. Gebruikte media en reagentia

Tenzij anders vermeld, geldt voor alle media dat:

- na samenbrengen van de ingrediënten het mengsel opgekookt werd in de microgolfoven tot een heldere oplossing,

- er gesteriliseerd werd gedurende 15 minuten bij 121°C in een autoclaaf, - na afkoeling tot 50°C in een warmwaterbad 1 ml filtergesteriliseerde vitamine B12‐

oplossing (conc. 1 mg/ml) (Sigma) per liter medium werd toegevoegd, - de media na afkoeling in een laminaire flow werden uitgegoten in petriplaten (∅ 90

mm).

♦ Vloeibaar BHI‐medium: 37 g ‘Brain Heart Infusion’ poeder (Oxoid) werd opgelost in 1 l gedestilleerd water. Dit mengsel werd verdeeld over buisjes van 10 ml en niet opgekookt in de microgolfoven maar rechtstreeks in de autoclaaf geplaatst.

♦ Vaste BHI‐bodem: ofwel werden 37 g ‘Brain Heart Infusion’ poeder en 1,5% ‘Bacteriological Agar’ (Oxoid) opgelost in 1 l gedestilleerd water ofwel werd 47 g ‘BHI Agar’ (Oxoid) opgelost in 1 liter gedestilleerd water. BHI‐medium is een complex medium, heel rijk aan nutriënten.

♦ SM‐bodem: 40 g ‘Skim Milk poeder’ (Oxoid) werd opgelost in 0.5 l gedestilleerd water. Dit mengsel werd niet opgekookt en werd slechts 5 minuten lang bij 121°C gesteriliseerd (niet langer, om karamelisatie te voorkomen). 17.5 g ‘Plate Count Agar’ (Oxoid) werd opgelost in 0.5 l gedestilleerd water, opgekookt en gedurende 15 minuten gesteriliseerd bij 121°C. Na afkoelen tot 50°C werden beide mengsels bij elkaar gegoten en geschud. De finale concentratie van het ‘Skim Milk’ poeder werd dus 4%. Nadien werd het medium verdeeld over petriplaten.

Op analoge wijze werden ook 10%‐, 8%‐, 6%‐ en 2%‐bodems werden aangemaakt. Het SM‐medium is een electief medium waarop caseïne‐afbraak kan worden aangetoond.

♦ NA + egg yolk‐bodem: 28 g ‘Nutriënt Agar’ (Oxoid) en 1% NaCl (Merck) werden opgelost in 920 ml gedestilleerd water. Naast 1 ml filtergesteriliseerde vitamine B12‐oplossing werd na afkoeling tot 50°C ook 80 ml ‘Egg Yolk Emulsion’ (Oxoid) toegevoegd. Er werden eveneens NA + egg yolk‐bodems aangemaakt zonder NaCl. Het NA + egg yolk‐medium is een electief medium dat fosfolipolyse‐activiteit aantoont.

♦ TA‐bodem: = ‘Tributyrin Agar’ bodem: 5 g ‘Peptone Bacteriological’ (Oxoid), 3 g ‘Yeast Extract’ (Oxoid) en 12 g ‘Agar Bacteriological’ (Oxoid) werden opgelost in 1 l gedestilleerd water. Na afkoelen tot 50°C werd naast vitamine B12‐oplossing ook 9.6 ml filtergesteriliseerde glyceryl tributyraat (Sigma) toegevoegd. Dit electief medium toont lipase‐activiteit aan.

♦ BHI + X‐gal‐bodem: deze bodem werd op dezelfde manier gemaakt als de BHI‐bodem. Nadat de platen gegoten en gedroogd waren, werden ze met behulp van een Trigalskispatel op steriele wijze (in ethanol dopen en afbranden) bestreken met 35 µl X‐gal (= 5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐beta‐D‐galactopyranoside) (50 mg/ml) (Invitrogen) en 20 µl IPTG (isopropylthiogalactoside) (23.8 mg/ml) (Gibco). Als het isolaat het enzyme β‐galactosidase aanmaakt, wordt dit zichtbaar door een blauwkleuring van de kolonie.

♦ Ringeroplossing: 1 tablet Ringer (Oxoid) werd opgelost in 0.5 l gedestilleerd water en vervolgens geautoclaveerd gedurende 15 minuten bij 121°C. Ringeroplossing is een isotonische zoutoplossing.

III.1.1.3. Gebruikte stammen

De stammen, die in de voorbereiding gebruikt werden, komen uit de MB(Moleculaire Biologie)‐collectie van het CLO‐DVK in Melle (Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek ‐ Departement voor de Kwaliteit van Dierlijke Producten). De micro‐organismen in die collectie worden bewaard op parels in vials (VWR) bij –80°C. Na ontdooien van een vial met de gewenste stam werd er met behulp van een steriele tandenstoker één parel overgebracht in een buisje met 10 ml vloeibaar BHI‐medium. Het buisje werd gedurende 24 u geïncubeerd bij de geschikte groeitemperatuur. Elke dag werd het medium van de stammen ververst door 100 µl van het oude buisje te pipetteren in een nieuw buisje met vers medium. De

gebruikte stammen behoren allen tot het genus Bacillus. In Tabel 6 (Appendix I) wordt een overzicht gegeven van de eigenschappen van de stammen.

III.1.1.4. Werkwijze

Tenzij anders vermeld, geldt voor elke MB‐stam dat eerst een verdunningsreeks in ringeroplossing werd aangelegd van 10‐4 tot 10‐7. Er werd vertrokken van het buisje met een in vloeibaar BHI‐medium gegroeide cultuur.

Daarvan werd 100 µl overgebracht in een epje (Eppendorfvaatje) met 900 µl ringeroplossing. Dit epje werd krachtig geschud (vortex) en vervolgens werd opnieuw 100 µl overgebracht in een volgend epje met 900 µl ringeroplossing.

Zo werd een verdunningsreeks aangelegd tot 10‐7, zoals weergegeven in Fig. 9.

Per verdunning werd telkens 100 µl uitgestreken op de groeibodems.

Fig. 9. Aanleggen van een verdunningsreeks.

III.1.1.4.1. β‐galactosidase‐activiteit

Bacillus cereus MB 2570 en Bacillus licheniformis MB 392 werden apart uitgeplaat op BHI + X‐gal‐bodem. De petriplaten werden gedurende 24 u geïncubeerd bij 30°C.

III.1.1.4.2. Lipase‐activiteit

B. cereus MB 2570 en B. subtilis MB 11 werden apart uitgeplaat op TA‐platen en 24 u geïncubeerd bij 30°C.

100

BHI

100µl

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl

10 ml

1 ml

III.1.1.4.3. Fosfolipase‐activiteit

B. licheniformis MB 392 en B. cereus MB 1308 en MB 2570 werden apart uitgeplaat op NA + egg yolk‐platen met 1% NaCl. Ook werd op één enkele NA + egg yolk‐plaat 50 µl van de 10‐5‐oplossing van B. licheniformis MB 392 en 50 µl van de 10‐5‐oplossing van B. cereus MB 2570 uitgestreken. Op de NA + egg yolk‐platen zonder NaCl werden B. coagulans MB 368 en B. cereus MB 2570 apart uitgestreken. De platen werden gedurende 24 u geïncubeerd bij 30°C. Van sommige stammen (B. coagulans MB 368) is gekend dat zij verminderde groei vertonen bij bepaalde NaCl‐concentraties (Gordon et al., 1973). Deze test zou aanwijzen of dit reeds bij een concentratie van 1% NaCl het geval was.

III.1.1.4.4. Caseïnehydrolase‐activiteit

B. cereus MB 1308 en MB 2570, B. lentus MB 9 en B. subtilis MB 11 werden apart uitgestreken op alle SM‐platen (10%, 8%, 6%, 4% en 2%). Ook werd van elk van deze 4 stammen 25 µl van de 10‐6 verdunning samen op één van elk van de verschillende SM‐platen gebracht en uitgestreken. De petriplaten werden 24 u geïncubeerd bij 30°C.

III.1.2. Melkafbraak

III.1.2.1. Principe

In het melkafbraakproces wordt de melk (na pasteurisatie) chemisch of enzymatisch afgebroken. Dit om twee redenen (Herman et al., 1997):

‐ melk kan op de groeimedia een film vormen die de groei van bepaalde stammen eventueel kan inhiberen of die kan interfereren met het karakteristieke kolonie‐uitzicht op de electieve platen,

‐ na het melkafbraakproces bevinden de sporen zich in een volume dat ongeveer 10 x kleiner is dan het oorspronkelijke volume (zie III.2.3.), met andere woorden, de sporen zijn meer geconcentreerd. Bepaalde stammen die niet zo abundant in de melk aanwezig zijn, kunnen op die manier toch gedetecteerd worden.

Nu is het nuttig om vooraf te weten 1) hoeveel tijd het afbraakproces in beslag neemt en 2) in hoeverre de melkfilm de groei van bacteriën beïnvloedt. III.1.2.2. Gebruikte media en reagentia

♦ SM‐medium (4%‐platen) (Oxoid). ♦ NH3 (25% ‐ pro analyse) (Merck). ♦ Petroleumether (Vel NV).

♦ Diethylether (Vel NV). ♦ SDS (10%) (= sodium dodecyl sulfaat) (Gibco BRL). ♦ Melk: volle UHT‐melk (GB, witte producten). ♦ Ringeroplossing (Oxoid). III.1.2.3. Gebruikte stam

Bacillus cereus MB 2570, opgegroeid in vloeibaar BHI‐medium.


Van een B. cereus MB 2570 cultuur (gedurende 24 u opgegroeid in vloeibaar BHI‐medium) werden in epjes 3 verdunningsreeksen aangelegd van 10‐4 tot 10‐7:

‐ één in ringeroplossing, ‐ één in UHT‐melk en ‐ één in UHT‐melk die nadien afgebroken werd.

In deze laatste reeks werd de melk chemisch afgebroken volgens een proces afgeleid van het protocol beschreven door Herman et al. (1994): aan elke verdunning werden, per ml, volgende reagentia toegevoegd:

‐ 27 µl NH3, ‐ 65 µl diethylether, ‐ 150 µl petroleumether, ‐ 14 µl SDS.

Vervolgens werden de epjes 15 minuten gecentrifugeerd aan 9500 g. Na centrifugatie bevonden de sporen zich in de pellet, samen met nog ongeveer 1% van de melkproteïnen. De overige melkcomponenten bleven in het supernatans dat afgepipetteerd werd. Om de chemische substanties die zich nog in de pellet bevonden te verwijderen, werd de pellet gesuspendeerd in 1 ml ringeroplossing en opnieuw, gedurende 15 minuten, gecentrifugeerd aan 9500 g. Deze laatste stap werd nog eens herhaald. Aangezien er werd uitgegaan van 1 ml melk werden de bacteriën niet geconcentreerd. Dit was niet nodig omdat de melk geïnoculeerd was met voldoende B. cereus MB 2570 cellen.

Van elke verdunning van de drie verdunningsreeksen werd telkens 100 µl apart uitgestreken op 4%‐SM‐platen. Deze platen werden gedurende 24 u geïncubeerd bij 30°C.

III.1.3. Visualiseren van de kolonies met zuren

III.1.3.1. Principe

Op SM‐bodem is de zichtbaarheid van de kolonies niet altijd optimaal. Deze testen zijn uitgevoerd om 1) na te gaan of de heldere zones rond de kolonies van caseïnehydrolase positieve stammen op SM‐bodem beter zichtbaar konden gemaakt worden met een zuurbehandeling (Wiedmann et al., 1999) en 2) of de leefbaarheid van de stammen door de zuurbehandeling werd beïnvloed.


♦ HCl (37%) (Merck). ♦ CH3COOH (100%) (Merck). ♦ 4%‐SM‐medium (Oxoid). ♦ HPLC‐water (= gesteriliseerd ELGA‐water). ♦ Ringeroplossing.

III.1.3.3. Gebruikte stammen

Bacillus lentus MB 9 cultuur in vloeibaar BHI‐medium en Bacillus cereus MB 2570 cultuur in vloeibaar BHI‐medium.


25 ml CH3COOH werd opgelost in 225 ml HPLC‐water en 24.6 ml HCl werd opgelost in 225.4 ml HPLC‐water. Van een B. lentus MB 9 en een B. cereus MB 2570 cultuur (overnacht opgegroeid in vloeibaar BHI‐medium) werden verdunningsreeksen in ringeroplossing aangelegd van 10‐4 tot 10‐7. Van deze verdunningen werd telkens 100 µl uitgespreid op SM‐platen. Deze platen werden 24 u geïncubeerd bij 30°C. Vervolgens werd één plaat overgoten met de CH3COOH‐oplossing en een andere plaat met de HCl‐oplossing. De zuren werden meteen van de platen verwijderd.

III.2. Isolatie van de aërobe sporenvormers uit melk

III.2.1. Inleiding

In deze thesis werd de aërobe sporenvormende flora in rauwe melk vergeleken tussen vier conventionele en vier biologische melkveebedrijven. Van elk bedrijf werd op steriele wijze een staal van 100 ml rauwe melk genomen tijdens de herfstperiode (september‐oktober). Van de biologische melkveebedrijven werden isolaten uit melk en uit afgebroken melk geïsoleerd, van de conventionele melkveebedrijven werd enkel uit melk geïsoleerd. Verder volgt de werkwijze voor de verwerking van één enkel staal.

III.2.2. Gebruikte media en reagentia

♦ De BHI‐, NA + egg yolk‐ en 4%‐SM‐media werden zowel in grote (∅: 140 mm) als in kleine (∅: 90 mm) petriplaten gegoten.

♦ Ringeroplossing. ♦ NH3 (25% ‐ pro analyse). ♦ Petroleumether. ♦ Diethylether. ♦ SDS (10%).

III.2.3. Werkwijze

Bepalen van het totale kiemgetal 1 ml rauwe melk werd op steriele wijze verspreid over een petriplaat (∅: 140 mm) met BHI‐medium. De BHI‐plaat werd 72 u geïncubeerd bij 37°C.

Pasteuriseren van de melk De rauwe melk werd gedurende 10 minuten op 80°C (in een warmwaterbad) gehouden. Door dit verhittingsproces werden nagenoeg alle vegetatieve cellen afgedood terwijl de sporen overleven (Madigan et al., 2000). Daarna werd het melkstaal afgekoeld op ijswater gedurende ongeveer 15 minuten.

Bepalen van het totale sporengetal 500 µl van de gepasteuriseerde melk werd op een steriele manier overgebracht op een BHI‐plaat (∅: 140 mm) en geïncubeerd bij 37°C gedurende 72 u.

Uitplatingen van de onderstaande verdunningsreeksen werden in drievoud uitgevoerd om bij drie verschillende temperaturen (20, 37 en 55°C) te kunnen incuberen voor isolatie van psychrotrofen, mesofielen en thermofielen. De incubatieperiode was telkens 72 u.

Verdunningsreeks zonder melkafbraak Uitgaande van 100 µl gepasteuriseerde melk werd een verdunningsreeks van 10‐1 tot 10‐3 aangelegd in ringeroplossing. Van die verdunningsreeks werd telkens 100 µl uitgestreken op platen (∅: 90 mm) met de BHI‐, 4%‐SM‐ en NA + egg yolk‐media.

Verdunningsreeks met melkafbraak 50 ml van de gepasteuriseerde melk werd chemisch afgebroken op een zelfde manier als tijdens de voorbereiding (III.1.2.4.) maar met aangepaste volumes voor 50 ml melk. De pellet werd nu echter niet gesuspendeerd in 50 ml maar in 5 ml ringeroplossing. Op die manier werd een (ongeveer) 10 x verhoogde sporenconcentratie bekomen, waarvan 500 µl werd uitgestreken op de petriplaten (∅: 140 mm) met de drie verschillende media. Van een verdunningsreeks (100 tot 10‐3) werd telkens 100 µl uitgestreken op petriplaten (∅: 90 mm) met diezelfde drie media.

III.2.4. Schematisch overzicht van de werkwijze voor de verwerking van een melkstaal (Fig.

10)

Fig. 10. Overzicht van de werkwijze voor de verwerking van één melkstaal.

Melkstaal

Totaal kiemgetal Pasteurisatie10 min bij 80°C

Totaal sporengetal

Verdunningsreeks zonder melkafbraak

Verdunningsreeksmet melkafbraak

Incubatie37°C, 72u

Incubatie20, 37 en 55°C,

72u

III.2.5. Oppikken van de isolaten en uitzuivering

Na incubatie gedurende 72 u werden de platen geanalyseerd:

‐ kiem‐ en sporengetal werden bepaald en ‐ per plaat werden de verschillende kolonies geselecteerd op basis van kolonie‐

morfologie en uitgezuiverd (op de electieve media werden enkel die kolonies geïsoleerd die de eigenschap waarvoor geselecteerd werd vertoonden).

Na uitzuivering werden de isolaten overgebracht in buisjes (Yfsolab) van 1.5 ml die een mengsel van vloeibaar BHI‐medium en 15% glycerol (Merck) bevatten. Dit werd in tweevoud gedaan: één keer voor de onderzoekscollectie van het DVK en één keer voor het Laboratorium voor Microbiologie ‐ Gent. De buisjes werden bewaard bij een temperatuur van –80°C.

III.3. Identificatie van de isolaten

III.3.1.Voorbereiding

III.3.1.1. Principe

Voordat het taxonomisch onderzoek werd aangevat, werd de collectie afkomstig van het DVK overgebracht naar de R(Research)‐collectie van het Laboratorium voor Microbiologie ‐ Gent.

III.3.1.2. Benodigdheden

♦ MicrobankTM‐vials met parels en cryoprotectant (één rode en één groene vial per isolaat).

♦ TSA‐medium: 40 g Tryptone Soya Agar (Oxoid) werd opgelost in 1 l gedestilleerd water en geautoclaveerd gedurende 20 minuten bij 121°C. Na afkoeling in warmwaterbad (50°C) werden de platen gegoten en een half uur gedroogd.


De buisjes met de isolaten van het DVK werden ontdooid. Na ontdooiing werd een steriele swab in de buisjes gebracht die dan uitgestreken werd op TSA‐platen. Die platen werden 24 u geïncubeerd bij dezelfde temperatuur als tijdens de isolatie. De isolaten werden na die 24 u nog eens overgeënt op TSA en na 24 u incuberen op zuiverheid gecontroleerd. Daarna werd met behulp van een steriele swab een hoeveelheid biomassa van de TSA‐platen gehaald en op steriele wijze in een MicrobankTM‐vial gebracht. Hierbij werd de swab zorgvuldig over alle parels in de vial gestreken. De micro‐organismen die via de swab in de vial terechtkwamen, bleven als het ware plakken op de poreuze parels. Dit werd in duplo uitgevoerd (groene en rode vials). Van de groene vials werd de cryopreservatieve vloeistof afgepipetteerd om later sneller te kunnen ontdooien indien men het micro‐organisme opnieuw nodig heeft. De rode vials kunnen beschouwd worden als reserve vials. De vials werden bewaard bij –80°C.

III.3.2. FAME – fatty acid methyl ester analysis

III.3.2.1. Principe

Voor de identificatie van bacteriële culturen door middel van FAME‐analyse volgens het Sherlock Microbial Identification System van MIDI, werden vetzuren uit bacteriële culturen geëxtraheerd. Volgende stappen kunnen onderscheiden worden (Microbial ID Inc., Newark, USA; Operating Manual version 3.0).

- Stap 1: kweken en oogsten De bacteriële culturen worden gekweekt volgens specifieke voorwaarden (temperatuur en tijd) op een specifiek medium (TSA‐VZ) en geoogst.

- Stap 2: saponificatie Een sterk basische methanolische oplossing gecombineerd met hitte lyseert de cellen. De vetzuren worden losgemaakt van de lipiden uit de cellen en worden omgezet tot hun natriumzouten.

- Stap 3: de methylatie Een methanol/HCl‐oplossing zet de natriumzouten van de vetzuren om in vluchtige methylesters van de vetzuren.

- Stap 4: de extractie Met behulp van een organisch reagens worden de methylesters van de vetzuren geëxtraheerd uit de zure waterige oplossing in een organische fase.

- Stap 5: het wassen Een milde basische oplossing extraheert storende residuen van reagentia uit de organische fase in de waterige fase. Deze residuen kunnen de chromatografische analyse beschadigen en verminderde detectie van methylesters van de hydroxyvetzuren veroorzaken.


♦ De reagentia 1 – 4 voor de vetzuurmethylbereiding werden centraal aangemaakt om optimale reproduceerbaarheid te garanderen.

- Reagens 1: 150 ml milliQ‐water + 150 ml methanol (Merck) + 45 g NaOH (Merck). - Reagens 2: 275 ml methanol (Merck) + 325 ml HCl‐oplossing (6N) [(HCl 32%)

(Merck) opgelost in milliQ‐water)]. - Reagens 3: 200 ml n‐hexaan (Merck) + 200 ml tertiair‐butylmethylether (Merck). - Reagens 4: 900 ml milliQ‐water + 10.8 g NaOH (Merck).

♦ TSA‐medium: zie hoger.

♦ TSA‐VZ‐medium: 30 g TrypticaseTM Soy Broth (BBLTM) en 15 g Bacto‐AgarTM (BBLTM) werden opgelost in 1 l gedestilleerd water en opgekookt tot helder. Nadien werd de oplossing gedurende 15 minuten geautoclaveerd (121°C). Na afkoeling tot 50°C in warmwaterbad werd het medium uitgegoten in petriplaten.

III.3.2.3. Gebruikte stam

Stenotrophomonas maltophilia LMG 958 werd ingesloten als referentie bij elke analysereeks. Het is een stam waarvan het vetzuurspectrum zeer stabiel blijft in de tijd. Indien het opgemeten spectrum van LMG 958 meer dan 75% similariteit vertoonde met het S. maltophilia‐spectrum uit de MIDI‐databank, kon er van uitgegaan worden dat de bepaling van de vetzuurpatronen in de betreffende reeks volgens het gestandaardiseerde protocol correct gebeurd was.


- Kweken en oogsten van de culturen De onbekende culturen, evenals de Stenotrophomonas maltophilia LMG 958 werden geënt op TSA‐VZ‐medium volgens een uitdunningsent.

De platen werden gedurende 24 u geïncubeerd bij 28°C (de onbekenden die geïsoleerd zijn bij 20 of 37°C) of 52°C (de onbekenden die geïsoleerd zijn bij 55°C). Van alle platen werd telkens één kolonie opgepikt en opnieuw geënt, nu volgens het patroon voorgesteld in Fig. 11.

Fig. 11. Oogstpatroon voor vetzuuranalyse (Kw. = kwadrant).

De platen werden exact 24 u geïncubeerd bij de gepaste temperatuur.

Kw. I. Kw. II.

Kw. III.Kw. IV.

De cellen werden per stam met behulp van een plastic öse geoogst uit de overlapszone tussen het 2de en het 3de kwadrant en in een glazen buisje met schroefdop gebracht. De buisjes werden eventueel bij –20°C bewaard gedurende enkele dagen.

- Saponificatie Aan elk buisje werd 1 ml van reagens 1 toegevoegd en krachtig geschud (met vortex). Gedurende 5 minuten werden de buisjes in een bad kokend water geplaatst. Buisjes werden opnieuw geschud om eventueel nog vastzittende pellets los te maken. Gedurende 25 minuten werden de buisjes in een bad kokend water geplaatst. Vervolgens werden ze afgekoeld op ijs.

- Methylatie Aan elk buisje werd 2 ml reagens 2 toegevoegd. Na goed vortexen werden de buisjes gedurende 10 minuten in een warmwaterbad van

80°C geplaatst. Na die 10 minuten: onmiddellijke afkoeling op ijs.

- Extractie 1.25 ml van reagens 3 werd aan elk buisje toegevoegd. De buisjes werden gedurende 10 minuten geschud. Met een pasteurpipet werd de onderste fase (waterige oplossing) verwijderd.

- Wassen Aan elk buisje werd 3 ml van reagens 4 toegevoegd. Gedurende 5 minuten werden de buisjes geschud. 2 à 3 druppels verzadigd NaCl werden toegevoegd. Met pasteurpipet werd 2/3 van de bovenste (organische) fase afgepipetteerd en

overgebracht in een GC‐flesje. De GC‐flesjes werden vervolgens nauwkeurig gesloten en de extracten gaschromato‐

grafisch geanalyseerd.

In Fig. 12 wordt een overzicht gegeven van de hierboven beschreven stappen.

Fig. 12. Bereiding van vetzuurextracten (www.MIDI‐inc.com).

- Gaschromatografische analyse van de vetzuurextracten

De geëxtraheerde vetzuren werden geanalyseerd met een Agilent 6890 Series (USA) gaschromatograaf. De gemethyleerde vetzuren werden gescheiden op een vaste apolaire silicone fase met H2 als mobiele fase. De 5% fenyl siloxaan capillaire kolom (Hewlett‐Packard Ultra, USA) heeft een diameter van 0.2 mm en een lengte van 25 m. Het vetzuurextract werd automatisch geïnjecteerd in de kolom bij 250°C. De vervluchtigde vetzuren werden gedetecteerd via een vlamionisatie detector. De verbranding van elk ester geeft een specifiek signaal (piek). Aan de hand van de retentietijd en kwantitatieve samenstelling van de pieken in het chromatogram werd een vetzuurprofiel opgemaakt. Dit profiel werd vergeleken met de gemiddelde vetzuurprofielen van de taxa die opgenomen zijn in de MIDI‐databank (Sherlock Microbial Identification Systems, versie 3.0 ‐ Library TSBA50, version 5.00). De meest waarschijnlijke species‐ en genusidentificaties werden samen met de similariteitsindexen weergegeven.

Preparing extracts

Harvesting

Saponification

Methylation

Extraction

Wash

Third quadrant4 mm loop Coat bottom

Add 1.0 mlreagent 1 Vortex

5-10 s100°C5 min

Vortex5-10 s

100°C25 min cool

Add 2.0 mlreagent 2

Vortex5-10 s

80°C, 10 mincool rapidly

Add 1.25 mlreagent 3

Shake10 min

Removebottom phase

Savetop phase

Add 3.0 mlreagent 4

Shake5 min

Remove 2/3top phase

Transfer toGC vial

Cap

De similariteitsindex is een maat voor de betrouwbaarheid van de MIDI‐identificatie en wordt door het systeem zelf berekend. De waarden van de similariteitsindex liggen tussen 0 en 1. Een MIDI‐identificatie wordt beschouwd als goed indien de similariteitsindex groter of gelijk is aan 0.6. De vermelding *NO MATCH* wordt weergegeven wanneer de similariteitsindex kleiner is dan 0.01. Bij elke isolaat wordt een 2de species‐ en genusidentificatie gegeven indien het verschil in similariteitsindex tussen de eerste en de tweede identificatie kleiner is dan de helft van de eerste similariteitsindex.

- Computerverwerking van de vetzuurpatronen

Het computerprogramma BioNumerics (Applied Maths) liet toe om de verschillende opgemeten vetzuurprofielen met elkaar te vergelijken.

Met behulp van clusteringsalgoritmen konden de isolaten gegroepeerd worden op basis van similariteit tussen de vetzuurprofielen.

III.3.3. Rep‐PCR

Uit het melkstaal van melkveehouder 1 werden de isolaten die door het MIDI‐identificatiesysteem benoemd werden als Bacillus cereus nader bestudeerd op hun geno‐mische diversiteit via de rep‐PCR‐methode.

Bacillus cereus is een verzameling van organismen met veel verschillende genotypes die een verschillend rep‐patroon vertonen (De Clerck et al.)

Het was de bedoeling om na te gaan of het grote aantal, als B. cereus benoemde isolaten, uit de melkstalen allen behoorden tot één of meerdere genotypes.

Daarbij werden nog enkele isolaten uit melkstalen afkomstig van de melkveebedrijven 2 tot 4, eveneens als B. cereus benoemd na MIDI‐identificatie, vergeleken.

Alle isolaten van biologische melkveehouders, benoemd als Bacillus cereus, worden weergegeven in Tabel 7 (Appendix 2). De stammen die gebruikt werden voor rep‐PCR zijn aangeduid in het geel.

III.3.3.1. DNA‐isolatie

III.3.3.1.1. Principe

Voor de isolatie van het DNA wordt de extractiemethode van Pitcher gevolgd met enkele aanpassingen omdat het genus Bacillus Gram‐positief is (Pitcher et al., 1989). Zo werden de cellen behandeld met lysozyme, een enzyme dat de β‐(1‐4)‐bindingen in de peptidoglycaanketens van de celwand kan afbreken.

Lyse van de cellen gebeurt met GES‐reagens. Dit reagens bevat (1) guanidiumthiocyanaat dat denaturerend werkt op proteïnen, (2) EDTA dat divalente metaalionen chelateert waardoor Dnase‐activiteit geïnhibeerd wordt en (3) het detergent sarkosyl.

Nadien wordt ammoniumacetaat toegevoegd om de eiwitten uit te zouten en de nucleïnezuren te stabiliseren. Toevoegen van chloroform/isoamylalcohol veroorzaakt drie fasen: een chloroformfase, een interfase (onoplosbare proteïnen en celdebris) en een waterige fase met de nucleïnezuren. De waterige fase wordt afgezonderd en er wordt isopropanol aan toegevoegd. Dit reagens precipiteert het DNA. Na wassen met ethanol wordt het DNA opgelost in TE‐buffer (lichte zoutbuffer). Tenslotte wordt Rnase toegevoegd om de RNA‐moleculen af te breken.

III.3.3.1.2. Reagentia

De reagentia nodig voor DNA‐extractie werden centraal aangemaakt, volgens de ‘Standard Operating Procedure DNA‐1A’ van het Laboratorium voor Microbiologie ‐ Gent.

♦ 0.5 M EDTA (pH 8.0): 186.1 g EDTA, 20 g NaOH en 800 ml milliQ‐water werden gemengd. De pH werd gesteld door NaOH‐oplossing toe te voegen.

♦ Resuspensie‐(RS)‐buffer: aan 1 l milliQ‐water werd 8.8 g NaCl en 3.7 g EDTA toegevoegd (pH 8.0) en het geheel werd gesteriliseerd.

♦ Tris‐EDTA‐(TE)‐buffer (100x): 121 g Tris‐HCl en 200 ml EDTA (pH 8.0) werden samengevoegd en aangelengd tot 1 l met milliQ en vervolgens gesteriliseerd.

♦ Guanidiumthiocyanaat‐EDTA‐sarkosyl‐(GES)‐reagens: 60 g guanidiumthiocyanaat, 20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) en 20 ml milliQ‐water werden samengevoegd en verwarmd bij 65°C. Na afkoelen werd 1 g sarkosyl toegevoegd waarna men aanlengde tot 100 ml met milliQ.

♦ Rnase‐oplossing: 50 mg Rnase A (Qiagen) (100 mg/ml) werd in 5 ml steriel milliQ‐water verwarmd bij 100°C gedurende 10 minuten.

♦ Lysozyme‐oplossing: 50 mg lysozyme werd opgelost in 1 ml TE‐buffer. ♦ Ammoniumacetaat 7.5 M (NH4Ac). ♦ Isopropanol (Merck). ♦ Chloroform/isoamylalcohol: 24/1 (v/v). ♦ 70 % ethanol (Merck).

III.3.3.1.3. Werkwijze

- Oogsten van de cellen Bacillus stammen kunnen endosporen vormen. Die zijn niet geschikt voor DNA‐extractie en daarom werd DNA geïsoleerd uit jonge, niet‐sporulerende culturen (ongeveer 15 u oud, afhankelijk van de stam).

De cellen werden geoogst met een plastic öse (één oog vol) en in epjes van 2 ml gewassen met 500 µl RS‐buffer. Nadien werden de cellen afgecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij 17900 g. Het supernatans werd afgepipetteerd.

- Lyseren van de cellen De pellet werd gesuspendeerd in 100 µl lysozyme‐oplossing. De epjes werden gevortexet om de pellet goed los te krijgen. Nadien werden ze een uur bij 37°C geïncubeerd. 500 µl GES werd toegevoegd en de suspensie werd gemengd door op‐ en neerpipetteren tot cellyse optrad. Dan werden de epjes gedurende 10 minuten op een koelblok geplaatst.

- Onteiwitten 250 µl ijskoud NH4Ac werd toegevoegd en de epjes werden manueel gemengd tot er kleine luchtbelletjes verschenen. Nadien werden ze opnieuw 10 minuten in een koelblok geplaatst.

In de trekkast werd vervolgens 500 µl koele chloroform/isoamylalcohol toegevoegd en de epjes werden krachtig gemengd tot een homogene suspensie met een melkwitte kleur werd bekomen. Na centrifugatie gedurende 20 minuten aan 14500 g werd 700 µl van de bovenste waterige fase afgepipetteerd en overgebracht in nieuwe epjes van 1.5 ml.

- Precipitatie van het DNA 378 µl koele isopropanol werd toegevoegd en de epjes werden heel zacht geschud tot een wit wolkje (DNA) zichtbaar werd. Dan werden de epjes gecentrifugeerd aan 17900 g gedurende 10 minuten (langer indien nog geen pellet zichtbaar was). Het supernatans werd afgepipetteerd en de pellet werd 3 maal gewassen met 150 µl ethanol. Nadien werd de pellet gedroogd en heropgelost in 100 µl 1 x TE‐buffer, en gedurende 48 u bij 4°C geplaatst.

- Rnase‐behandeling Na toevoegen van 25 µl Rnase werden de oplossingen 1 uur geïncubeerd bij 37°C.

De DNA‐oplossingen konden bewaard worden bij –20°C.

III.3.3.2. Kwaliteitscontrole van het geïsoleerde DNA


DNA geschikt voor een PCR‐reactie moet zo weinig mogelijk gefragmenteerd zijn (een hoog moleculair gewicht hebben). De kwaliteit van het geïsoleerde DNA wordt geanalyseerd met behulp van agarosegelelektroforese. Onder invloed van een aangelegde spanning zullen de DNA‐fragmenten in de gel migreren. Kleinere fragmenten zullen sneller migreren dan grotere fragmenten.

Eén duidelijke band bovenaan de gel wijst op DNA met hoog moleculair gewicht, terwijl een smeer wijst op gefragmenteerd DNA.


♦ Agarose (Merck). ♦ Tris‐acetaat‐EDTA‐buffer (50x): 242 g Tris‐HCl, 57 ml ijsazijnzuur en 100 ml 0.5 M EDTA

(pH 8.0) werden samengevoegd en aangelengd tot 1 l met milliQ‐water. ♦ Loading dye (6x geconcentreerd): 4 g sucrose en 2.5 mg broomfenolblauw werden

samen opgelost in 6 ml TE‐buffer (1x) en nadien aangelengd tot 10 ml met TE‐buffer (1x). ♦ Smartladder: moleculaire merker met DNA‐fragmenten van gekende lengte; laat toe om

moleculaire gewicht van onbekende DNA‐moleculen die de gel hebben doorlopen te bepalen.

♦ Ethidiumbromide: 10 mg/ml. Intercaleert tussen de baseparen van het DNA en licht op onder ultraviolet (UV)‐licht.


- Bereiding van de gel 1% agarose werd gemengd en opgekookt in 1 x TAE‐buffer tot een heldere oplossing. Na afkoelen tot ongeveer 60°C werd de gel gegoten en de kammetjes geplaatst. Na het stollen (ongeveer half uur) werden de kammetjes verwijderd en werd de gel in een met 1 x TAE‐buffer gevulde elektroforesetank geplaatst. Hierbij moest de gel volledig ondergedompeld zijn in de TAE‐buffer.

- Voorbereiding van de stalen Van elk staaltje werd 5 µl DNA‐oplossing genomen en gemengd met 3 µl loading dye.

- Laden van de gel In elk slotje werd 8 µl DNA‐mengsel gepipetteerd; om de 10 slotjes werd 5 µl Smartladder gepipetteerd. Wanneer alle slotjes gevuld waren, werd de tank afgesloten en werd de spanning ingesteld op 70V. Na 30 à 45 minuten (wanneer de bandjes ongeveer 3/4 van de gel hadden doorlopen) werd de spanning afgelegd en de gel uit de elektroforesetank gehaald.

- Visualiseren van het DNA De gel werd gedurende 30 à 45 minuten in een kleurbad met ethidiumbromide gedompeld; nadien werd hij gewassen. Via een UV‐transilluminator werd het DNA zichtbaar door fluorescentie. De UV‐belichte gel werd gefotografeerd.

III.3.3.3. Concentratie‐ en zuiverheidsbepaling van het DNA


Nucleïnezuren hebben een maximale absorbantie bij een golflengte van 260 nm. De concentratie dubbelstrengig DNA die gebruikt wordt in een PCR‐reactie is 50 µg per ml wat overeenkomt met een OD260‐waarde 1.

De aromatische aminozuren van proteïnen hebben een absorbantiemaximum bij 280 nm. De verhouding OD260/OD280 is dan ook een maat voor de contaminatie van het geïsoleerd DNA met proteïnen. Deze waarde moet tussen de 1.8 en 2.2 liggen. Hogere waarden zijn vaak te wijten aan RNA‐contaminatie, lagere waarden aan proteïnecontaminatie. Het aantal aromatische aminozuren in een proteïne is echter klein, waardoor OD260/OD280 niet zo’n gevoelige indicatie voor proteïnecontaminatie is. Daarom wordt ook de verhouding OD234/OD260 in rekening gebracht. Nucleïnezuren hebben een absorbantieminimum bij 234 nm en proteïnecontaminatie veroorzaakt een stijging van OD234/OD260 (> 0.5) (Winfrey et al., 1997).


Een 1/100 verdunning van de DNA‐oplossing werd gemaakt met steriel milliQ‐water. De absorbantie werd tegenover een blanco gemeten bij 234, 260 en 280 nm in een dubbelspectraalfotometer. Uit de absorbantiewaarden konden dan de DNA‐concentraties, de OD260/OD280‐ en OD234/OD260‐ verhoudingen berekend worden. De DNA‐oplossingen werden vervolgens verdund tot de gewenste concentratie (OD1) met TE‐buffer (1x).

III.3.3.4. Rep‐PCR

De amplificatie van het DNA gebeurt hier met primers die hybridiseren op de repetitieve REP sequenties (REP‐PCR) in het genoom van de bacteriën en met (GTG)5‐primers ((GTG)5‐PCR).


De reagentia werden centraal aangemaakt zoals beschreven in de ‘Standard Operating Manual REPPCR‐1A’ van het Laboratorium voor Microbiologie ‐ Gent.

PCR‐mix

♦ 5 x Gitschier‐buffer (5 µl / staal): samenstelling voor 200 ml: 16.6 ml 1 M (NH4)2SO4; 67 ml 1 M Tris‐HCl (pH 8.8); 6.7 ml 1 M MgCl2; 1.3 ml 1/100 verdunning van 0.5 M EDTA (pH 8.8); 2.08 ml 14.4 M β‐mercapto‐ethanol; 106 ml steriel milliQ‐water.

♦ BSA (10 mg/ml) (0.4 µl/staal). ♦ DMSO 100% (dimethylsulfoxide) (2.5 µl/staal). ♦ Steriel milliQ‐water (12.45 µl/staal voor REP‐PCR; 13.45 µl/staal voor (GTG)5‐PCR). ♦ dNTP’s ‐ 25 mM elk (1.25 µl/staal) (Amersham Pharmacia Biotech Inc.). ♦ Primers: REP1 en REP2 voor REP‐PCR; (GTG)5 voor (GTG)5‐PCR (1 µl/staal) (Amersham

Pharmacia Biotech Inc.). REP1 5' – IIIICGICGICATCIGGC ‐ 3' REP2 5' – ICGICTTATCIGGCCTAC ‐ 3' (GTG)5 5' ‐ GTGGTGGTGGTGGTGGTG ‐ 3'

♦ Taq DNA polymerase (0.4 µl/staal) (Goldstar RedTM) 5 U/µl.


In PCR‐reactievaatjes werd telkens 1 µl van OD2601‐DNA‐oplossing met 24 µl PCR‐mix gepipetteerd.

Door de gevoeligheid van de PCR‐reactie dienden bepaalde voorzorgen genomen te worden om contaminatie te vermijden.

De PCR‐mix werd gemaakt in een daartoe bestemd ‘clean’ lokaal om contaminatie te vermijden.

Het werkoppervlak en de pipetten werden regelmatig gereinigd met hypochloriet. Per reactie werd ter controle een blanco ingesloten. Deze bevatte alle componenten van

de PCR‐mix, maar geen DNA. Er werden gedurende de volledige procedure handschoenen gedragen. De eigenlijke PCR‐reactie gebeurde overnacht in een thermocycler (GeneAmp PCR System 9600; Applied Biosystems) met volgend temperatuursprogramma:

‐ initiële denaturatie: 7 minuten bij 95°C, ‐ amplificatie: 30 cycli; 1 minuut bij 94°C + 1 minuut bij 40°C + 8 minuten bij 65°C, ‐ finale elongatie: 16 minuten bij 65°C.

De reactieproducten konden enkele dagen bewaard worden bij een temperatuur van 4°C.

III.3.3.5. Agarosegel‐elektroforese van de rep‐PCR‐producten


De bekomen DNA‐fragmenten worden gescheiden volgens grootte op een agarosegel (zie III.3.3.3). De gel wordt evenwel op een enigszins andere maar sterk gestandaardiseerde manier aangemaakt. Enkel een reproduceerbare opgemaakt gel kan reproduceerbare fingerprints opleveren. De patronen die na scheiding worden bekomen zijn specifiek voor elk species, veelal zelfs voor subtypes van species. Er wordt bij 4°C gewerkt om bandverbreding door diffusie te vermijden.


♦ Tris‐EDTA‐(TE)‐buffer (100x): 121 g Tris‐HCl en 200 ml 0.5 M EDTA (pH 0.8) werden samengevoegd en aangelengd tot 1 l met milliQ‐water en vervolgens gesteriliseerd.

♦ Agarose (Biozym). ♦ Tris‐acetaat‐EDTA‐buffer (50x): 242 g Tris‐HCl, 57 ml ijsazijnzuur en 100 ml 0.5 M EDTA

(pH 8.0) werden samengevoegd en aangelengd tot 1 l met milliQ‐water. ♦ Loading dye (6x geconcentreerd): 4 g sucrose en 2.5 mg broomfenolblauw werden

samen opgelost in 6 ml TE‐buffer (1x) en aangelengd tot 10 ml met TE‐buffer (1x). ♦ Moleculaire gewichtsmerker specifiek voor rep‐PCR (35 µl PCR ruler 100 kb (Bio‐Rad); 28

µl PCR ruler 500 kb (Bio‐Rad); 37.5 µl loading dye; 50 µl 1 x TE‐buffer). ♦ Kleuringsbad: aan 1.5 l TAE‐buffer (1x) werd 150 µl ethidiumbromide stockoplossing (10

mg/ml) toegevoegd. ♦ Ontkleuringsbad: 1.5 l TAE‐buffer (1x).


- Bereiding van de gel 1.5 % agarose werd opgelost in 1 x TAE‐buffer (zie III.3.3.2.3). Dit moest heel nauwkeurig gebeuren; na opkoken in microgolfoven werd het volume verloren door verdamping weer aangevuld met milliQ‐water.

Na enkele minuten in een warmwaterbad van 60°C te hebben gestabiliseerd, werd de gel gegoten en de kammetjes geplaatst. Luchtbellen moesten vermeden worden in de gel. Tijdens het drogen (ong. 30 minuten) werden de gels bedekt met aluminiumfolie om stofdeeltjes te vermijden. Na het drogen werd de gel in een elektroforesetank geplaatst die gevuld was met TAE‐buffer. Deze buffer moest dezelfde zijn als deze die gebruikt werd om de gel te maken.

- Voorbereiding van de stalen De PCR‐stalen werden afgecentrifugeerd om te voorkomen dat er vloeistof aan de wand van de reactievaatjes bleef hangen. 6 µl PCR‐product werd gemengd met 3 µl loading dye.

- Laden van de gel De slotjes werden geladen door er 8 µl PCR‐product (gemengd met loading dye) in te pipetteren. Om de 5 slotjes werd 6 µl moleculaire merker geladen en ook de blanco werd ingesloten. De gel werd onder een spanning van 50V gebracht, (Sub Cell GT, Bio‐Rad), gedurende 960 minuten bij 4°C.

- Visualiseren van het DNA De gel werd gekleurd gedurende 30 minuten in het kleuringsbad en ontkleurd gedurende 10 minuten. De bandjes werden vervolgens gevisualiseerd met UV‐licht (302 nm) en door middel van een digitale videocamera werd het beeld als een ‘tiff‐file’ in de computer opgeslagen.

- Computerverwerking van de rep‐patronen De verwerking van de rep‐PCR‐patronen gebeurde met het computerprogramma BioNumerics.

Na het aanduiden van de verschillende lanen op het gelbeeld en het corrigeren voor de achtergrond, werd het gelbeeld genormaliseerd. Normalisatie is noodzakelijk omdat er compensatie nodig is voor de kleine afwijkingen tussen de verschillende gels en zelfs binnen eenzelfde gel. De normalisatie gebeurde door aligneren van de patronen aan de hand van gekende referentiepatronen zoals deze van de moleculaire gewichtsmerker. Op die manier konden patronen van verschillende gels met elkaar vergeleken worden.

Met behulp van clusteringsalgoritmen konden de fingerprints gegroepeerd worden.

In Fig. 13 wordt een schematisch overzicht gegeven van de rep‐PCR‐reactie en analyse.

Fig. 13. Schematisch overzicht van rep‐PCR (de Bruijn et al., 1996).

IV. Resultaten en bespreking

IV.1. Uittesten van de isolatieprocedure

In Materiaal en Methoden (II.1) is de werkwijze voor de verschillende testjes beschreven. IV.1.1. Cultuurbodems

IV.1.1.1. β‐galactosidase‐activiteit B. cereus MB 2570 vertoont geen blauwkleuring op de BHI + X‐gal‐bodem; B. licheniformis MB 392 wel (Fig. 14).

Fig. 14. Aantonen van de β‐galactosidase‐activiteit door blauwkleuring van B. licheniformis MB 392 (verdunning 10‐6).

De blauwkleuring is duidelijk mits X‐gal en IPTG egaal worden uitgestreken over de BHI‐platen. Dit is echter tijdrovend en de koloniemorfologie is niet altijd even duidelijk vast te stellen. Daarom wordt besloten om deze test niet tijdens de isolatie te doen maar pas nadat de isolaten reeds in de onderzoekscollectie van het DVK gedeponeerd zijn. IV.1.1.2. Lipase‐activiteit Bij het aanmaken van de TA‐bodems lost het glyceryl tributyraat niet goed op. Daardoor is er een onregelmatige verdeling in het medium waardoor de kolonies onduidelijk zijn.

Beide geteste stammen, B. cereus MB 2570 en B. subtilis MB 11, vormen witte kolonies. Bij geen enkele kolonie is echter een heldere zone zichtbaar wat zou betekenen dat de stammen geen lipase‐activiteit vertonen. Dit is echter niet in overeenstemming met de data uit Tabel 6 (Appendix I). De aangemaakte TA‐bodem blijkt dus niet geschikt om lipase‐activiteit aan te tonen en het wordt in dit scriptie‐onderzoek dan ook niet verder gebruikt.

IV.1.1.3. Fosfolipase‐activiteit De geteste stammen B. cereus MB 2570 en MB 1308 vertonen op de NA + egg yolk‐platen een opake zone van afzetting rond hun kolonies terwijl dit bij B. licheniformis MB 392 niet het geval is.

Er is een duidelijk verschil in kolonievorm merkbaar: B. cereus MB 2570 en MB 1308 vormen ronde, witte kolonies terwijl de kolonies van B. licheniformis MB 392 gelig zijn en stervormig (Fig. 15).

Fig. 15. B. cereus MB 2570 (links) en B. licheniformis MB 392 (rechts), telkens verdunning 10‐5, op NA + egg yolk‐platen.

Ook op de petriplaat waarop B. licheniformis MB 392 en B. cereus MB 2570 samen zijn uitgestreken is het verschil tussen beide duidelijk (Fig. 16).

Fig. 16. B. licheniformis MB 392 en B. cereus MB 2570 samen op één NA + egg yolk plaat.

Er is een duidelijk visueel verschil tussen micro‐organismen met en zonder fosfolipase‐activiteit, zelfs als beide samen op één NA + egg yolk‐plaat voorkomen. De NA + egg yolk‐bodem is dus geschikt om deze enzymatische activiteit aan te tonen. B. coagulans MB 368 en B. cereus MB 2570 die gegroeid zijn op platen NA + Egg yolk zonder NaCl vertonen geen verschil in aantal kolonies in vergelijking met NA + Egg yolk‐platen die wel 1% NaCl bevatten. De groei van B. coagulans MB 368 wordt dus niet gehinderd door 1% NaCl. De neerslagzone rond de kolonies is echter iets minder zichtbaar op petriplaten zonder NaCl; daarom wordt de voorkeur gegeven aan petriplaten met NaCl.

IV.1.1.4. Caseïnehydrolase‐activiteit Op de SM‐bodem kan caseïnehydrolase‐activiteit duidelijk aangetoond worden door de aanwezigheid van een heldere afbraakzone rond de kolonies. Zelfs als caseïne‐hydrolase positieve en negatieve bacteriën samen op één SM‐plaat voorkomen, zijn deze makkelijk te onderscheiden. Dit is zichtbaar in Fig. 17.

Fig. 17. B. cereus MB 2570 en MB 1308, B. subtilis MB 11 en B. lentus MB 9 op één SM‐plaat.

De zichtbaarheid van de kolonies van stammen die geen caseïne‐afbraak vertonen wordt beter naarmate het percentage SM‐poeder in de bodem verlaagd wordt. Dit is van belang voor het tellen van de kolonies. Nadeel is echter dat de heldere zones rond de kolonies van stammen die wel caseïne afbreken, overlappen.

Het verschil in diameter tussen de afbraakzones naargelang de hoeveelheid SM‐poeder in de bodem wordt duidelijk door Figuren 18 en 19 met elkaar te vergelijken.

Fig. 18. B. cereus MB 2570 (10-6) op een 2%-SM-plaat.

Fig. 19. B. cereus MB 2570 en MB 1308, B. subtilisMB 11 en B. lentus MB 9 op een 10%-SM-plaat.

Er wordt uiteindelijk gekozen voor de 4%‐SM‐bodem omdat met deze bodem zowel het onderscheid tussen de heldere zones rond caseïnehydrolase positieve stammen, als de zichtbaarheid van de kolonies van caseïnehydrolase negatieve stammen voldoende zijn.

IV.1.2. Melkafbraak

Het aantal kolonies dat geïsoleerd wordt uit ringeroplossing, melk en afgebroken melk is ongeveer gelijk. De petriplaten die geïnoculeerd zijn met melk vertonen een lichte film op het medium maar de groei van B. cereus MB 2570 wordt hierdoor niet gehinderd.

De resultaten zijn zoals verwacht: de bacteriën worden niet geconcentreerd door de melkafbraak waardoor er geen merkbaar verschil is in het aantal kolonies. Het schijnbaar ontbreken van invloed op de groei van Bacillus cereus MB 2570 door de melkfilm, is geen garantie dat dit bij alle sporenvormers zo zal zijn. Uit deze testen kan dus niet definitief besloten worden om het melkafbraakproces tijdens de isolatie over te slaan.

IV.1.3. Visualiseren van de kolonies met zuren

Het overgieten met de zuren levert geen duidelijker beeld op van de kolonies met hun heldere zones. Daarom wordt besloten deze zuren niet te gebruiken tijdens de isolatie en de leefbaarheid van de kolonies wordt dan ook niet meer getest.

IV.2. Isolatie van de aërobe sporenvormers uit melk

IV.2.1. Totaal kiemgetal

In Tabel 8 zijn de totale kiemgetallen voor de verschillende melkveebedrijven weergegeven.

Tabel 8. Overzicht van het totaal kiemgetal van de 8 melkveebedrijven (kve: kolonievormende eenheden).

Biologische melkveebedrijven Bedrijf 1 2776 kve/ml Bedrijf 2 3744 kve/ml Bedrijf 3 2388 kve/ml Bedrijf 4 4208 kve/ml Conventionele melkveebedrijven Bedrijf 5 11472 kve/ml Bedrijf 6 3856 kve/ml Bedrijf 7 4248 kve/ml Bedrijf 8 6224 kve/ml

Er zijn kleine schommelingen in kiemgetallen tussen de 8 melkveebedrijven onderling.

Deze waarden liggen meestal onder de officiële gemiddelde waarden voor Vlaamse rauwe melk die meestal teruggevonden worden (tussen 10000 en 16000 bacteriën per ml ‐ MCC‐Vlaanderen, 2004). De verklaring hiervoor moet waarschijnlijk gezocht worden in de detectiemethode. In deze scriptie worden de kiemgetallen van de acht melkveebedrijven bepaald door 1 ml melk uit te strijken op BHI‐platen en na 3 dagen incubatie bij 37°C het aantal kolonies te tellen.

Officieel gebeurt de analyse van het kiemgetal echter door flow cytometrie (Bactoscan). Via een conversietabel wordt het aantal gedetecteerde cellen dan omgezet naar kolonievormende eenheden bepaald met de referentiemethode (Kochse plaatmethode) (MCC‐Vlaanderen, 2004).

Gemiddeld zijn de kiemgetallen iets hoger bij de conventionele melkveebedrijven (6450 kve/ml) dan bij biologische melkveebedrijven (3280 kve/ml). In deze scriptie worden echter slechts 4 biologische melkveebedrijven vergeleken met 4 conventionele. Dit staalonderzoek is allicht te kleinschalig voor een statistische interpretatie. Dit zal moeten blijken uit de resultaten van het project waarbinnen deze scriptie kadert.

IV.2.2. Totaal sporengetal

In Tabel 9 wordt een overzicht gegeven van de totale sporengetallen van de verschillende melkveebedrijven.

Tabel 9. Overzicht van het totaal sporengetal van de 8 melkveebedrijven.

Biologische melkveebedrijven Bedrijf 1 17 sporen/ml Bedrijf 2 63 sporen/ml Bedrijf 3 52 sporen/ml Bedrijf 4 36 sporen/ml Conventionele melkveebedrijven Bedrijf 5 7 sporen/ml Bedrijf 6 63 sporen/ml Bedrijf 7 67 sporen/ml Bedrijf 8 72 sporen/ml

Het gemiddelde sporengetal bij de biologische melkveebedrijven is 42 sporen/ml, bij de conventionele bedrijven 52 sporen/ml. Deze waarden liggen binnen de grenzen van wat meestal teruggevonden wordt, nl. 25 tot 100 aërobe sporen per ml melk (Slaghuis et al., 1997); enkel het sporengetal van melkveebedrijf 5 is ietwat lager. Hiervoor is geen verklaring gevonden. Het sporengetal is (nog) geen officiele parameter bij het bepalen van de melkkwaliteit.

IV.2.3. Overzicht van de geïsoleerde stammen

In deze scriptie worden de aërobe sporenvormers, geïsoleerd uit melk en uit afgebroken melk, van vier biologische bedrijven geanalyseerd alsook de bacteriën geïsoleerd uit melk (maar niet uit afgebroken melk) van vier conventionele bedrijven. Omdat de melkstalen van de biologische melkveebedrijven hierdoor in principe twee maal onderzocht worden is het logisch dat de meeste isolaten afkomstig zijn van biologische melkveebedrijven.

In totaal worden in deze scriptie 294 isolaten bestudeerd.

In Tabellen 10 tot 17 (Appendix III) wordt per melkveebedrijf een overzicht gegeven van de geïsoleerde micro‐organismen. Daarin zijn volgende gegevens opgenomen:

‐ het R‐stamnummer van het Laboratorium voor Microbiologie ‐ Gent, ‐ het OC(onderzoekscollectie)‐stamnummer van het DVK, ‐ de temperatuur waarbij het isolaat wordt bekomen, ‐ de bodem waarvan het isolaat wordt opgepikt: van de electieve media worden enkel de

positieven (met de enzymatische eigenschap) geselecteerd, tenzij de bodem tussen haakjes staat,

‐ X‐gal‐activiteit: “x/‐” staat voor het aan‐/afwezig zijn van β‐galactosidase, bij niet ingevulde kaders is de activiteit tot nu toe onbekend,

‐ MIDI‐identificatie: identificatie volgens het MIDI‐identificatiesysteem aan de hand van het vetzuurprofiel,

‐ Sim.: de similariteitsindex, berekend door het MIDI‐identificatiesysteem (1 als maximum en 0 als minimum),

‐ M/A: staat voor de isolatie uit melk (M) of uit afgebroken melk (A).

IV.3.2.1. Bespreking van de Tabellen 10 tot 17

‐ Ongeveer 70% van de isolaten is afkomstig uit melk van de biologische melkveebedrijven.

‐ 73% van de isolaten worden van BHI‐bodem afgenomen, 9.5% van NA + egg yolk‐bodem en 17.5% van SM‐bodem. Omdat niet alle onderzoek afgewerkt is, kunnen in deze scriptie nog geen volledige besluiten worden getrokken over de enzymatische eigenschappen van de isolaten.

‐ De meeste isolaten worden bekomen bij 37°C, namelijk 54.8%. 25.7% van de isolaten wordt geïsoleerd bij 55°C en 19.5% bij 20°C. Indien men de isolaten, bekomen uit melk (niet uit afgebroken melk), van de biologische en conventionele melkveebedrijven apart beschouwt, is een duidelijk verschil merkbaar (Tabel 18).

Tabel 18. Verhouding van de isolaties bij 3 verschillende temperaturen voor conventionele en biologische melkveebedrijven.

Conventionele melkveebedrijven Biologische melkveebedrijven 20°C 10% 23.50% 37°C 43% 67% 55°C 47% 9.50%

Uit deze tabel blijkt dat er beduidend meer thermofiele sporenvormers geïsoleerd worden uit melkstalen van conventionele bedrijven. Een mogelijke verklaring hiervoor is het veevoeder.

Inderdaad, reeds bij de aanvang van het project waarbinnen deze scriptie kadert, werd de hypothese voorop gesteld dat verschillen in voeder tussen de twee types melkveebedrijven een invloed zouden hebben op de sporenflora van de melk. Daarom werd via een enquête, uitgevoerd door het DVK, bij de melkveehouders informatie ingewonnen over de samenstelling van dit veevoeder. De resultaten van die enquête zijn weergegeven in Tabel 19.

Tabel 19. Overzicht van de veevoeders die melkveehouders aan hun koeien geven (Resultaten DVK).

Melkveebedrijf Gewassen die in het voeder worden verwerkt

Andere voedingssupplementen

Biologisch Bedrijf 1 Weidegras, maïskuil, haver, tarwe‐gerst‐

triticale Mineralen

Bedrijf 2 Snijmaïs, gras, klaver, wortelen, zomergerst

Zeewierkalk, lijnschilfers, maïsgluten, maïsmeel

Bedrijf 3 Gras, klaver, maïs Lijnzaadschilfers Bedrijf 4 Gras‐klaver, triticale, maïs,

suikerbietkoppen Zout, mineralen, zeewierkalk

Conventioneel Bedrijf 5 Maïs, gras, stro, wintertarwe Soja, koolzaadschroot,

gevitamineerd mineralenmengsel Bedrijf 6 Maïs, ingekuild gras, eiwitkern Eiwitkern bestaande uit sojaschroot,

tarwe, koolzaadschroot, kokosschilfers, sojabonen, citruspulp, bietmelasse, cacaodoppen

Bedrijf 7 Maïs, aardappelen, geplette tarwe ‐ Bedrijf 8 Silomaïs, voordroog gras, korrelmaïs ‐

Een biologische melkveehouder streeft naar grondgebonden landbouw die een evenwichtig voeder oplevert voor de koeien op z’n bedrijf. Vlinderbloemigen (klaver), in symbiose met rhizobia, fixeren stikstofgas en leveren een eiwitrijk voeder op terwijl hakvruchten en graangewassen eerder voor energierijk voeder zorgen. Gras, in combinatie met klaver vormt een vrij evenwichtig voeder waardoor het gebruik van voedingssupplementen beperkt kan worden. De voedingssupplementen die aan koeien van biologische melkveebedrijven mogen gegeven worden zijn wettelijk vastgelegd en omvatten o.a. tarwegluten, maïsgluten, moutkiemen, getoaste sojabonen, lijnzaad(schilfers), aardappeleiwit, voederbieten, melasse, zeewier en ongeraffineerde levertraan (http://www.bioforum.be).

Conventionele melkveehouders voeden hun koeien ook voornamelijk met zelf gekweekt voeder, maar veel eenzijdiger. Daardoor is het voeder van onevenwichtige kwaliteit en wordt frequent gebruik gemaakt van voedingssupplementen, die eventueel afkomstig kunnen zijn van het buitenland (cacaodoppen, citruspulp, kokosschilfers) (BLIVO, expertisecentrum biologische landbouw). De endemische bacteriële flora van het voeder kan een contaminatiebron zijn voor de insleep naar rauwe melk.

Dit is reeds aangetoond voor Bacillus sporothermodurans (de Silva et al., 1998; Scheldeman et al., 2000). De oorzaak van het hoger aantal thermofielen ligt mogelijks in de verschillende voederpatronen die tussen de twee types bedrijven (biologisch vs. conventioneel) worden toegepast.

IV.3. Identificatie

IV.3.1. FAME‐identificatie

In Tabellen 10 tot 17 zijn de hoogste similariteiten vermeld van de FAME‐identificatie door het MIDI‐identificatiesysteem.

Met behulp van BioNumerics wordt een dendrogram (Fig. 20) van alle isolaten opgesteld aan de hand van hun vetzuurprofielen. De gebruikte similariteitsindex is ‘Euclidian distance’ en het gebruikte clusteringsalgoritme is UPGMA (Unweighted Pair‐Group Method using Arithmetic averages).

Isolaten die ten minste 99% similariteit in hun FAME‐patroon vertonen worden samen voorgesteld (grijze driehoeken). De grens van 99% wordt gekozen op basis van de rep‐patronen die in IV.3.2.3. worden besproken.

E u c l id i an d i s ta n ceT S B A 50 (5 .0 0)

100

999897969594939291

91 92 93 94 95 96 97 98 99 100Euclidian distance - TSBA 50 (5.00)

R-27341 Bacillus GC group 22 0.265R-27357 Bacillus sphaericus GC subgroup D 0.342R-27357 Bacillus sphaericus GC subgroup C and FR-26228 Bacillus GC group 22

R-26031 Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.243R-26865 Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.459R-26205 Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.561

R-26031 Bacillus sphaericus GC subgroup A

R-26205 Bacillus sphaericus GC subgroup D

R-26248 Bacillus sphaericus GC subgroup D 0.407R-27019 Bacillus sphaericus GC subgroup E 0.908

R-26030 Bacillus GC group 22 0.199

Bacillus insolitus / Bacillus GC group 22

0.177

Bacillus mycoides GC subgroup A / Bacillus cereus GC subgroup B

R-27334 Bacillus cereus GC subgroup B 0.149R-25352 Bacillus cereus GC subgroup B 0.311

R-25352 Bacillus cereus GC subgroup B 0.311

R-25352 Bacillus cereus GC subgroup B/A 0.311

R-25355 Bacillus cereus GC subgroup B 0.042R-27012 Bacillus cereus GC subgroup B 0.258

Thermus aquaticus GC subgroup B / Staphylococcus schleiferi

Thermus aquaticus GC subgroup B / Staphylococcus sciuri

Thermus aquaticus GC subgroup B

R-26370 Geobacillus stearothermophilus GC subgroup A 0.498R-26370 Thermus aquaticus GC subgroup B 0.498R-26357 Geobacillus stearothermophilus GC subgroup A 0.748

R-26370 Bacillus megaterium GC subgroup A 0.498

R-26370 Bacillus pumilus GC subgr. B/Bacillus megaterium GC subgr. A0.498

R-26370 Kurthia sibirica 0.498

R-26370 Bacillus pumilus GC subgroup B 0.498

A

1

2

B

1

2

1

Fig. 20. Dendrogram op basis van vetzuurprofielen (Euclidian distance, UPGMA).

R-26277 Kurthia sibirica 0.519Staphylococcus sc iuriBac illus laevolacticus

Bac illus licheniformis / Bacillus subtilis

R-26050 Bacillus olerionus 0.804Bacillus atrophaeus

R-27355 Paenibacillus alvei GC subgroup A 0.504R-27335 Bacillus GC subgroup 22 0.375R-27330 Bacillus olerionus 0.558

Staphylococcus schleiferi / Thermus aquaticus

Hyphomonas hirschiana / Bacillus clausii

Bac illus licheniformis

Bac illus licheniformis

R-25346 Bacillus laevolacticus 0.379R-26345 Bacillus laevolacticus 0.357R-27330 Bacillus clausii / Bacillus alcalophilus

0.558R-26046 Bacillus clausii 0.821

R-26046 Kytococcus sedentarius 0.821R-26367 Kytococcus sedentarius 0.095R-26208 Bacillus circulans 0.389R-26385 Bacillus GC group 22 0.516

R-26046 Paenibacillus lautusR-26046 Bacillus circulans 0.821

R-26243 Paenibacillus alvei GC subgroup A 0.419R-26046 Paenibacillus alvei GC subgroup A

0.821R-26217 Bacillus lentus 0.419R-26064 Nesterenkonia halobia 0.525

R-26046 Staphylococcus epidermidis GC subgroup B0.821R-27354 Staphylococcus aureus GC subgroup C 0.722

R-26046 Staphylococcus epidermidis GC subgroup B0.821R-27354 Staphylococcus aureus GC subgroup C 0.684

R-26035 Staphylococcus warneri 0.819

R-26052 Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.767R-26301 Staphylococcus hominis hominis 0.653

R-26046 Bacillus megaterium GC subgroup B0.821

R-26046 Staphylococcus hominis hominis0.821

R-26212 Paenibacillus pabuli 0.745

R-26264 Micrococcus luteus GC subgroup C 0.488R-27363 Micrococcus luteus GC subgroup C 0.505R-26379 Brevibacillus choshinensis 0.872R-26274 Micrococcus luteus GC subgroup C 0.790

R-27338 Micrococcus luteus GC subgroup A 0.728R-26046 Paenibacillus polymyxa 0.821R-26950 Streptococcus salivarius salivarius 0.011R-26337 NO MATCH 0.000R-26384 Listeria monocytogenes/innocua GC subgroup A 0.229R-26046 Microbispora rosea 0.821R-26046 Thermus aquaticus GC subgroup B

0.821R-26046 Lechevalieria flava / Ureibacillus thermosphaericus

0.821R-26046 Lechevalieria flava / Ureibacillus thermosphaericus

0.821R-26046 Lechevalieria flava / Ureibacillus thermosphaericus0.821R-26046 Lechevalieria flava / Ureibacillus thermosphaericus0.821R-26377 Duganella zoogloides 0.593

R-26854 Pseudomonas putida biotype A 0.507R-25356 Moraxella catarrhalis 0.093

R-26289 Moraxella catarrhalis 0.270

R-26860 Acinetobacter calcoaceticus 0.629

C

3

D

E

F

G

H

IV.3.1.1. Bespreking van het dendrogram

In de literatuurstudie (II.5.1) wordt reeds vermeld dat de taxonomische resolutie van de vetzuuranalyse meestal niet tot op het speciesniveau is. In het genus Bacillus bv. kan doorgaans enkel onderscheid worden gemaakt tussen speciesgroepen (Kämpfer, 1993).

Naast de identificatie, bekomen door het MIDI‐identificatiesysteem, worden de vetzuur‐profielen van de isolaten ook vergeleken met deze van de interne databank van het Laboratorium voor Microbiologie – Gent waaronder typestammen (aangeduid door een T na het stamnummer) van veel species. Er wordt in deze scriptie voornamelijk gezocht naar een taxonomische link tussen de onderzochte isolaten en deze typestammen.

Om de bespreking van dendrogram (Fig. 20) te vergemakkelijken wordt gebruikt gemaakt van een onderverdeling in arbitrair gekozen clusters (A, B, C,…).

Cluster A

De cluster A1 bevat voornamelijk isolaten die door het MIDI‐identificatiesysteem als Bacillus sphaericus worden benoemd. De similariteitsindexen zijn echter dikwijls lager dan 0.6.

Na vergelijking met de vetzuurprofielen van de Laboratorium databank blijken de isolaten ongeveer 98% similariteit te vertonen met Bacillus neidei LMG 21635T, Bacillus sphaericus LMG 7143T en Bacillus fusiformis LMG 9816T, drie nauw verwante species (Nakamura et al., 2002).

Hieruit wordt duidelijk dat op basis van vetzuurpatronen geen onderscheid kan gemaakt worden tussen deze nauw verwante species. Om de juiste identiteit van de isolaten te achterhalen is dus verder onderzoek vereist. De bacteriën worden allen geïsoleerd bij 20 of 37°C, voornamelijk van BHI‐platen, uit melkstalen van beide bedrijfstypes.

De cluster A2 bevat enkel isolaten opgepikt na incubatie bij 20°C, afkomstig uit melkstalen van biologische melkveebedrijven. De isolaten worden door het MIDI‐identificatiesysteem als Bacillus insolitus benoemd maar blijken na vergelijking met de Laboratorium databank op basis van vetzuurprofielen 98% similariteit te vertonen met Bacillus pseudofirmus LMG 17944T.

Cluster B

Deze cluster bevat voor het merendeel isolaten die door het MIDI‐identificatiesysteem als Bacillus cereus benoemd worden. Een vergelijking van hun vetzuurpatronen met deze van de Laboratorium databank toont 98% similariteit met Bacillus weihenstephanensis LMG 18989T, Bacillus mycoides LMG 7128T en Bacillus cereus LMG 6923T. Deze species zijn zeer nauw verwant en behoren tot de ‘Bacillus cereus groep’. Ook hier kan dus op basis van vetzuuranalyse geen onderscheid gemaakt worden op speciesniveau. Om de juiste identiteit van de isolaten uit deze cluster te bepalen, is verder onderzoek via karakteriseringstechnieken met hogere taxonomische resolutie nodig. De isolaten uit cluster

B zijn voornamelijk afkomstig van melkstalen van biologische melkveebedrijven, en worden opgepikt van BHI‐, SM‐ en NA + egg yolk‐platen na incubatie bij 20 of 37°C. Bij geen enkele isolaat wordt β‐galactosidase‐activiteit aangetoond.

Cluster C

De cluster C1 bestaat enkel uit thermofielen. De isolaten worden door het MIDI‐identificatiesysteem benoemd als Thermus aquaticus, Staphylococcus sciuri/schleiferi en Geobacillus stearothermophilus. Wanneer hun vetzuurpatronen worden vergeleken met deze van de interne databank blijken ze een similariteit van 97% te vertonen met Aneurinibacillus thermoaerophilus LMG 17165T, Bacillus clausii LMG 17945T, Bacillus halodurans LMG 7121T, Geobacillus stearothermophilus LMG 19007T, Bacillus licheniformis LMG 12363T en Bacillus gelatini LMG 21880T.

Het is duidelijk dat met FAME‐analyse zelfs geen onderscheid kan gemaakt worden tot op genusniveau. Om te bepalen welke identiteit de isolaten hebben, zal verder onderzoek nodig zijn.

De enkele isolaten (R‐27329, R‐26352, R‐26952, R‐27325, R‐26946 en R‐26363) die door het MIDI‐identificatiesysteem als Staphylococcus worden benoemd, vertonen in vetzuurprofiel de meeste gelijkenissen met B. licheniformis LMG 12363T. Ook hun kolonie‐ en celmorfologie blijkt dit te ondersteunen. De voorgestelde identificatie door het MIDI‐identificatiesysteem als Staphylococcus is dan ook foutief. Een vergelijking van de vetzuurprofielen met deze van de interne Laboratorium databank is dan ook zinvol om tot een betere voorlopige identificatie te komen.

De isolaten van cluster C1 zijn voornamelijk afkomstig uit melkstalen van conventionele melkveebedrijven.

De isolaten van cluster C2 worden benoemd als Bacillus megaterium, Bacillus pumilus en Kurthia sibirica door het MIDI‐identificatiesysteem. Na vergelijking van hun vetzuur‐profielen met deze van de Laboratorium databank wordt de grootste overeenkomst (ongeveer 98% similariteit) gevonden met Bacillus vireti LMG 21834T, Virgibacillus pantothenticus LMG 18726T en Bacillus pumilus LMG 7132T.

De isolaten die door het MIDI‐identificatiesysteem als Kurthia sibirica worden benoemd, vertonen, op basis van vetzuurprofielen, een similariteit van 99% met Bacillus farraginis LMG 22081. Dit is een nieuw species, geïsoleerd uit melk dat recent beschreven werd (Scheldeman et al., 2004). Isolaten van de C2 cluster zijn afkomstig van melkstalen van beide bedrijfstypes, en worden opgepikt na incubatie bij 20 of 37°C, zowel van BHI‐ als van SM‐platen.

De cluster C3 isolaten tenslotte vertonen meer dan 99% similariteit in hun vetzuurprofielen met B. licheniformis LMG 12363T, B. laevolacticus LMG 6329T, B. amyloliquefaciens LMG 9814T en B. subtilis LMG 2099T. Deze nauw verwante species behoren tot de ‘Bacillus subtilis groep’ zodat ook nu vetzuurpatronen niet toelaten een onderscheid te maken op speciesniveau binnen deze groep en verder onderzoek is nodig. De isolaten worden opgepikt van BHI‐ en SM‐platen, na incubatie bij 37°C (R‐26218 bij 20°C; R‐25364 bij 55°C). Ze zijn afkomstig uit melkstalen van zowel conventionele als biologische melkveebedrijven.

Cluster D

Deze cluster bevat vier isolaten die door het MIDI‐identificatiesysteem worden benoemd als Kytococcus sedentarius. Ze worden opgepikt van BHI‐platen na incubatie bij 55°C en zijn afkomstig van het biologische melkveebedrijf 3. Na vergelijking met de Laboratorium databank blijken ze, op basis van vetzuurprofielen, slechts 90% similariteit te vertonen met enkele Laboratorium stammen benoemd als B. coagulans. Het is waarschijnlijk dat deze isolaten tot een nieuwe taxonomische groep behoren en ze moeten dus verder onderzocht worden, bv. via 16S rDNA‐sequentie‐analyse, om hun identiteit te bepalen.

Cluster E

Cluster E omvat isolaten die na vergelijking met de Laboratorium databank de grootste similariteit in vetzuurprofiel vertonen met Bacillus circulans LMG 6926T (91.5%), Paenibacillus lactis LMG 21940T (93%) en Paenibacillus cookii LMG 18419 (91%). De similariteit is echter niet erg hoog, verder onderzoek is vereist om de identiteit van de isolaten te achterhalen.

Veel isolaten uit de centrale cluster van cluster E worden door het MIDI‐identificatiesysteem benoemd als leden van het genus Staphylococcus. Ook na vergelijking met de Laboratorium databank blijken de vetzuurprofielen van deze isolaten voor 99% overeen te komen met staphylococcen. Ter controle wordt de kolonie‐ en celmorfologie bestudeerd. De kolonies zijn wit, glad, rond en punctiform terwijl de cellen coccen zijn. Allicht bevestigt dit de identificatie die door de twee identificatie‐benaderingen gegeven wordt.

De isolaten uit cluster E zijn voornamelijk opgepikt van BHI‐platen na incubatie van melkstalen van beide bedrijfstypes bij 37°C.

Cluster F

De meeste isolaten uit cluster F blijken de grootste similariteit in vetzuurpatroon te vertonen met Geobacillus Laboratorium stammen, echter niet met de typestam. Ze worden voornamelijk opgepikt van BHI‐platen na incubatie bij 55°C en blijken afkomstig te zijn zowel van biologische als van conventionele melkveebedrijven.

De stam R‐26384, die duidelijk afzonderlijk valt, blijkt na vergelijking met de Laboratorium databank de grootste overeenkomst te vertonen met Listeria monocytogenes LMG 10470T. Deze isolaat wordt opgepikt na incubatie bij een temperatuur van 20°C zodat een clustering met thermofielen eerder onverwacht is.

Cluster G

Bevat isolaten die na vetzuuranalyse door het MIDI‐identificatiesysteem als Lechevalieria flava en Ureibacillus thermosphaericus benoemd worden. Na analyse met de Laboratorium databank blijkt de cluster het best overeen te komen (95%) met Ureibacillus terrenus LMG

19470T; dit is het typespecies van het in 2001 nieuw beschreven genus Ureibacillus (Fortina et al., 2001).

De isolaten zijn bijna exclusief afkomstig uit melk van conventionele melkveebedrijven. Enkel in melk van het biologische melkveebedrijf 3 worden deze thermofielen ook gevonden. Alle isolaten worden geïsoleerd na incubatie bij 55°C op BHI‐platen.

Cluster H

De isolaten uit cluster H vormen een outgroup binnen het dendrogram. Dit was te verwachten omdat de isolaten uit cluster H door het MIDI‐identificatiesysteem benoemd als micro‐organismen met een Gram‐negatieve celwand, terwijl alle overige isolaten een Gram‐positieve celwand hebben. De voorlopige identiteit van de isolaten wordt bevestigd met de gegevens van de Laboratorium databank maar wordt hier niet besproken omdat deze isolaten niet tot de aërobe sporenvormers behoren en dus uit het project vallen.

IV.3.1.2. Enkele vergelijkingen

IV.3.1.2.1. Belang van de temperatuur

Opvallend zijn enkele specifiek thermofiele clusters, bvb. G en C1 alsook enkele specifiek psychrotrofe clusters, nl. A2 en B1. Hieruit blijkt de noodzaak om te incuberen bij drie verschillende temperaturen en niet enkel bij 37°C.

IV.3.1.2.2. Het effect van melkafbraak

Indien enkel de biologische melkveebedrijven 1 tot 4 in beschouwing worden genomen voor de vergelijking tussen melk en chemisch afgebroken melk kunnen volgende punten worden vastgesteld:

‐ 70% van de isolaten is afkomstig uit afgebroken melk, ‐ enkele isolaten lijken enkel voor te komen in afgebroken melk (bv. isolaten voorlopig

geïdentificeerd als behorend tot de species B. amyloliquefaciens, B. insolitus, B. lentus, B. oleronius, Kytococcus sedentarius, Lechevalieria flava, Listeria monocytogenes/innocua, Nesterenkonia halobia, Paenibacillus pabuli en P. polymyxa).

Het lijkt er dus op dat de melkfilm sommige micro‐organismen inhibeert, of maskeert in hun groei op de platen waardoor ze niet opgepikt worden. Na afbraak worden er immers meer stammen geïsoleerd alsook enkele die zelfs niet uit melk worden opgepikt.

Het is dus mogelijk dat de melkafbraak een grotere diversiteit aan isolaten naar voor brengt: deze stelling moet zeker nog nagegaan worden na volledige identificatie van de isolaten.

IV.3.1.2.3. Vergelijking biologisch vs. conventioneel melkveebedrijf

Voor deze vergelijking worden enkel de isolaten uit melk beschouwd van de biologische melkveebedrijven en de conventionele melkveebedrijven (niet uit afgebroken melk). Volgende punten kunnen worden vastgesteld:

‐ kwantitatief worden iets meer micro‐organismen geïsoleerd uit melk van conventionele bedrijven (57%),

‐ er worden opvallend meer thermofielen geïsoleerd uit melk afkomstig van conventionele melkveebedrijven (Tabel 8),

‐ enkele isolaten die voorlopig geïdentificeerd zijn als vertegenwoordigers van het genus Ureibacillus komen, op enkele uitzonderingen na (R‐26342, R‐26341 en R‐26340), exclusief voor in melkstalen van conventionele melkveehouders.

IV.3.2. Rep‐PCR

Met rep‐PCR wordt de genotypische diversiteit van enkele isolaten, geïdentificeerd door het MIDI‐identificatiesysteem als B. cereus, nader onderzocht.

IV.3.2.1. REP‐PCR

De fingerprintpatronen van de isolaten zijn met BioNumerics toch verwerkt tot een dendrogram (UPGMA; Pearson‐correlatie) (Fig. 21).

Fig. 21. Groepering via REP‐PCR fingerprintpatronen.

Daaruit blijkt dat het bandenpatroon van de verschillende isolaten meestal identiek is met slechts één bandje. Uitzonderingen betreffen de isolaten R‐25381, R‐25355, R‐25376 en R‐25357 die een verschillend REP‐patroon vertonen.

Uit deze REP‐fingerprintpatronen kunnen we dus geen besluiten trekken in verband met de genomische karakteristieken van de isolaten. We hebben dan ook besloten een andere rep‐methode, nl. met de (GTG)5‐primer, uit te testen. In Fig. 22 is het dendrogram van deze fingerprints opgegeven.

P earson correlatio n (Op t:0. 30%) [1 4.0%-97.8%]R EP

100

9080706050403020100

REP

R-25371R-25373

R-25364

R-25374

R-26382

R-25377

R-26378R-26380

R-26381

R-26028

R-26203

R-26022R-26232

R-26383

R-25353

R-26233

R-26029

R-25387

R-25391R-26256

R-26229

R-26024

R-25358

R-25354R-26025

R-25388

R-25352

R-25362

R-25372

R-25381R-25355

R-25376

R-25357

IV.3.2.3.2. (GTG)5‐PCR

Fig. 22. Groeperingen via (GTG)5‐PCR fingerprintpatronen (UPGMA, Pearson‐correlatie).

Twee types worden onderscheiden: rood is type 1, blauw is type 2.

Pearson correlation (Opt:0.30%) [13.8%-89.9%]GTG5

100

80604020

GTG5

R-26380R-26381R-26378R-25353R-25377R-25352R-26382R-26383R-25354R-25371R-26256R-25373R-26232R-25364R-26203R-25362R-25391R-26028R-25358R-26024R-26233R-26025R-26029R-25388R-25387R-26022R-25372R-26229R-25374R-25376R-25355R-25381R-25357

A

C

D

Type 2

Type 1

Type 2

In dit dendrogram zijn twee types te onderscheiden met een onderling verschil van één bandje (aangeduid op de gel met een rode pijl in Fig.22).

Drie isolaten vertonen een totaal ander (GTG)5‐patroon (R‐25355, R‐25381 en R‐25357) en clusteren elk afzonderlijk.

Deze isolaten komen overeen met deze uit de REP‐fingerprintclustering, behalve R‐25376. Dit isolaat valt in de (GTG)5‐fingerprintclustering in type 2. In het REP‐experiment is de PCR niet doorgegaan (geen bandje in Fig. 21) om een onverklaarbare reden.

In de FAME‐clustering zijn R‐25381 en R‐25355 eveneens enigszins afwijkend (wanneer de similariteitsgrens op 99% wordt gelegd – niet getoond voor R‐25381 in Fig. 20) van de overige B. cereus isolaten terwijl R‐25357 middenin de grote B. cereus cluster valt. Om te achterhalen welke de precieze verschillen zijn tussen deze drie B. cereus isolaten en de overige is verder onderzoek nodig.

In het dendrogram valt type 2 uiteen in twee clusters omdat bij een deel van de type 2 isolaten (R‐26380, R‐26381, R‐26378, R‐25353, R‐25377 en R‐25352) er in het onderste gedeelte van de lanen een aantal banden ontbreken. Dit is mogelijks het gevolg van het minder intens kleuren van de gel.

De twee types B. cereus in Fig. 23 worden teruggevonden in melk van de 4 onderzochte biologische melkveebedrijven. Het type 1 wordt teruggevonden in melk van bedrijven 1, 2 en 3 terwijl het type 2 wordt teruggevonden in melk van bedrijven 1, 2 en 4. Dit is mogelijks een indicatie dat de isolaten geen klonen (afkomstig van eenzelfde cel) zijn van elkaar. Uit een analyse van de enzymatische activiteiten van de isolaten kan geen verklaring worden gevonden voor het onderscheid in de twee types.

Uit de gegevens over (GTG)5‐patronen van B. cereus stammen blijkt dat er veel verschillende types bestaan. In dit onderzoek hebben we slechts twee types teruggevonden wat eventueel zou kunnen betekenen dat slechts een beperkt aantal types van B. cereus aangepast zouden zijn om als contaminanten in de rauwe melk voor te komen.

V. Samenvatting en besluit

Het doel van deze scriptie was na te gaan of de verschillen in bedrijfsvoering tussen conventionele en biologische melkveebedrijven een invloed hebben op de samenstelling van de aërobe sporenflora in de rauwe melk. De representatieve aërobe sporenvormers werden uit rauwe melkstalen (periode late zomer/herfst) van vier biologisch en vier conventioneel bedreven melkveebedrijven geïsoleerd na een hittebehandeling van 10 minuten bij 80°C. Hiervoor werd elk staal uitgeplaat op BHI‐, SM‐ en NA‐bodem, één maal rechtstreeks en één maal na chemische afbraak van de melk. De platen werden geïncubeerd bij drie verschillende temperaturen (20, 37 en 55°C) gedurende 72 u. De isolaten werden op basis van koloniemorfologie opgepikt en uitgezuiverd. Een eerste identificatie van de isolaten werd bekomen door FAME‐analyse via het MIDI‐identificatiesysteem. De genotypische diversiteit van de als Bacillus cereus geïdentificeerde isolaten werd nader bestudeerd via rep‐PCR. Reeds bij de isolatie werd duidelijk dat er opvallend meer thermofielen voorkwamen in melkstalen afkomstig van conventionele melkveebedrijven. De resultaten van de FAME‐analyse toonden bovendien aan dat er sommige thermofiele taxa exclusief voorkomen in melkstalen van die conventionele melkbedrijven. Aan de hand van de electieve bodems (SM‐ en NA‐bodem) werd bij enkele isolaten de aanwezigheid van caseïnehydrolasen en fosfolipasen vastgesteld. Deze enzymen zijn een indicatie voor de mogelijke schadelijke effecten die bepaalde sporenvormers in melk kunnen hebben. Ook hier is verder onderzoek nodig om de juiste invloed van de sporenvormers op de kwaliteit van de melk na te gaan. Tenslotte bleek uit de rep‐PCR‐analyse dat er slechts een beperkt aantal genotypes van Bacillus cereus teruggevonden worden in de melk. Een verklaring hiervoor is tot nu toe niet gevonden, maar zou kunnen gerelateerd zijn aan de insleep en/of overlevingskarakteristieken van bepaalde B. cereus klonen. Uit deze voorlopige resultaten kan dus vastgesteld worden dat de verschillen in bedrijfsvoering tussen biologische en conventionele melkveebedrijven wel degelijk een invloed hebben op de aërobe sporenflora in rauwe melk. Een mogelijke verklaring zou kunnen gerelateerd zijn aan verschillen in voedingsstrategieën die toegepast worden in de twee bedrijfstypes. Verder onderzoek is nodig om de eventuele contaminatiebronnen van de insleep en de eventuele schadelijke effecten van de sporenvormers in rauwe melk te achterhalen. Een meer polyfasische karakterisering met een taxonomische resolutie op het speciesniveau zal tot een meer betrouwbare identificatie van de isolaten leiden en toelaten om intra‐ en intergenotypische diversiteit van de taxa waartoe de isolaten behoren, beter te beschrijven.

Tabel 6. Overzicht van de eigenschappen van de gebruikte MB‐stammen (+/‐: de stam bezit de specifieke eigenschap wel/niet; ?: geen informatie gevonden); aanduiding of de MB‐stam typestam van het species is (+) of niet (‐) en indien gekend de oorsprong van de stam (Gordon et al., 1973).

MB‐stamnummer

Species‐naam Eigenschappen Type‐stam

Oorsprong β‐galactosidase Lipase Fosfolipase Caseïne‐hydrolyse

MB 1308 B. cereus ‐ ‐ + + ‐ Melkpoeder isolaat MB 2570

B. cereus ‐ ‐ + + ‐ ?

MB 11 B. subtilis + + ‐ + ‐ ? MB 392 B. licheniformis + + ‐ + + ? MB 368 B. coagulans + + ‐ + + Geëvaporeerde melk MB 9 B. lentus ? ? ‐ ‐ ‐ ?

Appendix I

Tabel 7. Overzicht van de isolaten, benoemd als B. cereus door het MIDI‐identificatiesysteem, uit biologische melk; stamnummer in R‐collectie, groeitemperatuur tijdens isolatie, isolatiebodem, MIDI‐identificatie en bijhorende similariteitsindex, M/A, melkveebedrijf.

R‐stamnummer Isolatie‐temperatuur Isolatie‐bodem MIDI‐identificatie Similariteitsindex M/A Bedrijf

25371 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.857 A 1 25372 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.774 A 1 25373 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.863 A 1 25374 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.857 A 1 25376 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.835 A 1 25377 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.865 A 1 26378 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.833 A 1 26380 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.835 A 1 26381 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.840 A 1 26382 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.844 A 1 26383 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.850 A 1 25353 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.864 A 1 25354 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.633 A 1 25357 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.870 A 1 25358 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.867 A 1 26025 37°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.880 A 1 26029 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.822 A 1 26203 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.880 A 1 26022 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.816 M 1 26028 37°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.842 M 1 26232 37°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.812 M 1 25355 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup B 0.042 A 1 25381 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup B 0.389 M 1 25352 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup B 0.311 M 1 26024 37°C (NA) Bacillus cereus GC subgroup A 0.866 A 1 25363 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.854 A 2

25364 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.883 A 2 25369 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.784 A 2 26372 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.864 A 2 26057 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.801 A 2 26209 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.820 A 2 26214 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.869 A 2 26226 37°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.826 A 2 26229 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.783 A 2 26233 37°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.834 A 2 27002 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.705 A 2 25361 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.875 M 2 25362 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.857 M 2 25366 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.400 A 2 25391 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.845 A 3 26393 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.826 A 3 26259 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.879 A 3 26261 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.908 A 3 27012 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.258 A 3 26389 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.810 M 3 26390 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.811 M 3 26391 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.819 M 3 26256 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.913 M 3 26262 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.846 A 3 25387 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.859 A 4 25388 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.860 A 4 25389 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.873 A 4 26392 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.819 A 4 26298 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.904 A 4 25384 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.884 M 4 25385 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.875 M 4 25386 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.865 M 4

Appendix II

26287 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.886 M 4 26288 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.886 M 4 26302 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.869 M 4

Tabel 10. Isolaten afkomstig uit melk van biologisch melkveebedrijf 1; stamnummer in R‐ en OC‐collecties, groeitemperatuur tijdens isolatie, isolatiebodem, X‐galreactie, MIDI‐identificatie en bijhorende similariteitsindex, M/A indicatie.

R‐stamnummer OC‐stamnummer Isolatie‐temperatuur

Isolatie‐bodem

X‐gal MIDI‐identificatie Similariteitsindex M/A

25346 18 37°C BHI + Bacillus laevolacticus 0.379 M 25347 19 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.636 M 25348 20 37°C BHI ‐ Staphylococcus warneri 0.753 M 25349 21A 37°C BHI ‐ Bacillus megaterium GC subgroup B 0.565 M 25350 21B 37°C BHI ‐ Bacillus megaterium GC subgroup B 0.487 M 25351 22 37°C BHI ‐ Staphylococcus aureus GC subgroup C 0.684 M 25352 23 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup B 0.311 M 25353 24 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.864 A 25354 25 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.633 A 25355 26A 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup B 0.042 A 25356 26B 37°C BHI ‐ Moraxella catarrhalis 0.093 A 25357 27 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.870 A 25358 28 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.867 A 25371 130 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.857 A 25372 132 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.774 A 25373 135 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.863 A 25374 136 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.857 A 25375 137 20°C SM Bacillus mycoides GC subgroup A 0.403 A 25376 139 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.835 A 25377 140 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.865 A 25378 141A 20°C BHI x Bacillus megaterium GC subgroup A 0.800 A 25379 141D 20°C BHI x Bacillus megaterium GC subgroup A 0.823 A 25381 143 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup B 0.389 M 26021 31 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.902 A 26022 32 37°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.816 M 26025 35 37°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.880 A

26028 38 37°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.842 M 26029 39 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.822 A 26030 40 37°C BHI ‐ Bacillus GC group 22 0.199 A 26031 41 37°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.243 A 26032 42 37°C BHI x Bacillus licheniformis 0.731 A 26202 64 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.801 A 26203 65 37°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.880 A 26204 67 37°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.523 A 26232 105 37°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.812 M 26303 1 55°C (NA) Thermus aquaticus GC subgroup B 0.417 A 26320 91 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.353 M 26321 92 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.430 A 26375 138 20°C BHI Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.488 A 26377 141C 20°C BHI Duganella zoogloeoides 0.593 A 26378 142B 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.833 A 26379 144 20°C BHI Brevibacillus choshinensis 0.872 M 26380 145A 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.835 A 26381 145B 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.840 A 26382 146 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.844 A 26383 147 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.850 A

Appendix III



Isolatie‐bodem


25361 110 20°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.875 M 25362 111 20°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.857 M 25363 114 20°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.854 A 25364 115 20°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.883 A 25366 118 20°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup B 0.400 A 25367 123 20°C BHI ‐ Bacillus GC group 22 0.034 M 25368 124 20°C BHI ‐ Bacillus mycoides GC subgroup A 0.405 M 25369 125 20°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.784 A 26033 43A 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.817 M 26034 44 37°C BHI x Bacillus licheniformis 0.725 M 26035 45 37°C BHI ‐ Staphylococcus warneri 0.819 M 26045 46 37°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.550 M 26046 47 37°C BHI x Bacillus clausii 0.821 M 26047 48 37°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup D 0.865 M 26048 49 37°C BHI ‐ Kurthia sibirica 0.702 M 26049 50 37°C BHI ‐ Kurthia sibirica 0,699 A 26050 51A 37°C BHI ‐ Bacillus oleronius 0.804 A 26051 51B 37°C BHI ‐ Bacillus amyloliquefaciens 0.907 A 26052 52 37°C BHI ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.767 A 26056 56 37°C SM ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.728 A 26057 57 37°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.801 A 26062 61B 37°C NA Bacillus laevolacticus 0.527 M 26064 63 37°C (NA) x Nesterenkonia halobia 0.525 A 26205 68 37°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.561 M 26206 69A 37°C BHI x Bacillus pumilus GC subgroup B 0.725 M 26207 69B 37°C BHI x Bacillus pumilus GC subgroup B 0.717 M

26208 70 37°C BHI x Bacillus circulans 0.202 M 26209 71 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.820 A 26210 72 37°C BHI Bacillus subtilis 0.905 A 26211 73 37°C BHI x Bacillus laevolacticus 0.545 A 26212 74 37°C BHI x Paenibacillus pabuli 0.745 A 26213 75 37°C BHI x Bacillus circulans 0.628 A 26214 76 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.869 A 26215 77 37°C BHI ‐ Acinetobacter lwoffii GC subgroup A 0.769 A 26216 78 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.734 A 26217 79 37°C BHI x Bacillus lentus 0.419 A 26218 80 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.864 A 26220 82 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.749 A 26221 83 37°C SM x Bacillus laevolacticus 0.711 A 26223 85A 37°C SM ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.831 A 26226 88 37°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.826 A 26228 90A 37°C BHI ‐ Bacillus GC group 22 0.177 A 26229 90B 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.783 A 26233 106 37°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.834 A 26235 107B 37°C NA x Bacillus laevolacticus 0.761 A 26315 13 55°C SM x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.320 A 26318 16 55°C SM Thermus aquaticus GC subgroup B 0.121 A 26327 96B 55°C (NA) x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.368 A 26333 100 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.263 M 26372 119 20°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.864 A 26373 120A 20°C BHI ‐ Bacillus insolitus 0.012 A 26374 120B 20°C BHI ‐ Bacillus insolitus 0.030 A 26997 43B 37°C BHI ‐ Staphylococcus sciuri 0.605 M 27000 108A 37°C (NA) x Staphylococcus schleiferi 0.461 A 27002 121 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.705 A



Isolatie‐bodem


25382 235 20°C BHI Bacillus mycoides GC subgroup A 0.682 A 25383 238 20°C BHI Acinetobacter lwoffii GC subgroup A 0.683 M 25391 251 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.845 A 26238 112B 37°C BHI Bacillus subtilis 0.748 M 26239 113 37°C BHI Bacillus licheniformis 0.826 M 26241 122 37°C BHI Acinetobacter lwoffii GC subgroup B 0.668 M 26242 126 37°C BHI Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.448 M 26243 127 37°C BHI x Paenibacillus alvei GC subgroup A 0.419 M 26246 150 37°C SM Bacillus megaterium GC subgroup A 0.740 A 26248 156 37°C BHI Bacillus sphaericus GC subgroup D 0.407 A 26249 157 37°C BHI Bacillus pumilus GC subgroup B 0.764 A 26253 160A 37°C BHI Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.706 M 26254 160B 37°C BHI Bacillus licheniformis 0.810 M 26255 160C 37°C BHI Bacillus licheniformis 0.759 M 26256 161 37°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.913 M 26257 162 37°C BHI Bacillus licheniformis 0.627 A 26258 163 37°C BHI Bacillus licheniformis 0.706 A 26259 164 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.879 A 26260 165 37°C BHI Staphylococcus hominis hominis 0.802 A 26261 166 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.908 A 26262 167 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.687 A 26263 168 37°C BHI Bacillus sphaericus GC subgroup D 0.461 A 26285 187 37°C BHI Staphylococcus hominis hominis 0.759 A 26337 203 55°C SM *NO MATCH* 0.003 A 26338 204 55°C SM x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.298 A 26340 206 55°C BHI Lechevalieria flava 0.263 A

26341 207 55°C BHI Lechevalieria flava 0.123 A 26342 208 55°C BHI Lechevalieria flava 0.220 A 26343 209 55°C NA Thermus aquaticus GC subgroup B 0.163 A 26345 211 55°C BHI Bacillus laevolacticus 0.357 M 26363 224 55°C (NA) x Staphylococcus sciuri 0.265 A 26364 225 55°C BHI Kytococcus sedentarius 0.057 A 26365 226 55°C BHI Kytococcus sedentarius 0.045 A 26366 227 55°C BHI Kytococcus sedentarius 0.049 A 26367 228 55°C BHI Kytococcus sedentarius 0.095 A 26368 229 55°C BHI Thermus aquaticus GC subgroup B 0.148 A 26369 230 55°C BHI Thermus aquaticus GC subgroup B 0.322 A 26370 231 55°C BHI Geobacillus stearothermophilus 0.498 M 26371 232 55°C BHI Staphylococcus sciuri 0.336 M 26385 234 20°C BHI x Bacillus GC group 22 0.516 A 26386 236 20°C BHI * NO MATCH * 0.000 A 26389 239 20°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.810 M 26390 240 20°C NA Bacillus cereus GC subgroup A 0.811 M 26391 241A 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.819 M 26393 250 20°C SM Bacillus cereus GC subgroup A 0.826 A 27003 128 37°C NA Paenibacillus polymyxa 0.551 A 27005 134B 37°C SM Bacillus pumilus GC subgroup B 0.809 A 27006 148 37°C SM Bacillus sphaericus GC subgroup F 0.470 A 27007 152A 37°C BHI Bacillus subtilis 0.481 A 27008 152B 37°C BHI Bacillus subtilis 0.673 A 27009 153A 37°C BHI Bacillus sphaericus GC subgroup F 0.450 A 27012 155 37°C BHI Bacillus cereus GC subgroup A 0.258 A 27017 253 37°C SM Staphylococcus schleiferi 0.445 A



Isolatie‐bodem


25384 242 20°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.884 M 25385 243 20°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.875 M 25386 244 20°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.865 M 25387 246 20°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.859 A 25388 247 20°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.860 A 25389 248 20°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.873 A 26264 169 37°C BHI ‐ Micrococcus luteus GC subgroup C 0.488 M 26265 170 37°C BHI x Hyphomonas hirschiana 0.181 M 26266 171 37°C BHI x Bacillus clausii 0.428 M 26267 172 37°C BHI x Bacillus alcalophilus 0.210 M 26268 173 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.770 M 26269 174 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.688 M 26270 175 37°C BHI x Bacillus clausii 0.648 A 26271 176 37°C BHI ‐ Bacillus megaterium GC subgroup A 0.448 A 26272 177 37°C BHI ‐ Bacillus licheniformis 0.842 A 26273 178 37°C BHI x Bacillus licheniformis 0.739 A 26274 179A 37°C BHI ‐ Micrococcus luteus GC subgroup C 0.790 A 26275 179B 37°C BHI ‐ Bacillus megaterium GC subgroup A 0.633 A 26276 179C 37°C BHI ‐ Bacillus megaterium GC subgroup A 0.635 A 26277 181B 37°C BHI ‐ Kurthia sibirica 0.519 A 26279 183 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.701 A 26281 185A 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.803 A 26282 185B 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.787 A 26286 188 37°C SM ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.826 M 26287 189 37°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.886 M 26288 190 37°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.886 M

26289 191 37°C BHI ‐ Moraxella catarrhalis 0.270 M 26294 196A 37°C (NA) x Bacillus licheniformis 0.602 A 26298 199 37°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.904 A 26299 200 37°C BHI x Bacillus licheniformis 0.863 A 26300 201 37°C BHI x Bacillus pumilus GC subgroup B 0.567 A 26301 202 37°C BHI ‐ Staphylococcus hominis hominis 0.653 A 26302 252 37°C SM ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.869 M 26344 210 55°C BHI Thermus aquaticus GC subgroup B 0.341 M 26350 215B 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.374 A 26351 215C 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.364 A 26352 216A 55°C BHI x Staphylococcus schleiferi 0.323 A 26353 217A 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.354 A 26355 218 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.340 A 26356 219 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.394 A 26357 220 55°C BHI Geobacillus stearothermophilus GC subgroup A 0.758 A 26358 221A 55°C BHI ‐ * NO MATCH * 0.000 A 26359 221B 55°C BHI ‐ Paenibacillus polymyxa 0.013 A 26384 233 20°C BHI x Listeria monocytogenes/innocua GC subgroup A 0.229 A 26387 237A 20°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.697 M 26388 237B 20°C BHI Bacillus pumilus GC subgroup B 0.721 M 26392 245 20°C NA ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.819 A 27014 180 37°C BHI ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.593 A 27015 181A 37°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.207 A

Tabel 14. Isolaten afkomstig uit melk van conventioneel melkveebedrijf 5; stamnummer in R‐ en OC‐collecties, groeitemperatuur tijdens isolatie, isolatiebodem, X‐galreactie, MIDI‐identificatie en bijhorende similariteitsindex, M/A indicatie.


Isolatie‐bodem


26860 483 20°C BHI ‐ Acinetobacter calcoaceticus 0.629 M 26907 338 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.200 M 26908 339 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.324 M 26909 340 55°C BHI x Ureibacillus thermosphaericus 0.249 M 26918 439 55°C BHI ‐ Ureibacillus thermosphaericus 0.281 M 26919 440 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.344 M 26921 442 55°C BHI ‐ Thermus aquaticus GC subgroup B 0.111 M 26929 443 55°C SM x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.489 M 26930 444A 55°C SM x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.301 M 27018 368 37°C BHI ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.844 M 27019 369 37°C BHI Bacillus sphaericus GC subgroup C 0.839 M 27020 370 37°C BHI x Staphylococcus schleiferi 0.319 M 27021 371 37°C BHI ‐

Bacillus pumilus GC subgroup B 0.577 M

27038 475 37°C SM x Staphylococcus schleiferi 0.243 M


R‐ stamnummer

OC‐stamnummer Isolatie‐temperatuur

Isolatie‐bodem


26861 484 20°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup B 0.507 M 26862 485 20°C BHI ‐ Bacillus cereus GC subgroup A 0.544 M 26864 487 20°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.468 M 26865 488 20°C BHI ‐ Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.459 M 26943 352A 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.116 M 26944 352B 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.147 M 26945 353 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.186 M 26946 354 55°C BHI x Staphylococcus sciuri 0.294 M 26947 355 55°C BHI ‐ Ureibacillus thermosphaericus 0.562 M 26949 450 55°C BHI *NO MATCH* 0.100 M 26950 451A 55°C BHI x Streptococcus salivarius 0.011 M 26951 451B 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.299 M 26952 451C 55°C BHI x Staphylococcus schleiferi 0.310 M 26953 452A 55°C BHI x *NO MATCH* 0.000 M 27029 379A 37°C BHI x Paenibacillus alvei GC subgroup A 0.512 M 27030 379B 37°C BHI x Paenibacillus alvei GC subgroup A 0.566 M 27031 380A 37°C BHI x Staphylococcus schleiferi 0.414 M 27032 380B 37°C BHI x Staphylococcus schleiferi 0.243 M 27330 382 37°C BHI x Bacillus oleronius 0.558 M 27336 421 37°C BHI x Bacillus circulans 0.810 M 27337 422 37°C BHI ‐

Bacillus licheniformis 0.846 M

27338 423 37°C BHI ‐ Micrococcus lylae GC subgroup A 0.728 M 27343 454 55°C (NA) x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.434 M 27350 476 37°C SM ‐ Bacillus licheniformis 0.751 M 27351 477 37°C SM x Bacillus licheniformis 0.787 M

27352 479 37°C SM ‐ Bacillus licheniformis 0.904 M



Isolatie‐bodem


26868 491 20°C BHI x Bacillus sphaericus GC subgroup A 0.515 M 27323 364A 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.198 M 27324 364B 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.119 M 27325 365 55°C BHI x Staphylococcus schleiferi 0.347 M 27326 366A 55°C BHI ‐ Microbispora rosea 0.062 M 27327 366B 55°C BHI ‐ Lechevalieria flava 0.111 M 27328 367A 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.408 M 27329 367B 55°C BHI x Staphylococcus sciuri 0.324 M 27331 400 37°C BHI ‐ Bacillus licheniformis 0.773 M 27332 401 37°C BHI x Bacillus atrophaeus 0.616 M 27333 402 37°C BHI x Paenibacillus lautus 0.503 M 27334 403 37°C BHI x Bacillus cereus 0.149 M 27335 404 37°C BHI ‐ Bacillus GC group 22 0.375 M 27339 427 37°C SM ‐ Bacillus megaterium GC subgroup A 0.698 M 27340 428 37°C SM ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.836 M 27341 430 37°C BHI ‐ Bacillus GC group 22 0.265 M 27342 431 37°C BHI ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup B 0.803 M 27344 460 55°C BHI ‐ Microbispora rosea 0.058 M 27345 461A 55°C BHI ‐ Thermus aquaticus GC subgroup B 0.434 M 27346 461B 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.287 M 27347 462A 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.332 M 27348 462B 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.307 M 27349 463A 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.255 M 27424 463B 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.198 M 27425 463C 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.274 M 27426 464 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.415 M

27427 465 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.220 M 26428 467 55°C SM x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.535 M



Isolatie‐bodem


26854 612 20°C BHI ‐ Pseudomonas putida biotype A 0.507 M 26855 613 20°C BHI x Bacillus licheniformis 0.938 M 26859 616 20°C BHI ‐ Bacillus insolitus 0.012 M 27354 555 37°C BHI ‐ Staphylococcus aureus GC subgroup C 0.722 M 27355 556 37°C BHI ‐ Paenibacillus alvei GC subgroup A 0.504 M 27356 557 37°C BHI ‐ Bacillus licheniformis 0.885 M 27357 558 37°C BHI x Bacillus sphaericus GC subgroup D 0.342 M 27358 559 37°C BHI x Bacillus licheniformis 0.924 M 27359 560 37°C BHI x Paenibacillus lautus 0.617 M 27360 598A 37°C SM ‐ Bacillus megaterium GC subgroup A 0.656 M 27361 598B 37°C SM ‐ Bacillus pumilus GC subgroup B 0.700 M 27362 599 37°C SM ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup B 0.859 M 27363 600 37°C SM ‐ Micrococcus luteus GC subgroup C 0.505 M 27364 601 37°C SM ‐ Bacillus atrophaeus 0.689 M 27365 604 37°C BHI x Bacillus licheniformis 0.898 M 27366 605 37°C BHI ‐ Staphylococcus epidermidis GC subgroup C 0.811 M 26429 509 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.444 M 27430 510 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.302 M 27431 511 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.442 M 27432 520 55°C BHI x Thermus aquaticus GC subgroup B 0.286 M

FACULTEIT WETENSCHAPPEN VOORGELEGD TOT HET...

Documents

Transcript of FACULTEIT WETENSCHAPPEN VOORGELEGD TOT HET...