Effecten van “interventies” op in-vitro gekweekte darmcellen:

overeenkomsten met effecten gemeten in varkens en pluimvee

Marcel Hulst, Arjan Hoekman, Ilonka Wijers, Mari Smits

Dirkjan Schokker

VDI Thema-bijeenkomst 21 april 2015

Maternale en neonatale interventies

Effecten van interventies op in-vitro gekweekte

Intestinal Porcine Epithelial Cells (IPECJ2)

• Neonataal; interventie in kuikens met Octaciline = Amoxiciline;

Octacillin getest in IPECJ2; (vergelijking ook met ZnO-VDI-5; biggen/IPECJ2)

• Maternaal; interventie in drachtige zeugen – effect op biggen van Amoxiciline;

Paracilin getest in IPECJ2

(veel overeenkomsten Paracilin en Octacilin; Octacillin wordt besproken !)

• Neonataal; interventie in biggen met Lange (Lc) en Korte (Sc) keten Fructo-

oligosaccharides

In-vivo; 10% Lc-FOS and 90% Sc-FOS / In-vitro IPECJ2; apart Lc and Sc-FOS

(Frutafit® TEX [long chain FOS] / Frutalose® OFP [short chain FOS] SENSUS).

Nog geen kippen en rund darm epitheel cellijnen beschikbaar !

Overeenkomsten met effecten gemeten in varkens en pluimvee (VDI-6)

Gen expressie analyse; exprimental design

In vivo models In vitro model2 and 6 hrs

Pig: Zn (2500

mg/kg) vs regular

Zn. (~60-100 mg/kg

Testing period:

Day 14 – 23 post

weaning Pig: IPEC-J2 cells

Stimulated with:

Lc and Sc FOS (with or

without Salmonella)

Pigs: mixture of 10%

Lc / 90% Sc FOS

Testing period:

day 14 and 25 days

Pig : IPECJ2 cells

Stimulated with: Zn

(with or without

Salmonella)

Poultry: Octacillin

vs. Control

Age 5 or 14 days

Pig: IPECJ2 cells

Stimulated with:

Octacillin (with or

without Salmonella)

Output files:

Lists of up- and down-regulated genes

in-vitro versus in-vivo

IPECJ2 Biggen/kuikens

In-vitro; IPECJ2 1 type cel

Alle neuzen wijzen dezelfde kant op !

Ook indien er communicatie/feedback is tussen cellen en de omgeving

In-vivo; verzameling van verschillende type cellen en er is bloed toevoer

Influx van cellen (b.v. immuun cellen)

Communicatie tussen cellen (feedback)

Samenspel met microbiota–nutrient-cellen

Cel-test / Dierproef > lijst met genen die reageren

Respons genen > biologische processen die een rol spelen

Biologische processen > effect op darm functie

Darm functie > immuun competentie /performance

Respons genen > meetlat/uitleesparameters darm functie

additiveConcentration

(% w/v)FC cut off(up/down)

# genes * 2h # genes * 6h

Salm. NA 2 83 318

ZnO 0.0325 2 178 722

ZnO+Salm. 0.0325 2 35 651

Octacillin 0.50 2 92 707

Octacillin+Salm. 0.50 2 169 732

Lc FOS 2.50 2 0 1

Lc FOS + Salm. 2.50 2 271 309

Sc FOS 2.50 2 0 2

Sc FOS +Salm. 2.50 2 522 468

* number (#) of unique genes differentially expressed / FC = FOLD CHANGE

Gen expressie metingen; respons genen in-vitro

IPEC-J2 cells

+Additieven

(+ en – Salmonela)

2 hrs

6 hrs RNA Microarray regulated genes

2 hrs

6 hrs

• Effect additieven in stress (+Salmonella) en in niet-stress situatie

• Effect additieven op de immuun-signalering door IPECJ2 cellen •

Bioinformatica - datamining; meer biologische processen/pathways in-vitro dan in-vivo

Effect Octacillin en ZnO op expressie van cytokine/chemokine genen

gene hrs Salm. ZnOZnO-

Salm.Oct.

Oct-

Salm.

IL8 2 ↑↑ ↓↓ _ ↑ ↑

CXCL2 2 ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑

CXCL2 6 ↑ ↓↓ ↑ ↓↓ ↓↓

CSF2 2 ↑↑ ↑↑ ↑ ↑↑ ↑↑

CSF2 6 ↑ _ _ _ _

IL1A 2 ↑↑ ↑ _ ↑ ↑

IL1A 6 ↑↑ ↓↓ _ ↓↓ ↓↓

IL6 2 _ ↓ _ ↓ ↓

IL6 6 _ _ ↑ ↓ ↓

CCL20 6 ↑ ↓ _ _ ↓

IFNA4 6 ↓ _ ↑↑ _ _

IFNL1 2 _ ↑↑ _ _ _

IFNL1 6 _ _ _ ↑↑ ↑↑

IL18 6 ↓ _ ↓ _ ↑

IL21 6 ↑ _ ↑↑ _ _

IL1B 6 _ _ ↑↑ _ _

LTA 6 _ _ ↑↑ _ _

In-vitro Octacillin en ZnO....

� moduleren cytokine/chemokine respons in IPECJ2

� moduleren Salmonella geïnduceerd cytokine/chemokine respons

� modulatie CXCL2 en IL1A respons is identiek (boxen)

� TNF-signaal transductie reguleert cytokine/chemokine productie in IPECJ2

In-vivo cytokine/chemokine respons niet dominant /meetbaar

(geen pathogeen challenge en er is relatief laat gemeten > 5 dagen)

LTA

BIRC3

MAP3K8

CFLAR

MAP2K1

NFKBIA

BIRC3

NFKBIA

RIPK3

JUN

Not regulated by ZnO-Salm.

Not regulated by Salm.

Specific for ZnO-Salm.

Specific for Salm.

Cytokine/chemokine

Biologische processen/pathways geïnduceerd door Octacillin en ZnO

Pathway term% matched

genes

Oct

(2h)

Oct

(6h)

Oct-Salm

(2 h)

Oct-Salm

(6 h)

Salm

(2h)

Salm

(6 h)

ZnO

(2 h)

ZnO

(6 h)

ZnO-Salm

(6 h)

ZnO-Salm

(6 h)

IL6-mediated Signaling Events 18.0 + + + +

Validated Targets of C-MYC

Transcriptional Repression14.5 + + +

Hypoxia induced Factor (HIF1-alpha)

Transcription Factor Network11.5 + + + + + + + +

IL-9 Signaling Pathways 9.8 + + + +

TNF Signaling Pathway 9.1 + + + + + + +

Glucocorticoid Receptor Regulatory

Network8.0 + + + + +

Direct P53 Effectors

(DNA-schade / genotoxic stress)7.7 + + + + + + + +

TGF Beta Signaling Pathway 5.6 + + +

NOD-like Receptor Signaling Pathways 5.3 + + + + + + +

Translation Insulin Regulation of

Translation4.7 + + + + +

In-vitro Octacillin en ZnO moduleren /induceren....

� Oxidatieve (HIF1A) /genotoxische stress (P53) processen in IPECJ2

� IL6 signalering belangrijke voor regulatie HIF1A proces

� TNF signalering; regulatie cytokine/chemokine respons

SERPINE1

MAP2K1

CDKN1A/B

NPPA

EGLN1-3

radical-

sensor

TXNIP/DDIT4

(P53-DNA damage)

No regulation Octacillin Specific for Octacillin

SOCS3 inhibition of STAT3

effector molecules

NOX5/PKIA

cAMP/Ca2+ mediated

Intermittent ROS production

IL6 regulatie

Sterke (ZnO) en milde (Octacilline) up-regulatie gen expressie Metallothionein (MT1A) ZnO transporter

Network of genes responding to

Octacillin/ZnO in the presence and

absence of Salmonella.

Sensing of DNA-damage and regulation

of HIF1A transcription activity

(DDIT4, HIPK2, OXTR, NBN)

More dominant for Octacillin

Genes sensing and responding to DNA-damage

are shown in red.

Network of genes responding to Octacillin

Genes responding to oxygen shortage are

highlighted in red.

HIF1A effector genes/ proteins

ZnO/Octaciline induced oxidative stress (ROS)

IPECJ2 enterocytes react by secretion of

HIF1A-effectors like HMOX1, SERPINE1 and

EDN1 to widen veins to supply and stimulate

uptake of oxygen and glucose from the blood.

To survive from oxidative stress IPECJ2 cells

promote anaerobic energy metabolism by

regulating genes involved glucose, pyruvate,

and fructose transport (HK, SLC2A1, PDK1,

PFKFB3 and PGK1).

The interplay between IL6 and MT’s may be a

crucial mechanism to cope with ROS and in

protecting IPECJ2 cells from a ROS overload.

More dominant for ZnO

Key-genen (“meetlat genen”)

Biologische processen geïnduceerd in IPECJ2 door Octacillin en ZnO

additive gene description function

Octacillin DDIT4 DNA-damage-inducible transcript 4 regulates cell growth, proliferation and survival

Octacillin HIPK2 homeodomain interacting protein kinase 2 corepressor and a coactivator of transcription factor (TP53)

Octacillin NBN nibrin DNA damage sensing

Octacillin NOX5 NADPH oxidase, EF-hand calcium binding domain 5 calcium-dependen NADPH oxidase generating superoxide

Octacillin TXNIP thioredoxin interacting protein

inhibitor thioredoxin/inhibits proteasomal degradation of

DDIT4

ZnO HK2 hexokinase 2 phosphorylates glucose to produce glucose-6-phosphate

ZnO NPPA natriuretic peptide A hormone

ZnO OXTR oxytocin receptor hormone receptor

ZnO / Octacillin EDN1 endothelin 1 vasoconstrictor

ZnO / Octacillin EGLN1 egl-9 family hypoxia-inducible factor 1 intracellular radical sensor

ZnO / Octacillin HMOX1 heme oxygenase (decycling) 1 enzyme heme catabolism, cleaves heme to form biliverdin

ZnO / Octacillin SERPINE1 serpin peptidase inhibitor, clade E member 1 cytoskeleton actin-binding protein 1

ZnO / Octacillin MT1A metallothionein 1A intra and extracellular zinc transporter

In-vitro; Octacillin en ZnO moduleren/induceren....

• TNF signaal transductie; regulatie cytokine/chemokine respons

• Oxidatieve stress (HIF1A) / genotoxische stress (P53) processen

• IL6-MT1A signaal transductie belangrijke voor regulatie activiteit HIF1A

transcriptie

• C-MYC Transcriptional Repression; specifiek voor Octacillin

Biologische processen geïnduceerd in IPECJ2 door Octacillin en ZnO

HLADQA1

ZFP36L2

MT1AACTR5

SLC2A6

MT1ADMBT1

PPP1R3C

FOS

MT1A

FA2H

96 146

678

392

1

2

Jejunum 23d ZnO 2hr

ZnO 6hr

ZnO 2hr

ZnO 6hr

Ileum 23d

33 146

678

12

0

9 146 146

678

2

0

041

Jejunum 35d Ileum 35d ZnO 2hrZnO 2hr

ZnO 6hrZnO 6hr

10

678

1

0

0

ZnO (overlap met in-vivo)

Proefgroep gevoerd met een hoog Zinc rantsoen met 2500 mg/kg Zn)

d 14-24 en controlerantsoen van dag d 24-35

ZnO (overlap met in-vivo)

• HIF-1α Pathway

• MT1A

o Heavy metals

o IL6

o Oxidative stress/ inflammation

• FA2H (vasodilation/constriction)

o Ceramide metabolism

o SERPINE1 (alias PAI-1)

• SLC2A6

o Glucose energy shortage

OSER1

MID1IP1

ZBTB17

In-vivo day 14IPECJ2 2hr IPECJ2 2hr

IPECJ2 6hr IPECJ2 6hr

50

683

64

682

6434

0

0

0

0

241 242

In-vivo day 5

Octacillin (overlap met in-vivo)

Octacillin was administered via the drinking water (67 mg

amoxicillin/L) to 1-day-old chickens for a period of 24 hrs.

Dissection intestinal tissue at day 5 and 14

• Selected targets of cAMP responsive element binding protein 1 (CREB)

activation (signaal transductie betrokken bij veel processen)

• OSER1

o ROS responder

• ZBTB17 (alias Miz-1)

o Inhibition MYC transcription

o MYC target genes regulate Apoptosis/cell cycle arrest

o MYC responds to DNA-damage

Octacillin (overlap met in-vivo)

additiveConcentration

(% w/v)FC cut off(up/down)

# genes * 2h # genes * 6h

Lc FOS 2.50 2 0 1

Lc FOS + Salm. 2.50 2 271 309

Sc FOS 2.50 2 0 2

Sc FOS +Salm. 2.50 2 522 468

Lc en Sc FOS.....

� moduleren niet een cytokine/chemokine respons in IPECJ2

� moduleren niet een Salmonella geïnduceerd cytokine/chemokine respons

� reguleren nauwelijks gen expressie in IPECJ2 cellen

� beperkt effect op de expressie van genen geïnduceerd door Salmonella (Lc)

Biologische processen/pathways geïnduceerd in IPECJ2 door

Lc en Sc FOS

Lc FOS reduceert de expressie van Salmonella geïnduceerde genen

Figure. Chemical-protein interaction

network of Salmonella-induced genes

reduced in expression by Lc-FOS.

Genes/proteins associated with

membrane bound organelles are shown

in red. EXOSC genes were added to the

network.

ZFP36L1 (ZFP36 ring finger protein-like 1)

early response gene / Butyrate Response Factor 1 (ook

gereguleerd door ZnO alleen)

� Hypothesis

IPECJ2 cells respond to “metabolic products” of FOS

fermentation like Butyrate??

> ZFP36L1 interacts with core components of the

exosome (EXOSC’s)

> ZFP36L1 Recruits exosomes and enzymes to

degrade mRNA met AU-rich stretches (e.g cytokines)

additive gene description

FOS ERO1L ERO1-like (S. cerevisiae)

FOS P4HA1 prolyl 4-hydroxylase, alpha polypeptide I

FOS RYR2 ryanodine receptor 2 (cardiac)

FOS ZFP36L1 ZFP36 ring finger protein-like 1

Key-genes

FOS (overlap met in-vivo)

From day 2 or 3 after birth piglets got twice a

day an oral administration of 15 ml of 10g/L FOS

(9:1 Sc-Lc) dissolved in water.

Dissection intestinal tissue at day 14 and 25

• In-vivo 14 dagen; genexpressie regulatieo Up-regulatie extracellulair matrix genen (MMP’s/ADAM) en

cytoskelet genen (Actine / Laminin)

o Down-regulatie histone H1 genen

o Geen dominante pathways processen onderkend

• Overlap in-vivo/in-vitro

Sc-FOS reduceert de expressie van Salmonella geïnduceerde genen

-Histone demethylase; Lysine (K)-Specific Demethylase (KDM7A)

-Histone H1/H2/H4

Conclusies; overlap in-vivo / in-vitro

• Er is een beperkte overlap; verbeteren..

-tijdstip meten na interventie is belangrijk / dichter bij elkaar (eerder meten in-vivo !)

-challenge/stress in-vivo toepassen (meten effect op cytokine/chemokine response)

• Genen/processen geïdentificeerd bruikbaar als/voor...

o meetlat/uitleesparameter voor darmfunctie

o de ontwikkeling van alternatieve stoffen voor bestaande interventies

o verschaffen inzicht in functie van de darm

• In vitro “bioassay” ontwikkeld / gevalideerd

-Bruikbaar voor het pre-screenen van “voer additieven” in IPECJ2 cellen (goedkoop t.o.v. in-vivo).

-Deels toepasbaar voor kippen /en rund ?

• Interessante resultaten in-vitro

> Overlap respons Amoxicilline / ZnO (alternatieven voor antibiotica/ZnO)

> IPECJ2 test ook te gebruiken om effect van fermentatie producten

microbiota te meten ?