Exploratie van de wisselwerking tussen de prognostische...

Exploratie van de wisselwerking tussen de

prognostische merkers bij chronische

lymfatische leukemie

Kim Baert

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Philippé Jan

Begeleider: Pede Valerie Vakgroep Klinische biologie, microbiologie en immunologie

Academiejaar 2009-2010

Academiejaar 2009-2010

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor

consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk

gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in

het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te

vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Gent, mei 2010,

De auteur, de promotor,

Baert Kim Philippé Jan

Woord vooraf

Ik wil enkele mensen bedanken die het mogelijk hebben gemaakt om deze masterproef tot een

goed einde te brengen. Eerst en vooral mijn promotor Prof. Dr. Jan Philippé voor de vlotte

samenwerking en de bespreking van de resultaten, alsook voor het nalezen van mijn

masterproef. Ik ben u zeer dankbaar dat u me de kans heeft gegeven om dit onderzoek uit te

voeren.

Valerie Pede, u bedank ik voor de uitstekende begeleiding, de vele verbeteringen en nuttige

tips gedurende de maanden dat ik in het labo was. Ook bedank ik u voor het altijd paraat staan

met goede raad en antwoorden op mijn vele vragen. Het was zeer leerrijk en leuk om met u

samen te werken.

Ook dank aan Prof. Dr. Bruno Verhasselt voor zijn raadgevingen en besprekingen van de

resultaten. Een bijzondere dankuwel aan het Aids Referentie Labo voor de hulp bij het

uitvoeren van de sequenering en aan Davy Vandenbosch voor de uitleg bij het gebruik van de

fluorometer.

Tot slot wil ik u, de lezer, plezier wensen bij het lezen van deze masterproef.

Inhoudstafel

SAMENVATTING ............................................................................................................................................... 1

1. INLEIDING ............................................................................................................................................... 2

1.1 Prognostische merkers bij CLL ................................................................................................................ 3 1.2 B-lymfocyten en immunoglobulinen ...................................................................................................... 8 1.3 Celadhesie en migratie ......................................................................................................................... 10 1.4 Doelstelling onderzoek ......................................................................................................................... 11

2. MATERIAAL EN METHODEN .................................................................................................................. 12

2.1 DEEL 1 ........................................................................................................................................................ 12 2.1.1 Selectie CLL patiënten ...................................................................................................................... 12 2.1.2 Isolatie en stimulatie van de witte bloedcellen ................................................................................ 12 2.1.3 Kleuring B-lymfocyten + flowcytometer ........................................................................................... 13 2.1.4 Isolatie van RNA ............................................................................................................................... 14 2.1.5 Synthese cDNA ................................................................................................................................. 15 2.1.6 Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) ................................................................................................ 15

2.2 DEEL 2 ........................................................................................................................................................ 18 2.2.1 Klonering ........................................................................................................................................... 18 2.2.2 In vitro transcriptie (IVT): mRNA voor LPL......................................................................................... 22 2.2.3 Elektroporatie LPL (EP) ...................................................................................................................... 25 2.2.4 Kwantitatieve real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) ......................................................... 25 2.2.5 ELISA ................................................................................................................................................. 26 2.2.6 Confluolip

TM: Continuous Fluorometric lipase test ............................................................................ 26

2.2.7 Cycle sequencing ............................................................................................................................... 27

3. RESULTATEN ......................................................................................................................................... 29

3.1 DEEL 1 ........................................................................................................................................................ 29 3.1.1 Controle stimulatie............................................................................................................................ 29

3.2 DEEL 2 ........................................................................................................................................................ 30 3.2.1 Klonering ........................................................................................................................................... 30 3.2.2 In vitro transcriptie / elektroporatie ................................................................................................. 32 3.2.3 Eiwitexpressie ................................................................................................................................... 34 3.2.4 Cycle sequencing ............................................................................................................................... 38

4. BESPREKING .......................................................................................................................................... 41

4.1 DEEL 1 ........................................................................................................................................................ 41 4.1.1 Controle stimulatie............................................................................................................................ 41

4.2 DEEL 2 ........................................................................................................................................................ 41 4.2.1 Klonering ........................................................................................................................................... 41 4.2.2 In vitro transcriptie / elektroporatie ................................................................................................. 43 4.2.3 Eiwitexpressie ................................................................................................................................... 44

5. ALGEMEEN BESLUIT .............................................................................................................................. 46

6. REFERENTIES ......................................................................................................................................... 47

Kim Baert Pagina 1

Samenvatting

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is een ziekte met een zeer heterogeen klinisch

verloop. De patiënten worden onderverdeeld in verschillende stadia naargelang de ernst van

de symptomen. Dit systeem verschaft echter geen accurate voorspellingen over de prognose

van de ziekte bij patiënten in een vroeg stadium van de ziekte. Het voorspellen van de

prognose is uiterst belangrijk om zo te bepalen welke behandeling er wanneer gestart moet

worden. Onderscheid maken tussen patiënten met een lange overlevingsperiode (vergelijkbaar

met een gezonde controlepopulatie) en patiënten met een overleving van slechts 3 jaar

gemiddeld, gebeurt nu op basis van de mutatiestatus van de immunoglobuline zware keten

variabele regio (IgVH) gen. Omdat het bepalen van deze mutatiestatus tijdrovend en

arbeidsintensief is werd uitgekeken naar surrogaatmerkers en daarbij werd de expressie van

‘zeta-associated proteïn’ van 70 kDA (ZAP70), lipoproteïnelipase (LPL) en microRNAs

(miRNAs) als meest bruikbare merkers weerhouden. In het eerste deel van dit onderzoek

hebben we ons toegespitst op de veranderingen die plaatsgrijpen in de CLL B-cellen na

stimulatie van de B-cel receptor (BCR). Na het bestuderen van de resultaten verkregen via

‘quantitative real-time reverse transcriptase polymerase reaction’ (qRT-PCR), kunnen we

besluiten dat LPL wordt opgereguleerd na stimulatie van de BCR.

In het tweede deel hebben we LPL mRNA geëlektroporeerd in CLL cellen in een poging om

de functie van LPL in deze cellen te achterhalen. In dit onderzoek hebben we de introductie

van het LPL mRNA in CLL cellen kunnen aantonen via qRT-PCR. Eveneens werd via een

ELISA test gecontroleerd of dit mRNA overgeschreven wordt tot het enzyme LPL.

ConfluolipTM

lipase-activiteit test werd uitgevoerd om de activiteit van LPL in de

geëlektroporeerde cellen te meten. De resultaten van deze testen zijn echter niet eensluidend.

In het vervolg van deze studie zullen de cellulaire functies van LPL via mRNA- en miRNA-

expressieprofielen verder onderzocht worden. Een betere functionele kennis van de

prognostische merkers kan leiden tot identificatie van aangrijpingspunten voor therapie. Er is

namelijk nood aan het prognostisch profiel gekoppelde en geoptimaliseerde behandeling.

Kim Baert Pagina 2

1. Inleiding

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is een B-cel neoplasie gekarakteriseerd door een

progressieve milt- en lymfeknoop-vergroting geassocieerd met chronische lymfocytose. CLL

is de meest frequente leukemie in de westerse wereld, die vooral voorkomt vanaf het zesde

decennium van het leven [1, 2, 3, 4]. De rijpe B-lymfocyten die zich in een G0 fase van de

celcyclus bevinden, accumuleren in het bloed, beenmerg en de lymfoïde weefsels waardoor

andere bloedcellen verdrongen worden [5, 6]. Het exacte moleculaire mechanisme

verantwoordelijk voor de expansie van de klonale B-cellen is nog niet volledig gekend. De

vermoedelijke oorzaak is eerder te wijten aan een defect in het apoptosemechanisme dan aan

een defect bij de celdeling [1]. Ondersteunend voor deze stelling is de bevinding dat in 85%

van de gevallen het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 wordt overgeëxpresseerd. CLL cellen

hebben tot 25 keer meer Bcl-2 dan normale B-cellen [1, 7, 8]. Verder is het p53-gen ook van

belang, in 5-7% van de gevallen treedt er een deletie van het chromosoom 17p (locus van

p53) op wat leidt tot een slechtere prognose. Het p53 gen codeert voor een eiwit dat een

centrale rol speelt in de regulatie van de celcyclus. Patiënten met een del (17p13) hebben een

aanzienlijk kortere overlevingstijd dan patiënten zonder deze afwijking [1, 3, 4, 9, 10].

CLL is een sluimerende ziekte, waarbij initieel de patiënt geen symptomen vertoont. De

diagnose wordt dan ook dikwijls gesteld op basis van een toevallige vondst bij een

routinebloedonderzoek. De diagnose is gebaseerd op het aantal (meer dan 5 x 106 B-

cellen/mL), de morfologie (kleine lymfocyten met geblokt chromatinepatroon en onzichtbare

nucleoli) en de aanwezigheid van een uniek immunofenotype van de B-cellen

(CD5+/CD23+/CD20zwak/FMC7-/CD79bzwak); met een zwakke expressie van de klonale

immunoglobulines (frequent IgM en IgD) [1, 2]. Na verloop van tijd kunnen er symptomen

optreden zoals bleekheid, onverklaarbare vermoeidheid, herhaalde infecties, nachtelijke

koorts en zweten [11].

Deze vorm van leukemie heeft een gemiddelde incidentie van 2,7 per 100 000 personen in de

Verenigde Staten. CLL komt meer voor bij mannen dan bij vrouwen [11]. De ziekte is nog

steeds niet te genezen, maar kan wel tot op zekere hoogte onder controle gehouden worden.

Algemeen raadt men aan de behandeling uit te stellen tot op het moment van ziekteprogressie.

Bij een snel verlopend ziekteproces wordt gestart met celremmende chemotherapeutica [1, 9].

Kim Baert Pagina 3

De meest gebruikte geneesmiddelen om CLL te behandelen zijn chlorambucil (Leukeran®)

en fludarabine (Fludara®). Deze therapie leidt echter niet tot genezing [9, 12].

Af en toe wordt er een splenectomie uitgevoerd bij CLL patiënten. Deze operatie kan de

leukemie niet genezen, maar doet het aantal rode bloedcellen en plaatjes stijgen. Als de milt te

groot wordt, worden rode bloedcellen en bloedplaatjes gepoold en sneller afgebroken in de

milt wat leidt tot een anemie en trombocytopenie [13].

Stamceltransplantatie wordt zeer weinig toegepast, maar kan in combinatie met

chemotherapie een effectieve behandeling zijn. Na de chemotherapie krijgt de patiënt een

transplantatie waardoor de hematopoïese sneller op gang kan komen. Deze stamcellen kunnen

autoloog zijn of men kan een geschikte donor zoeken (allogeen). Uit onderzoek [14] is

gebleken dat bij een autologe transplantatie er slechts een kleine transplantatiegerelateerde

mortaliteit is terwijl ongeveer 80 % van de patiënten een volledige remissie kent, hoewel het

toch geen curatieve therapie blijkt te zijn. Bij een autologe transplantatie is er steeds kans dat

er toch een kleine hoeveelheid maligne cellen aanwezig is waardoor er later een herval zou

kunnen optreden. Allogene transplantaties hebben een veel hoger transplantatiegerelateerde

mortaliteit maar bij 40-60% van de patiënten treedt een volledige genezing op [14].

Patiënten met CLL overlijden meestal ten gevolge van een infectie, vermits de accumulatie

van de monoklonale lymfocyten de andere B-cellen verdringen [15].

1.1 Prognostische merkers bij CLL

Patiënten met B-CLL vertonen een heterogeen klinisch verloop. Sommige kunnen zeer lang

overleven zonder behandeling, terwijl anderen snel sterven ondanks een agressieve therapie

[1, 3, 9]. Onderverdeling van de patiënten in verschillende stadia wordt vooral gebaseerd op

het aantal vergrootte lymfeknopen al dan niet geassocieerd met splenomegalie, anemie en/of

trombocytopenie [3, 9]. Deze onderverdeling volgens Binet of Rai wordt wereldwijd gebruikt

en verschaft waardevolle prognostische informatie om intermediaire- en hoogrisico patiënten

te identificeren. Toch verschaft dit systeem geen accurate voorspellingen in de evolutie van

deze ziekte bij patiënten in een vroeg stadium (Binet A of Rai I) van de ziekte [3, 9, 12]. Het

is belangrijk om de prognose van de patiënten in een vroeg stadium accuraat te kunnen

bepalen om zo een optimale behandeling in te stellen. Patiënten met de agressieve vorm

zullen voordeel halen uit deze vroegtijdige voorspellingen door ze te behandelen vooraleer de

progressie optreedt, terwijl patiënten met de milde vorm geen agressieve therapie moeten

ondergaan. Daarom is men op zoek gegaan naar prognostische merkers. Er zijn al

verschillende merkers ontdekt; hierbij is de bepaling van de mutatiestatus van de

Kim Baert Pagina 4

immunoglobuline zware keten variabele regio (IgVH) genen de gouden standaard. De niet-

gemuteerde status (pre-germinale center naïve B-cellen) correleert met een slechtere prognose

(overlevingstijd van gemiddeld 3 jaar), de gemuteerde status (post-germinale center B-cellen)

met een goede prognose (overlevingstijd van meer dan 10 jaar) [1, 2, 3, 4, 9, 12]. De

sequentie van het IgVH gen wordt voor iedere patiënt bepaald met een forward en reverse

primer. De forward primer is complementair met de variabele regio van het immunoglobuline,

terwijl de reverse primer zal binden met de joining regio. De gevonden sequentie wordt dan

vergeleken met de kiemlijnsequentie om na te gaan hoeveel mutaties er zijn opgetreden.

Wanneer het percentage homologie meer dan 98% bedraagt, wordt het IgVH gen als

ongemuteerd beschouwd [10]. Deze analyse is echter niet eenvoudig en zeer arbeidsintensief.

Hierdoor werd er gezocht naar surrogaatmerkers voor de IgVH status om individuele patiënten

te evalueren [1, 2, 3, 9, 10, 12].

‘Zeta-associated proteïn’ van 70 kDA (ZAP70) blijkt een goede surrogaatmerker te zijn

waarbij hoge ZAP70 expressie correleert met een ongemuteerde status en dus ook een slechte

prognose [1, 3, 6, 9, 16]. ZAP70 wordt normaal geëxpresseerd in T- en NK-cellen [3, 9, 10].

Dit eiwit is een tyrosine kinase, dat bestaat uit 2 N-terminale SH2 domeinen, die

gefosforyleerde ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) binden, en één C-

terminaal kinase domein. ITAMs zijn verbonden met de cytoplasmatische ζ-keten van het

CD3 complex (gelegen in de T-cel). De twee tyrosines in de ITAM sequenties worden

gefosforyleerd door twee Src familie kinase (SFK) leden. Deze SFK leden (Lck en Fyn)

worden geactiveerd na interactie van de T-cel receptor (TCR) met het MHCII:peptidecomplex

(major histocompatibiliteitscomplex). Deze fosforylatie leidt tot recrutering van ZAP70 naar

het dubbel-gefosforyleerde ITAM. Actief ZAP70 fosforyleert tenminste twee kritische

belangrijke adaptor-proteïnes, nl. linker for the activation of T-cel (LAT) en Src homologie 2.

Deze gefosforyleerde adaptor proteïnes recruteren verschillende andere signaalmoleculen wat

downstream biochemische reacties veroorzaakt. Deze fosforylatiecascade kan leiden tot

transcriptionele veranderingen die lymfokine productie, T-cel differentiatie en proliferatie

kunnen veroorzaken (figuur 1) [6, 17]. Normale rijpe B-cellen hebben geen expressie van

ZAP70, maar wel van een functioneel analoog van ZAP70, nl. Syk, dat een honderd maal

hogere intrinsieke kinase activiteit bezit dan ZAP70 [6]. Sommige CLL patiënten hebben

echter wel expressie van ZAP70 in de B-cellen. De functie hiervan is tot op heden niet

gekend. Deze expressie doet vermoeden dat ZAP70 de B-cel signalisatie kan beïnvloeden in

een subset van CLL cellen en zo kan bijdragen tot een agressievere vorm van de ziekte [6,

Kim Baert Pagina 5

16]. Na activatie van de B-cel receptor (BCR) kan de aanwezigheid van ZAP70 voor

verhoogde fosforylatie van Syk zorgen wat leidt tot verhoogde proliferatie en differentiatie

(figuur 1) [6, 7, 16]. Uit onderzoek blijkt dat classificatie volgens het expressieniveau van

ZAP70 zeer accuraat is [9].

Figuur 1. Schematische voorstelling van de TCR en BCR signalisatie [7].

Na interactie van TCR met het MHCII:peptidecomplex worden ITAMs van de CD3 en ζ -ketens van de TCR

gefosforyleerd door recrutering van SFK leden (Lck en Fyn). Recrutering van ZAP70 naar deze ITAMs leidt tot fosforylatie en activatie van PTK, welke het signaal doorgeeft aan adaptor proteïnes en second

messengers. Deze fosforylatiecascade kan leiden tot transcriptionele veranderingen die lymfokine productie, T cel differentiatie en proliferatie kunnen veroorzaken.

De betrokkenheid van ZAP70 in BCR signalisatie in CLL cellen leidt tot verhoogde fosforylatie van Syk,

PLCγ en verhoogde calcium mobilisatie. Dit activeert eveneens downstream pathways wat leidt tot

celproliferatie en differentiatie.

Lipoproteïnelipase (LPL) is eveneens een prognostische merker voor CLL [12, 18]. Een hoge

LPL expressie correleert met een ongemuteerde status van IgVH en kortere overlevingstijd.

Bij gezonde personen wordt LPL voornamelijk teruggevonden in het hart, de spier, het

vetweefsel en in de endotheliale cellen die de capillairen aflijnen. De expressie van LPL komt

niet of in zeer lage concentraties voor in normale B-cellen, waar CLL cellen LPL wel tot

expressie brengen. De functie van LPL in deze CLL B-cellen is nog onbekend [2, 10, 18, 19,

20].

LPL speelt een centrale rol in het lipide metabolisme en transport. Dit enzyme hydrolyseert de

triglyceriden aanwezig in circulerende lipoproteïnes, zoals chylomicronen en very low density

Kim Baert Pagina 6

lipoproteïnes (VLDL) [2]. LPL wordt in de lever opgenomen en gedegradeerd. Dysfunctie

van LPL wordt dikwijls met dyslipidemie en atherosclerose geassocieerd [18, 20].

Naast zijn katalytische functie, kan LPL ook dienst doen als een eiwit-brug tussen

celoppervlakte proteïnes en lipoproteïnes, leidend tot verhoogde opname van lipoproteïnes in

de cellen. Zo kan het de interactie tussen monocyten en de capillaire endotheliale

celoppervlakte heparine glycosaminoglycaan componenten verhogen. LPL heeft namelijk

zowel aan het N-terminale als aan het C-terminale domein een heparine-bindingszijde (figuur

2). Dit ‘bridging vermogen’ zou de interactie van CLL cellen met stromale cellen kunnen

promoten. Het actieve enzyme (open conformatie) is een niet-covalent homodimeer waarbij

de katalytische zijde toegankelijk is voor het substraat, terwijl deze in gesloten conformatie

afgeschermd is. De activiteit van LPL wordt op een weefselspecifieke manier gereguleerd,

afhankelijk van de metabolische noden. Zo blijft het correcte level van lipoproteïnes in het

bloed behouden alsook de balans van hun katabolisme, zodat de juiste hoeveelheid vetzuren

naar het juiste weefsel op het juiste moment geleverd wordt [21].

Figuur 2. Moleculaire modellering van de dimerische structuur van LPL [21].

A: structurele zicht LPL zijwaarts; B: structurele zicht LPL van bovenaanzicht.

Geel: N-terminale heparine-bindings zijde; groen: basische aminozuren in het C-terminale domein; rood: cluster van hydrofobische residues. De katalytische zijde is vergroot weergegeven in B.

Kim Baert Pagina 7

Pallasch et al. [2] heeft aangetoond dat de expressie van LPL in CLL cellen geïnduceerd kan

worden door stimulatie van de B-cel receptor. LPL expressie treedt eveneens op zonder B-cel

stimulatie bij CLL patiënten met de niet-gemuteerde status. LPL komt niet tot expressie in

normale B-cellen of niet-gestimuleerde gemuteerde CLL cellen.

LPL als een prognostische factor heeft een voordeel tegenover het bepalen van de ZAP70

expressie. Het meten van de expressie van LPL in de B-cellen wordt namelijk niet beïnvloedt

door de aanwezigheid van andere bloedcellen (NK en T cellen) in het staal, zoals dat wel het

geval is bij de bepaling van ZAP70 [10, 20].

Uit onderzoek [1] blijkt dat eveneens de expressie van microRNAs (miRNAs) correleert met

de mutatiestatus. miRNAs zijn niet-coderende, enkelstrengige RNA-moleculen van 21-23

nucleotiden lang. Zij reguleren de eiwitexpressie via post-translationele gen silencing.

Het primair transcript wordt overgeschreven van het genoom, maar wordt niet vertaald tot een

proteïne. Dit primair miRNA wordt omgevormd tot een korte stem-loop structuur; het pre-

miRNA. Dit wordt uitgevoerd door het nuclease Drosha en de dubbelstrengige RNA bindende

molecule Pacha. Pre-miRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma via Exportine 5. Het

endonuclease Dicer zet het pre-miRNA verder om tot het uiteindelijke miRNA. In het

cytoplasma worden deze mature miRNAs geïncorporeerd in het RNA-induced silencing

complex (RISC) welke verantwoordelijk is voor de degradatie van het doelwit mRNA of de

translatie inhibitie (figuur 3) [1, 8, 22, 23, 24]. Argonaute, de grootste component van het

RISC complex, associeert namelijk met een korte regio (7 nucleotiden) in het 3’UTR van het

doelwit mRNA. Binding aan deze regio leidt tot inhibitie van translatie.

Het ander mechanisme voor gen silencing is miRNA-gemedieerde translatie repressie van het

target transcript, terwijl de miRNA het doelwit 3’UTR bindt met verschillende mismatches.

Deze gedeeltelijke complementariteit laat de miRNAs toe om 200-tal verschillende doelwitten

3’UTRs te binden [8].

Momenteel zijn reeds ruim 700 miRNAs geïdentificeerd in het humane genoom, waarbij de

meeste evolutionair geconserveerd zijn in muis en rat [1]. Ze spelen een rol in de controle van

celproliferatie, apoptose en celmetabolisme [8, 22, 24]. Er werd reeds aangetoond dat de

miRNA-expressieprofielen van CLL B-cellen verschillen met die van normale B-cellen. Zo

wordt de tumor suppressive miRNA miR-15/miR-16 cluster dikwijls downgereguleerd bij

CLL. Hierdoor komen deze miRNAs niet tot expressie in CLL cellen, wat leidt tot verhoogde

levels van Bcl-2 [1, 8, 22, 23].

Kim Baert Pagina 8

Figuur 3. miRNA biogenese [8].

Primair miRNA wordt overgeschreven van het genoom. Dit primair miRNA wordt omgevormd tot een korte stem-loop structuur; het pre-miRNA. Dit wordt uitgevoerd door het nuclease Drosha en de dubbelstrengige

RNA bindende molecule Pacha. Pre-miRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma via Exportine 5. Het

endonuclease Dicer zet het verder om tot het uiteindelijke miRNA van 21-23 nucleotide lang. In het cytoplasma worden deze mature miRNAs geïncorporeerd in het RNA-induced silencing complex (RISC)

welke verantwoordelijk is voor de degradatie van het doelwit mRNA of de translatie inhibitie.

Hoewel voor deze merkers een prognostische capaciteit werd aangetoond, worden er

vooralsnog geen van deze merkers opgenomen in internationale richtlijnen voor de

behandeling van CLL patiënten. Dit is naast het recente karakter ook te wijten aan een gebrek

aan gestandaardiseerde testen [3, 9, 19]. In dit onderzoek zal de wisselwerking van de

prognostische merkers ZAP70, LPL en miRNAs onderzocht worden in CLL patiënten om zo

de cellulaire functie van deze merkers te achterhalen. Deze merkers zouden immers kunnen

dienen als therapeutisch doelwit.

1.2 B-lymfocyten en immunoglobulinen

Immunoglobulinen (Ig of antilichamen) komen voor als receptor op het oppervlak van de B-

lymfocyten (IgM en IgD bij CLL) of kunnen vrij aanwezig zijn in het bloed. Antilichamen

dragen een typische moleculaire signatuur opgebouwd uit twee zware en twee lichte

polypeptide ketens. Deze ketens worden gecodeerd door verschillende gensegmenten, die uit

de variabele regio (V-genen), de constante regio (C-genen), de diversity regio (D-genen) en

de joining regio (J-genen) worden opgebouwd. De mogelijkheid tot recombinatie van deze

gensegmenten verklaart grotendeels de verscheidenheid die er bestaat tussen de zware keten

van de immunoglobulinen (figuur 4) [25].

Kim Baert Pagina 9

Figuur 4. Samenstelling van IgH genen.

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3e/VDJ_recombination.png).

Variabele (V), diversity (D), and joining (J) gensegmenten. Er bestaan verschillende recombinatie

mogelijkheden wat de verscheidenheid tussen de zware keten van de immunoglobulinen verklaart.

Somatische mutaties tijdens de ontwikkeling van de B-cel dragen eveneens bij tot deze grote

verscheidenheid. Na contact met een antigeen op de folliculaire dendritische cel, migreren de

rijpe B-cellen vanuit het beenmerg naar de perifere lymfoïde organen. In deze primaire

lymfefollikels grijpt de kiemcentrumreactie plaats; de variabele regio van het

immunoglobulinegen ondergaat somatische hypermutaties. Dit proces geeft aanleiding tot

cellen met een BCR met een verschillende affiniteit om het antigeen te binden. Cellen die

sterk kunnen binden, hebben een proliferatief voordeel ten opzichte van cellen die zwak

binden [25]. Het exacte mechanisme van deze mutaties is nog onbekend. Zoals reeds gezegd

is de aan- of afwezigheid van deze mutaties een belangrijke prognostische factor bij B-CLL

patiënten [1, 3, 8, 9, 12, 23]. De ZAP70 en LPL expressies liggen gemiddeld lager in

gemuteerde CLL gevallen [1, 3, 6, 12, 18].

BCR is de sleutelmolecule in de activatie van de CLL cellen, waarschijnlijk door de

herkenning van een autoantigeen [4]. Na binding van het antigeen op de BCR komt FOS tot

expressie door de activering van de NF-κB pathway en deze signaalweg leidt tot differentiatie

en proliferatie van de B-cellen [16]. Eveneens blijkt er een downregulatie te zijn van CXCR4

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3e/VDJ_recombination.png

Kim Baert Pagina 10

(een chemokine receptor) te zijn na stimulatie van de BCR. Dit wijst op een mogelijke rol van

chemokines in CLL [5, 26].

1.3 Celadhesie en migratie

Celadhesie en migratie zijn centrale aspecten van de pathofysiologie van CLL, wanneer alle

lymfeknopen ingenomen zijn zal de overlevingskans van de patiënt sterk dalen. High

endothelial venules (HEVs) zijn belangrijke routes waarlangs lymfocyten de lymfeknoop

binnentreden. De receptoren en liganden (chemokines) die bij deze migratie betrokken zijn,

zijn nog niet duidelijk gedefinieerd. De invloed van ZAP70 en LPL op deze chemokines is

ook nog ongekend [5, 26].

De micro-omgeving van de CLL cellen in de lymfeknopen wordt opgebouwd uit accessory

cellen (waaronder NLCs of nurselike cellen) die tumorgroei en drugsresistentie promoten.

NLCs zijn grote, ronde adherente cellen die differentiëren uit monocyten [5, 27]. Het

doorbreken van de crosstalk tussen de CLL B-cellen en hun milieu kan een aangrijpingspunt

zijn voor nieuwe behandelingsstrategieën bij CLL patiënten [27].

CLL cellen accumuleren snel in vivo maar ondergaan spontane apoptose in vitro. Er treedt

geen apoptose op bij cocultuur van CLL cellen met NLCs, wat erop wijst dat hun apoptose

resistentie afhangt van externe signalen, eerder dan een intrinsieke eigenschap te zijn van de

CLL cellen [27]. NLCs trekken CLL cellen aan door de secretie van de chemokines CXCL12

en CXCL13. CXCL12 (SDF-1) is een chemotactisch en anti-apoptotische factor voor CLL

cellen. CXCL12 bindt namelijk op zijn receptor CXCR4, welke in hoge levels geëxpresseerd

wordt op CLL cellen. CXCR4 antagonisten maken CLL cellen gevoeliger voor

chemotherapeutische geneesmiddelen [5]. CXCL13 bindt CXCR5, dat zich ook in hoge levels

op CLL cellen bevindt [5, 26]. Dit chemokine is eerder betrokken in de vorming van follikels

dan de migratie van de B-cellen naar de lymfeknopen [26].

Uit onderzoek [5, 27] blijkt dat chemokines geïnduceerd kunnen worden via BCR activatie.

Er is een positieve correlatie ontdekt tussen gestimuleerde CLL cellen en de inductie van

chemokines CCL3 en CCL4. Deze chemokines kunnen andere ondersteundende cellen (zoals

T-cellen) aantrekken. Dit suggereert dat de CLL cellen een actieve rol spelen in het creëren

van een ondersteunende omgeving. Dit kan veroorzaakt worden door de aanwezigheid van

ZAP70, maar de signalen voor chemokine-inductie kunnen eveneens overgebracht worden via

Syk. Deze hypothese wordt bekrachtigd door toediening van R406, een specifieke Syk

inhibitor. R406 inhibeert de inductie van CCL3 en CCL4 secretie in CLL cellen. Het

Kim Baert Pagina 11

mechanisme en de mogelijke antilichamen die in de interactie CLL-NLCs betrokken zijn

moet nog grondig onderzocht worden [5].

1.4 Doelstelling onderzoek

In het eerste deel van dit onderzoek zullen we het effect van stimulatie nagaan. De CLL B-

cellen worden gestimuleerd door middel van een anti-IgM antigeen. De stimulus kan

geëvalueerd worden aan de hand van het eiwit FOS dat tot expressie komt; deze expressie

zullen we bepalen om de stimulatie-efficiëntie te controleren. De patiënten worden ingedeeld

volgens hun mutatiestatus, ZAP70 en LPL aanwezigheid. Via ‘quantitative real-time reverse

transcriptase polymerase reaction’ (qRT-PCR) zal het effect van stimulatie bij de

geselecteerde patiënten onderzocht worden, waarbij we ons toespitsen op de expressie

veranderingen van het enzyme LPL.

In het tweede deel zullen we LPL mRNA elektroporeren in CLL cellen. Hiervoor zullen we

cellen isoleren van CLL patiënten met een goede prognose (gemuteerde B-cellen met

afwezigheid van ZAP70 (ZAP70-) en afwezigheid van LPL (LPL-)). Zo kunnen we bepalen

wat het effect is op RNA-niveau uitsluitend te wijten aan de aanwezigheid van LPL.

Nadien zal men na RNA isolatie mRNA- en miRNA-expressieprofielen opstellen. Deze

expressieprofielen zouden het verschil op RNA-niveau tussen de verschillende patiëntgroepen

moeten blootleggen. Dit zou ons iets kunnen leren over de cellulaire functie van LPL in de

CLL B-cellen om zo een mogelijke verklaring voor het ongunstiger verloop op te sporen. Een

betere causale kennis van de agressieve vorm van CLL zou kunnen leiden tot identificatie van

nieuwe aangrijpingspunten voor behandeling. Er is namelijk nood aan het prognostisch profiel

gekoppelde en geoptimaliseerde behandeling.

Kim Baert Pagina 12

2. Materiaal en methoden

2.1 DEEL 1 2.1.1 Selectie CLL patiënten

Patiënten worden geselecteerd op basis van de kliniek en de labresultaten. Vooral dit laatste is

van belang: per definitie vinden we bij CLL minstens 5000 klonale B-cellen/µL in het perifeer

bloed met een rijpcellige cytomorfologie en met CD5 en CD23 expressie aanwezig. Hiervan

werden er een 15-tal patiënten geselecteerd waarvan de mutatiestatus, LPL en ZAP70

aanwezigheid gekend is. Dit onderzoek werd goedgekeurd door het ethisch comité van het UZ

Gent en de patiënten onderschrijven een informed consent.

2.1.2 Isolatie en stimulatie van de witte bloedcellen

Witte bloedcellen (WBC) worden geïsoleerd uit vers afgenomen bloed van deze patiënten. Dit

bloedstaal wordt bij afname onstolbaar gemaakt met EDTA. Als alternatief kan ook gewerkt

worden met ingevroren lymfocyten die op een eerder tijdstip werden geïsoleerd. Ontdooien

van deze cellen gebeurt snel in een warmwaterbad.

Verse bloedstalen (~ 8 mL) van patiënten worden 2X verdund met Iscove’s Modified

Dulbecco’s Medium (IMDM, Invitrogen, Merelbeke, België). Toevoeging van 3 mL

lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noorwegen) bij het verdunde staal gevolgd door centrifugatie

resulteert in de scheiding van de oplossing in 4 fases. De gevormde laag met mononucleaire

cellen zal voorzichtig opgezogen worden met een pipet en overgebracht worden naar een

andere falconbuis. Na het wassen (2X) worden de cellen geteld in de Bürker celtelkamer. De

cellen worden 10X verdund met PBS (Lonza, Verviers, België) en trypaanblauw om zo geteld

te worden onder de microscoop. Er worden, indien voorradig, 40 x 106 cellen geïsoleerd per

patiënt en, na centrifugatie, opgelost in 4 mL CLL medium (IMDM verrijkt met 10% foetaal

kalf serum (Gibco, Paisly, VK), 1% penicilline en streptomycine (Invitrogen) en 1%

glutamine (Invitrogen)). Per patiënt worden 4 welletjes gevuld met 1 mL van deze oplossing,

zodat er telkens 10 x 106 CLL cellen per mL aanwezig zijn.

Vervolgens worden de CLL B-cellen gestimuleerd met 10 µL anti-IgM beads (Irvine

Scientific, California, VS). Als negatieve controle worden er 10 µL anti-IgA beads

toegevoegd die niet zullen binden, en dus geen stimulatie zullen uitlokken (tabel 1). Via de

EasySepTM

-technologie (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada), een

aanrijkingsmethode, zullen we na 3 uur en na 24 uur de B-CLL cellen selecteren. EasySepTM

Kim Baert Pagina 13

maakt gebruik van magnetische beads. Deze beads zijn nanopartikels bestaande uit ijzeroxide

bij elkaar gehouden door polymeren en hebben een unieke kwaliteit (superparamagnetisme) in

de aanwezigheid van een extern magnetisch veld. De cellen worden negatief geselecteerd

door de ongewenste lymfocyten (gelabeld met een cocktail van antilichamen) te crosslinken

aan de nanopartikels in de speciaal ontworpen EasySepTM

magneet. De gewenste cellen, die

niet binden, zullen na incubatie verzameld worden in een nieuw FACS buisje, terwijl de

magnetische gelabelde ongewenste cellen achterblijven in het oorspronkelijke buisje. Na

wassen van deze cellen worden ze geresuspendeerd in 1 mL TRIzol (Invitrogen).

Tabel 1. Overzicht stimulatie CLL cellen.

Schematische voorstelling van de gestimuleerde cellen. In elk welletjes bevinden zich 10 x 106 cellen.

IgA: antilichaam dat niet zal binden; IgM: antilichaam die B-cellen zullen stimuleren.

2.1.3 Kleuring B-lymfocyten + flowcytometer

Om de zuiverheid van de selectie te beoordelen wordt een kleine portie van de cellen gemerkt

door toevoeging van 2 µL CD7 FITC antilichaam en 2 µL CD19 PE antilichaam (BD

Biosciences, Erembodegem, België). De gekleurde B-cellen worden vervolgens via de

flowcytometer (BD Biosciences LSR II) afgelezen. Via flowcytometrie zal men de cellen

scheiden volgens grootte (forward scatter) en granulariteit (side scatter). Fluorescent-

gebaseerde detectie hangt af van de absorptie van het licht door de gelabelde cellen en de

emissie van dit licht bij een verschillende frequentie. Flowcytometrie maakt gebruik van deze

technologie door filters te gebruiken die enkel de gewenste emissiegolflengte doorlaat (figuur

5). Bij een frequentie van 488 nm (argon ion laserlicht) zullen de gebruikte fluorochromen

exciteren. De emissiegolflengte worden voor het FITC-label gemeten bij 525 nm en voor PE

bij 575 nm (http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/).

De antilichamen gericht tegen CD7 (T-celmerker) zullen groen fluoresceren (FITC), dit zijn

de cellen waarop we niet geselecteerd hebben. Antilichamen die gericht zijn tegen CD19

zullen rood (PE) kleuren, dit zijn de B-lymfocyten. Hierbij dient te worden opgemerkt dat er

sterische hindering kan optreden door de anti-IgM beads. Bij elke staal wordt er 4 µL PI

(propidium iodide) toegevoegd, PI wordt opgenomen door de dode cellen. Viabiliteit van de

B-cellen wordt bepaald door het percentage PI-negatieve en CD19-positieve cellen.

IgA

3u

IgM

3u

IgA

24u

IgM

24u

http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/

Kim Baert Pagina 14

Figuur 5. Schematische voorstelling van flowcytometer.

(http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/).

De verschillende componenten van de flowcytometer zijn weergegeven in deze figuur: lichtbron (laser), een vloeibare flow dat de celsuspensie doorheen de flowcytometer stuurt, een detector (photomultiplier) die het

geëmitteerde licht kan meten.

2.1.4 Isolatie van RNA

Er wordt gebruik gemaakt van een TRIzol-gebaseerde methode. TRIzol (Invitrogen) is een

monofasische oplossing van fenol en guanidine-isothiocyanaat. De cellen zullen lyseren, maar

de integriteit van het RNA blijft behouden. Chloroform (140 µL) (Sigma-Aldrich, St-Louis,

VS) wordt toegevoegd aan de geïsoleerde B-cellen (geresuspendeerd in 1 mL TRIzol),

waardoor er 3 fases ontstaan na centrifugatie (15 minuten, 4°C, 13000 rpm): een onderste roze

organische fase en chloroform, een witte DNA-interfase en een bovenste kleurloze waterige

fase met RNA. Deze bovenstaande fase wordt in een apart buisje overgebracht en aangelengd

met 100% ethanol (1,5 keer het volume) (VWR, Leuven, België), om geschikte

bindingscondities voor alle RNA molecules te voorzien. Dit staal wordt vervolgens op een

RNeasy Mini spin kolom (Qiagen, Venlo, Nederland) gebracht, waar het totale RNA aan de

membraan bindt en fenol en andere contaminanten efficiënt worden weggewassen. Het RNA

wordt ten slotte geëlueerd in 30 µL nuclease-vrij water (NF-H2O) (Applied Biosystems,

Foster City, VS).

De concentratie van het RNA wordt bepaald via de Nanodrop 1000 Spectrophotometer

(Isogen Life Science, St-Pieters-Leeuw, België). Nanodrop is een volledig spectrum (220-750

nm) spectrophotometer dat 1 µL stalen meet met een hoge accuraatheid en

reproduceerbaarheid. Enkel via oppervlaktespanning wordt het staal op zijn plaats gehouden,

wat de nood voor cuvetten en andere staalcontaminerende hulpmiddelen elimineert. De

Nanodrop heeft eveneens de mogelijkheid om hoog geconcentreerde stalen zonder dilutie te

http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/

Kim Baert Pagina 15

meten. RNA-concentratie wordt gemeten door de absorbantie te bepalen bij 260 nm.

Eveneens wordt de verhouding 260/280 nm bepaald om de zuiverheid van het RNA te

beoordelen. Een verhouding van ~ 2 wordt geaccepteerd als ‘zuiver RNA’. Dit RNA kan

bewaard worden bij -80°C [28].

2.1.5 Synthese cDNA

In de PCR reactie wordt er gebruik gemaakt van een DNA polymerase, dit wil zeggen dat

enkel DNA geamplificeerd kan worden. Het geïsoleerde RNA zal dus eerst omgezet moeten

worden in complementair DNA (cDNA). Het RNA fungeert hier als template voor de

synthese van enkelstrengig cDNA. Er wordt gewerkt met een SuperScriptTM

III First-Strand

Synthesis System for Real-time PCR kit van Invitrogen. Per reactie wordt er 1 µg RNA, 13X

Random hexamers en 13X dNTP mix samengevoegd en aangelengd met NF-H2O tot een

totaal volume van 13 µL. Vervolgens 5 minuten geïncubeerd in een 65°C hitteblok. Deze

epjes worden dan 3 minuten op ijs geplaatst en per reactie wordt er ten slotte een reverse

transcriptase mix (4 µL First Strand Buffer, 1 µL DTT, 1 µL RnaseOUT inhibitor en 1 µL

Superscript III RT) toegevoegd. Dit reactiemengsel wordt geplaatst in de 2720 Thermal cycler

van Applied Biosystems (programma: eerste 5 minuten bij 25°C, volgende 50 minuten bij

50°C en ten slotte nog 15 minuten bij 70°C). Na 3 minuten koelen op ijs wordt er ten slotte 30

µL NF-H2O aan deze suspensie toegevoegd. Dit cDNA wordt bewaard bij -20°C.

2.1.6 Kwantitatieve real-time PCR (qPCR)

De kwantitatieve PCR die in dit onderzoek gebruikt wordt om de genexpressie van FOS en

LPL in CLL B-cellen te onderzoeken maakt gebruik van de TaqMan-technologie. Deze

combineert een TaqMan-probe en de 5’ 3’ exonuclease-activiteit van het Taq-polymerase.

De TaqMan-probe is een oligonucleotide met aan het 5’ uiteinde een reportermolecule en aan

het 3’ uiteinde een quenchermolecule. Wanneer de probe niet hybridiseert, resulteert de

nabijheid van de quencher en reporter in de onderdrukking van de reporterfluorescentie

waardoor geen signaal wordt waargenomen. De opeenvolgende stappen (denaturatie,

annealing en elongatie) van een klassieke PCR worden hier ook uitgevoerd. Tijdens de

annealingstap zullen de TaqMan-probe en -primers met de specifieke sequentie van het cDNA

binden. De 5’ 3’ exonuclease-activiteit van het AmpliTaq Gold enzyme breekt de

gebonden probe af, wat leidt tot de scheiding van de reporter en de quencher, dat fluorescentie

tot gevolg heeft. De reporterfluorescentie die dan gemeten wordt na elke elongatiestap

correleert met de toename van het PCR-product (figuur 6) [29].

Kim Baert Pagina 16

Figuur 6. Schematische voorstelling van qPCR.

(http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx).

Real-time PCR-probes bestaan uit een oligonucleotide; complementair aan het cDNA. De probe is

gelabeld aan het 5’ einde met een fluorescente reportermolecule en aan het 3’ einde met een quencher.

Wanneer er geen complementaire sequentie beschikbaar is zal de fluorescentie ‘gedoofd’ zijn. Tijdens de PCR zal de oligonucleotide met het doelwitsequentie hybridiseren waardoor de 5’ fluorescentie verwijderd

wordt via de 3’ exonuclease activiteit van het TaqMan-polymerase. Zo kan men de fluorescentie meten, vermits deze niet meer ‘gedoofd’ wordt door de quencher.

In dit onderzoek wordt er gebruik gemaakt van een 7300 RealTime PCR System (Applied

Biosystems). Optimale PCR-condities worden verkregen met forward (FOR) en reverse

(REV) primers met een finale concentratie van 10 mM. Amplificatie werd toegepast op het

aangemaakte cDNA onder volgende condities: 50°C voor 2 minuten, een initiële

denaturatiestap voor 10 minuten bij 95°C, gevolgd door 50 cycli voor 30 seconden bij 95°C

en voor 1 minuut bij 60°C.

De probe en primers voor FOS werden ‘assay on demand’ aangemaakt door Applied

Biosystems. Voor het PCR-reactiemengsel (buffer, magnesiumchloride, enzymes en

nuleotides) wordt gebruik gemaakt van het TaqMan Universal PCR Master Mix (Roche,

Vilvoorde, België). Een volume van 5 µL cDNA wordt toegevoegd aan een PCR-

reactiemengsel van 15 µL bestaande uit 1 µL 10 mM probes en primers, 10 µL Universal

Master Mix en 4 µL NF-H2O. Er zal ook een standaardcurve opgesteld worden op basis van

http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx

Kim Baert Pagina 17

cDNA van cellen die het gen constitutief tot expressie brengt. Hiervoor werd er gekozen voor

een HUVEC-cellijn (Human Umbilical Vein Endothelial Cells). Deze zijn afkomstig van

endotheelcellen uit navelstreng. Van het geïsoleerde RNA wordt eerst cDNA gesynthetiseerd

waarvan vervolgens een verdunningsreeks (1/4 tot (1/4)8) wordt gemaakt met NF-H2O. De

standaarcurve beschrijft het verband tussen de initiële cDNA-concentratie en de CT-waarde.

De concentratie van LPL wordt eveneens bepaald via qPCR. Hier zal gebruik gemaakt

worden van primers en een probe aangemaakt via de Primer Express V2.0 software (Applied

Biosystems): 0.375 µL probe (5’ - CCATGGCTGGACGGTAACAGGAATGT - 3’), 1.5 µL

FOR (5’ - CAGCAGCAAAACCTTCATGGT - 3’), 1.5 µL REV (5’ - AGTTTTGGCAC

CCAACTCTCA - 3’). Er wordt in een totaal volume van 25 µL 10 mM primers en 10 mM

probe toegevoegd bij 12.5 µL TaqMan Universal Master Mix (Roche), 4.125 µL NF-H2O en

5 µL cDNA. Alle experimenten zijn uitgevoerd in duplo.

Als huishoudgen wordt voor elk staal ABL (v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene

homolog) gebruikt om FOS en LPL expressie te normaliseren. ABL is een gen dat in humane

hematopoietische cellen constitutief tot expressie komt. De probe en primers worden

aangemaakt via de gekende gensequentie van het DNA. Het PCR reactiemengsel zal als volgt

aangemaakt worden: 0.5 µL probes, 0.75 µL FOR, 0.75 µL REV, 12.5 µL TaqMan Universal

Master Mix (Roche), 5.5 µL water en 5 µL cDNA.

Voor LPL wordt gebruik gemaakt van de comparatieve CT-methode (ABI Prism 7700

Sequence Detechtion System, User Bulletin 2, 2001; Applied Biosystems). Bij deze methode

wordt zowel voor ABL als LPL gewerkt met de HL60 calibrator (Human Promyelocytic

Leukemia).

Alle gestimuleerde cellen zullen FOS tot expressie moeten brengen, we verwachten hetzelfde

expressiepatroon voor LPL.

Kim Baert Pagina 18

2.2 DEEL 2 2.2.1 Klonering

A. Vector pCMV-SPORT6

Figuur 7. Vector pCMV-SPORT6 (Vector NTI AdvanceTM

software van Invitrogen).

A. LBAmp platen maken

35 g ‘Defco LB Agar, Lennox’ (BD Biosciences) wordt toegevoegd aan 1 L NF-H2O. Na

goed schudden wordt deze suspensie gesteriliseerd door te autoclaveren. Om af te koelen

wordt de fles in een warm waterbad (50°C) geplaatst. Hieraan wordt 1 mL ampicilline

(Roche) toegevoegd en in de laminaire flow wordt dit mengsel verdeeld over de platen

(LBAmp platen).

B. Vector vermenigvuldigen

De vector pCMV-SPORT6 werd verkregen via Imagene (imaGenes GmbH, Berlijn,

Duitsland). Deze vector (aanwezig in bacteriën) wordt vermenigvuldigd door deze over te

brengen in het ‘Defco LB Broth, Lennox + ampicilline (LB broth Amp)’ medium (4 mL) (BD

Biosciences) en dit wordt overnacht geïncubeerd bij 37°C. Er wordt 10 µL van deze suspensie

uitgeplaat op de LBAmp platen. Deze platen worden één nacht geïncubeerd bij 37°C. Na

overnachting worden er verschillende kolonies opgepikt en elk in 5 mL ‘LB broth Amp’

medium gebracht en eveneens overnacht op een schudplaat (225 rpm) bij 37°C, zodanig dat er

Kim Baert Pagina 19

slechts één en dezelfde kolonie wordt vermenigvuldigd. Deze incubatie mag slechts 20 uren

duren, zodanig dat het ampicilline niet zal degraderen.

C. Miniprep + glycerol stock aanmaken

Om het DNA te zuiveren uit de cultuur wordt er gebruik gemaakt van Miniprep (QIAgen). Er

wordt eveneens een glycerol stock aangemaakt om zo de vector (aanwezig in de cellen) voor

lange tijd te bewaren. De ‘LB broth Amp’ cultuur wordt overgebracht in een 2 x 2 mL

eppendorf tube. Na 3 minuten centrifugeren bij 13000 rpm wordt de pellet bacteriële cellen in

250 µL buffer P1 geresuspendeerd. Vervolgens wordt er 250 µL lysis buffer toegevoegd en

onmiddellijk hierna geneutraliseerd met 350 µL buffer N3 (neutralising buffer). Nadien wordt

deze suspensie 10 minuten gecentrifugeerd bij 13000 rpm. Via de QIAprep spin kolommen

wordt het plasmide opgezuiverd en geïsoleerd in 50 µL elutiebuffer.

De overige milliliter zal gebruikt worden om de glycerol stock aan te maken. Onder de flow

op ijs wordt er 500 µL cultuur samengevoegd met 250 µL LB broth en 250 µL glycerol

(Merck, Brussel, België). Zo zal de eindconcentratie glycerol 25% zijn, dit wordt bewaard bij

-80°C.

D. Vector pCMV-SPORT6

LPL (1428 basenparen (bp)) wordt uit de geïsoleerde vector pCMV-SPORT6 geknipt door

gebruik te maken van de restrictie-enzymen XbaI en EcoRI (New England Biolabs, Leusden,

Nederland) (figuur 8). Het reactiemengsel bestaat uit 2 µg vector, 10X NEbuffer 2, 1 µL

XbaI, 1 µL EcoRI, 100X BSA en dit wordt aangelengd tot 50 µL met NF-H2O. Dit mengsel

wordt 3 uur geplaatst bij 37°C.

Figuur 8. Knipplaatsen XbaI en EcoRI in vector pCMV-SPORT6 (Vector NTI AdvanceTM

).

Kim Baert Pagina 20

E. Opzuivering

Vervolgens wordt het gewenste fragment via gelelektroforese opgezuiverd; hiervoor zal er bij

de aangemaakte 50 µL digest 6X loading dye (Fermentas, St. Leon-Rot, Duitsland)

toegevoegd worden. Na uitsnijden van het gewenste DNA-fragment zal via de Promega kit

(Leiden, Nederland) LPL geïsoleerd worden.

B. Vector pGEM4Z-EGFP-A64bis

A. Vector pGEM4Z-EGFP-A64bis

Vervolgens zal men het geïsoleerde LPL gen in de pGEM4Z-EGFP-A64bis vector kloneren

(figuur 9). Door zijn 64-lange polyA staart is deze vector optimaal voor in vitro transcriptie.

Deze klonering is echter niet gelukt, waardoor we op een andere maar efficiëntere manier toch

tot het uiteindelijke resultaat zijn gekomen. Hieronder geeft ik een korte samenvatting hoe de

klonering zou moeten verlopen hebben.

pGEM4Z-EGFP-A64bis werd reeds vroeger aangekocht en is aanwezig in een glycerol stock.

Dit plasmide wordt uitgeplaat en via Miniprep (Qiagen) geïsoleerd. Deze vector wordt

eveneens geknipt met de enzymes XbaI en EcoRI (NE Biolabs) en het gewenste fragment zal

ook via gelelektroforese en de Promega kit opgezuiverd worden (p20).

Figuur 9. Vector pGEM4Z-EGFP-A64bis (Vector NTI AdvanceTM

).

Vervolgens wordt deze vector gedefosforyleerd zodat de kans op autosluiting verkleint. Voor

deze defosforylatie wordt er 10X buffer, 60X µL alkalische fosfatase (Roche) toegevoegd aan

de 50 µL geknipte vector. Dit mengsel zal 30 minuten incuberen bij 37°C en vervolgens 2

minuten bij 75°C zodat het alkalische fosfatase geïnactiveerd wordt.

Kim Baert Pagina 21

B. Ligatie

Bij deze verknipte vector (50 ng, 2595 bp) wordt er een 1,68 keer kleiner gewicht van het

geïsoleerde DNA-fragment (LPL; 29 ng, 1538 bp) toegevoegd. Als verhouding vector/insert

wordt er zowel 1/1 als 1/2 gebruikt om zo te ligeren (figuur 10). Er wordt eveneens een

controle meegenomen waarbij het insert vervangen wordt door water, dit dient om de

achtergrond autosluiting te detecteren. De gewenste verhouding wordt samengevoegd bij

100X T4 DNA ligase en 10X T4 DNA buffer (Invitrogen). Dit mengsel wordt 45 minuten bij

4°C geplaatst.

Figuur 10. Geligeerde vector pGEM4Z-LPL-A64 (Vector NTI AdvanceTM

).

C. Transformatie in competente cellen

Om deze geligeerde vector te vermenigvuldigen en te bewaren wordt deze getransformeerd in

DH5α competente cellen. Hiervoor wordt 10 µL ligaat (pGEM4Z-LPL-A64) zeer voorzichtig

overgebracht in 100 µL competente cellen. Dit mengsel moet 45 minuten op ijs incuberen en

wordt vervolgens 2 minuten in een warm waterbad geplaatst waardoor de bacteriën een

hitteschok ervaren (hierdoor nemen ze de vector gemakkelijker op). Deze worden

onmiddellijk terug op ijs geplaatst waarna voorzichtig 700 µL S.O.C. medium (Invitrogen)

toegevoegd wordt. Dit medium is zeer rijk aan voedingsstoffen zodat de bacteriën zich terug

kunnen herstellen. Vervolgens wordt deze cultuur gedurende 1 uur bij 37°C geplaatst waarna

ze uitgeplaat worden op LBAmp Agar. Als positieve controle wordt er een ongeknipte vector

mee getransformeerd.

Kim Baert Pagina 22

D. Miniprep

Na overnachting worden alle aanwezige kolonies (25 aanwezig op de ligatieplaten, 3

aanwezig op de controleplaat) opgepikt en opgegroeid in ‘LB broth Amp’. Via Miniprep

(Qiagen) wordt de vector pGEM4Z-LPL-A64 geïsoleerd uit de bacteriën.

E. Screenen na transformatie

Als ligatie-controle worden de geïsoleerde vectoren (4133 bp) geknipt met twee ‘één-

knippers’: één in insert (NcoI) en één in de vector (NdeI) (NE Biolabs). Eveneens wordt er

geknipt met twee restrictie-enzymen die beide in de vector zullen knippen; namelijk NdeI en

SspI (NE Biolabs). Als absolute controle wordt eveneens opnieuw met XbaI en EcoRI geknipt

(figuur 11).

Figuur 11. Verwachte bandjes na ‘controle digest’ (Vector NTI AdvanceTM

).

2.2.2 In vitro transcriptie (IVT): mRNA voor LPL

A. Linearisatie van de vector pCMV-SPORT6-insertLPL

Vermits de vector pGEM4Z-LPL-A64 niet aangemaakt kon worden werd de in vitro

transcriptie, na isolatie via Miniprep,. toegepast op de aangekochte vector pCMV-SPORT6.

Hiervoor werd de mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit (Ambion) aangekocht bij

Kim Baert Pagina 23

Invitrogen. Deze kit kan een polyA staart creëren in elke expressievector waar een T7

promotor aanwezig is. Zo kan mRNA voor LPL in vitro rechtstreeks via de pCMV-SPORT6

vector aangemaakt worden [30].

Via het restrictie-enzyme EcoRV (Invitrogen) zal het plasmide gelineariseerd worden (figuur

12). Er wordt 20 µg plasmide toegevoegd aan 10X React 2, 3 µL EcoRV en dit wordt

aangelengd met NF-H2O tot 100 µL.

Figuur 12. Linearizatie pCMV-SPORT6-insertLPL (Vector NTI AdvanceTM

).

B. Opzuivering van het digest met QIAquick PCR Purification kit (Qiagen)

Na overnachting bij 37°C wordt er bij 100 µL van bovenstaand digest 5 volumes PB (500 µL)

toegevoegd. Deze 600 µL wordt over de QIAquick kolom gebracht en vervolgens gewassen

met PE buffer. Het opgezuiverde PCR-product wordt ten slotte in 30 µL NF-H2O opgelost.

De concentratie van dit cDNA wordt bepaald met een Nanodrop 1000 Spectrophotometer

(Isogen Life Science).

C. In vitro transcriptie

Om het cDNA over te schrijven naar mRNA, moet er een CAP structuur (LPLcap) aanwezig

zijn aan het 5’ einde en een polyA staart aan het 3’ einde. Deze in vitro transcriptie wordt via

het mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit uitgevoerd. Hierbij wordt er 1 µg lineair DNA,

10 µL 2X T7 NTP/ARCA, 2 µL 10X T7 reactiebuffer, 2 µL enzyme mix en dit aangelengd

tot 20 µL met NF-H2O samengevoegd in 1 reactiebuis. Dit wordt 2 uur 30 minuten

geïncubeerd bij 37°C.

Kim Baert Pagina 24

Als controle werken we eveneens met een uncapped structuur (LPLucap). Hiervoor gebruiken

we de MEGAscript Kit (Ambion). Hierbij wordt er 4 X 2 µL NTP/mix (10X) toegevoegd in

plaats van de CAP-structuur.

D. DNase behandeling

Na incubatie wordt er 1 µL TURBO DNase toegevoegd om zo het overgebleven DNA van de

vector te vernietigen, waarna het terug 15 minuten moet incuberen bij 37°C.

E. Poly-A-tailing

Escherichia coli Poly A Polymerase (E-PAP) en ATP worden gebruikt om tussen 50 en 100

A-bases toe te voegen om zo een poly-A staart te creëren. Hierdoor stijgt de mRNA stabiliteit

en translatie efficiëntie. De volgende tailing reagents worden bij de 20 µL reagentia in

volgende volgorde toegevoegd: 36 µL NF-H2O, 20 µL 5X E-PAP buffer, 10 µL 25mM

MnCl2, 10 µL ATP Solution en 4 µL E-PAP enzyme. Dit wordt 45 minuten geïncubeerd bij

37°C en vervolgens onmiddellijk op ijs geplaatst.

Voor de uncapped structuur wordt deze stap niet uitgevoerd.

F. Lithiumchloride (LiCl) precipitatie

Lithiumchloride precipitatie is een geschikte en effectieve manier om niet-geïncorporeerde

nucleotiden en de meeste proteïnes te verwijderen. Deze methode precipiteert echter transfer

RNA en RNAs kleiner dan 300 nucleotiden niet. Om een efficiënte precipitatie te verzekeren

moet de RNA concentratie ten minste 0.1 µg/µL zijn.

Het RNA wordt geprecipiteerd door 50 µL LiCl toe te voegen per reactie. Voor de uncapped

structuur wordt er 30 µL NF-H2O en 30 µL LiCl toegevoegd. Deze reacties worden overnacht

bewaard bij -20°C.

Vervolgens zal men dit mengsel 30 minuten centrifugeren bij 4°C. Na afname van het

supernatans wordt de pellet gewassen met 1 mL 70% ethanol (gemaakt met 100% ethanol

aangelengd met NF-H2O). Na 10 minuten centrifugeren bij 4°C wordt het supernatans

volledig verwijderd. Hierbij wordt 20 µL NF-H2O per reactie opgelost. Vermits het RNA

moeilijk te resuspenderen is zal men eerst zeer goed vortexen en vervolgens het mengsel

overnacht bewaren bij -20°C. Via Nanodrop 1000 Spectrophotometer (Isogen Life Science)

wordt de concentratie hiervan bepaald.

Kim Baert Pagina 25

2.2.3 Elektroporatie LPL (EP)

Om de functie van LPL in de CLL cellen te onderzoeken zullen we mRNA voor LPL

elektroporeren in CLL cellen, waar geen LPL mRNA aanwezig is (LPL- patiënten).

CLL cellen worden geïsoleerd via lymphoprep (Nycomed) zoals reeds beschreven (p12) en 3

uur in de incubator geplaatst. Deze geïsoleerde CLL cellen (10 x 106 cellen) worden twee keer

gewassen met IMDM (Invitrogen), en één keer met Optimix Wasbuffer solution A (Cell

Projects, Kent, VK) en vervolgens geresuspendeerd in 200 µL Optimix EP-medium (Cell

Projects). Dit medium bestaat uit 2.5 mL 2X concentraat elektrobuffer oplossing met 5.5 mg

ATP en 7.7 mg gluthathione (Cell Projects), dit mengsel wordt aangelengd tot 5 mL met NF-

H2O.

Bij deze cellen wordt er 40 ng van het IVT mRNA voor LPLcap of LPLucap toegevoegd, en

deze zullen getransfereerd worden naar 0.4 cm cuvettes (Eurogentec, Seraing, België). De

elektroporatie zal uitgevoerd worden met een Gene Pulser II elektroporatie instrument (Bio-

rad, Nazareth, België). Optimale elektroporatie settings zijn 500 V en 150 µF [31]. Na

elektroporatie zullen de cellen onmiddellijk getransfereerd worden naar 1 mL voorverwarmd

CLL medium bij 37°C, 5% CO. Alle experimenten bevatten eveneens positieve controles (10

x 106 CLL cellen geëlektroporeerd met 10 ng EGFP cap) die de EP-efficiëntie bepalen en een

mock controle (geëlektroporeerd zonder RNA). De viabiliteit van de getransfecteerde cellen

en de EGFP expressie wordt geanalyseerd door de flowcytometer (BD LSR II). Hiervoor

worden de cellen gemerkt met 1 µL CD3 APC antilichaam (T-cellen), 2 µL CD19 PE

antilichaam (B-cellen) (BD Biosciences) en 4 µL PI. De eiwitexpressie zal bepaald worden

via ELISA (AlpcoTM

, Salem, VS).

2.2.4 Kwantitatieve real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR)

Meten van de genexpressie van LPL zal gebeuren via qRT-PCR (p15-17). Real-time PCR

(Applied Biosystems) is een extra elektroporatie-controle. Hiervoor zal men een deel van de

cellen resuspenderen in 1 mL TRIzol, om zo het RNA te isoleren (p14). DNase behandeling

op een deel van het RNA wordt eveneens uitgevoerd om zo al het overgebleven DNA

(afkomstig van de oorspronkelijke vector pCMV-SPORT6) te elimineren. Hiervoor wordt er

gebruik gemaakt van DNase I Amplification Grade van Invitrogen. DNAse I wordt gebruikt

om de overgebleven ribunucleases te verwijderen, het wordt geleverd in 1 unit/µL. 1 µg RNA

wordt toegevoegd aan 1 µL 10X DNase I reactiebuffer en 1 µL DNase I. Dit mengsel wordt

15 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur, waarna het DNase wordt geïnactiveerd door

toevoeging van 1 µL 25 mM EDTA. Dit wordt 10 minuten verwarmd bij 65°C.

Kim Baert Pagina 26

Via de 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems) wordt het geïsoleerde RNA omgezet naar

cDNA ( p15).

2.2.5 ELISA

Om na te gaan of het ingebrachte mRNA omgezet wordt in het eiwit LPL wordt er gebruik

gemaakt van de ELISA methode. Via de firma Alpco™ wordt de LPL ELISA kit aangekocht.

Om de concentratie van het intracellulaire eiwit LPL te bepalen zullen de geëlektroporeerde

CLL cellen eerst gelyseerd moeten worden. Hiervoor zal men 10 x 106 geëlektroporeerde

cellen in 75 µL 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) resuspenderen [2]. Triton X-100 is een

mild niet-denaturerend detergent dat de cellen lyseert waarbij de integriteit van de eiwitten

bewaard blijft. Na 10 minuten centrifugeren bij 4°C (13000 rpm) zal men 50 µL supernatans

overbrengen in de gecoate well-plaat. Deze welletjes zijn gecoat met anti-LPL monoclonaal

antilichaam (MoAb), welke met LPL in het staal zal binden. Na de eerste incubatie (2 uur)

wordt er gewassen met wasbuffer (3X) om zo het ongebonden materiaal te verwijderen.

Vervolgens wordt 50 µL anti-LPL polyclonaal antilichaam (PoAb namelijk chicken anti-

bovine milk LPL IgG) toegevoegd welke bindt met het geïmmobiliseerde LPL in de welletjes.

Na de tweede incubatie (1 uur) en 3 wasbeurten, wordt er 50 µL enzyme-gelabelde PoAb

(horseradish peroxidase-labeled goat anti-chicken IgG IgG) toegevoegd. Dit antilichaam zal

met PoAb binden. Na de derde incubatie (1 uur) en wasbeurten (3X) wordt het

antilichaam/LPL/enzyme complex geïncubeerd (15 minuten) met een 50 µL substraat

oplossing (o-phenylenediamine opgelost in citraatbuffer) en vervolgens wordt deze reactie

stilgelegd met het stopreagens (50 µL; 7.7% H2SO4). De intensiteit van de kleur wordt

gelezen via de microplaat reader Versamax™ (Molecular Devices Inc, Sunnyvale, VS). De

absorbantie is proportioneel aan de concentratie van het LPL in het staal.

2.2.6 ConfluolipTM: Continuous Fluorometric lipase test

Om te onderzoeken of het geïntroduceerde LPL enzyme eveneens actief is in de

geëlektroporeerde CLL cellen zullen we een lipase-activiteit test (ConfluolipTM

Progen

biotechnik GMBH, Heidelberg, Duitsland) toepassen. De cellen (10 x 106) worden hiervoor

geresuspendeerd in 75 µL Triton X-100.

Deze lipase test berust op de afbraak van een substraat. Het lipase substraat is 1-

trinitrophenyl-aminododecanoyl-2-pyrendecanoyl-3-0-hexadecyl-sn-glycerol, een triglyceride

waarin de pyreen-fluorescentie intramoleculair gequencht is door de trinitrophenyl groep. Bij

toevoeging van actief lipase wordt de quencher gehydrolyseerd en de pyreen-fluorescentie

Kim Baert Pagina 27

kan gedetecteerd worden. De kinetiek die stijgt in de vorm van pyreen-fluorescentie bij 37°C

is proportioneel met de lipase-activiteit. Dit substraat (2 mL) wordt in een 24 well-plaat

gebracht en hierbij wordt er 20 µL celsuspensie toegevoegd. De fluorescentie intensiteit wordt

via de fluorometer Envision 2104 Multilabel Readerna 3 (Perkin Elmer, Zaventem, België) 15

minuten gemeten bij 340 nm excitatie en 400 nm emissie golflengte.

Er wordt eveneens een standaardreeks voorzien die het niet-gequencht fluorescente derivaat is

van het substraat. Deze standaard is vereist voor de calibratie van de fluorometer en voor de

berekening van de molaire fluorescentie van de pyreengroep.

2.2.7 Cycle sequencing

Vermits er noch eiwitexpressie noch lipase-activiteit aangetoond kon worden wekt dit het

vermoeden dat de sequentie van LPL puntmutaties bevat, waardoor er eventueel een

vroegtijdig stopcodon optreedt. Om dit te controleren werd de sequentie van LPL bepaald

gebruik makend van een geautomatiseerde methode die gebaseerd is op de

dideoxysequeneringsmethode van Sanger [32].

De gewenste sequentie werd eerst geamplificeerd in een PCR-reactie. De geïsoleerde vector

pCMV-SPORT6 bevat een T7 promotor en SP6 promotor. Met deze primers werd de PCR-

reactie uitgevoerd gebruik makend van de Mastercycler gradiënt (Eppendorf, Hamburg,

Duitsland). Hiervoor wordt 250 ng pCMV-SPORT6 vector samengevoegd bij het PCR-

reactiemengsel (Applied Biosystems) tot een totaal volume van 50 µL bestaande uit 0.2 µL

Taq-polymerase, 5 µL 10X Taq-polymerase buffer, 50 mM T7 FOR primer (Eurogentec) (5’ -

TAATACGACTCACTATAG - 3’), 50 mM Sp6 REV primer (Eurogentec) (5’ -

ATTTAGGTGACACTATAGAA - 3’), 1 µL dNTPs en 3 µL MgCl2. De initiële

denaturatiestap wordt ingesteld bij 94°C voor 5 minuten, gevolgd door 30 cycli bij 94°C (30

seconden), 53°C (30 seconden), 72°C (1 minuut). Ten slotte nog 1 cylcus bij 72°C voor 7

minuten. Dit PCR-product wordt opgezuiverd met de QIAquick PCR Purification kit (p23).

Vervolgens wordt het opgezuiverde PCR product 2X verdund met elutiebuffer.

Via het gebruik van fluorescente dideoxynucleotiden (ddNTPs) wordt de cycle sequencing

ingesteld: 1 µL van het opgezuiverde verdunde PCR-product wordt toegevoegd aan 1 µL

Terminator Ready Reactie mix (Applied Biosystems), 3.5 µL 5 X sequencing buffer (Applied

Biosystems) en 1 mM FOR T7 of REV Sp6 primer. Dit wordt aangelengd met NF-H2O tot

een totaal volume van 20 µL. De cycle condities zijn: 1 cyclus voor 6 minuten bij 96°C, 25

cycli voor 10 seconden bij 96°C, 5 seconden bij 50°C en 4 minuten bij 60°C. Doordat af en

toe ddNTPs worden ingebouwd zullen DNA fragmenten ontstaan van verschillende lengte.

Kim Baert Pagina 28

Elk van de vier ddNTPs is gemerkt met een verschillend fluorochroom, zodat de vier reacties

kunnen doorgaan in één reactiebuisje.

Via ethanolprecipitatie wordt het geamplificeerde PCR product opgezuiverd om de niet-

ingebouwde ddNTPs te verwijderen. Een volume van 20 µL cycle sequencing product wordt

samengevoegd bij 50 µL 96% ethanol (VWR) met 2 µL 3M natriumacetaat (Applied

Biosystems). Dit mengsel wordt vervolgens 10 minuten op ijs geplaatst. Centrifugeer

gedurende 30 minuten bij 13000 rpm en voeg vervolgens 250 µL 70% ethanol aan toe. Na

centrifuge (5 minuten) worden de open tubes 2 minuten gedroogd bij 95°C. Deze pellet wordt

geresuspendeerd in 25 µL formamide (Applied Biosystems) waarna het DNA gedenatureerd

wordt door exact 2 minuten te verhitten bij 95°C. Via de ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer

(Applied Biosystems) wordt de sequentie door de mensen van het ARL (Aids Referentie

Labo) bepaald. Via capillaire elektroforese zullen de fragmenten scheiden op basis van hun

lengte. Grote fragmenten ondervinden meer weerstand en migreren dus trager. De DNA-

fragmenten bereiken de detector in het capillair waarna de fluorochromen door een argon ion

laser geëxciteerd worden door een CCD-camera (charge coupled device camera). De

resultaten worden door de sequentie-analysesoftware geïnterpreteerd en de basen die

overeenkomen met de hoogste fluorescentie intensiteit op elk datapunt worden weergegeven

in een elektroferogram.

Via BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) wordt de gemeten sequentie vergeleken

met de sequentie van de vector pCMV-SPORT6. BLAST is een algoritme dat gebruikt wordt

voor het aligneren van DNA- of eiwitsequenties. Het zoekresultaat laat zien hoe goed de twee

sequenties met elkaar overeenkomen.

Kim Baert Pagina 29

B A

0

50

100

150

200

250

300

3u IgA 3u IgM

Gen

orm

ali

seerd

e ex

pre

ssie

A B

0

50

100

150

200

250

300

24u IgA 24u IgM

Gen

orm

ali

seerd

e ex

pre

ssie

0

20

40

60

80

100

24u IgA 24u IgM

Gen

orm

ali

seerd

e ex

pre

ssie

0

50

100

150

200

250

300

3u IgA 3u IgM

Gen

orm

ali

seerd

e ex

pre

ssie

3. Resultaten

3.1 DEEL 1

3.1.1 Controle stimulatie

Door stimulatie van de CLL cellen met anti-IgM beads komt LPL tot expressie (figuur 14).

Als stimulatie-controle wordt de FOS expressie mee bepaald (figuur 13). De relatieve

hoeveelheid RNA wordt zowel bepaald na 3 uur als na 24 uur stimulatie.

Figuur 13. FOS expressie na stimulatie CLL cellen.

A: FOS expressie bepaald na 3u stimulatie met IgA of IgM. B: FOS expressie bepaald na 24u stimulatie

met IgA of IgM.

Figuur 14. LPL expressie na stimulatie CLL cellen. A: LPL expressie bepaald na 3u stimulatie met IgA of IgM. B: LPL expressie bepaald na 24u stimulatie

met IgA of IgM.

Kim Baert Pagina 30

3.2 DEEL 2

In het tweede deel hebben we het eiwit LPL geïntroduceerd in CLL LPL- cellen om zo de

functie te achterhalen van dit enzyme in de CLL cellen. Hiervoor hebben we LPL mRNA

geëlektroporeerd in gemuteerde CLL ZAP70- en LPL- cellen.

3.2.1 Klonering

Als voorbereiding voor de in vitro transcriptie werd tevergeefs geprobeerd om LPL te

introduceren in de vector pGEM4Z-A64. Uit deze resultaten kan er éénduidig besloten

worden dat er een andere manier gezocht moest worden om LPL in vitro over te schrijven.

A. Digest Vector pCMV-SPORT6

LPL (1428 bp) wordt uit de vector pCMV-SPORT6 geknipt door gebruik te maken van de

restrictie-enzymen XbaI (T*CTAGA) en EcoRI (G*AATTC). Via gelelektroforese worden de

bandjes gescheiden en met ethidiumbromide zichtbaar gemaakt (figuur 15).

Figuur 15. Digestie van pCMV-SPORT6.

Laan L: ladder 100 bp; Laan 1: ongeknipte vector pCMV-SPORT6; Laan 2: vector pCMV-SPORT6

geknipt met XbaI en EcoRI.

Op deze manier werd de digestie-efficiëntie nagegaan. Het bandenpatroon vertoont slechts 4

bandjes, namelijk bij ~ 4300 bp, 1500 bp, 500 bp en 350 bp.

2

1

1 kbp

L

3000

bp

1000

1500

500

Kim Baert Pagina 31

B. Digest vector pGEM4Z-EGFP-A64bis

Digest van de pGEM4Z-EGFP-A64bis (3370 bp) vector met de enzymes XbaI en EcoRI

(figuur 16). Het verwachte bandenpatroon (775 bp en 2595 bp lang) wordt eveneens nagegaan

via gelelektroforese.

Figuur 16. Digestie van pGEM4Z-EGFP-A64bis.

Laan L: ladder 100 bp; Laan 1: ongeknipte vector pGEM4Z-EGFP-A64bis; Laan 2: vector pGEM4Z-

EGFP-A64bis geknipt met XbaI en EcoRI.

C. Controle digest na ligatie

Na ligatie wordt er via de restrictie-enzymen NcoI, NdeI, SspI, XbaI en EcoRI nagegaan of de

klonering van LPL volledig correct is uitgevoerd. Deze restrictie werd uitgevoerd op 3

kolonies (figuur 17).

Figuur 17. Digestie van de ligatievector .

Laan L: ladder 100 bp; Laan 1: ongeknipte geligeerde controle (zonder insert); Laan 2-3: ongeknipte geligeerde kolonies; A: vector geknipt met NcoI en NdeI; B: geknipt met NdeI en SspI; C: geknipt met XbaI

en EcoRI.

A B C

L A B C

A B C

1

1 kbp

1000

bp

500

3000

1500

L 2

3

2

1

1 kbp

3000

1500

1000

500

bp

L

Kim Baert Pagina 32

A

C D

CD3

CD

19

B

3.2.2 In vitro transcriptie / elektroporatie

In vitro transcriptie wordt onmiddellijk toegepast op de vector pCMV-SPORT6. Het

aangemaakte LPL mRNA wordt vervolgens geëlektroporeerd in CLL LPL- cellen. Eveneens

zal EGFP geëlektroporeerd worden om zo te bevestigen dat de elektroporatie gelukt is. Met de

flowcytometer bepalen we de EGFP fluorescentie en viabiliteit en via qRT-PCR

kwantificeren we het RNA voor LPL.

A. Flowcytometer

PI wordt toegevoegd aan de stalen om zo de viabiliteit aan te tonen. FITC zal EGFP cap

(Ecap) detecteren (figuur 18).

Figuur 18. Flowcytometer analyse van EGFP expressie in de geëlektroporeerde cellen.

A: Viabiliteit van geëlektroporeerde CLL cellen (de PI-negatieve cellen zijn de levende); B: Detectie B-

cellen (CD19 APC) en T-cellen (CD3 PE); C: EGFP detectie in geëlektropeerde CLL cellen met LPLcap mRNA; D: EGFP detectie in geëlektroporeerde CLL cellen met mRNA Ecap.

C

Kim Baert Pagina 33

B. qPCR

Na elektroporatie werden 0.5 x 106 cellen gelyseerd met 1 mL TRIzol om zo het RNA te

isoleren. Via reverse transcriptase werd dit RNA (~ 350 ng) omgezet naar cDNA om zo LPL

te kwantificeren via qPCR (figuur 19).

Figuur 19. Kwantificatie LPL mRNA in geëlektroporeerde CLL cellen.

LPLcap: LPLcap mRNA geëlektroporeerde cellen; Mock: geëlektroporeerde cellen zonder mRNA; Cult:

cellen zonder mRNA of elektroporatie; LPLucap: LPL uncapped mRNA geëlektroporeerde cellen; Ecap:

cellen geëlektroporeerd met EGFP mRNA.

Uit deze relatieve waarden kan men afleiden dat de cellen waarin we LPL mRNA

geëlektroporeerd hebben duidelijk een veel hoger signaal geven. Om uit te sluiten dat dit

signaal afkomstig is van de originele vector pCMV-SPORT6 waarop we in vitro transcriptie

hebben toegepast wordt het RNA zonder reverse transcriptase mee bepaald in een qPCR

reactie, evenals het RNA na DNase behandeling (tabel 2). Het RNA na DNase behandeling

wordt niet weergegeven in figuur 20 vermits deze PCR-reactie geen signaal gaf (tabel 2).

Tabel 2. CT-waarden na qPCR met LPL primers.

Staal gemiddelde CT-waarden

cDNA LPLcap 15,85

cDNA Mock 28,39

RNA LPLcap 33,48

RNA LPLcap met DNase behandeling Undetermined

water 34,71 Deze tabel geeft de gemiddelde CT-waarden weer van de stalen gemeten in een qPCR-reactie. In het PCR-

reactiemengsel wordt er gebruik gemaakt van het geïsoleerde RNA ofwel na reverse transcriptase (cDNA LPLcap en cDNA Mock) ofwel zonder reverse transcriptase (RNA LPLcap) ofwel na DNase behandeling.

LPLcap

Mock Cult

LPLucap

Ecap0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Gen

orm

ali

seerd

e ex

pre

ssie

Kim Baert Pagina 34

Figuur 20. Kwantificatie LPL cDNA in geëlektroporeerde CLL cellen.

cDNA LPLcap: geïsoleerde RNA van de LPLcap geëlektroporeerde cellen omgezet via reverse

transcriptase in cDNA; cDNA Mock: geïsoleerde RNA van de geëlektroporeerde cellen zonder mRNA omgezet via reverse transcriptase in cDNA; RNA LPLcap: geïsoleerde RNA van de LPLcap

geëlektroporeerde cellen zonder reverse transcriptase; water: negatieve controle.

3.2.3 Eiwitexpressie

A. ELISA

Om een calibratiecurve op te stellen wordt een verdunde reeks calibrator (human plasma

containing bovine milk LPL) met gekende concentratie gemeten via VersamaxTM

(Molecular

Devices Inc) (tabel 3).

Tabel 3. Gemeten absorbantie van de standaarden.

Staal Absorbantie MINUS Echte Log concen-

blanco absorbantie tratie ng/mL

standaard 1 (20 ng/mL) 0,7964 0,0947 0,7017 1,30

standaard 2 (10 ng/mL) 0,5823 0,4876 1,00

standaard 3 (5 ng/mL) 0,379 0,2843 0,70

standaard 4 (2,5 ng/mL) 0,2385 0,1438 0,40

standaard 5 (1,25 ng/mL) 0,1607 0,066 0,10

standaard 6 (0,63 ng/mL) 0,1316 0,0369 -0,20 De absorbantie van het blanco staal (dilutiebuffer) wordt afgetrokken van de absorbantie van de gemeten

standaarden om zo voor het achtergrond signaal te corrigeren.

cDNA LPLcap

cDNA MockRNA LPLcap

water

0

200

400

600

800

1000

1200

Gen

orm

ali

seerd

e ex

pre

ssie

Kim Baert Pagina 35

y = 0,4489x + 0,0405

00,10,20,30,40,50,60,70,8

0 0,5 1 1,5

Ab

sorb

anti

e

log concentratie LPL (ng/mL)

Figuur 21. Semi-logaritmische calibratiecurve.

Via de lineaire vergelijking van de rechte wordt de concentratie van de gemeten stalen bepaald.

De LPL eiwitexpressie in de cellen (10 x 106) geresuspendeerd in 75 µL 0.1% Triton X-100

zal eveneens bepaald worden. De absorbantie van de stalen LPLcap, LPLucap en Mock

worden telkens onverdund en 10X verdund met dilutiebuffer gemeten via VersamaxTM

(Molecular Devices Inc), deze lage dilutie wordt gebruikt wegens het vermoeden van een lage

eiwitconcentratie in de stalen. De negatieve controle (Triton X-100) wordt 30X verdund zoals

beschreven in het protocol. Als positieve controle wordt purified LPL from bovine milk

(Sigma-Aldrich) 1000X of 1500X verdund vermits zijn enorm hoge concentratie (0.62

mg/mL) (tabel 4).

Tabel 4. Berekende concentratie van het eiwit LPL.

Staal Absor- MINUS Echte Log conc Dilutie- Concen-

bantie blanco absorbantie

(y -

0,0405)/0,4489 factor tratie

LPLcap

onverdund 0,132 0,0947 0,0373 -0,007128536 1 9,84E-01 ng/mL

LPLcap 10X 0,1799

0,0852 0,099576743 10 1,26E+01 ng/mL

LPLucap

onverdund 0,1541 0,0594 0,042102918 1 1,10E+00 ng/mL

LPLucap

10X 0,1235

0,0288 -0,026063711 10 9,42E+00 ng/mL

Mock 0,1474 0,0527 0,027177545 1 1,06E+00 ng/mL

Mock 10X 0,128

0,0333 -0,016039207 10 9,64E+00 ng/mL

neg controle

30X 0,1134 0,0187 -0,048563154 30 2,68E+01 ng/mL

pos controle

1000X 2,0145 1,9198 4,186455781 1000 1,54E+07 ng/mL

pos controle

1500X 2,616 2,5213 5,526397861 1500 5,04E+08 ng/mL De stalen werden ofwel onverdund ofwel 10X verdund met dilutiebuffer. Eveneens werd er een negatieve

controle mee bepaald (neg controle of Triton X-100) en een positieve controle (purified LPL).

Kim Baert Pagina 36

y = 4,6385x + 377,59

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25

Flu

ore

sce

nti

e in

ten

site

it

(RFC

)

Concentratie (pmol/mL)

B. ConfluolipTM: Continuous Fluorometric lipase test

De lipase-activiteit zal berekend worden door een calibratiecurve op te stellen gebaseerd op

gekende concentraties van 4 standaarden. De standaard is de niet-gequencht fluorescente

derivaat van het substraat (figuur 22).

Figuur 22. Calibratiecurve.

De molaire fluorescentie constante van de pyreen-fluorescentie van het niet-gequenchte product is de

richtingscoëfficiënt van de rechte verkregen van de standaarden S1-S4.

Bij een volume van 2 mL substraat wordt er 20 µL celsuspensie toegevoegd. De cellen zijn

gelyseerd in Triton X-100. Bij een excitatiegolflengte van 340 nm en een emissiegolflengte

van 400 nm wordt via de fluorometer de fluorescentie intensiteit gedurende 10 minuten

gemeten (figuur 23).

Figuur 23. Fluorescentie intensiteit gemeten in 24 well-plaat.

A1: standaard 1; A2: standaard 2; A3: standaard 3; A4: standaard 4; A5: purified LPL from bovine milk

(Sigma-Aldrich); A6: NF-H2O; B1: LPLcap; B2: LPLucap; B3: Mock; B4: LPLcap; B5: IgA gestimuleerde CLL cellen na 24 uur; B6: IgM gestimuleerde CLL cellen na 24 uur; C1-D6: niet gevuld.

Kim Baert Pagina 37

De gemeten fluorescentie intensiteiten van LPLcap (figuur 23; B1) en de positieve controle

(figuur 23; A5) worden vervolgens uitgezet in een grafiek (figuur 24 en 25).

Figuur 24. Fluorescentie intensiteit LPLcap.

Zoals in figuur 23 zichtbaar is, daalt de fluorescentie van elk staal, behalve van de positieve

controle, waarbij het zuivere LPL eiwit werd toegevoegd aan het substraat (figuur 25).

Figuur 25. Fluorescentie intensiteit positieve controle.

De lipase activiteit wordt berekend als het quotiënt van de richtingscoëfficiënt van deze rechte

verkregen van de kinetische metingen en de molaire fluorescentie constante, verkregen van de

calibratiecurve.

17.558 RFU x min-1

4.6385 RFU x pmol-1 x mL = 3.79 pmol x ml

-1 x min

-1

y = -0,8365x + 374,81

366367368369370371372373374

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Flu

roe

sce

nti

e in

ten

site

it

(RFU

)

Tijd (minuten)

y = 17,558x + 484,09

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2 4 6 8 10 12

Flu

ore

sce

nti

e in

ten

site

it

(RFU

)

Tijd (minuten)

Kim Baert Pagina 38

3.2.4 Cycle sequencing

Via BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) wordt de gemeten sequentie vergeleken

met de sequentie van de vector pCMV-SPORT6 (tabel 5) om zo foutieve nucleotiden op te

sporen. Deze fouten worden indien mogelijk verbeterd aan de hand van het elektroferogram.

Tabel 5. BLAST-alignering

>lcl|54645

Length=539

Score = 996 bits (539), Expect = 0.0

Identities = 539/539 (100%), Gaps = 0/539 (0%)

Strand=Plus/Plus

Query 1 ATGGAGAGCAAAGCCCTGCTCGTGCTGACTCTGGCCGTGTGGCTCCAGAGTCTGACCGCC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1 ATGGAGAGCAAAGCCCTGCTCGTGCTGACTCTGGCCGTGTGGCTCCAGAGTCTGACCGCC

Query 61 TCCCGCGGAGGGGTGGCCGCCGCCGACCAAAGAAGAGATTTTATCGACATCGAAAGTAAA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 61 TCCCGCGGAGGGGTGGCCGCCGCCGACCAAAGAAGAGATTTTATCGACATCGAAAGTAAA

Query 121 TTTGCCCTAAGGACCCCTGAAGACACAGCTGAGGACACTTGCCACCTCATTCCCGGAGTA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 121 TTTGCCCTAAGGACCCCTGAAGACACAGCTGAGGACACTTGCCACCTCATTCCCGGAGTA

Query 181 GCAGAGTCCGTGGCTACCTGTCATTTCAATCACAGCAGCAAAACCTTCATGGTGATCCAT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 181 GCAGAGTCCGTGGCTACCTGTCATTTCAATCACAGCAGCAAAACCTTCATGGTGATCCAT

Query 241 GGCTGGACGGTAACAGGAATGTATGAGAGTTGGGTGCCAAAACTTGTGGCCGCCCTGTAC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 241 GGCTGGACGGTAACAGGAATGTATGAGAGTTGGGTGCCAAAACTTGTGGCCGCCCTGTAC

Query 301 AAGAGAGAACCAGACTCCAATGTCATTGTGGTGGACTGGCTGTCACGGGCTCAGGAGCAT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 301 AAGAGAGAACCAGACTCCAATGTCATTGTGGTGGACTGGCTGTCACGGGCTCAGGAGCAT

Query 361 TACCCAGTGTCCGCGGGCTACACCAAACTGGTGGGACAGGATGTGGCCCGGTTTATCAAC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 361 TACCCAGTGTCCGCGGGCTACACCAAACTGGTGGGACAGGATGTGGCCCGGTTTATCAAC

Query 421 TGGATGGAGGAGGAGTTTAACTACCCTCTGGACAATGTCCATCTCTTGGGATACAGCCTT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 421 TGGATGGAGGAGGAGTTTAACTACCCTCTGGACAATGTCCATCTCTTGGGATACAGCCTT

Query 481 GGAGCCCATGCTGCTGGCATTGCAGGAAGTCTGACCAATAAGAAAGTCAACAGAATTAC

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 481 GGAGCCCATGCTGCTGGCATTGCAGGAAGTCTGACCAATAAGAAAGTCAACAGAATTAC

Query: LPL sequentie (pCMV-SPORT6) gekregen van Imagene; Sbjct: gesequencete LPL sequentie via

cycle sequencing; Geel: begincodon LPL.

De laatste 889 basenparen van de LPL sequentie (1428 bp) volgend op de gesequencete 539

basenparen werd nog niet bepaald. In verder onderzoek zou men deze sequentie (tabel 6)

kunnen sequencen om zo puntmutaties uit te sluiten.

Kim Baert Pagina 39

Tabel 6. Vervolg LPL sequentie (889 bp) (http://www.imagenes-bio.de/). TGGCCTCGATCCAGCTGGACCTAACTTTGAGTATGCAGAAGCCCCGAGTCGTCTTTCTCCTGATGATGCAGATTT

TGTAGACGTCTTACACACATTCACCAGAGGGTCCCCTGGTCGAAGCATTGGAATCCAGAAACCAGTTGGGCATGT

TGACATTTACCCGAATGGAGGTACTTTTCAGCCAGGATGTAACATTGGAGAAGCTATCCGCGTGATTGCAGAGAG

AGGACTTGGAGATGTGGACCAGCTAGTGAAGTGCTCCCACGAGCGCTCCATTCATCTCTTCATCGACTCTCTGTT

GAATGAAGAAAATCCAAGTAAGGCCTACAGGTGCAGTTCCAAGGAAGCCTTTGAGAAAGGGCTCTGCTTGAGTTG

TAGAAAGAACCGCTGCAACAATCTGGGCTATGAGATCAGTAAAGTCAGAGCCAAAAGAAGCAGCAAAATGTACCT

GAAGACTCGTTCTCAGATGCCCTACAAAGTCTTCCATTACCAAGTAAAGATTCATTTTTCTGGGACTGAGAGTGA

AACCCATACCAATCAGGCCTTTGAGATTTCTCTGTATGGCACCGTGGCCGAGAGTGAGAACATCCCATTCACTCT

GCCTGAAGTTTCCACAAATAAGACCTACTCCTTCCTAATTTACACAGAGGTAGATATTGGAGAACTACTCATGTT

GAAGCTCAAATGGAAGAGTGATTCATACTTTAGCTGGTCAGACTGGTGGAGCAGTCCCGGCTTCGCCATTCAGAA

GATCAGAGTAAAAGCAGGAGAGACTCAGAAAAAGGTGATCTTCTGTTCTAGGGAGAAAGTGTCTCATTTGCAGAA

AGGAAAGGCACCTGCGGTATTTGTGAAATGCCATGACAAGTCTCTGAATAAGAAGTCAGGCTGA

Vervolg LPL sequentie (540-1428 bp) gekregen van Imagene; Geel: stopcodon.

Als controle van aanwezigheid van de XbaI herkenningszijde (T*CTAGA) op positie 2925

wordt dit deel eveneens gesequenced.

Tabel 7. BLAST-alignering

>lcl|41617

Length=605

Score = 1086 bits (588), Expect = 0.0

Identities = 600/605 (99%), Gaps = 4/605 (0%)

Strand=Plus/Minus

Query 2493 CTCCAACGTT-AAAAGACAGTGGATCATG-AAAAGTGCTGTTTTGTCCTTTGAGAAAGAA

|||||||||| |||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 605 CTCCAACGTTAAAAAGACAGTGGATCATGAAAAAGTGCTGTTTTGTCCTTTGAGAAAGAA

Query 2551 ATAATTGTTTGAGCGCAGAGTAAAATAAGGCTCCTTCATGTGGCGTATTGGGCCATAGCC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 545 ATAATTGTTTGAGCGCAGAGTAAAATAAGGCTCCTTCATGTGGCGTATTGGGCCATAGCC

Query 2611 TATAATTGGTTAGAACCTCCTATTTTAATTGGAATTCTGGATCTTTCGGACTGAGGCCTT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 485 TATAATTGGTTAGAACCTCCTATTTTAATTGGAATTCTGGATCTTTCGGACTGAGGCCTT

Query 2671 CTCAAACTTTACTCTAAGTCTCCAAGAATACAGAAAATGCTTTTCCGCGGCACGAATCAG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 425 CTCAAACTTTACTCTAAGTCTCCAAGAATACAGAAAATGCTTTTCCGCGGCACGAATCAG

Query 2731 ACTCATCTACACAGCAGTATGAATGATGTTTTAGAATGATTCCCTCTTGCTATTGGAATG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 365 ACTCATCTACACAGCAGTATGAATGATGTTTTAGAATGATTCCCTCTTGCTATTGGAATG

Query 2791 TGGTCCAGACGTCAACCAGGAACATGTAACTTGGAGAGGGACGAAGAAAGGGTCTGATAA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

Sbjct 305 TGGTCCAGACGTCAACCAGGAACATGTAACTTGGAGAGGGAGGAAGAAAGGGTCTGATAA

Kim Baert Pagina 40

Query 2851 ACACAGAGGTTTTAAACAGTCCCTACCATTGGCCTGCATCATGACAAAGTTACAAATTCA

||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 245 ACA-AGAGGTTTTAAACAGTCCCTACCATTGGCCTGCATCATGACAAAGTTACAAATTCA

Query 2911 AGGAGATATAAAATCTAGATCAATTAATTCTTAATAGGCTTTATCGTTTATTGCTTAATC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 186 AGGAGATATAAAATCTAGATCAATTAATTCTTAATAGGCTTTATCGTTTATTGCTTAATC

Query 2971 CCTCTCTCCCCCTTCTTTTTTGTCTCAAGATTATATTATAATAATGTTC-TCTGGGTAGG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||

Sbjct 126 CCTCTCTCCCCCTTCTTTTTTGTCTCAAGATTATATTATAATAATGTTCCTCTGGGTAGG

Query 3030 TGTTGAAAATGAGCCTGTAATCCTCAGCTGACACATAATTTGAATGGTGCaaaaaaaaaa

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 66 TGTTGAAAATGAGCCTGTAATCCTCAGCTGACACATAATTTGAATGGTGCAAAAAAAAAA

Query 3090 aaaaa 3094

|||||

Sbjct 6 AAAAA 2

Query: sequentie van de vector pCMV-SPORT6 (gekregen van Imagene); Sbjct: gesequencete insert

sequentie via cycle sequencing; Rood: gaps. Geel: XbaI knipplaats op positie 2925 in de vector pCMV-SPORT6.

Kim Baert Pagina 41

4. Bespreking

4.1 DEEL 1 4.1.1 Controle stimulatie

Uit de genormaliseerde expressiewaarden (figuur 13 en 14) kan men éénduidig afleiden dat de

cellen effectief gestimuleerd werden. Na 24 uur stimulatie werd er minder FOS RNA

aangemaakt in vergelijking met 3 uur stimulatie. Deze vaststelling zien we eveneens bij LPL;

na 24 uur merken we een lichtere tot geen stijging op van het LPL RNA. Het RNA wordt

namelijk afgebroken na een aantal uren en omgezet tot het enzyme LPL.

Stimulatie van de B-cellen leidt tot een significant hogere expressie van LPL na 3 uur.

4.2 DEEL 2

4.2.1 Klonering

A. Digest Vector pCMV-SPORT6 en pGEM4Z-EGFP-A64bis

Het bandenpatroon van de vector pCMV-SPORT6 vertoont slechts 4 bandjes na digest met

XbaI en EcoRI, namelijk bij ~ 4300 bp, 1500 bp, 500 bp en 350 bp (figuur 15). Dit kan

verklaard worden doordat XbaI niet knipt in de vector op plaats 2925 (figuur 26). Het

verwachte bandenpatroon wordt dan: 4352 bp, 1538 bp, 338 bp en 469 bp. Een mogelijke

verklaring voor het onvermogen van XbaI om op deze plaats te knippen kan er niet gegeven

worden. Een mogelijke puntmutatie, waarbij de XbaI herkenningsplaats op positie 2925

verloren gaat, kan uitgesloten worden via cycle sequencing (tabel 7).

Figuur 26. Digestie van pCMV-SPORT6 (Vector NTI AdvanceTM

) .

Kim Baert Pagina 42

Het bandenpatroon van de vector pGEM4Z-EGFP-A64bis vertoont de verwachte bandjes bij

775 bp en 2595 bp (figuur 16).

B. Controle digest na ligatie

Het gewenste bandenpatroon zoals hierboven beschreven (p22) werd niet verkregen. De

bandjes van deze drie kolonies volgen hetzelfde patroon. De kolonie op de negatieve

controleplaat is dus dezelfde als deze op de ligatieplaten. Op basis van dit bandenpatroon kan

men besluiten dat dit de vector pGEM4Z-EGFP-A64bis is (figuur 27). Bij het verknippen van

de overige aanwezige kolonies zagen we hetzelfde bandenpatroon. Als extra controle hebben

we eveneens de vector pGEM4Z-EGFP-A64bis met dezelfde controle restrictie-enzymen

geknipt, wat hetzelfde bandenpatroon opleverde. Er treedt dus geen ligatie op, enkel

autosluiting van de vector pGEM4Z-EGFP-A64bis. De enige verklaring hiervoor is een

slechte opzuivering van het geknipte vector-fragment waarbij nog kleine hoeveelheden

ongeknipte vector mee getransformeerd worden. Er werd noch een verklaring gevonden voor

de onmogelijkheid om de vector pGEM4Z-LPL-A64 te creëren, noch voor de slechte

opzuivering van de pGEM4Z-EGFP-A64bis vector.

Figuur 27. Bandenpatroon na ‘controle digest’ van vector pGEM4Z-EGFP-A64bis (Vector NTI

AdvanceTM

).

We hebben verschillende mogelijke alternatieven uitgeprobeerd om toch de gewenste vector

te creëren. Zo hebben we de defosforylatiestap niet uitgevoerd, zodat we meer vectormateriaal

overhielden. Hierdoor zou de kans op autosluiting wel groter zijn. We hebben eveneens vóór

de transformatie het geligeerde product geknipt met een restrictie-enzyme welke enkel in

Kim Baert Pagina 43

EGFP knipt en niet in de geligeerde vector. Zo zou enkel de ligatievector in de competente

cellen getransformeerd kunnen worden. We hebben ook, bij het uitvoeren van de

gelelektroforese, de gel 3X langer laten lopen zodat de bandjes meer gescheiden zouden zijn.

Zo kon het gewenste bandje beter uitgesneden worden. Al deze alternatieven leverden

hetzelfde resultaat op; het bandenpatroon kwam overeen met de ongeknipte vector pGEM4Z-

EGFP-A64bis.

4.2.2 In vitro transcriptie / elektroporatie

Uit de resultaten van de flowcytometer (figuur 18) kan er besloten worden dat het Ecap

mRNA efficiënt geëlektroporeerd werd in de CLL cellen. Het histogram illustreert namelijk

een duidelijke shift naar rechts bij Ecap in vergelijking met het LPLcap geëlektroporeerde

mRNA (figuur 18C en D). De viabiliteit is eveneens zoals verwacht (figuur 18A). Via de

antilichamen CD3 en CD19 bevestigen we een goede selectie van de B-cellen (figuur 18B).

A. qPCR

De relatieve waarden van LPLcap en LPLucap zijn duidelijk veel hoger dan deze die niet

geëlekroporeerd zijn met LPL (Mock, Cult en Ecap) (figuur 19). Hieruit kunnen we besluiten

dat het mRNA dat we geëlektroporeerd hebben codeert voor het LPL enzyme. Om uit te

sluiten dat een deel van het DNA van de oorspronkelijke vector opgepikt wordt, werd qPCR

eveneens toegepast op het geïsoleerde RNA (zonder reverse transcriptase). We merken op dat

er toch een klein deel LPL DNA wordt opgepikt, wat we als achtergrond beschouwen (figuur

20). Het verschil tussen deze waarden vormt dan het eigenlijke geëlektroporeerde LPL

mRNA. Eveneens werd er DNase behandeling uitgevoerd op het geïsoleerde RNA. Deze

PCR-reactie gaf geen signaal, terwijl het RNA zonder DNase behandeling wel een CT-waarde

gaf (tabel 2). Met deze resultaten hebben we aangetoond dat er een klein deel achtergrond

DNA aanwezig blijft na RNA isolatie, die in de qPCR-reactie wordt geamplificeerd. DNase

behandeling zorgt voor volledige verwijdering van het DNA, wat resulteert in niet

gedetermineerde waarden bij uitvoering van qPCR.

Kim Baert Pagina 44

4.2.3 Eiwitexpressie

A. ELISA

De gemeten absorbanties (tabel 4) van de stalen liggen lager dan de laagste standaard (0.63

ng/mL). De concentratie van LPL in de geëlektroporeerde stalen ligt dus niet in het

concentratiebereik van deze test. Door deze lage waarden zijn de berekende concentraties niet

betrouwbaar. De stalen meer concentreren kan een oplossing bieden. Om dit te bekomen

kunnen er 20 x 106 cellen geëlektroporeerd worden om deze dan te resuspenderen in 75 µL

0.1 % Triton X-100. Het valt eveneens op dat de gemeten absorbanties bij de verdunde stalen

(10X dilutiebuffer) systematisch lager liggen, behalve bij LPLcap, waarbij de absorbantie

hoger is in het verdunde staal. Voor deze bevinding bestaat er geen duidelijke verklaring;

staalverwisseling zou hier een mogelijke oorzaak van kunnen zijn. Het valt eveneens op dat

de absorbanties tussen de verdunde en onverdunde stalen nagenoeg niet verschillen, waardoor

de 10X verdunde stalen na concentratieberekening niet dezelfde concentratie vertonen. Het

zou kunnen dat de stalen, ondanks hun lage LPL concentratie, toch moeten verdund worden

met dilutiebuffer om betrouwbare metingen te verkrijgen.

Een verklaring voor de oorzaak van de lage concentraties zou kunnen liggen bij een

inefficiënte vertaling van het LPL mRNA tot het eiwit. Concentratie verhoging zou hierbij

dan niet helpen. Eveneens zou de oplossing in Triton X-100 een rol kunnen spelen, waarbij de

cellen niet effectief gelyseerd worden of dit detergent aanleiding geeft tot inhibitie bij deze

test.

Een ander mogelijke oorzaak is de sequentie van LPL. De gekregen vector (pCMV-SPORT6;

Imagene) zou moeten coderen voor het eiwit LPL, maar door puntmutaties zou er ergens een

stopcodon kunnen geïntegreerd zijn middenin de sequentie. Dit hebben we dan ook nagegaan

via Cycle sequencing.

B. ConfluolipTM: Continuous Fluorometric lipase test

De gemeten fluorescentie van de standaarden S1-4 werden bepaald om de fluorometer te

calibreren en om de molaire fluorescentie van de pyreen groep te bepalen. Het fluorescentie

signaal van de standaard S4 ligt hoger dan S3. De lineaire rechte van de calibratiecurve wordt

dan ook enkel bepaald door de standaarden S1-3 (figuur 22). De richtingscoëfficiënt van deze

rechte wordt de molaire fluorescentie constante genoemd.

Kim Baert Pagina 45

Bij alle stalen, waarvan de fluorescentie gemeten wordt, daalt de grafiek (figuur 24). Dit

betekent dat er geen meetbare lipase-activiteit aanwezig is in de gelyseerde cellen. LPL kan

namelijk een inactieve gesloten conformatie aannemen in de geëlektroporeerde cellen. In het

artikel van Mansouri et al. [18] werd er zelfs aangetoond dat, ondanks een verhoogde

expressie van LPL, toch een lagere activiteit zichtbaar is in de niet-gemuteerde cellen in

vergelijking met de gemuteerde cellen.

Het zou eveneens kunnen dat de condities van het lipase-substraat geschaad werden, maar

vermits de positieve controle het substraat wel kon afbreken lijkt deze hypothese ongegrond.

De positieve controle, die bestaat uit het zuivere eiwit LPL, vertoont een mooie stijgende

grafiek. Na enkele minuten werd er veel substraat afgebroken waardoor het signaal versterkt

(figuur 25).

Vermits we noch eiwit noch eiwit-activiteit konden aantonen lijkt het waarschijnlijk dat het

eiwit LPL niet aanwezig is in de cellen.

Zoals uit onderzoek blijkt [18] kan LPL activiteit ook gemeten worden door C-gelabelde

trioleïne substraat. Voor deze techniek maakt men gebruik van 200 µC van 3H-gelabelde

trioleïne (dit bevat 1 gram trioleïne en 0,05 gram L-phosphatidylcholine). In verder onderzoek

zou men deze radio-actieve test kunnen gebruiken voor het meten van de lipase-activiteit.

C. Cycle sequencing

Om na te gaan of de LPL sequentie effectief codeert voor het eiwit hebben we de vector

pCMV-SPORT6 gesequenced. Vermits er maar een sequentie van 600-tal basenparen tegelijk

kan bepaald worden hebben we de sequentie nog niet volledig kunnen sequencen. We hebben

namelijk de primers voor de T7 en Sp6 promotor gebruikt in de PCR-reactie, tussen deze twee

promotors ligt er echter een sequentie van 2444 bp. Het eerste deel (539 bp) van de sequentie

werd reeds bepaald via cycle sequencing. Via de software BLAST hebben we de twee

sequenties gealigneerd wat een gelijkenis van 100% gaf. Om het overige deel van de

sequentie te bevestigen zouden we nieuwe FOR en REV primers moeten creëren (5’ -

TCCCATTCACTCTGCC - 3’) om zo de gehele sequentie te sequencen.

Kim Baert Pagina 46

5. Algemeen besluit

Er is nog veel onderzoek nodig om de functie van LPL in CLL cellen aan te tonen. In dit

onderzoek hebben we de voorbereidende stappen uitgevoerd, waarbij we vergelijkbare

groepen hebben opgesteld om zo het verschil op RNA-niveau tussen beide groepen na te

gaan. Zo hebben we de CLL B-cellen al dan niet gestimuleerd om de LPL expressie

verschillen te detecteren. Via mRNA- en miRNA-expressieprofielen kunnen meer verschillen

blootgelegd worden.

We hebben eveneens een poging ondernomen om het effect van uitsluitend één eiwit (LPL)

na te gaan door dit eiwit te introduceren in CLL cellen. Het aantonen van LPL in deze

geëlektroporeerde CLL cellen moet nog op punt gesteld worden. Hierbij zoeken we naar de

meest optimale methode om de cellen te lyseren en het intacte eiwit te detecteren. De methode

die we in dit onderzoek hebben toegepast was niet in staat om dit te doen. Van zodra de

eiwitexpressie aangetoond kan worden in deze cellen kan men het verschil op RNA-niveau

tussen de CLL cellen met of zonder LPL nagaan. Zo zou men essentiële transcripten kunnen

detecteren die up- of downgereguleerd worden en die uitsluitend te wijten zijn aan de

aanwezigheid van LPL. Op basis van deze resultaten zou men targets voor een

gepersonaliseerde behandeling kunnen ontdekken.

Via migratie-experimenten kan men eveneens nagaan of er enig effect is op de up- of

downregulatie van bepaalde chemokines of hun receptoren. Zo kan men eventueel de migratie

van CLL cellen in de hand werken.

Verder onderzoek kan toegespitst worden op elektroporatie van andere prognostische merkers

(waaronder miRNAs) in CLL cellen, om zo het effect van deze merkers op de CLL cellen te

bestuderen. Hoe beter de wisselwerking tussen de prognostische merkers gekend is, hoe

geoptimaliseerder en gepersonaliseerder de behandeling voor CLL patiënten kan worden.

Kim Baert Pagina 47

6. Referenties

1. Fulci V et al. (2007). Quantitative technologies establish a novel microRNA profile of

chronic lymphocytic leukemia. Blood 109(11): 4944-4951.

2. Pallasch CP et al. (2008). Targeting lipid metabolism by the lipoprotein lipase inhibitor

orlistat results in apoptosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia 22(3):

585-92.

3. Gachard N et al. (2008). Multicenter study of ZAP-70 expression in patients with B-cell

chronic lymphocytic leukemia using an optimized flow cytometry method. Haematologica-

the Hematology Journal 93(2): 215-223.

4. Codony C et al. (2009). Gene expression profiling in chronic lymphocytic leukaemia. Best

Pract Res Clin Haematol 22(2): 211-22.

5. Burger JA et al. (2007). High-level expression of the T cell chemokines CCL3 and CCL4

by chronic lymphocytic leukemia B cells in nurselike cell co-cultures and in response to

BCR stimulation. Blood 110(11): 107a-108a.

6. Au-Yeung BB et al. (2009). The structure, regulation, and function of ZAP-70.

Immunological Reviews 228:41-57.

7. Amin S et al. (2008). ZAP70 in chronic lymphocytic leukaemia. International Journal of

Biochemistry & Cell Biology 40(9): 1654-1658.

8. Papagiannakopoulos T and Kosik KS (2008). MicroRNAs: regulators of oncogenesis and

stemness. Bmc Medicine 6.

9. Chen YH et al. (2007). Comparative analysis of flow cytometric techniques in assessment

of ZAP-70 expression in relation to IgV(H) mutational status in chronic lymphocytic

leukemia. American Journal of Clinical Pathology 127(2): 182-191.

10. van't Veer MB et al. (2006). The predictive value of lipoprotein lipase for survival in

chronic lymphocytic leukemia. Haematologica-the Hematology Journal 91(1): 56-63.

11. Van Bockstaele F et al. (2009). Prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia: a

comprehensive review. Blood Reviews 23(1): 25-47.

12. Maloum K et al. (2009). IGHV gene mutational status and LPL/ADAM29 gene

expression as clinical outcome predictors in CLL patients in remission following

treatment with oral fludarabine plus cyclophosphamide. Ann Hematol 88(12): 1215-21.

13. Cusack JC, Jr. et al. (1997). Role of splenectomy in chronic lymphocytic leukemia. J Am

Coll Surg 185(3): 237-43.

14. Esteve J et al. (2002). Different clinical value of minimal residual disease after autologous

and allogenic stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia. Blood 99(5):

1873-4.

15. Hallek M et al. (2008). Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic

leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia

updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood 111(12):

5446-56.

16. Fallah-Arani F et al. (2008). Redundant role for Zap70 in B cell development and

activation. European Journal of Immunology 38(6): 1721-1733.

17. Lineberry N and Fathman CG (2006). CYLD: deubiquitination-induced TCR signaling.

Nature Immunology 7(4): 369-370.

18. Mansouri M et al. (2010). Lipoprotein lipase is differentially expressed in prognostic

subsets of chronic lymphocytic leukemia but displays invariably low catalytical activity.

Leuk Res 34(3): 301-6.

Kim Baert Pagina 48

19. Van Bockstaele F et al. (2007). Lipoprotein lipase mRNA expression in whole blood is a

prognostic marker in B cell chronic lymphocytic leukemia. Clinical Chemistry 53(2):

204-212.

20. Xu W et al. (2009). Expression level of lipoprotein lipase in Chinese patients with chronic

lymphocytic leukemia and its correlation with other prognostic factors. Int J Lab Hematol

31(5): 552-9.

21. Kobayashi Y et al. (2002). Molecular modeling of the dimeric structure of human

lipoprotein lipase and functional studies of the carboxyl-terminal domain. Eur J Biochem

269(18): 4701-10.

22. Calin GA et al. (2006). MicroRNAs and leukemias: How strong is the connection?

Leukemia Research 30(6): 653-655.

23. Calin GA et al. (2004). MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic

lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A 101(32): 11755-60.

24. Kim VN (2005). MicroRNA biogenesis: Coordinated cropping and dicing. Nature

Reviews Molecular Cell Biology 6(5): 376-385.

25. Jung D et al. (2006). Mechanism and control of V(D)J recombination at the

immunoglobulin heavy chain locus. Annual Review of Immunology 24:541-570.

26. Till KJ et al. (2002). The chemokine receptor CCR7 and alpha 4 integrin are important for

migration of chronic lymphocytic leukemia cells into lymph nodes. Blood 99(8): 2977-

2984.

27. Burger JA et al. (2009). The microenvironment in mature B-cell malignancies: a target for

new treatment strategies. Blood 114(16): 3367-75.

28. ND-1000 Spectrophotometer V3.5 User's Manual (2007). Wilmington, NanoDrop

Technologies, Inc.

29. Heid CA et al. (1996). Real time quantitative PCR. Genome Res 6(10): 986-94.

30. Anger M et al. (2005). CDC6 requirement for spindle formation during maturation of

mouse oocytes. Biol Reprod 72(1): 188-94.

31. Van Bockstaele F et al. (2008). Efficient gene transfer in CLL by mRNA electroporation.

Leukemia 22(2): 323-9.

32. Sanger F et al. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad

Sci U S A 74(12): 5463-7.

Exploratie van de wisselwerking tussen de prognostische...

Documents

Transcript of Exploratie van de wisselwerking tussen de prognostische...