KA THOLIEKE UNIVERSITEIT TE LEUVEN

FACULTEIT WETENSCHAPPEN

DEPARTEMENT BIOLOGIE

LAB ORA TORIUM VOOR PLANTENECOLOGIE

Ecologie van de fosfaatopname door macrofyten, met bijzondere aandacht voor Chara giobuiaris

door

Heroen Verbruggen

Promotor: Prof. Dr. J. Van Assche

2000-2001

proefschrift ingediend tot het behalen van de graad van licentiaat in de Biologie

Dit proefschrift is een examendocument, dat na verdediging niet gecorrigeerd wordt voor eventueel vastgestelde fouten. In publicaties mag enkel naar dit werk gerefereerd worden mits schriftelijke toelating van de promotor vermeld op de voorpagina.

Vele mensen hebben mij bijgestaan en geholpen gedurende het voorbije jaar en ik wil hiervoor mijn dankbaarheid uiten. Zoals het hoort, dank ik in de eerste plaats mijn promotor, JozefVan Assche, voor de kans die hij mij gaf op zijn labo het onderzoek te doen dat me erg geboeid heeft. Ik heb van hem bijzonder veeI vrijheid gekregen bij het invullen van het onderzoek, wat ik erg apprecieer. Ik wil ook Wouter, mijn begeleider, bedanken voor alle hulp en de kritische opmerkingen.

De professoren en het personee1 van de laboratoria Ontwikkelingsbiologie en Plantenfysiologie wil ik bedanken voor hun collegialiteit. Het gebruik van hun materiaal was, ten gevolge van defecte pH-meters en drukbezette fotospectrometers in het eigen laboratorium, een absolute noodzaak.

Andre van Laere en Jan Colpaert hebben mij bijgestaan toen er zich problemen stelden in verband met de transporterkinetica. Luc De Meester en Steven Declerck hebben een aantal nuttige suggesties en opmerkingen aangebracht in verband met een aantal hypothesen over de pH-afhankelijkheid van de fosforhuishouding en de consequenties hiervan voor de ecologie van het meer. Luc Vervoort ver­schafte mij toegang tot het natuurreservaat Vorsdonkbos-Turfputten en wisselde met mij van gedach­ten over de groeistrategieen van Chara en Elodea. Allemaal bedankt hiervoor. I would like to thank Tetsuro Mimura and Robert Reid for their unpublished findings and their helpful comments on the regulation of phosphate uptake in Chara.

Ik wens ook Olga te bedanken voor de resultaten van haar arbeidsintensief telwerk die ik heb mogen incorporeren in de gegevensset over de seizoenale opvolging. Bedankt ook voor de hulp bij de wateranalyse en voor het foutloos meenemen van pen en papier op het veld. Pieter, bedankt voor de diepgaande babbels over de ecologie van ondiepe meren en over tal van andere onderwerpen, voor de hulp bij de wateranalyse en voor de niet aflatende vriendschap gedurende de voorbije vier jaren. Ineke en Annemie hebben het hobbelige pad van de stikstotbepaling voor mij geeffend, heel stevig bedankt daarvoor.

Ik wil ook aIle andere mensen op het labo bedanken, voor de geweldige tekeningen op het bord en de samenwerking, en last but not least, voor het opgebrachte geduld, dat ongetwijfeld nodig was om een heeljaar in (relatieve) vrede met mij samen te werken. Ook dank aan aI mijn vrienden, in het bij­zonder aan Kurt, Philippe en Saar. Ik wens ook mijn broer te danken omdat hij mij toch maar blijft steunen in wat hij zelf mijn vakidiotie noemt.

Uiteindelijk zou ik deze gelegenheid willen aangrijpen om heel mijn familie, maar in het bijzon­der mijn ouders, te danken. Zonder hen zou ik onmogelijk staan waar ik nu sta. Ik wil hen danken voor aile steun, zowel de materiele als de psychologische. Het is aan mijn ouders dat ik deze eindverhan­deling opdraag.

Heroen Verbruggen, 10 mei 2001.

INHOUD

INLEIDING EN DOELSTELLINGEN

LITERA TUURSTUDIE

2.1 FOSFOR ALS MACRO NUTRIENT

2.2 FOSFOR IN AQUA TISCHE MILIEUS

2.3 FOSFORCOMPARTIMENTEN EN -POOLS IN DE CEL

2.4 FOSFAATOPNAME IN PLANTEN: TRANSPORTERS EN REGULATIE

2.4.1 FOSF AA TOPNAME DOOR PLANTEN

2.4.2 DE RESPONS VAN PLANTEN BIJ FOSFORUITHONGERING

2.4.3 CONTROLEMECHANISMEN VAN DE FOSFAATOPNAME

2.4.4 FOSF AA THOMEOST ASE

2.5 DE INVLOED VAN pH EN NATRIUM OP DE FOSF AA TOPNAME

2.6 MACROFYTEN EN DE FOSFORHUISHOUDING VAN ONDIEPE MEREN

2.6.1 WATERKOLOM EN SEDIMENT ALS FOSFORBRONNEN VOOR MACROFYTEN

2.6.2 MACROFYTEN EN DE PI-CONCENTRATIE VAN WATERKOLOM EN SEDIMENT

2.6.3 FOSFOR EN DE ECOLOGIE V AN CHARA

2.6.4 FYTOPLANKTON EN DE FOSFORHUISHOUDING V AN ONDIEPE MEREN

2.7 BIOLOGISCHE STOICHIOMETRIE: EEN KORTE INLEIDING

2.8 INTERACTIES TUSSEN FYTOPLANKTON, PERIFYTON EN MACROFYTEN

2.9 BEKNOPTE UITDIEPING VAN DE ECOLOGIE VAN ONDIEPE WATERS

2.9.1 EUTROFIERING

2.9.2 HET VOEDSELWEB IN ONDIEPE ZOETWATERECOSYSTEMEN

2.9.3 ALTERNATIEVE EVEWICHTEN

2.9.4 MACROFYTEN EN DE HELDERE TOESTAND

2.9.5 BIOMANIPULATIE

MATERIAAL EN METHODEN

3.1 W A TERANALYSE EN SEIZOENALE OPVOLGING V AN DE FOSFAA TOPNAME

3.2 DE INVLOED VAN NA+ EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME

3.3 OPNAME-EXPERIMENTEN V AN ZEER KORTE DUUR

3.4 INVLOED VAN DE pH OP DE PI-OPNAME

3.5 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING

3.6 HET CBARA-ELODEA EXPERIMENT

3.7 HET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

3

3

3

4

5

5

8

9

13

16

17

17

19

21

23 24

28 30

30

31

32 34

34

37

37 40

43

44

46

46 49

RESULTATEN

4.1 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME

4.2 SEIZOENALE OPVOLGING

4.3 DE INVLOED VAN NA + EN K+

4.4 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

4.5 INVLOED V AN DE pH OP DE PI-OPNAME

4.6 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING

4.7 BET CHARA-ELODEA EXPERIMENT

4.8 BET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

BESPREKING

5.1 DE OPNAME VAN FOSFOR DOOR CHARA GLOBULARIS

5.2 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME

5.3 SEIZOENALE OPVOLGING

5.4 DE INVLOED V AN NA + EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME

5.5 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

5.6 INVLOED VAN DE pH OP DE SNELHEID VAN FOSFAATOPNAME

5.7 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFAATUITHONGERING

5.8 BET CHARA-ELODEA EXPERIMENT

5.9 BET CHARA FOSFORUITHONGERINGSEXPERIMENT

REFERENTIELIJST

SAMENV ATTING

SUMMARY

ApPENDICES

ApPENDIX 1: SAMENSTELLING VAN APW

ApPENDIX 2: AFKORTINGENLIJST

ApPENDIX 3: MA TERIAAL EN METHODEN

ApPENDIX 4: RESULTATEN

51

51

51

56

59

60

63

64

70

73

73

74 75 78

79 80 81

81

86

89

93

95

A-1

A-2

A-3

A-5

INLEIDING EN DOELSTELLINGEN

Fosfor is een belangrijk macronutrient. Het is een component van structure Ie en functionele mole­culen in de cel. Het speelt bovendien een belangrijke rol in het energiemetabolisme en de regulatie van enzymen. In natuurlijke omstandigheden is fosfor vaak in ondermaat aanwezig. Planten hebben dan ook tal van morfologische en fysiologische adaptaties verworven om efficient fosfaat op te nemen.

Voor natuurlijke zoetwater-ecosystemen wordt tamelijk algemeen aanvaard dat fosfor de voor­naamste limiterende factor is voor de groei. De laatste decennia werden echter de meeste vijvers en meren uit bewoonde gebieden, door toedoen van menselijke activiteiten, overmatig aangerijkt met fosfor en andere nutri"enten (eutrofiering). De reactie op deze aanrijking was vaak overweldigend. De vijvers en meren, die voorheen helder waren en voorzien van een florerende onderwatervegetatie en dito fauna, werden omgevormd tot sobere waters waarin, op de dense fytoplanktongemeenschap na, nog amper leven te bespeuren was.

Ondergedoken macrofyten, en in het bijzonder charofyten, zijn belangrijk in het behoud van de heldere toestand van zoetwatersystemen. Charofyten verdwijnen relatief snel bij nutrientaanrijking van een water. De oorzaak hiervoor was een punt van discussie. Vroeger nam men, op basis van slechts een studie, aan dat de charofyten verdwenen ten gevolge van toxische effecten van de hoge fosfor­concentraties. Deze fosfaatinhibitie werd echter hoe langer hoe meer tegengesproken. Tegenwoordig neemt men aan dat het verdwijnen van de charofyten, net zoals van de andere macrofyten, vooral te wijten is aan lichtcompetitie met het fytoplankton en epifyton, dat door de nutrientaanrijking in staat is sterk te floreren.

Macrofyten stabiliseren de heldere toestand van het water. Hiertoe zijn er enkele mechanismen gekend, waarvan allelopathie en sterke competitieve kracht voor het verwerven van groeilimiterende nutrienten er twee zijn. Uit een aantal studies blijkt dat macrofyten over het algemeen sterke competitoren zijn voor fosfor en dat ze op die manier in staat zijn de fosforcyclus van het water te domineren. Het onderzoek dat in deze scriptie wordt voorgesteld had als doel bijkomende informatie en inzichten te verwerven over dit fenomeen.

De studie kent in hoofdzaak drie doelstellingen. De eerste is om seizoenale patronen in abiotische factoren te koppelen aan de fosfaatopname van Chara globularis in een door deze soort gedomineerde vijver. Ten tweede werd beoogd in laboratoriumomstandigheden de invloed van een aantal parameters (ionenconcentraties, pH) op de fosfaatopname na te gaan. Een laatste doelstelling is om de groeistra­tegieen van Chara (typisch voor oligo- en mesotrofe waters) en Elodea (typisch voor eutrofe waters) te koppelen aan hun fosfaatopname-gedrag.

Wat betreft de eerste doelstelling werd gedurende een volledig jaar een vijver maandelijks bemonsterd. De fosfaatopname van de erin aanwezige Chara globularis werd in het laboratorium gekwantificeerd en er werd getracht de kinetische parameters te koppelen aan enerzijds de groei­patronen en het inwendige fosforgehalte van de planten en anderzijds aan de abiotische kenmerken van het ecosysteem.

Het tweede luik besteedt aandacht aan de invloed van abiotische factoren op de fosfaatopname van Chara globularis. Vooral de pH en de natrium- en kaliumconcentraties werden hierbij geviseerd. Wat betreft pH werd ook een experiment uitgevoerd met Nitella jlexilis. Er werden bovendien een

aantal experimenten uitgevoerd om na te gaan hoe snel Chara reageert op fosforuithongering en om de aard van het transmembranair transport van fosfaat na te gaan.

Het derde luik centreert zich rond een aantal biotische kenmerken die mogelijk een invloed heb­ben op de fosfaatopname. Chara globularis en Elodea nutallii werden in het laboratorium gedurende lange termijn blootgesteld aan fosforloos en -bevattend medium. De snelheid van fosfaatopname werd opgevolgd terwijl de inwendige fosforgehaltes veranderden door toedoen van de incubatie. De waar­genomen patronen werden gekoppeld aan de levensstrategieen van beide soorten.

2

LITERA TUURSTUDIE

2.1 FOSFOR ALS MACRONUTRIENT

Fosfor is een belangrijk macronutrient dat instaat voor ongeveer 0.2% van het drooggewicht van de gemiddelde plant. Het is een essentieel component van nucleYnezuren en fosfolipiden en is boven­dien van enorm belang in het energiemetabolisme en de regulatie van enzymen (Mimura, 1995 en referenties daarin). De rol van fosfor in metabolische pathways, in de regulatie van RNasen en fosfa­tasen, voor wortelarchitectuur en mycorrhiza-interacties en in zijn eigen opname zijn reeds intensief bestudeerd (Theodorou & Plaxton, 1993; Raghothama, 1999 en referenties daarin)

Algemeen wordt aangenomen dat, voor terrestrische ecosystemen, fosforlimitatie de tweede meest voorkomende vorm van macronutrientlimitatie is; waarschijnlijk komt stikstoflimitatie nog meer voor (Schachtman et at., 1998). Voor zoetwater-ecosystemen wordt voornamelijk fosfor als de groeilimi­terende factor gezien. Een recent gepubliceerde grootschalige studie toont echter aan dat stikstof­limitatie meer voorkomt dan algemeen aangenomen (Elser et at., 2000b).

Fosfaattekort reduceert relatief snel de groei van de plant. De deficientie remt de fotosynthese, veroorzaakt een herverdeling van het aanwezige fosfor en heeft een duidelijke invloed op de allocatie van de gevormde assimilaten.

2.2 FOSFOR IN AQUATISCHE MILIEUS

2.2.1 FOSFOR IN DE WATERKOLOM

Meestal komt fosfor voor in de geoxideerde vorm, als anorganisch orthofosfaation (HPO/-, HP04-) of gebonden aan organische stoffen (Holtan et at., 1988). Fosfor kan onder ver­schillende gedaanten voorkomen in de water­kolom. Eerst kan men onderscheid maken tus-sen de fractie fosfor die gebonden is in zwe­vende partikels (p.p.1) en de oplosbare fosfor­

{

P.P.

Tot-P S.P. {S.R.P

S.U.P.

Tot-P = total phosphorus P.P. = particulate phosphorus S. P. = soluble phosphorus S.R.P. = soluble reactive

phosphorus S.U.P. = soluble unreactive

phosphorus

Figuur 2.1 Fosfor in de waterkolom (naar Holtan et a/., 1988)

fractie (S.P.). Deze laatste kan nog verder ingedeeld worden in oplosbaar reactief fosfor (S.R.P.) en oplosbaar onreactieffosfor (S.U.P.) (figuur 2.1). Van het S.R.P. nam men lang aan dat het grotendeels equivalent was aan het orthofosfaat (HPO/-, H2POn en de onmiddellijk beschikbare fosforfractie was.

Tussen de verschillende vormen van het S.P. en het P.P. bestaat er intensieve uitwisseling, met belangrijke gevolgen voor de fosforbeschikbaarheid van organismen. Van het S.R.P. neemt men aan dat het volledig beschikbaar is voor opname door organismen. Het S.U.P. is snel mobiliseerbaar (enzymatische hydrolyse) en het P.P. kan snel in oplossing komen als de omstandigheden hiertoe

1 Appendix 2 vat de gebruikte afkortingen samen.

3

geschikt zijn. Vee 1 van het fosfor dat niet direct beschikbaar is voor groei van organismen kan dus relatief snel worden omgezet in een beschikbare vorm.

In eutroficatiestudies gebruikt men vaak de totale hoeveelheid fosfor die aanwezig is in de water­kolom (totaal-P of TP). Dit brengt echter twee beperkingen met zich mee. Ten eerste kan niet de volledige hoeveelheid TP in de waterkolom snel worden omgezet in beschikbare vorm en ten tweede is er in ondiepe meren een sterke uitwisseling van P tussen het sediment en de waterkolom, zodat een momentopname van het TP van de waterkolom niet noodzakelijk representatief is voor de nutrient­status van het meer (zie ook figuur 2.21).

Orthofosfaatconcentraties in zoetwatermeren en -vijvers zijn meestal te situeren tussen 1.5 IlgP rl (0.05 11M) en 60 IlgP rl (211M) of zelfs meer (Bieleski, 1973).

2.2.2 FOSFOR IN HET SEDIMENT EN INTERACTIES TUSSEN BE IDE FOSFORPOOLS

Holtan et al. (1988) en Scheffer (1998) gaan dieper in op de fosforreservefunctie van het sedi­ment. De fosforcyclus van een doorsnee ondiep meer wordt kort geschetst in figuur 2.2.a. Turbulentie speelt hierin een belangrijke rol. Enerzijds wordt het fosfortransport vanuit het sediment naar de waterkolom versneld door turbulentie (fosforvrijzetting door resuspensie). Anderzijds zorgt turbulentie voor een blijvende aerobe bovenlaag van het sediment. Dit haalt fosfor weg uit de waterkolom door sedimentatie van Fe3+ met Pi. De invloed van de turbulentie op de fosforvrijzetting uit het sediment wordt samengevat in figuur 2.2.b. Merk op dat de zuurstofstatus in de toplaag van het sediment ook in belangrijke mate onder invloed van het biotische activiteiten (b.v. microbieel zuurstofverbruik) staat.

(a)

:::::====~ t Afbraak J

, , ' .. ~ ~ -................ -_ .. -_ .. __ .. -- ........ -.... -- -_ .. '

(b) ji

turbulentie aan sedimentoppervlak ,

Figuur 2.2 (a) Schematische voorstelling van de belangrijkste processen van de interne fosforcyclus van een ondiep meer. Turbulentie veroorzaakt maar tempert tegelijk de fosfaatvrijzetting. Naar Scheffer, 1998. (b) Sche­matische voorstelling van het effect van turbulentie aan het sedimentoppervlak op de fosforvrijzetting vanuit het sediment. Naar Scheffer, 1998.

2.3 FOSFORCOMPARTIMENTEN EN -POOLS IN DE CEL

Het grootste gedeelte (ongeveer 90%) van het fosfaat in de eel is aanwezig in de vacuole. De overige 10% van het fosfaat wordt, samen met het veresterd fosfor, teruggevonden in het cytoplasma (Bieleski & Ferguson, 1983 en referenties daarin). Recentere 31 p_NMR spectroscopie toont aan dat het Pi-gehalte van het cytoplasma nog lager is dan voorheen gedacht (ca. 1-5% van de totale Pi in de eel) (Schachtman et al., 1998). Ais radioactief gemerkt fosfor wordt toegediend aan cellen zullen de cyto-

4

plasmatische Pi-pool en de fosfaatesters van het cytoplasma gemerkt worden lang voor­dat de eerste radioactiviteit verschijnt in de vacuole. In lagere planten is vaak een poly­fosfaatreserve aanwezig.

Ook binnen het het cytoplasma kunnen verschillende fosfaatpools worden onder­scheiden. Enerzijds maakt men vaak onder­scheid op basis van de chemische vorm waaronder het fosfor voorkomt: Pi, DNA, RNA, vetgebonden P en andere P-esters (Bieleski, 1973; Schachtman et ai., 1998).

Anderzijds kan men onderscheid maken op basis van de fYsische compartimentatie: de

O.B

0.6 .!!!

~ 0.4

0.2

O~------~--~------~--~----~~ o 1 2 3 4 5 6 7 B 9 10 11 12 13 14

pH

Figuur 2.3 pH-afhankelijkheid van het ionkarakter van fosfaat. Bij lage pH komt Pi voor onder vorm van H3P04. Met toenemende pH verliest het steeds meer protonen aan het medium ...... : H3P04; -: H2P04-; - - -: HPO/-; . - . -: P043-.

verschillende organellen en het grondplasma kunnen als afzonderlijke pools gezien worden. Afhan­kelijk van de pH in het compartiment zal fosfaat voorkomen als H3P04, H2P04 -, HPO/- of pol- (zie figuur 2.3).

AIleen de cytoplasmatische fosfaatpool is metabolisch actief. Voor de metabolische reacties is het zeer belangrijk de cytoplasmatische fosfaatconcentratie binnen nauwe grenzen te houden (homeo­stase). Hiertoe wordt voomamelijk gebruik gemaakt van de fosfaatreserve in de vacuole (cf. 2.4.4).

2.4 FOSFAATOPNAME IN PLANTEN: TRANSPORTERS EN REGULA TIE

2.4.1 FOSFAATOPNAME DOOR PLANTEN

2.4.1.1 Inleiding

De import van fosfor in de plant gebeurt aan het plasmalemma. De fosfaatopname over de plasmamembraan gebeurt tegen een steile concentratiegradient in (1000x tot meer). Bij de meeste onderzochte planten wordt tweefazige opname waargenomen. De hoge affiniteitstransporters (vaak zijn er meerdere aanwezig) werken optimaal bij lage concentraties Pi in het medium (grootte-orde )lM) en de lage affiniteitstransporter (waarschijnlijk in de meeste soorten maar een) werkt optimaal in het mM gebied.

Gezien de lage fosfaatconcentraties in de meeste natuurlijke milieus is het zeer waarschijnlijk dat voomamelijk de hoge affiniteitstransporters van primair belang zijn voor de fosfaatopname. Het H2P04- ion wordt het makkelijkst opgenomen door piantencellen. Aangezien immers de orthofosfaat­ionen tegen een elektrische potentiaal in moeten worden opgenomen, is deze vorm energetisch gunstiger dan de andere twee (HPO/-, PO/-).

5

2.4.1.2 Opname met behulp van proton-cotransport

Voor de opname werd cotransport met protonen voorgesteld (Sakano, 1990; Sakano et al., 1992; Raghothama, 1999 en referenties daarin). Sakano (1990) vond dat toevoeging van fosfaat aan het incubatiemedium van celsuspensies van Catharanthus roseus (L.) G. Don. stijging van de pH van het incubatiemedium veroorzaakte (figuur 2.4.a). Deze stijgingen bleken proportioneeJ toe te nemen met de hoeveelheid toegediend fosfaat (figuur 2.4.b). De proton/fosfaat stoichiometrie is negatief gecor­releerd met de hoeveelheid toegediend fosfaat (figuur 2.4.c). Ze bedraagt meestal tussen de 2 (zoals eerder al voorgesteld door Ullrich-Eberius et at., 1981 en 1984; beide uit Sakano, 1990) bij relatief hoge fosfaatconcentratie en 4 bij zeer lage fosfaatconcentraties. Buffering van het medium veroorzaakt dan ook een lichte pH-stress voor de plantencellen (Sakano, 1990; Sakano et al., 1992; figuur 2.5)

(b)

lOmin

<a) 5.0

4.5 lOmin

Pi dose (.umoie/g fresh wt)

Figuur 2.4 Fosfaatopname in celsuspensies van Catharanthus roseus (L.) G. Don. (a) en (b) tonen de pH-ver­schuivingen die gepaard gaan met fosfaatopname. In (a) werd telkens 10 !lmol fosfaatoplossing toegediend. De tijd nodig om te pH-piek te bereiken is telkens 7 minuten. (b) Bij toediening van verschillende hoeveelheden Pi veranderde ook de pH-respons, wat een goede aanduiding is voor proton/fosfaat cotransport. Bij de eerste toe­diening van 1 !lmol fosfaat werd geen daling van de pH waargenomen, waarschijnlijk omdat voor zulke kleine verschillen de H+-ATPasen niet in werking worden gesteld. (c) De waargenomen proton/fosfaat stoichiometrie staat duidelijk in negatief verband met de hoeveelheid toegevoegd fosfaat. Uit Sakano, 1990.

Fosfaattransporters worden gecodeerd door een kleine genenfamilie (Muchhal et al., 1996; uit Muchhal & Raghothama, 1999). Alle gekloneerde Pi transporters zijn integrale protei'nes met 12 membraanoverspannende regio's. Deze membraanoverspanningen zijn, door een grote hydrofiele regio aan de cytoplasmatische zijde, opgedeeld in twee groepen van zes (figuur 2.6). Deze structuur komt voor bij de meest uiteenlopende organismen en is erg gelijkend aan suiker-, ionen-, antibiotica- en aminozuurtransporters (Raghothama, 1999).

Het pH optimum van de fosfaattransporters ligt in het bereik 4.5 a 5.0.

cytoplasmatische zijde

Figuur 2.6 Een model van de fosfaattransporter van planten, met 12 membraanoverspannende gebieden. Uit Raghothama, 1999.

6

100

;;; 80 :

8 60 il t

40 .s ;;: 20 --<>-----0

0

0 10 20 30

Time (min)

Figuur 2.5 Het tijdsverloop van de fos­faatopname door een celsuspensie van Catharanthus roseus (L.) G. Don. bij een initiele pH van 4.2, in ongebufferd (0) en MES-TRIS gebufferd (e) medium. Uit Sakano et al., 1992.

2.4.1.3 Fosjaatopname bij Chara corallin a

De kinetica van de fosfaatopname van het groenwier Chara corallina werd bestudeerd door Mimura et al. (1998). Figuur 2.7 toont hun bevin­dingen. Er kunnen twee opnamesystemen worden onderscheiden, een met hoge affiniteit voor Pi (Km ~ 4 11M ~ 124 I1gP/l) en een met lage affiniteit voor Pi (Km ~ 220 11M ~ 6820 IlgP/I).

Er werden bij Chara corallina geen pH-varia­ties waargenomen bij toediening van fosfaat, zoaIs weI het geval was bij vroeger onderzoek met ho­gere planten (Sakano, 1990; Ullrich-Eberius et al., 1981; Ullrich-Eberius et al., 1984). Om een even­tueIe invloed van in de praktijk onmeetbare pH­variaties over de plasmamembraan na te gaan werd de cytoplasmatische pH gevarieerd door intra­cellulaire perfusie (Mimura et al., 1998). Dit expe­riment leverde geen verband op tussen de cyto­pIasmatische pH en de fosfaatopname en doet dus vermoeden dat het opnamesysteem niet uit een proton/fosfaat cotransporter bestaat.

Toen Smith en Walker (1989) aantoonden dat K+ influx bij Chara australis Na+ vereiste stelden

30

~'" 20 's "0 S ,5. >< ~ 10 .S e::

0

0.2 "' N

's 0,15 "0 S

:S 0.1

" ::: 0.05 0::: .S

if 0

(a)

0 0.2 0.4 0.6 0.8

Pi (mM)

(b)

0.6

r r 0.4

0.2

0 0 50 100 0 50 100

l/Pi concentration (l/mM)

Figuur 2.7 Fosfaatopname in geTsoleerde interno­diumcellen van Chara corallina. e: controle; 0: fos­foruitgehongerde cellen. (a) Afhankelijkheid van fosfaatinflux op de externe Pi concentratie. (b) dubbele reciproque plots van (a). Uit Mimura et al. (1998),

ze de hypothese dat Na+ gekoppeld membraantransport een vaker voorkomend mechanisme is bij Chara en dat dit een adaptatie zou kunnen zijn aan de relatief aIkalische omgevingsomstandigheden waarin Chara vaak voorkomt. Walker & Sanders (1991) stelden bovendien vast dat ook in het genus Nitella Na + -cotransportsystemen aanwezig zUn voor de opname van K+, ureum en lysine.

Reid et al. (2000) diepten de fosfaatopname van Chara corallina verder uit. Hun resultaten tonen dat de aanwezigheid van Na+ in het medium een duidelijke invloed heeft op de fosfaatopname door het hoge-affiniteitssysteem (figuur 2.8).

Om een Na+/Pi cotransport aan te tonen vol­stond het dus om hierbovenop ook aan te tonen dat Pi een stimulator is van Na+ opname. Figuur 2.9 toont de fosfaatafuankelijke Na+ influx in functie van de fosfaatconcentratie van het medium. We zien hier het lage-affiniteits Pi opnamesysteem (gefitte Km ~ 5 11M) tevoor­schijn komen. Na+ kan in zekere mate worden vervangen door K+ maar in dat geval is de sti­mulatie vee I lager. In waters met een hoge K+/Na+ verhouding zal de fosfaatopname dus door competitieve inhibitie van K+ aan de Na+ bindingsplaats worden geremd.

6

+Na ! I~I

.~ '--'" -----' .-, r i -Na

.~_-o---D---.¢-----V

o ~------~----~------------~ o 200 400 600 800

Pi (IJM)

Figuur 2.8 Concentratieafhankelijkheid van de 32p

influx in Chara corallina in aan- (_) en afwezigheid (0) van 0.4 mM Na bij pH 6. De cellen ondergingen zes dagen pre"lncubatie in fosforloos APW. Uit Reid et al. (2000).

7

Reid et al. (2000) von den ook een sterk synergetisch effect bij toediening van NaT in combinatie met toediening van ATP aan het cytoplasma (figuur 2.10). De eenvoudigste verklaring voor dit patroon is dat het ATP nodig is om de depolarisatie van de membraan, die door het Na+/Pi cotransport wordt veroorzaakt (cotransport van ongeveer 6 Na+ per Pi), tegen te werken. Het zwak transport in de derde conditie kan dan worden verklaard doordat Na+ gedeeltelijk terug naar buiten kan diffunderen. Deze hypothese verklaart echter niet dat bij lage pH de Pi opname hoog blijft (figuur 2.19). De Na+/Pi stoichiometrie zal immers bij lage pH waarden nog veel hoger zijn dan 6. Een alternatieve hypothese is dat het transportsysteem een Na+/Pi ATPase zou zijn (cf. Na+/K+ ATPase bij dieren). Dit zou de goede werking van de transporter bij lage pH verklaren maar zou dan weer in tegenspraak zijn met de opname in een ATP-arm cytoplasma (figuur 2.10). Een derde hypothese is dat een Na+/Pi cotrans­porter zorgt voor de Pi opname maar dat de Na+ ionen bij lagere pH kunnen worden vervangen door protonen. Het genoom van Chara coral/ina codeert zowel voor een Na+/Pi cotransporter als voor een W/Pi cotransporter (Tetsuro Mimura, pers. med.). Mogelijk is de aanwezigheid van beide transporters verantwoordelijk voor de waargenomen patronen

'", 10 ~ 8 / ..... O-'.--.~.-..... --.......... -.-.. --.............. ~

E ! .s 6, P

4 ~

2W

o 100 200 300

[Pij (IJM)

Figuur 2.9 Fosforafhankelijkheid van de 22Na influx bij Chara coral/ina. Enkel de component van de 22Na influx die door Pi gestimuleerd werd is weergegeven. De curve is een Michae­Iis-Menten fit met Km = 5 (..1M en Vmax = 10 nmol m-2 S-1. Dit komt overeen met het lage affiniteitssysteem voor fosfaatopname. Uit Reid et al. (2000).

1.5

-,,'" E 0 1.0 E .s )( :::> r;::

0.5 .., fJ-

11 0 ~ r---J

ATP (mM) I 0 0

0 0 0.4 0.4 Na (mM)

Figuur 2.10 Het effect van toediening van Na+ aan het externe medium en ATP aan het interne medium (intracellulaire perfusie) op de 32p influx in ge"lso­leerde internodiumcellen van Chara coral/ina. De gebruikte externe fosfaatconcentratie was 10 (.1M. Uit Reid et a/. (2000).

2.4.2 DE RESPONS VAN PLANTEN BIJ FOSFORUITHONGERING

Fosfordeficientie is zeer algemeen in de natuur. De evolutie heeft dan ook geleid tot zeer gespecialiseerde mechanismen om het zeldzame fosfor uit de omgeving te verwerven en te gebruiken. Een fosfortekort activeert in de meeste organismen een aantal uithongeringsresponsen die in twee categorieen kunnen worden ingedeeld, namelijk de P-specifieke en de algemene.

De P-specifieke responsen passen de heersende fosforlimiterende omstandigheden aan door de efficiente mobilizatie en verwerving van fosfor te bevorderen. Zo zal er accumulatie van fosfaat­transporters met hoge affiniteit en synthese met bijhorende secretie van RNasen en fosfatasen met een breed substraatspectrum plaatsvinden. Er zullen bovendien metabolische veranderingen optreden. Zo zal bijvoorbeeld de glycolyse een alternatieve, weinig fosfaatvereisende, pathway volgen (Raghothama, 1999 en referenties daarin).

8

De algemene responsen trachten het organisme aan te passen aan de omstandigheden, door te zorgen dat het metabolisme (en de groei) zodanig wordt aangepast dat het organisme (zo lang moge­lijk) kan overleven bij de heersende nutrientencondities.

Er kunnen ook morfologische veranderingen optreden als respons op fosforstress. Zo zal in wortelende planten bij fosforstress het wortelstelsel zodanig worden uitgebreid dat een grotere opper­vlakte:volume verhouding tot stand komt.

2.4.3 CONTROLEMECHANISMEN VAN DE FOSFAATOPNAME:

FOSFORBESCHIKBAARHEID EN INTERNE FOSFORCONCENTRA TIE

2.4.3.1 Inductie van de hoge-a.ffiniteitstransporter

De meeste planten bezitten een fosfaatopnamesysteem met lage affiniteit en een of meerdere met hoge affiniteit (waarschijnlijk zes in het geval van Arabidopsis). Het lage affiniteitssysteem lijkt con­stitutief tot expressie te komen terwijl het systeem met hoge affiniteit bij fosfordeficientie wordt gei"nduceerd (Furihata et al., 1992).

Het inductieproces van de hoge-affiniteitstransporter omvat 'de novo' synthese van transporter­protei"nes (Muchhal & Raghothama, 1999). Bij tomaat (Lycopersicon esculentum) vonden Muchhal & Raghothama (1999) een duidelijke negatieve correlatie tussen de fosfaatbeschikbaarheid in het medium en de hoeveelheid LePT1-protei"nes (Lycopersicon esculentum Phosphate Transporter) in de worteI.

Er werd bovendien aangetoond dat reeds na 24 uur fosforstress duidelijke accumulatie van LePTl voorkomt. Deze respons is voIIedig reversibel; de hoeveelheid van het protei"ne nam, binnen de 24 uur na de fosfortoediening volgend op de uithongering, terug sterk af. Het is duidelijk dat deze regulatie leidt tot een verhoogde fosforopname bij Pi-uithongering, niet door verlaging van Km, maar door ver­hoging van V max (Jungk et al., 1990).

Ook bij Chara corralina wordt de hoge affiniteitstransporter bij fosfaatuithongering snel gei"nduceerd (Tetsuro Mimura, ongepubliceerde gegevens). Merkwaardig is in dit geval dat ook de natriumconcentratie in het prei"ncubatiemedium een rol speelt. In aanwezigheid van fosfor en afwezig­heid van Na+ wordt toch de hoge affiniteitstransporter gei"nduceerd.

AIs fosforuitgehongerde planten in fosfaatrijk medium worden gebracht zal ook een sneJIe res­pons volgen (de fosfaatopname vertraagt snel). Dit wordt toegeschreven aan de toxische effecten van overdadige fosfaatopname (Clarkson & Scattergood, 1982).

2.4.3.2 'Phosphorus Starvation Response'

Wykoff et al. (1999) beschreven in Chlamydomonas reinhartii (Chlorophyta) een gen dat het fosformetabolisme reguleert. Uit mutantenstudies bleek dat het betreffende PSRI-gen (Phosphorus Starvation Response) absoluut noodzakelijk is voor de adaptatie aan P-limiterende omstandigheden.

9

Het voomamelijk in de celkem voorkomend protelne Psrl bezit, naast DNA-bindende gebieden en een dimerisatiezone ook een glutaminerijk gebied zoals men dat aantreft in transcriptie-activatoren.

Bij fosforuithongering van wildtype Chlamydomonas werd een tienvoudige toename van het Psrl protelne waargenomen. Vanaf acht uur na de initiatie van de P-uithongering neemt men significant hogere hoeveelheden fosfaattransporters met hoge affiniteit waar en vanaf zestien uur worden ook fosfatasen uigescheiden.

Wykoff et al. (1999) stellen, op basis van sequentieovereenkomsten met Arabidopsis, Nicotiana en Lycopersicon, dat Psr-achtige regulatie van het fosformetabolisme mogelijk ook voorkomt in hogere planten.

2.4.3.3 Typische respons op fosforuithongering

Er werden verschillende studies ondemomen om de controle van de fosforopname te achterhalen (o.a. Lefebvre & Glass, 1982; Clarkson & Scattergood, 1982; Cogliatti & Clarkson, 1983; Jungk et aI., 1990; Dunlop et aI., 1997; Liu et aI., 1998; Dong et aI., 1999;). Wat voIgt (2.4.3.3 en 2.4.3.4) is een beknopte samenvatting van een selectie uit de resultaten van deze studies.

Bij fosforuithongering stijgt over het algemeen de opnamesnelheid relatief snel, een plateau bereikend na een 3- a 5-tal dagen, afhankelijk van de bestudeerde soort (zie ook figuur 2.7 voor Chara coral/ina). In figuur 2.11 is duidelijk dat de fosfaatopname nagenoeg constant blijft in de +P conditie (voorbehandeling was ook in +P) en geleidelijk toeneemt in de -P conditie.

De opnamesnelheid bereikt een maximum en daalt daama terug. Als men aan het medium van fosforuitgehongerde planten fosfaat toevoegt (streepjeslijn), nam in dit experiment de opname gedu­rende de eerste twee dagen sterk toe. Daama daalde ze tot het niveau van de controle. Deze piek is echter uitzonderlijk (komt niet terug in andere studies).

BTomato - §] jll _, (li«l . JO

B Tomato 600 600

: i~ °0 8 16 J 1 Tane(d) ;-'........ «ll

~.!. ' ,~!i i : \ ; , f \

10

20

Figuur 2.11 Absorptie en translocatie van gemerkt fosfaat door de wortels van (a) gerst en (b) tomaat. Symbolen: -.-: controle, 150 ~M Pi; ·· .. 0·· .. : fosforuithongerings­conditie, geen Pi; ---e---: herincubatie van de fosforuit­gehongerde planten in fosforbevattend medium, 150 ~M Pi. Uit Clarkson & Scattergood, 1982.

10

~ ~ 12 16

Figuur 2.12 Variatie van de fosforconcentratie in de bebladerde stengels van gerst (a) en tomaat (b) gedurende incubatie in oplossingen met of zonder 150 ~M H2P04 -. Zelfde symbolen als in figuur 2.11. De patronen gevonden voor de wortels van dezelfde planten waren erg gelijkend maar minder uitgespro­ken. Uit Clarkson & Scattergood, 1982.

Het fosforgehalte per biomassa-eenheid neemt af tijdens de fosforuithongering (figuur 2.12). AIs na een peri ode van fosforstress planten in een fosforbevattend medium worden gezet, gaan ze, dank zij de verhoogde opnamecapaciteit die tijdens de peri ode van fosforstress werd opgebouwd, zeer snel het fosfor opnemen uit het medium. De fosfaatconcentratie in het weefsel overstijgt snel dat van de controleplanten (figuur 2.12). Dit is waarschijnlijk te wijten aan de lage turn-over van de fosfaattrans­porters die in grote hoeveelheden in de plasmamembraan werden aangelegd (Dong et aI., 1999; en referenties daarin). De hoge opnamesnelheid daalt snel als de planten blijvend blootgesteld worden aan hogere fosfaatconcentraties, maar blijft hoger dan de opname bij controleplanten.

2.4.3.4 De invloed van cytoplasmatisch en vacuolair fosfaat op de fosfaatopname

Bij hogere planten wordt waargenomen dat Pi opgenomen in het cytoplasma de fosfaatopname inhibeert. Lefebvre & Glass (1982) stelden voor dat de fosfaatopname aIIosterisch gereguleerd wordt door cytoplasmatisch Pi (zie ook Dong et aI., 1999). Pi zou een niet-competitieve inhibitor van de W-ATPasen in de plasmamembraan zijn (Tetsuro Mimura, pers. med.). Voor de instandhouding van de fosfaatopname is het nodig dat deze protonpompen actief blijven. Ook bij Chara corallina lijkt inhibitie van de fosfaatopname door intern Pi voor te komen (Tetsuro Mimura, pers. med.).

Dat aIIosterische effecten van cytoplasmatisch Pi relatief onbelangrijk zijn in vergelijking met de hoeveelheid fosfaattransporters in de plasmamembraan blijkt uit figuur 2.12. Mocht de aIIosterische opnamehindering van Pi dominant zijn, zouden de fosfaatuitgehongerde planten hun opname staken als de fosforconcentratie die van de controleplanten bereikte. Dit is duidelijk niet het gevaI.

Liu et al. (1998) vonden dat de expressie van LePT! en LePT2 bij tomaat nauw gecorreleerd is met de beschikbaarheid van Pi in het medium. Hun experimenten met in twee gedeelde wortels toonden echter aan dat de expressie niet door de externe fosfaatconcentratie wordt gereguleerd maar door een interne factor.

In dit kader vonden Bun-ya et al. (1991) voor gist dat hoge interne Pi concentraties de opname­snelheid verlagen door regulatie van de transcriptie. Liu et al. (1998) vonden voor hogere planten dat de opnamesnelheid afneemt met interne fosfaatconcentratie, ook door transcriptionele regulatie. De mechanismen aan de basis van deze transcriptionele regulatie zijn voorlopig onbekend.

In de zoektocht naar de controle van de fosfaatopname werd ook de hypothese gesteld dat de vacuolaire fosforconcentratie een rol zou spelen (Takeshige et ai., 1992; Mimura et al., 1998; en de referenties in beide). Deze geeft immers aan in welke mate de cel fosforstress ondervindt, omdat de vacuolaire Pi-pool aangesproken wordt onder fosfaatstress en aangevuld wordt onder niet fosforlimi­terende omstandigheden. Mimura et al. (1998) acht het onwaarschijnlijk dat de vacuolaire Pi concen­tratie een rol speelt in de fosfaatopname van Chara corallina (cf. figuur 2.17.b).

2.4.3.5 Het belang van de internefosforstatus

Een heel aantal experimenten tonen aan dat planten hun fosfaatopname aanpassen aan hun interne fosforstatus (figuur 2.13), meestal door V max te verhogen (figuur 2.13, a & b) en in veel mindere mate door veranderingen aan te brengen in de Km en/of de minimale fosfaatconcentratie waarbij nog netto opname gebeurt (Cmin) (Junkg eta!., 1990) (figuur 2.13.c).

11

(a)

. ~+ ) 1.1 . Tr "" J

'0

(b)

\ 3D

0

(e) 20

£' 15 Q

Mo,z .. • "noo\ -in

.rOOI

U 1

.,-~ 20

.,-~

" E

is: H)

\_." 6 10 ,~ -0.96: I '00

'00

J s.,,,~~ osheO!

_E .. ~ 0.00\

\ I

y~ 23.)-2s.e~

\ r.-0.939 .. 0 I I I

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0

1.2 " 0 02 0' 0.6 aB 1.0 Plant P concentr. % in d.m % PindeVo.Ortel

Figuur 2.13 (a) Negatieve correlatie, zoals gevonden tussen de fosfaatinflux en de fosfaatconcentratie in gerst­worlels. Uit Lefebvre & Glass, 1982. (b) Negatieve correlatie tussen Vmax en het fosforgehalte van de worlels bij Glycine max en Zea mays. Uit Jungk et a/., 1990. (e) Afhankelijkheid van Km van de fosfaatstatus van de worlel van Glycine max. Naar gegevens uit Jungk et a/., 1990.

In een aantal experimenten (o.a. Clarkson & Scatter­good, 1982; Lefebvre & Glass, 1982) werd een omge­keerd evenredig verband tussen de opnamesnelheid en de weefseIconcentratie teruggevonden. Clarkson & Scatter­good (1982) suggereerden dat de verhoogde opname­snelheden bij fosfaatuithongering best als een derepres­sie van het opnamesysteem wordt gei"nterpreteerd.

Dong et al. (1999) en Jungk et al. (1990) vonden bij respectievelijk de zandraket (Arabidopsis thaliana) en maYs (Zea mays) en de sojaboon (Glycine max) dat opnamesnelheid lineair afnam met het fosforgehalte van de plant (figuur 2.14 resp. figuur 2.13.b). Dong et al. (1999) stelden, op basis van de zeer gelijkende correlatie tussen de expressie van de transporter en de interne fos­forstatus (figuur 2.14), dat transcriptionele regulatie aan de basis lag van het waargenomen verband tussen de opnamesnelheid en deze interne fosforstatus.

2.4.3.6 Andere mechanismen en signaaitransductie

4.0

3.5 (I) f'i2=0.85 (a) 0' '" ~ 3_0

0::

~ * 2.5

~ <IJ 2.0 a: 2 1 5 c. .

::> 1.0

0.5

7.0

b: ~ 6.0

'" c 5.0 ~.~ 4.0

"* ~ 3.0 a: x '" 2.0

1.0

0.0

+ f'i2=0.93 (b)

0.00 0.05 0.10 0.15 0.200.250.30

Pi concentration in roots (~g mg" fw)

Figuur 2.14 Afname van de opnamesnel­heid en de relatieve transporlerexpressie (APT1 en APT2) met toenemende interne fosforstatus bij Arabidopsis thaliana. Uit Dong et a/., 1999.

Bij Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) komen er, naast analogen van sommige van de hier­boven beschreven processen, ook protei"ne-protei"ne interacties voor in de regulatie van de Pi opname (tussen de transporter (Ph084) en Pho86, ook een membraanprotei"ne) (Bun-ya et aI., 1996). Er werd reeds gesuggereerd dat protei"ne-protei"ne regulatie van de Pi opname ook bij planten voorkomt (Raghothama, 1999).

De mechanismen die fosforstress in verband brengen met de respons zijn voorlopig slecht gekend. Hoewel er nooit rechtstreeks bewijs voor is geleverd, zijn er aanwijzingen dat ethyleen een rol zou kunnen spelen in de fosfaatuithongeringsrespons (Liu et al., 1998 en referenties daarin). Een signaal­functie van suikerfosfaten mag zeker niet worden uitgesloten (Liu et al., 1998).

12

2.4.3. 7 Samenvatting

Uit de gepubliceerde studies kan men afleiden dat in de meeste gevallen de capaciteit van de fosfaatopname gereguleerd wordt door transcriptionele controle over het totaal aantal transporters. Allosterische regulatie is waarschijnlijk, maar wordt sinds de ontdekking van de genetische mecha­nismen als ondergeschikt beschouwd.

Mogelijk zijn meerdere systemen werkzaam. Zo is het bijvoorbeeld denkbaar dat bij fosforstress de externe fosfaatconcentratie van primair belang is in de bepaling van de opnamesnelheid, terwijl dit bij niet fosforgelimiteerde omstandigheden de interne concentratie is.

Aangezien in de natuur de fosfaatconcentratie meestal zeer laag is, zal zeer waarschijnlijk de expressie van de genen voor en de hoeveelheid Pi transporters hoog zijn. In de natuur kan tijdelijke verhoogde fosforstress overwonnen worden zonder sterk effect op de groei, door herverdeling van fos­faat in de plant. Onder natuurlijke omstandigheden wordt bovendien de groeisnelheid aangepast aan de nutrientenbeschikbaarheid.

2.4.4 FOSFAATHOMEOSTASE

2.4.4.1 Inleiding

Pi is een zeer belangrijk metaboliet van het suikermetabolisme, is een belangrijk structuur­onderdeel van nucle'inezuren en fosfolipiden en speelt een cruciale rol in de energiehuishouding en de enzym- en transcriptiecontrole. Het is dan ook van groot belang dat de cytoplasmatische concentratie strikt gereguleerd is. Er bestaat dan ook, net zoals voor een aantal andere belangrijke ionen, een fosfaathomeostase in de cel: de interne concentratie (cytoplasma) wordt nagenoeg constant gehouden (grootteorde mM) terwijl de externe concentraties sterk variabel zijn (grootteorde 11M).

In hogere planten fungeren cytoplasma en vacuole als gescheiden Pi bevattende compartimenten. Overschot aan Pi wordt opgeslagen in de vacuole en bij fosfordeficientie doet de vacuole dienst als Pi­bron. Lagere planten leggen een fosforreserve aan onder vorm van polyfosfaat, ze maken geen (of weinig) gebruik van hun vacuole als fosforreserve. Mimura et al. (1998) namen bij Chara corallina waar dat de vacuole een belangrijke rol heeft als fosforreserve. Over andere mechanismen van fosfor­opslag bij Chara werd geen uitspraak gedaan.

Als men planten in fosforarme omstandigheden onderbrengt, zal de fosfaatconcentratie in de protoplast nagenoeg constant blijven door de fosforreserve van de vacuole aan te spreken. Pas nadat de vacuolaire pool uitgeput raakt, wordt ook een concentratieverlaging in het cytosol waargenomen.

13

2.4.4.2 De Tol van de vacuole

Mimura et al. (1990) onderzochten bij cellen van gerstbladeren (Hordeum vulgare L.) het trans­port van fosfaat over de verschillende membranen en de consequenties hiervan voor de fosfaathomeo­stase van de eel. Ze kwamen tot het besluit dat de epidermis en de apoplast van gerstbladeren zeer weinig belang hebben voor de fosfaathomeostase van het blad. Het teveel aan Pi wordt opgenomen in de mesofy1cellen, waar het opgeslagen wordt in de vacuole. Deze accumulatie in de vacuole is ener­getisch gunstig dankzij het elektrisch potentiaalver­schil over de tonoplast (positief binnen de vacuole).

In Pi uitgehongerde cellen werd zeer snelle fosfaatopname waargenomen (figuur 2.14). De uit­gehongerde cellen hadden bovendien een veel hogere capaciteit om 32p op te slaan in hun vacuo len (figuur 2.15), niet enkel omdat de eel snel

Figuur 2.14 Opname van 32Pi door ge"lsoleerde protoplasten van gerst-mesofylcellen. Controle­planten (e) werden opgegroeid in aanwezigheid van Pi, de planten van de tweede conditie (0) wer­den opgegroeid in fosforloos medium. In de figuur is de afhankelijkheid van de Pi opname van de uit­wendige fosfaatconcentratie weergegeven. In de inzet zijn dezelfde gegevens uitgezet als Line­weaver-Burk plot. De fosfaat-uitgehongerde cellen namen uitgesproken beter fosfaat op, vooral bij lage uitwendige Pi concentraties. Uit Mimura et a/. (1990).

Pi opneemt en er dus meer Pi beschikbaar is om naar de vacuole te lei den, maar ook omdat het A TP­aangedreven fosfortransport van het cytosol naar de vacuole sterk wordt verhoogd (figuur 2.16). Bij fosfaatstress zal de vacuolaire reserve aangesproken worden om de cytoplasmatische fosfaathomeo­stase in stand te houden. Mimura et al. (1990) vonden echter dat de efflux van Pi uit de vacuole traag verloopt, zowel in aan- als afwezigheid van AIP. De regulatie van het uittreden van fosfaat uit de vacuole bij fosforstress is vooriopig onopgehelderd.

o 30 60 90 time (min)

Figuur 2.15 Transport van Pi naar de vacuole van ge"lsoleerde mesofylcellen van gerst-meso­fylcellen. e: controleplanten, op­gegroeid in Pi bevattend me­dium. 0: planten opgegroeid in fosforloos medium. Uit Mimura et a/. (1990).

14

.. -ATP +ATP

/ Vi 15 -!.;n 15 OJ

-0 OJ

::> -0 u ::> ttl u > ttl

> g10 '"'g 10

2 ~ ttl ~ .c

a. a.

5 ID r Y ~ 5 til 0 .c .c a. a.

-0 -0 ~/~ E E c:: c:: 0 0

0 10 20 0 10 20 a time (min) b time (min)

Figuur 2.16 Het tijdsverloop van de afhankelijkheid van de Pi op­name van ATP in vacuolen ge·isoleerd uit controleplanten (e) of Pi uitgehongerde planten (0). In (a) werd geen ATP toegevoegd aan het incubatiemedium van de vacuolen, in (b) werd 1 mmoW1 ATP toegevoegd. Uit Mimura et a/. (1990).

2.4.4.3 De rol van fosfaatefllux

Efflux van fosfaat uit de cel (over de plasmamembraan) werd reeds een aantal maal voorgesteld als regulerende factor van de cytoplasmatische fosfaatconcentratie (Cogliatti & Clarkson, 1983; Raghothama, 1999 en referenties daarin). Als fosfor niet de graeilimiterende factor is, is efflux uit het cytoplasma waarschijnlijk het voornaamste element in het behoud van de homeostase. In dat geval neemt men immers vaak waar dat verhoogde P-efflux de hogere P-influx, die resulteert uit de hogere externe Pi concentratie, compenseert. De efflux verhoogt aanzienlijk met toenemende exteme Pi con­centratie. Waarschijnlijk zijn anionenkanalen, die gereguleerd worden door pH en/ofmembraanpoten­tiaal, betrokken bij de efflux.

2.4.4.4 De situatie bij Chara

U it de experimenten van Mimura et al. (1998) kan worden besloten dat ook in Chara corallina de Pi concentratie van het cytoplasma constant wordt gehouden, en dit tenminste gedeeJtelijk door het gebruik van de vacuole als reservoir. PreYncubatie bij verschillende Pi regimes toonde aan dat, ten gevolge van fosforlimitatie, geleidelijk een reversibele verhoogde opnamecapaciteit tot stand komt (figuur 2.17.a). In de conditie waar Chara fosfaatuithongering onderging, yond men een daling van de vacuolaire Pi concentratie na 2 dagen terwijl een daling van de cytoplasmatische Pi concentratie pas na 6 dagen zichtbaar werd. Dit illustreert de verwachte stabiliserende invloed van de vacuolaire Pi reserve op de cytoplasmatische Pi concentratie.

In de zoektocht naar de contra Ie van de fosfaatopname werd, zoals reeds eerder aangehaald, de hypothese gesteld dat de vacuolaire fosforconcentratie een ral zou spelen (cf. 2.4.3.4). Figuur 2.17.b ontkracht deze hypothese enigszins. In het geval dat de vacuolaire fosforconcentratie een invloed zou hebben op de opnamesnelheid, zou men immers na de omschakeling van fosfaatbevattend naar fosfaatloos medium op dag 10 naast een stijging van de opnamecapaciteit ook een daling van de vacuolaire fosfaatconcentratie vinden. Deze laatste blijft echter afwezig. Bovendien zou bij de fosfaatIoze incubatie de vacuolaire Pi concentratie moeten dalen om de waargenomen stijgende opnamesnelheid te verklaren.

Het is belangrijk zich er van bewust te zijn dat fosfaathomeostase een relatiefbegrip is. Er zijn in sommige gevallen kleine maar duidelijke fluctuaties van de fosfaatconcentratie waar te nemen. Zo nam men bij Chara waar dat de cytosolische fosfaatconcentratie verandert afhankelijk van de licht­intensiteit. In het donker werden hogere fosfaatconcentraties gemeten. Zeer waarschijnlijk is de oorzaak voor deze fluctuatie een hoge graad van verestering van fosfor in het licht.

(a) 20.---------------------~

"f:' 16

'0 12

" -5 ~ 8 c: . 5 0: 1 , l' ~:>:b, ______ l ___ =-",,-~~- '

. r·----···=-f-·-~··-

6 10 12 !-I

Time (d)

(b) 20~------------------~

... 10 '" Q

= " .. >

o 2 6 8 10 12

time (d)

Figuur 2.17 Verloop van de fosfaatinflux (a) en de vacuolaire Pi concentratie (b) gedurende incubatie van inter­nodiumcellen van Chara corallina in fosforloos medium (-0-), medium met 0.1 mM Pi (---0---) en medium met 5 mM Pi ( .... A ... ) Na 10 dagen werd de conditie met 0 mM Pi getransfereerd naar 0.1 mM Pi en vice versa. Uit Mimura et a/., 1998.

15

2.5 DE INVLOED VAN pH EN NATRIUM OP DE FOSFAATOPNAME

2.5.1 DE INVLOED VAN DE pH VAN HET MEDIUM

De fosfaatopname wordt in veel gevallen bei"nvloed door de pH van het omliggende medium. Box (1986) onderzocht de pH-afhankelijkheid van de fosfaatopname in het rizoi"d van Chara hispida L. en nam hogere opnamesnelheden waar bij intermediaire pH-waarden (figuur 2.18.a).

Toen Leggewie et al. (1997) de genen die coderen voor StPTI en StPT2 (Solanum tuberosum Phosphate Transporter) tot expressie brachten in een fosfaatopname-deficiente giststam, von den ze een negatief verband tussen fosfaatopname van de getransformeerde gist en de pH van het omliggende medium (figuur 2.18.b). Dit patroon komt overeen met de verwachting voor een W /Pi transporter. Hierbij moet niet enkel het pH-optimum van het transporterprotei"ne in acht worden genomen, maar ook het feit dat fosfaat samen met protonen over de plasmamembraan wordt gezet. Leggewie et al. (1997) argumenteren dat vooral dit laatste bepalend is voor het waargenomen patroon.

Reid et al. (2000) onderzochten hoe de opname­snelheid van Chara corallina. Figuur 2.19 geeft hun bevindingen weer. De stippellijn geeft weer hoeveel van het Pi onder vorm van H2P04- aanwezig is. We kunnen dus tot de conc1usie komen dat, enkel op basis van de specificiteit van de transporter (er is immers geen, of slechts weinig, W cotransport bij Chara corallina), H2P04- vee I beter wordt opgeno­men dan HPol-.

Dunlop et al. (1997) vonden bij de zandraket (Arabidopsis thaliana) geen verband tussen fosfaat­opname en de pH van het opnamemedium.

(a) (b)

9 10

pH

pH

Figuur 2.19 De pH- en Na-afhankelijkheid van de 32Pi influx in ge'isoleerde internodiumcellen van Chara corallina . • : geen Na+-toediening; 0: 0.4 mM Na+ in het externe medium. De curve stelt de berekende concentratie H2P04 - voor, bij een totale fosfaatconcentratie van 10 iJM in het externe medium. Uit Reid et at. (2000).

;- 140 l c 'E 120 ~

2100~ ~ ~

~ ~ 80 ~ §-:g 60 ~ ii: ~

.§. 4(),

"0 20 ~

! .'-

4 4.5 5 55 6 6.5 7 7.5 8

pH

____ YStPT1 ________ YStPT2

Figuur 2.18 (a) pH-afhankelijkheid van de 32Pi-opname in het rizo"id van Chara hispida L. De experimenten wer­den uitgevoerd bij een initiele fosfaatconcentratie van 1 iJM ('" 30 iJgPII) en liepen gedurende vier uur. Naar gege­vens van tabel 2 uit Box (1986). (b) pH-afhankelijkheid van de 32Pi-opname in gist getransformeerd met StPT1 of StPT2. De opname werd gemeten bij 140 iJM ('" 4340 iJgPII) Pi. De gistcellen werden voor het opname­experiment gedurende vijf minuten gepre"incubeerd in glucose. Naar figuur 5 uit Leggewie et at. (1997).

16

2.5.2 DE INVLOED VAN NATRIUM

Bij Chara corallina werd waargenomen dat aanwezigheid van natrium in het medium de opname van fosfaat sterk stimuleert (figuren 2.8 en 2.19). Dit is te wijten aan het mechanisme van fosfaat­opname (Na+/Pi cotransport; Reid et al., 2000). Kalium is in staat de rol van natrium over te nemen in het transmembranair transport, maar de stimulatie door kalium is niet zo sterk dan die door natrium. Dit zou inhibitie van de fosfaatopname kunnen teweegbrengen in waters met lage Na+/K+ verhou­dingen.

Recent werd verder uitgediept hoe de natriumconcentratie van het medium de fosfaatopname beYnvloed. Natriumuithongering van intemodiumcellen van Chara corallina veroorzaakte een stimu­latie van de fosfaatopname (Tetsuro Mimura & Robert Reid, ongepubliceerde gegevens).

2.6 MACROFYTEN EN DE FOSFORHUISHOUDING VAN ONDIEPE MEREN

2.6.1 W ATERKOLOM EN SEDIMENT ALS FOSFORBRONNEN VOOR MACROFYTEN

2.6.1.1 INLEIDING

MacrofYten staan in contact met het sediment, waarin ze wortelen, en met de waterkolom, waarin ze hun bladeren uitspreiden. Dit brengt met zich mee dat zowel het sediment als de waterkolom in theorie als fosforbron kunnen fungeren (cf. 2.2). De relatieve bijdrage van beide compartimenten werd reeds zorgvuldig onderzocht, zowel in tamelijk artificiele laboratoriumexperimenten (o.a. Littlefield & Forsberg, 1965; Bristow & Whitcombe, 1971; Box, 1986) als in veldexperimenten (o.a. Carignan & Kalff, 1980; Rattray et al., 1991). Deze studies hebben uitgewezen dat zowel sediment als waterkolom een bijdrage hebben in de fosforvoorziening. In welke mate ze bijdragen is afhankelijk van de plant in kwestie en van de relatieve beschikbaarheid van fosfor in beide pools.

2.6.1.2 SEDIMENT OF W A TERKOLOM?

Lundegard (1966; uit Bristow & Whitcombe, 1971) stelt dat macrofYten zich voornamelijk voor­zien van fosfor door opname uit het sediment via de wortel. Sutcliffe (1962; uit Bristow & Whitcombe, 1971) besluit echter, op basis van de waarneming van ionenabsorptie door bladeren en op basis van de afwezigheid van goed gedifferentieerd geleidingsweefsel, dat fosfaat voornamelijk via de bladeren uit het water wordt opgenomen.

Dat fosfaat effectief opgenomen wordt door de wortels van macrofYten en ook verplaatst wordt in de plant, werd pas in 1970 aangetoond (McRoy & Barsdate, 1970; uit Bristow & Whitcombe, 1971). Er zijn een aantal argumenten om het belang van de wortel niet te onderschatten. Zo vormt de wortel een aanzienlijk deel van de biomassa van de plant, wat wijst op een hoge allocatie van C naar de wortel. Bovendien bezitten wortels van macrofyten vaak wortelharen en veroorzaakt worteldruk waterbeweging in aquatische vaatplanten.

17

Bristow & Whitcombe (1971) onderzochten bij een aantal waterplanten (aUemaal vaatplanten) de bijdrage van de wortelzone in de fosfaatopname. Ze brachten de plant hiertoe in een incubatieapparaat met twee compartimenten, zodat het bovenste en het onderste (bewortelde) deel elk in een apart compartiment zaten. De experimenten leverden duidelijk bewijs voor opname van 32p in het onderste compartiment (met de wortels). Er gebeurde echter ook opname door de bladeren. Deze was echter transient, terwijl de opname door de wortels langdurig van aard was.

Carignan & Kalff (1980) deden 'in situ' experimenten met een aantal vaatplanten om te achter­halen waar ze in de natuur hun fosfor vandaan halen. Macrofyten uit potten met 32p gemerkt sediment namen het overgrote dee I van hun fosfor op uit het sediment.

Rattray et al. (1991) deden 'in situ' experimenten in een eutroof en een oligotroof meer. Ze plaatsten in beide meren potten met eutroof en oligotroof sediment, afkomstig uit de twee meren in kwestie. In deze potten werden dan een aantal planten gebracht. Ze namen waar dat in het oligotroof meer de groei (biomassa en stengellengte) sterk gestimuleerd werd in de potten met het eutrofe sedi­ment (in vergelijking met het oligotrofe sediment). Dit komt overeen met de hypothese van McRoy & Barsdate (1970; uit Twilley et al., 1977) dat bij lagere nutrientengehaltes het sediment toeneemt in belang voor de nutrientvoorziening. Er werd verder waargenomen dat de planten in het eutroof meer vee I meer fosfor bevatten dan de planten van dezelfde conditie in het oligotroof meer. Dit bevestigt opnieuw bovenstaande hypothese: bij hoge nutrientbeschikbaarheid in het water, neemt het relatief belang van deze pool toe.

2.6.1.3 DE FOSFORBRONNEN VAN CHARACEAE

Characeae zijn vastgehecht aan hun substraat met een rizoYd. Aangezien ze voorkomen in waters met weinig fosfor is het mogelijk dat het sediment een rol speelt in de fosforvoorziening. Bij Chara werd de rol van dit rizoYd in de fosforopname reeds bestudeerd.

Littlefield & Forsberg (1965) toonden aan dat, bij fosforuitgehongerde jonge Chara globularis plantjes, ongeveer even veel 32Pi werd opgenomen door het rizoYd dan door de rest van de plant. Translocatie van Pi gebeurde zowel apipetaal als basipetaal.

Box (1986) onderzocht de kortetermijn Pi-opname van het Chara hispida rizoYd. Zijn resultaten tonen dat aan het rizoYd ongeveer 4.3% bijdraagt aan de totale Pi-opname van de plant, terwijl het rizoYd slechts 1.24% van de biomassa bedraagt. In afwezigheid van O2 viel de opnamesnelheid van het rizoYd echter sterk terug in vergelijking met de controleconditie (bij normale Ordruk).

2.6.1.4 INVLOEDEN VAN COMPARTIMENTATIE VAN HET BESCHIKBARE FOSFOR EN VAN

(AN)AEROBIE

De relatieve bijdrage van de wortel en de stengel aan de fosforopname is uiteraard afhankelijk van de relatieve beschikbaarheid van fosfor in het sediment en de waterkolom. Carignan en Kalff (1980) voerden daarom hun experimenten uit met varierende fosforconcentraties, zowel in het sediment als in het water (verschillende locaties in hetzelfde meer). In mesotrofe omstandigheden werd waargenomen dat nagenoeg al het opgenomen P afkomstig was van het sediment. In eutrofe omstandigheden ging het nog steeds om meer dan 90% en in het hypertrofe meer vonden ze dat 72% van het opgenomen fosfor afkomstig was uit het sediment.

18

2.6.2.2 INVLOED OP DE PI-CONCENTRA TIE VAN DE WA TERKOLOM

Dat macrofyten, en meer in het bijzonder charofyten, in laboratoriumexperimenten in staat zijn zeer snel grote hoeveelheden fosfaat te onttrekken aan de waterkolom werd aangetoond door Kufel & Ozimek (1994). Op deze manier zouden zij zelfs de grote nutrientenstroom die het Luknajno-meer te verwerken krijgt kunnen opvangen (cf. 2.6.3.3).

Ook het sediment speelt een belangrijke rol in de fosforvoorziening (cf. 2.6.1). Macrofyten kunnen dan ook een grote rol spelen in de nutrientcyclus van een ondiep meer. Ze zijn immers in staat fosfor uit het sediment in hun bovengrondse biomassa te brengen. Dit fosfor kan dan op twee verschillende manieren in de waterkolom terechtkomen.

Enerzijds werd bij verschillende so orten waargenomen dat secretie van nutrienten (ook fosfor) naar de waterkolom plaatsvindt (o.a. Twilley et ai., 1977; Carignan & Kalff, 1982). Dit proces kan echter slechts zwak bijdragen aan de fosforconcentratie in de waterkolom (o.a. Graneli & Solander, 1988). July AUQ Sept Oc t

Anderzijds kan deze biomassa-nutrientenpool zeer snel omgezet worden naar beschikbaar fosfor in de waterkolom door seizoenale sterfie van de macrofyten (Graneli & Solander, 1988; Barko et ai., 1991 en refe­renties daarin). Dit wordt aangetoond in een experiment van Landers (1982; uit Graneli & Solander, 1988). Na afsterven van de macrofyten, steeg het TP in de macro­fyt-conditie sterk in verhouding met die van de macro­fytloze conditie (figuur 2.20, bovenaan). Deze stijging van het fosforgehalte werd gevolgd door een snelle toe­name van de fYtoplanktondensiteit (gemeten als chloro­fyl a) (figuur 2.20, onderaan). In de conditie waar de macrofyten werden verwijderd, bleef het TP laag, net zoals in de vijver zelf (buiten de afgesloten delen) (figuur 2.20). Het proces van nutrientuitlekking na sterfie zal alleszins een veel aanzienlijker bijdrage leveren aan het TP van de waterkolom dan secretie.

De uitlekking van fosfor uit afstervende macrofyten is een fysisch proces. De snelheid is rechtevenredig met de initiele fosforconcentratie van het weefsel. Carpenter (1980) stelde een model op waarin de fosforvrijzetting uit senescente macrofYten wordt voorspeld aan de hand van de initiele fosforconcentratie, de tijd en nog twee bijkomende constanten. Gemiddeld wordt per dag 1 it 10% van de initiele fosforconcentratie vrijgegeven (Graneli & Solander, 1988 en referenties daarin). Het is voomamelijk anorganisch fosfaat dat vrijkomt. Bij initiele fosforconcentraties lager dan 0.1 % van het drooggewicht lekt geen of slechts zeer weinig fosfor uit (Carpenter & Adams, 1978; uit Graneli & Solander, 1988).

20

a. -l

~

120

060 I-

30

o,+---____ ~--~--~--~ __ ~

90

01

-l -l roo :I: a. o a: o -l :I: 30 U

o .. 0 10 120

July

Experiment Day

AUQ Sept

~:;:~:~;:;;;;::;:(~;;:jS: I I I \

I I I

I I I

I I I

I I

! i I

I I

.., .0 Experiment Day

PLANTS DENUDED

Oct

OPEN

Figuur 2.20 TP (boven) en chlorofyl a (on­der) in afgesloten stukken met Myriophyllum spicatum (plants), in afgesloten stukken waar de vegetatie werd verwijderd (denu­ded) en in niet-afgesloten stukken van de vijver (open). Naar Landers (1982), uit Gra­neli & Solander (1988).

Macrofyten zijn dus in staat de fosforcycIus van het meer te versnellen. Deze effecten zijn vooral in ondiepe meren uitgesproken. Hier vindt men immers vaak een grote hoeveelheden ondergedoken macrofyten met een hoge biomassa-turnover tijdens hun groeiseizoen, dat in vele gevallen overeen­komt met de peri ode van maximale productie van de planktongemeenschappen (Barko et aI., 1991 en referenties daarin). In oligotrofe ondiepe meren is de biomassa-turnover door macrofYten vaak laag. De nutrientencycIus wordt hierdoor aanzienlijk vertraagd.

Studies die de fosforconcentratie binnen macrofytbedden (zonder senescentie) vergeleken met die buiten de bedden, komen niet tot eenduidige resultaten (Graneli & Solander, 1988 en referenties daarin). Waarschijnlijk is het relatief belang van de verschiIIende factoren vooral afhankelijk van de macrofytsoorten. Deze bepalen immers in welke mate er partikelsedimentatie (met bijhorende mineralisatie en vrijzetting van nutrienten) zal optreden, hoeveel fosfor opgenomen (of vrijgegeven) wordt uit (aan) de waterkolom en of de zuurstofconcentratie en de pH aan het sedimentoppervlak al dan niet gunstig zijn voor fosforvrijzetting.

2.6.2.3 Conclusie

Samengevat kan men stellen dat macrofyten een erg tweeledig karakter hebben voor de fosfor­concentraties in de waterkolom en in het sediment. Enerzijds zorgen zij ervoor dat fosfor wordt vrij­gezet uit het sediment (door een heel gamma aan processen), en anderzijds zorgen zij ook voor her­aanvulling van de sedimentaire fosforpooi.

2.6.3 FOSFOR EN DE ECOLOGIE VAN CHARA

2.6.3.1 CHARA KOMT VOORAL VOOR OLIGOTROFE WATERS

Chara komt vooral voor in kalkrijk water met hoge pH (vaak hoger dan 8). Deze twee factoren hebben een sterk gemeenschappelijk effect op de nutrientensamenstelling van het water. Bij hoge pH­waarden en Ca2+ concentraties is het immers vee I waarschijnlijker dat een aantal belangrijke nutrienten (o.a. fosfor) neerslaan. Het valt dan ook op dat Chara vooral voorkomt bij lage fosforconcentraties. In natuurlijke vijvers van de gematigde streken waar de fosforconcentratie lager is dan 20 J.lgP/l (~ 0,65 J.lM) wordt de macrofytenflora vaak voIIedig door Chara gedomineerd (Forsberg, 1964).

Ook recentere studies tonen aan dat het voorkomen van Chara-soorten afhankelijk is van de fosforconcentratie. Zo heeft vegetatieonderzoek langs een eutroficatiegradient in de Everglades aangetoond dat Chara zeyTanika een relatief betrouwbare indicator voor lage Pi concentratie in het water is (Vaithiyanathan & Richardson, 1999). Toen Chiang et aT. (2000) in dezelfde Everglades nutrienten (N en P) toedienden leidde dit echter tot de vervanging van het 'Utricularia-perifYton complex' door een Chara-gedomineerde vegetatie.

21

2.6.3.2 FOSFAATINHIBITIE

Fosfor is vaak een limiterende factor voor plantengroei door de lage concentraties waarin het in regel voorkomt. In sommige gevallen kan echter ook een teveel aan fosfor de groei inhiberen. Zo wordt de groei van sommige eencellige wieren (o.a. Dinobryon divergens en Uroglena americana, beide chrysofyten) ge"inhibeerd door toenemende fosforconcentraties (Rodhe, 1948; uit Forsberg, 1964). In het geval van Dinobryon en Uroglena begint de groeirepressie vanaf ongeveer 5 flgP/I ~ 0,16 flM). Deze onderdrukking is dus realistisch in veel meren; het SRP in eutrofe waters overstijgt vele mal en deze concentratie.

Forsberg (1964) stelde vast dat het moeilijk is om Chara globularis Thuill. var. globularis te kweken in een aantal standaardgroeimedia. Na toevoeging van Ca2+ behaalde hij betere resultaten. Kraantjeswater (relatief hoge Ca2+ concentratie, lage Pi concentratie) leverde ook goede resultaten op. Toevoeging van fosfaat aan het kraantjeswater resulteerde in verminderde groei. Na toevoeging van 8 flgP/I (~ 0,26 flM) vie I de groei terug op 70% van die in de controle; toevoeging van 30 flgP/I (~ I flM) resulteerde in een volledige groeistop.

Verdere experimenten met welomschreven groeimedia toonden aan dat de groei van steriele thalli van Chara globularis inderdaad wordt ge"inhibeerd door stijgende fosforconcentratie en dat deze inhi­bitie verzwakt bij langere daglengtes en bij doorborreling van het medium. Op basis van de groei­reductie in deze experimenten en van de lage fosfaatconcentraties waarbij de soort van nature voor­komt, kwam Forsberg tot de conclusie dat Chara globularis fosforgevoeligheid vertoont.

Henricsson (1976; uit Blindow, 1988) herhaalde de experimenten van Forsberg en yond geen ver­schillen tussen de condities met fosfaattoediening en de controleconditie. Hij sloot ook uit dat het kation uit het toegediende fosfaatzout de groei-inhibitie in de experimenten van Forsberg veroorzaakte en suggereerde dan ook dat de afwezigheid van Chara in eutrofe waters niet kan worden verklaard door de fosfaatconcentratie maar eerder door competitie met andere primaire producenten. Blindow (1988) onderzocht de fosfortoxiciteit bij niet-steriele thallusfragmenten van Chara tomentosa en van Chara hispida. Ook hij yond geen verschillen tussen de groei in fosfaatrijk en fosfaatarm medium.

2.6.3.3 DE ROL V AN CHARA IN DE CONTROLE V AN DE FOSFORCYCLUS IN ONDIEPE MEREN

Kufel & Ozimek (1994) onderzochten de fosfaatopname door Chara aspera Deth. ex Willd. uit het Luknajno-meer in Polen. In dit meer is de macrofytenvegetatie gedomineerd door vier charofyten (Chara aculeolata Klitz., C. aspera Deth. ex Willd., C. contraria Klitz. en C. tomentosa L.) die er een dense vegetatiemat vormen. Hoewel het meer een aanzienlijke nutrienteninput kent is het slechts weinig geeutrofieerd (lage fosforconcentratie, weinig fytoplankton).

De resultaten van hun laboratoriumexperimenten tonen aan dat in aanwezigheid van C. aspera het toegevoegd fosfaat vee I sneller wordt gedepleteerd en dat de groei van de planten in het meer voor­namelijk door fosfor werd gelimiteerd. Het potentieel om snel grote hoeveelheden fosfor op te nemen stelt de planten in staat de jaarlijkse fosforinput efficient te compenseren. Op deze manier verhindert Chara de ontwikkeling van fytoplankton.

De resultaten van Kufel & Ozimek (1994) bieden verdere aanwijzingen voor de afwezigheid van fosfortoxiciteit bij Chara. Ze von den namelijk een positieve verband tussen de biomassatoename en de hoeveelheid toegediend fosfor, en weI tot bij de hoogste fosforconcentratie die ze toedienden (770 flgP r l ).

22

Chara is dus, dankzij snelle opname en grote opslagcapaciteit, in staat veel fosfor te immobili­sereno Naast deze immobilisatie door opname kan, in ca1ciumrijke waters, ook neerslag van ca1cium­fosfaat lei den tot reductie van de fosfaatconcentratie van de waterkolom (Blindow, 1992; en referen­ties daarin).

2.6.3.4 CONCLUSIE

Ongeacht de rol van de fosforconcentratie op de groei van Chara, is het onwaarschijnlijk dat aileen fosfortoxiciteit de afwezigheid van Chara in eutrofe meren kan verklaren. Het werd meermaals aangetoond dat in eutrofe meren de Secchi-diepte sterk afneemt ten gevolge van de hoge fYtoplank­tondensiteiten. Oeze lichtlimitatie zal waarschijnlijk een bijkomende rol spelen in de densiteitsafname van Characeae in eutrofierende vijvers.

2.6.4 FYTOPLANKTON EN DE FOSFORHUISHOUDING VAN ONDIEPE MEREN

Naast de macrofYten kan ook het fYtoplankton een belangrijke rol spelen in de fosforhuishouding van een ondiep water. Ten eerste kan bij het afsterven en de afbraak van algen in de zomer veel Pi vrijkomen in de waterkolom als de omstandigheden hiertoe geschikt zijn. Ten tweede kan er, bij hoge productiviteit van het fytoplankton, ijzergebonden fosfor uit het sediment vrijkomen in de waterkolom.

Hiertoe werden drie processen beschreven (Scheffer, 1998). Het eerste proces is de mortaliteits­gemedieerde anoxische fosfaatvrijzetting. De hoge productiviteit brengt een hoge mortaliteit met zich mee, zodat de omstandigheden aan het sedimentoppervlak anoxisch worden ten gevolge van de afbraak van het dood fytoplankton. De kans op anoxische fosfaatvrijzetting (ten gevolge van reductie van Fe3+ tot Fe2+) wordt hierdoor groter. Het tweede fosfaatvrijzettend proces is een gevolg van de hoge fotosynthetische activiteit. Dit verhoogt immers de pH in het water met aIs gevoIg dat de capaciteit van ijzer om fosfaat te binden daalt. Het derde proces komt op gang omdat de aIgenbloei vee 1 fosfaat vereist. Het fYtoplankton zal door zijn sterke groei nagenoeg al het S.R.P. in het water opgebruiken. Oit verhoogt de kans dat bij sedimentresuspensie partikelgebonden fosfaat zal vrijkomen in het water.

Deze fYtoplankton-gemedieerde fosforvrijzet­ting heeft een belangrijk effect op de interpretatie van het totaal-P (figuur 2.21). AIs het fYtoplankton hoge densiteiten bereikt, zodat fosfaat limiterend wordt in de waterkolom, zal bijkomend fosfaat uit het sediment worden vrijgezet en opgenomen in de biomassa. Ais de fYtoplanktondensiteit laag wordt gehouden, bijvoorbeeld door zooplanktonbegrazing, zal er relatief meer fosfor in het sediment blijven en zal het totaal-P van de waterkolom aanzienlijk lager ZIJn.

algen rtotaal-P

algen totaal-P-<

SRP SRP

sediment

sediment

Figuur 2.21 Het effect van de algenbiomassa op de TP concentratie van de waterkolom. De aan­wezigheid van grote hoeveelheden algen bevor­dert de vrijzetting van fosfor uit het sediment. Het vrijgekomen fosfor zal daarop zeer efficient in de fytoplanktonbiomassa worden vastgehouden. Het TP is dus, via dit proces, gecorreleerd met de fytoplanktonbiomassa. Naar Scheffer (1998).

23

2.7 BIOLOGISCHE STOICHIOMETRIE: EEN KORTE INLEIDING

2.7.1 INLEIDING

Recent werd, onder leiding van James Elser van de Arizona State University, een prestigieus IRC­EB onderzoeksproject (Integrated Research Challenges in Environmental Biology) opgestart. Dit kreeg als doel het belang van de ecologische stoichiometrie (de C:t~:p verhoudingen) uit te doeken te doen, van celbiologisch tot ecologisch niveau, in een breed spectrum aan habitattypes.

Biologische stoichiometrie is een breder begrip dan ecologische stoichiometrie. Het wordt omschreven als de studie van de balans van energie en verschillende chemische elementen in levende systemen. Bovendien streeft men in het bestuderen van de biologische stoichiometrie naar een begrijpen van de moleculaire achtergrond van de zich op ecosysteem uitende nutritionele en ener­getische vereisten.

In wat voigt wordt ingegaan op twee van de artikels die reeds resulteerden uit het onderzoeks­project en op een aantal andere artikels in verband met ecologische stoichiometrie (onder andere bij primaire producenten).

2.7.2 DE N:P VERHOUDING VAN DE VEGETATIE ALS INSTRUMENT VOOR HET

BEPALEN VAN DE HEERSENDE NUTRIENTLIMIT ATIE

Het is, zeker voor primaire producenten, van belang in te zien dat nutrientlimitatie een relatief begrip is. Sommige planten zullen in hun groei beperkt worden door een tekort aan een bepaald nutrient terwijl andere planten bij dezelfde concentratie van het betreffende nutrient geen stress onder­gaan (Koerselman & Meuleman, 1996 en referenties hierin). Oit geldt zowel op niveau van het individu als op niveau van de populatie. Het is voomamelijk deze niche-differentiatie die kan lei den tot hoge diversiteit in een vegetatie (Tilman, 1985; uit Koerselman & Meuleman, 1996).

Het nagaan van de aard van nutrientlimitatie in de natuur is een zeer arbeidsintensieve bezigheid. Hiertoe moeten experimenten opgezet worden waarbij de respons op toediening van elk individueel nutrient wordt nagegaan. Omwille van deze arbeidsintensiviteit is men op zoek gegaan naar altema­tieve methodes.

Men kan veronderstellen dat, bij lage fosforbeschikbaarheid en hoge stikstofbeschikbaarheid, de vegetatie meer N dan P zal opnemen. De N:P verhouding van het plantenmateriaal zal dus, ten gevolge van de overdadige opname van N, hoog zijn. Bij omgekeerde relatieve nutrientbeschikbaarheden kan men ook een omgekeerde N:P verhouding in het plantenmateriaal verwachten.

Koerselman & Meuleman (1996) hebben, uitgaande van bovenstaande redenering, de aard van nutrientlimitatie trachten in verband te brengen met de N:P verhouding van de vegetatie. Hiervoor gingen ze uit van de beschikbare literatuur over moerasvegetaties. Figuur 2.22 toont het resultaat van hun onderzoek. Voor N:P massaverhoudingen van de vegetatie kleiner dan 14 yond men telkens stikstoflimitatie of colimitatie tussen stikstof en kalium. Bij N:P massaverhoudingen groter dan 16 yond men dan weer fosforgelimiteerde vegetaties. Tussen beide in (14 < N:P < 16) werden vooma­melijk vegetaties onder colimitatie van N en P teruggevonden. Het betreft hier massaverhoudingen.

24

Men kan dus inderdaad tot het besluit komen dat de stikstof- en fosforgehaltes van planten voomamelijk door de beschikbaarheid hiervan wordt bepaald. Het wordt bovendien duidelijk uit het brede bereik dat beide nutrientconcentraties vertonen (figuur 2.22), dat er geen duidelijk verband bestaat tussen de nutrientinhoud van de plant en de aard van nutrientlimitatie. Koerselman & Meuleman (1996) stellen weI dat er mogelijk een limietwaarde be staat (1.1 mgP (g DWr1 ~ 0.035 mmolP (g DWrl) boven dewelke geen fosforlimitatie meer kan voorkomen.

Let weI dat het gebruik van de N:P verhouding als middel om de limitatie van de plantengroei te achter­hal en, slechts bruikbaar is als ofwel N ofwel P de groei­limiterende factor is. In de natuur komt echter zelden een andere vorm van nutrientlimitatie v~~r. De N:P zegt bovendien niets over de absolute nutr"ientbeschikbaarheid. Het doet enkel uitspraak over de relatieve beschik­baarheid van be ide.

4

3.5

'", 3 . ....

'" 2.5 .s ... c: oS c:: 1.5 0 <.l

ci.. 0.5

Figuur 2.22 Het verband tussen het stik­stof- en fosforgehalte van de vegetatie en de aard van nutrientlimitatie voor 40 Europese moerassen. Elk punt in de grafiek komt overeen met een fertilisatiestudie. De stip­pellijnen wijzen duiden de N:P massaver­houdingen 14 en 16 aan. Dit komt, op ato­maire schaal, neer op 31 en 35.4. 0: P­limitatie; .: N-limitatie; 0: colimitatie tussen N en P; ... : colimitatie tussen N en K. Uit Koerselman & Meuleman, 1996.

2.7.3 HET VERBAND TUSSEN C:N:P STOICHIOMETRIE EN GROEI

Autotrofen kennen een zeer uiteenlopende C:N:P samenstelling, zowel intra- als interspecifiek. Er is een duidelijke negatieve trend tussen het N- en P-gehalte van de plant en zijn biomassa. Deze trend gaat gepaard met hogere gemiddelde groeisnelheden bij de afnemende lichaamsgrootte. Wat vooral opvalt is dat, bij toenemende groeisnelheid, het P-gehalte sneller toeneemt dan het N-gehalte. Het komt er dus op neer dat kleine autotrofen (bv. eencellige algen) veellagere N:P gehalten hebben dan grotere autotrofen.

Bij autotrofen is de C:N:P verhouding niet zonder meer te vergelijken aangezien een gedeelte van de variatie in deze verhouding te verklaren is door reserveopslag van nutrienten in peri odes dat het aanbod de vraag overstijgt. Ze kunnen bovendien vlot hun groeisnelheid aanpassen aan de omstandig­heden (ongebalanceerde groei).

Elser et al. (2000a) vatten een aantal vuistregels voor de autotrofe C:N:P verhouding samen. De N:P verhouding van het plantenmateriaal zal steeds volgen in het spoor van het opgelegde N:P regime. Bovendien zal, bij een con stante toevoersnelheid van een nutrient X, de C:X verhouding afnemen als de lichtintensiteit en/of de partiele COrdruk stijgt. Als de groei gelimiteerd wordt door nutrient X zal, bij afnemende groeisnelheid, de C:X verhouding van de biomassa snel toenemen (Elser et ai., 2000a en referenties daarin).

Uiteraard heeft het nutrientgehalte van de primaire producenten consequenties voor de hogere trofische niveaus. Meercellige dieren vertonen immers (over het algemeen) gebalanceerde groei en moeten daarom een vaak hoger, maar vooral constant nutrientgehalte handhaven. Men heeft reeds duidelijke bewijzen dat herbivoren lijden aan fosforlimitatie bij opname van fosforarm voedsel (Urabe

25

et al., 1997; Elser et al., 2000c; beide uit Elser et ai., 2000a). Zulke stressomstandigheden kunnen gevolgen hebben voor de evolutie (Elser et al., 1996).

Bij sommige dieren kan echter de C:N:P verhouding varieren, bijvoorbeeld door opslag van hoogenergetische nutrientloze reservestoffen (o.a. vetten). De adaptatie die de meeste dieren vertonen om met voedsel om te gaan met een andere C:N:P stoichiometrie dan die van zichzelf, is selectieve excretie van het element dat in overvloed voorkomt. Verder zal de groei geremd worden als er een element in te lage hoeveelheid aanwezig is. Deze adaptaties staan dus in schril contrast met de luxe-opslag van het overvloedig aanwezig element, en het gebruik hiervan in peri odes van nutrientstress, zoals dat bij planten wordt waargenomen.

Voor dieren wordt, net zoals voor planten, verwacht dat de N:P verhouding toeneemt met omvang en groeisnelheid (figuur 2.23). Hier vindt men echter, bij grotere dieren, twee verschillende strategieen. Enerzijds zijn er de vertebraten, die bij toenemende grootte meer en meer gaan investeren in beenderen (P-rijk) en anderzijds zijn er de invertebraten, die bij toenemende grootte investeren in een stevig chitineskelet.

1000TI -------------, lo'll"

f 100

£! .. e ; 10

:z:

invenebrates

.' 1+-~~~~~~~-r-r~~--­-16 ·14 ·12 ·10 ·8 ·6 ·4 ·2 0 2 4 6 8

Log(Mass. g)

Figuur 2.23 De voorspelde variatie in de N:P ratio van heterotrofe organismen, in functie van hun lichaamsgrootte (massa). De stippeliijnen wijzen erop dat er waarschijnlijk grote ecologisch of evolutionair ontstane va­riatie aanwezig is. 8ij grote lichaamsomvang zijn twee trajecten mogelijk (zie tekst).

In de ecologie werd traditioneel energie gebruikt als maat om de trofische dynamiek te bestuderen, met veel succes trouwens. Rekening houdende met bovenstaande overwegingen, kan men zich echter de vraag stellen of opgenomen energie wei altijd de beste maatstaf is voor de toename in fitness van het consumerende trofisch niveau. Zeer waarschijnlijk is dit niet het geval en speelt ook de minerale voedselkwaliteit een grote roi.

2.7.4 DE CELBIOLOGISCHE BASIS VAN HET VERBAND TUSSEN C:N:P EN GROEI

Om na te gaan welke celbiologische processen belang kunnen hebben in de C:N:P stoichiometrie van een organisme is het nuttig te gaan kijken waar de nutrienten in de cel voorkomen. Figuur 2.24 (a en b) geeft een idee van de nutrientinhoud van enkele belangrijke molecules en van de organellen.

Van al de molecules die fosfor bevatten hebben de meeste ofwel een nagenoeg con stante hoeveel­heid in de cel, ofwel komen ze slechts in onbeduidende concentraties v~~r. Alleen de nucle'inezuren en de prote'ines vormen hierop een uitzondering. De rRNA concentratie van de cel varieert binnen brede grenzen.

Een heel aantal studies relateren variaties in groeisnelheid aan de allocatie naar fosforrijk rRNA (Elser et ai., 2000a en referenties daarin). Aangezien RNA voor ongeveer 10% uit fosfor bestaat, zijn verschillen in het RNA-P voldoende om de verschillen in N:P van het volledige organisme te

26

verklaren (Elser et ai., 2000a). Het komt er dus op neer dat een fosforrijke (lage N :P) habitus een noodzaak is voor snelle groei.

Merk op dat de processen die in dit punt behandeld zijn voor dieren werden gevonden. Planten spelen, zoals reeds eer­der aangehaald, anders om met nutrienten door hun ongebalan­ceerde groei.

(a) 25T5~O:-,~:----~p~n~os~pn~o~.,~g;~n;~n.~--~ • 15:1 7:1 •

20 .. Z 15 rOiein

?fi 10 !! ./ • chiti~

5 ::..-::.' phOSPhOlipidS· o ,.-.-

o 5

• • phosphocreatine

nucleic ATP. acids

10

%P 15 20

(b) 2 0 ~OO'" 50;1 .' ,uk.'yoUe .' : "biideria :5:"' • nbOSO:!~" /.

15 :~mma.· Chromosome.......... / :': • E:~' • nucleus .......... pr~karyotic

~ 1: (\.~~~~; •••. 7;' "bosom.

: .' mitochondrion .... ...... .. .. _ ... 1.1 ....... ----

o -:''' -----.-... o 2 3 4 5 6

%P

Figuur 2.24 Stoichiometrisch diagram ter iIIustratie van de stikstof- en fosforsamenstelling van (a) nutrientbevattende biomolecules en (b) or­ganellen. De percentages stikstof en fosfor zijn massapercentages. De stippellijnen situeren de ligging van een aantal N:P waarden. Let op de verschillende schalen. Uit Elser et al., 1996.

2.7.5 VERGELIJKING VAN TERRESTRISCHE EN ZOETWATER-ECOSYSTEMEN

Terrestrische voedselketens kennen meestal een zeer nutrientenarme basis. De autotrofen hebben er een veel hogere C:N en C:P dan in zoetwaterecosystemen (figuur 2.25.a). Desondanks dat is, voor beide habitattypes, de N:P verhouding van de primaire producenten nagenoeg constant (figuur 2.25.a).

(a) 60 Oterrestrial • freshwater (b)40 o terrestrial • freshwater (e) 25 • 50 mean: 36 10.2 mean: 6.5 6.3 • '" median: 32 9.6 median: 6.4 6.0

~ 20 ,: c s.d.: 23 3.0 '" s.d.: 1.' 1.3 0 40 c 30 • .~ C.V.: 0.64 0.29 .Q C.V.: 0.29 0.21 '" ~ n; 406 267 i

no 124 38 c;, ,.: . ~

30 20 '0 '5 • •• .D

~ - -0 20 .D • • ~ . 0 10

'* 10 () 10 '* W

Cl Cl 5 Mean v

~~~ .. BiomassC:N Biomass C:N Pieris rapae 10% a

so o terrestrial • freshwater 0 10 20 30 40 o terrestrial • freshwater 40 mean: 968 307 mean: 116 124 Biomass CoN in food

'" 40 median: 799 256

median: 73.2 114 c :£ s.d.: 72.4 48 60 .!2 s.d.: 73' 2'2 .2

30 C.V.: 0.62 0.38 -. Daphnia magna

<0 30 C.V.: 0.75 0.69 <0 n; 27 40 ~ n: 413 273

~ ~ 50 •

~ 20 .D 20 .D e 0 0 Cl 40 ;f. '0 '*

10 '0 • ~

30 • ~ '" :il :e ~ '" ~ '" ~ '" 0 '" 8 ()

N N N '" N 20 N N ~ W • Biomass C:P Cl Biomass C:P Cl

'0 Mean o terrestrial • freshwater '0% . 90% 40

mean: 26.4 22.3 0 median: 22.6 18.5 0 200 400 600 800 1.000

:£ '" 30 s.d.: '0,1 10.5 c C.v.: 0.38 0.47 Biomass CoP in food .2 .2

<0 1 <0 n; 22 37

~ ~ 20

.D 1 .D 0 0

10

'* '* '" '" ~ :2 ~ gJ ?l ~ 0 ~ :il :ll ~ v ~

Biomass N:P Biomass N:P

Figuur 2.25 (a) Frequentiehistogrammen van C:N:P stoichiometrie in autotrofen, in terrestrische en zoetwater­ecosystemen (vnl. fytoplankton voor de zoetwater-ecosystemen); (b) Frequentiehistogrammen van C:N:P stoichiometrie in invertebrate herbivoren (vnl. zooplankton voor de zoetwater-ecosystemen); (c) Afname van de bruto groei-efficientie (GGEc) met toenemende C:N in het voedsel, voor typische terrestrische en zoetwater­grazers. Uit Elser et al., 2000b.

27

De traditionele visie dat N de groeilimiterende factor bij uitstek is in terrestrische ecosystemen en P in aquatische, komt hierdoor eventueel op de helling te staan. Het is echter ook mogelijk dat de optimumwaarde voor N:P verschilt in aquatische versus terrestrische ecosystem en en dat dus, ondanks gelijkende N:P verhoudingen in de vegetatie, toch P overwegend de groei limiteerd in het water en N op land. Deze laatste hypothese wordt echter niet ondersteund door de studie van Verhoeven et al. (1996; uit Elser et al., 2000b).

De autotrofen mogen dan grote verschillen in C:N:P verhouding vertonen tussen terrestrische en aquatische systemen, hun grazers hebben een zeer gelijkende C:N:P stoichiometrie (figuur 2.25.b). Aan de lage voedselkwaliteit (hoge C:nutrienten) wordt, zoals reeds eerder aangehaald, verholpen door selectief C te excreteren en door, indien nodig, de groeisnelheid te verlagen (figuur 2.25.c).

2.7.6 CONCLUSIE

De ecologische stoichiometrie blijkt een nuttig instrument bij de interpretatie van ecosystemen. De N:P verhouding blijkt, onder strikte voorwaarden, een goede maat om de aard van nutrientlimitatie na te gaan. De variabiliteit in de ecologische stoichiometrie is vaak te wijten aan verschillen in groei­snelheid. Bij planten speelt echter nog een ander, en waarschijnlijk belangrijker element: de ongebalanceerde groei. Dit laatste maakt dat bij planten zeer omzichtig moet worden omgesprongen met interpretaties vanuit de ecologische stoichiometrie.

2.8 INTERACTIES TUSSEN FYTOPLANKTON, PERIFYTON EN MACROFYTEN

In een aquatisch ecosysteem zijn er drie verschillende habitats die door fototrofen bezet kunnen worden: het open water, het sedimentoppervlak en het wateroppervlak. In diepe meren is de opper­vlakte aan belicht sediment zeer klein en zal de primaire productie nagenoeg volledig door fytoplank­ton worden gedomineerd. In ondiepere systemen kunnen echter macrofyten een aanzienlijk deel van de primaire productie voor hun rekening nemen.

2.8.1 NUTRIENT EN

De nutrientenbeschikbaarheid is over het algemeen veel lager in de waterkolom dan in het sedi­ment. Macrofyten zijn vaak in staat om, naast de waterkolom, ook het sediment aan te spreken als nutrientenbron (cf. 2.6.1.2). Fytoplankton en epifyten zijn daarentegen volledig aangewezen op de waterkolom voor hun nutrientenvoorziening, hoewel fytoplankton dus wei in staat is fosfor vrij te zetten uit het sediment (cf. 2.6.4).

De stikstof- en fosforbehoefte van macrofyten is aanzienlijk lager dan die van veel fytoplankton­soorten. Sand-Jensen & Borum (1991) trachten dit te verklaren steunend op drie verschillen tussen beide. Ten eerste hebben macrofyten hoge inwendige C:P en dito C:N verhoudingen. Voor mariene macrofyten werden gemiddelde C:N:P verhoudingen van 550:30: 1 gevonden, terwijl fytoplankton aanzienlijk meer stikstof en fosfor bevat (C:N:P gemiddeld 106: 16: 1) (Sand-Jensen & Borum, 1991 en referenties daarin). Ten tweede groeit fytoplankton sneller, wat op zich meer nutrienten kost. Deze

28

twee verschillen zijn gedeeltelijk samenhangend (cf. 2.7). Een derde verschil dat kan instaan voor de verschillende nutrientenbehoeften is de efficiente bewaring en herverdeling van de aanwezige nutrienten die bij macrofyten wordt waargenomen. Dat macrofyten minder nutrienten nodig hebben dan fytoplankton komt dus goed overeen met hun ecologische verspreiding. Terwijl fytoplankton vaak domineert in eutrofe waters zijn het vaak macrofyten die overheersen in oligotrofe waters (zowel in zoetwater-, brakwater- en mariene omgevingen).

Epifyten zijn voornamelijk afhankelijk van het water voor hun nutrientenbiomassa. Aangezien zij voorkomen op macrofyten, die vaak in oligotrofe system en voorkomen, is hun groei zeer vaak n utri entge 1 im iteerd.

Een aantal studies tonen echter aan dat de macrofyten spontaan nutrienten, die opgenomen werden uit het sediment, afstaan aan de waterkolom (Twilley et ai., 1977; en referenties daarin).

Hoewel in de natuur waarschijnlijk minder nutrienten worden afgestaan dan in de artificiele experimenten van Twilley et al. (1977), mag zeker niet uitgesloten worden dat epifyten een gedeelte van hun nutrientenvoorziening aan hun gastheer te danken hebben. Carignan & Kalff (1982) toonden aan dat epifyten op Myriophyllum spicatum L. een kleine fractie (3.4 Ii 9%) van hun fosfor te danken hebben aan hun gastheer. Bij extreem lage fosforbeschikbaarheid kan dit oplopen tot 60% (Moeller et ai., 1988; uit Sand-Jensen & Borum, 1991).

2.8.2 KOOLSTOF EN ZUURSTOF

Door fotosynthese zal in dense fototrofe gemeenschappen de pH en de Oz-beschikbaarheid stijgen, terwijl het DIC afneemt in concentratie. Dit zou kunnen leiden tot verminderde COz-fixatie en verhoogde fotorespiratie. Vooral macrofyten zullen hieronder lijden, aangezien in dense macrofyt­bedden diffusie de belangrijkste factor is voor de Or en de COz-voorziening, waar deze in open water (voor fytoplankton) voornamelijk door waterbewegingen worden gecontroleerd (Sand-Jensen & Borum, 1991).

2.8.3 LICHT

Licht is waarschijnlijk de belangrijkste factor in de bepaling van de samenstelling van fototrofe gemeenschappen. Hoewel het fytoplankton blootstaat aan zeer variabele lichtcondities (verandert voortdurend van positie in de waterkolom) is het sterk bevoordeeld wat betreft de competitie voor licht. Het is immers in suspensie in de bovenste lagen van de waterkolom en heeft alsdusdanig (als gemeenschap) de volledige lichtintensiteit ter beschikking.

Ondergedoken macrofyten en hun epifyten ontvangen relatief minder licht dan het fytoplankton, maar de intensiteit is, op korte termijn althans, nagenoeg constant. De minimale Iichtbehoefte van macrofyten wordt 10 maal hoger geschat dan die van fytoplankton (Sand-Jensen & Borum, 1991) en licht is dan ook de meest waarschijnlijke groeilimiterende factor voor macrofyten.

Naast de beschaduwing door fytoplankton en de zelfbeschaduwing waarmee ondergedoken macrofyten geconfronteerd worden, kunnen ook epifyten hun gastheer aanzienlijk beschaduwen. Er werd reeds aangetoond dat de absorptie in de epifytenfilm soms belangrijker is dan de absorptie in de volledige bovenliggende waterkolom. Als bij eutroficatie de nutrientlimitatie op de groei van de

29

epifyten wegvalt, kan de proliferatie van de epifytenmat aanzienlijk bijdragen tot het uiteindelijke afsterven van de macrofytvegetatie (Phillips et al., 1978; Sand-Jensen & Borum, 1991).

Van Vierssen & Prins (1985) trekken het belang van beschaduwing door epifyten echter in vraag. Ze namen waar dat voomamelijk oudere delen van de macrofyt gekoloniseerd werden, terwijl de jongste delen van de plant voor het meerendeel van de productie instaan. Ze suggereren dat het voor­komen van de epifyten op oudere delen van de macrofyt vooral toe te schrijven is aan verhoogde nutrientenvrijzetting door oudere weefsels.

Sand-J ensen & Borum (1991) berekenden dat de maximale kolonisatiediepte van macrofyten veel sterker door het lichtopslorpend effect van de waterkolom dan door de lichtabsorptie van het epifyton wordt bepaald.

2.8.4 CHEMISCHE OORLOGSVOERING

Het onderzoek naar allelopathische interacties in aquatische milieus staat nog in zijn kinder­schoenen. Er werden reeds een aantal organische stoffen geYsoleerd uit macro:tytweefsels, die de groei van fytoplankton significant onderdrukken bij lage concentratie (o.a. Wium-Andersen et ai., 1982; Kleiven, 1991). Dat dergelijke bioactieve stoffen uit plantenmateriaal geYsoleerd kunnen worden, wi! echter nog niet zeggen dat ze ook effectief worden uitgescheiden in voldoende concentratie om fytoplankton- en epifytongroei te inhiberen.

Tot op heden is er in situ nooit allelopathie door macrofyten op fytoplankton aangetoond. Het bestaan ervan wordt dan ook vaak in vraag gesteld (o.a. Forsberg et al., 1990). Hoewel er geen dus geen sluitend experimenteel bewijs voor bestaat is het best mogelijk dat allelopathie voorkomt. De lichtlimitatie ten gevolge van fytoplankton- en epifytongroei kan immers bij macrofyten resulteren in een sterke selectie voor dit kenmerk.

Epifyten zullen waarschijnlijk de eerste slachtoffers zijn van allelopathie, aangezien zij in direct contact staan met de plant. Effecten op fytoplankton liggen moeilijker aangezien de afgescheiden stoff en erg worden verdund in de waterkolom vooraleer ze deze gemeenschap bereiken. In ondiepe waters is de waarschijnlijkheid dat ook fytoplankton in aanzienlijke mate blootgesteld wordt aan vrij­gezette allelopathische stoffen dan ook groter dan in diepe systemen.

Ook andersom kunnen allelopathische effecten aanwezig zijn. Zo to on den Van Vierssen & Prins (1985) aan dat ook fytoplankton in staat is bioactieve stoffen aan te maken die de netto zuurstof­productie van de macrofyt Zanichellia peltata Berto!. reduceren.

2.9 BEKNOPTE UITDIEPING VAN DE ECOLOGIE VAN ONDIEPE WATERS

2.9.1 EUTROFIERING

De heldere meren en vijvers met overweldigende groei van waterplanten en grote hoeveelheden zooplankton, zoals die een aantal decennia geleden nog voorkwamen zijn nu zeer zeldzaam geworden in bewoonde gebieden. De meeste van deze vijvers zijn tegenwoordig troebe!. De meest algemene

30

oorzaken voor deze verandering zijn de overrnatige influx van afvalwater afkomstig van steden en industrie, en van het regenwater dat afvloeit van de met meststoffen verzadigde landbouwgronden.

Deze overmatige influx van nutrienten (eutrofiering) veroorzaakt in het meer een hoge densiteit aan f)rtop I ankton , dat ervoor zorgt dat licht niet kan doordringen tot de bodem. De waterplanten verdwijnen dan ook sne!. Het enige wat overblijft in zulke meren is fYtoplankton, een laagdiverse benthifauna en benthivore vis.

Aangezien fosfor traditioneel aanzien wordt als de limiterende groeifactor in zoetwatereco­systemen, wordt over het algemeen de fosforconcentratie (vooral TP) gebruikt om de graad van eutroficatie aan te duiden (o.a. Jeppesen et al., 2000).

Vijvers met lage nutrientgehaltes vertonen meestal een heldere toestand terwijl deze met hoge nutrientgehaltes over het algemeen troebel zijn. Nu blijkt dat interrnediaire nutrientgehaltes meestal niet overeenkomen met een intermediaire troebelheid, maar dat in de mesotrofe vijvers ofwel helder, ofwel troebel zijn. Hierop word verder ingegaan in punt 2.9.3; eerst wordt wat meer uitleg gegeven bij het voedselweb in ondiepe meren.

2.9.2 HET VOEDSELWEB IN ONDIEPE ZOETWATERECOSYSTEMEN

Aan de basis van de voedselketen vindt men de macrofYten, in het littoraal van de vijver, en het fYtoplankton, zowel in het littoraal als in de limnetische zone. Het f)rtoplankton wordt voornamelijk door zooplankton geconsumeerd. De carnivore vissen voeden zich met de benthivore en de planktivore vissen, die zich op hun beurt voeden met respectievelijk benthische en planktonische invertebraten. De benthifauna leeft van gesedimenteerd organisch materiaa!'

De graad van eutrofiering (gemeten als TP) heeft een duidelijke invloed op de relatieve abundantie van elk van de hoger besproken trofische groepen (figuur 2.26). Ook de verschillende taxonomisch-ecologische groepen die deel uitmaken van deze verschillende trofische niveau's vertonen andere abundanties afhankelijk van de fosforstatus van het water (figuur 2.27).

Figuur 2.26 De densiteit een planktivore vis, het percentage carnivore vis, de zooplankton:fytoplankton verhouding, de chlo­rofyl a concentratie, de Secchi-diepte en de maximale diepte tot waar macrofytengroei voorkomt, allen in functie van de TP-con­centratie van het water. De gegevens zijn afkomstig van een grootschalige screening van Deense meren. Uit Jeppesen et al., 2000. Hoge fosforconcentraties zijn duidelijk positief gecorreleerd met fytoplanktondensiteit (chlorofyl a) en planktivore vis (vnl. cypriniden). De densiteit aan carnivore vis neemt sterk af met toenemende TP. De Secchi-diepte en de zooplank­ton:fytoplankton verhouding nemen, grotendeels ten gevolge van de sterk stijgende fytoplanktondensiteit, af met toenemende fos­forconcentratie. De maximumdiepte tot waar macrofyten voor­komen is nauw gecorreleerd met de Secchidiepte en neemt dus af bij toenemende eutroficatie. Uit Jeppesen et al., 2000.

I

0-0.05 0.05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.4

Total phosphorus (mg t'l

31

(a) 1 .S E!Sl Rotifers fi !2J Cyclopoid copepods 3: CJ CaIanoid copepods o 1.0 ~ Small cladocerans C) _ Daphnia spp.

.5.

I Cii

<o.OS .05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.4 >0.4 Total phosphorus (mg P 1:')

(b) fi E .5. I:! as

.~

.c

'" as '" ::E

~ is ,.. .B ·c ;: 8

<0.05 .05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.4 >0.4

Total phosphorus (mg P t')

Figuur 2.27 De gemiddelde zomerbiomassa (boven) en percentage vertegenwoordiging (onder) van de verschillende zooplankton- (a) en fytoplanktongroepen (b). De biomassa zooplankton neemt toe met de fosfor­concentratie. Hoe hoger echter de fosforconcentratie, hoe minder abundant de grote cladoceren (Daphnia spp.) worden en hoe abundanter de kleine soorten (cycloporde copepoden en kleine cladoceren) worden. De biomassa fytoplankton neemt toe met de fosforconcentratie. Bij hogere fosforconcentratie worden relatief minder flaggelate soorten waargenomen (dinofyten en cyanofyten), terwijl de abundantie van de chlorofyten en de cyanofyten toeneemt. Uit Jeppesen et al. (2000).

2.9.3 ALTERNATIEVE EVENWICHTEN

Uit verschillende studies kan worden besloten dat de turbiditeit van meren in lineair verband staat met de fosforconcentratie (o.a. Jeppesen et at., 2000) (figuur 2.26). Het is nochtans zo dat over een breed bereik van nutrientconcentraties twee alternatieve toestanden kunnen voorkomen in ondiepe meren. De ene is een heldere toestand, gedomineerd door macrofyten; de tweede is een troebele toestand, waar vooral het fytoplankton het belangrijkste aandeel heeft in de primaire productie en vaak peri odes van massale bloei kent.

Elk van deze alternatieve toestanden stabiliseert zichzelf middels een aantal feedback mecha­nismen die zich vooral centreren rond de interactie tussen de ondergedoken vegetatie en de turbidite it (figuur 2.28). Ondergedoken planten kunnen maar groeien tot een bepaalde diepte, afhankelijk van de turbiditeit van het water (figuren 2.29 en 2.26). Het verdwijnen van planten bij toenemende eutroficatie gebeurt waarschijnlijk door lichtlimitatie (toene­mende beschaduwing door epifyten (o.a. Phillips et aI., 1978) en fytoplankton (o.a. Melzer et aI., 1977 (uit Blindow, 1988); Sand-Jensen & Borum, 1991). In het model van Scheffer wordt duidelijk de na­druk gelegd op het fytoplankton.

De aanwezigheid van de vegetatie heeft echter een verhelderend effect op het water door de resus­pensie van bodempartikels te verhinderen en door de groei van fytoplankton te inhiberen. Voor dit laatste zijn er twee mechanismen voorzien in het

32

Figuur 2.28 De belangrijkste feedback mecha­nismen waarvan gedacht wordt dat ze aan de basis liggen van de twee alternatieve evenwichtstoe­standen in ondiepe meren. Zowel de heldere als de troebele toestand versterken zichzelf. Naar Scheffer et al., 1993.

model: aIIelopathie en competitie voor nutrienten. Eens er zich een troebele toestand heeft gevestigd stabiliseert deze zichzelf door hoge fytoplankton­concentraties en een hoge sedimentresuspensie te handhaven (figuur 2.28). Deze idee is eenvoudig grafisch voor te steIIen (figuur 2.30.a). Merk op dat deze figuur op nogal onbehouwen veronderstel­lingen steunt. Zo zal bijvoorbeeld de vegetatie niet plots verdwijnen bij een kritische troebelheid. Meer realistische modellen leveren grafieken op als in figuur 2.30.b. Het model van alternatieve helder­heidstoestanden kan ook voorgesteld worden met behulp van het welbekende knikkermodel.

Toenemende eutroficatie van heldere waters met weelderige vegetatie leidt tot verkleining van de stabiliteit van de heldere toestand (langs de onderste curve steeds dichter bij de kritische helderheid - figuur 2.30). De kans dat een versto­ring (bvb. storm met vernietiging van de vegetatie) optreedt die groot genoeg is om het water naar troebele toe stand te brengen wordt dus alsmaar groter. Bij verdere eutroficatie van het water zal het zonder bijkomende stimulans overgaan naar de troebele toestand.

I (/) Q)

>. .c 0.. e al E "0

o 2 3 5 6 7 8 9

Secchi-depth (m)

. .. t ... .. .. '" ~j. .. ... .. ":'~~~~~~~;)~ .. ~.:;.~.:..:.-t~ .• : ... : .... , ......... .

o 100 200 300 _ 500 600 700 eoo 900 1000

Total phosphorus (J.1g P 1")

Figuur 2.29 Bovenaan het verband tussen de transparantie van het water (Secchi-diepte) en de onderlimiet van vegetatie in 27 Finse meren. Onderaan werd de Secchi-diepte van Deense me­ren uitgezet in functie van TP, voor meren met (e) en zonder (L) hoge bedekking door macrofyten. Uit Scheffer et a/. (1993).

Sinds een aantal decennia zijn een groot aantal meren door nutrientinflux van menselijke oorsprong gestabiliseerd in de troebele toestand. De grote soortenrijkdom die de heldere watertoestand karakteriseert is dan ook een grate stimulans geweest om methoden te zoeken die deze troebele toestand naar een heldere toestand omzetten. Het komt er hierbij op neer om, nadat het nutrientgehalte voldoende is verlaagd, de kritische schakel tussen turbiditeit en vegetatie tijdelijk te onderbreken zodat er zich opnieuw ondergedoken planten kunnen vestigen.

Dit kan door een tijdelijke verlaging van de waterstand (figuren 2.26 en 2.27 bovenaan) of door een zogenaamde biomanipulatie waarbij de planktivore vissen die de traebele toestand karakteriseren (vnl. cypriniden) worden weggevist. Dit zal dan via twee feedback mechanismen (figuur 2.26) leiden tot een verlaging van de turbi-diteit. Het mechanisme dat (a) (b)

speelt via de vraat van zoo­plankton op fytoplankton wordt het trofisch cascade effect genoemd.

Merk uiteindelijk nog op dat de kwantificatie van de verschiIIende feedback mecha­nismen uit figuur 2.26 moeilijk is en dat ze waarschijnlijk variabel zijn tussen meren.

CD

~ <II

. .... ,.' crilical -------- turbiditY"

Nutrients nutrients

Figuur 2.30 Alternatieve evenwichten in de turbiditeit, met aan- of af­wezigheid van vegetatie als bepalende factor van de toestand bij inter­mediaire nutrientconcentraties. (a) theoretisch model, (b) een realis­tischer vegetatie-algen model. Uit Scheffer et a/. (1993).

33

2.9.4 MACROFYTEN EN DE HELDERE TOESTAND

Macrofyten stabiliseren de heldere toestand van het water door algen te onderdrukken (nutrient­limitatie, allelopathie en verschaffen van schuilgelegenheid aan zooplankton) en door resuspensie te minimaliseren (cf. figuur 2.28).

Hoewel macrofyten een belangrijk potentieel tot compensatie van nutrienttoevoeging, zonder grote gevolgen voor het ecosysteem, bezitten (Balls et al., 1989; Kufel & Ozimek, 1994), stelt men bij eutrofiering van een zoetwatersysteem systematisch vast dat de macrofytenvegetatie wordt terug­gedrongen (o.a. van den Bergh et aI., 1998; Jeppesen et at., 2000). Het wordt algemeen aangenomen dat lichtlimitatie (ten gevolge van verhoogde hoeveelheden fytoplankton en epifyton) een dominante rol speelt in het verdwijnen van de macrofyten.

Vooral Charofyten blijken gevoelig voor eutro­fiering (Forsberg, 1964; Blindow, 1992a; en referen­ties in beide). Ze vertonen nochtans een lager licht­compensatiepunt dan angiospermen en komen in heldere meren tot op veel grotere diepte voor (figuur 2.31). Bij eutrofiering zal echter de helderheid van het water sterk terugvallen en in deze omstandig­heden is de kolonisatiediepte van angiosperme macrofyten groter dan die van charofyten (Blindow, 1992a) (figuur 2.31). Dit heeft waarschijnlijk te maken met een aantal morfologisch-rysiologische adaptaties die de angiospermen toelaten hun bladeren dichter bij het oppervlak te brengen.

2.9.5 BIOMANIPULATIE

20

:§ 15

r.

~ 10 '"0

" o :::; 5

2 6 8 10 Secchi depth (m)

Figuur 2.31 Schematische weergave van het verband tussen de Secchi-diepte en de maximale diepte tot waarop macrofyten voorkomen. Uit Blindow, 1992a.

Eutrofe waters zuIlen, door nutrientreductie aIleen, niet gemakkelijk in staat zijn om te slaan van de troebele naar de heldere toestand, hoewel beide toestanden kunnen voorkomen over een breed bereik van nutrientconcentraties. Dit is een gevolg van de stabilisatiemechanismen van de troebele toestand. Het bekomen van een heldere toestand met hoge biodiversiteit is echter een streefdoel van veel beheerswerkers.

Vit het model van Scheffer et al. (1993) kan worden afgeleid dat de aanwezigheid van vegetatie cruciaal is voor de instandhouding van de heldere toestand. De vegetatie staat vooral onder invloed van de intensiteit van zonne-instraling. Vit het model blijkt dat er twee mechanismen zijn die in staat zijn deze intensiteit te bevorderen, namelijk het artificieel verlagen van de waterdiepte en het verwijderen van de zooplanktivore vissen.

Het eerste mechanisme werkt rechtstreeks in op de stralingsintensiteit door de attenuatie door de waterkolom te verlagen. Het tweede mechanisme werkt via de trofische cascade. Als er minder zoo­planktivore vissen aanwezig zijn verlaagt de predatiedruk op het zooplankton en floreert deze gemeen­schap. Bijgevolg zal het fytoplankton sterk begraasd worden, met een verlaagde turbiditeit en dus een verhoogde intensiteit van zonne-instraling tot gevolg.

34

Biomanipulatie zorgt enkeI voor het tot stand komen van de heldere toestand; wiI deze persisteren moet hij verder gestabiliseerd worden. Het is hierin dat herkolonisatie van het water door onderge­doken vegetatie cruciaaI is. Characeae zijn in dit verband zeer interessant aangezien zij zeer sneIIe kolonisatoren zijn dankzij hun massale aanwezigheid onder vorm van sporen. Bovendien vormen de meeste Characeae dichte vegetatiematten (sterke sedimentatie van partikeIs) en zijn ze vaak gedurende het voIIedige jaar aanwezig. Van den Bergh et al. (1998) steIden voor om bij biomanipulatie in vijvers waar nooit tevoren Characeae hadden gestaan, propagules te introduceren.

35

MATERIAAL EN METHODEN

3.1 W ATERANALYSE EN SEIZOENALE OPVOLGING VAN DE FOSFAAT­

OPNAME

3.1.1 STAALNAMES

Tijdens het jaar 2000 werden elke maand (met uitzondering van juni) stalen genom en in vijver 19bis van natuurreservaat 'de Maten' in Genk. De temperatuur, de pH en de zuurstofconcentratie van het water werden ter plekke gemeten (zie 3.1.2.1). Er werd iedere keer een waterstaal en een bodem­staal (boorkem) genomen. Het waterstaal (ongeveer een liter) werd nabij het oppervlak van de vijver genomen. Het bodemstaal werd genomen met behulp van een PVC-buis en een plastic stop om deze buis afte sluiten.

De water- en bodemstalen werden bij aankomst in het laboratorium ingevroren voor latere ana­lyse. Er werden elke maand drie kwadraten van 0,25 m2 leeggeplukt om de aanwezige Chara­biomassa te bepalen. Er werd bovendien telkens voldoende van het wier geoogst om een fosfaatop­name-experiment uit te voeren in het laboratorium (zie 3.1.5). Het betreft Chara globularis ThuiIl. var. globularis (Breekbaar kransblad).

3.1.2 WATERANALYSE

De wateranalyse gebeurde in samenwerking met Olga Jongeneelen, Wouter Rommens en Pieter Vanormelingen. Er werden standaardmethoden gebruikt uit APHA, A WW A & WPCF (1985).

3.1.2.1 TEMPERATUUR, pH, OPGELOSTE ZUURSTOF EN CONDUCTIVITEIT

De temperatuur, de pH en de zuurstofconcentratie van het water werden tijdens de staalname gemeten. Voor de pH en de temperatuur werd hiertoe gebruik gemaakt van een elektronische pH­meter (HI 9025, Hanna instruments). De zuurstofconcentratie (D.O.) van het water werd bepaald met een elektronische zuurstofmeter (HI 9143, Hanna instruments) en werd uitgedrukt in percentage zuur­stofverzadiging. AIle andere abiotische waterkenmerken werden bepaald uitgaande van de waterstalen die na elke staalname ingevroren werden (zie 3.1.1). Vlak na de ontdooiing werd de conductiviteit gemeten met een elektronische conductiviteitsmeter (LF 340, WTW instruments). De conductiviteit werd uitgedrukt in /lS em-I.

3.1.2.2 CHLOROFYL

Het chlorofyIgehalte, dat in rechtstreeks verband staat met de fytoplanktondensiteit, werd bepaald door chlorofylextractie van het fytoplankton, dat na filtratie van het ontdooide waterstaal over een Millipore filter (1.2 /lm) achterbleef op het filter. De absorbanties bij 630, 645, 665 en 750 nm werden gemeten, na een donkerperiode van ongeveer 24 uur en hieruit werden de concentraties chlorofyI a, b en c berekend. De chlorofylconcentraties werden uitgedrukt in Ilg rl.

37

3.1.2.3 FOSFOR EN NITRAA T

Voor elk waterstaal werden SRP, orthofosfaatconcentratie (o-P) en totaalgehalte fosfor (TP) be­paald. Hiertoe werd de ascorbinezuunnethode van Murphey & Riley (1962) toegepast op ongeschud en ongefilterd waterstaal (aIle partikels naar de bodem gezonken) voor het SRP, afgefilterd waterstaal (Milipore 1.2 ~M) voor het o-P en opgeschud, ongefilterd, perchloorzuurverteerd staal voor het TP. AIle fosforconcentraties werden uitgedrukt in ~gP rl.

Nitraat werd bepaald met een geautomatiseerde methode (Technikon AutoAnalyzer II). Hierbij wordt het nitraat over een Cu/Cd kolom gereduceerd tot nitriet. Dit nitriet reageert met een kleur­reagens tot een paarse verbinding, waarvan de absorbantie bij 520 nm een maat is voor de nitriet­concentratie.

3.1.2.4 VRIJ CO2 EN TOT ALE ALKALINITEIT

Het vrij CO2 gehalte werd titrimetrisch bepaald. Het waterstaal werd getitreerd met NaOH zodat NaHC03 wordt gevonnd. De reactie is volledig bij de kleuromslag van fenolfthaleine (pH 8.3). Het gehalte vrij CO2 werd uitgedrukt in mg rl. Ook de totale alkaliniteit (een maat voor de buffercapaciteit van het water) werd titrimetrisch bepaald door, onmiddeIlijk na de bepaling van het vrij CO2 gehalte, het staal met HCI te titreren tot de kleuromslag van methyloranje. De gebruikte hoeveelheid HCl is een directe maat voor aIle aanwezige titreerbare basen (vn!. CO/-, HC03- en OW). De alkaliniteit werd uitgedrukt in me rl.

3.1.2.5 OPGELOSTE ORGANISCHE STOF

De opgeloste organische stof werd bepaald door in zwavelzuur, kaliumpennanganaat en natrium­oxalaat gekookt staal te titreren met kaliumpennanganaat. Het zwavelzuur werd toegevoegd bij het begin van de opwanning, kaliumpennanganaat bij het bereiken van het kookpunt en natriumoxalaat na tien minuten koken. Het gehalte opgeloste organische stof werd uitgedrukt in mg rl.

3.1.2.6 ANDERE ANION EN EN KA TIONEN

Het sulfaatgehalte werd bepaald met de geautomatiseerde methylthymolblauw-methode (Techni­con AutoAnalyzer III). Het SO/- reageert met bij lage pH met BaCh (slaat neer als BaS04). Het over­schot aan Ba2+ reageert na een pH-verhoging met methylthymolblauw tot een blauw chelaat. De hoe­veelheid overblijvend ongecheleerd methylthymolblauw (grijs) werd afgelezen en is een maat voor de initiele sulfaatconcentratie. De sulfaatconcentratie werd uitgedrukt in mg rl.

Het chloridegehalte werd bepaald door titratie van het staal met zilvemitraat, in aanwezigheid van kaliumchromaat als indicator (kleuromslag). Het zilverchloride slaat kwantitatief neer vooraleer het rode zilverchromaat wordt gevormd. De chlorideconcentratie werd uitgedrukt in mg rl.

Er werd uiteindelijk ook de concentratie van een aantal kationen (K+, Ca2+, Na+ en Mg2+) bepaald door de atomaire absorptie te meten. De concentraties werden uitgedrukt in mg rl.

38

3.1.3 BODEMANALYSE

De bodemstalen werden voorlopig niet onderzocht.

3.1.4 BEPALING VAN DE AANWEZIGE BIOMASSA EN DE KOOLSTOF-, FOSFOR- EN

STIKSTOFCONCENTRA TIE VAN HET GEOOGSTE PLANTENMA TERIAAL

Er werden elke maand drie willekeurig geplaatste kwadraten (0,25 m2) leeggeplukt om de aanwe­zige biomassa kranswieren te kwantificeren (zie 3.1.1). Bij aankomst in het laboratorium werden de geoogste wieren gespoeld om het merendeel van de onzuiverheden weg te halen en werden de stalen gedroogd bij ca. 95°C. Na volledige droging van de stalen werd hun drooggewicht genoteerd. De bio­massa werd uitgedrukt per oppervlakte-eenheid (g DW m-2).

De fosforconcentratie van het plantenmateriaal werd colorimetrisch bepaald (Murphey & Riley, 1962) na veras sing (5 uur bij 550°C) van het staal en zoutzuurdigestie van de as. De stikstofconcen­tratie werd bepaald volgens Kjeldahl (1883). De koolstofconcentratie werd berekend uit het verschil tussen het drooggewicht en het asvrij drooggewicht na 5 uur verassing bij 550°C. De fosfor-, koolstof­en stikstofconcentraties werden uitgedrukt in mmol (g DWrl.

3.1.5 METING VANDE FOSFAATOPNAME

3.1.5.1 PREINCUBA TIE

Tijdens elke staalname (zie 3.1.1) werd voldoende Chara meegebracht om een fosfaatopname­experiment uit te voeren. Het plantenmateriaal werd bij aankomst in het laboratorium grondig ge­spoeld met leidingwater om onzuiverheden en het grootste gedeelte van het epifyton te verwijderen. Daama werd het plantenmateriaal tot de volgende morgen gei"ncubeerd in A.P.W. (Artificial Pond Water), gebufferd met MES op pH 6,5 (bij benadering de pH die he erst in vijver 19bis - zie appendix 1 voor de samenstelling van het A.P.W.) en in een kweekkamer geplaatst (T = 18°C, 14 uur licht - 10 uur donker).

3.1.5.2 HET OPNAME-EXPERIMENT

De fosfaatopname van de thalli werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (ge­vuld met 80 ml medium). De fosfaatopname werd gemeten in een A.P.W. gebufferd op pH 6,5 met MES-buffer (appendix 1) bij fosforconcentraties 0, 100,200, 500, 1000,2000, 5000 en 10000 !lgP rl. Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevolgd door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode van Murphy & Riley (1962).

De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een rela­tief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden. Na afloop van het experiment (voldoende fosfaatdepletie) werden de gebruikte thalli gedroogd bij ca. 95°C gedurende ongeveer 3 dagen en werd het drooggewicht opgetekend.

39

3.1.5.3 VERWERKING VAN DE GEGEVENS VAN DE FOSFAATOPNAME-EXPERIMENTEN

De afnemende fosfaatconcentraties in het medium werden vermenigvuldigd met het cuvetvolume om de overblijvende hoeveelheid fosfor in de cuvet te bepalen en werden daarna gedeeld door de hoe­veelheid plantenmateriaal (g DW). De resulterende gegevens werden voor elke replica apart uitgezet tegenover de tijd en de opnamesnelheid (dit is het complement van de richtingscoeffici'ent van de regressierechte), die quasi constant bleek gedurende de relatief korte duur van de experimenten, werd aldus voor elke replica apart berekend. De initiele fosforconcentraties werden in deze regressies niet gebruikt om de hoge initiele opnamesnelheid door absorptie aan de celwanden niet in rekening te brengen.

Met de opnamesnelheden werden zowel Michaelis-Menten, Eadie-Hofstee als Hanes-Woolf plots gemaakt. Op basis van hyperbolische curve-fits door de datapunten uit de Michaelis-Menten plots (en­kel de datapunten uit het concentratiebereik tussen 0 en 2000 IlgP I-I werden gebruikt) werden de kinetische constanten Km en V max van de fosfaatopname bepaald. Voor de motivaties in verband met deze werkwijzen wordt verwezen naar de discussie (cf. 6.2).

Deze methode werd gebruikt voor aile fosfaatopname-experimenten die aan bod komen in deze scriptie, al werden soms geen Michaelis-Menten curve-fits gemaakt.

3.1.6 WATERKWALITEIT EN SEIZOENALE FOSFAATOPNAME: GEGEVENSVERWER­

KING

De gegevens van de wateranalyse en de fosfaatopname-experimenten werden, samen met de door Olga Jongeneelen verzamelde gegevens over de epifytenflora op de kranswiervegetatie, samenge­bracht in een gegevenstabel.

Vanaf de maand juli werden ook de stikstof- en fosforgehaltes van het plantenmateriaal gemeten. Van aile gegevens van de maanden juli tot december werd nog een extra tabel gemaakt. Tijdens de be­paling van het stikstofgehaite van het plantenmateriaal voor de maand juli is een fout gebeurd, waar­door dit gegeven niet bruikbaar was. In de gegevenstabel werd het stikstofgehaite van de maand augustus ook ingevuld voor de maandjuli.

Op de resulterende tabellen werden een aantal exploratieve principaaIcomponentanalysen (PCA) uitgevoerd. Verdere uitdieping van patronen gebeurde met Pearson en Spearman rank correlatie­analysen. Aile analyses gebeurde met STATISTICA 4.1 (StatSoft, Inc.).

3.2 DE INVLOED VAN NA + EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME

3.2.1 INLEIDING

Reid et al. (2000) vonden bij Chara corallina een sterke stimulatie van de fosfaatopname door Na+ (cf. 2.4.1.3), werden ook met Chara globularis een aantal experimenten uitgevoerd om een even­tuele gelijkaardige stimulatie te bevestigen of te ontkennen. In twee inleidende experimenten werd, naast de maandelijkse opnamemeting (cf. 3.1.5) een extra opnamemeting gedaan waarin fosfaat werd toegediend als NaH2P04 in plaats van K3P04. Er werd ook of er verschillen waren in opnamesnelheid

40

bij incubatie in verschillende Na+ concentraties (0, 1, 2, 3 en 5 mM). Dit experiment werd later her­haald om de invloed van een vijf dagen durende natriumuithongering van het plantenmateriaal na te gaan. Uiteindelijk werd nog een bijkomend experiment uitgevoerd met prelncubatie en opnamemeting bij verschillende Na+ en K+ concentraties.

3.2.2 INLEIDENDE EXPERIMENT EN

3.2.2.1 PLANTENMATERIAAL

De opname-experimenten uit deze inleidende experimenten verliep volledig parallel met de op­name-experimenten voor de seizoenale opvolging (maanden november en december). Het planten­materiaal heeft dan ook dezelfde oorsprong (cf. 3.1). De behandeling en prelncubatie van de planten gebeurde zoals beschreven in 3.1.5.1.

3.2.2.2 HET OPNAME-EXPERIMENT

De snelheid van fosfaatopname werd gemeten bij pH 6.5 en bij exteme fosfaatconcentraties 0, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 en 10000 flgP rl. In de eerste conditie werd fosfaat toegediend als K3P04 (cf. 3.1.5), in de tweede conditie als NaH2P04 . De opname werd gemeten zoals beschreven in 3.1.5.2.

3.2.2.3 VERWERKING VAN DE GEGEVENS

Op de bekomen resultaten werd, zowel voor de resultaten van november als december, tweewegs ANOV A uitgevoerd met conditie (fosfaattoediening als natrium- of als kaliumzout) en [Pi]medium als onafhankelijke variabelen en opnamesnelheid als afhankelijke variabele. Voor elke maand apart wer­den bovendien de bekomen kinetische parameters Km en V max vergeleken met behulp van een t-test.

3.2.3 INVLOED VAN DE NATRIUMCONCENTRATIE

3.2.3.1 PLANTENMATERIAAL

Het gebruikte plantenmateriaal voor beide stimulatie-experimenten was afkomstig uit vijver 19bis van natuurreservaat 'de Maten' te Genk. Het betreft Chara globularis Thuil. var. globularis (Breekbaar kransblad). De oogst van het plantenmateriaal gebeurde op 12 oktober 2000. De opname-experimenten gebeurden nadat het plantenmateriaal enkele weken de kans had gekregen zich aan te passen aan de laboratoriumomstandigheden.

41

3.2.3.2 HET OPNAME-EXPERIMENT

Er waren in beide experimenten vijfverschillende condities (0,1,2,3 en 5 mM Na+). Na+ werd toegevoegd als NaC\; KCI, CaCh en MES-buffer werden toegediend zoals in het standaard gebruikte APW-medium (appendix 1). De media werden op pH 6.5 gebracht met KOH. Voor elk van de condi­ties werd de fosfaatopname gemeten bij een initiele fosforconcentratie van 500 IlgP r 1, met 5 replica's per conditie. Fosfaat werd toegediend als K3P04 .

Voor het experiment zonder voorafgaande natriumuithongering werd het plantenmateriaal gedu­rende een nacht in standaard APW op pH 6.5 gepre'incubeerd. Voor het experiment met natriumuit­hongering werd het plantenmateriaal vijf dagen voor het opname-experiment in een natriumloos APW -medium gebracht. Het pre'incubatiemedium werd op de derde dag van de pre'incubatie vervan­gen.

3.2.3.3 GEGEVENSVERWERKING

Er werd een gepaarde t-test uitgevoerd op de opnamesnelheden te vergelijken tussen de condities met en zonder natriumuithongering.

3.2.4 STIMULATIE VAN DE FOSFAATOPNAME DOORNA+ EN K+

3.2.4.1 PLANTENMA TERIAAL

Het plantenmateriaal (Chara globularis Thuillier var. globularis - Breekbaar kransblad) die voor dit experiment gebruikt werd is afkomstig uit natuurreservaat 'de Maten' te Genk (vijver 19bis) en werd geoogst op 19 januari 2001. Het werd bij aankomst in het laboratorium gespoeld en ontdaan van onzuiverheden. Het plantenmateriaal kreeg de kans zich enkele weken aan te passen aan de laboratoriumomstandigheden (incubatie in standaard APW).

3.2.4.2 DE VERSCHILLENDE CONDITIES

Er werden experimenten gedaan bij verschillende Na+ en K+ concentraties. Er werd gekozen voor twee verschillende K+ (0.125 en 1.25 mM) concentraties en, hiermee in combinatie, 3 Na+ concentra­ties (0, 1 en 5 mM). De planten voor de condities 1 tot 6 werden vier dagen voor de aanvang van het opname-experiment gepre'incubeerd bij de omstandigheden van het opname-experiment, maar dan zonder fosfor. Voor de condities 7 tot 12 werden de p1anten even lang gepre'incubeerd, maar allemaal onder dezelfde Na+ en K+ regimes. Tabel A.3.2 in appendix 3 vat de condities samen. ABe incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg con stante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag­nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker.

3.2.4.3 HET OPNAME-EXPERIMENT

De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de condities werd de fosfaatopname van de planten gemeten bij een initiele fosforconcentratie van 775 IlgP rl. Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van

42

de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolyb­daatmethode (Murphy & Riley, 1962).

De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een rela­tief constante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden.

Voordat de planten in het opnamemedium werden geplaatst, werden ze gespoeld in gedesioni­seerd water.

3.2.4.4 METING VAN DE pH GEDURENDE HET OPNAME-EXPERIMENT

Gedurende het experiment werd een aantal maal de pH van het medium van elke replica gemeten (HI 9025, Hanna instruments).

3.2.4.5 VERWERKING V AN DE GEGEVENS

Er werd een volledige gegevensset samengesteld met voor elke replica de [Na+]medium, [K+]medium, gebruikte biomassa, preYncubatieregime, pH-stijging gedurende het opname-experiment en depletie­snelheid. Hierop werd een exploratieve factoranalyse (PCA) uitgevoerd.

Gebruik makende van dezelfde gegevensset werden eventuele globale effecten van enkele van de variabelen op de opnamesnelheid gezocht (eenwegs ANOVA). De gebruikte variabelen zijn [Na+]medium, [K+]medium en preYncubatieregime. Er werd ook tweewegs ANOVA uitgevoerd met [K+]medium en preYncubatieregime als onafhankelijke en opnamesnelheid als afhankelijke variabele. Er werd een Mann-Whitney U test uitgevoerd om de condities met toevoeging van 0 mM Na+ te vergelij­ken met die waar 1 mM Na+ werd toegevoegd.

3.3 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

In een poging de aard van het transmembranair transport te achterhalen (proton- of natrium­gemedieerd), werden een aantal opname-experimenten van zeer korte tijdsduur uitgevoerd. In de expe­rimenten was een zeer grote hoeveelheid biomassa aanwezig in het opnamemedium en was de initiele fosfaatconcentratie hoog, zodat eventuele veranderingen in natriumconcentratie of pH ten gevolge van fosfaatopname merkbaar zouden zijn.

3.3.1 HET PLANTENMA TERIAAL

Het plantenmateriaal (Chara globularis Thuill. var. globularis - Breekbaar kransblad) werd ge­oogst op 11 maart 2001 uit vijver 19bis van 'De Maten'. Het werd op de gebruikelijke manier gespoeld en ontdaan van onzuiverheden (cf. 3.1.5.1) en geYncubeerd in standaard APW gebufferd op pH 6 (zie appendix 1).

43

3.3.2 DE OPNAME-EXPERIMENTEN

De opname-experimenten gebeurden in zuurgewassen erlenmeyers (250 ml). Hierin was een klein compartiment afgescheiden van de grote, er boven liggende watermassa, door een geplastificeerd metaalgaas. Hierdoor kon het medium constant worden opgeschud met behulp van een magnetische roerstaaf, zonder schade toe te brengen aan het plantenmateriaal.

Wegens tijdsgebrek bleven deze experimenten in een erg verkennende fase. Er werden in totaal 6 experimenten uitgevoerd, waaronder enkele in gebufferd en enkele in ongebufferd medium, enkele bij 1 mM Na+ en enkele bij 0.4 mM Na+.

De planten werden in het opnamemedium gebracht voordat hier fosfaat aan toegevoegd werd. De menging van het medium werd op gang gebracht en het systeem werd toegelaten (gedurende ongeveer een uur) te stabiliseren.

Na stabilisatie van de pH werd een fosfaatoplossing (KH2P04) toegediend zodat de fosfaatcon­centratie van het opnamemedium 2000 ~gP rl bedroeg. Deze fosfaatoplossing werd op dezelfde pH gebracht dan de pH van het opnamemedium na stabilisatie, zodat de toevoeging geen invloed zou heb­ben op de pH. De fosfaatoplossing werd in het onderste compartiment van de erlenmeyer gebracht met behulp van een pasteurpipet. Dit verzekert een zeer snelle (minder dan een seconde) en efficiente menging (werd getest met een gekleurde vloeistof).

Op welbepaalde tijdstippen (tabel A.3.4 uit appendix 3) werd de pH van het opnamemedium af­gelezen en werd een gedeelte van het opnamemedium weggenomen voor analyse van de natrium- en de fosfaatconcentratie. De fosfaatconcentratie werd bepaald met de methode van Murphy & Riley (1962) en de natriumconcentratie werd bekomen door atomaire absorptiespectrometrie.

3.4 INVLOED VAN DE pH OP DE PI-OPNAME

3.4.1 INLEIDING

De pH-experimenten werden uitgevoerd met twee soorten: Chara globularis Thuil. var. globularis (Breekbaar kransblad) (in wat voigt kortweg Chara) en Nitellajlexilis (L.) Agardh (Buig­zaam glanswier) (in wat voigt kortweg Nitella). Voor Chara werd het pH-experiment tweemaal uitge­voerd, een eerste maal zonder langdurige preYncubatie bij de pH waarbij de opnamemeting zou gebeu­ren en een tweede maal waarbij wei zo'n preYncubatie voorafging aan het experiment. Voor Nitella kon, wegens een probleem met de cultuur ervan, enkel een experiment zonder voorafgaande preYncu­batie worden gedaan. De pH's waarbij de fosfaatopname werd gemeten zijn 5, 6, 7, 8 en 9.

3.4.2 HET PLANTENMA TERIAAL

De Chara gebruikt voor de experimenten is allemaal afkomstig uit natuurreservaat 'de Maten' te Genk (vijver 19bis). De Nitella is afkomstig uit een prive-vijver in Heestert (Zwevegem). Voor het experiment met Chara zonder langdurige preYncubatie (kortweg Czp) werd plantenmateriaal geoogst op 20 januari 2001. Het experiment werd uitgevoerd op 1 februari 2001. Voor het experiment met Chara met langdurige preYncubatie (kortweg Cmp) werd plantenmateriaal geoogst op 11 maart 2001 en het experiment werd uitgevoerd op 22 maart 2001 (na 11 dagen preYncubatie bij de verschillende

44

pH's). Nitella werd geoogst op 20 februari 2001 en het opname-experiment werd voltrokken op 22 februari 2001.

Het plantenmateriaal werd op de gebruikelijke manier gespoeld en ontdaan van afvalresten.

3.4.3 PREINCUBA TIEREGIMES

Voor de experimenten zonder langdurige prei"ncubatie bij de verschillende pH's werd het plan­tenmateriaal ongeveer 14 uur voor de aanvang van het opname-experiment gelncubeerd bij die pH waarbij ook de meting zou verlopen. De samenstelling van de verschillende APW-media, inclusief de gebruikte buffers, is te vinden in appendix 1.

Voor de experimenten met langdurige prelncubatie bij de verschillende pH's werden dezelfde media gedurende langere tijd (11 dagen voor Cmp) gebruikt. De media werden tijdens de prei"ncubatieperiode dagelijks op pH gebracht (indien nodig) en driedagelijks vervangen.

Aile incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg con stante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag-nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker.

3.4.4 FOSFAA TOPNAME-EXPERIMENTEN

De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de vijfprelncubatieregimes (pH 5,6, 7, 8 en 9) werd de fosfaatopname van de planten gemeten onder vier condities, namelijk bij een initiele fosforconcentratie van 0, 150, 500 en 2000 /lgPll (zie tabel A.3.3 in appendix 3 voor de exacte samenstellingen). Van elke conditie werden drie replica's voorzien.

De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962). De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een relatief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtinten­siteit (± 17300 lux) te behouden.

3.4.5 METING VAN DE pH GEDURENDE HET EXPERIMENT

Tijdens de incubatieperiode van het plantenmateriaal voor Crop werd de pH van het incubatieme­dium dagelijks opgemeten om de adaptatie van het plantenmateriaal na te gaan (HI 9025, Hanna instruments ).

Gedurende het opname-experiment werd een aantal maal de pH van het medium gemeten.

3.4.6 VERWERKING VAN DE GEGEVENS

Voor elk van de experimenten werd een gegevenstabel opgesteld met hierin de gemiddelde opge­meten pH-waarde, de pH-stijging gedurende het experiment, [Na+]medium, de gebruikte biomassa, de fosforconditie (0, 150,500 of2000 /lgP rI) en de snelheid van fosfaatopname.

45

Op deze gegevenstabel werd telkens een exploratieve factoranalyse (PCA) uitgevoerd. Er werd tweewegs ANOV A uitgevoerd met fosfaatconcentratie in het opnamemedium en pH-conditie als on­afhankelijke variabelen en opnamesnelheid als afhankelijke variabele.

3.5 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING

3.5.1 HET PLANTENMATERIAAL

Er werd tweemaal een experiment uitgevoerd om na te gaan of een pre'incubatie van ongeveer 14 uur in fosforloos medium een invloed heeft op de snelheid van fosfaatopname. Deze experimenten liepen steeds gelijk met het experiment van de +P conditie van het Chara fosforverzadigings­experiment (zie later). Het plantenmateriaal is dan ook identiek.

3.5.2 DE PREINCUBA TIECONDITIES EN DE OPNAME-EXPERIMENTEN

De achtergrond van het plantenmateriaal is hetzelfde dan dat van de +P conditie van het Chara fosforverzadigingsexperiment. De experimenten werden uitgevoerd op dag 21 (12 maart) en dag 28 (19 maart) na de start van de incubatie.

Naast het gewone opname-experiment voor de +P conditie van het Chara fosforverzadigings­experiment werd een conditie gecreeerd waarbij het plantenmateriaal niet ovemacht gepre'incubeerd wordt in fosforloos APW maar in fosforbevattend medium (1.5 mgP rl, zoals in de incubatie (cf. 3.7.4)). Voordat het opname-experiment gestart werd, werden de planten afgespoeld in standaard APW om zoveel mogelijk aangehecht fosfor te verwijderen.

De snelheid van fosfaatopname werd gemeten bij 750 ~gP rl. Er waren in het eerste experiment drie en in het tweede experiment vijfreplica's van elke conditie. De methode uit 3.1.5.2 werd gevolgd.

3.5.3 VERWERKING VAN DE GEGEVENS

am de opnamesnelheden van beide condities met elkaar te vergelijken werd een ongepaarde t-test uitgevoerd.

3.6 HET eBARA-ELODEA EXPERIMENT

3.6.1 INLEIDING

Teneinde de verschiIlende groeistrategieen van Chara en Elodea te koppelen aan hun fosfaatopnamegedrag werd de fosfaatopname van beide so orten opgevolgd gedurende een nutrientaan­rijkings- en -uithongeringsexperiment.

46

3.6.2 HET PLANTENMA TERIAAL

De gebruikte soorten zijn Elodea nutallii (Planeh.) St John (Smalle waterpest) en Chara globularis Thuillier var. globularis (Breekbaar kransblad), in wat voIgt kortweg Elodea en Chara. De Elodea werd verzameld uit een van de bomkraters uit natuurreservaat 'Vorsdonkbos-Turfputten' te Gelrode (Aarsehot). Aangezien in de bomkraters onvoldoende Chara aanwezig was om het experi­ment te starten werd gekozen om plantenmateriaal van deze soort te gebruiken uit natuurreservaat 'de Maten'te Genk (vijver 19bis).

Al het plantenmateriaal werd verzameld op 19 januari 2001 (in wat voIgt dag 0). Bij aankomst in het laboratorium werd het plantenmateriaal ontdaan van dode plantenresten en meermaals gespoeld onder strom end leidingwater.

3.6.3 ANALYSE VAN DE NUTRITIONELE OORSPRONG VAN RET PLANTENMA TERIAAL

Er werd onmiddellijk een gedeelte van het plantenmateriaal gedroogd bij ongeveer 95°C voor analyse van de nutrientensamenstelling (totaalgehalte N en P - zie 3.6.6).

Er werd ook, bij verzameling van het plantenmateriaal, een waterstaal genomen uit de vijver voor analyse in het laboratorium.

3.6.4 DE INCUBA TIEREGIMES

Nadat de planten gewassen waren werd Elodea gefragmenteerd wegens de onhandelbaarheid van stijve stengels langer dan ongeveer 5 em. Al het plantenmateriaal werd dan getneubeerd bij de ver­sehillende nutrientenregimes. Voor elk van de soorten was er een fosfaatloos (kortweg i-P) en een fos­faatbevattend (kortweg i+P) regime. Deze regimes worden in wat voIgt afgekort door Ci-P en Ci+P voor Chara en door Ei-P en Ei+P voor Elodea.

De exaete samenstelling van de ineubatiemedia is weergegeven in tabel 3.1. Het medium werd tweedagelijks vervangen. Vanaf dag 26 van het experiment werden de ineubatieregimes veranderd. De i-P eondities kregen vanaf dan fosfaatrijk en de i+P eondities fosfaatloos medium (zie tabel 3.1 voor de samensteling). Het regime werd een laatste maal herzien op dag 31 van het experiment. In de i-P eondities werd de relatieve abundantie fosfaat verder opgedreven. De fosfaatloze ineubatieregimes bleven onveranderd.

Tabel3.1 De index 1 staat voor het ineubatieregime van dag 0 t.e.m. dag 25, de index 2 voor het regime van dag 26 t.e.m. dag 30 en de index 3 voor het regime van dag 31 tot de afloop van het experiment. De incubatiemedia werden op pH 6 gebracht met NaOH en He!. Er werd geen buffersubstantie toegevoegd.

NaCI CaCb KCI NaN03 NaH2P04 Na2HP04 [N031 [Pi] regime (mM) (mM) (mM) (uM) (uM) (uM) (mqNII) (UqPII)

i+P1 1.0 0.5 0.1 357 22.7 1.45 5 750 i-P1 1.0 0.5 0.1 357 0 0 5 0 i+P2 1.0 0.5 0.1 178 0 0 2.5 0 i-P2 1.0 0.5 0.1 178 22.7 1.45 2.5 750 i+P3 1.0 0.5 0.1 178 0 0 2.5 0 i-P3 1.0 0.5 0.1 178 45.4 2.90 2.5 1500

47

Alle incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg con stante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag-nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker.

3.6.5 FOSFAATOPNAME-EXPERIMENTEN

Er werden opname-experimenten gedaan op de dagen 1,3, 6, 10, 16,26, 31 en 35 van het experi­ment. Voor Elodea werd nog een bijkomend experiment gedaan op dag 44. Ongeveer 14 uur voor de aanvang van elk opname-experiment werd een gedeelte van het plantenmateriaal gei'ncubeerd in nitraat- en fosfaatloos APW medium (MES gebufferd, pH 6 - zie appendix 1). Het opname­experiment van dag 1 geeft de fosfaatopname van de planten weer voordat ze nutrientenbehandeling ondergingen. Hiertoe werd na het was sen van het plantenmateriaal op dag 0 dadelijk plantenmateriaal gei'ncubeerd in het nitraat- en fosfaatloos APW medium.

De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de vier prei'ncubatieregimes werd de fosfaatopname van de planten gemeten onder drie condities, namelijk bij een initiele fosforconcentratie van 200, 750 en 2000 /lgP rl (zie ta­bel A.3.5 in appendix 3 voor de exacte samenstellingen). Van elke conditie werden drie replica's voor­zien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962).

De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een rela­tief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden.

Na afloop van het experiment (voldoende fosfaatdepletie) werden de gebruikte thalli gedroogd bij ca. 95°C gedurende ongeveer 3 dagen en werd het drooggewicht opgetekend.

3.6.6 OPVOLGING VAN DE N- EN DE P-STATUS VAN DE PLANTEN

Om de fosfor- en de stikstofstatus in de planten op te volgen werden, elke keer de planten geprei'ncubeerd werden voor een opname-experiment, een aantal scheuten gedroogd (± 95°C). Van dit gedroogd plantenmateriaal werd achteraf het totaalgehalte P en N bepaald zoals beschreven in 3.1.4.

3.7.7 VERWERKING VAN DE GEGEVENS

Er werd een gegevenstabel samengesteld met daarin voor elke individuele replica de dag van het experiment, de incubatieconditie (+P of -P), de fosfaatconditie (200, 750 of2000 /lgP r 1), de snelheid van fosfaatopname, de gebruikte biomassa in het opname-experiment en de nutrientenverhoudingen C:P, C:N en N:P.

Op deze gegevenstabel werd een exploratieve factoranalyse uitgevoerd (PCA). Er werden een aantal correlatie-analysen gedaan om de trends die uit de biplot naar voren kwamen uit te diepen. Om­dat de N:P verhouding in grote mate door het P-gehalte werd bepaald, werd ook een correlatie gezocht tussen het stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de snelheid van fosfaatopname.

48

3.7 BET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

3.7.1 INLEIDING

Uit het Chara-Elodea experiment kon niet worden afgeleid of Chara een bovenlimiet van interne fosforconcentratie had. Het is echter onwaarschijnlijk dat plantenmateriaaI fosfor kan blijven accu­muleren. Er werd, om na te gaan of Chara niet toch zulk een bovengrens heeft, een bijkomend expe­riment uitgevoerd met zeer vee I gelijkenis aan het Chara-Elodea experiment maar dan enkel met Chara en met drastischere incubatieregimes.

3.7.2 HET PLANTENMATERIAAL

Chara globularis ThuiIlier var. globularis (Breekbaar kransblad) werd geoogst uit natuurreservaat 'de Maten' te Genk (vijver 19bis) op 19 februari 2001. Bij aankomst in het laboratorium werd het plantenmateriaal ontdaan van dade plantenresten en meermaals gespoeld onder stromend leidingwater.

3.7.3 ANALYSE VAN DE NUTRITIONELE OORSPRONG VAN HET PLANTENMATERIAAL

Er werd onmiddeIlijk een gedeelte van het plantenmateriaal gedroogd bij ongeveer 95°C voor analyse van de nutrientensamensteIling (totaaIgehalte N en P - zie 3.7.6).

Er werd ook, bij verzameling van het plantenmateriaal, een waterstaal genomen uit de vijver voor analyse in het laboratorium.

3.7.4 DE INCUBATIEREGIMES

Het plantenmateriaal werd geincubeerd bij 0 f.!gP rl voor de -P conditie en bij 1,5 mgP rl voor de +P conditie. Het betreft telkens ongebufferd APW (appendix J) op pH 6 met daarin al dan niet fosfaat (mengsel van NaH2P04 en Na2HP04). De natriumconcentratie werd constant gehouden tussen de con­dities door minder NaCl toe te voegen in de +P conditie. Er werd voor beide regimes 2.5 mgN rl toe­gevoegd als NaN03.

AIle incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg constante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag-nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker. De incubatiemedia werden dagelijks vervangen.

3.7.5 FOSFAATOPNAME-EXPERIMENTEN

Er werden opname-experimenten gedaan op de dagen 1, 4, 14, 21 en 28 van het experiment. Ongeveer 14 uur voor de aanvang van elk opname-experiment werd een gedeelte van het planten­materiaal geincubeerd in nitraat- en fosfaatloos APW medium (MES gebufferd, pH 6 - zie appendix J). Het opname-experiment van dag 1 geeft de fosfaatopname van de planten weer voordat ze nutrientenbehandeling ondergingen. Hiertoe werd na het wassen van het plantenmateriaal op dag 0 dadelijk plantenmateriaal geincubeerd in het nitraat- en fosfaatloos APW medium.

49

De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de prelncubatieregimes werd de fosfaatopname van de planten gemeten bij 750 IlgP rl (zie tabel A.3.5 (middelste rij) in appendix 3 voor de exacte samenstellingen). Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962).

De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een rela­tief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden. Na afloop van het experiment (voldoende fosfaatdepletie) werden de gebruikte thalli gedroogd bij ca. 95°C gedurende ongeveer 3 dagen en werd het drooggewicht opgetekend.

3.7.6 OPVOLGING VAN DE N- EN DEP-STATUS VAN DE PLANTEN

Om de fosfor- en de stikstofstatus in de planten op te volgen werden, elke keer de planten gepre'incubeerd werden voor een opname-experiment, een aantal scheuten gedroogd (± 95°C). Van dit gedroogd plantenmateriaal werd achteraf het totaalgehalte P en N en het prote'inegehalte bepaald zoals beschreven in 3.104.

3.7.7 VERWERKING VAN DE GEGEVENS

Er werd een gegevenstabel samengesteld met daarin voor elke individuele replica de dag van het experiment, de incubatieconditie (+P of -P), de snelheid van fosfaatopname, de gebruikte biomassa in het opname-experiment en de nutrientenverhoudingen C:P, C:N en N:P.

Op deze gegevenstabel werd een exploratieve factoranalyse uitgevoerd (PCA). Er werden een aantal correlatie-analysen gedaan om de trends die uit de biplot naar voren kwamen uit te diepen. Omdat de N:P verhouding in grote mate door het P-gehalte werd bepaald, werd ook een correlatie gezocht tussen het stikstofgehaite van het plantenmateriaal en de snelheid van fosfaatopname.

50

RESULTATEN

4.1 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME

Voor de fosfaatopname van Chara werden zeer typische Michaelis-Menten scatterplots waar­genomen (zie figuur 4.1 voor een voorbeeld). De fosfaatopname voIgt een typisch patroon tot bij de fosfaatconcentratie 2000 f.lgP 1-1• Vanaf de volgende concentratie (5000 f.lgP r1) worden duidelijk lagere snelheden van fosfaatopname waargenomen. Dit is waarschijnlijk een gevolg van de inhibitie van het hoge-affiniteits opnamesysteem bij hogere externe fosfaatconcentraties (cf. 5.2). Voor het weergegeven voorbeeld in de figuur is er een terugval van de snelheid van fosfaatopname bij deze hoge concentraties. In andere gevallen was het lage-affiniteitssysteem in veel hogere mate werkzaam en lagen de opnamesnelheden bij 5000 en 10000 f.lgP r1 hoger dan die uit het 0-2000 f.lgP r1 bereik.

De kinetische constanten Km en V max werden berekend door een hyperbolische functie door het bereik 0-2000 f.lgP r1 te fitten. In figuur 4.1 is een voorbeeld weergegeven. Voor een tweefazig opnamesysteem moet normaalgezien de som van twee hyperbolen worden gefit. Dit resulteerde echter vaak in negatieve Km-waarden, wat onzinnig is. In de plaats hiervan werd verkozen 'gewone' Michaelis-Menten kinetische curven te gebruiken, wat een zeer goede benadering biedt voor het bereik 0-2000 f.lgP r1 (cf. 5.2). Voor verdere gegevensanalyse werd de opnamesnelheid bij 5000 f.lgP r1 gebruikt als maat voor de activiteit (en de mate van aanwezigheid) van de lage-affiniteits transporter.

'0 .~ 'w .<: E Qi c: ~ '" " 0

E .g '" c: 0.. c.",

°3

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000

[Pi]medium (~gP 1"')

4.0

3.5

"0 1: 3.0 'w .r::: E Qi

~ 2.5

t::

'" '" 0 2.0 E .g '" t::o.. 1.5 c.",

°3 1.0

0.5

0.0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250

[Pi]medium (~gP 1"')

Figuur 4.1 Voorbeeld van een Michaelis-Menten plot van de fosfaatopnamesnelheden bij Chara g/obularis. De linkergrafiek geeft het volledige bereik van de gebruikte fosfaatconcentraties weer en toont de afnemende opnamesnelheid boven 2000 j.JgP 1-1" De rechtergrafiek toont, voor dezelfde gegevens, het bereik 0-2000 j.JgP 1-1 met de hyperbolische curve fit erdoor. De kinetische constanten zijn, voor dit voorbeeld, Km = 285 j.JgP ,-1 en Vmax

= 3.7 j.JgP (g DWr1 min-1 (in de figuur aangeduid met stippellijnen).

4.2 SEIZOENALE OPVOLGING

4.2.1 EXPLORATIEVE ANALYSE

De gegevens over de maandelijkse fosfaatopname zijn terug te vinden in tabel A.4.1 uit appendix 4. Tabellen A.4.2 en A.4.3 tonen de gegevenstabellen gebruikt voor respectievelijk biplot 1 en 2 (zie verder).

51

Pagina hiertegenover: Figuur 4.3 Seizoenaal verloop van de meeste van de opgemeten variabelen. Voor de figuur met de chlorofylgehalten: -.-: chlorofyl a; ___ .A. ___ : chlorofyl b; - -T- -: chlorofyl c. Voor de figuur met de fosforconcentraties: ___ .A. ___ : orthofosfaat; -.-: totaal fosfaat.

Op de gegevens over de seizoenale opvolging van de waterkwaliteit, de plantenbiomassa en de fosfaatopname werden een aantal principaalcomponentanalyses (peA) uitgevoerd. Biplot 1 (figuur 4.2 en tabel Ao4o4 uit appendix 4) bevat de gegevens van februari tot december. Aangezien vanaf juli gegevens zijn verzameld over het fosfor- en stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de fosfaatopname vanaf toen ook minder willekeurig verloopt dan in de maanden ervoor (zie figuur 4.3 en bespreking in 6.3), werd een tweede biplot geconstrueerd (figuur 404 en tabel A.4.S uit appendix 4), met enkel de gegevens van de periode juli tot december. In deze biplot werd ook de fosfaatopname

0.8

S042- okt

o. • bacillariofyten

TP • o. ~ ..•........... apr

nov ...........

o. ........... . ....... 02

......... . .......................................... )1

N DOC .... 0 -§ chlorofyten • co

LL

ei • -0. K+ .... • co l211ka I ......

• • .... ····aug -0. . ...

tempe..r.af~ur -0. eL'

Na+

• -0.

-1

-1.

-1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2

Factor 1

Figuur 4.2 Siplot 1 van de seizoenale opvolging. De factorscores voor de datapunten (de verschillende maanden) werden gedeeld door 2.5 om binnen de schaal van de grafiek te vallen. Factor 1 verklaart 42% van de variabiliteit en factor 2 verklaart 15%, zodat de biplot in totaal 57% van de totale variabiliteit verklaart. De factorladingen voor de verschillende variabelen zijn terug te vinden in tabel A.4.4 uit appendix 4.

52

400

350 CO 300 rJl~

rJl" 250 CO E

E~ 200

"2 ~ 150 .c 100

50

c E

~ 0 ~ 4 0-0> 3 2

} 2

800

700

::- 600

0- 500 0>

2 400

~ 300

200

100

50

45

40

35 0>

2 30 >. -25 2 0 20 :c U 15

10

6000

5000 I:: CllN' 4000 >," -§ 2:§ 3000 o ffi - '" .s:::- 2000 U

1000

6000

I:: 5000 :Cll ";:: CllN' 4000 U§ Jl~ 3000

o ~ 1::_ 2000 CO

()' 1000

5000

I:: Cll 4000 >,N' O§ 3000 .~ ~

'OJ! 2000

CO .c 1000

F M A M J A S 0 N D

..... 30r-----------------------------------, ::l ::l 25

CO _ 20 Q;~ c.. - 15

E 2

140r-------------------------------------,

I+- g> 120

.8 :Ql 100

~n 80 ::s ~ 60 N'#. 40

20

::- 350 400~ OJ 300 .s 250

a ~~~ :. U 100 50

o-r-'--.--r--r--r--r--r-'r-.--'--.-~

CD

~

500r---------------------------------~--,

450 400

350 300 250

200

150

100

50 O~_r--r__r--r__r--~~--._~--._~~

16r-----------------------------------,

12

50

40

-- ca>' K'

.--... -- Na+ "" ................. ___ .. ," '\

.. __ ............. _ ............ J

------------ ........ _---

----- so.," ..... ~ --- CI" -~ 30 c-~.[ 20 C

8 10

100

80 Z Cl

3 60

co jg 40

"2 20

1000

900

0- 800 0> 2 (J) 700 CD

:;::; 600 ~

1:: 500 CD U I:: 400

~ 300 0 't5 0 200 - 100

FMAMJJASOND

53

bij 5000 IlgP rl uitgezet (maat voor de werkzaamheid fosfaattransporter met Iage affiniteit). De gegevens werden in functie van de tijd uitgezet in figuur 4.3. Beide bipIots en de grafieken met het seizoenaaI verIoop zuBen in wat voIgt samen aan bod komen.

In de vroege herfst (september-oktober) is een duideIijke fosfaatpiek waar te nemen (figuur 4.3). Gedurende deze piek is nagenoeg aI het fosfor in het water aanwezig aIs orthofosfaat. Tijdens ongeveer dezeIfde periode wordt een terugvaI van de gangbare, hoge zuurstofconcentratie waargenomen, terwijI het CO2-gehalte van het water hoog is. Ook de conductiviteit is hoog in deze periode, ten gevoIge van piekende ionenconcentraties (vnl. Ca2+, cr en SOi-). De fosfaatconcentratie heeft sIechts een zeer kIeine invIoed op de conductiviteit. Ze bedraagt op haar hoogste niveau (septem-

0.8

o.

0

o.

N ... 0 ~ co I.L.

-0.

-0.

-0.

-0.

-1

-1.2

de 02

DOt<; ___ .............. ············· ... N·~9~~;!t~~;I~i'~:~·.j • ~"" !

·1 -0.8 ·0.6 -0.4

I I I I

/ I I I I

I I

/ I I I I I

I

Vr:v\ax j I t

-0.2 o

bacill§~ oktMg2+

@'\l rofyt

•

0.2

N03

•

0.4

• •

co~ductiviteit alkalin~it

•

temperatuur

biomctssa

•

0.6 0.8

Factor 1

1.2

Figuur 4.4 Biplot 2 van de seizoenale opvolging. Enkel de gegevens van juli tot december werden gebruikt. Factor 1 verklaart 40% van de totale variabiliteit, factor 2 nog een bijkomende 20%. De factorscores werden gedeeld door 2 om binnen de schaal van de grafiek te vallen. Tabel AA.5 in appendix 4 geeft de factorladingen van de verschillende variabelen weer.

54

ber) nog steeds minder dan I mgP rl. Ook de cyanobacterie-epifYten vertonen een densiteitspiek in september-oktober. Zowel V max als Km van de fosfaatopname zijn laag gedurende de herfst.

Figuren 4.2 en 4.4 (verder respectievelijk biplot I en biplot 2 genoemd) tonen dat oP en TP nage­noeg samenvallen (in biplot I is oP het punt net onder TP, het label kon niet weergegeven worden wegens samenvallend met dat van TP) en bijgevolg een nauwe correlatie vertonen (cf. figuur 4.3). Beide biplots zijn, ondanks het gebruik van een aantal andere variabelen en slechts een gedeelte van de meetwaarden in biplot 2, erg gelijkend.

Biplot I suggereert dat de maximumsnelheid van de fosfaatopname (V max) niet gecorreleerd is met de fosfaatconcentratie van het water. Biplot 2 suggereert nochtans dat er mogelijk toch een correlatie bestaat tussen V max en oP (hoek tussen beide ongeveer 137°). Het nitraatgehalte lijkt weI een verband te vertonen met V max, vooral voor biplot I. De lage Km-waarden tijdens de fosfaatpiek van de late zomer en de vroege herfst uiten zich ook in de biplots: Km vertoont een negatief verband met de fosfaatconcentratie.

Het COz-gehalte staat in negatief verband met de zuurstofconcentratie in het water. Biplot 2 suggereert bovendien een negatieve correlatie tussen het fosforgehalte van het plantenmateriaal ener­zijds en Km en opname bij 5000 IlgP rl anderzijds. Merk op dat het stikstof- en fosforgehalte van het plantenmateriaal slechts weinig van de variabiliteit voor hun rekening nemen. In biplot 2 valt op dat de maximale snelheid van fosfaatopname (V max) een nagenoeg rechte hoek vertoont met het fosforgehalte van de plant. Dit zou betekenen dat de snelheid van fosfaatopname in het bereik 0-2000 IlgP r l , niet afhangt van de fosforstatus van de plant.

Links in biplot I is een sterke clustering van een aantal afwijkende datapunten uit september waar te nemen. De cyanofYten liggen hier samen met een aantal ionen en het COz-gehalte. Ook de andere ionen (incIusief fosfaat), en de conductiviteit meer in het algemeen, liggen in deze buurt. De fosfaat­piek uit de herfst komt dus, zoals reeds eerder aangehaald, overeen met een cyanofYtenbloei in de epifytengemeenschap, hoge CO2-gehalten en lage Oz-gehalten. Ook in biplot 2 is dit patroon zichtbaar (met de cluster deze maal aan de rechterzijde van de grafiek).

Het chlorofYlgehalte (maat voor de densiteit van fytoplankton) profileert zich in geen van beide biplots (Jigt altijd tamelijk dicht bij de oorsprong).

4.2.2 VERDERE UITDIEPING

In dit deel zullen een aantaI van de suggesties uit voorgaande biplots worden uitgewerkt. Een eer­ste opvallende waameming uit de biplots is dat de zuurstofconcentratie en het COz-gehalte volledig aan de andere zijde van de biplot Iiggen. Dit suggereert een sterke negatieve correlatie tussen beide. Figuur 4.5.a bevestigt deze correlatie, aI zijn het vooral de maanden met de extreme O2- en COz­gehalten die er sterk toe bijdragen.

Figuur 4.5.b toont het verband tussen de ortho- en de totaal-fosfaatconcentratie. Deze correlatie is uitsluitend toe te schrijven aan de waarden van september en oktober. Zonder deze waarden, of met een niet-parametrische test, is het verband niet significant (p-waarden 0.859 en .072 voor een Pearson correlatie-analyse zonder de outliers en een Spearman rank correlatie-analyse, respectievelijk).

55

(a) 140

120

~ . moo .'" 100 ap'un .

" ~ '"' . ~

60 . I 60 . .

40 ~

i 20

40 60 120 160 200 240 260 320 360

C02 gehalte van het water (mg/l)

(b)

£" 2: ro

~ .g 0;

-" .2

1200

1000

600

600

400

200

v 0

0< .

orthofosfaat (l-IgP/I)

Figuur 4.5 (a) Regressie van de zuurstofconcentratie tegenover het C02-gehalte. De Pearson-correlatie is signifi­cant (p < 0.001), met R2 van de gefitte rechte 0.78. (b) Regressie van totaal fosfaat tegenover orlhofosfaat. De Pearson-correlatie is significant (p < 0.0001). De R2 van de gefitte rechte bedraagt 0.9967.

Om correlaties te achterhalen die V max of Km bevatten werden, om hogergenoemde redenen, telkens twee verschillende analyses uitgevoerd, een eerste op de gegevens van aIle maanden samen en een tweede op de gegevens vanaf de maand julio

Pearson correlatie-analyses bevestigen dat V max niet gecorreleerd is met oP. Omdat de grafiek (niet weergegeven) echter twee outliers vertoonde (zeer hoge orthofosfaatconcentraties in september en oktober, terwijl de V max-waarden niet proportioneei mee veranderden), werd ook een niet para­metrische correlatie-analyse uitgevoerd. Deze bevestigt opnieuw dat er geen correlatie is tussen beide variabelen.

Beide biplots suggereren sterk dat Km in negatief verband staat met de orthofosfaatconcentratie. Ook figuur 4.3 geeft suggesties in die aard. Pearson noch Spearman correlatie-analyses vinden een betekenisvol verband. Ook de nitraatconcentratie vertoont geen significant lineair verband met V max.

Wat betreft de invloed van het fosforgehalte van het plantenmateriaal op de opname van fosfaat werden ook een aantal mogelijke verbanden onderzocht. Deze analyses beslaan enkel de maanden juli tot december (cf. hoger). Het fosforgehalte van de plant stond in significant lineair verband met noch de affiniteit of de maximale snelheid van de fosfaatopname, noch de opnamesnelheid bij 5000 IlgP rl.

4.3 DE INVLOED VAN NA + EN K+

4.3.1 INLEIDENDE EXPERIMENTEN

In november werd, parallel met het opname-experiment voor de seizoenale opvolging, nog een experiment gedaan om na te gaan of de Na+- of de K+-concentratie van het opnamemedium een invloed hebben op de fosfaatopname. De resultaten zijn samengevat in figuur 4.6.a. De kinetische con­stanten kunnen worden teruggevonden in het bijschrift van de figuur.

De depletiegegevens zijn weergegeven in tabel A.4.6 uit appendix 4.

56

De opnamesnelheid verschilt significant tussen de twee condities (p = 0.0104, tweewegs ANOYA) en ook de interactie tussen fosfaatconcentratie van het opnamemedium en conditie blijkt de snelheid van fosfaatopname significant te bei"nvloeden (p < 0.001). Dit betekent dat bij verschillende fosfaatconcentraties de opname anders door de conditie zal bei"nvloed worden.

Hetzelfde experiment werd herhaald in december. De resultaten van dit experiment zijn terug te vinden in figuur 4.6.b. De opnamesnelheden van december liggen veel hoger dan die van november (andere schaal in figuren a en b).

Er was opnieuw op een significant andere opname in beide condities (p < 0.001, tweewegs ANOY A). De interactie tussen de conditie en de concentratie bleek in deze analyse de fosfaatopname niet significant te bei"nvloeden. De opnamesnelheid wordt dus voor aIle fosfaatconcentraties in het opnamemedium geIijkaardig bei"nvloed, wat reeds door figuur 4.6.b werd gesuggereerd.

Op de bekomen kinetische constanten werd ook nog een ongepaarde t-test uitgevoerd. In novem­ber verschilden de Ymax- en Km-waarden significant van elkaar (p-waarden 0.0042 en 0.0137, respec­tievelijk). In december waren de kinetische constanten niet significant verschillend. Merk op dat, bij hogere fosfaatconcentraties in het opnamemedium, NaH2P04-toediening resulteert in relatief hogere opnamesnelheid in november maar in lagere in december. Bij de lage concentraties (100 en 200 ~gP r 1) verloopt de opname steeds beter als het fosfaat werd toegediend als K3P04.

(a) 3.0

2.5

:Et ~"f 2.0

~~ '" s: Q) 0 1.5

~.9 a. 'En 1.0 °20

0.5

li ---------------r------------------------------

O.O+--,...--.,---,--,...---r--,--r---. 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000

[Pilm•dium (~gP r')

(b) 6

250 . 500 750 1000 1250 1500 1750 2000

[Pilm.d;um (~gP I·')

Figuur 4.6 (a) Fosfaatopname in november, bij toediening van NaH2P04 (-e-) of K3P04 (---.---). De kine­tische constanten zijn, voor de K+-conditie: Vmax = 1.6 I-lg (g Dwr1 min-1 en Km = 190 I-lgP 1-1; en voor de Na+­conditie: Vmax = 2.5 I-lg (g DWr1 min-1 en Km = 552 I-lgP 1-1. (b) Dezelfde grafiek voor het experiment van decem­ber. De kinetische constanten zijn in dit geval Vmax = 5.4 I-lg (g DW)-1 min-1 en Km = 553 I-lgP 1-1 voor de K+-con­ditie en Vmax = 3.9 IJg (g DWr1 min-1 en Km = 594 I-lgP 1-1 voor de Na+-conditie. Let op de verschillende schalen.

4.3.2 INVLOED VAN DE NATRIUMCONCENTRATIE

In dit experiment werd de Na+-concentratie van het opnamemedium gevarieerd. Het verschil tussen beide condities is dat het plantenmateriaal al dan niet natriumuitgehongerd werd gedurende 5 dagen voor het opname-experiment.

De depletiegegevens zijn weergegeven in tabel AA.7 uit appendix 4.

57

De waargenomen patronen zijn weergegeven in figuur 4.7. Voor het experiment zonder Na+-uithon­gering werden hoge opnamesnelheden gevonden in het concentratiebereik 0-2 mM Na+, bij de concentraties 3 en 5 mM Na+ was de opname minder sneI. Voor het experiment met Na+-uithongering wordt een ander patroon waargenomen: bij de twee extreme concentra­ties (0 en 5 mM Na+) worden Iagere opnamesnelheden

2.5 .5

:=- 2.0 ~ c Ji "e ~ ~ 1.5

EO ~ i 1.0 ••• --................. l ................................ _

0.5

O.O+----r--,--,-----r---/-O.O o

opgetekend dan bij de intermediaire. De opnamesnel= [Na+]medlum (m M)

Figuur 4.7 Invloed van de natriumconcen­tratie op de fosfaatopname. ---.---: zonder voorafgaande Na+-uithongering; -e-: met voorafgaande Na+-uithongering. De opname­snelheden werden gemeten bij 500 I-lgP 1-1.

heden zijn significant hoger in het tweede experiment dan in het eerste (p = 0.0013).

4.3.3 STIMULATIE VAN DE FOSFAATOPNAME DOOR NA+ EN K+

Dit is het Iaatste uit de rij van experimenten die de invloed van Na+ en K+ op de fosfaatopname tracht aan het Iicht te brengen. In dit experiment werd aan een aantaI onnauwkeurigheden uit vorige experimenten oplossing geboden (cf. 5.4).

De depletiegegevens zijn weergegeven in tabeI A.4.8 uit appendix 4.

Een exploratieve factoranalyse van de voIIedige gegevensset (figuur A.4.1 en tabeI A.4.9 in appendix 4) toont een nagenoeg rechte hoek tussen de opnamesnelheid en de Na+- en K+-concentratie. De preincubatie Iijkt een negatieve correlatie te vertonen met de opnamesnelheid.

Op de voIIedige dataset werden een aantal statistische analyses gedaan. Er werd een eenwegs ANOV A uitgevoerd om een eventueel globaal effect van natriumconcentratie na te gaan. Dit effect was aanwezig (p = 0.0086), toevoeging van 1 mM Na+ had een stimulerend effect op de opname­snelheid (p-waarde van de Tukey HSD test 0.0063) ten opzichte van de totale afwezigheid ervan. Bij 5 mM werd terug een afname van de opname waargenomen. De verschillen tussen de conditie met 5 mM Na+ en de condities zonder en met 1 mM Na+ waren niet significant.

.~ E

~ o

a. '" .::; "0 .0; .s: a; t:

'" ., E <II t: C. o

conditie

10 11 12

De condities: 1: 0 mM Na+, 0.125 mM K+, pre"incubatie identiek

2: 1 mM Na+, 0.125 mM K+, pre"incubatie identiek

3: 5 mM Na+, 0.125 mM K+, pre"incubatie identiek

4: 0 mM Na+, 1.25 mM K+, pre"incubatie identiek

5: 1 mM Na+, 1.25 mM K+, pre·incubatie identiek

6: 5 mM Na+, 1.25 mM K+, pre"incubatie identiek

7: 0 mM Na+, 0.125 mM K+, standaard APW preinc.

8: 1 mM Na+, 0.125 mM K+, standaard APW preinc.

9: 5 mM Na+, 0.125 mM K+, standaard APW preinc.

10: 0 mM Na+, 1.25 mM K+, standaard APW preinc.

11: 1 mM Na +, 1.25 mM K+, standaard APW preinc.

12: 5 mM Na+, 1.25 mM K+, standaard APW preinc.

Figuur 4.8 Opnamesnelheden bij de verschillende Na+', K+- en pre"incubatieregimes. De opnamesnelheden werden gemeten bij 775 I-lgP r1.

58

De K+ concentratie had geen significant globaal effect op de opnamesnelheid (t-test). Noch de interactie tussen Na + - en de K+ -concentratie, noch die tussen K + en prei"ncubatietype had een signifi­cante invloed op de opnamesnelheid (tweewegs ANOV A's).

Hoewel het prei"ncubatieregime een duidelijk effect had op de opnamesnelheid, werd geen signifi­cant effect gevonden (p = 0.075, t-test). Ook voor de condities zonder Na+-toediening, waar de verschillen tussen de prei"ncubatiecondities het grootst lijken, kan net niet worden besloten tot een significant verband tussen de opnamesnelheid bij prei"ncubatie in standaard APW of natriumloos APW (p = 0.057).

Bij het bekijken van de balken uit figuur 4.8 kan in drie van de vier groepen een maximale opnamesnelheid worden waargenomen bij de conditie met 1 mM Na+. Het zou dus kunnen dat het optimum van de opname als functie van de natriumconcentratie in de buurt van 1 mM ligt en dat hogere concentraties de fosfaatopname afremmen. Dit werd ook in het vorige experiment waarge­nomen. Het optimum van de fosfaatopname lag daar in de buurt van 1 it 2 mM Na+ (figuur 4.7). Als, voor het hier besproken experiment, enkel de concentraties 0 en 1 mM Na+ in de analyse werden gehouden, kon een significante stimulatie van de opnamesnelheid door de aanwezigheid van Na+ worden aangetoond (p = 0.0047).

De verschiIlen in opnamesnelheid zijn vooral duidelijk merkbaar in de condities waar prei"ncu­batie gebeurde in standaard APW (laatste zes balken van figuur 4.8). Daar waar de opnamesnelheid bij 1 mM nagenoeg gelijk blijft over het prei"ncubatieregime heen (condities 2, 5, 8 en 11), is deze bij 0 mM opmerkelijk lager in de condities waar prei"ncubatie gebeurde in standaard APW (condities 1 en 4 versus 7 en 10). Dit effect is net niet significant (p = 0.0575).

4.4 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

In een poging de aard van het transmembranair transport te achterhalen (proton- of natrium­gemedieerd), werden een aantal opname-experimenten van zeer korte tijdsduur (± 20 min) uitgevoerd. In deze experimenten was een zeer grote hoeveelheid biomassa aanwezig in het opnamemedium en was de initiele fosfaatconcentratie hoog, zodat eventuele veranderingen in natriumconcentratie of pH tengevolge van fosfaatopname merkbaar zouden zijn.

Wegens tijdsgebrek bleven deze experimenten in een erg verkennende faze. Er werden in totaal 6 experimenten uitgevoerd, waaronder enkele in gebufferd en enkele in ongebufferd medium, enkele bij 1 mM Na+ en enkele bij 0.4 mM Na+.

De algemene waarnemingen zijn de volgende. In de eerste plaats werd er na de fosfaattoediening vaak een kleine pH-daling waargenomen. Na een tiental minuten was deze meestal ongedaan gemaakt. De fosfaatconcentratie van het opnamemedium nam, gedurende de opnameperiode, nagenoeg lineair af. De natriumconcentratie, die initieel telkens meer dan het dubbele bedroeg van de toegediende con­centratie, kon met de gebruikte methode niet nauwkeurig genoeg worden bepaald. Typische patronen zijn weergegeven in figuur 4.9.

59

~~,---------------~ 6.7 ~~,---------------~ (a)

6.6 (b)

J: 6.5 Cl.

6.4 ... . '. 6.3

~~ nn ~-Eo

'+' E 27~

~3 -. 2500

(e)

1500-

E~ =-~::.

.1 '5, 17~-:·· ~3

6.2-!---,--,----,--..,----I o 200 400 600 800 1CXXl o 200 400 600 800 1CXXl o 200 400 600 8IXl 1CXXl

tijd (5) tijd (5) tijd (5)

Figuur 4 .. 9 TYPIsche patronen zoals voJaargenomen de kortetermijn opname-experimenten. (a) fosfaatconcentratie, (b) pH, (c) natriumconcentratie.

4.5 INVLOED VAN DE pH OP DE PI-OPNAME

4.5.1 pH-AFHANKELIJKHEID VAN DE FOSFAATOPNAME BIJ CHARA

Met Chara werden twee experimenten gedaan om na te gaan hoe de pH van het incubatiemedium de fosfaatopname belnvloed. Bij het eerste experiment werd de Chara slechts gedurende een nacht (ongeveer 14 uur) geprelncubeerd bij de pH waarbij ook het opname-experiment zich zou voltrekken. Dit experiment wordt in wat voIgt Czp genoemd (Chara zonder prelncubatie). Voor het tweede expe­riment werd het opname-experiment voorafgegaan door een twee weken durende prelncubatie bij de gewenste pH, met als doel de planten te adapteren aan deze pH. Dit experiment wordt in wat voIgt Cmp (Chara met prelncubatie) genoemd.

Tabel A.4.1 0 uit appendix 4 geeft de depletiegegevens van het opname-experiment weer.

4.5.1.1 pH-adaptatie tijdens de langdurige prei"ncubatie van het emp-experiment

Het plantenmateriaal paste zich, zoals verwacht, geleidelijk aan aan de opgelegde pH. Elke dag (ongeveer op hetzelfde uur) werd de pH van het medium gecorrigeerd tot de gewenste pH. Vooraleer deze pH-aanpassing gebeurde, werd gemeten hoeveel de pH was veranderd gedurende de voorbije dag. Figuur A.4.2 uit appendix 4 toont de adaptatie van het plantenmateriaal aan de pH.

4.5.1.2 Exploratieve analyse

Een aantal exploratieve factoranalysen (biplots niet weergegeven) leverden noch voor het Cmp-, noch voor het Czp-experiment merkwaardige trends.

4.5.1.3 Afwijkingen van de initiele pH gedurende de opname-experimenten

Hoewel de incubatiemedia gebufferd werden op de gewenste pH met 2 mM MES, MOPS of CHES buffer, werden toch in enkele gevallen gedurende de loop van het experiment pH-variaties waargenomen. In het experiment met Chara zonder prelncubatie (Czp) werden significante stijgingen van de pH waargenomen in de conditie pH 5 en significante dalingen in de condities pH 8 en pH 9. In

60

de condities pH 6 en pH 7 bleef de pH nagenoeg onver­anderd. Figuur 4.1 O.a toont een voorbeeld van een tijds­opvolging van de pH, figuur 4.1 O.b geeft voor elk van de pH-condities (Czp experiment) weer in welke mate de pH afweek van de initiele waarde.

De pH-veranderingen uit het Czp-experiment werden in enkele gevallen significant bei"nvloed door de biomassa plantenmateriaal in de incubatiecuvet (Pearson correlatie­analyse). Voor de conditie pH 5 werd op elk van de vier tijdstippen waarop de pH werd gemeten een significant effect van de biomassa op de pH-toename gevonden (p = 0.003). Ook voor de conditie pH 9 werd een significant effect gevonden (p = 0.003). In aIle andere condities was er geen duidelijk effect van de biomassa op de pH-varia­tie.

Tijdens het Cmp-experiment was er amper een af­wijking van de initiele pH. De grootste afwijking deed zich voor bij pH 5 en bedroeg slechts 0.3 pH-eenheden.

De afwijking vanaf de initiele pH werd, net als de gemiddelde pH gedurende het experiment, voor elke replica apart betrokken in de exploratieve factoranalyses (4.5.1.2).

4.5.1.4 Bei"nvloeding van de josjaatopname door de pH

6.25 (a)

6.00

:c 5.75 0-

5.50

5.25

5.00

0 100 200 300 400 500 60J

tijd (min)

• 0 ~gP/I ... 150 ~gPIl .., 500 ~gPIl • 2000 ~gP/I

c '" 0-en Cil > ~

'" .0

'"

1..0,-------------------, (b)

pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9

pH conditie

Figuur 4.10 Verloop van de pH gedurende het Czp experiment. (a) conditie pH 5: De pH neemt significant toe in de tijd. De curve fits zijn exponentieel (pH :: span.exp(K.x) + plateau). (b) De totale afwijking vanaf de ini­tie Ie pH is het grootst bij de extreme pH condities. De hoogte van de balken wordt bepaald door het gemiddelde (over de 4 fosforcondities) van de 'span' (de hoogte van de exponentiele fit). Deze waarde geeft een zeer goed beeld van de afwijking vanaf de initiele pH.

De pH-conditie had een significant effect op de fosfaatopname (p < 0.000 I voor Cmp en p = 0.0062 voor Czp), en de afhankelijkheid die de fosfaatopname vertoont ten opzichte van de pH veran­dert met de fosfaatconcentratie in het medium (p < 0.0001 voor Cmp en p = 0.0062 voor Czp). Met andere woorden, bij lage fosfaatconcentraties in het opnamemedium heeft de pH een ander effect dan bij hoge fosfaatconcentraties. De opnamesnelheden zijn gevisualiseerd in figuur 4.11 (a tot c), voor elke fosfaatconcentratie waarbij de opname werd gemeten apart.

De twee experimenten die werden uitgevoerd met Chara kunnen niet zonder meer met elkaar worden vergeleken, aangezien het plantenmateriaal op verschillende datums geoogst werd. Absolute opnamesnelheden kunnen bijgevolg niet enkel als gevolg van de prei"ncubatie-omstandigheden worden gezien. Enkel de patronen van fosfaatopname kunnen worden vergeleken.

Uitgaande van de figuren 4.11 (a tot g) kan men tot de conclusie komen dat de langdurige prei"n­cubatie van het plantenmateriaal, dat het toestond zijn metabolisme te adapteren aan de heersende pH, geen verandering van de patronen in de opnamesnelheid heeft veroorzaakt.

61

"0_ 1.4

~ ~~ 1.2 ID _ 1.0 :;;~ 0.8 IDCl E OJ 0.6 "'0.. 0.4 C OJ C. ::!.

0.2 0-

0.0

4

(a)

vkt±",+ - - r .l1 567 9 10

pH conditie

"0_ 3.0

~ ~~ 2.5 (b)

ID_ 2.0

~ :;;~ //' --- ---IDCl 1.5 E.9 "'0.. 1.0 C OJ C. ::!.

0.5 0-

0.0 4 5 6 7 8 9 10 4 5 6 7 8 9 10

pH conditie pH conditie

~~1~~

}l~ in1'~i~jDI o ~::. f& " ,}"~'

__ 1500~f) '~ 1CXXJ

~ ~:,\, ., i· '.,. 5 6 7 8 9

~~ ::~g.), ........... '. ; .• ~E 9.'X) ~' ( s\ ~, ;. ; o ... ; •.... ': ••

56789

pH conditie

5 6 7 8 9

pH conditie pH conditie

5 6 7 8 9

pH conditie

Figuur 4.11 pH-afhankelijkheid van de fosfaatopname bij Chara globularis. (a) fosfaatopname bij 150 I-lgP 1-1; (b) fosfaatopname bij 500 I-lgP 1-1 ; (e) fosfaatopname bij 2000 I-lgP 1-1; ---+---: Cmp, -e-: Czp. Let op de andere sehalen. Vmax van de opname voor Cmp (d) en Czp (e). Km van de opname voor Cmp (f) en Czp (g).

4.5.2 pH-AFHANKELIJKHEID VAN DE FOSFAATOPNAME BIJ NITELLA

Voor Nitella werd enkel een experiment uitgevoerd zonder langdurige prei"ncubatie omdat, gedurende de langdurige prei"ncubatie, de planten overwoekerd werden door een dichte epifytenmat. De depletiegegevens zijn weergegeven in tabel A.4.11 uit appendix 4.

In dit experiment werden (op 2 fosforcondities van de pH 9 conditie na) geen trendmatige veran­deringen van de pH gevonden. Er was nergens een verband tussen pH variatie en biomassa in de cuvet.

Bij het opname-experiment werd netto efflux waargenomen in aIle 0 IlgP rl condities en ook in een aantal 150 IlgP rl condities (pH 5 en pH 9). Voor de verdere analyse werd verondersteld dat de efflux onafhankelijk is van de externe fosfaatconcentratie (wat zeer waarschijnlijk niet zo is). De opnamesnelheden werden vermeerderd met de efflux-snelheid bij 0 IlgP rl.

Een exploratieve factoranalyse (niet weergegeven) bracht geen opmerkenswaardige patronen met zich mee.

"0 0.75,----------, 'Qi ~ (a) ~ ~ 0.60

;; ~ 045 IDCl E .9 0.30 ~~ g.2; 0.15

O.OO+--f~_.__,_-,___.___I

4 5 6 8 9 10

pH conditie

0.75..,----------,

] ~ 0.60 ID _

;; ~ 0.45 alCl E .9 0.30 "'0.. c 0> g. 2; 0.15

(b)

('h 0.00-+--.,.-...--.--.---.---1

4 5 6 7 10

pH conditie

1.50.,-----------,

]~1.25-(C)~ Q) - 1.00-;;~ al Cl 0.75-E CO>

~ i 0.50-

g. 2; 0.25-

0.00+--.--,..--,--.--,..--1 4 678

pH conditie

10

Figuur 4.12 pH-afhankelijkheid van de fosfaatopname bij Nitella f1exilis. Opnamesnelheden bij (a) 150 I-lgP 1-1,

(a) 500 I-lgP r , (e) 2000 I-lgP 1-1 . Let op de verschillende schalen

62

Ook in het geval van Nitella is het moeilijk een algemeen patroon te herkennen in de figuren (figuur 4.12). Bij lagere fosfaatconcentraties in het opnamemedium (150 maar vooral 500 IlgP I-I) wordt een relatief hogere snelheid van fosfaatopname waargenomen in het centrale deel van het onderzochte pH-spectrum. Bij 2000 IlgP rl zien we een vrij con stante opname over het pH-bereik van 5 tot 7. Bij hogere pH daalt bij deze fosfaatconcentratie de opnamesnelheid, al is deze daling niet betekenisvol door de grate variabiliteit in de andere condities.

4.5.3 VERGELIJKING VAN DE PATRONEN BIJ CHARA EN NITELLA

Figuur 4.13 verzamelt de waargenomen patronen bij Chara en Nitella, voor elke fosfaatcon­centratie waarbij de opname werd gemeten apart. De resultaten die voor Chara zijn weergegeven zijn die van het Czp experiment.

De figuur toont dat, voor aIle condities, de opnamesnelheden hoger zijn bij Chara dan bij Nitella. De patronen zijn erg gelijkend, behalve misschien bij de condities met 2000 IlgP rl. Hier wordt, voor toenemende pH, een afname van de opnamesnelheid waargenomen bij Nitella, terwijl de opname bij Chara een optimum vertoont bij intermediaire pH.

De fosforconcentraties van het plantenmateriaal waren, voor de in figuur 4.13 weergegeven resul­taten, 0.023 en 0.189 mmol P (g DWr l , respectievelijk voor Chara en Nitella.

-0 _ 1.4..,-----------., '0; -c 1.2 (a) £ '0; '" _ 1.0

~ ~ 0.8 '" 0 E ~ 0.6

~ 'a 0.4 Q.::l. 0- 0.2

O.O+--1'''--.,.--r-..,.---.--i 4 5 6 7 8 9 10

pH conditie

"0 _ 3.0..,-----------, '0; -c 25- (b) £0; .

~~2.0- ~ '" 0 1.5-E~ ~ 'S, 1.0-

g-2:0.5-~ O.O+--;:,-.,-..,.---.-.--i

4 5 6 7 8 9 10

pH conditie

"0 _ 6-,----------,

~~~5 (c)~ ~ '7 4 "'~ '" 0 3 E~ en Co 2 c: Ol

g-2:1 ! i • • __

4 678 9

pH conditie

10

Figuur 4.13 Vergelijking van de pH-afhankelijkheid van de snelheden van fosfaatopname bij Chara globularis en Nitella f1exilis. -.-: Nitella, -~- Chara. Opname bij (a) 150, (b) 500 en (c) 2000 I-lgP 1-'. Let op de verschil­len de schalen

4.6 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING

Er werd bij Chara onderzocht of een preYncubatieperiode van een nacht in fosforvrij medium, zoals dit gebeurde voor de seizoenale opvolging van de fosfaatopname en voor het Chara-Elodea en het Chara fosforverzadigingsexperiment, een significante invloed heeft op deze fosfaatopname.

Hoewel een duidelijk lagere opnamesnelheid werd waargenomen als geen preYncubatie in fosfor­vrij medium werd doorgevoerd (figuur 4.14.a), waren de gemiddelde opnamesnelheden niet significant verschiIlend van elkaar (p-waarde voor de ongepaarde t-test 0.1978). Dit was voornamelijk te wijten aan de grote variabiliteit van de opnamesnelheid. Toen in een tweede, identiek experiment (figuur 4.14.b) vijfreplica's (in de plaats van drie in het eerste experiment) en gelijke versgewichten planten-

63

materiaal werden gebruikt, waren de gemiddelde opnamesnelheden van beide groepen wei significant verschillend van elkaar, met hoge significantie (p = 0.0081).

(a) 1.0l 0.8

0.6 .

pre'lnc geen pre"lnc

conditie

(b) 1.0l 0.8

0.6 ,

0.2

O.O....L..----=~""'--.....I""-"""""'-'---

conditie

Figuur 4.14 Opnamesnelheden met en zender evernacht pre·incubatie in fosforloos medium. (a) experiment van 12 maart, (b) experiment van 19 maart.

4.7 HET CHARA-ELODEA EXPERIMENT

In het Chara-Elodea experiment wordt beoogd meer te leren over de strategieen die beide soorten evolutionair hebben ontwikkeld om met verhoogde fosfaatconcentraties (eutrofiering) om te gaan. Elke soort werd in laboratoriumomstandigheden gei'ncubeerd bij aan- en afwezigheid van fosfaat in het medium. Na 26 dagen incubatie werden de incubatieregimes omgewisseld. De vier condities worden als voigt aangeduid: Ei+ (Elodea met initiele +P incubatie), Ei- (Elodea met initiele -P incu­batie), Ci+ (Chara met initieJe +P incu-batie) en Ci- (Chara met initiele -P in­cubatie).

4.7.1 EXPLORATIEVE ANALYSE

VAN DE GEGEVENS

In eerste instantie werden ook hier een aantal exploratieve principaa1com­ponentanalysen (PCA) uitgevoerd. Figuur 4.15 toont de biplot voor Elodea. Hieruit blijkt dat de C:P verhouding van het plantenmateriaaI in nauw verband staat met de opnamesnelheid. De biplot suggereert verder dat de C:N verhou­ding van het plantenmateriaal weinig invloed heeft op de fosfaatopname. De C:N verhouding neemt af met toene­mende incubatieduur.

64

0.8

0.6 dag

0.'

0.2

N

! 0

-0.2

-0.'

-0.6

-0.8

-0 ..

C

c 'b c

C C

-0.2

II'

Factor 1

c

C ...

I "" blomassa

•

:N

0.2 0.6 08

Figuur 4.15 Siplot 1 voor Elodea. De factorscores van de indi­viduele waarnemingen werden gedeeld door 3 om binnen de schaal van de figuur te vallen. 0: Ci+; 0: Ci-. Factor 1 verklaart 44% van de totale variabiliteit, factor 2 nog eens 25%. De factorladingen van de verschillende variabelen kunnen in appendix 4 worden teruggevonden (tabel A.4.12).

Let op, de biomassa uit de biplot is niet de totale biomassa in de preYncubatieconditie maar de biomassa die voor elk van de individuele replica's van de opname-experimenten werden gebruikt. Deze variabele zegt dus niets over de groei van de planten. De hoeveelheid gebruikte biomassa neemt af met de incubatietijd. De gebruikte hoeveelheid biomassa lijkt geen invloed te hebben op de opnamesnelheid.

Bijkomende informatie op de grafiek (figuur 4.16 links) toont dat de twee incubatietypes zich met toenemende incubatietijd (variabele dag) duidelijk van elkaar scheiden.

Ook voor de Chara condities werd een dergeIijke biplot geconstrueerd (figuur 4.7 rechts). De algemene trends uit de biplots voor Elodea komen ook hier terug. De opname lijkt bij Chara echter zwakker gecorreleerd te zijn met de C:P verhouding en bovendien suggereert de biplot een negatief verband tussen opnamesnelheid en de C:N verhouding. Ook hier blijkt C:N af te nemen met toe­nemende incubatieduur.

I C:P

r ., , N:P

, , . ."

d" lI''' ." , "' C:N , "

\ .,

Factor 1 Factor 1

Figuur 4.16 Links biplot 2 voor Elodea. De labels geven de incubatieconditie (Ei+ of Ei-) en de incubatieduur in dagen weer. Zelfde biplot als in figuur 4.15. - - -: Ei-, -: Ei+. Rechts de biplot voor Chara. De factorscores van de individuele waarnemingen werden gedeeld door 3 om binnen de schaal van de figuur te vallen. 0: Ci+; 0: Ci-. -: Ci+; - - -: Ci-. Factor 1 verklaart 34% van de totale variabiliteit, factor 2 nag eens 30%. De factorladingen van de verschillende variabelen kunnen in appendix 4 worden teruggevonden (tabel A.4.13).

4.7.2 VERLOOP VAN DE NUTRIENTENGEHALTES VAN HET PLANTENMATERIAAL

Omdat aanzienlijke hoeveelheden plantenmateriaal nodig zijn voor een succesvolle Kjeldahl­stikstofbepaling, zijn telkens de gehaItes van slechts een replica gemeten, en dit zowel voor de stikstof- als de fosforbepalingen. Vooriopig worden enkel de patronen van voor de incubatieom­wisseling besproken (cf. 4.7.6 voor de patron en erna).

Het koolstofgehalte is tamelijk constant in de tijd, zowel in Chara als in Elodea (figuur AA.3 in appendix 4). De twee incubatieregimes resuIteren echter duidelijk in twee trends wat betreft het verioop van het fosforgehalte (figuur 4.17 a&b). In de Ci+ conditie stijgt de fosforconcentratie gelei­delijk, zodat op dag 26 bijna het drievoudige van de oorspronkeIijke fosforconcentratie aanwezig is. In de Ci- conditie daalt de fosforconcentratie, maar niet in aanzienlijke mate.

65

Voor Elodea worden gelijkaardige trends waargenomen. Hier zien we echter weI een duidelijke daling van het fosforgehalte in de Ei- conditie. In de Ei+ conditie laat de stijging van de fosfor­concentratie bovendien even op zich wachten. Vanaf dag 10 neemt het fosforgehalte echter duidelijk toe, zodat het op dag 26 nagenoeg 150% van de initiele concentratie bedraagt.

De stikstofgehalten (figuur 4.17 c&d) varieren amper bij Chara. Na een initiele afname neemt het stikstofgehalte geleidelijk toe in de Ci+ conditie terwijl in de Ci- conditie, na een geleidelijke stijging het stikstofgehalte terug afnam. Bij Elodea varieren de stikstofgehalten wei. In de Ei+ conditie zien we dat het geleidelijk toeneemt na een korte periode waarin ze amper verandert. In de Ei- conditie zien we dat na een initiele stijging het stikstofgehalte een plateau bereikt en terug begint afte nemen.

Door de tamelijk con stante koolstofgehaltes leren de C:P verhoudingen noch de C:N verhoudingen (figuur A.4.2 in appendix 4) ons vee I bij over de nutritionele toestand van het planten­materiaal. Het verioop van de N:P verhoudingen is weergegeven in figuur 4.17 (e&f).

De N:P verhouding van het plantenmateriaal van de condities Ci- en Ei- neemt geleidelijk toe met de tijd. In de Ci+ conditie neemt de N:P verhouding gestaag af, terwijl deze verhouding in de Ei+ conditie nauwelijks verandert (op een outlier na, te wijten aan een abnormaal hoog stikstofgehalte).

(a)

(e)

(e)

0.30,.--------------,

§- 0.25

o 0.20 S

i::~ O.OO-l---,.-.,..--,--,..--,--r--r---,r---I

incubatietijd (dagen)

1.75,.---------r------,

~ tED o 12 _

S 1.00 ~ rc'~ -

Z 0.75 (5 E O.ED E

0.25

0.00-1---,.-.,..--,..-J-,--,.---,---,r---r---I o 4 8 12 16 20 24 28 32 36

incubatietijd (dagen)

36,.------------r-------,

.Q 30

~ 0.. 25

Z 20 ~ .0; 15

is 10 iii

5

incubatietijd (dagen)

(b)

(d)

(f)

0.30-,----------,---------.,

~ 0.25

o 0.20

0.15 c.. ~ 0.10

E 0.05

O.oo-l--,..---,--,---.--....--..-----r--,---;

o 5 10 15 20 25 30 36 40 45

incubatietijd (dagen)

20,.---------------------,

§- 1.5 o

1.0 Z (5

§ 0.5

~~

O.O-l---r---.--,----,---....--,...---,.--,---;

o 5 10 15 20 25 30 36 40 45

incubatietijd (dagen)

36-,---------------------,

.Q 30 ~ c.. 25

Z 20 ~ '0; 15

is 10 iii

5

o 5 10 15 20 25 30 36 40 45

incubatietijd (dagen)

Figuur 4.17 Verloop van de nutrientgehalten van het plantenmateriaal. De grafieken links (a, c, e) betreffen Chara, die rechts (b, d, f) Elodea. De bovenste grafieken (a en b) geven het fosforgehalte weer, de middelste (c en d) het stikstofgehalte en de onderste (e en f) de atomaire N:P verhouding. -.- of -e-: i+, - .... -: i-. De verticale stippeliijn geeft het tijstip van de incubatieomwisseling weer.

66

4.7.3 VERLOOP VAN DE OPNAMESNELHEDEN

Het verloop van de opnamesnelheden is gevisualiseerd in figuur 4.18. Voor Chara werd waar­genomen dat de opnamesnelheid reeds na twee dagen incubatie (dag 3 van het experiment) een hogere opnamesnelheid vertoonde in de Ci- conditie. Deze hogere opnamesnelheid werd niet aangehouden, na de initiele stijging van de opnamesnelheid wordt opnieuw een lichte daling waargenomen. Vanaf incubatiedag 16 werd opnieuw een hogere opnamesnelheid waargenomen. Het patroon voor de Ci+ conditie vertoont een gelijkaardig patroon, maar de opnamesnelheid ligt hier gemiddeld 1 flgP (g DWr l min-I lager dan in de Ci- conditie.

Voor Elodea wordt een volledig ander patroon waargenomen. Hier daalden de opnamesnelheden, zowel in de Ei+ als de Ei- condities. Pas op dag 16 van de incubatie kon een merkbaar hogere opnamesnelheid worden waargenomen bij het plantenmateriaal van de fosforloze incubatie. Deze stijging van de fosfaatopnamesnelheid zette zich door tot aan de incubatieomwisseling. In de Ci+ conditie daalde de opnamesnelheid traag tot ze, op dag 26 van het experiment (dag van de incubatie­omwisseling), nog slechts 28% van de initiele waarde bedroeg.

10-,-------------, "O~ ·o:;.s 8 ='= E Q) ...,

:.;; ~ 6 Q)a

~.9 4 c c.. Cl.C)

O 2 2

incubatietijd (dagen)

10-,---------------,

incubatietijd (dagen)

Figuur 4.18 Verloop van de opnamesnelheid van fosfaat, bij pre'incubatie in fosforloos (i-, _.A_) en fosfor­bevattend (i+, -e-) medium. De vertikale stippellijn geeft het tijdstip aan waarop de incubatiecondities omge­wisseld werden. De linkse figuur betreft Chara, de rechtse Elodea.

4.7.4 VERBAND TUSSEN DE OPNAMESNELHEID EN HET FOSFORGEHALTE

De biplots suggereerden, zeker in het geval van Elodea, een positief verband tussen opnamesnel­heid en de C:P verhouding van het plantenmateriaal. De uitgevoerde Pearson correlatie-analyse op de gegevens van voor de omwisseling van de incubatiemedia resuIteerde inderdaad in een significant positief resuItaat (p < 0.0001, figuur 4.19 .a). Voor Chara werd geen significant lineair verband gevon­den (figuur 4.19.b). Een betere voorstellingswijze blijkt echter de opnamesnelheid uit te zetten tegen het fosforgehaIte van de plant (zie figuur 4.19 c&d). De opnamesnelheid vertoont in deze grafiek bij benadering een hyperbolisch verband met het fosforgehalte.

Uit figuur 4.19.c, en in mindere mate ook uit 4.20.d, blijkt dat de opnamesnelheid snel toeneemt als het fosforgehaIte van de plant een bepaalde kritische ondergrens bereikt. am de verschillen tussen Chara en Elodea beter te visualiseren werden beide in eenzelfde grafiek gezet (figuur 4.20). De gege­vens van het 'Chara fosforverzadigingsexperiment' (cf. 4.8) werden ook toegevoegd aan de grafiek. De grafiek laat toe te besluiten dat de gebruikte Elodea reeds bij hogere interne fosforconcentraties zijn fosfaatopname stimuleert dan het geval is voor beide experimenten met Chara. Opvallend is dat, voor beide experimenten met Chara, de opnamesnelheid bij 'fosforverzadiging' (horizontaal deel van de grafiek) niet even groot is.

67

(a) 6.,-------------------,

(e)

"tJ i:: 'Qi .-.r: E ai.,-iii~ Q)Cl E '" C\l~

ca. c.",

°a

. ••• • *'1 . .

•

•

o~-~·.,---._----._----._----.---~ o 250 500 700 1000 1250 1500

atomaire C:P verhouding

6

5-

4-

3-

2- * 1-

, ,.; • • . . • 0 •

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

fosforgehalte plantenmateriaal (mmol (g 0\1\1)-1)

(b) 6-.------------------,

"tJ 1: 5 0Qj ._ . • .r: E 4 • • 0;"7 •• +

iii~ • •• • • IDCl 3 . • • E '" • • • C\l~ • · •• ca. 2 · • c.", • °a

O~---.---r---.----~-----r-~ o 250 500 750 1000 1250 1500

atomaire C:P verhouding

~) 6,-----------------------------~

• . •• +

•• .... • ••• • , . .. •• . ••

O~----,_----._----~----~----~--~ 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

fosforgehalte plantenmateriaal (mmol (g 0\1\1)-1)

Figuur 4.19 (a,b) Verband tussen de fosfaatopnamesnelheid bij 750 I-IgP 1-1 en de C:P verhouding van het plantenmateriaal voor (a) Elodea en (b) Chara. (c,d) Verband tussen de fosfaatopnamesnelheid bij 750 I-IgP 1-1

en het fosforgehalte van het plantenmateriaal voor (c) Elodea en (d) Chara.

E 4

i Cl S a. '" a 3 "tJ 'Qi .r: ai iii ID E C\l c: 0.

°

"

0.00 0.05

I I I¢ I I I I I \

~

[J Chara verz

" Chara

¢ Elodea

¢

0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

fosforgehalte (mmol (g 0\1\1)-1)

Figuur 4.20 Verband tussen fosforgehalte en opnamesnelheid. Er werden geen gegevens ge"incorporeerd van na de mediumomwisseling. De gefitte hyperbolische curven zijn weergegeven (----: Chara verzadigings­experiment, -: Chara, - -: Elodea). De parameters voor de hyperbolen kunnen in appendix 4 worden terug­gevonden (tabel AA.14).

68

4.7.5 VERBAND TUSSEN DE OPNAMESNELHEID EN HET STIKSTOFGEHALTE

Het verband tussen de N:P verhouding van het plantenmateriaal en de opnamesnelheid, dat gesug­gereerd werd in de biplots (figuren 4.15 en 4.16), blijkt significant (Pearson correlatie) voor zowel Chara als Elodea (p < 0.001 in beide gevallen) (figuur 4.21 c&d).

De opnamesnelheid werd ook tegenover het stikstofgehalte van het plantenmateriaal uitgezet (figuur 4.21). Voor een bepaald stikstofgehalte, lijkt de opnamesnelheid steeds gemiddeld hoger te liggen voor de i- conditie dan voor de i+ conditie. Voor Elodea kan uit de grafiek niet veel afgeleid worden. Het patroon voor Ei- is zeer onregelmatig en er wordt hier dan ook geen correlatie gevonden. Voor Ei+ wordt een negatieve correlatie waargenomen tussen opnamesnelheid en N-gehalte (p =

0.0097, Pearson correlatie). Voor de Ci- conditie wordt een positieve trend waargenomen tussen het stikstofgehalte en de opnamesnelheid (p = 0.0139). Voor Ci+ moet worden aangenomen dat de opnamesnelheid niet verandert in functie van de stikstofconcentratie.

7.5 7.5

"0 i:: (a)

i:: (b)

6.0-"0

6.0 Ow 0_ .0; .-J:: E J:: E Qi.,.

4.5-Qi.,.

4.5 ..

55$ 55$ .. .. .. .. .. Q)o Q)O .... .. .. ~.9 E 0> • t" .. I 3.0- • 3.0 · -C\l~ . " .. Co.. • * Co.. · .-0..0> .. 0..0> .: " 0 3 1.5- ..

i .. ' .. . 0 3 1.5 !

0.0 • 0.0 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6

N-gehalte plantenmateriaal (mmol (g DVV)-1) N-gehalte plantenmateriaal (mmol (g DVV)-1)

7.5 7.5

"0' (e) "0";- (d)

._ C ._ C Q) .- Q) .-J:: E .. == E Qi~ 5.0 Q)~ 5.0- .. C"-. C"-. .. IllS .. IllS .. .. .. EO EO

.... .. .. I • t·

C\l 0> • C\l 0> •• .. C~ 2.5 * C~ 2.5 • .. •• •• 0..0.. • .. 0..0.. • • • 0 0> ... • • o 0> •

3 'I •

~ .. 3

0.0 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 5 10 15 20 25 30 35 40

atomaire N:P verhouding atomaire N:P verhouding

Figuur4.21 De opnamesnelheid bij 750 !lgP 1-1 als functie van het stikstofgehalte (a en b) en de N:P verhouding (c en d) van de plant. e: i+, ... : i-. (a) en (c): Elodea; (b) en (d): Chara. Let op de verschillende schalen op de x­as van figuren (c) en (d).

4.7.6 W AARGENOMEN PATRONEN BIJ DE INCUBA TIEOMWISSELING

Op dag 26 van het experiment werden de incubatieregimes omgewisseld. De planten die voordien in fosforbevattend medium zaten, werden nu in fosforloos medium geplaatst en vice versa. De condi­ties blijven echter, voor de eenvoud, dezelfde naam behouden: i+ en i-. De opname-experimenten stopten voor Chara op dag 35 van het experiment, voor Elodea op dag 44.

De incubatieomwisseling had een aantal opmerkelijke responsen tot gevolg. Het fosforgehalte (figuur 4.17 a&b) leek voor Ci+ nagenoeg constant te blijven op het bereikte niveau; bij Ci- steeg het echter zeer snel. Waar de Ci+ conditie voor de incubatieomwisseling 25 dagen nodig had om zijn

69

fosforgehalte te verdrievoudigen, verviervoudigde na de herincubatie de Ci- conditie zijn fosfor­gehalte op slechts negen dagen.

Bij Elodea steeg het fosforgehalte net zo spectaculair in de Ei- conditie. Voor Ei+ daalde het fosforgehalte gestaag na de incubatieomwisseling. Het stikstofgehalte (figuur 4.17 c&d) bleef constant in de Ei+ conditie en begon opnieuw toe te nemen in de Ei- conditie. Bij Chara leken de stikstof­gehaltes niet systematisch te veranderen na de herincubatie.

Ook de veranderingen in opnamesnelheid zijn spectaculair. In Ci+, waar de opnamesnelheid nagenoeg constant was gebleven gedurende de volledige periode voor de preYncubatie, verdubbelde deze na de herincubatie om daar een plateau te bereiken. De opnamesnelheid van de Ci- conditie daalde geleidelijk maar snel tot ongeveer 25% van de waarde bij preYncubatie na negen dagen herincubatie.

Bij Elodea waren de veranderingen nog opzienbarender. De opnamesnelheid van de Ei+ conditie vertienvoudigde op 5 dagen, waarna ze op dit niveau stabiliseerde en terug een beetje afnam op experimentdag 45. In de Ei- conditie decimeerde de opname op 9 dagen tijd. Na 18 dagen in het fosfaatrijke medium te zitten werd bij zelfs netto efflux waargenomen bij de opnamecondities 200 en 750 /lgP rl. In de data-analysen werden de opnamesnelheden hiervoor manueel op 0 gebracht.

4.8 HET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

In een poging na te gaan of het fosforgehalte bij Chara een bovengrens kent werd een bijkomend experiment uitgevoerd waarbij de planten in de ene conditie aan zeer hoge fosfaatconcentraties werden blootgesteld (1.5 mgP rl); in de andere conditie werd Chara nogmaals uitge­hongerd. De nitraatconcentratie werd zodanig gekozen dat ze zeker vol­doende laag was om stikstoflimitatie tot stand te laten komen in de incubatie bij hoge fosforconcentratie.

Bij het bepalen van de stikstofge­haltes van het plantenmateriaal werd voor de vierde dag van het experiment (tweede meting) een fout gemaakt. Om niet aIle gegevens van deze metingsdag veri oren te laten gaan in de analyses werd een waarde voor het stikstofge­halte berekend door lineaire intrapolatie van de stikstofgehaltes van de omrin­gende metingsdagen (dag 1 en dag 14).

Figuur 4.22 toont de biplot die resulteerde uit de principaalcomponent­analyse. Opvallend zijn opnieuw de correlatie tussen C:P, N:P en opname-

70

0.8

0.6

0.4

0.2

dag

---- ............ /'"":.;;; "-

// ~ 00

/ ~

/ ·:14 // I 0-:14. /'

opijamesl1elheld /'

\._~ ./

\ \

-:2\ I 0-: I

I

5 or--=--__________ ~~~I--~r-~+~~----~ ~ I ~4

·0

·0.

.(J

-1.2

I C

1

I • t /

!.. .bio1'Tlass

-0.8 -0.6 -OA -0.2

I I

Factor 1

0.2

G;N

• +:~:4

C 0

+:4

0.4 0.6 0.8 '-2

Figuur 4.22 Biplot voor het fosforverzadigingsexperiment. Factor 1 verklaart 50% van de variabiliteit, factor 2 nog eens 35% (totaal 85%). De factorladingen van de verschillende variabelen zijn terug te vinden in tabel A.4.15 uit appendix 4. - -: Ci-; -: Ci+.

snelheid. De datapunten zijn duidelijk geclusterd volgens de verschillende meetdagen. De twee condi­ties bewegen zich ook in deze figuur snel weg van elkaar in functie van de tijd. De afbuiging die beide paden vertonen zijn grotendeels gevolg van het gebruik van de variabele incubatieduur (dag) in de factoranalyse. Ook in deze biplot liggen C:N en biomassa ongeveer tegenover de incubatietijd.

De +P conditie beweegt zich reeds vanaf de tweede meetdag (na 3 dagen preYncubatie) sterk weg van de cluster met C:P, N:P en opnamesnelheid.

De planten namen veel stikstof op (figuur 4.23.b); na de volle 28 dagen incubatie was hun stikstofgehalte opgelopen tot meer dan 160% van de initiele waarde. De planten van de -P conditie namen in het begin van de incubatie ook vlot nitraat op, maar deze opname stopte later.

Het koolstofgehalte van de Chara uit de +P conditie lag hoger dan dat van de -P conditie, ten gevolge van een plotse stijging tussen dag 1 en dag 4 van het experiment.

De fosforconcentratie van de planten neemt snel toe in de +P conditie. Na de volle 28 dagen bedroeg het fosforgehalte meer dan het tienvoudige dan bij de start van het experiment. De fosfor­concentratie van de -P conditie kent een wisselvallig patroon (figuur 4.23.a), wat zich zeer sterk uit in de C:P en N:P verhoudingen (figuur 4.23.c). De C:P en de N:P verhoudingen vertonen een nagenoeg identiek patroon, omdat be ide vooral bepaald worden door de grote verschillen in fosforconcentratie van het weefsel. In wat voIgt zal vooral de C:P verhouding gebruikt worden.

De snelheden van fosfaatopname (enkel gemeten bij 750 /lgP rl, figuur 4.23.d) verlopen volgens eenzelfde patroon als de C:P en de N:P verhoudingen, zoals de biplot reeds suggereerde. Ook in deze grafiek is het merkwaardige wisselvallige patroon dat we zagen in de C:P verhoudingen van de -P conditie terug te vinden (figuur 4.23.d). De opnamesnelheid vertoont dan ook een extreem significant lineair verband met de C:P verhouding van het plantenmateriaal (p < 0.000001) (figuur 4.23.e). De opnamesnelheid werd ook hier uitgezet in functie van het fosforgehalte (figuur 4.23.f). Het hyper­bolische verband tussen beide variabelen, dat we reeds eerder zagen (figuur 4.20), is weergegeven in de figuur.

0.30

~~ 0.25 (a)_+p

~o _.p

Q) Cl 0.20

Cl ~ 0.15 .e::

'" 0 0.10 .2 E

E O.OS

0.00

5 10 15 20 25 30

incubatietijd (dagen)

~ 5~-------------. ~f 4 (d) -+P

~ ~ --p

~~3~ E .8l 2 OJ Il. <:: '" §-2:1

5 10 15 20 25 30

incubatietijd (dagen)

1.25 Q)::::"" (b) "'3: 1.00 ~o

~ <1> '" 0.75 ~~

£z 0.50 '" -"" 0

Ui E 0.25 -+p

E --p

0.00

5 10 15 20 25 30

incubatietijd (dagen)

~ 5~-----------, 'iii :; (e) ~ ~E 4

;;; ~ 3 <1> 0

E .8l 2 '" ll. c:: 0> g.3 1

/0: 0• . .

• . o 300 600 900 1200 1600 1600

atomaire C:P verhouding

1800

0.. (e) -+p 1500

U --p

~ 1200

·ro 900 E 0 600 10

300

10 15 20 25 30

incubatietijd (dagen)

"C 5..,.---------------, .;:; :; (f)

~ ~E 4

;;;~3 <1>0

E .8l 2 "'Il. <:: 0> g-2;1

L :-. -~-,....--. . 0.00 O.OS 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

fosforgehalte (rrm::i PIg DV\?")

Figuur 4.23 Verloop van de nutrientengehaltes en de opnamesnelheid bij het Chara fosforverzadigings­experiment. (a) verloop van het fosforgehalte; (b) verloop van het stikstofgehalte; (c) verloop van de C:P verhou­ding; (d) verloop van de opnamesnelheid bij 750 IJgP 1-1; (e) opnamesnelheid in functie van de C:P verhouding. met de lineaire fit; (f) opnamesnelheid in funtie van het fosforgehalte. met de hyperbolische fit.

71

In de -P conditie is de opnamesnelheid duidelijk positief gecorreleerd met het stikstofgehalte van het plantenmateriaal (Pearson correlatie: p = 0.002; figuur 4.24.a) terwijl in de +P conditie (figuur 4.24.b) de opnamesnelheid geen patroon vertoont in functie van het stikstofgehalte (de eerste opname­dag niet te na gesproken - drie datapunten links in de scatterplot).

Zowel voor het Chara-Elodea experiment als voor het Chara fosforverzadigingsexperiment werd waargenomen dat de planten van de +P condities donkerder groen waren dan de planten van de -P condities. Bovendien was in het Chara fosforverzadigingsexperiment het plantenmateriaal van de +P conditie veel zwakker dan dat van de -P conditie. Vooral de kranscellen waren in de eerstgenoemde conditie veel gemakkelijker los te maken van het thallus. Geen van deze bijkomende waarnemingen werd gekwantificeerd.

(a)

~* • · . • • · : . 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.60

stikstofgehalte (mmol (g DVV)-1)

~ 5,--------------------------, ~t: ~'E 4 Q)~ ~ §' 3 "'0 ~ 9 2 Co.. Q.Cl1 02:

(b)

•

: O~--r-~---r--~~---r--'-~ 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.60 0.85 0.00

stikstofgehalte (mmol (g DVV)-1)

Figuur 4.24 Opnamesnelheid in functie van de stikstofconcentratie. (a) gegevens van de -P conditie, (b) gege­vens van de +P conditie_

72

BESPREKING

Omwille van de aanzienlijke omvang van de bespreking werd aan sommige punten een korte samenvatting toegevoegd.

5.1 DE OPNAME VAN FOSFOR DOOR CHARA GLOBULARIS

Ondergedoken macrofyten staan zowel in contact met het sediment als met de waterkolom en kunnen dus van de fosforpools aanwezig in beide compartimenten gebruik maken. Over het algemeen vertegenwoordigt het sediment in de meeste ondiepe meren een belangrijke fosforreserve (zie o.a. Raven (1981) en Scheffer (1998) voor een overzicht).

Het lijkt er echter op dat Chara geen, of slechts zeer weinig, fosfaat opneemt uit het sediment. De meeste vasculaire macrofyten doen dit weI, en meestal is het sediment zelfs de belangrijkste fosfor­bron (o.a. Carignan & Kalff, 1980; Rattray et al., 1991). Ook in vijver 19bis bevat het sediment waar­schijnlijk grote hoeveelheden fosfor (cf. 5.3). Dat de Chara globularis uit deze vijver waarschijnlijk geen fosfor opneemt uit het sediment blijkt uit het zeer lage fosforgehalte van het plantenmateriaal (gemiddeld ca. 0.025 mmol (g DWrl ;::; 0.08 massa% van het drooggewicht). Bij deze interne fosfor­concentraties bevindt het plantenmateriaal zich in fosforstress (cf. figuur 4.20 en latere bespreking in 5.8).

Te verklaren waarom Chara geen fosfor opneemt uit het sediment blijfi, op basis van de verza­melde gegevens, giswerk. Er kunnen in dit kader echter twee hypothesen vooropgesteld worden. De eerste is dat Chara niet in staat is fosfor op te nemen uit het sediment. Box (1986) toonde aan dat het rizoid van Chara hispida in staat was Pi op te nemen, maar dat de opname sterk terugviel bij anoxi­citeit van het incubatiemedium. In dense Chara-matten werd vastgesteld dat het sedimentoppervlak soms anaeroob is (Round, 1981). Ook in vijver 19bis werd met de diepte in de Chara-mat een gradient van afnemende aerobie vastgesteld (Wouter Rommens, ongepubliceerde gegevens). Het is mogelijk dat de combinatie van deze twee factoren de opname van fosfor uit het sediment verhindert.

Een tweede hypothese is dat Chara weI in staat is fosfor op te nemen uit het sediment maar dat dit fosfor het groeiende thallus niet kan bereiken. De Chara globularis van vijver 19bis vertoont immers basale sterfie. Dit fenomeen werd voor het eerst beschreven door Andrews et al. (1984). Deze basale sterfte houdt in dat de onderste internodia (bij de Chara uit vijver 19bis een vijftal) sterk senescent of afgestorven zijn. Het is waarschijnlijk dat transport van fosfor vanuit het rizoid naar het groeiende thallus sterk wordt gehinderd of onmogelijk wordt gemaakt door deze basale sterfie.

In het kader van de eerste hypothese kan men zich afvragen waarom er uit de anaerobe zone, waar veel fosfor in oplossing is (Scheffer, 1998), geen fosfaat ontsnapt naar de waterkolom. Mogelijk is ook hier de Chara-mat voor verantwoordelijk. Die zou immers een scherp afgelijnde grens kunnen veroor­zaken tussen een anoxische zone (vlakbij het sediment, in de zone van de bas ale sterfie) en een zuur­stofrijke zone (in de actieffotosynthetiserende zone van de vegetatiemat). Deze scherpe overgang zou, in het ijzerrijke water van vijver 19bis kunnen zorgen voor een uiterst efficiente resedimentatie van het vrijgekomen fosfor. Merk nogmaals op dat het bovenstaande in sterke mate hypothetisch is. Uitsluitsel geven in deze kwesties vraagt verder onderzoek.

73

Merk op dat de tweede hypothese enkel mag toegepast worden op dense Chara-matten waar de planten basale sterfie vertonen. Het rizold en de fosforpool uit het sediment kunnen wei een rol spelen in situaties waar geen basale sterfte optreedt (b.v. bij diffuse Chara-bedden of in vegetaties waar ook vaatplanten staan die de vorrning van dense bedden tegengaan) of bij kiemplantjes, waar helemaal geen sprake is van basale sterfie. In dit laatste geval is het zelfs heel waarschijnlijk dat het rizold een aanzienlijke bijdrage aan de fosforvoorziening levert (grate gelijkenis met de omstandigheden uit de experimenten van Littlefield & Forsberg, 1965 en Box, 1986).

Samenvatting: Op basis van de resultaten kan worden besloten dat in vijver 19bis het sediment waarschijnlijk een

belangrijke fosforreserve vertegenwoordigt. Nochtans lijkt het er sterk op dat de aanwezige Chara, in tegenstelling tot wat bij de meeste vaatplanten wordt waargenomen, geen fosfor opneemt uit het sedi­ment. In dit kader werden twee hypothesen gesteld. Enerzijds kan een zuurstofgebrek aanleiding geven aan slechte fosfaatopname uit het sediment. Anderzijds is het mogelijk dat basale sterfie geen transport van opgenomen fosfor naar het groeiende thallus toelaat.

5.2 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME

Tijdens de opname-experimenten voor de seizoenale opvolging werd gedurende ongeveer vijf uur de fosfaatconcentratie van het incubatiemedium opgevolgd. Deze ken de, over deze lange tijdspanne, een bij benadering exponentieel afnemend verloop. Aangezien echter de capaciteit tot fosfaatopname van het gebruikte plantenmateriaal snel afneemt bij incubatie in medium met hogere fosfaatconcen­traties (o.a. Muchhal & Raghothama, 1999; Dong et ai., 1999; Liu et al., 1998; eigen waamemingen­resultaten niet weergegeven), werd ervoor gekozen enkel de eerste drie a vier meetwaarden te gebrui­ken. Door de scatterplot van deze datapunten kon met zeer hoge nauwkeurigheid een rechte kon worden gefit.

De Michaelis-Menten scatterplots die voor Chara werden waargenomen wijzen op de aanwezig­heid van (minstens) twee opnamesystemen, een van hoge en een van lage affiniteit. Dit is overeen­komstig met wat in andere Characeae (Mimura et ai., 1998; Reid et ai., 2000) en ook in hogere planten wordt gevonden (o.a. Dunlop et al., 1997; Raghothama, 1999 en referenties hierin; Van Tichelen & Colpaert, 2000).

Bij Chara globularis Thuill. var. globularis (Breekbaar kransblad) lijkt het er sterk op dat het hoge affiniteitssysteem gelnhibeerd wordt als de fosfaatconcentratie van het opnamemedium 2000 IlgP rl (~ 65 11M) overstijgt (figuur 4.I.a). Dit werd niet teruggevonden bij Chara corallin a (Mimura et al., 1998; Reid et ai., 2000).

Het was, ten gevolge van dit fenomeen, niet moge­lijk door het volledige bereik van de gebruikte concen­traties (0 tot 10000 IlgP rl) zinvolle curven te fitten. De functies die door Borstlap (1983) werden voorgesteld (figuur 5.1), voldoen enkel voor situaties waar zulke inhibitie niet voorkomt. Het is, bij mijn weten, voorlopig niet bekend hoe zulke patranen best wiskundig worden beschreven.

74

V = Vmax . [Pi]medium Km + [Pi ]medium

V =Vmax.[Pi]medium e[p·]. [ .] +. I medium

K m + PI medium

V V max I . [Pi ]medium V max 2 . [Pi ]medium = + --==-=--~ Kml + [Pi ]medium Km2 + [Pi ]medium

Figuur 5.1 Gebruikte functies ter beschrij­ving van de fosfaatopname. Naar Borstlap, 1983.

Er werd gekozen om door het bereik 0 tot 2000 IlgP rl de curven voorgesteld door Borstlap (1983) te fitten. De curve die gebruikt wordt voor standaard Michaelis-Menten kinetica (figuur 5.1, bovemi.an) leverde goede r2-waarden. De curve met een bijkomende lineaire factor (figuur 5.1, mid­den) gaf resultaten van gelijkaardige kwaliteit. De derde functie die BorstIap voorstelde benaderde echter de resultaten het best (figuur 5.1, onderaan). Gebruik van deze functie bracht echter een ander, groot probleem met zich mee. In een aantal gevallen werden negatieve Kml-waarden gevonden.

Daarom werd geopteerd om in het bereik 0 tot 2000 IlgP rl de zeer goede benadering met een opnamesysteem te gebruiken (figuur 5.1, bovenaan). Hoewel dus duidelijk blijkt uit de resultaten dat twee opnamesystemen aanwezig zijn, wordt de kinetica wiskundig benaderd door een functie opge­steld voor de werking van een enkel enzym. Binnen het gebruikte bereik van fosfaatconcentraties is dit echter een zeer goede benadering van de gegevens, die ook door andere auteurs wordt aangewend (o.a. Dong et ai., 1999).

Aangezien het er sterk op lijkt dat bij de fosfaatconcentraties 5000 en 10000 JlgP I-I de fosfaat­opname door het opnamesysteem met hoge affiniteit tot nul is herleid, werd in de gegevenstabel voor de seizoenale opvolging van de ecologie van vijver 19bis de opnamesnelheid bij 5000 JlgP rl toege­voegd als maat voor de werkzaamheid en de mate van aanwezigheid van de lage affiniteits-transporter.

Samenvatting: Chara globularis bezit, net zoals andere charofYten en de hogere planten, een tweefazig opname­

systeem voor fosfaat. Het lijkt er zeer sterk op dat bij Chara globularis het opnamesysteem met hoge affiniteit ge"inhibeerd wordt bij hogere externe fosfaatconcentraties (> 65 11M). Er werd, om praktische redenen, gekozen om, ondanks het feit dat de opname tweefazig is, eenfazige Michaelis-Menten curven te fitten door de gegevens.

5.3 SEIZOENALE OPVOLGING

Op de gegevens over de seizoenale opvolging van enkele belangrijke abiotische en biotische componenten van vijver 19bis werd pricipaalcomponentanalyse (PCA) toegepast. Er werd zowel op de gegevens van het volledige jaar 2000 als op de gegevens van de maanden juli tot december van hetzelfde jaar een aparte analyse gedaan. Dit werd gedaan omdat enerzijds vanaf juli bijkomende gegevens werden verzameld over de nutrientinhoud van het plantenmateriaal (C:N:P verhoudingen). Anderzijds is het zo dat gedurende de eerste helft van het jaar de fosfaatopname-experimenten door een andere onderzoeker werden uitgevoerd (De Smedt, 2000). De eerder willekeurige patron en die werden waargenomen tijdens die eerste he 1ft van hetjaar stonden in contrast met het duidelijk patroon dat werd waargenomen gedurende de tweede he 1ft van het jaar en deden twijfels rijzen bij deze resul­taten.

De levenscyc1us van Chara lijkt een aantal ingrijpende invloeden te hebben op het systeem. Injuli sporuleerde de aanwezige Chara. Deze sporulatie werd gevolgd door senescentie en afsterven van de planten. In de maand van het afsterven van het plantenmateriaal (augustus) werd een veellagere zuur­stofverzadiging van het water waargenomen. Dit is waarschijnlijk een gevolg van de verminderde fotosynthese in combinatie met de persistentie van de aerobe afbraak van organisch materiaal in het water. Het is mogelijk dat deze aerobe afbraak door vrijzetting van organische stoffen uit het dood macrofYtweefsel (Graneli & Solander, 1988; Carpenter, 1980) wordt gestimuleerd.

75

Dat verminderde fotosynthese en/of persistente aerobe afbraak van organisch materiaal aan de basis ligt van de achteruitgang van de zuurstofconcentratie wordt verder gesuggereerd door het verloop van de CO2-concentratie, die tijdens de betrokken periode nagenoeg het dubbele bedroeg van de gangbare waarde.

In de herfst (september en oktober) werd een omvangrijke fosfaatpiek duidelijk. Bierbij is het opvaIlend dat nagenoeg aIle fosfor in de waterkolom aanwezig is als orthofosfaat. Bet is onmogelijk dat deze fosfaatpiek door uitlekking van fosfor uit de senescente Chara-planten wordt veroorzaakt. Een ruwe berekening op basis van de fosforinhoud van het plantenmateriaal in augustus, september en oktober wees uit dat, ten gevolge van uitlekking van Pi uit het plantenmateriaal, slechts ongeveer 30 IlgP rl in het water kon terechtkomen in de periode augustus-september en ongeveer 90 IlgP rl in de peri ode september oktober. De fosfaatpiek van september is echter aanzienlijk groter (ongeveer 900 IlgP rl).

Er moeten dus andere mechanismen werkzaam zijn geweest. De lage zuurstofverzadiging die werd waargenomen vanaf augustus heeft mogelijk een bijdrage in de vrijzetting van fosfor uit het sediment. Bet fosfaat in het sediment is aanwezig als onoplosbare Fe- en Al-zouten. Bij anoxiciteit worden echter ijzer en aluminium gereduceerd en is hun affiniteit voor fosfaat vee I kleiner. Op deze manier kunnen aanzienlijke hoeveelheden fosfor worden vrijgezet uit het sediment (Scheffer, 1998; Holtan et ai., 1988; zie ook 2.2 en in het bijzonder figuur 2.2.b). Deze hypothese kan echter niet met de beschikbare gegevens worden bevestigd. Onderzoek van de genomen bodemsta1en kan hier verdere evidentie leveren.

De fosforpiek uit de herfst is grotendee1s als orthofosfaat aanwezig. Dit betekent dat het fytop1ankton over deze tijdspanne niet in staat was het beschikbare fosfor op te nemen. De fyto­planktondensiteit was en bleef laag tijdens de herfst. Er moet een of andere beperkende factor voor fytoplanktongroei aanwezig zijn geweest gedurende deze maanden. Landers (1982; uit Graneli & Solander, 1988) yond in zijn experiment dat, na het afsterven van de macrofytvegetatie, de fyto­planktondensiteit weI toenam ten gevolge van de hogere nutrientconcentraties.

De uitgesproken densiteitspiek van cyanobacterien in de epifytongemeenschap gedurende de maanden september en oktober komt bijzonder goed overeen met de fosfaatpiek. Dat dit in een oorzaak-gevolg verband moet worden gezien is niet duidelijk. Enerzijds werd de groei van de cyano­bacterien ongetwijfeld gunstig be'invloed door de hoge fosfaatconcentratie, maar anderzijds is de late zomer en de vroege herfst vaak de peri ode waarin cyanobacterien van nature in hoge densiteit voor­komen (Jeppesen etai., 1999; Jupp & Spence, 1977).

De afname van de fosfaatconcentratie na de piek in september is niet eenvoudig te verklaren. Vanaf oktober, maar zeer duidelijk vanaf november was er plaatselijk hernieuwde groei van Chara. Deze hernieuwde groei zal ongetwijfeld een gedeelte van het fosfaat hebben weggenomen, maar kan, door opname alleen, niet instaan voor het verdwijnen van de volledige hoeveelheid fosfor, mede omdat Vmax laag is in die periode. Waarschijnlijk heeft de hernieuwde groei terug voldoende zuurstof in de vijver gebracht om het fosfor als ijzer- en aluminiumzout te do en neerslaan.

Uit de tweede biplot blijkt dat de maximale snelheid van fosfaatopname (V max) geen verband vertoont met het intern fosforgehalte van de plant. In het Chara-Elodea experiment en het Chara fosforverzadigingsexperiment vonden we echter weI een duidelijke correlatie tussen fosforgehalte en snelheid van fosfaatopname (cf. figuur 4.20). Bet fosforgehalte van Chara was echter zeer laag in het veld (verticale deel van het patroon in figuur 4.20) en vertoonde slechts weinig variatie (minimum 21

76

~mol P (g DWrI, maximum 24 ~mol P (g DWrI). Bij deze permanente fosforstress zullen ook andere factoren een invloed hebben op de opnamesnelheid (zie verder).

Er werd geen correlatie gevonden tussen het fosfaatgehalte van het plantenmateriaal enerzijds en Km en de opnamesnelheid bij 5000 ~gP I-I anderzijds. Van de fosfaattransporter met lage affiniteit vermoedt men sterk dat hij constitutief tot expressie komt (Furihata et aI., 1992; Raghothama, 1999). Uit deze gegevens blijkt dat deze constitutieve expressie niet onder invloed staat van de interne fosfor­concentratie.

De snelheid van de fosfaatopname door het hoge-affinteitssysteem wordt, voor planten die in fosforstress verkeren, eerder door de externe fosfaatconcentratie dan door het intern fosforgehalte gecontroleerd (Liu et al., 1998; Muchhal & Raghothama, 1999). Uit de gegevens blijkt dat de fosfaat­concentratie in de waterkolom geen invloed heeft op de snelheid van fosfaatopname van Chara globularis uit vijver 19bis, hoewel de planten zeer waarschijnlijk in hun groei beperkt waren door fosfor.

In dit kader kunnen drie mogelijke oorzaken naar voren worden geschoven. Eerst kan men stellen dat bij Chara andere mechanismen werkzaam zijn dan in de hogere planten die Liu et al. (1998) en Muchhal & Raghothama (1999) bestudeerden. Ongepubliceerde gegevens van Tetsuro Mimura tonen aan dat dezelfde fenomenen die bij hogere planten waargenomen worden ook bij Chara corallina voorkomen. Een tweede hypothese is dat geen verband kan worden gevonden tussen de opname­snelheid en de fosfaatconcentratie van het water omwille van de lage variatie die deze laatste vertoont. Uiteindelijk kan geopperd worden dat de prei"ncubatie in fosforloos medium gedurende de nacht voor het opname-experiment de verschillen in opnamesnelheid heeft uitgevlakt.

De vooropgestelde vraag, of er een verband bestaat tussen opnamesnelheid enerzijds en interne en externe fosforconcentraties anderzijds, kan niet uit de verzamelde gegevens worden beantwoord. Waarschijnlijk heeft dit vooral te maken met de geringe variatie van de fosforconcentraties in water­kolom en weefsel. Aan de hand van de waargenomen patronen van fosfaatopname is het aanneme­lijker deze in verband te brengen met ontwikkelingsstadia van de planten. Er werden hoge opname­snelheden waargenomen in de peri ode van sporulatie en in de peri ode van de heraanvatting van de groei in de late herfst en de vroege winter.

In dit verband is verder onderzoek gewenst. Enclosure-experimenten met manipulatie van de externe fosforconcentratie kunnen hier een uitweg bieden. Deze laten toe om bij planten van hetzelfde ontwikkelingsstadium de snelheid van fosfaatopname enkel in functie van de externe (en interne) fosforconcentratie te beschouwen. Ze laten tegelijkertijd toe te controleren of het inderdaad de ontwikkelingscyc1us is die verantwoordelijk is voor de waargenomen patronen.

Merk uiteindelijk op dat het gevaarlijk is de waargenomen kinetische kenmerken te extrapoleren naar het fosfaatopname in het veld. In het laboratorium werd immers gewerkt onder constante licht- en temperatuursomstandigheden. Deze variabelen veranderen echter in veldomstandigheden, met aan­zienlijke invloed op energiebeschikbaarheid en werkingssnelheid van de transporters. Dat energie­beschikbaarheid een duidelijke invloed heeft op de fosfaatopname werd door Reid et al. (2000) aangetoond voor Chara corallina. Het vooropgestelde doel, namelijk om na te gaan welke invloed interne en externe fosforconcentratie hebben op de snelheid van fosfaatopname, kon echter enkel bereikt worden door te werken bij con stante incubatieomstandigheden.

77

Samenvatting: De levenscyclus van Chara, de dominante macrofyt in vijver 19bis, heeft een grote invloed op het

ecosysteem. Dit blijkt uit de drastische veranderingen die de abiotische kenmerken ondergingen na de senescentie en het afsterven van de planten. In deze peri ode werd een omvangrijke fosfaatpiek waar­genomen in de waterkolom. Deze wordt toegeschreven aan anoxische fosfaatvrijzetting uit het sedi­ment.

De kinetische parameters van de fosfaatopname konden niet in verband worden gebracht met de fosforconcentratie van het water, noch met die van het plantenmateriaal. Oat de interne fosforconcen­tratie weinig invloed heeft op de opnamesnelheid is waarschijnlijk: het plantenmateriaal beyond zich gedurende het volledige jaar in fosforstress. Onder fosforstress staat de snelheid van fosfaatopname van planten vooral onder controle van de externe fosforconcentratie. Oat ook hiermee geen verband werd gevonden is waarschijnlijk te wijten aan de geringe variatie die ze vertoonde. De enige variabele waarmee de opnamesnelheid correlatie vertoonde was de ontwikkeling van de plant. De opname­snelheid was hoog bij sporenvorming en intense groei van jonge scheuten. Er worden enclosure-expe­rimenten voorgesteld om de invloed van de interne en externe fosforconcentratie verder uit te diepen.

5.4 DE INVLOED VAN NA + EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME

Het kation waarmee het fosfaat wordt toegediend speelde wei degelijk een rol in de inleidende experimenten (cf. 4.3.1). Bij lage fosfaatconcentraties in het medium verliep de opname steeds sneller als fosfaat werd toegediend als K3P04 • Bij hoge fosfaatconcentraties werd in december waargenomen dat K+ een gunstiger effect had dan Na+ de fosfaatopname; in november was dit omgekeerd. Er werden geen seizoenale variaties gevonden die verantwoordelijk kunnen zijn voor dit verschil.

Verder werden twee experimenten uitgevoerd om na te gaan welke invloed de natriumconcen­tratie heeft op de opnamesnelheid, een met en een zonder voorafgaande natriumuithongering. De fosfaatopname is duidelijk hoger in de conditie met natriumuithongering.

Oat door natriumuithongering de fosfaatopname gestimuleerd wordt geeft een aanw1Jzmg in verband met de aard van het transmembranair transport van fosfaat. Ais de fosfaattransporter immers ook een natriumtransporter is, zal deze bij natriumstress worden gei"nduceerd. Tetsuro Mimura en Robert Reid (pers. med.) von den zeer recent gelijkaardige fenomenen bij Chara corallin a, waar reeds Na+IPi cotransport werd aangetoond (Reid et aI., 2000).

Wat betreft het waargenomen patroon van fosfaatopname in functie van de natriumconcentratie (figuur 4.7) kan worden besloten dat de opnamesnelheden globaal gezien het hoogst liggen in de con­dities met I en 2 mM natrium. Bij hogere natriumconcentraties werd een duidelijke afname van de fosfaatopname vastgesteld. In afwezigheid van natrium was de opnamesnelheid hoger dan in aan­wezigheid ervan in de conditie zonder prei"ncubatie; in de conditie met prei"ncubatie daarentegen was de opnamesnelheid lager in de 0 mM Na+ conditie. Heel waarschijnlijk wijst dit op een onnauw­keurigheid in het experiment.

Het plantenmateriaal werd in de cuvetten gebracht zonder voorafgaande spoeling in gedesioni­seerd water. Zo heeft de aan- of afwezigheid van natrium in het oorspronkelijke medium (standaard APW in het geval van het experiment zonder prei"ncubatie, APW zonder Na+ in het geval van de natriumuithongeringsconditie) waarschijnlijk een invloed gehad op de opname. Deze hypothese wordt bevestigd door het derde experiment (4.3.3), waarbij, na spoelen van het p lantenmateriaal in gedes-

78

ioniseerd water, de opnamesnelheden bij afwezigheid van Na+ telkens lager waren dan die bij aan­wezigheid ervan.

Uiteindelijk werd nog een experiment uitgevoerd om zowel de invloed van Na+ als K+ op de fosfaatopname na te gaan, deze keer zonder Na+-contaminaties. De opnamesnelheid nam duidelijk toe in aanwezigheid van natrium. De verschillen waren vooral groot in de condities waar preYncubatie gebeurde in standaard APW. Dit komt overeen met wat eerder reeds werd vastgesteld, namelijk dat de snelheid van fosfaatopname toeneemt als de planten natriumuitgehongerd worden (condities 1 en 4 tegenover 7 en 10).

De hier vastgestelde resultaten komen overeen met de resultaten van Reid et al. (2000). Zij vonden dat toediening van 0.4 mM Na+ een significant stimulerend effect had op de snelheid van fos­faatopname bij Chara corallina.

Het is wei van belang op te merken dat de verschillen tussen de condities met 0 en 1 mM Na+ vee I kleiner zijn dan in het experiment met C. corallin a (Reid et al., 2000). Er kunnen twee oorzaken aan de basis liggen van dit verschil. Ten eerste werd in het experiment van Reid et al. (2000) 0.4 mM Na+ toegediend. Mogelijk wordt de fosfaatopname reeds bij 1 mM Na+ ge"inhibeerd.

Een tweede mogelijkheid is dat het verschil tussen beide experimenten te wijten is aan het gebruik van andere soorten. Bij C. corallin a staat de grote intemodiumcel in direct contact met het exteme medium, terwijl deze bij C. globularis bedekt wordt door een laag cortexcellen. Dit kan tot gevolg hebben dat er bij het spoelen van het plantenmateriaal toch nog Na+ aanwezig blijft in de intercellu­laire matrix. Het is ook mogelijk dat de cortexcellen en de kranscellen, die in het experiment van Reid et al. (2000) niet aanwezig waren, het afwijkende gedrag verklaren. Een derde mogelijkheid in verband met het gebruik van andere soorten is dat bij C. globularis, hier geoogst uit zoet water, het W/Pi transportsysteem sterker tot expressie komt dan het Na+/Pi transportsysteem. Mimura en mede­werkers vonden recent dat dat bij C. corallina naast het Na+lPi cotransportsysteem ook genetische code voor een W/Pi transporter aanwezig is (Tetsuro Mimura, pers. med.).

Samenvatting: De fosfaatopname van Chara corallina, een soort uit brak water, is natriumgemedieerd (Reid et

al., 2000). Dit betekent niet dat ook Chara-soorten uit zoet water dit Na+/Pi cotransport vertonen. Nochtans werd bij Characeae uit zoet water reeds cotransport van een aantal andere stoffen met Na+ aangetoond (o.a. Walker & Sanders, 1991).

Aanwezigheid van natrium in het opnamemedium had ook bij Chara globularis een stimulerend effect op de snelheid van fosfaatopname. Bovendien werd de fosfaatopname gestimuleerd door natriumuithongering. Uit deze resultaten kan echter niet besloten worden dat ook hier de fosfaat­opname gebeurt via Na+lPi cotransport. De kaliumconcentratie bleek van ondergeschikt belang aan de natriumconcentratie.

5.5 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

Uit de experimenten die trachtten de natrium- en kaliumconcentraties aan de fosfaatopname te koppelen bleek reeds een duidelijke invloed van de aanwezigheid van natrium. Mimura en mede­werkers toonden aan dat het genoom van Chara coral/ina zowel codeert voor een Na+/Pi cotransporter

79

als voor een H+ (Pi cotransporter. In een poging de aard van het transmembranair transport bij Chara globularis te achterhalen werd een kortetermijn experiment uitgevoerd.

Er gebeurde duidelijke fosfaatopname in de experimenten. De pH van het medium zakte lichtjes in aIle experimenten bij de fosfortoediening. Sakano (1990) nam, in een systeem met protoncotrans­port, waar dat de pH van het medium sterk steeg bij fosfortoediening. Er moet dus besloten worden dat in deze experimenten met Chara globularis waarschijnlijk geen protoncotransport plaatsgrijpt.

De natriumbepalingen in het opnamemedium zijn echter onvoldoende nauwkeurig om een cotransport te bewijzen. Om ondubbelzinnig aan te tonen dat de opname van fosfaat natriumgeme­dieerd is, zuIlen dus andere methoden moeten worden gevonden. Het gebruik van radioactief natrium e2Na) zal vee I nauwkeurigere resultaten opleveren en laat toe zowel de radioactiviteit van het het medium als van het plantenmateriaal op te volgen. Deze methode werd door Reid et al. (2000) met succes toegepast op gei"soleerde intemodiumceIlen van Chara corallina.

Samenvatting: Ook in deze experimenten kon niet worden bewezen dat de fosfaatopname via een Na+lPi trans­

porter verloopt. De resultaten suggereren weI dat protoncotransport onwaarschijnlijk is. Bijkomende experimenten waarin 22Na wordt gebruikt, kunnen oplossing bieden.

5.6 INVLOED VAN DE pH OP DE SNELHEID VAN FOSFAATOPNAME

De adaptatie van het plantenmateriaal aan de opgelegde pH verliep voor de meeste condities vrij vlot. Na drie a vier dagen was de pH meestal nagenoeg stabiel.

Bij de extreme pH-condities werd voor het Czp experiment afwijking van de oorspronkelijke pH­waarde waargenomen (figuur 4.1 O.a). Aangezien voor het bepalen van de opnamesne1heden slechts de eerste datapunten, waardoor een rechte kon worden gefit, werden gebruikt (cf. 5.2), zal de invloed van deze pH-variaties eerder klein zijn. Bij de andere pH-experimenten werd weinig afwijking van de beoogde pH-waarden waargenomen.

De fosfaatopname blijkt voor Cmp en Czp significant verschillend bij verschillende pH-waarden. De waargenomen patronen zijn bovendien verschillend bij de verschillende fosfaatconcentraties in het opnamemedium. In de 200 IlgP rl conditie werd eerder een afname van de opnamesnelheid gevonden met toenemende pH. Bij de 750 en 2000 IlgP rl condities werd echter een duidelijk optimum van de opnamesnelheid gevonden bij intermediaire pH-waarden. Deze gegevens komen niet overeen met het pH-optimum dat waargenomen werd voor de proton-fosfaat transporters (dit bedraagt 4.5 a 5) (Raghothama, 1999).

De waargenomen patronen van fosfaatopname zijn erg gelijkend aan wat Box (1986) vond voor het rizoid van Chara hispida. Het patroon dat door Reid et al. (2000) werd gevonden voor de fosfaat­opname van Chara coral/ina was duidelijk anders. Hier nam de opname af met toenemende pH. Het lijkt er sterk op dat bij Chara globularis de voorkeur voor opname van H2P04 - boven sterker geYoni­seerde vormen van Pi veel kleiner is dan bij Chara corallina.

Ook voor Nitella blijkt de fosfaatopname gemiddeld genomen optimaal te verlopen bij inter­mediaire pH. De opnamesnelheid was opmerkelijk hoger bij Chara (Czp) dan bij Nitella. Ais de

80

interne fosforconcentraties van beide so orten echter gei'nterpreteerd worden naast figuur 4.20 met de resuItaten van het Chara-Elodea experiment en het Chara fosforverzadigingsexperiment, moet men tot de conclusie komen dat deze verschiIlen eerder hieraan gebonden zijn dan aan intrinsieke ver­schillen in fosfaatopname tussen beide soorten.

Hoewel de pH in natuurlijke waters sterk varieert (dag-nacht cyclus), zou deze een aantal ecolo­gische consequenties kunnen hebben voor de fosfaathuishouding van het meer. Naast het belang van de pH voor het evenwicht van de fosforconcentraties in het sediment en de waterkolom (Scheffer, 1998), is hier dus ook een invloed op de fosfaatopname door macrofYten aangetoond.

Samenvatting: De fosfaatopname van de onderzochte soorten verloopt globaal genom en optimaal in het centrale

deel van het onderzochte bereik. De voorkeur voor laaggei'oniseerd Pi (H2P04 -) is zwakker dan bij Chara corallina. Waarom de patronen in opnamesnelheid verschillen bij de verschillende fosfaat­concentraties in het opnamemedium blijft onduidelijk. De lagere opnamesnelheid die Nitella ver­to on de was waarschijnlijk te wijten aan het grote verschil in fosforstatus van het plantenmateriaal en niet aan soortspecifieke verschillen.

5.7 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSF AA TUITHONGERING

Er werd aangetoond dat de fosfaatopname van Chara met hoog intern fosforgehalte, dat gei'ncu­beerd was bij 1500 f.lgP rl (experiment parallel met het fosforverzadigingsexperiment), significant hoger was als de planten voor het opname-experiment een prei'ncubatie in fosforloos medium onder­gingen. De opnamesnelheid nam nochtans lang niet zoveel toe dat ze in de buurt kwam van de -P conditie van het fosforverzadigingsexperiment.

Het blijkt dus dat het opnamesysteem met hoge affiniteit bij Chara globularis geactiveerd wordt door gedurende korte periodes exteme fosforstress aan te leggen. Dit is consistent met de gegevens over andere planten en wieren (Liu et al., 1998; Muchhal & Raghothama, 1999; Wykoff et al., 1999; Dong et al., 1999; Raghothama, 1999). De resultaten van het Chara-Elodea experiment en het Chara fosforverzadigingsexperiment werden waarschijnlijk slechts weinig bei'nvloed.

5.8 HET CHARA-ELODEA EXPERIMENT

Het Chara-Elodea experiment is het eerste uit het derde luik van het voorgesteld onderzoek. Het doel was de patronen die de nutrientgehaItes en de fosfaatopname vertonen bij fosforuithongering en fosforaanrijking in verband te brengen met de groeistrategieen van beide so orten en aldus een zicht te krijgen op de competitieve sterkte bij eutrofiering. In de bespreking van het Chara-Elodea experiment zullen regelmatig resuItaten uit het Chara fosforverzadigingsexperiment worden aangehaald.

Chara en Elodea houden er een andere groeistrategie op na. Chara globularis vormt typisch dense bedden, waarbij het grootste deel van de biomassa zich dicht bij de bodem van het meer bevindt. De soort vertoont trage apicale groei, die vaak gecompenseerd wordt door basale sterfte (Andrews et al., 1984). De tum-over snelheid van biomassa (en dus ook nutrienten) is laag.

81

Elodea nutallii, een exoot in onze streken, groeit uitgesproken sneller, en zal vanop de bodem snel naar de oppervlakte groeien en daar het grootste gedeelte van zijn biomassa produceren. De snelle en persistente groei geeft in de bovenste waterlaag aanleiding aan een dichte vegetatiemat. De tum-over snelheid van biomassa (en nutrienten) is hoog.

Bij fosforuithongering van Chara bleefhet fosforgehalte nagenoeg constant terwijl het bij Elodea weI aanzienlijk daalde. Waarschijnlijk was dit een gevolg van het feit dat de Chara bij aanvang van het experiment onder sterkere fosforstress stond dan de Elodea. De Elodea uit de fosforuithongerings­conditie bleef groeien en waarschijnlijk herverdeelde het hiertoe de reserve aan fosfor.

Bij vergelijking van de fosforaanrijkings- en -uithongeringscondities zien we dat het stikstof­gehalte voor elke soort toeneemt in beide condities, maar dat deze toename in de uithongerings­condities snel een plateau bereikt. Dit lijkt overeen te komen met de hypothese van Shaver & Melillo (1984; uit Graneli & Solander, 1988), die zegt dat luxe-opname van een element element geremd wordt als een ander element limiterend is. Hierbij moet weI opgemerkt worden dat het stikstofgehalte niet aIleen functie is van luxe-opname en reserveopslag maar bijvoorbeeld ook van herverdeling na groei.

De N:P gehaltes van het plantenmateriaal zijn sterk variabel bij Chara, terwijl deze bij Elodea binnen veel striktere grenzen blijven. De sterke variatie van de N:P gehaItes in Chara zijn in eerste plaats toe te schrijven aan de sterke toename van het fosforgehalte in de +P conditie. De stikstof­gehaIten varieren amper bij Chara. De N:P verhouding van Elodea blijft binnen veel nauwere grenzen, ondanks sterk variabele stikstof- en fosforgehaltes van het plantenmateriaal.

De N:P verhouding die voor Elodea werd waargenomen blijft niet aIleen binnen strikte grenzen, ze is gemiddeld ook veel lager dan die voor Chara. Hoewel planten van nature zeer uiteenlopende nutrientgehaltes kunnen vertonen ten gevolge van hun ongebalanceerde groei (Elser et al., 2000a), komen lage N:P verhoudingen globaal gezien overeen met snelgroeiende soorten (Elser et al., 1996 en 2000a). Gedurende het experiment werden inderdaad duidelijke verschillen in groeisnelheid waar­genomen. Elodea groeide zowel in de fosforuithongerings- als -aanrijkingsconditie veel sneller dan Chara.

Indien de nauwe grenzen waarbinnen de N:P van Elodea varieert genetisch bepaald zijn, heeft dit belangrijke consequenties voor zijn concurrentiele positie. Het zal immers relatief fosforrijke waters nodig hebben om de macrofytvegetatie efficient te domineren. In fosforgelimiteerde vijvers zal Elodea het lastiger hebben. Merk hierbij weI op dat Elodea bij lage fosforconcentraties in het water in staat is fosfor uit het sediment op te nemen (Carignan & Kalff, 1980; Bristow & Whitcombe 1971). Verderop wordt nog dieper ingegaan op de fosforminnende aard van Elodea.

In figuur 4.20 wordt gesuggereerd dat de grens van interne fosforconcentratie onder dewelke verhoogde fosfaatopname (fosforstress) optreedt, een fysiologische constante is voor het ecotype (of de soort). Beide curven voor Chara stijgen immers vanaf ongeveer dezelfde fosforconcentratie. In dit verband is echter verder onderzoek wenselijk. De huidige experimenten werden immers uitgevoerd met Chara uit slechts een vijver, zodat het enige verschil tussen de planten van het Chara-Elodea experiment en het fosforverzadigingsexperiment is dat ze met een maand verschil werden geoogst. Elodea kwam uit een andere vijver.

Hoewel de fosforconcentratie vanafwaar fosforstress optreedt nagenoeg gelijk is voor beide expe­rimenten met Chara, verschilt de minimale opnamesnelheid (bij relatief hogere interne fosfaat-

82

concentraties) weI. In dit verband kunnen drie hypothesen naar voren worden gebracht. De eerste is dat er een seizoenaal effect waar te nemen is. Het plantenmateriaal voor het Chara-Elodea experiment werd een maand vroeger geoogst dan dat voor het verzadigingsexperiment. Dat de planten bij het bereiken van het horizontaal deel van de grafiek reeds geruime tijd onder laboratoriumomstandigheden waren ondergebracht, ontkracht deze hypothese enigszins.

Een tweede mogelijkheid is een verschil in de incubatiecondities. Voor het Chara-Elodea experi­ment werd het plantenmateriaal voor de fosforaanrijkingsconditie gelncubeerd in APW met 750 )lgP r I en 5 mgN rl. Voor dezelfde conditie van het fosforverzadigingsexperiment waren de incubatie­omstandigheden drastischer: er werd gebruik gemaakt van APW met 1500 )lgP rl en slechts 2.5 mgN I-I. Het is voor hogere planten geweten dat de fosforconcentratie van het medium een invloed heeft op de fosfaatopname (o.a. Liu et aI., 1998; Muchhal & Raghothama, 1999).

Een laatste hypothese in dit verband is dat een eventueel verschil in protelnegehalte (fosfaat­transporters) de verschillen in opnamesnelheid zou veroorzaken. In de uithongeringsconditie van het verzadigingsexperiment was N immers de beperkende factor in het medium. De stikstofgehaltes (geen protelnegehaltes) zijn inderdaad lager in het verzadigingsexperiment (gemiddeld ongeveer 0.7 mmol (g DWrl tegenover ongeveer 1.0 mmol (g DWrl voor het Chara-Elodea experiment).

Verdere analyse van de resultaten uit het Chara-Elodea experiment tonen een correlatie tussen het stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de fosfaatopname, in de eerste plaats voor de -P condities. Of dit zonder meer in een oorzaak-gevolg verband mag worden gezien is niet af te leiden uit de resul­taten. Hoewel het stikstofgehalte (via het protelnegehalte) ongetwijfeld een invloed uitoefent op de fosfaatopname, covarieerden in de hier besproken condities de graad van fosforuithongering en het stikstofgehalte. Dit laat dus niet toe te besluiten dat de toename van de snelheid van fosfaatopname enkel gevolg is van hogere stikstofgehalten.

Bij de incubatieomwisseling werden een aantal interessante waamemingen gedaan. Ten gevolge van de hoge opnamesnelheden die werden bereikt gedurende de fosforuithongering, nam het fosfor­gehalte van de planten uit de i- condities zeer snel toe na de incubatieomwisseling. De opname­snelheid zakt tamelijk snel bij Elodea, bij Chara eerder traag. De fosforuithongering die vanaf de incubatieomwisseling wordt opgelegd aan het plantenmateriaal van de i+ condities maakt dat de opnamesnelheden zeer snel stijgen en deze hoge waarden aanhouden. De respons is minder uitge­sproken bij Chara dan bij Elodea.

Het is duidelijk dat na de incubatieomwisseling andere factoren de snelheid van fosfaatopname controleerden dan ervoor. In de i+ condities, waar de opnamesnelheid mooi gecontroleerd leek door het fosforgehaite het plantenmateriaal, steeg plots de opnamesnelheid met een factor 2 voor Chara en met een factor 10 voor Elodea, terwij I de fosforgehaltes niet aanzienlijk veranderden. Dit is in over­eenkomst met de resultaten uit de literatuur (Clarkson & Scattergood, 1982; Muchhal & Raghothama, 1999; Dong et al., 1999) en wijst er duidelijk op dat de exteme fosforconcentratie van groot belang is voor de opnamesnelheid.

Het is erg waarschijnlijk dat de hoge snelheden van fosfaatopname die ontstonden bij de fosfor­uithongering gevolg zijn van verhoogde expressie van de genen coderend voor de fosfaattransporters met hoge affiniteit (Muchhal & Raghothama, 1999; Dong et al., 1999). Deze kunnen op korte termijn (dagen tot uren) sterk in aantal toenemen door 'de novo' synthese.

Ook de afname van de opnamesnelheid, die werd waargenomen bij toediening van fosfaat aan het groeimedium van fosforuitgehongerde planten, komt overeen met de resultaten uit de literatuur. Dat de

83

terugval van de opnamesnelheid een nagenoeg perfect exponentieel verloop kent, steunt de hypothese dat de sterke verhoging van het fosforgehalte van de planten (soms tot toxische niveaus, cf. Cogliatti & Clarkson, 1983), een gevolg is van een eerder lage turn-over snelheid van de fosfaattransporters uit de membraan (Dong et aI., 1999; en referenties daarin). Bij Chara nam de opnamesnelheid veeI trager af dan bij Elodea.

Vooraleer in te gaan op een aantaI ecologische aspecten van de waarnemingen, wordt nog een bedenking gemaakt bij het model van Koerselman en Meuleman (1996) dat de N:P verhouding van de vegetatie koppelt aan de aard van nutrientlimitatie.

Koerselman & Meuleman (1996) stelden voor een gamma Europese moerasvegetaties (vennen, moerassen, natte heide) een model op om te bepalen of de groei van het plantenmateriaal in natuurlijke omstandigheden in fosfor-, stikstof- of cogelimiteerd was door beide. Ze vonden voor de door hen gebruikte gegevens kritische massa-N:P waarden van 14 en 16. Dit komt ongeveer overeen met atomaire verhoudingen van 31 en 35.5. Voor N:P verhoudingen onder de eerste waarde von den zij stikstofgelimiteerde groei, voor verhoudingen hoger dan de tweede waarde fosforgelimiteerde. In wat voIgt worden enkel nog atomaire N:P verhoudingen besproken.

Als we de snelheid van fosfaatopname gebruiken als maat voor fosforlimitatie, kunnen we, afgaande op het waargenomen patroon tussen opnamesnelheid en N:P gehalte bij Elodea (figuur 4.2l.c), besluiten dat deze soort reeds vanaf een inwendige N:P verhouding van ongeveer 12.5 fosfor­limitatie ondervond. Voor Chara (figuur 4.21.d) werd geen duidelijke stijging van de opnamesne1heid waargenomen vanaf een welbepaalde N:P verhouding. Mogelijk was het plantenmateriaal de heIe tijd in fosforstress. Dit laatste word alleszins gesuggereerd door figuur 4.20 waar, voor het Chara verzadi­gingsexperiment, een diepteplateau van de fosfaatopname wordt waargenomen na een tijdje incubatie in de +P conditie. Dit diepteplateau werd, waarschijnlijk door de minder drastische behandeling, niet bereikt in de Ci+ conditie van het Chara-Elodea experiment.

Dat het model van Koerselman en Meuleman niet overeenkomt met de gegevens voor Elodea uit deze studie kan een aantal verschillende oorzaken hebben. Zo is het mogelijk dat niet gedurende het hele experiment aan de assumpties voor het gebruik van het model werd voldaan. Er moet nameIijk op elk ogenblik ofwel fosforlimitatie, ofwel stikstoflimitatie, ofwel een combinatie van deze twee voor­komen. Hoewel dit waarschijnlijk het geval was, kan men dit niet zonder meer aannemen.

Een tweede oorzaak voor het verschil tussen beide studies is dat Koerselman & Meuleman zich toelegden op moerasplanten. Deze staan in contact met de bodem en halen het merendeeI van hun nutrienten hieruit. De situatie in 'eehte' aquatisehe systemen en in dit experiment is anders. Elser et al. (2000b) haalden bovendien aan dat mogelijk de ideale N:P verhouding lager is voor limnetische sys­temen dan voor terrestrisehe. Op eventuele oorzaken hiervoor werd niet ingegaan.

Enkel op basis van gegevens voor een soort het model van Koerselman & Meuleman (1996) ver­werpen of aanpassen is onzinnig. Binnen eenzelfde vegetatie vertonen verschillende soorten immers vaak andere, soms sterk afwijkende, N:P verhoudingen (Koerselman & Meuleman, 1996).

Door vergelijking van de waarnemingen bij Chara en Elodea kan worden bevestigd dat Elodea een fosforminnende soort is, of dat ze tenminste geadapteerd is aan relatief fosforrijk water. Een eerste waarneming is dat bij fosforuithongering het fosforgehalte van Elodea duidelijk afnam terwijI het bij Chara nagenoeg constant bleef. Dit mag echter niet zonder meer gei"nterpreteerd worden alsof Chara beter in staat is het aanwezige fosfor vast te houden. Waarschijnlijk is dit eerder gevolg van hun andere groeistrategieen die zieh ook in het laboratorium uitten: de Nitella groeide duidelijk sneller, en

84

de lagere fosforgehalten in het weefsel zijn dan ook waarschijnlijk grotendeels te verklaren door her­verdeling van het fosfor.

Ook figuur 4.20 wijst op de fosfonninnende aard van Elodea. Het weefsel reageert reeds bij veel hogere fosforgehalten op fosforuithongering door de opnamesnelheid te verhogen. Men zou dit patroon echter ook kunnen toeschrijven aan de verschillende achtergrond van beide soorten (Chara uit vijver 19bis, Elodea uit bomkrater). Deze mogelijkheid wordt gedeeltelijk ontkracht door de fosfor­concentraties van beide waters, die nagenoeg gelijk zijn (zelfs iets hoger in vijver 19bis). Verder onderzoek is in dit verband gewenst.

Een algemene waarneming bij de incubatieomwisseling is dat de opnamesnelheid bij Elodea sneller reageert op de veranderende omstandigheden dan bij Chara. Dit blijkt vooral bij fosforuit­hongering van de i+ conditie. Ondanks het hoge fosforgehalte van het plantenmateriaal verhoogt Elodea in deze omstandigheid zeer snel de opnamesnelheid. Men zou de hypothese kunnen stellen dat het net aan dit hoge fosforgehalte te danken is dat er zo snel kan worden gereageerd. Hoge fosfor­concentraties komen immers overeen met grote hoeveelheden rRNA (Elser et al., 1996 en 2000a) en Iaten op die manier snelle aanmaak van fosfaattransporters toe.

Ook de afname van de opnamesnelheid gebeurt sneller bij Elodea dan bij Chara, al is hier het verschil niet zodanig groot. Waarschijnlijk is de tum-over van membraanproteYnes groter bij Elodea. De snelheid van de reactie op cellulair vlak, zoals hierboven beschreven, komt goed overeen met die van de reactie op het niveau van de volledige plant. Elodea is een snel groeier, met hoge turn-over van biomassa, Chara groeit veel trager. Elodea zal, bij fosfaataanrijking, op korte tijd veel biomassa aan­maken, Chara niet.

Ais Chara en Elodea blootgesteld worden aan eutrofiering zijn beide soorten in staat zijn een aan­zienlijke hoeveelheid fosfor op te slaan in hun weefsels en op die manier de heldere toe stand te bufferen (o.a. Scheffer, 1998). Chara is echter niet in staat de fosforaanrijking om te zetten in snellere groei. Dit betekent dat, als Chara en Elodea samen voorkomen in een vijver, Elodea bij eutrofiering sterk zal bevoordeeld zijn. Dit wordt bevestigd door waarnemingen uit het veld: bij eutrofiering wordt Chara vaak overwoekerd door Elodea (Luc Vervoort en Wouter Rommens, pers. med.).

Hetzelfde geldt voor fytoplankton. Bij fosforaanrijking wordt de groei van het fytoplankton sterk gestimuleerd (o.a. Forsberg et aI., 1990, Jeppesen et al., 2000). Hierdoor worden de ondergedoken waterplanten beschaduwd (o.a. Scheffer et al., 1993). Ook in dit geval zal Chara meer nadeel onder­vinden dan Elodea aangezien bij Chara het grootste deel van de biomassa kort bij de bodem van de vijver zit en Elodea dichter aan het wateroppervlak groeit. Het is echter mogelijk dat Chara, bij middel van allelopathie, het hoofd kan bieden aan het fytoplankton (Wium-Andersen et al., 1992; Kleiven, 1991).

Samenvatting: De opnamesnelheid bleek duidelijk gecorreleerd met de inwendige fosforstatus van de plant.

Elodea lijkt gevoeliger aan fosforstress dan Chara. Het verhoogt reeds zijn fosfaatopname als het inwendig fosforgehalte afneemt onder 0.3% van het DW. Chara doet dit pas als het fosforgehalte onder de 0.15% van het DW zakt.

De N:P verhouding van het weefsel is bij Elodea tamelijk constant en veel lager dan bij Chara, wat in overeenstemming lijkt met de groeistrategie van beide soorten.

Bij fosforstress is de snelheid van fosfaatopname gekoppeld aan het stikstofgehalte van het plantenmateriaal. Of dit in een oorzaak-gevolg verband moet worden gezien is echter niet duidelijk.

85

De fosfaatopname van Elodea reageert sneller op veranderende omstandigheden dan die van Chara. Waarschijnlijk is Elodea, door toedoen van zijn lage N:P verhouding, in staat op korte tijd veel fosfaattransporters te produceren. Vermoedelijk is ook de turn-over snelheid van membraanproteYnes groter.

Elodea kan, beter dan Chara, een toediening van fosfor omzetten in verhoogde groeisnelheid. Dit betekent een competitief voordeel van de soort bij eutrofiering. Bij lage fosforconcentraties is Chara waarschijnlijk competitief bevoordeeld.

5.9 HET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

Uit het Chara-Elodea experiment bleek dat Elodea in staat was fosforaanrijking om te zetten naar hogere groeisnelheden. Bij Chara was dit vee I minder het geval. Desondanks dit nam Chara veel fosfor op in het weefsel. Dit experiment heeft als hoofddoel na te gaan of de fosforopslag in het weefsel beperkt is tot een zeker niveau, of er met andere woorden een limiet is waarboven Chara geen fosfaat meer kan opslaan in het weefsel.

De fosforconcentratie van het plantenmateriaal stijgt, net als in het Chara-Elodea experiment geleidelijk in de +P conditie, al is de stijging in dit geval veel sneller dan in het Chara-Elodea experi­ment. Het fosforgehalte vertienvoudigde gedurende het experiment en nog steeds werd geen asymp­totisch verloop gevonden. De snellere stijging van het fosforgehalte in vergelijking met het Chara­Elodea experiment is waarschijnlijk te wijten aan het drastischere incubatieregime.

Het stikstofgehalte stijgt zowel in de +P als de -P conditie. In de -P conditie vie I het N-gehalte echter terug na de initiele toename. Dit komt overeen met wat we waarnamen in het Chara-Elodea experiment, zowel voor de Ci- als de Ei- conditie. De hypothese van Shaver & Melillo wordt hier dus opnieuw bevestigd.

Er werd in de -P conditie een significant positief verband waargenomen tussen het stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de opnamesnelheid. In de +P conditie was geen dergelijk verband aan­wezig. Dit komt overeen met de gegevens uit het Chara-Elodea experiment.

Een opvallende waarneming is dat de Chara uit de +P conditie veel zwakker was dan in de -P conditie. Vooral de kranscellen kwamen snel los van de rest van het thallus. Dit fenomeen is, bij mijn weten, nooit eerder beschreven. Indien inderdaad het plantenmateriaal zwakker wordt met incubatie in fosforrijk medium, zou dit belangrijke ecologische gevolgen kunnen hebben. Het plantenmateriaal zal in dit geval bij eutrofiering sneller beschadigd worden. Ook is het mogelijk dat deze zachte en nutrientrijke planten meer gegeten worden. Van Chara is geweten dat het door vissen, vogels en slak­ken wordt gegeten. Characeae zijn bij de eerste macrofyten die verdwijnen bij eutrofiering (Forberg, 1964; Blindow, 1992a; en referenties in beide).

De vraagstelling bij dit experiment, of er een limiet is aan het fosforgehalte van Chara, kan voor­lopig niet worden beantwoord. Er werd gedurende het experiment een vertienvoudiging van het fosforgehalte waargenomen zonder een asymptoot werd bereikt. Hiermee is natuurlijk niet bewezen dat er helemaal geen bovenlimiet aan de fosforconcentratie is. Het is echter zeer onwaarschijnlijk dat in de natuur fosforgehaltes zo hoog als de hier waargenomen (0.78% van het DW) tot stand kunnen komen.

86

KufeI & Ozimek (1994) toonden aan dat Chara in staat was de aanzienlijke nutrientinflux in het Luknajno-meer te compenseren. Ze kwamen tot de concIusie dat dit gedeeltelijk aan groei, en gedeeI­telijk aan de opslagcapaciteit voor fosfor te danken was. Uit de hier besproken resuitaten blijkt dat Chara bijzonder grote hoeveelheden fosfor kan opslaan in het weefseI. Deze opslagcapaciteit betekent een competitief voordeeI, dat er, samen met de mogelijkheid tot sneIIe absorptie van fosfaat bij ogen­blikkelijke fosforinput, voor zorgt dat Chara in staat is fYtoplanktonbloei te voorkomen (KufeI & Ozimek, 1994).

Samenvatting: Er kon geen bovengrens aan het fosforgehalte van Chara worden vastgesteld. De fosforconcen­

tratie in het weefsel Iiep uiteindelijk op tot 0.78% van het drooggewicht. Deze grote opslagcapaciteit betekent dat de soort een aanzienlijke bufferwerking kan uitoefenen bij eutrofiering van een meer.

87

REFERENTIELIJST

Andrews, M., I.R. Davison, M.E. Andrews and J.A. Raven. (1984) Growth ofChara hispida: I. Apical growth and basal decay. Journal of Ecology 72: 873-884

APHA, A WW A & WPCF (1985) Standard methods for the determination of water and wastewater. 16th edition. American Public Health Association, American Water Works Association, and Water Pollution Control Federation.

Balls, H., B. Moss and K. Irvine. (1989) The loss of submerged plants with eutrophication: I. Experimental design, water chemistry, aquatic plant and phytoplankton biomass in experiments carried out in ponds in the Norfolk Broadland. Freshwater Biology 22: 71-87

Barko, J.W., D. Gunnison and S.R. Carpenter. (1991) Sediment interactions with submerged macrophyte growth and community dynamics. Aquatic Botany 41: 41-65

Bieleski, R.L. (1973) Phosphate pools, phosphate transport, and phosphate availability. Ann. Rev. Plant Physiol. 24: 225-252

Bieleski, R.L. and LB. Ferguson. (1983) Physiology and metabolism of phosphate and its compounds. In: A Uiuchli, A. and R.L. Bieleski, eds, Inorganic Plant Nutrition. Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Vol 15A, Springer- Verlag, Berlin, Germany, pp 422-449

Blindow, I. (1988) Phosphorus Toxicity in Chara. Aquatic Botany 32: 393-395 Blindow, I. (1992a) Decline of charophytes during eutrophication: comparison with angiosperms.

Freshwater biology 28: 9-14 Blindow, I. (1992b) Long- and short-term dynamics of submerged macrophytes in two shallow

eutrophic lakes. Freshwater biology 28: 15-27 Borstlap, A.C. (1983) The use of model-fitting in the interpretation of 'dual' uptake isotherms. Plant,

Cell and Environment 6: 407-416 Box, RJ. (1986) Quantitative short-term uptake of inorganic phosphate by the Chara hispida rhizoid.

Plant, Cell and Environment 9: 501-506 Bristow, J .M. and M. Whitcombe. (1971) The role of roots in the nutrition of aquatic vascular plants.

American Journal of Botany 58: 8-13 Bun-ya M., K. Shikata, S. Nakade, C. Yompakdee, S. Harashima and Y. Oshima. (1996) Two new

genes, PH086 and PH087, involved in inorganic phosphate uptake in Saccharomyces cerevisiae. Current Genetics 29: 344-351

Carignan, R. and J. Kalff. (1980) Phosphorus sources for aquatic weeds: water or sediments? Science 207: 987-989

Carignan, R. and J. Kalff. (1982) Phosphorus release by submerged macrophytes: Significance to epiphyton and phytoplankton. Limnology and Oceanography 27: 419-427

Carpenter, S.R. (1980) Enrichment of lake Wingra, Wisconsin, by submerged macrophyte decay. Ecology 61: 1145-1155

Chiang, C., C.B. Craft, D.W. Rogers and c.J. Richardson. (2000) Effects of 4 years of nitrogen and phosphorus additions on Everglade plant communities. Aquatic Botany 68: 61-78.

Clarkson, D.T. and C.B. Scattergood. (1982) Growth and phosphate transport in barley and tomato plants during the development of, and recovery from, phosphate-stress. Journal of experimental botany 33: 865-875

Cogliatti, D.H. and D.T. Clarkson. (1983) Physiological changes in, and phosphate uptake by potato plants during development, and recovery from phosphate deficiency. Physiologia plantarum 58: 287-294

De Smedt, E. (2000) Allelopathie en nutrientopname bij Chara, Studie waterkwaliteit van 'De Maten' in Genk. Graduaatsthesis

89

Dong, B., P.R. Ryan, Z. Zengel and E. Delhaize. (1999) Phosphate uptake in Arabidopsis thaliana: dependence of uptake on the expression of transporter genes and internal phosphate concentrations. Plant, Cell and Environment 22: 1455-1461

Dunlop, J., H.T. Phung, R. Meeking and D.W.R. White. (1997) The kinetics associated with phosphate absorption by Arabidopsis and its regulation by phosphorus status. Australian Journal of Plant Physiology 24: 623-629

Elser, J.J., D.R. Dobberfuhl, N.A. MacKay and J.H. Schampel. (1996) Organism size, life history, and N:P stoichiometry. Bioscience 46: 674-684

Elser, J.1., R.W. Sterner, E. Gorokhova, W.F. Fagan, T.A. Markow, J.B. Cotner, J.F. Harrison, S.E. Hobbie, G.M. Odell and L.1. Weider. (2000a) Biological stoichiometry from genes to ecosystems. Ecology Letters 3: 540-550

Elser, J.J., W.F. Fagan, R.F. Denno, D.R. Dobberfuhl, A. Folarin, A. Huberty, S. Interlandi, S.S. Kilham, E. McCauley, K.L. Schulz, E.H. Siemann and R.W. Sterner. (2000b) Nutritional constraints in terrestrial and freshwater food webs. Nature 408: 578-580

Fish, G.R. and G.M. Will (1966) Fluctuations in the chemical composition of two lakeweeds from New Zealand. Weed Res. 6: 346-349

Forsberg, C. (1964) Phosphorus, a Maximum Factor in the Growth of Characeae. Nature 201: 517-518

Forsberg, C., S. Kleiven and T. Willen. (1990) Absence of allelopathic effects of Chara on phytoplankton in situ. Aquatic botany 38: 289-294

Furihata, T., M. Suzuki, H. Sakurai. (1992) Kinetic characterization of two phosphate uptake systems with different affinities in suspension-cultured Catharanthus roseus protoplasts. Plant Cell Physiol. 33: 1151-1157

Graneli, W. and D. Solander. (1988) Influence of macrophytes on phosphorus cycling in lakes. Hydrobiologia 170: 245-266

Holtan, H., L. Kamp-Nielsen and A.O. Stuanes. (1988) Phosphorus in soil, water and sediment: an overview. Hydrobiologia 170: 19-34

Jeppesen, E., J.P. Jensen, M. Sondergaard & T. Lauridsen. (1999) Trophic dynamics in turbid and clearwater lakes with special emphasis on the role of zooplankton for water clarity. Hydrobiologia 408/409: 217-231

Jeppesen, E., J.P. Jensen, M. Sondergaard, T. Lauridsen and F. Landkildehus. (2000) Trophic structure, species richness and biodiversity in Danish lakes: changes along a phosphorus gradient. Freshwater biology 45: 201-218

Jungk A., c.J. Asher, D.G. Edwards and D. Meyer. (1990) Influence of phosphate status on phosphate uptake kinetics of maize (Zea mays) and soybean (Glycine max). Plant and Soil 124: 175-182

Jupp, B.P. and D.H.N. Spence (1977) Limitations on macrophytes in a eutrophic lake, Loch Leven. I. Effects of phytoplankton. Journal of Ecology 65: 175-186

Kjeldahl, J. (1883) A new method for the determination of nitrogen in organic matter. Z. Anal. Chem. 22: 366

Kleiven, S. (1991) An analysis of allelopathic effects of Chara on phytoplankton development. Acta Universitatis Upsaliensis. Comprehensive summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science 313

Koerselman, W. and A.F .M. Meuleman. (1996) The vegetation N:P ratio: a new tool to detect the nature of nutrient limitation. Journal of applied ecology 33: 1441-1450

Kufel, L. and T. Ozimek. (1994) Can Chara control phosphorus cycling in Lake Luknajno (Poland)? Hydrobiologia 275/276: 277-283

Lee, K-S and K.H. Dunton. (1999) Inorganic nitrogen acquisition in the seagrass Thalassia testudinum: Development of a whole-plant nitrogen budget. Limnology and oceanography 44: 1204-1215

90

Lefebvre, D.O. and A.D.M. Glass. (1982) Regulation of phosphate influx in barley roots: Effects of phosphate deprivation and reduction of influx with provision of orthophosphate. Physiologia plantarum 54: 199-206

Leggewie G., L. Willmitzer and J.W. Riesmeier. (1997) Two cDNAs from potato are able to complement a phosphate uptake-deficient yeast mutant: Identification of phosphate transporters from higher plants. Plant Cell 9: 381-392

Littlefield, L. and C. Forsberg. (1965) Absorption and translocation of phosphorus-32 by Chara globularis Thuili. Physiologia Plantarum 18: 291-296

Liu, C., U.S. Muchhal, M. Uthappa, A.K. Kononowicz and K.G. Raghothama. (1998) Tomato phosphate transporter genes are differentially regulated in plant tissues by phosphorus. Plant physiology 116: 91-99

Mimura, T. (1995) Homeostasis and transport of inorganic phosphate in plants. Plant Cell Physiol. 36: 1-7

Mimura, T., KJ. Dietz, W. Kaiser, MJ. Schramm, G. Kaiser and U. Heber. (1990) Phosphate transport across biomembranes and cytosolic phosphate homeostasis in barley leaves. Planta 180: 139-146

Mimura, T., RJ. Reid and A. Smith. (1998) Control of phosphate transport across the plasma membrane of Chara corallina. Journal of Experimental Botany 49: 13-19

Muchhal U.S. and K.G. Raghothama. (1999) Transcriptional regulation of plant phosphate transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 5868-5872

Murphy, J. and J.P. Riley. (1962) A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Analytica Chimica Acta 27: 31-36

Ozimek, T., R.D. Gulati and E. van Donk. (1990) Can macrophytes be useful in biomanipulation of lakes? The Lake Zwemlust example. Hydrobiologia 200/201: 399-407

Phillips, G.L., D.F. Eminson and B. Moss. (1978) A mechanism to account for macrophyte decline in progressively eutrophicated freshwaters. Aquatic Botany 3: 55-63

Raghothama, K.G. (1999) Phosphate acquisition. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bioi. 50: 665-693

Rattray, M.R., C. Howard-Williams and J .M.A. Brown. (1991) Sediment and water as sources of nitrogen and phosphorus for submerged rooted aquatic macrophytes. Aquatic botany 40: 225-237

Raven, J.A. (1981) Nutritional strategies of submerged benthic plants: the acquisition of C, Nand P by rhizophytes and haptophytes. New. Phytol. 88: 1-30

Reid, RJ., T. Mimura, Y. Ohsumi, N.A. Walker and F.A. Smith. (2000) Phosphate uptake in Chara: membrane transport via NaiPi cotransport. Plant, Cell and Environment 23: 223-228

Round, F .E. (1981) The ecology of algae. Cambridge University Press, Cambridge Sakano, K. (1990) Proton/phosphate stoichiometry in uptake of inorganic phosphate by cultured cells

of Catha ran thus roseus (L.) G. Don. Plant Physiology 93: 479-483 Sakano, K., Y. Yazaki and T. Mimura. (1992) Cytoplasmatic acidification induced by inorganic

phosphate uptake in suspension cultured Catharanthus roseus cells. Plant Physiology 99: 672-680

Sand-Jensen K. and J. Borum. (1991) Interactions among phytoplankton, periphyton, and macrophytes in temperate freshwaters and estuaries. Aquatic Botany 41: 137-175

Schachtman, D.P., RJ. Reid and S.M. Ayling. (1998) Phosphorus uptake by plants: from soil to cell. Plant Physiology 116: 447-453

Scheffer, M. (1990) Multiplicity of stable states in freshwater systems. Hydrobiologia 200/201: 475-486

Scheffer, M. (1998) Ecology of Shallow Lakes. Chapman & Hall, London Scheffer, M., S.H. Hosper, M-L. Meijer, B. Moss and E. Jeppesen. (1993) Alternative Equilibria in

Shallow Lakes. Trends in Ecology and Evolution 8: 275-279

91

Smith, F.A. and N.A. Walker. (1989) Transport of potassium by Chara australis. 1. A symport with sodium. Journal of Membrane Biology 108: 125-137

Takeshige, K., F. Mitsumori, M. Tazawa and T. Mimura. (1992) Role of cytoplasmic inorganic phosphate in light-induced activation ofW-pumps in the plasma membrane and tonoplast of Chara corallina. Planta 186: 466-472

Theodorou, M.E. and W.e. Plaxton. (1993) Metabolic adaptations of plant respiration to nutritional phosphate deprivation. Plant Physiology 101: 339-344

Twilley, R.R., M.M. Brinson and GJ. Davis. (1977) Phosphorus absorption, translocation, and secretion in Nuphar luteum. Limnology and Oceanography 22: 1022-1032

Ullrich-Eberius, C.1., A. Novacky, E. Fischer and U. Llittge. (1981) Relationship between energy­dependent phosphate uptake and the electrical membrane potential in Lemna gibba. Plant physiology 67: 797-801

Ullrich-Eberius, C.l., A. Novacky, A.J.E. van Bel. (1984) Phosphate uptake in Lemna gibba: energetics and kinetics. Planta 161: 46-52

Vaithiyanathan, P. and e.J. Richardson. (1999) Macrophyte species changes in the Everglades: Examination along a eutrophication gradient. J Environ. Qual. 28: 1347-1358

Van den Bergh, M.S., M. Scheffer and H. Coops. (1998) The role of char ace an algae in the management of eutrophic shallow lakes. Journal of Phycology 34: 750-756

Van Tichelen, K.K. & J.V. Colpaert. (2000) Kinetics of phosphate absorption by mycorrhizal and non-mycorrhizal Scots pine seedlings. Physiologia Plantarum 110: 96-103

Van Vierssen, W. and T.e. Prins. (1985) On the relationship between the growth of algae and aquatic macrophytes in brackish water. Aquatic Botany 21: 165-179

Walker, N.A. and D. Sanders. (1991) Sodium-coupled solute transport in charophyte algae: A general mechanism for transport energization in plant cells? Planta 185: 443-445

Wium-Andersen, S., U. Anthoni, C. Christophersen and G. Houen. (1982) Allelopathic effects on phytoplankton by substances isolated from aquatic macrophytes (Charales). Oikos 39: 187-190

Wykoff, D.D., A.R. Grossman, D.P. Weeks, H. Usuda and K. Shimogawara. (1999) Psrl, a nuclear localized protein that regulates phosphorus metabolism in Chlamydomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 15336-15341

92

SAMENV ATTING

Fosfor is een belangrijk macronutrient dat in de natuur voornamelijk door hoge-affiniteits fosfaat­transporters wordt opgenomen. In deze scriptie wordt beschreven dat de fosfaatopname van Chara globularis afneemt bij externe fosfaatconcentraties groter dan 65 11M. Er word gesteld dat, bij deze hoge concentraties, het hoge-affiniteitssysteem geYnhibeerd wordt.

De eerste doelstelling van deze studie was om seizoenale patron en van abiotische en biotische factoren uit een door de ondergedoken macrofyt C. globularis gedomineerde vijver te koppelen aan de kinetica van de fosfaatopname van deze soort. Er kon niet besloten worden dat de fosfaatopname ver­bonden was aan de fosforconcentratie van het plantenmateriaal of de waterkolom. Ze was eerder afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de planten, met hoge opnamesnelheden bij sporen­vorming en intense groei van jonge scheuten. C. globularis bleek een grote impact te hebben op het ecosysteem. Bij afsterven van de planten werd het water anaeroob en gebeurde er waarschijnlijk fosfaatvrijzetting uit het sediment.

Het lijkt er sterk op dat C. globularis in de bestudeerde vijver geen fosfor opneemt uit het sedi­ment. In dit kader werden twee hypothesen gesteld. Enerzijds kan een zuurstofgebrek aanleiding geven aan slechte fosfaatopname uit het sediment. Anderzijds is het mogelijk dat basale sterfie geen transport van opgenomen fosfor naar het groeiende thallus toelaat.

In een tweede luik van het onderzoek stond de invloed van abiotische factoren op de fosfaat­opname centraal. Vooral natrium kreeg hierbij aandacht, omdat recent werd aangetoond dat de fosfaatopname bij Chara corallina in cotransport met natrium gebeurt. Ook de invloed van de pH werd onderzocht.

Hoewel het niet rechtstreeks kon bewezen worden, suggereren drie waarnemingen duidelijk dat de fosfaatopname bij C. globularis, net zoals bij C. corallina, gebeurt door Na +/Pi cotransport. Vooreerst had de aanwezigheid van natrium in het opnamemedium een stimulerend effect op de fosfaatopname, met een optimum nabij 1 a 2 mM. Ten tweede veroorzaakte natriumuithongering verhoogde fosfaat­opname en ten derde deed toediening van Pi aan het medium de pH hiervan niet stijgen, zoals ver­wacht kan worden bij proton-fosfaat cotransport.

De fosfaatopname verliep, zowel voor C. globularis als voor Nitella jlexilis, optimaal in het centrale deel van het onderzochte bereik, bij pH-waarden van 6 tot 8. De voorkeur voor laaggeYoni­seerd Pi (H2POn is dus duidelijk zwakker dan bij sommige andere soorten. De patronen van fosfaat­opname in functie van de pH waren anders bij verschillende fosfaatconcentraties. Dit fenomeen blijfi onduidelijk. Nitella vertoonde een lagere opnamesnelheid dan Chara. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het grote verschil in fosforstatus van het plantenmateriaal en niet aan soortspecifieke verschillen.

In een derde en laatste luik van het onderzoek werd nagegaan welke invloed de nutrientstatus van het plantenmateriaal had op de fosfaatopname. Hiertoe werden twee macrofytsoorten (c. globularis en Elodea nutallii) onderworpen aan een fosforaanrijking en -uithongering.

De opnamesnelheid bleek duidelijk gecorreleerd met de inwendige fosforstatus van de plant. Elodea lijkt gevoeliger aan fosforstress dan Chara. Het verhoogt reeds zijn fosfaatopname als het inwendig fosforgehalte afneemt onder 0.3% van het drooggewicht. Chara doet dit pas als het fosfor­gehalte onder de 0.15% van het drooggewicht zakt. De N:P verhouding van het weefsel is bij Elodea

93

tamelijk constant en veel lager dan bij Chara, wat in overeenstemming lijkt met de groeistrategie van beide soorten.

De fosfaatopname van Elodea reageert sneller op veranderende omstandigheden dan die van Chara. Waarschijnlijk is Elodea, door toedoen van zijn lage N:P verhouding, in staat op korte tijd veel fosfaattransporters te produceren. Vermoedelijk is ook de turn-over snelheid van membraanprote'ines groter.

Elodea kan, beter dan Chara, een toediening van fosfor omzetten in verhoogde groeisnelheid. Dit betekent een competitief voordeel van de soort bij eutrofiering. Desondanks het feit dat Chara minder goed in staat is een toediening van fosfor om te zetlen in verhoogde groeisnelheid, kan deze soort bij fosfortoediening de fosfaatconcentratie in het water laag houden. Dit is voornamelijk toe te schrijven aan opslag van het fosfor in het weefsel. Er kon geen bovengrens aan het fosforgehalte van Chara worden vastgesteld. De fosforconcentratie in het weefselliep in een van de experimenten op tot 0.78% van het drooggewicht. Deze grote opslagcapaciteit betekent dat de soort een aanzienlijke buffer­werking kan uitoefenen bij eutrofiering van een meer.

94

SUMMARY

Phosphorus is a major nutrient acquired primarily via high-affinity inorganic phosphate transporters. In this thesis, it is shown that phosphorus uptake activity in Chara globularis decreases at external phosphate concentrations exceeding 65 11M. It is suggested that, at these high concentrations, the high-affinity transport system is inhibited.

The first major aim of the present study was to link seasonal patterns in abiotic and biotic factors from a pool dominated by the submerged macrophyte C. globularis to the phosphate uptake kinetics in this species. The phosphate uptake could not be linked to the phosphorus concentrations of either tissue or water. It rather seemed dependent on the developmental stage of the plants, showing high uptake rates when spores were formed and young shoots were intensively growing. C. globularis seemed to have a large impact on the ecosystem. As the plants died off, the water became anoxic, and most probably anoxic phosphate release from the sediment occured.

It seems the C. globularis from the studied pool does not use the sediment as a source for phosphorus. To explain this, two hypotheses were formulated. Firstly, a lack of oxygen at the sediment surface could cause uptake rates to be low, and secondly, basal decay of the plants could inhibit the transport of phosphorus taken up from the sediment to the actively growing parts of the thallus.

A second aim was to investigate the influence of abiotic factors on the uptake rate. As Na+/Pi cotransport was recently shown in C. corallin a, Na+ was given most attention. The influence of medium pH on uptake rate was also investigated.

Although it could not be proven directly, three observations provide evidence for the existence of Na+/Pi cotransport in C. globularis. Firstly, the uptake of Pi was stimulated by the presence ofNa+ in the medium, with an optimal concentration in the range 1-2 mM. Secondly, Na+ starvation of the plants enhanced the phosphate uptake rates. Thirdly, addition of Pi to the uptake medium did not increase its pH, suggesting uptake does not occur through proton-phosphate cotransport.

In both C. globularis and Nitellaflexilis, phosphate uptake was maximal in the central part of the studied pH range, at pH 6 to 8. Preference for weakly ionised Pi (H2POn is obviously lower than in certain other studied species. The patterns the uptake rate showed as a function of pH changed with increasing phosphate concentrations in the uptake medium. This phenomenon stays unclear. Nitella showed lower uptake rates than Chara. This was probably due to the large difference in tissue phosphorus content and not to species-specific differences.

The third aim of the study was to investigate the influence of the tissue nutrient status on phosphate uptake. For this purpose two macrophyte species (c. globularis and Elodea nutallii) were subjected to phosphorus starvation and enrichment.

The uptake rate was correlated with the tissue phosphorus content for both species. Elodea seems more susceptible to phosphorus stress than Chara. It increases its uptake rate as the internal phosphorus content decreases below 0.3% of dry weight. Chara only starts showing increased uptake rates until its phosphorus content decreases below 0.15% of dry weight. The N:P ratio of the tissue is rather constant in Elodea and considerably lower than in Chara. This seems to agree with the growth strategies of both species.

95

Phosphate uptake responds more quickly to changing conditions in Elodea. Probably this species can produce great amounts of phosphate transporters at a fast rate. Most probably the turnover rate of membrane proteins too, is higher in Elodea.

On supply of phosphorus to the plants, Elodea is better able to convert this into higher growth rates. This means the plants will be competitively advantaged on eutrophication of the water. Although Chara hardly succeeds to convert higher phosphorus supply rates into an increased growth rate, it is able to keep the phosphorus concentration of natural waters low. This is in great amount due to the accumulation of phosphorus in plant tissue. In the experiments no upper limit to the phosphorus content of Chara could be observed. The phosphorus concentration of the plant tissue increased to 0.78% of dry weight in one of the experiments. Chara can, due to its capacity to store phosphorus to large amounts, efficiently stabilize moderate eutrophication of natural waters.

96

Appendix 1: samenstelling van A.P. W.

BASISSAMENSTELLING

waterige oplossing met

NaCI 1mM 0,5 mM toegevoegd als CaCb.2H20

KCI 0,1 mM

BUFFERS

eventuele toevoeging van volgende buffers:

2-(N-morfolino )-ethaansulfonzuur (MES) 2mM voor pH 5, 6 en 6,5 3-(N-morfolino )-propaansulfonzuur (MOPS) 2mM voor pH 70f8 2-( cycIohexylamino )-ethaansulfonzuur CCHES) 2mM voorpH 9

A-1

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~---. ---~-. ~-~~~--~---~~--~-

Appendix 2: Atkortingenlijst

[X] A.P.W. ATP Cmin

D.LC. D.O.C. Km me NMR o-p P P.A.R. P.P. PCA Pi S.P. S.R.P. S.U.P. tot TP Vmax

A-2

concentratie van de stof X artificial pond water adenosine trifosfaat minimale concentratie waarbij de transporter nog actief is dissolved inorganic carbon dissolved organic carbon affiniteitsconstante van de Michaelis-Menten kinetica mill i-equivalent nucleomagnetic resonance orthofosfaatconcentratie fosfor photo-active radiation particulate phosphorus - partikelgebonden fosfor principaalcomponentanalyse anorganisch fosfor - de som van alle fosfaationen (H2P04 -, HP042-, POl-) soluble phosphorus soluble reactive phosphorus soluble unreactive phosphorus totaal totaalgehaIte fosfaat (total phosphorus) maximale opnamesnelheid van de Michaelis-Menten kinetica

Appendix 3: MateriaaI en methoden

Tabe/ A.3.1 De exacte samenstelling van de opnamemedia voor de seizoenale opvolging. De afkortingen van de

verschillende condities stellen de fosforconcentratie v~~r. In werkefijkheid ligt de Na+ concentratie een weinig

hoger omdat de stockoplossing met NaCI, CaCI2, KCI en MES-buffer met NaOH op pH 6.5 werd gebracht.

NaCI CaCI2 KCf MES K3P04 [Pi] conditie (mM) (mM) (mM) (mM) (iJM) (iJgP/I)

0 0.88 0.44 0.09 1.75 0 a 100 0.88 0.44 0.09 1.75 3.23 100 200 0.88 0.44 0.09 1.75 6.45 200 500 0.88 0.44 0.09 1.75 16.1 500

1000 0.88 0.44 0.09 1.75 32.3 1000

2000 0.88 0.44 0.09 1.75 64.5 2000 5000 0.88 0.44 0.09 1.75 161 5000

10000 0.88 0.44 0.09 1.75 323 10000

Tabe/ A.3.2 De verschiflende opnamemedia voor het experiment 'Stimulatie van de fosfaatopname door Na + en

K+' (ct. 3.2.4). Aan aile opnamemedia werd 437.5 IJM CaCI2 en 591.5 IJM Ca(OH)2 toegevoegd De resulterende

[Ca2+] is weergegeven in de tabel. De media, gebufferd met 2 mM MES, werden dan met HCI op pH 6 gebracht.

conditie

1

[Na1 (mM)

o 775

[K1tot (mM)

0.125

[Ca21tot pre'incubatieregime (mM)

1.03 zoals in opname-exp. 2 1.00 775 0.125 1.03 zoals in opname-exp. 3 __ _ ~cqQ _________ UP.. ___ _ q._1_~~ _______ :! ~g~ ___ ~9§1l~ _i!1_ 9P_I!~~~:~~P~ 4 0 775 1.250 1.03 zoals in opname-exp. 5 1.00 775 1.250 1.03 zoals in opname-exp.

. _________ ~ ___ _ ~cqQ _________ ??? ____ _ 1'f_~Q __ _____ :! ~g~ ___ ~9§1l~ _i!1_ 9pn~~~:~~P~ 7 0 775 0.125 1.03 in standaard APW 8 1.00 775 0.125 1.03 in standaard APW 9 5.00 775 0.125 1.03 in standaard APW ---------------------------------------------.-----------.------

10 0 775 1.250 1.03 in standaard APW 11 1.00 775 1.250 1.03 in standaard APW 12 5.00 775 1.250 1.03 in standaard APW

o 8

40 ----------o

0.8 5 o 8

40 ----------0

0.8 5

A-3

Tabel A.3.3 De exacte samenstelling van de opnamemedia voor de pH-experimenten (cf. 3.4). De afkortingen

van de verschillende condities zijn steeds samengesteld uit de pH en de fosforconcentratie in IJgP/1. De

percentuele bijdragen van NaH2P04 en Na2HP04 werden zo gekozen dat ze bij de betreffende pH zo weinig

mogelijk verstoring van deze pH zouden betekenen. De Na+ concentratie werd tussen de verschillende condities

constant gehouden (1 mM) door, afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegd NaH2P04 en Na2HP04, meer of

minder NaCI toe te voegen. In werkelijkheid ligt de Na+ concentratie een weinig hoger omdat de stockoplossing

met CaCI2, KCI en MES-buffer met NaOH op de juiste pH werd gebracht. In de gegevenstabellen werd hiervoor

gecorrigeerd door de concentratie Na + te verhogen met de toegevoegde concentratie NaOH.

KCI CaCh buffer NaH2P04 Na2HP04 NaCI [Pi] conditie (mM) (mM) (mM) (!JM) (~M) (mM) (~gP/I)

5-0 0.1 0.5 2.0 0 0 1.000 0 5-150 0.1 0.5 2.0 4.83 0 0.995 150 5-500 0.1 0.5 2.0 16.1 0 0.984 500 5- 2000 0.1 0.5 2.0 64.5 0 0.936 2000 ------------ -------------------------------------------------------- ---------6-0 0.1 0.5 2.0 0 0 1.000 0 6-150 0.1 0.5 2.0 4.55 0.290 0.995 150 6-500 0.1 0.5 2.0 15.2 0.968 0.983 500 6- 2000 0.1 0.5 2.0 60.6 3.87 0.932 2000 .--.-------- -------------------------------------------------------- -------.-7-0 0.1 0.5 2.0 0 0 1.000 0 7-150 0.1 0.5 2.0 3.00 1.84 0.993 150 7-500 0.1 0.5 2.0 10.0 6.13 0.978 500

7 - 2000 0.1 0.5 2.0 40.0 24.5 0.911 2000 ----------.- ----------------------------------.--------------------- ---------8-0 0.1 0.5 2.0 0 0 1.000 0

8-150 0.1 0.5 2.0 0.677 4.16 0.991 150

8-500 0.1 0.5 2.0 2.26 13.9 0.970 500

8 - 2000 0.1 0.5 2.0 9.03 55.5 0.880 2000 ._---------- -------------------------------------------------------- ---------9-0 0.1 0.5 2.0 0 0 1.000 0 9-150 0.1 0.5 2.0 0 4.83 0.990 150

9-500 0.1 0.5 2.0 0 16.1 0.968 500 9- 2000 0.1 0.5 2.0 0 64.5 0.871 2000

Tabel A.3.4 De tijdstippen waarbij, voor de opname-experimenten van zeer korte duur (cf. 3.6), de pH werd

genoteerd en mediumstaal werd genomen voor analyse.

-20", 15", 30", 45", 1 '00", 1 '30", 2'00", 2'30", 3'00", 4'00", 5'00", 6'00", TOO", 9'00", 11 '00", 13'00", 15'00" en 19'00"

Tabel A.3.5 De exacte samensteliing van de opnamemedia voor het Chara-Elodea experiment. De Na +

concentratie werd tussen de verschiliende condities constant gehouden (1 mM) door, afhankelijk van de

hoeveelheid toegevoegd NaH2P04, meer of minder NaCI toe te voegen. In werkelijkheid ligt de Na+ concentratie

een weinig hoger omdat de stockoplossing met CaCb, KCI en MES-buffer met NaOH op pH 6 werd gebracht.

CaCh KCI MES NaH2P04 NaCI [Pi]

conditie (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (lJgP/I)

200 0.44 0.09 1.75 6.45 0.994 200

750 0.44 0.09 1.75 24.2 0.976 750

2000 0.44 0.09 1.75 64.5 0.935 2000

A-4

Appendix 4: Resultaten

Tabel A.4.1 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de seizoenale opvolging.

Fosfaatopname juli 2000

fosfBBtconcentratie (lIgP 1")

t(min 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 1 1 1 48 96 63 176 228 195 399 522 479

38 1 1 1 10 6 1 153 129 63 224 323 290 63 1 1 1 1 1 1 96 96 115 195 252 224 90 1 1 1 1 1 1 77 44 72 181 162 186

120 1 1 1 1 1 1 39 29 44 124 172 110

t(min) 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0 1223 1138 1091 2341 2583 2564 4767 4814 4842 7676 7733 7932

38 1024 844 783 2152 1640 2066 4601 4482 4478 7705 7610 7733 63 835 721 607 1867 2033 1972 4596 4487 4587 7657 7724 7799 90 749 650 489 1725 1801 1834 4525 4430 4563 7439 7496 7051

120 640 569 375 1640 1863 1683 4534 4444 4577 7525 7553 7297

drooggewlcht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.079 0.107 0.108 0.112 0.107 0.172 0.064 0.100 0.080 0.129 0.137 0.122

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.115 0.132 0.147 0.139 0.108 0.133 0.116 0.136 0.119 0.145 0.121 0.133

correctle voor cuvetvolume en drooggewicht (lIgP (g OWr')

t(min 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 1 1 1 35 72 29 168 183 194 247 305 316

38 1 1 1 7 4 0 145 103 62 139 189 191 63 1 1 1 1 1 0 91 77 114 121 147 147 90 1 1 1 1 1 0 73 35 72 112 95 122

120 1 1 1 1 1 0 37 24 43 77 100 72

t(min) 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0 855 689 594 1346 1915 1543 3299 2828 3250 4229 5125 4786

38 716 511 426 1237 1216 1244 3164 2633 300S 4245 5044 4565 63 583 437 331 1074 1507 1187 3181 2636 3078 4219 5119 470S 90 524 394 266 962 1335 1104 3131 2602 3052 4099 4968 4254

120 448 345 204 943 1381 1013 3138 2611 3072 4146 5006 4403

richtingscoiifficient van de gefitte rechte (lIgP (g OWr' min")

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200·2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 0 0 -0.7117 -1.7742 -0.7551 -1.132 -1.336 -1.283 -2.8605 -3.0597 -3.2833

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -4.255 -4.OS2 -4.199 -4.111 -5.437 -4.797 -1.967 -3.218 -3.029 -1.032 -1.084 -3.976

opnamesnelheid (lIgP (g OWr' min")

condo ",pI 1 ",pI 2 re 13 em. 0 0 0 0 0

100 0.712 1.77 0.755 1.08 200 1.13 1.34 1.28 1.25 500 2.86 3.06 3.28 3.07

1000 4.26 4.06 4.20 4.17 2000 4.11 5.44 4.80 4.78 5000 1.97 3.22 3.03 2.74

10000 1.03 1.08 3.96 2.03

A-5

Fosfaatopname augustus 2000

fosfaatconcentratie (lJgP I"')

t(min) 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 1 1 1 72 89 72 184 140 201 391 418 465

30 1 1 1 42 28 52 120 133 167 340 384 320 59 1 1 1 21 1 32 228 109 177 276 337 282 95 1 1 1 86 1 1 59 89 65 235 292 215

142 1 1 1 1 1 1 18 65 21 164 235 154 179 1 1 1 1 1 1 86 35 1 116 177 86 241 1 1 1 1 1 1 1 8 1 62 130 25 300 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 76 1

t(min) 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0 916 825 828 1770 1733 1746 3085 3078 3105 3021 2607 2682

30 804 780 784 1658 1699 1635 3119 3170 3122 3058 2661 2682 59 757 740 733 1624 1662 1611 3204 3163 3146 2668 2536 3092 95 709 672 692 1546 1614 1675 3197 3207 3136 3011 2489 2546

142 658 631 631 1482 1540 1482 3105 3163 3085 3519 2899 2889 179 608 584 597 1448 1485 1418 3095 3099 3092 3051 2492 2506 241 553 503 536 1357 1431 1319 3051 3092 3017 3417 2828 2929 300 516 445 462 1306 1391 1255 3021 3048 2956 2983 2265 2309

drooggewicht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.057 0.060 0.035 0.064 0.073 0.042 0.056 0.051 0.055 0.069 0.064 0.062

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.044 0.046 0.047 0.053 0.036 0.049 0.054 0.047 0.058 0.059 0.091 0.077

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (lJgP (g OWr')

!(min) 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 1 1 2 91 98 137 261 220 291 451 526 598

30 1 1 2 52 31 99 170 209 242 392 483 411 59 1 1 2 27 1 60 324 172 257 318 423 363 95 1 1 2 108 1 2 83 140 95 271 368 276

142 1 1 2 1 1 2 25 103 31 189 295 197 179 1 1 2 1 1 2 122 55 1 134 223 110 241 1 1 2 1 1 2 1 12 1 72 163 32 300 1 1 2 1 1 2 1 2 1 9 95 1

t(min 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0 1681 1422 1403 2672 3851 2845 4613 5229 4321 4075 2305 2775

30 1476 1346 1329 2503 3775 2663 4664 5364 4344 4125 2353 2775 59 1389 1276 1242 2452 3693 2625 4791 5372 4377 3600 2242 3200 95 1302 1159 1174 2334 3587 2729 4780 5447 4363 4061 2200 2635

142 1208 1089 1070 2237 3421 2415 4644 5372 4292 4747 2562 2989 179 1115 1007 1013 2186 3301 2310 4628 5263 4302 4116 2203 2593 241 1015 867 909 2048 3180 2150 4563 5252 4198 4610 2499 3031 300 947 767 783 1971 3090 2045 4517 5177 4113 4025 2002 2390

richtingscoefficient van de gefi'tte rechte (~gP (g OWr' min")

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 0 -1.083 -1.638 -1.313 -1.581 -0.871 -1.902 -1.759 -1.681 -2.463

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -3.866 -2.745 -2.459 -3.38 -2.786 -3.757 -0.58 -0.4777 -0.7515 2.587 -0.8183 -1.99

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min-')

condo repl1 repl2 repl3 gem. 0 0 0 0 0

100 1.08 1.84 1.31 1.34 200 1.58 0.87 1.90 1.45 500 1.76 1.68 2.46 1.97

1000 3.87 2.75 2.46 3.02 2000 3.38 2.79 3.76 3.31 5000 0.580 0.478 0.752 0.60

10000 0.00 0.818 1.99 0.94

A-6

Fosfaatopname september 2000

fosiaatconcentratie (lJgP r')

t(min 0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 0 1 1 1 71 71 118 151 148 315 381 305

30 1 1 1 1 14 18 68 31 288 158 198 59 1 1 1 1 1 1 28 1 208 61 81 95 1 1 1 1 1 1 1 1 124 1 1

142 1 1 1 1 1 1 1 1 41 1 1 179 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 241 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

t(min 1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 0 782 658 785 1790 1783 1886 4436 4035 4436 7652 9481 8814

30 652 485 715 1332 1426 1419 3675 3928 3541 7666 7185 7679 59 495 311 585 1156 1249 1279 4048 3474 3448 7052 7532 7639 95 341 148 458 952 1035 1089 3621 3701 3141 6384 6611 6918

142 221 38 341 765 849 925 3221 3208 2727 6665 5957 6091 179 78 1 235 522 652 685 2433 2679 2300 6932 5971 5690 241 1 1 91 361 398 482 2260 2260 1739 6852 6932 6905

drooggewicht (9 OW)

0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 0.116 0.157 0.131 0.105 0.095 0.155 0.129 0.124 0.108 0.107 0.205 0.140

1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 0.131 0.189 0.134 0.178 0.148 0.169 0.173 0.180 0.239 0.182 0.154 0.172

correctie voorcuvetvolume en drooggewicht (~gP (9 OW}")

t(min 0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500-2 500·3 0 1 1 1 54 60 73 98 109 236 149 174

30 1 1 1 1 12 11 44 23 216 62 113 59 1 1 1 1 1 1 18 1 156 24 46 95 1 1 1 1 1 1 1 1 93 0 1

142 1 1 1 1 1 1 1 1 31 0 1 179 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 241 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

t(min 1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 0 478 279 469 804 961 895 2052 1794 1483 3367 4922 4107

30 399 205 427 599 769 673 1700 1747 1184 3373 3730 3578 59 303 132 349 519 673 607 1873 1545 1153 3103 3910 3559 95 209 63 274 428 558 517 1676 1646 1050 2809 3432 3223

142 135 16 204 344 457 439 1490 1426 912 2933 3093 2838 179 48 0 140 234 351 325 1126 1191 769 3050 3100 2651 241 1 0 54 162 215 228 1046 1005 581 3015 3598 3217

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (9 Owr' min")

0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500-3 0 0 ·1.724 ·1.5426 ·2.0027 ·1.7362 ·2.7882 ·1.659 ·2.135 ·2.167

1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 ·2.712 -2.065 -2.123 -3.366 -3.764 -3.295 -4.064 -3.253 -3.317 -4.421 -12.26 -9.004

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min")

repl1 repl2 repl3 gem. 0 0 0 0

100 1.72 1.54 1.63 200 2.00 1.74 2.79 2.16 500 1.66 2.14 2.17 1.99

1000 2.71 2.07 2.12 2.30 2000 3.37 3.76 3.30 3.48 5000 4.06 3.25 3.32 3.54

1DDDO 4.42 12.3 9.00 8.56

A-7

Fosfaatopname oktober 2000

fosfaatconcentratie (lJgP 1'1)

t(min) 0·1 0·2 0.3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 0 21.626 5.222 2.459 98.315 114.592 87.861 146.422 173.597 147.555 377.196 398.147

30 25.685 4.017 6.529 85.846 92.167 73.683 114.290 157.232 115.392 271.886 362.473 58 20.699 3.270 5.393 70.359 73.603 58.125 85.523 10.248 85.268 196.243 267.353

118 16.743 ·0.249 0.430 46.104 50.107 34.812 44.851 66.313 47.765 106.786 183.212 177 13.873 ·0.374 ·1.007 33.983 36.366 25.635 31.569 37.195 31.488 48.337 122.374 238 11.631 0.793 0.490 23.436 26.807 15.676 20.067 20.976 17.236 22.011 71.192

t(min) 1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 0 800.440 884.279 920.147 1679.171 1608.859 1776.164 4366.564 4507.272 4477.004 8966.324 8961.624 9067.944

30 692.193 809.168 841.198 1622.317 1590.199 1692.511 4607.388 4767.048 4832.220 9324.984 9704.420 9562.484 58 577.046 715.239 756.429 1474.938 1463.478 1552.574 4502.736 4773.316 4420.028 9677.416 9437.208 9997.168

118 419.872 615.918 657.009 1324.426 1156.507 1388.205 4256.980 4945.904 4327.968 9389.140 9305.176 9457.872 177 310.785 539.608 567.556 1152.800 1063.408 1276.301 3829.344 4529.628 4192.340 8931.428 9203.096 9360.160 238 215.427 466.748 496.130 1027.768 919.534 1153.271 3546.944 4289.729 3687.144 8049.652 8210.372 8176.988

drooggewicht (g OW)

0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 0.194 0.231 0.204 0.207 0.189 0.228 0.258 0.201 0.182 0.209 0.221 0.193

1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 0.172 0.217 0.285 0.232 0.214 0.237 0.234 0.225 0.271 0.211 0.271 0.256

correctie voorcuvetvolume en drooggewicht (lJgP (g OW)")

t(min 0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 0 9 2 1 38 49 31 45 69 65 136 165

30 11 1 3 33 39 26 35 63 51 98 150 59 9 1 2 27 31 20 26 4 37 71 111 95 7 0 0 18 21 12 14 26 21 39 76

142 6 0 0 13 15 9 10 15 14 17 51 179 5 0 0 9 11 6 6 8 8 8 29

t(min) 1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 0 371 326 259 580 601 599 1493 1605 1323 3404 2847 2839

30 321 299 237 560 594 571 1576 1698 1428 3541 2867 3000 59 268 264 213 509 546 524 1540 1700 1306 3674 2788 3130 95 195 227 185 457 432 468 1456 1762 1279 3565 2749 2961

142 144 199 160 398 397 431 1310 1613 1239 3391 2719 2931 179 100 172 140 355 343 389 1213 1528 1090 3056 2426 2560

richtingscoefficUint van de gefitte rechte (~gP (g OWr' min")

0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3

0 0 ·0.1862 ·0.3 ·0.1799 ·0.2639 ·0.3736 ·0.368 ·1.13 ·0.9285

1000·1 1000·2 1000·3 2000-1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000.3

·1.796 ·1.074 ·0.7931 ·0.972 ·1.171 ·0.8846 ·1.431 ·0.446 ·1.078 ·1.617 ·1.09 ·1.292

opnamesnelheid (~gP (g OWr' min")

repll repl2 repl3 gem. 0 0 0 0 0

100 0.186 0.300 0.180 0.222 200 0.284 0.374 0.368 0.335 500 0.000 1.13 0.929 0.686

1000 1.79 1.07 0.793 1.22 2000 0.972 1.17 0.885 1.01 5000 1.43 0.446 1.08 0.985

10000 1.62 1.1 1.29 1.33

A-a

Fosfaatopname november 2000

fosfaatconcentratie (~gP r')

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 39 32 29 113 98 82 194 166 153 441 451 435 63 23 17 17 79 63 54 132 101 104 333 321 336 98 11 5 8 51 36 29 91 57 79 249 252 302

146 5 2 5 32 23 20 57 26 45 178 163 225 187 -2 -2 -2 17 8 2 36 11 23 132 110 175 247 -2 -2 2 8 5 5 23 5 14 70 67 119 305 2 -2 2 2 2 2 11 -2 5 42 36 67

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 875 912 894 1836 1814 1805 1290 1325 1380 2338 2276 2319 63 785 789 779 1718 1603 1653 1222 1281 1287 2285 2136 2270 98 699 702 705 1588 1532 1557 1052 1052 1083 1966 1845 1941

146 596 578 612 1427 1367 1405 1086 1108 1182 2189 2081 2118 187 513 500 590 1362 1284 1337 987 1018 1052 1799 1727 1814 247 401 429 497 1229 1160 1191 962 974 1036 1802 1734 1789 305 327 345 414 1123 1070 1098 1074 1080 1142 1994 2012 2096

drooggewicht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.110 0.099 0.088 0.096 0.147 0.133 0.109 0.187 0.142 0.149 0.173 0.121

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.139 0.117 0.124 0.127 0.141 0.134 0.135 0.134 0.106 0.194 0.211 0.154

correctie voor cuvetvolume en drooggewlcht (lIgP (g OW)"')

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 28 26 27 94 53 49 142 71 86 238 209 289 63 17 14 16 66 35 33 97 43 58 179 148 223 98 8 4 7 42 19 18 67 25 45 134 117 200

146 3 1 4 27 13 12 42 11 25 96 75 149 187 -1 -1 -1 14 4 1 26 5 13 71 51 116 247 -1 -1 1 6 3 3 17 2 8 38 31 79 305 1 -1 1 1 1 1 8 -1 3 23 16 44

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 504 622 577 1155 1026 1076 766 791 1044 963 865 1205 63 452 537 503 1081 907 985 725 765 973 941 812 1179 98 402 478 455 999 867 928 624 628 819 810 701 1008

146 343 394 395 897 784 838 644 881 894 902 791 1100 187 295 341 381 856 727 797 586 608 795 741 656 942 247 231 292 321 773 656 710 571 582 784 742 659 930 305 188 235 267 706 606 655 637 645 8S3 821 765 1069

rlchtlngscollfflcillnt van de gefitte rechte (lIgP (g OW)"' min")

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 0 0 -0.3797 -0.4993 -0.4362 -0.8738 -0.7387 -0.6062 -1.086 -0.9751 -1.045

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -1.722 -1.751 -1.685 -1.907 -2.049 -1.907 -6.692 -9.444 -11.01 -14.91 -14.46 -11.06

opnamesnelheid (lIgP (g OW)"' min-')

repl1 repI2 0 0

100 0.38 0.50 0.44 200 0.87 0.74 0.61 0.74 500 1.09 0.98 1.05 1.04

1000 1.72 1.75 1.69 1.72 2000 1.91 2.05 1.91 1.95 5000 6.7 9.4 11.0 9.0

10000 14.91 14.5 11.1 13.5

A-9

Fosfaatopname december 2000

fosfaatconcentratie (1J9P 1"1)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 25 22 15 87 129 80 198 178 194 439 458 436 63 12 5 5 74 90 54 162 145 158 387 390 361

116 -8 -14 8 -5 61 22 123 93 116 273 295 256 183 -21 -24 -24 -24 28 -5 87 57 74 191 220 -37 247 -24 -24 -24 -24 12 -14 54 35 54 132 158 96 305 -27 -27 -27 -27 -5 -27 31 5 25 77 106 51

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 882 885 908 1922 1932 1811 4337 4976 4390 6241 6646 6789 63 833 778 840 1837 1779 1676" 4768 4937 4129' 6085 6346 6567

116 709 631 722 1746 1635 1485 4585 4233 3698 6098 6046 6463 183 618 494 592 1687 1547 1296 4742 4494 3503 5654 6646 7076 247 517 383 498 1586 1423 1123 4207 4376 3516 6176 5980 6411 305 439 299 419 993 1127 1476 4155 4090 2851 6111 6515 7024

drooggewicht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.065 0.057 0.058 0.088 0.048 0.065 0.045 0.047 0.044 0.062 0.064 0.072

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.051 0.069 0.063 0.056 0.061 0.051 0.063 0.058 0.064 0.091 0.054 0.056

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (~gP (g OWr1)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 3D 30 30 21 79 217 99 352 304 352 570 576 487 63 14 7 7 67 151 67 288 248 287 502 490 403

116 -10 -20 12 -4 102 27 218 159 211 354 371 286 183 -26 -34 -33 -22 47 -6 155 98 134 248 277 -42 247 -30 -34 -33 -22 20 -18 96 59 98 172 199 108 305 -34 -39 -38 -25 -8 -34 56 9 45 100 133 57

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 1395 1028 1153 2751 2538 2858 5552 6864 4200 5499 9937 9751 63 1317 903 1068 2630 2337 2647 6103 6810 3951 5361 9489 9432

116 1122 733 917 2499 2148 2344 5869 5839 3539 5373 9040 9283 183 977 574 752 2415 2033 2045 6069 6198 3352 4982 9937 10163 247 817 445 632 2270 1870 1773 5385 6037 3364 5442 8943 9208 305 694 347 532 1421 1480 2328 5318 5641 2728 5364 9742 10088

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (g OW)"' min")

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 a a -1.006 -1.3 -0.8346 -1.531 -1.681 -1.632 -2.538 -2.367 -2.317

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -3.225 -3.413 -2.75 -2.886 -4.44 -5.958 -1.767 -3.915 -4.593 -0.2993 -0.6731 1.065

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min")

repll repl2 repl3 gem. 0 0 a a a

100 1.01 1.30 0.835 1.05 200 1.53 1.68 1.63 1.61 500 2.54 2.37 2.32 2.41

1000 3.23 3.41 2.75 3.13 2000 2.89 4.44 5.96 4.43 5000 1.77 3.92 4.59 3.43

10000 0.299 0.673 0.000 0.324

A-10

Tabel A.4.2 De gegevenstabel gebruikt voor biplot 1 van de seizoenale opvolging (figuur 4.2).

datum maand biomassa conductiviteit Vmax Km T·P o·p N03· CO2 HC03· 13-01·00 J 152 247 3.76 698 28.7 32.7 85 16·02-00 F 176 266 2.27 36 13.8 12.7 52 220 0.66 15·03·00 M 153 231 2.77 432 26.7 16.0 51 158.4 0.62 12-04-00 A 262 202 0.95 81 14.6 14.4 0 158.4 0.8 29-05·00 M 286 221 2.77 653 46.9 19.4 19 167.2 0.8

3-07·00 257 304 6.34 582 16.3 19.4 45 149.6 1.17 16·08·00 A 230 350 3.70 285 13.9 2.69 14 308 1.7 17·09·00 S 188 367 3.01 107 925 775 34 299.2 1.6 12·10·00 0 111 252 1.43 482 458 355 6 220 0.76 8·11·00 N 112 224 2.41 640.3 36.9 7.70 5 184.8 0.82

19-12·00 0 94 209 5.35 553 43.6 7.11 25 184.8 0.71 (gm·2) ~Scm·1 ~gP/g OW/min ~gP/1 ~gP/1 ~gPtl ~gNtl mg C02l1 meq

datum maand CamgtL MgmgtL KmgtL NamgtL chloride chi a chi b chi c 13·01·00 J 0.00 0.00 0.00 16·02·00 F 4.72 18.8 1.3 5.8 18.1 0.00 0.00 0.00 15·03·00 M 2.72 6.32 1.26 6 13.5 0.00 0.00 0.00 12·04-00 A 2.43 6.88 1.2 6.8 12.8 7.25 3.73 5.65 29·05-00 M 3.49 3.68 1.3 8 13.1 10.5 1.41 0.81 3-07-00 4.98 8.64 1.91 11.4 20.2 7.59 0.41 0.00

16·08-00 A 6.08 8.96 2.36 10 22.3 27.1 3.60 4.12 17-09-00 S 8.2 24.32 2.58 9.5 42.6 11.2 2.27 1.83 12·10·00 0 8.04 12.88 1.5 6.9 22.7 8.95 1.96 2.67 8·11·00 N 2.83 14.16 1.28 6 18.1 11.2 2.10 3.46

19-12·00 0 3.1 20.8 1.42 7.3 17.7 42.9 5.28 3.14 mgtl mgtl mgtl mgtl mgtl ~gtl J.lg/I J.lgtl

datum maand sulfaat DOC Cyanophyta Chlorophyta Bacillarioph ceae zuurstof temperatuur 13·01·00 J 105.2 2.3 16-02·00 F 15 20.9 698 4540 550 101.1 5.6 15-03·00 M 20 18.8 360 5392 1513 110.2 8.2 12-04-00 A 20 22.4 519 5101 1386 98.2 12.3 29-05-00 M 14 22.0 180 5407 519 101.2 16.2

3·07-00 15 19.8 2624 2016 979 89.0 24.4 16·08-00 A 14 18.9 1566 4127 2111 45.0 23.6 17·09-00 S 26 14.4 5913 931 2217 49.2 17.5 12·10-00 0 29 18.5 2513 2270 2963 80.0 11.6 8·11-00 N 14 21.6 455 1058 1730 88.4 8.9

19·12-00 0 14 23.5 1889 730 1032 93.5 5.7 mgn mgtl aantal cm·2 aantal cm·2 aantal cm·2 %02 ·C

Tabel A.4.3 De gegevenstabel gebruikt voor biplot 2 van de seizoenale opvolging (figuur 4.4).

A·11

datum maand biomassa conductiviteit Vmax Km T-P o-P N03- CO2 HC03- Ca mg/L 3-07-00 257 304 6.34 582 16.3 19.4 45 149.6 1.17 4.98

16-08-00 A 230 350 3.70 285 13.9 2.69 14 308 1.7 6.08 17-09-00 S 188 367 3.01 107 925 775 34 299.2 1.6 8.2 12-10-00 0 111 252 1.43 482 458 355 6 220 0.76 8.04 8-11-00 N 112 224 2.41 640.3 36.9 7.70 5 184.8 0.82 2.83

19-12-00 D 94 209 5.35 553 43.6 7.11 25 184.8 0.71 3.1 (g m-2) ~S cm-1 ~gP/g DW/min ~gP/I ~gP/I ~gP/I ~gN/I mgC02/1 meq mg/l

datum maand Mg mg/L Kmg/L Na mg/L chloride chi a chi b chi c sulfaat DOC 3-07-00 J 8.64 1.91 11.4 20.2 7.59 0.41 0.00 15 19.8

16-08-00 A 8.96 2.36 10 22.3 27.1 3.60 4.12 14 18.9 17-09-00 S 24.32 2.58 9.5 42.6 11.2 2.27 1.83 26 14.4 12-10-00 v' 12.88 1.5 ',:).;1 22.7 8.95 1.96 2.67 29 18.5 8-11-00 N 14.16 1.28 6 18.1 11.2 2.10 3.46 14 21.6

19-12-00 D 20.8 1.42 7.3 17.7 42.9 5.28 3.14 14 23.5 mg/l mg/l mg/l mgll ~g/l ~g/l ~g/l mg/l mg/l

datum maand Cyanophyta Chlorophyta Bacillariophyceae zuurstof temperatuur fosforgehalte stikstofgehalte opname 5000 3-07-00 J 2624 2016 979 89.0 24.4 0.023 0.76 2.74

16-08-00 A 1566 4127 2111 45.0 23.6 0.023 0.76 0.603 17-09-00 S 5913 931 2217 49.2 17.5 0.024 0.80 3.54 12-10-00 0 2513 2270 2963 80.0 11.6 0.023 0.66 0.985 8-11-00 N 455 1058 1730 88.4 8.9 0.024 0.80 9.05

19-12-00 D 1889 730 1032 93.5 5.7 0.021 0.85 3.43 aantal cm-2 aantal cm-2 aantal cm-2 %02 "C mmol P/gDW mmol N/gDW ~gP/(g DW.min)

A-12

Tabel AAA Factorladingen en verklaarde variabiliteit voor biplot 1 van de seizoenale opvolging (figuur 4.2).

Factor 1 Factor 2

biomassa 0.03908 -0.58432 conductivitei -086833 -0.36615

Vma -0.14877 -0.72546 Km 0.302146 -0.21751 TP -0.80639 0.399483 oP -0.81371 0.375474

N03 -0.04168 -0.44443 CO2 -0.79926 0.07477

alkalinitei -0.80889 -0.3821 Ca2 -0.85989 0.112282 Mg2 -0.51148 0.337727

K -0.90824 -0.32136 Na -0.58001 -0.6922

CI -0.93442 0.108741 chlorofyl a -0.1423 -007337 chlorofyl b -0.11621 0.248846 chlorofyl c -0.04013 0.406811

S042 -0.47743 0.622838 DOC 0.83707 -0.04588

cyanofyten -0.89908 0.050167 chlorofyten 0.487206 -0.15701

bacillariofyten -0.60909 0.49859 02 0.875348 0.121857

temperatuu -0.67471 -0.5769

ExplVa 10.11384 3.665934 Prp.Totl 0.42141 0.152747

Tabel AA.5 Factoriadingen en verklaarde variabiliteit voor biplot 2 van de seizoenale opvolging (figuur 4.4).

Factor 1 Factor 2

biomassa 0.550999 -0.79429 conductivitei 0.898542 -0.33499

Vma -0.22803 -0.81158 Km -0.87714 -0.12061

opname 5000 -0.45296 0.230521 TP 0.735491 0.537972 oP 0.757809 0.500489

N03 0.291483 -0.61564

CO2 0.732737 0.198425 alkaliniteit 0.788806 -0.38982

Ca2+ 0.858564 0.255174 Mg2+ 0.155818 0.548375

K+ 0.878115 -0.30383 Na+ 0.547996 -0.79492

CI- 0.853839 0.25717 chlorofyl a -0.41483 -0.06905 chlorofyl b -0.32023 0.221505 chlorofyl c -0.24208 0.423203

5042 0.574003 0.622228 DOC -0.95387 -0.15138

cyanofyten 0.791675 0.134554 chlorofyten 0.291472 -0.40038

bacillariofyten 0.504254 0.641026 02 -0.81748 0.011228

temperatuu 0.615323 -0.71349 P-gehalte plant 0.452427 0.059666 N-gehalte plant -0.291 -0.1665

Expl.Va 10.93348 5.508726 Prp.Totl 0.404944 0.204027

A-13

Tabel AA.6 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de inleidende experimenten over de invloed

van Na+ en K+ op de opnamesnelheid (4.3.1).

Fosfaatopname november 2000 conditie met K 3 PO 4 -toediening

fosfaatconcentrafie (~gP r')

T 0·1 0·2 0·3 100.1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 30 39 32 29 113 98 82 194 166 153 441 451 435 63 23 17 n 79 63 54 132 101 104 333 321 336 98 11 5 8 51 36 29 91 57 79 249 252 302

146 5 2 5 32 23 20 57 26 45 178 163 225 187 ·2 ·2 ·2 17 8 2 36 11 23 132 110 175 247 ·2 ·2 2 8 5 5 23 5 14 70 67 119 305 2 ·2 2 2 2 2 11 ·2 5 42 36 67

T 1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 30 875 912 894 1836 1814 1805 1290 1325 1380 2338 2276 2319 63 785 789 779 1718 1603 1653 1222 1281 1287 2285 2136 2270 98 699 702 705 1588 1532 1557 1052 1052 1083 1966 1945 1941

146 596 578 612 1427 1387 1405 1086 1108 1182 2189 2081 2118 187 513 500 590 1362 1284 1337 987 1018 1052 1799 1727 1814 247 401 429 497 1229 1160 1191 962 974 1036 1802 1734 1789 305 327 345 414 1123 1070 1098 1074 1080 1142 1994 2012 2096

drooggewicht (g OW)

0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 0.110 0.099 0.088 0.096 0.147 0.133 0.109 0.187 0.142 0.149 0.173 0.121

1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000-3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·' 10000·2 10000·3 0.139 0.117 0.124 0.127 0.141 0.134 0.135 0.134 0.106 0.194 0.211 0.154

co"ectie voor cuvetvo/ume en drooggewichf (~gP (9 OWr')

T 0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100·3 200·1 200·2 200·3 500·1 500·2 500·3 30 28 26 27 94 53 49 142 71 86 238 209 289 63 17 14 16 66 35 33 97 43 58 179 148 223 98 8 4 7 42 19 18 67 25 45 134 117 200

146 3 1 4 27 13 12 42 11 25 96 75 149 187 ·1 ·1 ·1 14 4 1 26 5 13 71 51 116 247 ·1 ·1 1 6 3 3 17 2 8 38 31 79 305 1 ·1 1 1 1 1 8 ·1 3 23 16 44

T 1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000·3 5000·1 5000·2 5000·3 10000·1 10000·2 10000·3 30 504 622 577 1155 1026 1076 766 791 1044 963 865 1205 63 452 537 503 1081 907 965 725 765 973 941 812 1179 98 402 478 455 999 867 928 624 626 619 610 701 1006

146 343 394 395 897 784 838 644 661 894 902 791 1100 187 295 341 381 856 727 797 586 608 795 741 656 942 247 231 292 321 773 656 710 571 582 784 742 659 930 305 188 235 267 706 606 655 637 845 863 821 765 1089

richtingscoiifficiijnt van de gefitte rechte (lJgP (g OW)"' min")

0·1 0·2 0·3 100·1 100·2 100-3 200·1 200·2 200·3 500·1 500-2 500-3

0 0 0 ·0.3797 ·0.4993 ·0.4362 ·0.8738 ·0.7387 ·0.6062 ·1.086 ·0.9751 -1.045

1000·1 1000·2 1000·3 2000·1 2000·2 2000.3 5000·1 5000·2 5000-3 10000·1 10000·2 10000·3 ·1.722 ·1.751 ·1.685 ·1.907 ·2.049 ·1.907 -6.692 ·9.444 ·11.01 ·14.91 ·14.46 ·11.06

opnamesnelheid (lJgP (g OW)"' min")

repl1 repl2 repl3 gem. 0 a 0 0 0

100 0.38 0.50 0.44 0.44 200 0.87 0.74 0.61 0.74 500 1.09 0.98 1.05 1.04

1000 1.72 1.75 1.69 1.72 2000 1.91 2.05 1.91 1.95 5000 6.7 9.4 11.0 9.0

10000 14.91 14.5 11.1 13.5

A-14

Fosfaatopname november 2000 conditie met NaH 2 PO 4 -toediening

fosfaatconcentratie (~gP I"')

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 2 2 11 79 79 110 163 150 156 414 327 367 63 0 0 2 54 48 82 122 107 135 324 259 290 98 0 0 0 54 29 70 91 76 107 271 203 225

146 0 0 2 23 17 51 70 51 88 200 122 166 247 0 0 0 11 5 32 39 23 67 125 54 88

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 841 801 807 1780 1805 1836 5015 5473 5238 10320 10580 10406 63 739 609 714 1579 1653 1718 4643 4817 4817 10109 10059 9935 98 671 534 587 1517 1520 1628 4085 4457 4333 8597 8969 8795

146 584 417 479 1377 1393 1501 4296 4470 4593 9415 9873 9340 247 448 203 308 1086 1173 1337 3255 3775 3949 7692 8287 8051

drooggewicht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.086 0.109 0.123 0.093 0.117 0.108 0.096 0.118 0.096 0.132 0.143 0.132

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.101 0.144 0.137 0.137 0.138 0.119 0.164 0.126 0.097 0.137 0.132 0.172

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (J,lgP (9 DWr1)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 1 0 7 68 54 81 136 102 130 251 183 223 63 0 0 1 47 33 61 102 72 112 196 145 176 98 0 0 0 47 20 52 76 51 89 164 114 136

146 0 0 1 20 12 38 58 35 73 121 68 100 247 0 0 0 9 3 24 32 16 55 76 30 53

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 668 445 472 1037 1046 1232 2451 3470 4333 6030 6436 4837 63 586 338 417 920 958 1153 2269 3053 3985 5907 6120 4618 98 532 297 343 884 881 1093 1996 2825 3585 5024 5456 4088

146 464 232 280 802 807 1008 2099 2833 3800 5502 6007 4342 247 355 113 180 633 680 897 1591 2393 3267 4495 5041 3743

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (g OW)"' min-')

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 0 -0.3797 -0.4993 -0.4362 -0.8738 -0.7387 -0.6062 -1.086 -0.9751 -1.045

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -1.722 -1.751 -1.685 -1.907 -2.049 -1.907 -6.692 -9.444 -11.01 -14.91 -14.46 -11.06

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min")

repl1 repl2 repl3 gem. 0 0 0 0 0

100 0.38 0.50 0.44 0.44 200 0.87 0.74 0.61 0.74 500 1.09 0.98 1.05 1.04

1000 1.72 1.75 1.69 1.72 2000 1.91 2.05 1.91 1.95 5000 6.7 9.4 11.0 9.05

10000 14.91 14.5 11.1 13.5

A-15

Fosfaatopname december 2000 conditie met K 3 PO 4 -toediening

fosfaatconcentratie (JlgP 1'1)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 25 22 15 87 129 80 198 178 194 439 458 436 63 12 5 5 74 90 54 162 145 158 387 390 361

116 -6 -14 8 -5 61 22 123 93 116 273 295 256 183 -21 -24 -24 -24 26 -5 87 57 74 191 220 -37 247 -24 -24 -24 -24 12 -14 54 35 54 132 156 96 305 -27 -27 -27 -27 -5 -27 31 5 25 77 106 51

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 882 885 908 1922 1932 1811 4337 4976 4390 6241 6646 6789 63' 833 778 840 1837 1779 1678 4768 4937 4129 608S 6346 6567

116 709 631 722 1746 1635 1485 4585 4233 3698 6098 6046 6463 183 618 494 592 1687 1547 1296 4742 4494 3503 5654 6646 7076 247 517 383 498 1586 1423 1123 4207 4376 3516 6176 5980 6411 305 439 299 419 993 1127 1476 4155 4090 2851 6111 6515 7024

drooggewicht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.065 0.057 0.058 0.088 0.048 0.065 0.045 0.047 0.044 0.062 0.064 0.072

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.051 0.069 0.063 0.056 0.061 0.051 0.063 0.058 0.064 0.091 0.054 0.056

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht {lJgP (9 Dwrt)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 30 30 21 79 217 99 352 304 352 570 576 487 63 14 7 7 67 151 67 288 248 287 502 490 403

116 -10 -20 12 -4 102 27 218 159 211 354 371 286 183 -26 -34 -33 -22 47 -6 155 98 134 248 277 -42 247 -30 -34 -33 -22 20 -18 96 59 98 172 199 108 305 -34 -39 -38 -25 -8 -34 56 9 45 100 133 57

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 3D 1395 1028 1153 2751 2538 2858 5552 6864 4200 5499 9937 9751 63 1317 903 1066 2630 2337 2647 6103 6810 3951 5361 9489 9432

116 1122 733 917 2499 2148 2344 5869 5839 3539 5373 9040 9283 183 977 574 752 2415 2033 2045 6069 6198 3352 4982 9937 10163 247 817 445 632 2270 1870 1773 5385 6037 3364 5442 8943 9208 305 694 347 532 1421 1480 2328 5318 5641 2728 5384 9742 10088

richtingscoefficienf van de gefitte rechte (~gP (g OW)"' min·')

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 -1.006 -1.3 -0.8346 -1.531 -1.681 -1.632 -2.538 -2.367 -2.317

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -3.225 -3.413 -2.75 -2.886 -4.44 -5.958 -1.767 -3.915 -4.593 -0.2993 -0.6731 1.065

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min"')

repll repl2 repl3 gem. 0 0 0 0 0

100 1.01 1.30 0.835 1.05 200 1.53 1.68 1.63 1.61 500 2.54 2.37 2.32 2.41

1000 3.23 3.41 2.75 3.13 2000 2.89 4.44 5.96 4.43 5000 1.77 3.92 4.59 3.43

10000 0.299 0.673 0.000 0.324

A-16

Fosfaatopname december 2000 conditie met NaH 2 PO 4 -toediening

fosfaatconcentratie (jJgP 1"1)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 -1 -1 5 87 87 87 178 181 162 -37 442 403 63 -5 -5 5 67 80 64 162 162 136 308 400 370

116 -14 -8 2 48 113 48 129 136 87 224 390 318 183 -37 -18 -5 25 -37 18 93 116 44 132 299 253 247 -21 -21 -8 8 25 12 80 113 18 77 266 188 305 -24 -21 -11 -1 18 -5 57 74 2 41 217 149

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 -37 879 885 1808 1805 1821 3398 4872 4390 9697 9084 8876 63 758 752 807 1769 1776 1642 4324 4455 4116 8680 9045 8823

116 625 690 670 1577 1538 1482 4350 4324 3972 9319 8980 8628 183 491 524 586 1433 1371 1423 3933 4116 3959 9110 8158 8002 247 390 423 471 1296 1251 1189 3672 4259 3764 8380 8432 8706 305 312 351 413 1127 1137 1062 3542 4024 3438 8054 7884 8237

drooggewicht (g OW)

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0.052 0.029 0.038 0.047 0.040 0.042 0.046 0.044 0.066 0.070 0.053 0.064

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 0.057 0.058 0.058 0.080 0.068 0.067 0.072 0.063 0.061 0.055 0.071 0.081

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht {f.lgP (g OW)"1)

T 0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 30 -2 -4 11 148 174 164 307 333 197 -43 672 501 63 -7 -13 11 115 161 121 279 297 165 353 608 461

116 -22 -22 4 81 227 90 223 249 105 256 593 396 183 -57 -49 -10 42 -75 35 161 213 54 151 454 315 247 -32 -58 -17 14 50 22 138 207 22 88 405 234 305 -37 -58 -23 -2 37 -9 99 135 2 47 330 185

T 1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 30 -53 1208 1226 1801 2114 2174 3766 6226 5785 14079 10221 8820 63 1074 1033 1117 1762 2080 1960 4791 5693 5424 12602 10177 8769

116 864 948 928 1571 1801 1770 4820 5526 5235 13530 10104 8574 183 695 720 810 1428 1606 1700 4358 5260 5218 13227 9180 7952 247 552 581 652 1291 1465 1419 4069 5443 4960 12167 9488 8652 305 441 482 571 1123 1331 1267 3925 5143 4531 11694 8871 8185

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (g owr' min-')

0-1 0-2 0-3 100-1 100-2 100-3 200-1 200-2 200-3 500-1 500-2 500-3 0 -0.6728 -0.5645 -0.8081 -0.9879 -0.9694 -1.066 -1.674 -1.322 -1.219

1000-1 1000-2 1000-3 2000-1 2000-2 2000-3 5000-1 5000-2 5000-3 10000-1 10000-2 10000-3 -3.14 -2.992 -2.751 -2.483 -2.977 -3.086 -1.299 -3.066 -3.766 -6.692 -4.934 -2.025

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min-')

repll repl2 repl3 gem. 0 0 0 0

100 0.67 0.58 0.808 0.69 200 0.99 0.97 1.07 1.01 500 1.67 1.32 1.22 1.41

1000 3.14 2.99 2.75 2.96 2000 2.48 2.98 3.09 2.85 5000 1.30 3.07 3.79 2.72

10000 6.692 4.934 2.025 4.55

A-17

Tabel A.4. 7 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de experimenten uit punt 4.3.2.

Experiment zonder voorafgaande natrium uithongering

fosfaatconcentraties

biomassa

tijd 29 58 89

118

29 58 89

118

0·1 344 259 159 100

2-1 297

96 65 27

5-1 313 178

74 56

0·1 0.251

2·1 0.304

5-1 0.375

correctie voor biomassa en cuvetvolume

tijd 29 58 89

118

29 58 89

118

29 58 89

118

0-1 110 83 51 32

2-1 78 25 17 7

5-1 67 38 16 12

richtingscoefticienten van de raaklijnen

opnamesne/heden

Na-cond.

A-18

0·1 -0.98

2-1 -1.01

5-1 -0.84

r1 0.98 1.12 1.01 0.93 0.84

0·2 369 175 128

71

2-2 347 237

78 49

5-2 200

49 24

0·2 0.232

2-2 0.268

5-2 0.318

0-2 127

60 44 25

2·2 104

71 23 15

5-2 50

12

0·2 -1.37

2-2 -1.34

5-2 -0.52

r2 1.37 1.15 1.34 0.67 0.52

0·3 388 291 215 206

2-3 225 231 125 87

190 131

53 40

0-3 0.187

2-3 0.206

5-3 0.282

0-3 166 124

92 88

2-3 88 90 48 34

5-3 54 37 15 11

0-3 -1.23

2-3 -0.66

5-3 -0.65

,3 1.23 0.90 0.66 0.82 0.65

0-4 325 244 150 87

2-4 303 165

90 49

231 87 34 31

0-4 0.185

2-4 0.249

0.365

0-4 141 105 65 38

2-4 97 53 29 16

51 19 7

0-4 -1.27

2-4 -1.14

-0.72

,4 1.27 0.98 1.14 0.75 0.72

0·5 266 212 140

90

2-5

;~;I 90 40

153 62 46 12

0-5 0.209

2-5 0.249

5-5 0.312

0-5 102 81 54 34

2-5 104 54 29 13

5-5 39 16 12

0-5 -0.80

2-5 -1.25

5-5 -0.45

,5 0.80 0.92 1.25 0.78 0.45

1·1 309 200 109 40

3-1 309 153 100 62

1-1 0.238

3·1 0.299

1-1 104 67 37 13

3-1 83 41 27 17

1-1 -1.12

3·1 -0.93

gem. 1.13 1.01 1.08 0.79 0.64

1-2 353 209 147

96

3-2 231 100 46 18

1-2 0.239

3·2 0.366

1-2 119 70 49 32

3-2 51 22 10

1-2 -1.15

3-2 -0.67

1-3 316 212 128

74

3-3 241 109

53 24

1-3 0.278

3-3 0.303

1-3 91 61 37 21

3-3 64 29 14 6

1-3 -0.90

3·3 -0.82

1-4 331 184 137

90

3-4 278 272 106 62

1-4 0.263

3-4 0.310

1-4 101

56 42 27

3-4 72 70 27 16

1-4 -0.98

3-4 -0.75

1-5 394 256 234 172

3-5 259 172 87 46

1-5 0.229

3-5 0.296

1-5 137

89 82 60

3-5 70 46 23 12

1-5 -0.92

3·5 -0.78

Experiment met voorafgaande natriumuithongering

fosfaatconcentraties

"d 0-1 0-2 0-3 0-4 0-5 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 17 628 589 621 680 569 572 697 595 576 576 46 546 477 487 546 396 369 523 438 409 399 78 428 409 399 481 330 258 494 297 307 294

116 389 324 317 396 248 167 389 216 245 212 171 304 245 212 327 173 75 291 137 150 121

2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 17 576 608 648 599 576 618 572 612 671 546 46 379 409 520 379 474 438 386 455 527 360 78 258 255 409 245 343 265 301 350 432 275

116 160 154 252 147 = 252 212 232 347 173 171 95 65 183 62 121 134 91 144 226 88

5-1 5-2 5-3 5-4 5-S 17 631 618 605 477 589 46 360 425 484 474 474 78 288 379 350 216 373

116 150 275 242 114 248 171 68 163 131 46 167

biOnJaua 0-1 0-2 0-3 0-4 0-5 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5

0.197 0.172 0.197 0.157 0.175 0.223 0.158 0.200 0.179 0.252

2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 0.225 0.219 0.221 0.239 0.216 0.184 0.221 0.204 0.236 0.246

5-1 5-2 5-3 5-4 5-S 0.258 0.220 0.230 0.261 0.279

cOn'ectie voor biomassa en cuvetvoJume

tijd 0-1 0-2 0-3 0-4 0-5 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 17 255 273 252 347 261 205 352 238 258 176 46 222 = 198 278 181 133 264 175 183 122 78 174 190 152 245 151 93 250 119 138 90

116 150 150 129 202 114 60 197 86 110 65 171 124 114 86 167 79 27 147 55 67 37

2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 17 204 222 235 201 213 269 207 240 227 178 46 135 149 189 127 176 191 140 178 178 117 78 92 93 148 82 127 115 109 137 146 89

116 57 56 95 49 82 110 77 91 117 56 171 34 24 66 21 45 58 33 56 76 29

5-1 5-2 5-3 5-4 5-S 17 196 225 211 146 169 46 112 155 169 145 136 78 89 138 122 66 107

116 47 100 84 35 71 171 21 60 46 14 48

richtingscoefficJinten van de raaklijnen

0-1 0-2 0-3 0-4 0-5 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 -1.33 -1.36 -1.47 -1.66 -1.78 -1.84 -1.66 -1.95 -1.96 -1.40

2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 -1.01 -1.84 -2.11 -1.42 -1.93 -2.52 -1.60 -1.67 -1.32 -1.44

5-1 5-2 5-3 S-4 5-S -1.73 -1.41 -1.46 -1.34 -1.01

opnamesnelheden

Na-cond. r1 r2 r3 r4 rS gem. 0 1.33 1.36 1.47 1.66 1.78 1.52 1 1.84 1.66 1.95 1.96 1.40 1.76 2 1.84 2.11 1.42 1.93 1.41 1.74 3 2.52 1.60 1.67 1.32 1.44 1.71 5 1.73 1.41 1.46 1.34 1.01 1.39

A-19

Tabel A.4.B Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de experimenten uit punt 4.3.3.

fosfaatconcentratie

tijd (min)

20

49

90

148

209

20

49

1

90

148

209

0

9

0

148

20 9

drooggewicht

1·1

750

697

589

567

498

5·1

728

643

574

479

403

9·1

744

731

659

662

608

1·1

0,0397

5·1

0.0439

9·1

0.019

1·2

728

687

637

640

574

5·2

738

728

640

630

586

9·2

757

725

668

640

605

1-2

0.0398

5-2

0.03

9·2

0.0217

correctie v~~r cuvetvolume en drooggewicht

1-3

712

662

583

536

492

5-3

728

:;1 561

9-3

738

690

652

608

555

1-3

0.0462

5-3

0.0232

9-3

0.0287

2·1

728

690

596

539

482

6·1

744

706

646

602

533

10~1

725

731

697

684

668

2·1

0.0282

6·1

0.0363

10-1

0.0196

2·2

757

665

640

611

539

6·2

738

690

634

570

529

10-2

753

728

678

649

640

2·2

0.0368

6-2

0.0252

10-2

0,0221

tijd (min) 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2

20 1511.931083 1467.430126 1435.643728 1467.430126 1524.645642

49 1403,85733 1384.785491 1333.927254 1391.142771 1340.284534

90 1187.709824 1283.069018 , 174.995264 1200.424383 1289.426297

2-3

722

668

599

533

485

6-3

~~:I' 634

611

570

10-3

753

706

649

611

574

2-3

0.0428

6-3

0.0358

10-3

0.0248

3·1

731

643

567

517

444

7·1

706

659

624

611

570

11-1

719

703

643

599

536

3·1

0.0371

7·1

0.0268

11·' 0.0229

3·2

738

643

580

533

485

7·2

753

697

646

646

586

11-2

687

640

548

488

413

3·2

0.0338

7·2

0.0206

0.043

741

694

637

586

548

7-3

~~~I 621

618

583

11-3

741

671

640

593

520

3-3

0.0287

7-3

0.025

11-3

0.0304

4·1

662

665

627

580

520

8·1

719

659

593

526

454

12-1

722

687

662

608

580

4·1

0.0319

8·1

0,0337

12-1

0.0192

4·2

719

668

618

583

567

8·2

728

690

615

545

501

12-2

731

675

615

567

520

4-2

0,0319

8·2

0.0251

12-2

0.0303

722

675

608

570

523

8-3

757

712

675

627

593

12-3

725

652

611

555

495

4-3

0.0382

8-3

0,0224

12-3

0.0285

1454.715567 1473.787406 1486.501965 1492.859244 1333.927254 1448.358287 1454,715567

1346.641814 1295.783577 1295.783577 1397.50005 1340.284534 1346.641814 1359.356373

1206.781662 1143.208666 1168.637985 1283.069018 1263.997179 1244.92534 1225.853501

148 1143.208866 1289.426297 1079.636071 1085.99335 1232.210781 1073.278791 1041.492393 1073.278791 1181.352544 1168.637985 1174.995264 1149.566146

209 1003.348715 1155.923426 990.6341562 971.5623174 1085.99335 977.919597 895.2749622 977.919597 1105.065189 1047.849673 1143.208866 1054.206952

5·1

20 1467.430126

49 1295.783577

90 1155.923426

148 965.2050378

209 812.6303275

9·1

20 1499.216524

49 1473,787406

90 1327.569975

148 1333.927254

209 1225.853501

5·2

1486.501965

1467.430126

1289.426297

1270.354458

1181.352544

9·2

1524.645642

1461.072846

1346.641814

1289.426297

1219.496222

richtingscoefficitinten van de lineaire fits

1·1 1·2

-1.464

5·1 5·2

-3.373 -1.65

9·1 9·2 -1.407 -1.594

5-3 6·1 6·2

1467.430126 1499.216524 1486.501965

1422.929169 1422.929169 1391.142771

1302.140856 1302.140856 1276.711738

1251.28262 1213.138942 1149.566146

1130.494307 1073.278791 1066.921511

9-3 10-1 10-2

1486.501965 1461.072846 1518.288363

1391.142771 1473.787406 1467.430126

1314.855416 1403.85733 1365.713652

1225.853501 1378.428212 1308.498136

1117.779748 1346,641814 1289.426297

1-3 2·1 2·2

-2.327 -2.664 -1.998

5-3 6·1 6·2

-1.753 -2.201 -2.219

9-3 10-1

-1.862 -1.241

opnamesnelheid (zie balkenfiguur in basisbestand.pzm)

cond 1

cond 2

condJ

cond4

cond5

cond 6

cond7

cond 8

cond 9

cond 10

cond 11

cond 12

A-20

r1 r2

2.59

2.66

2.87

1.60

3.37

2.20

1.30

2.75

1.41

0.68

1.98

1.51

1.46

2.00

2.49

1,56

1.65

2.22

1.56

2.49

1.59

1.24

2.91

2,18

r3

2.33

2.51

2.03

2.06

1,75

1,75

1.69

1.71

1.86

1.86

2.16

2.30

gem.

2.13

2.39

2.46

1.74

2.26

2.06

1.51

2.32

1.62

1.26

2.35

2.00

6-3 7·1 7·2 7--3 8·1 8-2 8-3

1480.144685 1422.929169 1518.288363 1505.573804 1448.358287 1467.430126 1524.645642

1429.286448 1327.569975 1403.86733 1429.286448 1327,569975 1391.142771 1435.643728

12.76.711738 1257.639899 1302.140856 1251.28262 1194.067103 1238.56806 1359.356373

1232.210781 1232.210781 1302.140856 1244.92534 1060.564232 1098.707909 1263.997179

1149.566146 1149.566146 1181.352544 1174.995264 914.346801 1009.705995 1194.067103

10-3 11-1 11-2 11-3 12-1 12-2 12-3

1518.288363 1448.358287 1384.785491 1492.859244 1454.715567 1473.787406 1461.072846

1422.929169 1416.571889 1289.426297 1352.999093 1384.785491 1359.356373 1314.855416

1308.498136 1295.783577 1105.065189 1289.426297 1333,927254 1238.56806 1232.210781

1232.210781 1206.781662 984.2768766 1194.067103 1225.853501 1143.208866 1117.779748

1155.923426 1079.636071 831.7021662 1047.849673 1168.637985 1047.849673 996.9914358

2-3 3·1 3·2 3-3 4·1 4-2 4--3

-2.514 -2.865 -2.487 -2.025 -1.596 -1.564 ·2.06

6-3 7·1 7·2 7-3 8·1 8-2 8-3

-1.749 -1.296 -1.561 -1.685 -2.753 -2.487 -1.706

10-3 11-2 11-3 12-3

-1.86 -1.984 -2.909 -2.161 -1.512 -2.176 -2.304

Figuur A.4.1 Biplot bij de factoranalyse van het Na+/K+ stimulatie experiment (4.3.3). De factorladingen en de verklaarde variabiliteit zijn terug te vinden in tabel A.4.9 (hieronder).

0.8

0.6

0.4

0.2

.0 .

.0.

.0 .

.0.

-D.8 ..0.6 -0.4 .0.2

Factor 1

0.2 0.4

bioma opnamesnelt¥!id

pH-stijging

0.6 0.8

Tabel A.4.9 Factorladingen en verklaarde variabiliteit van de biplot over het Na+/K+ stimulatie experiment (figuur A.4.1)

Factor 1 Factor 2 natrium 0.10 -0.59 kalium 0.01 -0.67

biomassa 0.91 0.21 preincubatie -0.72 -0.16 pH-stijging 0.55 -0.66

0 namesnelheid 0.75 0.16 Expl.Var 2.22 1.33 Prp.Totl 0.37 0.22

A-21

Tabel A.4.10 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van het pH-experiment voor Chara (4.5.1).

Czp - pH 5

fosfaatconcentraties (~gPII) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 500-2 24 2 2 2 59

106 174 255 289 427 543 658

2 6 o o 2 2 o o

drooggewichten (g)

2 o o o a a o

o o o o o o o o

117 79 47 15 6 6 2 2 2

98 50 15 2 2 2 2 o 2

104 56 15 2 2 o 2 2 2

409 285 171 72 18 2 2 2 2

371 260 136 44

9 2 6 2 2

0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 500-2 0.111 0.094 0.148 0.084 0.123 0.159 0.162 0.174

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (~gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 500-2 24 2 2 1 112 63 52 202

141 84 36

59 2 2 0 75 32 28 106 174 255 289 427 543 658

Czp - pH 6

4 o o 2 2 o o

a a a a a o o

fosfaatconcentraties (~gPII) tijd 0-1 0-2 24 58

107 166 248 341 420 536 650

4 o o 4 o a o

drooggewichten (g)

o a o o o a o o

o a a o o o o

45 14 5 5 2 2 2

0-3 150-1 a 96 o 64 o 26 a 4 o a 4 a 4 a 0

1

10 2 2 2 2 o 2

8

9

150-2 150-3 500-1 89 99 341 45 58 209 7 20 118

7 33 4

17 1 4 1 1 o

0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 0.079 0.078 0.088 0.116 0.121 0.072 0.149

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (~gP/~gDW)

A-22

tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 24 1 0 66 59 109 183 58 a 0 44 30 64 112

107 4 18 5 22 63 166 a a 3 8 18 248 1 2 341 420 536 650

4 o a

o o o a

a o

3 3 a

o

9 2

170 119 62 20

4

3

500-3 403 311 206 120

50 12 6 2 2

500-3 0.097

500-3 334 257 171

99 41 10

5 2 2

500-2 382 246 127 45

7

500-2 0.113

500-2 270 174

90 32

5

2000-1 2000-2 2000-3 1861 1709 1455 1372 1156 898 775 552 355

1734 1674 1369 1261 1048

794 666 419 218

1871 1734 1461 1375 1226 1026

867 692 527

2000-1 2000-2 2000-3 0.118 0.128 0.074

2000-1 2000-2 2000-3

500-3 325 206

86 23

4 1

500-3 0.109

500-3 238 151 63 17

3

1264 1160 988 932 785 610 526 375 241

2000-1 1781 1564 1337 1098

375 171 61

2000-1 0.111

2000-1 1279 1123

960 789

270 123 44

1087 1049 858 790 657 498 418 262 137

2000-2 1674 1501 1246 1048 756 520 356 174 64

2000-2 0.123

2000-2 1091

979 813 683 493 339 232 114 42

2025 1877 1581 1489 1327 1110

938 749 570

2000-3 1784 1611 1416 1193

932 696 536 316 162

2000-3 0.108

2000-3 1323 1194 1050

884 691 516 397 234 120

Czp - pH 7

fosfaatconcentraties ("gPII) tijd 0-1 0-2 24 7 4 54

102 162 244 337 415 531 646

4 13

4 4

10 7 4 4

drooggewicht (g) 0-1

4 4 4 7 4 4 7 4

0-2

0-3 7 7 4 4 4 4 7 4 4

0-3 0.135 0.090 0.080

150-1 67 29

7 4 7 4 7 4 7

150-1 0.132

150-2 83 54 19 10 7 7

10 7

150-2 0.094

150-3 83 35 10

7 7 7 7 4 7

150-3 0.119

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht ("gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 24 4 3 7 41 70 56 54 2 3 7 18 46 24

102 8 3 4 4 16 7 162 2 3 4 2 8 5 244 2 6 4 4 6 5 337 415 531 646

Czp -pH 8

6 4 2 2

3 3 6 3

fosfaatconcentraties ("gPII)

4 7 4 4

2 4 2 4

6 6 8 6

5 5 2 5

500-1 364 253 140

13 7 7 7 7

500-1 0.102

500-1 285 198 109

10 5 5 5 5

500-2 361 247 133

54 16

7 7 7 7

500-2 0.126

500-2 229 157

85 34 10 4 4 4 4

500-3 361 238 130 45 10

7 7 4 7

500-3 0.124

500-3 233 153 84 29

6 4 4 2 4

tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 500-2 500-3 24 2 2 55 2 0

100 171 241 327 406 521 636

o a o a 2 a a

drooggewicht (g)

a a a a a a a

2 a a a a a a 5 a

107 85 40 18 5 2

11 a 2

107 78 34 8 5 2

14 2 2

82 46 14

5 5 5 5 2 5

389 264 142 43

8 2 8 2 2

386 277 152 62

2 2 2 2

395 290 200 104 50 11 2 5 2

2000-1 1591 1335 987 690 348 124 38

7 7

2000-1 0.146

2000-1 871 730 540 377 191 68 21 4 4

2000-2 1616 1430 1104 829 503 266 117

32 10

2000-2 0.143

2000-2 907 802 619 465 282 149 66 18 6

2000-1 2000-2 1646 1666 1333 1512 1010 1294 706 1022 459 789 229 546 104 2

21 219 5 101

2000-3 1670 1395 1072 766 446 190 67 13 10

2000-3 0.143

2000-3 933 779 599 428 249 106 37

2000-3 1720 1592 1352 1122 939 731 549 331 181

7 6

0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 500-2 500-3 2000-1 2000-2 2000-3 0.1438 0.0973 0.1051 0.0984 0.0856 0.1786 0.1396 0.1308 0.0984 0.1156 0.1009 0.1432

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht ("gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 24 1 1 87 100 55 a 0 69 73

100 a a 0 33 31 171 a 0 0 14 8 241 327 406 521 636

a a

a a

a a a a a

a a a 4 a

4 1 9 a

5 2

14 2 2

150-3 37 21 6 2 2 2 2 1 2

500-1 223 151

82 25

5 1 5

500-2 236 169

93 38

500-3 321 236 163 85 40

9

4 1

2000-1 1139

922 699 488 318 158 72 14

3

2000-2 1321 1199 1026

811 625 433

174 80

2000-3 961 889 755 627 525 409 307 185 101

A-23

Czp - pH 9

fosfaatconcentraties (..,gPII) tijd 0-1 0-2 19 7 55 90

162 231 318 397 512 626

27 4 4 4 4

11 7 4

7 4 4 4 4 4 4 4

drooggewicht (g) 0-1 0-2

0.089 0.091

0-3 7 4

65 4 4 7 4 4 4

0-3 0.073

150-1 132

97 74 46 23 11 11 7 7

150-1 0.092

150-2 122 74 52 20 11

7 7 7 7

150-2 0.095

150-3 122

90

39 20

7 7 7 7

150-3 0.089

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (..,gP/gDW)

500-1 426 336 260 164

94 43 23

7 7

500-1 0.117

500-2 483 438 416 365 317 272 224 164 113

500-2 0.083

tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 500-1 500-2 19 7 7 8 115 103 109 291 466 55 24 7 5 85 63 81 230 423 90

162 231 318 397 512 626

4 4 4 4

10 7 4

4 4 4 4 4 4 4

71 5 5 8 5 5 5

Cmp - pH 5

fosfaatconcentraties (1J9P r') ti"d min 0-1 0-2

21 8 8 47 8 8 84 5 5

151 5 5 230 8 8 326 8 8

drooggewichten (9 OW) 0-1

0.091 0-2

0.107

65 40 20

9 9 6 6

44 17

9 6 6 6 6

0-3 8 8 5 5 5 8

0-3 0.085

35 18 7 7 7 7

150-1 126 104 76 55 33 14

150-1 0.073

correctie voor biomassa en drooggewicht (1J9P (9 OW)"') ti"d min 0-1 0-2 0-3 150-1

21 7 6 7 137 47 84

151 230 326

Cmp - pH 6

7 4 4 7 7

6 4 4 6 6

fosfaatconcentraties (1J9P r') ti"d 0-1

-1 50 -1 93 -4

144 -4 222 -1 318 -1

drooggewichten (g DW) 0-1

0.080

0-2 -1 -4 -4 -4 -4 -4

0-2 0.086

7 4 4 4 7

0-3 -1 -1 -4 2

-1 -1

0-3 0.098

114 83 59 36 15

150-1 114

88 60 41

9 -1

150-1 0.086

correctie voor biomassa en drooggewicht (f.JgP (g DW) -1 )

ti"d 0-1 0-2 0-3 150-1

A-24

222 318

-1 -1 -1 106 -1 -4 -1 82 -4 -4 -3 56 -4 -4 -1 -4 -1 -4

2 -1 -1

38 8

-1

177 112 64 29 16 5 5

150-2 132 98 73 39 20

8

150-2 0.100

150-2 106 79 59 31 16

6

150-2 126 111 76 34 15 2

150-2 0.059

150-2 172 150 103 47 21

3

401 352 306 263 217 158 109

500-3 413 358 307 208 148 97 58 23 11

500-3 0.095

500-3 349 303 260 176 125

150-3 129 101 79 42 23 14

150-3 0.088

150-3 117 92 72 38 21 13

150-3 120 95 53 25

9 -1

150-3 0.075

150-3 128 101 57 26

9 -1

82 49 20

9

2000-1 1833 1709 1587 1345 1156

965 799 662 499

2000-1 0.139

2000-1 1054

983 913 773 665 555 460 381 287

500-1 441 434 313 213 114 42

500-1 0.118

500-1 298 294 212 145 77 29

500-1 438 397 295 203 117 44

500-1 0.069

500-1 511 463 344 237 136

51

2000-2 1862 1645 1549 1278 1026 885 738 524 378

2000-2 0.170

2000-2 878 775 730 602 483 417 348 247 178

500-2 462 416 347 241 154 67

500-2 0.108

500-2 343 308 257 179 114

50

500-2 457 394 289 206 111 37

500-2 0.083

500-2 439 378 277 198 106

36

2000-3 1763 1571 1444 1332 1112

981 818 620 454

2000-3 0.154

2000-3 919 819 752 694 579 511 426 323 237

500-3 2000-1 459 1926 413 1811 335 1789 269 1605 188 1418 92 1225

2000-2 2000-3 1926 1935 1910 1889 1702 1748 1506 1543 1344 1266 1141 1082

500-3 2000-1 2000-2 2000-3 0.097 0.091 0.108 0.106

500-3 380 341 277 223 156 76

500-3 460 416 324 235 133

63

2000-1 1693 1592 1573 1411 1247 1077

2000-1 1940 1851 1650 1450 1278 1049

500-3 2000-1 0.068 0.091

500-3 541 489 380 276 156 74

2000-1 1707 1629 1452 1276 1125 923

2000-2 1423 1411 1257 1112

993 843

2000-2 1937 1695 1739 1351 1132

893

2000-3 1459 1424 1318 1163 954 816

2000-3 1911 1771 1666 1478 1249 1036

2000-2 2000-3 0.083 0.088

2000-2 1860 1628 1670 1298 1087 858

2000-3 1737 1610 1515 1344 1136 942

Cmp - pH 7

fosfaatconcentraties (llgP 1") trd 0-1

84 -2 135 -2 212 308

drooggewichten (g OW) 0-1

0.112

0-2 -2 1

-2 -2 1

-2

0-2 0.114

0-3

-2 -2

0-3 0.114

150-1 122

81 58 33 10

150-1 0.098

correctie voor biomassa en drooggewicht (pgP (g OW) -7 )

150-2 106 109 68 46 20

7

150-2 0.093

trd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 -2 99 92

48 1 1 66 94 84 -2 -2 -2 47 59

135 -2 -2 -2 27 39 212 1 1 9 17 308 -2 6

Cmp - pH 8

fosfaatconcentraties (Ilg PI") trd 0-1 0-2

13 7 7 7 4 4 4 4 7 7 4 7

drooggewichten (g OW) 0-1 0-2

0.105 0.131

0-3 7 7 4 4 7 7

0-3 0.134

150-1 142 136

86 38 16 7

150-1 0.098

correctie voor biomassa en drooggewicht (pgP (g OW) ·7 )

trd 0-1 0-2 0-3 150-1

Cmp - pH 9

10 5 3 3 5 3

4 4 2 2 4 4

fosfaatconcentraties (llgP 1") trd 0-1 0-2

7 7 7 7

16 7 7 4 7 7 7 7

drooggewichten (g OW) 0-1

0.110 0-2

0.107

4 4 2 2 4 4

0-3 7 7 7 7 7 7

0-3 0.162

116 111 70 31 13

5

150·1 135 119 93 32 13 7

150·1 0.103

correctie voor biomassa en drooggewicht (llgP (g OW) -7 )

trd min 0-1 0-2 0-3 150-1 21 5 5 3 105 51 85

142 221 323

5 12

5 5 5

5 5 3 5 5

3 3 3 3 3

92 72 25 10 5

150-2 146 133

79 32 13 10

150-2 0.094

150-2 124 114

68 27 11

8

150-2 138 132 100

39 13 16

150-2 0.102

150-2 109 104 78 31 10 13

150-3 125 90 42 30 14

150-3 0.110

150-3 91 66 31 22 10

150-3 146 86 54 22 10 7

150-3 0.106

150-3 110 65 41 17 7 5

150-3 132

93 61 20 10 10

150-3 0.115

150-3 92 65 43 14 7 7

500-1 422 371 224 132 46 10

500-1 0.118

500-1 286 251 152 89 31 7

500-1 458 316 218 127

51 19

500-1 0.137

500-1 268 185 128 74 30 11

500-1 456 401 283 202 106

52

500-1 0.096

500-1 381 335 236 169

89 43

500-2 489 428 364 183 52 10

500-2 0.134

500-2 292 255 217 109

31 6

500-2 490 449 373 206 114

51

500-2 0.106

500-2 370 339 281 155 86 38

500-2 478 366 234 190 90 36

500-2 0.086

500-2 445 341 218 177 84 33

500-3 460 399 278 234 119 36

500-3 0.113

2000-1 1920 1605 1557 1420 1142 964

2000-1 0.106

2000-2 1975 1828 1566 1429 1161

954

2000-2 0.105

2000-3 1917 1767 1643 1442 1161

977

2000-3 0.111

500-3 2000-1 2000-2 2000-3 326 1453 1512 1384 283 1215 1399 1276 197 1178 1199 1186 166 1075 1094 1041

84 865 889 839 26 729 731 705

500-3 2000-1 1872

480 1759 344 1418 183 1127 82 932 57 689

500-3 2000-1 0.114

500-3

336 241 128

58 40

0.138

2000·1 1089 1023

825 656 542 401

500-3 2000-1 456 1930 350 1706 299 1613 167 1443 65 1334 20 1113

2000-2 1781 1964 1487 1260 1011

865

2000-2 0.121

2000-2 1174 1295

981 831 666 571

2000-2 1959 1940 1607 1434 1312 1103

2000-3 1920 1695 1503 1231 1023 853

2000-3 0.094

2000-3 1630 1440 1276 1046

869 724

2000-3 1930 1619 1533 1401 1180

985

500-3 2000-1 2000-2 2000-3 0.149 0.127 0.106 0.134

500-3 244 188 160

90 35 11

2000-1 1216 1075 1016 909 840 701

2000-2 1484 1470 1217 1086

994 836

2000-3 1154

968 917 838 706 589

A-25

Opnamesnelheden samengevat

Cmp IpHS IpH6 pH7 pHS 'pH9 repll repl2 repl3 repll repl2 reol3 reoll reol2 reol3 reoll reol2 reol3 reoll repl2 rej>l3

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 150 0.856 0.732 0.703 0.696 0.982 0.846 0.820 0.560 0.968 0.719 0.869 1.02 0.669 0.674 0.632 500 1.12 1.10 1.05 2.31 2.00 2.21 2.20 1.20 2.10 2.09 1.36 1.97 1.81 2.21 1.22

2000 1.99 1.96 2.21 2.66 3.35 2.67 2.72 3.21 2.81 3.40 3.18 4.29 1.55 2.18 1.69

Czp H5 H6 H7 HS H9 re 11 re 12 re 13 re 11 re 12 re 13 re 11 re 12 re 13 re 11 re 12 re 13 re 11 re 12 re 13

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 150 OB10 0.644 0,539 0573 0.643 1.03

1 0.45 0.680 0.601. 0.717 0.910 n -=ta~ 0.7Q5 0.832 a

5001 1.42 1.31 1.98 1.41 2.14 2.09 2.22 1.82 1.87 1 1.83 1.87 -;051 1.61 0.917 1.25

2000 2.26 2.14 3.70 3.40 2.90 3.05 4.22 3.70 4.23 5.73 3.879 2.73 1.99 2.09 2.35

Figuur A.4.2 Adaptatie van het plantenmateriaal van het Cmp-experiment aan de gewenste pH. Op de vertikale as werd de absolute waarde van de mate van afwijking (in pH-eenheden) van de gewenste pH uitgezet.

::r: c. Ol 'O~ 0>.,­Ol 0>

~~ C. . 0'0 Ol .-'OJ! c: c: III Ol > Ol

o>::r: c: c. ~-:=-s: rn

A-26

1.50-,--------------------------, -- pH 5 ---1<-- pH 6 - ... - pH 7 ----- pH 8 --e-- pH 9

1.25

pre'lncubatieduur (dagen)

Tabe/ AA.11 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van het pH-experiment voor Nitella (4.5.2).

Nzp - pH 5

fosfaatconcentraties (/lgPII) T 0·1

22 36 50 61 91 79

148 92 224 123 321 144 438 156 516 163 636 159 756

drooggewichten (g) 0·1

0.156

0·2 46 46 55 52 64 55 55 49 52

0·2 0.137

0·3 104

89 101 98

101 132 129 135 132

0·3 0.046

150·1 156 166 169 178 181 187 212 206 200

150·1 0.133

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (/lgP I g DW min) T 0·1 0·2 0·3 150·1

22 19 27 179 94 ~ ~ V 1~ 100 91

148 224 321 438 516 636 756

Nzp - pH 6

41 47 63 74 80 84 82

32 30 38 32 32 29 30

fosfaatconcentraties (/lgPII) T 0·1

23 54 51 66 87 73

143 79 218 91 315 103 433 119 510 125 631 159 750

drooggewichten (g) 0·1

0.104

0·2 17 45 51 51 48 42 39 36 33

0·2 0.103

174 169 174 227 222 233 227

0·3 125 128 137 168 193 174 174 162 147

0·3 0.100

101 107 109 113 127 124 120

150·1 128 134 122 103 94 88 85 79 73

150·1 0.091

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (/lgP I g DW min) T 0·1 0·2 0·3 150·1

23 42 13 100 113 51 51 35 103 118 87 56 40 110 107

143 218 315 433 510 631 750

61 70 79 91 96

122

40 37 32 30 28 25

135 155 140 140 130 118

91 83 78 75 69 64

150·2 212 212 240 258 286 320 366 381 375

150·2 0.127

150·2 134 134 151 163 181 202 231 241 237

150·2 147

8 140 137 116 116 110 110 100

150·2 0.118

150·2 100

96 93 79 79 75 75 68

150·3 184 181 172 169 163 153 141 141 144

150·3 0.106

150·3 139 137 130 128 123 116 107 107 109

150·3 196 199 190 184 165 153 137 125 110 119

150·3 0.106

150.3 148 150 143 139 125 115 104 94 83 90

500·1 581 597 587 578 563 520 547 544 535 507

500·1 0.174

500·1 267 274 270 265 258 239 251 250 246 233

500·1 479 446 446 415 390 362 338 350 325 279

500·1 0.123

500·1 313 291 291 270 254 236 220 228 212 182

500·2 526 517 501 477 474 480 495 486 474 560

500·2 0.101

500·2 417 409 397 378 375 380 392 385 375 443

500·2 479 498 479 461 427 393 372 365 344 338

500·2 0.093

500·2 411 427 411 395 366 337 319 313 295 290

500·3 486 477 489 480 492 517 547 535 538 517

500·3 0.076

500·3 510 500 513 504 517 542 575 562 565 542

500·3 711 711 708 686 649 627 606 590 538 575

500·3 0.122

500·3 466 466 464 450 426 412 398 387 353 377

2000·1 1961 1930 1890 1939 1837 1736 1951 1853 1874 1871

2000·1 0.128

2000·1 1227 1208 1183 1214 1150 1087 1222 1160 1173 1171

2000·1 1922 1848 1768 1709 1651 1571 1478 1469 1426 1481

2000·1 0.137

2000·1 1122 1078 1032 997 963 917 863 857 832 864

2000·2 1917 1862 1874 1874 1779 1720 1813 1804 1770 1727

2000·2 0.116

2000·2 1328 1290 1298 1298 1232 1192 1256 1249 1226 1196

2000·2 2058 1925 1916 1857 1814 1759 1728 1737 1666 1682

2000·2 0.157

2000·2 1049

981 976 946 924 896 880 885 849 857

2000·3 1998 1939 1865 1847 1816 1727 1751 1748 1631 1677

2000·3 0.104

2000·3 1537 1492 1435 1421 1397 1328 1347 1345 1255 1290

2000·3 1885 1805 1814 1728 1685 1565 1521 1450 1472 1441

2000·3 0.188

2000-3 804 770 774 737 719 668 649 619 628 615

A-27

Nzp - pH 7

fosfaatconcentraties (pgPfl) T 0-1

22 7 50 16 89 22

142 16 216 22 312 25 430 29 508 19 628 19 7471

drooggewichten (g) 0-1

0.144

0-2

13 10 13 10 10 10 13

0-2 0.155

0-3 38 41 38 29 25 19 19 13 16

0-3 0.114

150-1 126 120 107

94 82 85 79 69 73 47

150-1 0.122

correctie v~~r cuvetvolume en drooggewicht (pgP f 9 DW min) T 0-1 0-2 0-3 150-1

22 4 27 83 50 9 3 29 78 89 12 7 27 70

142 9 5 20 62 216 12 7 18 54 312 14 5 13 56 430 508 628 747

Nzp - pH 8

16 11 11

fosfaatconcentraties (pgPfl) T 0-1

24 16 50 22 86 31

138 44 211 63 307 78 426 88 503 85 623 88 742

drooggewichten (g) 0-1

0.150

0-2 47 53 50 60 60 66 78 81 94

0-2 0.115

13 9

11

0-3 50 53 56 63 66 72 94 94 97

0-3 0.146

52 46 48

150-1 156 156 153 175 172 222 203 216 219 310

150-1 0.118

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (pgP f 9 DW min) T 0-1 0-2 0-3 150-1

24 50 86

138 211 307 426 503 623 742

A-28

8 12 17 23 34 42 47 45 47

33 37 35 42 42 46 55 57 66

28 29 31 34 36 40 52 52 53

106 106 104 119 117 151 138 147 149 210

150-2 151 145 138 126 101

91 76 63 51

107

150-2 0.119

150-2 102 98 93 85 68 62 51 43 34

150-2 263 219 200 203 185 178 175 175 178 206

150-2 0.130

150-2 162 135 123 125 114 110 108 108 110 127

150-3 148 157 138 132 116 101 110 104 110 211

150-3 0.170

150-3 70 74 65 62 55 47 52 49 52

150-3 156 147 150 144 131 128 128 128 131 181

150-3 0.151

150-3 83 78 80 76 70 68 68 68 70 96

500-1 471 459 430 374 361 314 292 267 242 164

500-1 0.118

500-1 319 311 291 253 245 213 198 181 164 111

500-1 469 450 400 378 378 353 353 335 335 475

500-1 0.112

500-1 334 321 285 269 269 252 252 238 238 338

500-2 487 424 411 383 336 280 236 214 192 135

500-2 0.133

500-2 292 255 247 230 202 168 142 128 115

81

500-2 541 528 500 494 472 444 435 441 441 438

500-2 0.102

500-2 426 417 394 389 372 350 343 348 348 345

500-3 468 421 393 346 302 248 207 192 157

1340

500-3 0.185

500-3 202 182 170 150 130 107 90 83 68

500-3 513 516 519 525 522 497 535 535 516 513

500-3 0.142

500-3 290 291 293 297 295 281 302 302 291 290

2000-1 1880 1833 1616 1645 1563 1510 1453 1397 1340 1629

2000-1 0.177

2000-1 851 830 732 745 708 684 658 632 607 738

2000-1 1910 1873 1776 1688 1679 1585 1591 1519 1451 1623

2000-1 0.158

2000-1 967 948 899 854 850 802 805 769 734 821

2000-2 1965 1905 1842 1824 1764 1673 1714 1670 1654 1541

2000-2 0.111

2000-2 1419 1376 1330 1317 1274 1208 1237 1206 1194 1113

2000-2 1951 1901 1766 1745 1738 1713 1663 1623 1666 1510

2000-2 0.190

2000-2 820 799 743 733 731 720 699 682 701 635

2000-3 1940 1896 1842 1820 1698 1648 1585 1488 1598 226

2000-3 0.098

2000-3 1585 1549 1506 1488 1388 1347 1295 1216 1306

2000-3 1929 1857 1879 1857 1748 1654 1638 1666 1679 1491

2000-3 0.108

2000-3 1425 1372 1388 1372 1291 1222 1210 1231 1240 1102

Nzp - pH 9

fosfaatconcentraties (pgPII) T 0·1 0·2 0·3 150·1 150·2 150·3 500·1 500·2 500·3 2000·1 2000·2 2000·3

22 21 12 21 164 192 158 503 482 510 1888 1829 1916 51 31 28 46 186 202 171 500 460 497 1844 1779 1847 90 43 152 65 196 202 171 488 472 522 1807 1720 1785

136 46 80 214 214 168 494 472 535 1801 1698 1776 208 65 59 90 233 214 168 485 460 528 1760 1602 1714 305 77 71 102 258 211 174 479 444 541 1720 1577 1695 424 90 84 112 283 199 475 435 500 1633 1490 1595 500 102 87 118 289 208 189 463 444 528 1673 1514 1598 620 124 105 124 298 192 171 441 426 507 1602 1440 1490 739 224 189 143 348 429 538 1427 1589 1676

drooggewichten (g) 0·1 0·2 0·3 150·1 150·2 150·3 500·1 500·2 500·3 2000·1 2000·2 2000·3

0.099 0.073 0.163 0.163 0.093 0.130 0.109 0.178 0.115 0.125 0.175 0.214

correctie voor cuvetvotume en drooggewicht (pgP I g DW min) T 0·1 0·2 0·3 150·1 150·2 150·3 500·1 500·2 500·3 2000·1 2000·2 2000·3

22 17 13 10 81 166 98 370 217 353 1211 837 717 51 25 30 23 91 174 105 367 207 345 1183 815 692 90 35 32 96 174 105 358 213 362 1159 788 669

136 51 39 105 185 103 363 213 371 1155 778 665 208 52 64 44 114 185 103 356 207 366 1129 733 642 305 62 78 50 126 183 107 351 200 375 1103 722 635 424 72 92 55 138 172 349 196 347 1047 682 597 500 82 95 58 141 180 117 340 200 366 1073 694 599 620 100 115 61 146 166 105 324 192 351 1027 659 558 739 109 164 88 255 193 373 916 728 628

Aile opnamesnelheden samengevat (effiuxwaarde eraf getrokken)

Nzp IpH5 pHS IpH7 H8 IpH9 repl1 repl2 repl3 repl1 repl2 repl3 repl1 repl2 repl3 repl1 repl2 repl3 repl1 repl2 repl3

0 ·0.135 0.02219 0.1178053 0.0623 ·0.0245 ·0.1929 -0.0148 0.03248 0.08082 ·0.0586 0.07153 0.15781 0.0131 ·0.031 0 150 0.01104 ·0.186 0.1894873 0.3933 0.26693 0.22766 0.16806 0.17376 0.13098 0.11129 0.71892 0.25216 0.0706 0.13005 0.20788 500 0.13853 0.27757 0.0709273 0.4866 0.43493 0.31616 0.54896 0.49696 0.47013 0.66789 0.45512 0.14387 0.33193 0.32348 0.15889

2000 0.72124 0.44377 1.5779473 1.2331 0.90273 0.59546 0.98986 0.87496 0.86053 1.09349 0.92132 0.54609 0.6734 0.80915 0.6203

Tabel AA.12 Factorladingen bij de biplot voor Elodea uit het Chara-Elodea experiment (figuren 4.15 en 4.16a)

Factor 1 Factor 2

dag -0.79 0.51

opnamesnelheid -0.61 -0.56

C:P -0.66 -0.61

C:N 0.66 -0.66

N:P -0.85 -0.36 biomassa 0.68 -0.39

concentratie -0.15 -0.34

A-29

Tabe/ A.4.13 Factorladingen bij de biplot voor Chara uit het Chara-Elodea experiment (figuur 4.16b)

Factor 1 Factor 2 dag 0.50 -0.73

concentratie 0.41 0.05 opnamesnelheid 0.76 0.09

C:P 0.43 0.86 C:N -0.76 0.41 N:P 0.62 0.70

biomassa -0.51 0.41

Figuur A.4.3 Verloop van de koolstofgehaltes en de C:P en C:N verhoudingen van het plantenmateriaal van het

Chara-Elodea experiment. Voor de grafieken van de C:P verhouding gelden dezelfde legendes dan voor de

andere.

A-30

koolstofgehalte Chara

50.0 -Ci+

~~47.5 -Ci-

a 45.0 S I

U42,5~

~ 40.0

E 37,S

35.0+--,---,-.,.--,---,-,--,--,---, o 8 12 16 20 24 28 32 36

incubatietijd (dagen)

,2 "§ Cl.. (.)

~ '0; E 0 n;

70

.S! 60 ., ~ 50 Z ii 40

.~ 30

§ 20 ., 10

1200

11XXJ

Em

Em

400-

200-

0 0

C:Pverhouding Chara

-:-----~-.

.-- ",

,.

4 8 12 16 20 24 28 32 36

incubatietijd (dagen)

C:N verhouding Chara

-Ci+ -Ci-

O+--,--.-r-.--,--,--o--r-. o 8 12 16 20 24 28 32 36

incubatietijd (dagen)

50.0

~'- 47.5 ;: a 45.0 S U 42.5

koolstofgehalte Elodea

~ .... ~~~:=----- ----~ 40.0 0::::::--

E 37.5

-Ei+ -Ei-

35.0+--.---,-,--,--,--,--.--,---, o 5 10 15 20 25 30 35 40 45

§ ~

Cl.. (.)

~ '0; E 0 n;

incubatielijd (dagen)

C:P verhouding Elodea

1200

11XXJ

Em

600

400

200 :"-~--z-------.:.-.------ - ----~

0 0

incubatietijd (dagen)

70

60

50

C:N verhouding Elodea

::~ 20

10

0+--.--.-.,.--,--,--,--.--,---, o 5 10 15 20 25 30 35 40 45

incubatietijd (dagen)

-Ei+ -Ei-

Tabel AA.14 Parameters van de hyperbolen gefit door de gegevens uit figuur 4.20

Gefitte hyperbolen waren van het type y = a . x / (b + x)

verzadigingsexperiment Chara Elodea

a 1.005 1.860 0.6744

b -0.01596 -0.01916 -0.07233

Tabel AA.15 Factorladingen bij de biplot voor Chara uit het Chara-Elodea experiment (figuur 4.22)

dag opnamesnelheid

C:P C:N N:P

biomassa

Factor 1 0.06 -0.95 -0.98 0.34 -0.99 -0.12

Factor 2 0.95 0.14 -0.14 -0.62 -0.04 -0.88

A-31