Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) • Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te...
-
Upload
julia-hermans -
Category
Documents
-
view
234 -
download
3
Transcript of Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) • Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te...
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
• Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed
• Berust op binding tussen antilichaam (Ab) en antigeen (Ag)
96 wells plaat: 8 rijen (A-H) en 12 kolommen (1-12)
Doel van ELISA experiment
Het uitvoeren van een kwantitatieve immunologische bepaling
• Wat heb je hiervoor nodig?
• Gezuiverd antigeen. In deze practicumproef is dat humaan insuline (Ag)
• Een deel wordt gebruikt voor opwekken antilichamen
• Een deel (1 mg/ml) wordt gebruikt voor calibratie
• Een deel Ag wordt voorzien van biotine groep (AgB)
één putje van een 96-wells plaat
ELISA procedure
• Competitie tussen biotine gelabeld (AgB) en ongelabeld antigeen (Ag)• Hoeveelheid gebonden AgB wordt bepaald met avidine-gelabeld HRP
Uitvoering
• Allereerst moet het percentage werkzame IgG moleculen worden bepaald.
Dit doe je door bij een variabele IgG concentratie (A-H) te bepalen wat de minimale hoeveelheid Ag (1-12) is waarbij alle AgB nog gebonden blijft.
Antilichaam aan putje binden
Bereken de verdunning die je in moet vullen en noteer alle informatie!
Percentage werkzame antilichamen
Coat IgG: Voeg 100 µl IgG (Ab) toe aan elk putje
Maximale bindingscapaciteit van IgG per putje is 4 µg/ml, dus 100 µl x 4 µg/ml = 400 ng
Niet gebondenantilichaamwegwassen
Alle eiwitbindingsplaatsen
bezetten/blokkeren
Biotine-gelabeld antigeen (AgB) toevoegen
• Per putje 10 µl insuline (AgB), steeds dezelfde concentratie
• Maximaal 1 ng per putje zodat niet alle antilichamen zijn gebonden
Ongelabeld antigeen (Ag) toevoegen
• in elk putje 100 µl ongelabeld antigeen (Ag)
• in elke kolom een andere concentratie (12 kolommen)
• begin met overmaat (bijv. 100 ng) en verdun steeds met factor 2
Ongebondenantigeen
wegwassen
Avidine-peroxidase toevoegen
• Avidine bindt zeer sterk aan biotine
• Peroxidase is een enzym
Ongebondenavidine-peroxidase
wegwassen
Substraat voor peroxidase toevoegen
Peroxidase zet substraat om in kleurstof waarvan de absorptie gemeten kan worden
Stoppen kleurreactie
Absorptiewaarden voor kleurstof
Daar waar de absorptie afneemt treedt competitie op!
Reken uit hoeveel procent van het antilichaam aan het antigen heeft gebonden:(Ag+AgB)*15/(Ab)*100 %
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12IgG ng/well
A 0,186 0,297 0,655 1,248 1,713 1,710 1,649 1,690 1,696 1,683 1,692 1,664 250,000B 0,037 0,193 0,366 0,645 1,227 1,668 1,686 1,644 1,668 1,627 1,673 1,665 125,000C 0,053 0,123 0,184 0,352 0,590 1,002 1,402 1,652 1,641 1,634 1,666 1,668 62,500D 0,031 0,056 0,118 0,189 0,252 0,508 0,799 1,167 1,508 1,713 1,702 1,635 31,250E 0,000 0,000 0,015 0,046 0,185 0,222 0,371 0,567 0,763 0,870 0,956 0,981 15,625F 0,000 0,000 0,000 0,043 0,103 0,137 0,205 0,341 0,351 0,475 0,476 0,516 7,813G 0,043 0,000 0,000 0,047 0,020 0,101 0,081 0,169 0,169 0,182 0,240 0,201 3,906H 0,000 0,000 0,000 0,012 0,040 0,023 0,054 0,085 0,063 0,141 0,113 0,102 1,953
AgB (ng/well) 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83
Ag (ng/well) 80,00 40,00 20,00 10,00 5,00 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04Ag + AgB (ng/well) 80,83 40,83 20,83 10,83 5,83 3,33 2,08 1,46 1,14 0,99 0,91 0,87
Voorbeeld van een testcurve
Neem daarna een nieuwe plaat voor het maken van een optimale calibratiecurve
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.000.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
1.800
Absorbance against dilution of Ag at one IgG dilution (one row of the Excel sheet)
Ag + AgB added per well (ng)
Ab
sorb
ance
Test voor een optimale calibratiecurve
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,150 0,234 0,322 0,424 0,564 0,635 0,860 1,143 1,393 1,818 1,771 1,764B 0,159 0,200 0,340 0,386 0,515 0,654 0,894 1,077 1,359 1,777 1,771 1,776C 0,203 0,269 0,309 0,369 0,536 0,619 0,847 1,127 1,382 1,757 1,837 1,817D 0,149 0,252 0,334 0,383 0,541 0,706 0,886 1,063 1,433 1,764 1,772 1,821E 0,158 0,201 0,325 0,401 0,484 0,702 0,901 1,142 1,386 1,772 1,781 1,772F 0,234 0,206 0,340 0,377 0,560 0,680 0,859 1,141 1,431 1,791 1,826 1,774G 0,234 0,223 0,354 0,423 0,494 0,627 0,814 1,057 1,420 1,801 1,789 1,768H 0,221 0,201 0,271 0,398 0,527 0,628 0,832 1,126 1,439 1,774 1,825 1,799
gem. 0,189 0,223 0,324 0,395 0,528 0,656 0,862 1,110 1,405 1,782 1,797 1,786
Ag + AgB (ng/well) 80,8 62,4 48,2 37,2 28,8 22,4 17,4 13,6 10,6 8,4 6,6 5,3
Ag (ng/well) 80,00 61,54 47,34 36,41 28,01 21,55 16,57 12,75 9,81 7,54 5,80 4,46
IgG ng/well dilution250,0 1,0
AgB ng/well0,83 1,0
Ag ng/well80,0 1,3
Test voor de calibratiecurve
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.00.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
1.800
2.000
test for a calibration curve of 6 points
Ag + AgB added per well (ng)
Ab
sorb
ance
Ag concentratie in monster bepalen
Concentratie Ab constant houden
Kolom 1-6: calibratie Kolom 7-12: monster
Ag concentratie in monster bepalen
Kolom 1-6: calibratiecurve
Kolom 7-12: monster
Ab concentratie constant
Ag concentratie in monster bepalen
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,293 0,371 0,517 0,650 0,925 1,192 0,366 0,428 0,590 0,695 0,904 1,189B 0,313 0,374 0,560 0,674 0,879 1,161 0,301 0,391 0,589 0,729 0,923 1,205C 0,319 0,410 0,561 0,742 0,872 1,132 0,368 0,382 0,571 0,698 0,886 1,180D 0,358 0,430 0,587 0,732 0,873 1,118 0,355 0,386 0,572 0,690 0,867 1,170E 0,331 0,457 0,565 0,676 0,857 1,211 0,363 0,380 0,537 0,723 0,857 1,197F 0,285 0,450 0,561 0,704 0,934 1,197 0,287 0,376 0,515 0,728 0,947 1,116G 0,346 0,457 0,531 0,723 0,877 1,193 0,274 0,440 0,558 0,700 0,868 1,176H 0,325 0,444 0,559 0,677 0,942 1,174 0,370 0,415 0,495 0,680 0,879 1,140
gem. 0,321 0,424 0,555 0,697 0,895 1,172 0,336 0,400 0,553 0,705 0,891 1,172
Ag + AgB (ng/well) 80,8 62,4 48,2 37,2 28,8 22,4
Ag (ng/well) 80,00 61,54 47,34 36,41 28,01 21,55
Sample (ng/well) 800,00 615,38 473,37 364,13 280,10 215,46
IgG ng/well dilution250,0 1,0
AgB ng/well0,83
Ag ng/well80,0 1,3
Sample ng/well800,0 1,3
Optimale calibratiecurve
10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
f(x) = 25.6264816468876 x^-0.994174742135574
calibration
Ag + AgB added per well (ng)
Ab
so
rba
nc
e
Monster curve
100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
Sample
ng (sample)+ngAgB
Ab
sorb
ance
Berekening hoeveelheid insuline in monster
Sample SampleY-value (absorbance)
X-value (ng sample+ 0.83 ng AgB)
X-value calibration curve
Ag in sample (ng)
mg Ag / mL sample
Getallen trendlijn
a 25,626 0,891 280,1 29,3 28,5 1,017E-01
b -0,994
0,035
-3,359
3,379
y = 25,626x-0,994
Y/aln (Y/a)
ln (Y/a)/be ^ (ln (Y/a) / b)
Opdrachten
- Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde IgG preparaat
Vuistregels: zie kader blz. 15
- Testcurve en kwantitative analyse van het insuline monster
Verslag - progress report! - het preparaat dat getest is
- het percentage werkzame antilichamen- de testcurves en de curves van ijklijn en monsterverdunningen- de berekening van de concentratie insuline in het monster
Opdrachten en verslag