De ontwikkeling van een nieuwe generatie TNF-blokkers ...

De ontwikkeling van een nieuwe generatie

TNF-blokkers: Nanobodies en microRNA’s

Nele VAN DER STEEN

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biochemie en de Biotechnologie,

Major Biomedische Biotechnologie Academiejaar 2011-2012

Promotor: Prof. Dr. Claude Libert Wetenschappelijk begeleider: Drs. Leen Puimège Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie VIB - Departement voor Moleculair Biomedisch Onderzoek

i

Dankwoord

Deze thesis is tot stand gekomen met de hulp van vele mensen, zonder wie het mij nooit gelukt zou zijn.

Ik dank in de eerste plaats mijn promotor, Prof. Dr. Claude Libert, om mij de kans te geven deze thesis te verwezenlijken en voor de opbouwende kritiek.

Mijn speciale dank gaat uit naar Drs. Leen Puimège. Zij heeft me ingewijd in de wereld van

TNF en me begeleid in het ontrafelen van TNFR1 en TNFR2. Ze bracht me de liefde voor muizen bij en heeft nauwgezet mijn thesis gecorrigeerd.

Dank ook aan Elyn Hollevoet, voor de fijne uren waarin we samen de experimenten hebben uitgevoerd.

Dank aan mijn medestudenten voor de troost en steun die we elkaar konden geven.

Dank aan de mensen van UCli, voor de antwoorden op mijn vragen en de hulp waarop ik altijd kon rekenen.

Dank aan Dr. Ir. Anne Van Keersbergen. Zij liet mij tijdens de zomermaanden de praktische ervaring opdoen die ik nu goed kon gebruiken, en gaf vele nuttige opmerkingen bij mijn

thesis.

Bedankt aan Piet die als professioneel foto-amateur mij uit de nood geholpen heeft met enkele figuren.

Dank aan pepe, die mijn eeuwige ‘dt’ fouten verbeterde en speciale dank aan meme en

tante Hilde, die tijdens de examenperiodes een enorm zenuwachtige studente hebben opgevangen.

Dank aan papa die probeerde om met zijn medische kennis mijn thesis te begrijpen, wat hem niet helemaal gelukt is. Toch heeft hij me kunnen wijzen op enkele onduidelijkheden en rare zinsconstructies.

Maar ik mag natuurlijk ook mama niet vergeten, die elke week naar het relaas van mijn activiteiten moest luisteren.

Childhood is not from birth to a certain age and at a certain age The child is grown, and puts away childish things.

Childhood is the kingdom where nobody dies.

Edna St. Vincent Millay

iii

Inhoudstabel

Dankwoord ............................................................................................................................................... i

Inhoudstabel ............................................................................................................................................ iii

Lijst met afkortingen .............................................................................................................................. vii

Lijst met figuren....................................................................................................................................... xi

Lijst met tabellen ..................................................................................................................................... xi

Samenvatting ......................................................................................................................................... xiii

1. Inleiding ....................................................................................................................................... 1

1.1 Tumor Necrosis Factor (TNF) ................................................................................................... 1

1.2 TNF Receptor 1 (TNFR1) .......................................................................................................... 1

1.3 TNF Receptor 2 (TNFR2) .......................................................................................................... 3

1.4 Huidige generatie TNF-blokkers .............................................................................................. 4

1.5 Reumatoïde artritis ................................................................................................................. 5

1.6 Inflammatoire darmziektes ..................................................................................................... 7

1.7 Multiple sclerose ..................................................................................................................... 9

1.8 Nanobodies ........................................................................................................................... 10

1.8.1 Antilichamen ................................................................................................................. 10

1.8.2 Zware keten antilichamen ............................................................................................. 10

1.8.3 Nanobodies ................................................................................................................... 11

1.9 microRNA’s ............................................................................................................................ 12

1.9.1 Intergenische miRNA’s .................................................................................................. 12

1.9.2 Intragenische miRNA’s (mirtrons) ................................................................................. 13

1.9.3 Functie(s) geselecteerde miRNA’s ................................................................................. 14

2. Doelstelling ................................................................................................................................ 17

3. Resultaten ................................................................................................................................. 19

3.1 Nanobodies ........................................................................................................................... 19

3.1.1 pHen4 en pHen6c vector ............................................................................................... 19

3.1.2 PCR ................................................................................................................................. 19

3.1.3 Gelelektroforese ............................................................................................................ 20

3.1.4 Zuivering ........................................................................................................................ 20

3.1.5 Nanodrop ....................................................................................................................... 20

3.1.6 Restrictiedigest .............................................................................................................. 21

3.1.7 Ligatie ............................................................................................................................ 22

3.1.8 Transformatie: elektroporatie ....................................................................................... 22

iv

3.1.9 Kolonie-PCR ................................................................................................................... 22

3.1.10 Sequentie-analyse ......................................................................................................... 23

3.1.11 Expressie ........................................................................................................................ 24

3.1.12 SDS-PAGE ....................................................................................................................... 24

3.1.13 Coomassie kleuring ....................................................................................................... 24

3.1.14 Western Blotting ........................................................................................................... 25

3.1.15 Opzuivering.................................................................................................................... 26

3.1.16 Eiwitbepaling ................................................................................................................. 27

3.1.17 Bindingsaffiniteit ELISA .................................................................................................. 27

3.1.18 Weefselkweek L929 NF-ϰB/luc cellen ........................................................................... 29

3.1.19 In vitro inhibitietest ....................................................................................................... 29

3.2 miRNA’s ................................................................................................................................. 33

3.2.1 Selectie kandidaat TNFR1 inhiberende miRNA’s ........................................................... 33

3.2.2 Transformatie: hitte shock ............................................................................................ 34

3.2.3 Kolonie-PCR ................................................................................................................... 34


3.2.5 Zuivering ........................................................................................................................ 35

3.2.6 Weefselkweek C57BL/6-MEF cellen .............................................................................. 36

3.2.7 In vitro test miRNA-511 ................................................................................................. 37

3.2.8 Hydrodynamische staartader injectie ........................................................................... 38

3.2.9 TNF/LPS letaliteitexperiment ........................................................................................ 39

4. Discussie .................................................................................................................................... 45

5. Materiaal en methode............................................................................................................... 49

5.1 Nanobodies ........................................................................................................................... 49

5.1.1 pHen4 en pHen6c vector ............................................................................................... 49

5.1.2 PCR ................................................................................................................................. 50


5.1.4 Zuivering ........................................................................................................................ 50

5.1.5 Nanodrop ....................................................................................................................... 50

5.1.6 Restrictiedigest .............................................................................................................. 51

5.1.7 Ligatie ............................................................................................................................ 51

5.1.8 Transformatie: elektroporatie ....................................................................................... 51

5.1.9 Kolonie-PCR ................................................................................................................... 52

5.1.10 Sequentie-analyse ......................................................................................................... 52

5.1.11 Expressie ........................................................................................................................ 52

5.1.12 SDS-PAGE ....................................................................................................................... 53

5.1.13 Coomassie kleuring ....................................................................................................... 53

5.1.14 Western Blotting ........................................................................................................... 53

v

5.1.15 Opzuivering.................................................................................................................... 54

5.1.16 Eiwitbepaling ................................................................................................................. 54

5.1.17 Bindingsaffiniteit ELISA .................................................................................................. 54

5.1.18 Weefselkweek L929 NF-ϰB/luc cellen ........................................................................... 55

5.1.19 In vitro inhibitietest ....................................................................................................... 55

5.2 miRNA’s ................................................................................................................................. 56

5.2.1 Transformatie: hitte shock ............................................................................................ 56

5.2.2 Kolonie-PCR ................................................................................................................... 57

5.2.3 Zuivering ........................................................................................................................ 57

5.2.4 Weefselkweek C57BL/6 MEF cellen .............................................................................. 57

5.2.5 In vitro test miRNA-511 ................................................................................................. 58

5.2.6 Hydrodynamische staartader injectie ........................................................................... 58

5.2.7 TNF/LPS letaliteitexperiment ........................................................................................ 59

6. Referenties ................................................................................................................................ 61

7. Bijlagen ...................................................................................................................................... 71

7.1 Nanobody sequenties ............................................................................................................ 71

7.2 Nanobody sequentie-analyse ................................................................................................ 72

7.2.1 Nanobody 10 ................................................................................................................. 72

7.2.2 Nanobody 15 ................................................................................................................. 73

7.2.3 Nanobody 42 ................................................................................................................. 74

7.2.4 Nanobody 62 ................................................................................................................. 75

7.2.5 Nanobody 64 ................................................................................................................. 76

7.2.6 Nanobody 86 ................................................................................................................. 77

7.3 Coomassie kleuring Nanobody fracties ................................................................................. 78

7.4 miRNA predictieprogramma’s ............................................................................................... 79

7.5 Productenlijst ........................................................................................................................ 80

7.6 Protocols ................................................................................................................................ 82

7.6.1 Nanobodies ................................................................................................................... 82

7.6.2 miRNA’s ......................................................................................................................... 87

7.7 Samenstelling buffers en media ............................................................................................ 91

vii

Lijst met afkortingen Afkorting Verklaring

Ab Antibody

ADAM17 A Disintegrin And Metalloprotease 17

AmpR Ampicillin Resistance gene

AP Activator Protein

AU Adenylate Uridylate

BIDI BI-DIstilled water

bp baseparen

BSA Bovine Serum Albumin

C Constant Domain (Antibody)

CD Crohn's Disease

cDNA complement DNA

CDR Complementarity Determining Region

CIA Collagen Induced Arthritis

cIAP cellular Inhibitor of Apoptosis Protein

CMV CytoMegaloVirus

CTR Controle

CYLD CYLinDromatosis

DD Death Domain

DGCR8 DiGeorge syndrome Critical Region gene 8

DISC Death Induced Signaling Complex

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DNA DeoxyriboNucleic Acid

DSS Dextran Sodium Sulfate

dXTP deoxyTriPhosphate nucleotides

EAE Experimental Autoimmune Encephalitis

EBV Epstein Barr Virus

E. coli Escherichia coli

EDTA EthyleneDiamineTetraAcetic acid

eGFP enhanced Green Fluorescent Protein

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Fab Fragment antigen binding

FADD Fas-Associated protein with a Death Domain

Fc Fragment crystallizable

FCS Fetal Calf Serum

Fv Fragment variable

HC Heavy Chain

HCAb Heavy Chain Antibody

His-tag HexaHistidine tag

HLA Human Leukocyte Antigen

HRP Horse Radish Peroxidase

viii

HSV-TK Herpes Simplex Virus -Thymidine Kinase

hTNFtg human TNF transgenic

IBD Inflammatory Bowel Disease

IFN Interferon

Ig Immunoglobulin

IKK IϰB Kinase

IL InterLeukin

IMAC Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

IPTG IsoPropyl β-D-1-ThioGalactopyranoside

IϰB Inhibitor of NF-ϰB

JNK c-Jun N-terminal Kinase

kDa kiloDalton

LB Lysogeny Broth

LC Light Chain

LD Loading Dye

LNA Locked Nucleic Acid

LPS LipoPolySaccharide

LUBAC Linear UBiquitin chain Assembly Complex

MAP Mitogen Activated Protein

MAP3K Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase

MEF Mouse Embryonic Fibroblast

MEKK MAP/ERK Kinase Kinase

MHC Major Histocompatibility Complex

miRNA microRiboNucleic Acid

MMP Matrix MetalloProtease

MOG Myelin Oligodendrocyt Glycoprotein

MRI Magnetic Resonance Imaging

mRNA messenger RiboNucleic Acid

MS Multiple Sclerosis

mTNFR mouse TNFR

Nb Nanobody

NEAA Non Essential Amino Acid

NEMO NF-ϰB Essential MOdulator

NF- ϰB Nuclear Factor ϰB

NIK NF-ϰB Inducing Kinase

OD Optical Density

PAZ Piwi-Argonaute-Zwolle

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PEG PolyEthyleneGlycol

RA Rheumatoïd arthritis

RanGTP Ras-related nuclear protein Guanosine TriPhosphate

RANKL Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand

RIIID RNase III-domain

ix

RIP Receptor Interacting Protein

RISC RNA-Induced Silencing Complex

RNA RiboNucleic Acid

rpm revolutions per minute

RT-PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

SOC Super Optimal broth with Catabolite repression

SODD Silencer Of Death Domain

sTNF soluble Tumor Necrosis Factor

TACE Tumor necrosis factor-α Converting Enzyme

TAK TGF-β Activated Kinase

TB Teriffic Broth

TBS Tris-Buffered Saline

TBS-T Tris-Buffered Saline + Tween

Th-cell T-helper cell

TMB 3,3′,5,5′-TetraMethylBenzidine

tmTNF transmembrane Tumor Necrosis Factor

TNF Tumor Necrosis Factor

TNFR Tumor Necrosis Factor Receptor

TRADD Tumor necrosis factor Receptor Associated Death Domain

TRAF Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor

Treg T-regulatory cell

TTP TrisTetraProlin

Ubc Ubiquitine conjugating enzyme

UC Ulcerative Colitis

V Variable Domain (Antibody)

WB Western Blot

xi

Lijst met figuren FIGUUR 1: SIGNALISATIEWEGEN TNFR1 ......................................................................................................................... 2

FIGUUR 2: SIGNALISATIEWEGEN TNFR2 ......................................................................................................................... 4

FIGUUR 3: HUIDIGE GENERATIE TNF-BLOKKERS ................................................................................................................ 5

FIGUUR 4: CONVENTIONEEL ANTILICHAAM, ZWARE KETEN ANTILICHAAM, NANOBODY .......................................................... 11

FIGUUR 5: BIOGENESE VAN INTERGENISCHE MIRNA’S ..................................................................................................... 13

FIGUUR 6: BIOGENESE VAN INTRAGENISCHE MIRNA’S ..................................................................................................... 13

FIGUUR 7: GELELEKTROFORESE NANOBODIES ................................................................................................................. 20

FIGUUR 8: KOLONIE-PCR ........................................................................................................................................... 23

FIGUUR 9: COOMASSIE KLEURING VAN DE AFGEZONDERDE FRACTIES .................................................................................. 25

FIGUUR 10: WESTERN BLOT VAN DE AFGEZONDERDE FRACTIES ......................................................................................... 25

FIGUUR 11: COOMASSIE KLEURING EN WESTERN BLOT ELUATEN ....................................................................................... 26

FIGUUR 12: GRAFIEK BINDINGSAFFINITEIT ELISA ............................................................................................................ 28

FIGUUR 13: GRAFIEKEN INHIBITIETEST .......................................................................................................................... 32

FIGUUR 14: KOLONIE-PCR MIRNA’S ........................................................................................................................... 35

FIGUUR 15: C57BL/6-MEF CELLEN ............................................................................................................................. 36

FIGUUR 16: IN VITRO TEST MIRNA-511 ....................................................................................................................... 37

FIGUUR 17: TNFR1 LEVEL BIJ MIRNA-511 ................................................................................................................... 38

FIGUUR 18: TNFR1 LEVEL NA TOEDIENING MIRNA’S ...................................................................................................... 39

FIGUUR 19: LETALITEIT EN TEMPERATUURSMETING NA TOEDIENING TNF ............................................................................ 40

FIGUUR 20: LETALITEIT EN TEMPERATUURSMETING NA TOEDIENING LPS. ........................................................................... 41

FIGUUR 21: LETALITEIT EN TEMPERATUURSMETING NA TOEDIENING LPS BIJ TNFR1 KNOCK-OUT MUIZEN ................................ 43

FIGUUR 22: PHEN6C VECTOR ...................................................................................................................................... 49

FIGUUR 23: PEZX-MR04 VECTOR ............................................................................................................................... 56

FIGUUR 24: NANOBODY SEQUENTIES ............................................................................................................................ 71

FIGUUR 25: SEQUENTIE-ANALYSE NANOBODY 10 ........................................................................................................... 72






FIGUUR 31: COOMASSIE KLEURING NANOBODY FRACTIES ................................................................................................ 78

Lijst met tabellen TABEL 1: OVERZICHT VAN GENEN GEASSOCIEERD MET IBD ................................................................................................. 8

TABEL 2: FUNCTIE MIRNA’S........................................................................................................................................ 15

TABEL 3: PCR-TEMPERATUURPROFIEL .......................................................................................................................... 19

TABEL 4: DNA CONCENTRATIE EN ZUIVERHEID NA PCR.................................................................................................... 20

TABEL 5: DNA CONCENTRATIE EN ZUIVERHEID NA DUBBELDIGEST ...................................................................................... 21

TABEL 6: TOTALE EIWITCONCENTRATIE NANOBODY-ELUATEN............................................................................................ 27

TABEL 7: MIRNA PREDICTIEPROGRAMMA’S ................................................................................................................... 33

TABEL 8: TEMPERATUURPROFIEL KOLONIE-PCR MIRNA’S ............................................................................................... 34

TABEL 9: CONCENTRATIE EN ZUIVERHEID VAN MIRNA’S................................................................................................... 36

TABEL 10: MIRNA PREDICTIEPROGRAMMA’S ................................................................................................................. 79

TABEL 11: PRODUCTENLIJST ........................................................................................................................................ 81

xiii

Samenvatting

Tumor Necrosis Factor (TNF) is een cytokine dat onder meer een belangrijke rol speelt bij

inflammatie. Het komt voor als oplosbaar en transmembranair eiwit. De signalisatie van TNF verloopt

via twee receptoren: TNF receptor 1 en 2. Receptor 1 is betrokken bij meerdere processen zoals

inflammatie, celproliferatie, celoverleving en apoptose. Receptor 2 speelt een rol bij de regulatie van

het immuunsysteem en het initiëren van een herstelreactie na inflammatie.

Dysregulatie van TNF speelt een rol bij de ontwikkeling van auto-immuunziektes zoals reumatoïde

artritis, inflammatoire darmziektes en multiple sclerose. Vandaag worden reeds 5 TNF-blokkers

gebruikt als behandeling voor deze auto-immuunziektes: Adalimumab, Golimumab, Certolizumab,

Infliximab en Etanercept. Deze neutraliseren het TNF en blokkeren zo de signalisatie via de twee

receptoren. Bij het gebruik van deze TNF-blokkers kunnen echter neveneffecten optreden zoals

demyelinisatie en lupus-achtige symptomen.

Het doel van ons onderzoek is een nieuwe generatie TNF-blokkers te ontwikkelen, die specifiek

gericht zijn tegen TNF receptor 1 om de inflammatie te verminderen. TNF receptor 2 wordt dan niet

geïnhibeerd, zodat deze blijft zorgen voor de regulatie van het immuunsysteem en herstelreacties

kan induceren. Hierdoor kunnen de neveneffecten van de huidige generatie TNF-blokkers

verminderd en eventueel zelfs voorkomen worden. Om ons doel te bereiken opteren we voor het

gebruik van Nanobodies en microRNA’s.

De aangemaakte Nanobodies werden opnieuw gekloneerd en in vitro getest op bindings- en

inhibitiecapaciteit. Hieruit bleek dat Nanobodies 15, 42 en 62 een sterke bindingscapaciteit vertonen,

Nanobody 1, 3 en 86, 10 en 64 en Nanobody 7 een minder sterke. Uit een eerste inhibitietest blijkt

voorlopig dat Nanobody 1 een goede inhibitiecapaciteit vertoont. De overige Nanobodies bezitten

geen inhibitiecapaciteit.

De microRNA’s werden in vitro getest of ze het TNF receptor 1 expressieniveau verlagen. Hieruit is

gebleken dat het TNF receptor 1 expressieniveau significant gedaald is bij cellen die getransfecteerd

werden met microRNA-511 in vergelijking met cellen die getransfecteerd werden met controle-

microRNA. Vervolgens werden deze microRNA’s in vivo getest via hydrodynamische staartader

injectie en letaliteittesten, zowel in C57BL/6 muizen als in TNF receptor 1 knock-out muizen. Uit de

afgezonderde leverstalen bleek dat microRNA-511 het TNF receptor 1 expressieniveau significant

verlaagde ten opzicht van de controle. Het zorgde er eveneens voor dat de behandelde muizen

resistenter werden tegen TNF en lipopolysaccharide in een letaliteittest. Dit laatste effect was niet

zichtbaar bij testen met TNF receptor 1 knock-out muizen, waaruit afgeleid kan worden dat de

bescherming door microRNA-511 specifiek het gevolg is van een verlaging van het TNF receptor 1

expressieniveau. Tenslotte werd een eerste in vivo test uitgevoerd met alle, uit in silico predictie,

bekomen microRNA’s via hydrodynamische staartader injectie. Uit de afgezonderde leverstalen bleek

dat het TNF receptor 1 expressieniveau het sterkst gedaald is na toediening van microRNA-125b1,

gevolgd door respectievelijk microRNA-125a, -511, -29b2, -146a, -335, -351, -763, -29c, -211, -149a, -

125b2, -29b1 en -29a.

xv

Summary

Tumor Necrosis Factor (TNF) is a cytokine, involved in inflammation. It exists as a soluble and as a

transmembrane protein. TNF signaling acts through two receptors: TNF receptor 1 and 2. Receptor 1

is involved in multiple processes like inflammation, cell proliferation, cell survival and apoptosis.

Receptor 2 plays a role in the regulation of the immune system and initiates healing after

inflammation.

Dysregulation of TNF plays a role in the development of autoimmune diseases like rheumatoid

arthritis, inflammatory bowel disease and multiple sclerosis. Today, already 5 TNF blockers are used

in the treatment of those autoimmune diseases: Adalimumab, Golimumab, Certolizumab, Infliximab

and Etanercept. These blockers neutralize TNF and block the signaling via the two receptors. But the

use of these TNF blockers may induce several side effects like demyelinisation and the rise of lupus

like symptoms.

The purpose of our research is the development of a new generation TNF blockers, with TNF receptor

1 as a target. By the specific blockage of TNF receptor 1, inflammation can be reduced. Receptor 2 is

not blocked, so it can exert its function in the regulation of the immune system and the initiation of

healing. So it could be possible to reduce or even prevent the side effects of the current generation

TNF blockers. To achieve this, we use Nanobodies and microRNAs.

The produced Nanobodies were recloned and tested in vitro for binding and inhibition capacity. The

results showed that Nanobodies 15, 42 and 62 are strong binders. Nanobody 1, 3 and 86, 10 and 64

and Nanobody 7 are weaker binders. Nanobody 1 is a good inhibitor. The other Nanobodies show no

inhibition. This inhibition test needs to be repeated before definite conclusions can be made.

The microRNAs were tested in vitro to see if they lower the TNF receptor 1 expression level. This test

showed that the TNF receptor 1 level is significantly lower after transfection with microRNA-511 in

comparison with microRNA-controle. Next microRNA-511 was thoroughly tested in vivo by

hydrodynamic tail vein injection and lethality tests, both in C57BL/6 and in TNF receptor 1 knock out

mice. The isolated liver samples showed that TNF receptor 1 expression was significantly lower after

treatment with microRNA-511 then after treatment with the microRNA-control. Also, microRNA-511

made mice more resistant against TNF and lipopolysaccharide in a lethality test. This protection was

absent in TNF receptor 1 knock out mice. From this experiment can be concluded that microRNA-511

offers protection specifically through the lowering of the TNF receptor 1 expression level. After these

results with microRNA-511, the hydrodynamic tail vein test was repeated with all of the produced

microRNAs. The isolated liver samples showed that the TNF receptor 1 expression level is lowered

the most after treatment with microRNA-125b1, followed by microRNA-125a, -511, -29b2, -146a, -

335, -351, -763, -29c, -211, -149a, -125b2, -29b1 en -29a.

Hoofdstuk 1: Inleiding

1

1. Inleiding

1.1 Tumor Necrosis Factor (TNF)

In de jaren ‘60 werd voor het eerst tumor regressie waargenomen bij muizen. Het serum van muizen, behandeld met Serratia marcescens polysaccharide, werd ingespoten in muizen met sarcoma 37 waardoor de tumor verkleinde (O'Malley et al, 1963).

Het duurde tot 1984 eer TNF geïsoleerd kon worden (Aggarwal et al, 1985). Het cDNA werd gekloneerd aan de hand van de eiwitsequentie. Via sequentiehomologie werden meerdere

leden van de TNF-superfamilie geïdentificeerd. Deze familie wordt gekenmerkt door een domein dat bestaat uit 2 antiparallelle β-sheets die een jelly-rol structuur vormen (Eck & Sprang, 1989). Vandaag zijn in deze familie 19 leden gekend. Deze spelen een rol in vele processen waaronder inflammatie, apoptose en celproliferatie. Ook zijn ze betrokken bij de pathogenese van verschillende ziektes, zoals inflammatoire darmziektes, reumatoïde artritis, multiple sclerose en kanker. Hierdoor worden ze beschouwd als goede drug targets voor de behandeling van deze ziektes (Aggarwal et al, 2012).

TNF is een homotrimeer van 212 aminozuren. Het is een type II transmembranair eiwit waarvan de aminoterminus zich in het cytosol bevindt. Dit transmembranair TNF (tmTNF) kan gekliefd worden door het metalloprotease TACE (Tumor necrosis factor-α Converting Enzyme), ook bekend als ADAM17 (A Disintegrin And Metalloprotease 17), waardoor uit het

extracellulaire deel het oplosbaar TNF ontstaat (sTNF) (Horiuchi et al, 2010).

TNF wordt zowel door immuun- als door somatische cellen geproduceerd. Een snelle reactie op infectie of verwonding is mogelijk door een strikte controle op het messengerRNA (mRNA) van TNF. Dit mRNA bevat Adenylaat Uridylaat (AU)-rijke sequenties in de 3’-UTR regio en is daardoor zeer onstabiel, waardoor slechts weinig TNF-eiwit geproduceerd wordt. Bij een stimulus wordt het mRNA gestabiliseerd door gefosforyleerd TTP (TrisTetraProline). Hierdoor kan de expressie van TNF snel toenemen (Clement et al, 2011).

1.2 TNF Receptor 1 (TNFR1)

De beide vormen van TNF (sTNF en tmTNF) kunnen binden op TNFR1. Deze binding veroorzaakt de clustering van 3 identieke subunits van de receptor tot een trimeer. Hierdoor komt de inhibitor SODD (Silencer Of Death Domain) vrij van de subunits. De signalisatieweg van TNFR1 start met de binding van TRADD (TNFR Associated Death Domain) aan het DD (Death Domain) van de TNFR1. TRADD fungeert als een adaptoreiwit en rekruteert TRAF2 en -5 (TNFR Associated Factor), cIAP1 en -2 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein) en RIP1 (Receptor Interacting Protein) naar de receptor en samen vormen ze complex I. Vanuit dit complex kunnen verschillende signaalwegen gevolgd worden (Figuur 1).

Bij de eerste signaalweg bindt MEKK1 (MAP/ERK Kinase Kinase) aan het complex I. Door contact met TRAF2 ondergaat MEKK1 autofosforylatie en wordt het geactiveerd. Vervolgens


2

activeert MEKK1 JNK (c-Jun N-terminal Kinase) en start zo een kinasecascade die leidt tot de

fosforylatie en activatie van AP-1 (Activator Protein). AP-1 transloceert naar de nucleus en activeert daar zijn targetgenen. Deze targetgenen zijn onder meer betrokken bij celoverleving, celproliferatie en apoptose.

Een tweede signaalweg start eveneens vanuit complex I. Bij deze signaalweg worden zowel aan TRAF2 als aan RIP1 Lysine 63 (K63) poly-ubiquitineketens aangehecht door de ubiquitine E3 ligase-activiteit van cIAP1 en -2. Deze ketens zijn noodzakelijk voor de rekrutering van het TAK1 (TGF-β Activated Kinase 1) kinasecomplex en het IKK (IϰB Kinase) complex. Dit IKK complex bestaat uit verschillende subunits: IKKα, IKKβ en IKKγ/NEMO (NF-ϰB Essential MOdulator). Dit complex wordt gerekruteerd naar de receptor door de binding van NEMO aan RIP1. Deze binding wordt gestabiliseerd door LUBAC (Linear UBiquitin chain Assembly Complex). Het TAK1 kinase fosforyleert de IKKβ waardoor het IKK complex actief wordt. IKK fosforyleert vervolgens de Inhibitor van NF-ϰB (IϰBα). Het gefosforyleerde IϰBα wordt herkend en vervolgens ge-ubiquitinileerd door een E2 ubiquitine ligase van de Ubc4/5

Figuur 1: Signalisatiewegen TNFR1: De figuur schetst de signaaltransductie vanuit TNFR1 (Cabal-Hierro & Lazo, 2012). Afkortingen: TNF: Tumor Necrosis Factor; TRADD: Tumor necrosis factor Receptor Associated Death Domain; TNFR: Tumor Necrosis Factor Receptor; RIP: Receptor Interacting Protein; TRAF: Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor; cIAP: cellular Inhibitor of Apoptosis Protein; MAP3K: Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase; JNK: c-Jun N-terminal Kinase; AP-1: Activator Protein; K63: Lysine 63; LUBAC: Linear UBiquitin chain Assembly Complex; IKK: IϰB Kinase; NEMO: NF-ϰB Essential Modulator; IϰB: Inhibitor of NF-ϰB; NF- ϰB: Nuclear Factor ϰB; FADD: Fas-Associated protein with a Death Domain


3

familie en het SCF-βTrCP E3 ligase, waarna het afgebroken wordt in het 26S proteasoom

(Chen, 2005). Hierdoor komt NF-ϰB (Nuclear Factor ϰB) vrij en kan het transloceren naar de nucleus, waar het zijn targetgenen kan activeren. Deze zijn onder meer betrokken bij celoverleving, apoptose en inflammatie.

Bij de derde signalisatieweg wordt de receptor geïnternaliseerd via endocytose. Hierbij speelt de ubiquitinatie van RIP1 een rol. In het cytosol gaat CYLD (CYLinDromatosis) RIP1 de-ubiquitineren, waarop RIP1 gerekruteerd wordt door DISC. Het DISC (Death Induced Signaling Complex) complex bestaat verder uit: TRADD, FADD (Fas-Associated protein with a Death Domain), RIP3 en procaspase-8. De inactivatie van RIP1 en RIP3 leidt tot de activatie van caspase-8, waardoor de pro-apoptotische caspase-cascade geactiveerd wordt. Indien procaspase-8 echter geïnhibeerd wordt door vb. medicatie of celstress, is het DISC complex niet in staat om apoptose te veroorzaken. In deze situatie kan, afhankelijk van het celtype,

het necroptosoom gevormd worden. Het necroptosoom bestaat uit TRADD, FADD en RIP1 en-3. De start van deze alternatieve signaalweg is de fosforylatie van RIP1 en -3. Hierdoor worden verschillende processen in gang gezet die uiteindelijk leiden tot geprogrammeerde celdood op een caspase-onafhankelijke manier (Cabal-Hierro & Lazo, 2012).

TNFR1 speelt een rol in het immuunsysteem. Bij muizen die deficiënt zijn voor TNFR1 is aangetoond dat ze minder Peyerse platen hebben dan wild-type muizen, ook is de ontwikkeling van de germinale centra en folliculaire dendritische cellen verstoord (Matsumoto et al, 1997). De receptor speelt ook een rol bij de bestrijding van microbiële en virale infecties (Flynn et al, 1995; Jacobs et al, 2000).

1.3 TNF Receptor 2 (TNFR2)

In tegenstelling tot TNFR1, die geactiveerd kan worden door zowel sTNF als tmTNF, wordt TNFR2 vooral geactiveerd door binding van tmTNF en bevat de receptor geen DD (Death Domain). Bij de binding van tmTNF clusteren 3 identieke subunits samen tot een trimeer. Dit zorgt ervoor dat TRAF2 bindt aan de receptor. TRAF2 is een adaptoreiwit en rekruteert TRAF3, cIAP1 en cIAP2. De vorming van dit complex start de signaaltransductie die leidt tot de activatie van de transcriptiefactoren AP-1 (zie TNFR1 signalisatie) en NF-ϰB. NF-ϰB wordt via twee verschillende signalisatiewegen geactiveerd (Figuur 2): de klassieke NF-ϰB signalisatieweg (zie TNFR1 signalisatie) en de alternatieve weg. Deze alternatieve signalisatieweg loopt via de activatie van NIK (NF-ϰB Inducing Kinase). NIK fosforyleert IKK,

dat vervolgens afgebroken wordt. Hierdoor wordt NF-ϰB vrijgesteld en transloceert het naar de nucleus, waar het zijn targetgenen activeert (Cabal-Hierro & Lazo, 2012).

TNFR2 speelt een rol bij de werking van het immuunsysteem. TNFR2 is onder meer belangrijk voor CD8+ T-cel ontwikkeling (Kim et al, 2006) en de regulatie van het immuunsysteem (Tsakiri et al, 2012). Muizen waarbij TNFR2 gedeletet is, zijn vatbaarder voor polymicrobiële shock (Ebach et al, 2005).


4

1.4 Huidige generatie TNF-blokkers

Momenteel worden 5 TNF-blokkers gebruikt in de behandeling van auto-immuunziektes (Figuur 3). Infliximab is een gehumaniseerd antilichaam dat bestaat uit een murine Fv (variabel Fragment) en een humane Fc (constant/‘crystallizable’ Fragment) (zie 1.8.1).

Adalimumab en Golimumab zijn humane antilichamen. Etanercept is een fusie-eiwit dat bestaat uit 2 TNFR2 extracellulaire domeinen en een Fc IgG1 fragment. Certolizumab tenslotte is een gehumaniseerd antigen bindend fragment gekoppeld aan PEG (PolyEthyleen Glycol) (Taylor, 2010).

De nevenwerkingen van de huidige generatie TNF-blokkers zijn onder meer een verhoogd risico op ernstige infecties (Dixon et al, 2006) en lymfomen (Wolfe & Michaud, 2004). Ook is er kans op een heractivatie van tuberculose; TNF zorgt er immers voor dat Mycobacterium tuberculosis ingekapseld blijft in de granulomen. Bij blokkering van TNF worden deze granuloma’s niet langer in stand gehouden en flakkert de ziekte op (Dixon et al, 2010). Hierbij komt een hoger risico op infectie met andere intracellulaire pathogenen en opportunistische infecties zoals Herpes simplex (Salmon-Ceron et al, 2011). Een andere

Figuur 2: Signalisatiewegen TNFR2: De figuur schetst de signaaltransductie vanuit TNFR2 (Cabal-Hierro & Lazo, 2012). Afkortingen: mTNF: transmembranair Tumor Necrosis Factor; TNFR: Tumor Necrosis Factor Receptor; TRAF: Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor; cIAP: cellular Inhibitor of Apoptosis Protein; MAP3K: Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase; JNK: c-Jun N-terminal Kinase; AP: Activator Protein; IKK: IϰB Kinase; NEMO: NF-ϰB Essential MOdulator; IϰB: Inhibitor of NF-ϰB; NF- ϰB: Nuclear Factor ϰB; NIK: NF-ϰB Inducing Kinase


5

bijwerking is demyelinisatie (Bernatsky et al, 2010; Mohan et al, 2001). Tenslotte bestaat

een kans dat de patiënten andere auto-immuunziektes ontwikkelen bij behandeling met TNF-blokkers. De meest voorkomende zijn lupus, vasculitis en interstitiële longziekte (Ramos-Casals et al, 2007).

1.5 Reumatoïde artritis

Reumatoïde artritis (RA) is een inflammatoire aandoening van de gewrichten, met voornamelijk een aantasting van de kleine gewrichten (handen, voeten en cervicale wervelzuil). Klinisch wordt dit gekenmerkt door pijnlijk gezwollen gewrichten, ochtendstijfheid en een algemeen onwelzijn.

De ziekte treft ongeveer tweemaal zoveel vrouwen als mannen en start typisch tussen de 40

en 60 jaar (Bullough, 2004). De ziekte ontstaat door een samenspel van genetische en

omgevingsfactoren. De concordantie bij monozygote tweelingen is 15-30%, bij dizygote tweelingen is dit 5% (MacGregor et al, 2000). Genen die reeds in verband zijn gebracht met RA zijn onder andere HLA-DRB1, dat betrokken is bij de antigen presentatie aan T-cellen, MHC dat een rol speelt bij antigen presentatie en PTPN22, dat o.a. deelneemt aan de activatie en controle van T-cellen. Polymorfismen in INFγ/IL26 lijken bij te dragen tot een verhoogde incidentie bij vrouwen. Tenslotte veroorzaken polymorfismen van IL10, die zorgen voor een lager expressieniveau, ernstiger symptomen.

Roken is een omgevingsfactor die niet alleen een rol speelt bij de pathogenese van RA, maar ook de ziekte-ernst doet toenemen (Schur, 2011). Omgevingsfactoren kunnen ook een rol spelen via moleculaire mimicry, wanneer een vreemd antigen zeer gelijkend is aan een lichaamseigen eiwit. Het immuunsysteem brengt bij contact met dit vreemd antigen een

Figuur 3: Huidige generatie TNF-blokkers: Schematische vergelijking tussen de goedgekeurde TNF-blokkers Adalimumab, Golimumab, Certolizumab, Infliximab en Etanercept (Thalayasingam & Isaacs, 2011). Afkortingen: Fab: antigen bindend Fragment; Fc: constant/‘crystallizable’ Fragment; PEG: PolyEthyleenGlycol; TNFR2: Tumor Necrosis Factor Receptor 2.


6

immuunreactie op gang, niet alleen tegen het vreemde antigen, maar ook tegen het

lichaamseigen eiwit. Deze auto-immuunreactie leidt meestal tot chronische inflammatie. Een mogelijk voorbeeld hiervan bij RA is het Epstein-Barr virus. Er is echter nog geen zekerheid omtrent deze hypothese (Toussirot & Roudier, 2008). Eénmaal geïnduceerd, onderhoudt RA zichzelf (Schur, 2011).

Microscopisch is er een toename van het aantal (hyperplasie) en het volume (hypertrofie) van de synoviocyten, wat macroscopisch een papillair aspect geeft. Soms zijn er erosies, waarbij de synoviocyten verdwijnen en vervangen worden door granulatieweefsel en fibrine. De synoviocyten zijn van het type A en B. Type A synoviocyten hebben macrofaagmerkers en functioneren als antigen-presenterende cellen. Type B synoviocyten secreteren hyaluronidasen die het kraakbeen afbreken. Typisch voor RA is de pannus. Dit lijkt op een normaal synovium, maar bevat talrijke capillairen en mastcellen.

Onder de synoviocyten is er een dens inflammatoir infiltraat, bestaande uit T- en B-lymfocyten, plasmacellen en mastcellen. Het is niet geweten of mastcellen een rol spelen in de inflammatie, of gerekruteerd worden door de inflammatie. Ze secreteren cytokines en groeifactoren die de extracellulaire matrix van het kraakbeen afbreken. De destructie van het kraakbeen gebeurt klassiek op de overgang tussen het synovium en het kraakbeen. Deze erosie kan zich verder uitbreiden tot in het botweefsel. Door een verhoogde osteoclast-activiteit kan in het omgevende botweefsel osteoporose ontstaan, de productie van cytokines leidt tot een stimulatie van de osteoclasten en een verminderde activiteit van de osteoblasten.

TNF speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling en het in stand houden van RA. Zo is aangetoond dat TNF overgeëxpresseerd wordt in het synoviaal vocht en het synoviale

membraan van reumapatiënten (Alsalameh et al, 1999). Ook de TNF receptoren worden overgeëxpresseerd op het synoviale membraan (Steiner et al, 1995). Muizen die humaan TNF overexpresseren (hTNFtg), ontwikkelen spontaan de symptomen van RA (Keffer et al, 1991).

De twee receptoren van TNF spelen een verschillende rol. Zo is gebleken dat TNFR1 de drijvende kracht is achter de ontwikkeling van RA. TNFR1-deficiënte muizen hebben minder ernstige symptomen dan wild-type muizen in het CIA model (Collagen Induced Arthritis). TNFR1-deficiënte hTNFtg muizen zijn zelfs volledig beschermd tegen RA (Bluml et al, 2012). De herintroductie van TNFR1 in de mesenchymale cellen van deze muizen is echter al voldoende voor de ontwikkeling van RA (Armaka et al, 2008). Een andere functie van TNFR1 is een toename van het aantal osteoclasten, die verantwoordelijk zijn voor de botdestructie

(Kobayashi et al, 2000; Zhang et al, 2001). TNFR1 inhibeert echter ook de productie van pathogene Th17 cellen, waardoor de expansie van deze cellen verhinderd wordt (Notley et al, 2008).

TNFR2 heeft een overwegend beschermende functie, o.a. door de expressie op hematopoïetische cellen en regulatorische T-cellen (Treg). Deze laatste staan in voor auto-tolerantie en bescherming tegen auto-immuunreacties (Chen et al, 2010; Nadkarni et al, 2007). Deze beschermende functie is af te leiden uit het feit dat TNFR2 deficiënte hTNFtg muizen zwaardere symptomen vertonen dan wild-type muizen. Dit kan deels verklaard worden door de waarneming dat indien hematopoïetische cellen de TNFR2 receptor verliezen, meer inflammatoire cellen naar het synovium gerekruteerd worden (Bluml et al,


7

2010). Een ander gegeven is dat TNFR2 knock-out muizen een verhoogde osteoclastgenese

vertonen, wat bijdraagt tot botafbraak (Abu-Amer et al, 2000).

1.6 Inflammatoire darmziektes

Chronisch inflammatoire darmziektes of IBD is een verzamelnaam voor een reeks aandoeningen zonder gekende etiologie. De meest voorkomende zijn de ziekte van Crohn (CD, Crohn’s disease) en Ulceratieve Colitis (UC). Ze worden meestal vastgesteld op jongere leeftijd, hoewel ze op elke leeftijd kunnen starten.

De ziekte van Crohn tast het terminale ileum aan. Maar de letsels kunnen in het hele

maagdarmstelsel optreden. Typisch aan de ziekte van Crohn is dat de volledige dikte van de darmwand wordt aangetast en dat de letsels segmentair en discontinu zijn: aangetaste en normale zones wisselen af. Macroscopisch is de wand van het ileum meestal verdikt. De mucosa is oedemateus met ulceraties en kloven. Frequent worden fistels gevormd door een verbinding tussen de aangetaste darm en een ander deel van de darm of huid. Microscopisch wordt de ziekte in meer dan de helft van de gevallen gekenmerkt door granulomen, opgebouwd uit epitheloïden en lymfocyten.

UC lokaliseert zich meestal in het rectum en breidt zich continu uit over de hele dikke darm. De letsels blijven meestal beperkt tot de mucosa, enkel in ernstige gevallen breidt de ontsteking zich uit over de hele dikte van de wand. In de actieve fase kunnen microscopisch crypte-abcessen gezien worden, een opstapeling van polynucleairen in de klierbuizen die kunnen openbarsten met vorming van abcesjes.

Zowel bij CD als bij UC is de architectuur van de mucosa verstoord: de klierbuizen verlopen onregelmatig, vertakken en reiken niet steeds tot tegen de muscularis propria.

De concordantie tussen monozygote tweelingen is bij CD 50%, wat wijst op een invloed van genetische factoren. Bij UC is de concordantie slechts 16%, dit duidt erop dat genetische

factoren hier een mindere rol spelen (Orholm et al, 2000). Verschillende genen zijn in verband gebracht met CD en/of UC (Tabel 1). Het NOD2 eiwit herkent en bindt bacteriële peptidoglycanen, waardoor NF-ϰB wordt geactiveerd. Mutaties in NOD2 die in verband gebracht worden met verhoogd risico op CD, bevinden zich in de peptidoglycaan- en nucleotide-bindende regio van het eiwit. MHC, TNF en HLA genen bevinden zich in de IBD3 locus. Deze genen worden zowel met CD als met UC geassocieerd (Noffsinger et al, 2007).

IBD ontstaat waarschijnlijk door een samenspel tussen genetische factoren, omgevingsfactoren en een ontregeld immuunsysteem. Roken heeft een verschillend effect op CD en UC. Bij CD verergert het de symptomen, terwijl het de symptomen mildert en bescherming biedt bij UC. Dit kan verklaard worden door het feit dat nicotine een inhiberende werking uitoefent op Th2 cellen, die een rol spelen bij UC. Het heeft echter geen invloed op Th1 cellen, die belangrijk zijn bij CD (Noffsinger et al, 2007). De intestinale flora en TNF spelen een rol bij het ontstaan en in standhouden van IBD. De patiënten tolereren hun eigen microbiële flora niet, wat voor een constante bron van inflammatie zorgt (Mayer, 2010). TNF beschadigt het epitheel met dysfunctie van de epitheliale grens als gevolg. De microbiële flora kan zo binnendringen in de darmwand, waardoor meer contacten plaatsvinden tussen de microbiële flora en immuuncellen. In latere fasen speelt TNF vooral


8

een rol bij de adaptieve immuunrespons (Armaka et al, 2008; Guma et al, 2011; Nenci et al,

2007; Roulis et al, 2011).

Locus Chromosomale locatie IBD-type Kandidaat genen

IBD1 16q12 CD NOD2

IBD2 12q13 UC VDR, IFN-γ

IBD3 6p13 CD, UC MHC I, MHC 2, TNF

IBD4 14q11 CD TCR α/γ complex

IBD5 5q31-33 CD IL3, IL4, IL5, IL13, CSF-2

IBD6 19p13 CD, UC ICAM-1, C3, TBXA2R, LTB4H

Andere 1p36 CD, UC TNFR familie, CASP9

Andere 3p CD, UC HGFR, EGFR, GNAI2

Andere 7q CD, UC MUC-3

Muizen die TNF overexpresseren, ontwikkelen spontaan symptomen van CD (Kontoyiannis et al, 1999). Muizen met een TNFR1 deficiëntie daarentegen, ontwikkelen geen CD (Armaka

et al, 2008), terwijl bij muizen met een TNFR2 deficiëntie de symptomen later optreden. Beide receptoren spelen dus een rol in het ziekteverloop van IBD (Kontoyiannis et al, 1999).

In het DSS (Dextraan Sodium Sulfaat) model voor IBD zijn aanwijzingen gevonden voor de heilzame werking van TNF. TNFR1-signalisatie activeert de aangeboren immuniteit, wat leidt tot minder schade. Ook de expressie van TNFR2 op CD4+ T-lymfocyten speelt een beschermende rol. TNFR2 signalisatie leidt tot activatie-geïnduceerde celdood en voorkomt zo de expansie van CD4+ cellen, die een rol spelen bij de ontwikkeling van IBD (Schneider et al, 2009).

De behandeling kan bestaan uit een verandering van levenswijze, medicatie en/of chirurgie. Een verandering in de levenswijze is onder meer stoppen met roken, gezien dit de mucosale

immuunrespons kan beïnvloeden (Noffsinger et al, 2007). Voorlopig worden drie TNF-blokkers gebruikt in de behandeling van IBD: Infliximab, Adalimumab en Certolizumab. Infliximab wordt zowel gebruikt bij CD als bij UC. Op termijn kan de werking hiervan afnemen, een mogelijke hypothese hiervoor is de ontwikkeling van antilichamen tegen Infliximab vanwege het chimere karakter. Adalimumab en Certolizumab worden enkel gebruikt bij de behandeling van CD. Behandeling met Etanercept leverde echter geen resultaat op. Natalizumab is eveneens een monoklonaal antilichaam, maar richt zich tegen α4-integrine, waardoor het de migratie van leukocyten verhindert (Rutgeerts et al, 2009).

Tabel 1: Overzicht van genen geassocieerd met IBD: Deze tabel geeft een overzicht van de genen die in verband gebracht werden met IBD, de loci en bij welk subtype IBD ze een rol spelen (Noffsinger et al, 2007).


9

1.7 Multiple sclerose

Multiple sclerose (MS) is een progressief voortschrijdende, demyeliniserende aandoening. De myelineschede rond de axonen verdwijnt, terwijl de axonen zelf niet worden aangetast. Het klinisch verloop is afhankelijk van de aangetaste zenuwen en variabel in de tijd. De ziekte treedt vaker op bij mannen dan bij vrouwen en begint gewoonlijk tussen de 20 en 40 jaar.

Genetische factoren spelen een rol bij MS. Zo is de concordantie bij monozygote tweelingen 30% en 14% bij dizygote tweelingen (Kuusisto et al, 2008). Genen die in verband zijn gebracht met MS zijn onder andere HLA-I en HLA-II, TCRβ, CTLA4, ICAM1 en SH2D2A (Dyment et al, 2004).

Indien iemand, jonger dan 15 jaar, verhuist van een regio met een hoge prevalentie van MS naar een regio met een lagere prevalentie, neemt het risico bij die persoon ook af. Het omgekeerde is eveneens waar: iemand jonger dan 15 jaar die verhuist van een regio met een lage prevalentie naar een regio met een hoge prevalentie, loopt meer risico op het ontwikkelen van MS. Soms zijn er “epidemies” van MS, wat een infectieuze origine doet vermoeden. Studies vermoeden een auto-immuun aandoening, waarschijnlijk uitgelokt door een virale infectie (Louis et al, 2009).

De myelineschede wordt gevormd door oligodendrocyten en omgeeft het axon van neuronen. Het isoleert het axon van de omgeving en zorgt zo voor een efficiënte geleiding van elektrische signalen doorheen het neuron. Bij multiple sclerose herkent het immuunsysteem componenten van deze myelineschede als pathogeen en breekt deze af,

wat resulteert in focale plaques. Deze onderbreking/beschadiging van de myelineschede verstoort de elektrische geleiding doorheen het axon, wat op termijn leidt tot een fysische of cognitieve handicap. Tijdens het ziekteproces wisselen opstoten af met periodes van (gedeeltelijk) herstel (Ellison et al, 2004).

Studies in het EAE model (Experimentele Auto-immuun Encephalitis) tonen een dubbele rol aan voor TNF. In dit model worden muizen geïmmuniseerd met eiwitten uit de myelineschede zoals het MOG eiwit (Major Oligodendrocyt Glycoprotein). Hierdoor ontstaat een auto-immuunreactie met dezelfde symptomen als MS. Het toedienen van TNF-blokkers voorkomt echter het ontstaan van EAE. Bij muizen die deficiënt zijn voor TNF is er een vertraging van de symptomen, maar eenmaal de symptomen optreden, kennen ze eenzelfde ziekteverloop als bij wild-type muizen. Een knock-out muis voor TNFR1 heeft mildere

symptomen dan een wild-type, terwijl een knock-out muis voor TNFR2 juist ernstiger symptomen heeft. Deze experimenten wijzen op een rol voor TNF zowel bij het initiëren van demyelinisatie als bij het herstel. TNFR1 wordt geassocieerd met inflammatie en demyelinisatie, terwijl TNFR2 bijdraagt tot oligodendrocytregeneratie en de suppressie van actieve lymfocyten (Caminero et al, 2011).

TNF-blokkers worden voorlopig niet gebruikt bij de behandeling van MS. Bij de behandeling van 2 patiënten met Infliximab verergerden de symptomen van MS. Het aantal plaques dat zichtbaar was op MRI, was toegenomen, evenals het aantal lymfocyten in het cerebro-spinale vocht (van Oosten et al, 1996). Een studie met Lenercept (een fusie-eiwit bestaande uit het extracellulair domein van TNFR1 en het IgG1 zware keten fragment) is stopgezet door een toename van opstoten bij de behandelde patiënten. Deze toename bleek dosis-


10

afhankelijk te zijn (Group, 1999). TNF-blokkers blijken demyelinisatie te veroorzaken, ook bij

gebruik in andere auto-immuunziektes (zie 1.4).

1.8 Nanobodies

1.8.1 Antilichamen

Antilichamen of immuunglobulines (Ig) worden geproduceerd door de plasmacellen van het adaptieve immuunsysteem. De conventionele structuur van een antilichaam bij Mammalia bestaat uit 2 identieke zware (heavy, H) en 2 identieke lichte (light, L) ketens die een Y-structuur aannemen (Figuur 4). Zowel de zware als de lichte keten bestaan uit constante (C)

en variabele (V) domeinen. Elke zware keten bestaat uit 4 domeinen: CH3, CH2, CH1 en VH. Een scharnierregio bevindt zich tussen domein CH2 en CH1. Elke lichte keten bestaat uit 2 domeinen: CL en VL. De C-domeinen vormen de constante regio van het antilichaam en bepalen het isotype (IgA, IgD, IgE, IgG of IgM). De V-regio’s vormen het variabele gebied van

het antilichaam en staan in voor de epitoop binding, ze bepalen m.a.w. de specificiteit van het antilichaam. Het deel van het antilichaam onder de scharnierregio (domein CH2 en CH3 van beide zware ketens) wordt het Fc (‘fragment crystallizable’) fragment genoemd. Dit deel van het antilichaam zorgt ervoor dat een immuunrespons volgt door binding aan Fc-receptoren en complementfactoren. Het deel boven de scharnierregio is het FAb of ‘Fragment Antigen binding’ regio. Dit deel bevat de paratoop, gevormd door de variabele regio’s van de zware en lichte ketens, ook het Fv (Fragment variable) fragment genoemd. Dit

fragment wordt gevormd door 3 variabele β-lussen op elk variabel domein, de ‘Complementarity Determining Regions’ of CDRs. Deze CDRs worden van elkaar gescheiden door ‘framework regions’ (Murphy et al, 2007).

1.8.2 Zware keten antilichamen

De Camelidae (Kameelachtigen) bezitten naast deze conventionele antilichamen nog een ander type antilichaam van het isotype IgG2 en IgG3: zware keten antilichamen of ‘Heavy-Chain Antibodies’ (HCAb) (Conrath et al, 2003)(Figuur 4). Deze bestaan uit 2 identieke zware ketens, maar bezitten geen lichte keten. Elke zware keten bestaat uit slechts 2 constante regio’s en één variabele regio, ze bezitten geen CH1 regio. De CH2 en CH3 regio zijn zeer

homoloog aan het Fc domein van de conventionele antilichamen. De paratoop bestaat hierdoor uit slechts 2 gelijke domeinen, in plaats van 4 bij de conventionele antilichamen. Het variabele domein bestaat zoals bij de conventionele antilichamen, eveneens uit 3 variabele β-lussen die echter geëvolueerd zijn om dit verschil (deels) op te vangen. Zo zijn de eerste en derde variabele lus van het domein langer, waarbij disulfidebruggen waarschijnlijk voor extra stabiliteit zorgen (Conrath et al, 2003). Een tweede aanpassing is dat in de tweede ‘framework region’ veel minder hydrofobe aminozuren terug te vinden zijn. Deze regio is de contactregio tussen de zware en lichte keten bij de conventionele antilichamen. Bij de HCAb is deze ankerplaats echter overbodig geworden. Door minder hydrofobe aminozuren in te bouwen wordt de oplosbaarheid bevorderd.


11

1.8.3 Nanobodies

Een Nanobody (Nb) bestaat uit slechts één domein en werd ontwikkeld uit het variabele domein van HCAb van Camelidae, het VHH domein (Figuur 4). Dit domein kan onafhankelijk een epitoop binden na klonering en expressie in Bacteria (Muyldermans & Lauwereys, 1999). Eén van de voordelen van een Nb is de beperkte grootte (12-15kDa), waardoor het toegang heeft tot holtes of groeves die onbereikbaar zijn voor de conventionele Abs (150-160 kDa) of HCAbs (110 kDa). Ook kan het beter doordringen in solide tumoren, kan het de bloed-hersenbarrière penetreren (Abulrob et al, 2005; Iqbal et al, 2010) en kan het beter doordringen in gefixeerde cellen (Perruchini et al, 2009). Een andere functie is het detecteren en moduleren van eiwitactiviteit in vivo (Kirchhofer et al, 2010; Klooster et al, 2009). Doordat de paratoop slechts uit één variabel domein bestaat, is het echter mogelijk

dat de specificiteit verminderd is ten opzichte van HCAb en Ab. Het VHH heeft een convexe vorm, in tegenstelling tot Abs die een concaaf tot plat oppervlak hebben. Hierdoor bindt het VHH preferentieel antigenen met een concave vorm, zoals actieve sites van enzymen (Lauwereys et al, 1998).

De productie van Nbs start met de injectie van een kameelachtige met het antigen en een adjuvans. Na een paar weken worden lymfocyten afgezonderd. Met behulp van RT-PCR wordt het VHH repertoire uit de B-cellen gekloond in een faagdisplayvector. De Nbs bevinden zich aan de tip van de fagen. Het antigen wordt geïmmobiliseerd en de faagbibliotheek wordt toegevoegd. Indien het Nb het antigen herkent, blijft de faag gebonden aan de drager, niet-specifieke fagen worden weggewassen. Na een paar selectierondes bekomt men zo een specifieke Nb-bibliotheek. Dit proces is ook gekend als panning of ‘phage-display’

(Muyldermans & Lauwereys, 1999).

Momenteel worden Nbs nog niet op grote schaal gebruikt bij de behandeling van patiënten. Wel zijn verschillende Nbs in ontwikkeling voor behandeling van diverse ziektes met als targets onder andere TNF, IL-6R en RANKL. Voor verschillende van deze Nbs zijn momenteel

Figuur 4: Conventioneel antilichaam, zware keten antilichaam, Nanobody: De figuur geeft een schematische weergave van een conventioneel antilichaam, een zware keten antilichaam en een Nanobody. Het geeft ook het onderlinge grootteverschil weer. (www.vib.be-Stefaan van Gysegem)


12

klinische trials aan de gang. Zo wordt onder meer het anti-TNF Nb getest in een fase II

klinische trial (Ablynx, 2010).

Door de geringe grootte van Nbs is het mogelijk om een gerichte afgifte te bekomen. Een voorbeeld hiervan is de productie van een anti-TNF Nb door Lactococcus lactis. Bij orale inname komen deze levende cellen in de darm terecht, waar het anti-TNF Nb gesecreteerd wordt. Behandeling met deze cellen leverde een verbetering op van symptomen van IBD bij muismodellen. Door het anti-TNF Nb niet langer systemisch toe te dienen kunnen vele neveneffecten, zoals een verminderde weerstand tegen infecties, voorkomen worden (Vandenbroucke et al, 2010).

1.9 microRNA’s

De microRiboNucleineZuren of miRNA’s zijn een klasse van niet-coderende RNA moleculen van ongeveer 22 nucleotiden lang. Er zijn 2 types: intergenische miRNA’s bevinden zich in de niet-coderende transcriptionele units van het genoom; de intragenische bevinden zich in de intronen van eiwit-coderende genen (Berezikov et al, 2007).

1.9.1 Intergenische miRNA’s

De transcriptie van de eerste precursor, het pri-miRNA, wordt uitgevoerd door RNA polymerase II (Lee et al, 2004). Het pri-miRNA neemt nadien een stam-lus structuur aan met onvolledige base-complementariteit en een 3’-overhangend einde. Het nucleaire enzym

Drosha, met cofactor DGCR8 of Pasha, herkent deze imperfecte structuur. Drosha bestaat uit 4 verschillende domeinen: een PAZ-domein (Piwi-Argonaute-Zwolle-domein), 2 RNase III-domeinen en een dubbelstrengig RNA (dsRNA) bindingsdomein. Het PAZ-domein bindt het 3’-overhangend einde. De RIII- domeinen vormen de 2 katalytische centra van Drosha. Deze centra klieven een fosfodiësterbinding op elk van de twee strengen met een verschil van 3 nucleotiden, waardoor opnieuw een 3’-overhangend einde gevormd wordt (Han et al, 2004). Het pre-miRNA wordt vervolgens via exportine-5 naar het cytoplasma getransporteerd op een RanGTP-afhankelijke manier (Yi et al, 2003).

In het cytoplasma wordt de 3’-overhang herkend door het enzym Dicer. Dicer bestaat uit 5 subunits: een PAZ-domein, 2 RIII-domeinen, een helicase-domein en een dsRNA bindingsdomein. Net zoals bij Drosha bindt het PAZ-domein de 3’-overhang en staan de RIII-

domeinen in voor het klieven van de fosfodiësterbindingen. De afstand tussen het PAZ-domein en de katalytische centra bedraagt ±65Å, wat overeenkomt met ongeveer 25 nucleotiden (Macrae et al, 2006). De lengte van het miRNA wordt m.a.w. bepaald door de afstand tussen het PAZ domein en de RIII-domeinen en niet op basis van sequentieherkenning. Hierdoor is het mogelijk om miRNA’s met verschillende sequenties met dezelfde enzymen te verwerken. Vervolgens worden de twee strengen ontwonden en de leidende streng (guide-strand) wordt geïncorporeerd in RISC (RNA Induced Silencing Complex) (Meister et al, 2004), meer bepaald door associatie van Argonaute met het mature miRNA (Liu et al, 2004). Dit complex wordt naar het complementaire mRNA geleid en blokkeert zo de translatie door binding of vernietiging van dit mRNA (Figuur 5).


13

1.9.2 Intragenische miRNA’s (mirtrons)

Mirtrons worden gelijktijdig afgeschreven met het coderende gen waarin ze zich bevinden

door RNA polymerase II. Het mRNA en miRNA bevinden zich met andere woorden in hetzelfde transcript. Het pre-miRNA wordt bij de meeste mirtrons (Lin et al, 2003) uit dit pre-mRNA losgemaakt door Drosha, al dan niet na splicing van het pre-mRNA (Kim & Kim, 2007). Nadien volgen ze de pathway zoals hierboven beschreven (Figuur 6).

2 types mirtrons volgen een alternatieve productieweg: de korte-haarspeld en de ‘tailed’ mirtrons. Bij de korte haarspeld mirtrons vallen de uiteinden van het pre-miRNA samen met

Figuur 6: Biogenese van intragenische miRNA’s: Het eerste deel van de biogenese van intragenische miRNA’s wordt weergegeven, vanaf de transcriptie tot de vorming van het pre-miRNA. Het tweede deel van de biogenese verloopt identiek als bij intergenische miRNA’s zoals weergegeven bij figuur 5B (Gambari 2011). Afkortingen: RNA pol II: RNA polymerase II; TF: Transcription Factor.

Figuur 5: Biogenese van intergenische miRNA’s: Figuur A toont de biogenese vanaf de transcriptie tot de vorming van het pre-miRNA. Figuur B toont het tweede deel van de biogenese vanaf het transport uit de nucleus tot de vorming van RISC. Dit tweede deel van de biogenese is gemeenschappelijk voor intergenische en intragenische miRNA’s (Gambari et al, 2011). Afkortingen: RNA pol II: RNA polymerase II; m7G: 5’ RNA cap; Ran: Ras related nuclear protein; RISC: RNA Induced Silencing Complex; TRBP: HIV-1 Transactivating response RNA-Binding Protein; TF: Transcription Factor.

B


14

de splice sites van het intron. Door splicing wordt het mirtron bevrijd uit het pre-mRNA. De

‘tailed’ mirtrons hebben maar één uiteinde dat samenvalt met een splice-site, het andere uiteinde bevat een staart met extra basen. Na trimming van deze staart door het RNA-exosoom (3’-staart) of 5’-3’ exoribonucleasen (5’-staart) worden ze herkend door Dicer en volgen ze de conventionele productieweg (Flynt et al, 2010).

1.9.3 Functie(s) geselecteerde miRNA’s

Uit eerder onderzoek is gebleken dat SPRET/Ei muizen hyporesponsief zijn voor TNF en LPS (Mahieu et al, 2006; Staelens et al, 2002). Het lagere TNFR1 expressieniveau in deze SPRET/Ei muizen is hier een verklaring voor (Van Hauwermeiren, 2011-2012). Bij een micro-array experiment, waarbij de expressie van miRNA’s in C57BL/6 vergeleken werd met de

expressie in SPRET/Ei muizen, blijkt dat miRNA-511 een significant hoger expressieniveau heeft in SPRET/Ei dan in C57BL/6 muizen. Bij een volgende stap in het onderzoek werden via in silico predictieprogramma’s meer miRNA’s gezocht die een invloed kunnen hebben op het TNFR1 expressieniveau. Deze predictieprogramma’s zijn gebaseerd op verschillende methoden zoals complementariteit tussen het miRNA en het mRNA van de target, de thermodynamica van de binding tussen het miRNA en de target, of de conservatie van de miRNA sequentie tijdens evolutie. De bekomen miRNA’s staan opgelijst in Tabel 2. De tabel vat enkele van de functies/targets uit de literatuur samen die reeds in verband gebracht werden met deze miRNA’s.

miRNA Functie Referentie

29a Cel cyclus arrest door neerregulatie p42.3

Suppressie tristetraprolin

Dmnt3 DNA methylase neerregulatie

Neerregulatie MMP-2

Neerregulatie perifeer myeline eiwit 22 (PMP22)

(Cui et al, 2011)

(Gebeshuber et al, 2009)

(Hand et al, 2012)

(Jones et al, 2011)

(Verrier et al, 2009)

29b Inhibitie invasie, apoptose en proliferatie in glioblastoma. Neerregulatie Podoplanin

(Cortez et al, 2010)

29c Cel cyclus arrest door suppressie cycline E

Neerregulatie Spry1

Dmnt3 DNA methylase neerregulatie

Neerregulatie extracellulaire matrix eiwitten geassocieerd met migratie en metastase

(Ding et al, 2011)

(Long et al, 2011)

(Nguyen et al, 2011)

(Sengupta et al, 2008)

125a Neerregulatie Mcl1, anti-apoptotisch eiwit

Neerregulatie Podoplanin

Neerregulatie ARID3B, tumorigeen eiwit

Neerregulatie Bak1, overleving hematopoïetische progenitorcellen

Opregulatie p53, induceert apoptose

(Balakrishnan et al, 2012)

(Cortez et al, 2010)

(Cowden Dahl et al, 2009)

(Gerrits et al, 2012)

(Jiang et al, 2011)


15

125b Neerregulatie VE-cadherine, voorkomt vorming bloedvaten

Neerregulatie Bmf en KLF13, expansie hematopoïetische cellen

Neerregulatie MAZ, leidt tot daling VEGF

Neerregulatie TNF

Neerregulatie Bcl-2, een anti-apoptotisch eiwit

(Muramatsu et al, 2012)

(Ooi et al, 2010)

(Smits et al, 2012)

(Tili et al, 2007)

(Zhao et al, 2012)

146a Neerregulatie MMP16

Negatieve regulatie immuunsysteem, targets niet gekend

Neerregulatie IRAK1 en TRAF6, belangrijk bij aangeboren immuuntolerantie

Neerregulatie Stat1, rol bij immuuntolerantie

Activatie microgliacellen, targets niet gekend

Neerregulatie pro-inflammatoire cytokines

(Astarci et al, 2012)

(Boldin et al, 2011)

(Chassin et al, 2010)

(Lu et al, 2010)

(Saba et al, 2012)

(Curtale et al, 2010); (Hua et al, 2011)

149 Neerregulatie Akt1 en E2F1, anti-apoptotische eiwitten (Lin et al, 2010)

211 Neerregulatie IGF2R, TGFBR2 en NFAT5 wat leidt tot tumorsuppressie

(Levy et al, 2010)

335 Indirecte opregulatie BRCA1, wat leidt tot tumorsuppressie

Neerregulatie SP1, wat leidt tot suppressie van metastase

(Heyn et al, 2011)

(Xu et al, 2012)

351 Neerregulatie TMEM 59 (Li et al, 2012)

763 Geen data

511 Modulatie immuunsysteem via TLR4 en CD80 (Tserel et al, 2011)

Tabel 2: Functie miRNA’s: De tabel geeft een selectie van de gekende functies van de miRNA’s die bekomen werden via miRNA predictieprogramma’s. Deze miRNA’s kunnen een invloed uitoefenen op TNFR1.

Hoofdstuk 2: Doelstelling

17

2. Doelstelling

TNF speelt een belangrijke rol in vele processen waaronder inflammatie, apoptose en celproliferatie en is noodzakelijk voor een efficiënte afweer tegen pathogenen. Het brengt bijvoorbeeld de acute fase reactie bij een infectie op gang en is betrokken bij de controle van immuuncellen.

Dysregulatie van TNF kan chronische auto-immuunziektes induceren en onderhouden waaronder reumatoïde artritis, inflammatoire darmziektes en multiple sclerose. Deze auto-immuunziektes worden gekenmerkt door een verlies aan autotolerantie, het immuunsysteem van deze patiënten reageert tegen lichaamseigen eiwitten. Door zijn rol bij

de regulatie van het immuunsysteen is TNF een belangrijk ‘drug target’ in de behandeling van deze auto-immuunziektes.

Vandaag zijn reeds meerdere TNF-blokkers goedgekeurd voor de behandeling van bepaalde auto-immuunziektes: Infliximab, Adalimumab, Golimumab, Etanercept en Certolizumab. Deze TNF-blokkers neutraliseren vooral oplosbaar TNF, maar kunnen ook transmembranair TNF binden. Ze voorkomen de interactie tussen TNF en zijn receptoren.

De behandeling met TNF-blokkers kan echter leiden tot ernstige neveneffecten. Deze zijn onder meer een verhoogd risico voor infecties, reactivering van tuberculose, demyelinisatie en de ontwikkeling van lupus-achtige symptomen. Deze neveneffecten zijn waarschijnlijk te wijten aan het feit dat TNF een complexe rol speelt in de controle van het immuunsysteem.

De dubbele rol van TNF kan verklaard worden door de signalisatie via twee receptoren, zoals onder meer aangetoond in studies met knock-out muizen. Zo zijn TNFR1 knock-out muizen volledig beschermd tegen IBD en vertonen TNFR2 knock-out muizen een vertraging van de symptomen. Bij RA en MS vertonen TNFR1 knock-out muizen mildere symptomen, terwijl TNFR2 knock-out muizen net ernstiger symptomen vertonen dan wild-type muizen. Deze vaststellingen duiden er mogelijks op dat TNFR1 grotendeels deze symptomen veroorzaakt,

terwijl TNFR2 vooral een beschermende rol vervult. Bij MS bijvoorbeeld speelt TNF via TNFR1 een rol bij de initiatie van demyelinisatie, maar zorgt het ook voor het initiëren van de herstelreactie en remyelinatie via TNFR2.

Ons onderzoek focust zich op de vraag of specifieke blokkering van TNFR1 een beter therapeutisch effect kan bereiken dan de huidige generatie TNF-blokkers. Door gericht

TNFR1 te blokkeren, die de chronische inflammatie in stand helpt te houden, en niet langer TNFR2 te blokkeren, kunnen neveneffecten misschien voorkomen worden en kan het herstel via TNFR2 mogelijks bevorderd worden. Nanobodies vormen een nieuwe klasse van therapeutische eiwitten met een groot potentieel. Enkele voordelen van het gebruik van Nanobodies zijn onder andere hun geringe grootte en eenvoudige productie. De gegenereerde Nanobodies kunnen TNFR1 afschermen voor binding met TNF of trimerisatie van de TNFR1 verhinderen, waardoor er niet langer signalisatie is. Aangezien recent meerdere Nanobodies met succes klinische ‘trials’ fase I en II hebben doorstaan, schept dit mogelijkheden voor de toepassing van deze behandeling bij de mens op korte termijn.

Een andere nieuwe invalshoek is het gebruik van miRNA’s. De miRNA’s binden op de 3’-UTR regio van het mRNA van hun target. Hierdoor wordt de transcriptie en/of translatie

Hoofdstuk 2: Doelstelling

18

verhinderd, wat het expressieniveau verlaagt. Door het gebruik van miRNA’s (rechtstreeks of

onrechtstreeks) gericht tegen TNFR1, zullen we trachten het expressieniveau van TNFR1 te verlagen en zodoende de gevoeligheid voor TNF te verlagen. Voorlopig worden miRNA’s echter nog niet toegepast als therapie bij de mens, gezien de mogelijke risico’s nog niet gekend zijn.

Hoofdstuk 3: Resultaten

19

3. Resultaten

3.1 Nanobodies

Tijdens de volgende experimenten werd gewerkt met de constructen 1, 3, 7, 10, 15, 42, 62, 64, 81 en 86. De sequenties werden opgelijst in bijlage 7.1. Deze Nbs zijn gericht tegen TNFR1. Met deze Nbs proberen we een specifieke inhibitie van de receptor te bekomen.

3.1.1 pHen4 en pHen6c vector

De Nanobodies (Nbs) werden geproduceerd door de VIB Nanobody Service Facility (Brussel). De constructen werden geleverd in de pHen4 vector. Deze vector bevat een pelB sequentie die zorgt voor de translocatie van de geproduceerde Nbs naar het periplasma. Daarnaast codeert de vector voor een haemagglutininetag aan de Nbs. Vermits geopteerd werd om gebruik te maken van een poly-histidinetag, werden de coderende Nb sequenties geherkloneerd naar de pHen6c vector (Figuur 22).

3.1.2 PCR

In een eerste stap werden de coderende Nb sequenties geamplificeerd d.m.v. een PCR (Polymerase Chain Reaction) met primer A6E (GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGA GGA

GG) en primer 38 (GGA CTA GTG CGG CCG CTG GAG ACG GTG ACC TGG GT). Er werd 50 µl mix aangemaakt met het template DNA en een mastermix van deze beide primers, Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, polymerase buffer, dXTP’s (deoxyTriPhosphate nucleotides) en BIDI (5.1.2). Vervolgens werd de PCR-cyclus 35x doorlopen in een C-1000 thermal cycler (Bio-Rad) volgens het temperatuurprofiel weergegeven in Tabel 3.

Stap Temperatuur (°C) Duur (min: sec)

Startdenaturatie 95 5:00

Denaturatie 95 0:30

Aanhechting (Annealing) 55 0:30

Elongatie 72 1:00

Eindelongatie 72 5:00

Afkoeling 10 oneindig

Aantal cycli denaturatie - aanhechting - elongatie: 35

Tabel 3: PCR-temperatuurprofiel: In de tabel wordt het gevolgde PCR-temperatuurprofiel weergegeven met de toegepaste temperatuur en tijdsduur per stap van de cyclus.


20

3.1.3 Gelelektroforese

Ter controle werd 2 µl staal samengevoegd met 8 µl BIDI (BI-DIstilled water) en 2 µl 6x LB (LadingsBuffer) en geladen op een 2% agarosegel met Sybr Safe samen met de ‘Small Fragments’ ladder. De elektroforese werd uitgevoerd in 1x TBE buffer bij 100 V gedurende 40 min.

De bekomen fragmenten (Figuur 7) zijn ± 400 bp lang, wat overeenkomt met de lengte van de Nb sequenties (7.1) . Alle stalen werden geselecteerd voor verdere kloneringsstappen.

3.1.4 Zuivering

Het geamplificeerde DNA-fragment werd opgezuiverd met de ‘Nucleospin Gel and PCR clean-up kit’ (M&N). Hierbij werd het DNA geëlueerd in 20 µl BIDI.

3.1.5 Nanodrop

De zuiverheid en concentratie van de stalen werd nagegaan door meting met de ‘Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer’ (Thermo Scientific) (Tabel 4).

Muis Nb Concentratie (ng/µl) 260:280 260:230

1 74,06 1,80 1,68

3 74,73 1,79 1,59

7 73,95 1,74 1,47

10 108,99 1,80 1,74

15 98,20 1,82 1,85

25 87,54 1,81 1,37

29 62,03 1,84 1,27

42 83,78 1,79 1,75

62 94,05 1,80 1,46

64 114,13 1,79 0,32

81 129,16 1,79 0,43

86 27,33 1,66 0,79

Tabel 4: DNA concentratie en zuiverheid na PCR: De tabel geeft de DNA-concentratie en de zuiverheid weer na de PCR-reactie. De stalen werden vervolgens gemeten met de Nanodrop. Afkortingen: Nb: Nanobody

Figuur 7: Gelelektroforese Nanobodies: De foto’s van de agarosegels worden weergegeven. Onder de laantjes zijn de overeenkomstige Nb-nummers weergegeven. Rechts zijn de groottes van de verschillende fragmenten van de ladder aangeduid in aantal baseparen. Afkortingen: Bl: Blanco


21

Uit deze resultaten blijkt dat de contaminatie van de DNA-stalen met eiwit minimaal is. De

lage 260:230 ratio geeft wel een contaminatie aan. Vermoedelijk zijn er nog chaotrope zouten zoals guanidine thiocyanaat aanwezig bij het DNA. Deze contaminatie kan te wijten zijn aan het gebruik van deze zouten bij de silica-kolomopzuivering met de gebruikte kit. Dit vormt echter geen probleem bij de volgende stappen van de klonering.

3.1.6 Restrictiedigest

Op 1 µg van het bekomen Nb-DNA en 10 µg pHen6c vector-DNA werd een dubbeldigest uitgevoerd. Het eerste digest werd uitgevoerd met PstI in buffer H. Om de stabiliteit van het

enzym te verhogen werd BSA (Bovine Serum Albumine) toegevoegd aan de restrictiemix. De mix werd aangevuld tot een volume van 20 µl met BIDI en gedurende 4 u geïncubeerd bij 37°C. Het DNA werd opgezuiverd met de Nucleospin kit.

Het tweede digest werd uitgevoerd op het opgezuiverde DNA met BstEII in buffer D. Na toevoeging van BSA en BIDI werd de mix gedurende 4 u geïncubeerd bij 50°C. Het DNA werd opnieuw opgezuiverd met de Nucleospin kit en de concentratie werd gemeten met de Nanodrop.

Muis Nb Concentratie (ng/µl) 260:280 260:230

1 21,69 2,39 0,05

3 26,70 1,90 1,15

7 36,87 1,68 0,76

10 39,71 1,69 0,88

15 40,32 1,67 0,92

25 35,66 1,52 0,24

29 50,98 1,72 1,04

42 31,16 1,77 0,40

62 37,54 1,57 0,87

64 19,31 1,58 0,40

81 24,58 1,61 0,45

86 18,74 1,38 0,45

pHen6c 30,77 1,60 0,70

Uit Tabel 5 is af te leiden dat er een lichte eiwitcontaminatie is, samen met een contaminatie met chaotrope zouten. De concentratie van het DNA is eveneens gedaald ten opzichte van de beginconcentratie. Dit kan verklaard worden door de herhaalde opzuiveringen, waarbij telkens een verlies aan DNA optreedt. De kwaliteit is echter voldoende om verder te gaan met de volgende stap in de klonering.

Tabel 5: DNA concentratie en zuiverheid na dubbeldigest: Op het bekomen DNA na PCR werd een dubbel restrictiedigest uitgevoerd met PstI en BstEII. Nadien werd het DNA opgezuiverd. De concentratie en zuiverheid werden nagegaan met de Nanodrop. Afkortingen: Nb: Nanobody


22

3.1.7 Ligatie

84.6 ng insert DNA per Nb-sequentie werd geligeerd in 269 ng pHen6c vector d.m.v. ligatie met T4 ligase in T4 ligase buffer (Vergelijking 1). Dit werd in een volume van 20 µl gebracht door het toevoegen van BIDI. Vervolgens werd de mix overnacht geïncubeerd bij kamertemperatuur. De volgende dag werd een transformatie uitgevoerd.

3.1.8 Transformatie: elektroporatie

Elektrocompetente WK6 cellen (E. coli) werden ontdooid op ijs. Vervolgens werd 5 µl

geligeerd plasmide-DNA toegevoegd, waarna de cellen gedurende 1 min op ijs geplaatst werden. Nadien werd het mengsel in een elektroporatiekuvet gebracht. Er werd een elektroporatie uitgevoerd bij 2.5 kV. Nadien werden de cellen onmiddellijk in SOC-medium gebracht en gedurende 1 u geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm. Hierna werd 200 µl uitgeplaat op selectieve platen van LB-agar met 100 µg/µl ampicilline. Deze platen werden overnacht geïncubeerd bij 37°C. De volgende dag waren er kolonies zichtbaar op deze platen.

3.1.9 Kolonie-PCR

Om na te gaan of de gegroeide kolonies het correct geligeerde plasmide bevatten, werd een kolonie-PCR uitgevoerd met Universal forward primer (CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC) en Universal reversed primer (TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA). Per construct werden meerdere kolonies van de selectieve platen opgepikt, in een PCR-tube met BIDI gebracht en vervolgens geënt op een streepplaat. De streepplaat werd overnacht geïncubeerd bij 37°C. De mastermix zoals beschreven bij 5.1.2, maar zonder het Pfu DNA polymerase, werd toegevoegd aan de PCR-tubes. Tijdens de PCR-reactie werd eenzelfde temperatuurprofiel gevolgd als in Tabel 3, met toevoeging van een extra verhittingsstap gedurende 10 min bij 95°C aan het begin van de PCR-reactie, zodat de cellen opengebroken worden. Er werd

gebruik gemaakt van de C-1000 thermal cycler (Bio-Rad).

Ter controle werd opnieuw een agarosegelelektroforese uitgevoerd. Hierbij werd 5 µl 6x LB toegevoegd aan 25 µl PCR-mix. Hiervan werd 12,5 µl geladen op een 2% agarosegel, samen met 5 µl van de Small Fragments ladder. De elektroforese werd uitgevoerd bij 100 V in 1x TBE buffer gedurende 1 u. Er werden 5 kolonies per construct getest, bij construct 81 waren slechts 3 kolonies zichtbaar op de plaat, deze werden alle 3 getest. Van construct 86, bekomen op latere datum, werden 10 kolonies getest (zie Figuur 8).

Vergelijking 1: Ligatiereactie: Met bovenstaande formule wordt de hoeveelheid insert bepaald dat gebruikt wordt bij de ligatiereactie. De gebruikte molaire ratio is 1/3. Afkortingen: kb: kilo-basen.


23

Indien de klonering en transformatie geslaagd zijn, is een bandje rond 550 bp zichtbaar. Bij de constructen 10, 15, 42, 62, 64 en 86 was telkens bij minstens één kolonie een bandje zichtbaar rond 550 bp. Uit deze positieve kolonies werden kolonie 10.4, 15.5, 42.4, 62.5, 64.4 en 86.1 geselecteerd voor sequentie-analyse (rode pijlen). Bij de kolonies van construct 1, 3, 7, 25 , 29 en 81 is dit fragment niet zichtbaar. Van deze kolonies werden in een eerste stap extra kolonies van de platen opgepikt voor een nieuwe kolonie-PCR (met uitzondering van 81, aangezien slechts 3 kolonies zichtbaar waren) (resultaat niet weergegeven). Deze tweede kolonie-PCR leverde evenmin het beoogde resultaat op, waarna werd overgegaan tot een volledige herklonering van deze constructen. Dit leverde echter eveneens geen

resultaat op, waarna besloten werd voorlopig geen nieuwe klonering uit te voeren.

3.1.10 Sequentie-analyse

De geselecteerde constructen werden opgepikt vanop de streepplaat en overnacht opgegroeid in 3 ml LB met 100 µg/µl ampicilline bij 37°C en 200 rpm. De volgende morgen werden de plasmiden opgezuiverd met de ‘Plasmid purification mini-kit’ (Qiagen) en het bekomen plasmide-DNA werd opnieuw opgelost in 20 µl BIDI. Hiervan werden de concentratie en zuiverheid bepaald met de Nanodrop (5.1.5). Deze plasmiden werden verdund tot een concentratie van 50 ng/µl en samen met 1 nmol/µl Universal forward

Figuur 8: Kolonie-PCR: De foto’s van de agarosegels worden getoond in deze afbeelding. Onderaan staan de staalnummers weergegeven. Rechts worden de fragmentgroottes van de ‘Small Fragments’ ladder weergegeven in aantal baseparen. De rode pijltjes duiden de geselecteerde kolonies aan.


24

primer en 1 nmol/µl Universal reversed primer opgestuurd naar de VIB Genetic Service

Facility (Antwerpen). De resultaten van deze sequentie-analyse bevinden zich in bijlage 7.2

De bekomen sequentie-analyses werden gecontroleerd op de correcte sequentie. Indien deze sequentie een ‘mismatch’ bevatte, werd gecontroleerd of het plasmide codeerde voor het correcte aminozuur. Indien dit het geval was, werd doorgegaan met de expressie van deze constructen. De constructen 10.4, 15.5, 42.4, 62.5, 64.4 en 86.1 waren allen correct.

3.1.11 Expressie

De bacteriën met de geselecteerde constructen werden opgepikt van de streepplaat en een uitdunningsenting werd uitgevoerd op LB-agar met ampicilline en 1% glucose. Hierdoor

werden verse, aparte kolonies bekomen. Eén kolonie hiervan werd opgepikt en geënt in 15 ml LB-medium met 100 µg/µl ampicilline en 0,1% glucose. Deze precultuur werd gedurende 6 u geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm. Van deze precultuur werd vervolgens 2 x 3 ml geënt in 2 x 500 ml TB-medium met 100 µg/µl ampicilline, 2 mM MgCl2 en 0,1% glucose, waardoor in totaal 1 liter cultuur bekomen werd. Deze cultuur werd geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm tot een OD600 (Optische Densiteit bij 600 nm) bekomen werd tussen 0,6 en 0,9. Eenmaal deze OD-waarde bereikt, werd IPTG (IsoPropyl β-D-1-ThioGalactopyranoside) aan de cultuur toegevoegd (finale concentratie 1 mM) waarna de cultuur gedurende 20 u geïncubeerd werd bij 28°C en 200 rpm tot een OD600 tussen 25 en 30 bereikt werd. Dit om de correcte opvouwing van het Nb te promoten.

3.1.12 SDS-PAGE

Uit de cultuur, bekomen na de expressie, werd 1 ml staal geïsoleerd. Van dit staal werden verschillende fracties geïsoleerd (5.1.12): het cultuurmedium (S1), de periplasmatische fractie (S2) en de cellulaire restfractie (P2). Deze fracties werden vervolgens getest op de aanwezigheid van het Nb door de eiwitten te isoleren en een SDS-PAGE uit te voeren. Hiervoor werden twee 15% polyacrylamidegels aangemaakt. 20 µl van de stalen werd opgekookt samen met 5 µl 5x ladingsbuffer met β-mercapto-ethanol en de ‘Precision Plus Protein’ ladder. Hiervan werd 12,5 µl geladen op de gel. De SDS-PAGE werd uitgevoerd in 1x EB buffer gedurende 20 min bij 80 V en gedurende 1 u bij 120 V.

3.1.13 Coomassie kleuring

Eén van de acrylamidegels, bekomen na SDS-PAGE, werd overnacht gekleurd met 1x Coomassie in Destain. Deze gel werd de volgende dag ontkleurd in Destain. Hierbij werd de gel op kamertemperatuur geïncubeerd en lichtjes geschud, terwijl de Destain regelmatig vervangen werd. De gel werd vervolgens ingepakt en gedroogd in cellofaan met 20% methanol, zodat hij bewaard kan worden. Een voorbeeld van een bekomen gel wordt weergegeven in Figuur 9.


25

Bij alle gels is een bandje te zien ter grootte van 15 kDa, dit is de grootte van de Nbs (zie

bijlage 7.3). Dit bandje is zichtbaar in alle fracties. Bij Nb 64 op Figuur 9 is het bandje minder zichtbaar dan bij Nb 62. Bij de eiwitbepaling werd aangetoond dat de concentratie van Nb 64 lager is dan van Nb 62 (3.1.16).

3.1.14 Western Blotting

De tweede polyacrylamidegel, bekomen na SDS-PAGE (3.1.12), werd geblot op een 0,22 µm nitrocellulosemembraan voor kleine eiwitten. Hierbij werd de gel op het membraan gelegd, tussen filterpapiertjes. Het geheel werd gedrenkt in blotbuffer. Het ‘semi-dry’ blotten werd uitgevoerd bij 50 mA gedurende 1 u (berekend volgens de formule 0,8 mA per cm²). Nadien werden de vrije plaatsen op het membraan overnacht geblokkeerd met BSA bij 4°C.

De volgende morgen werd het membraan gewassen met 1x TBS-T. Nadien werden de His-tag gekoppelde Nbs gebonden door het membraan gedurende 1 u op kamertemperatuur te incuberen met 10 µl/ 10 ml het primair antilichaam muis-α-hexaHistag (1 mg/ml) (AbD Serotec). Vervolgens werd het membraan opnieuw gewassen met 1x TBS-T en 1 u op kamertemperatuur geïncubeerd met 1 µl/10 ml secundair antilichaam IRDye 680 Goat Anti-Mouse IgG (1 mg/ml) (Li-Cor). Na wassen werd het membraan gescand met de Infrared Fluorescent Imager (Odyssey) bij een golflengte van 680 nm.

Figuur 9: Coomassie kleuring van de afgezonderde fracties: Van de expressiecultuur werd 1 ml geanalyseerd. Het cultuurmedium, de periplasmatische fractie en de cellulaire restfractie werden afgezonderd. De eiwitten werden geïsoleerd en gescheiden via SDS-PAGE, samen met de ‘Precision Plus Protein’ ladder (kDa). Afkortingen: S2: eiwitten neergeslagen uit periplasmatische fractie; P2: eiwitten geïsoleerd uit de cellulaire restfractie; S1: eiwitten neergeslagen uit het cultuurmedium; 62.5 en 64.4: Nanobodies.

Figuur 10: Western Blot van de afgezonderde fracties: Van de cultuur, bekomen na de expressie van het Nb, werd 1 ml geanalyseerd. Het cultuurmedium, de periplasmatische fractie en de cellulaire restfractie werden afgezonderd. De eiwitten werden uit deze fracties geïsoleerd en gescheiden via SDS-PAGE samen met de ‘Precision Plus Protein’ ladder (kDa). De eiwitten werden gedetecteerd met het muis-α-hexaHistag antilichaam en het IRDye 680 Goat Anti-Mouse IgG antilichaam. Afkortingen: S2: eiwitten neergeslagen uit periplasmatische fractie; P2: eiwitten geïsoleerd uit de cellulaire restfractie; S1: eiwitten neergeslagen uit het cultuurmedium; 62.5 en 64.4: Nanobodies.


26

Door gebruik te maken van de specifieke antilichamen werd de identiteit van de Nbs

nagegaan (Figuur 10). De rood oplichtende bandjes zijn zichtbaar ter hoogte van 15 kDa. Dit komt overeen met de grootte van de Nbs. De Nbs bevinden zich in alle fracties. Bij de volgende experimenten werd verder gewerkt met de periplasmatische fractie.

3.1.15 Opzuivering

De periplasmatische fractie werd geïsoleerd via koude osmotische shock en afgezonderd. De bekomen fractie werd gecentrifugeerd en doorheen een cellstrainer overgebracht naar een nieuwe tube, zodat het cellulaire debris verwijderd werd. De Nbs werden opgezuiverd met de His-GraviTrap kit (GE Healthcare) (5.1.15). De Nbs werden geëlueerd in 3 ml elutiebuffer.

Vervolgens werden de stalen gedialyseerd in 1x PBS om de elutiebuffer te verwijderen. Hierbij werden Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes gebruikt met een cut-off van 3500 kDa. Met een injectienaald werd het staal in de cassettes gebracht, waarna de resterende lucht verwijderd werd om het contactoppervlak van het staal met de PBS-buffer zo groot mogelijk te maken. Na 2 u werd de 1x PBS ververst. De stalen werden overnacht geïncubeerd bij 4°C en zachtjes geroerd. De volgende morgen werd het staal uit de cassettes gehaald met een injectienaald en overgebracht in een 15 ml tube.

Er werd opnieuw een Coomassie kleuring en Western Blot uitgevoerd op de Nbs om de zuiverheid na te gaan van de bekomen eluaten (Figuur 11).

Bij elk van de eluaten is een bandje zichtbaar rond 15 kDa. Uit de Coomassie kleuring is af te

leiden dat eluaat 10 en 86 zuiverder zijn dan eluaat 15, 62 en 64. Bij de Western Blot is bij eluaat 62 en 64 een tweede bandje zichtbaar. Dit duidt mogelijk op de aanwezigheid van een dimeer Nanobody.

Figuur 11: Coomassie kleuring en Western Blot eluaten: Links staat de Coomassie-kleuring van de eluaten, rechts is de overeenkomstige Western Blot weergegeven. Als ladder werd de ‘Precision Plus Protein’ ladder (kDa) gebruikt. Afkortingen: Nb: Nanobody


27

3.1.16 Eiwitbepaling

Om de totale eiwitconcentratie te bepalen werd een eiwitbepaling uitgevoerd op een 1/3 verdunningsreeks van de bekomen eluaten. Hierbij werd de ‘Dc protein assay kit’ (Bio-Rad) gebruikt. Bij deze test werd een 10 mg/ml BSA standaard meegenomen. De blauwkleuring, bekomen met de gebruikte kit, werd gemeten met de Microplate Reader (Bio-Rad) bij 655 nm. De waarden werden uitgezet in een grafiek en de concentraties werden bepaald aan de hand van de standaard.

De bekomen concentraties zijn samengevat in Tabel 6. Nb 42 en 62 hebben een hoge concentratie, waar Nb 15 en 64 een lage concentratie hebben. Nb 10 en 86 hebben een goede concentratie. Dit concentratieverschil kan te wijten zijn aan een verschillende expressie-efficiëntie tussen de Nbs onderling.

Nanobody Totale eiwitconcentratie (mg/ml)

10 3,3

15 0,034

42 9,235

62 11,01

64 0,307

86 2,3

3.1.17 Bindingsaffiniteit ELISA

Een ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) werd uitgevoerd om de affiniteit van de verschillende Nbs na te gaan. Hierbij werd een 96-well Maxisorp plaat overnacht gecoat met 100 µl recombinant mTNFR1 (1 ng/µl) bij 4°C.

De volgende morgen werd de plaat gewassen en vervolgens geblokkeerd met 2% BSA in 1x TBS-T. Hierbij werd de plaat op kamertemperatuur gedurende 1 u geïncubeerd. Vervolgens

werd een 1/4 verdunningsreeks van Nb 1, 3, 7, 10, 10 (nieuw aangemaakt), 15, 42, 62, 64 en 86 op de plaat gebracht, startende van 1 ng/µl. Als positieve controle werd 1 ng/µl ‘anti-mouse sTNFRI/TNFSF1A antibody’ gebruikt. 1 ng/µl anti-MMP-7 (Matrix MetalloProtease) Nb en 1x TBS werden gebruikt als negatieve controle. De plaat werd vervolgens 1 u geïncubeerd bij kamertemperatuur en vervolgens 3x gewassen met 1x TBS-T. Aan de Nb stalen en de negatieve controles werd nadien 10 µl/10 ml muis-anti-His antilichaam (1 mg/ml) (AbD Serotec) toegevoegd. De plaat werd opnieuw gedurende 1 u geïncubeerd bij kamertemperatuur en nadien 3x gewassen met 1x TBS-T. Vervolgens werd 1 µl/10 ml anti-mouse IgG HRP-linked antilichaam (1 mg/ml) (GE Healthcare) toegevoegd aan de Nb stalen en aan de negatieve controles, terwijl 1 µl/10 ml anti-goat IgG Horse Radish Peroxisase (HRP)-linked antilichaam (1 mg/ml) werd toegevoegd aan de positieve controle. Alle

Tabel 6: Totale eiwitconcentratie Nanobody-eluaten: De totale eiwitconcentratie van de eluaten werd bepaald met de ‘Dc protein assay kit’ (Bio-Rad). De blauwkleuring werd gemeten met de Microplate Reader (Bio-Rad) bij 655 nm.


28

controles en stalen werden gedurende 1 u geïncubeerd bij kamertemperatuur, waarbij de

plaat afgeschermd werd van het licht. Vervolgens werd de plaat gewassen. 50 µl TMB (TetraMethylBenzidine) substraat werd toegevoegd (BD Opteia) en de plaat werd ongeveer 30 min geïncubeerd bij kamertemperatuur, afgeschermd van het licht. Zodra genoeg blauwkleuring zichtbaar was, werd 50 µl stopoplossing (1 M H2SO4) toegevoegd, waardoor een gele kleuromslag bekomen werd. De kleuromslag werd gemeten met de Microplate Reader (Bio-Rad) bij 450 nm met een referentiemeting bij 595 nm.

De gemeten waardes werden uitgezet in een grafiek, te zien in Figuur 12.

In de grafiek is te zien dat het antilichaam, gebruikt als positieve controle, de hoogste OD-waarde heeft. Dit is niet abnormaal aangezien een antilichaam een paratoop bezit die bestaat uit 4 domeinen die alle bijdragen tot die bindingscapaciteit, waar de paratoop bij een Nb slechts uit 1 domein bestaat (zie 1.8). Nbs 15, 42 en 62 vertonen de hoogste bindingscapaciteit, gevolgd door respectievelijk Nb 1, 86 en 3, 10, 64 en 7. Nbs 1, 3 en 7 werden eerder opgezuiverd door de VIB Protein Service Facility. Beide negatieve controles, anti-MMP-8 Nb en 1x TBS vertonen geen binding.

Figuur 12: Grafiek bindingsaffiniteit ELISA: De figuur toont de grafiek na de bindingsaffiniteit ELISA om de bindingscapaciteit van de Nbs te bepalen. Op de x-as wordt de verdunningsstap van de Nbs weergegeven, beginnende vanaf 1 ng/µl en verdund volgens een 1/4 verdunningsreeks. De y-as toont de optische densiteit gemeten bij 450 nm met een referentiemeting bij 595 nm. De legende bestaat uit de positieve controle: ‘anti-mouse sTNFRI/TNFSF1A antibody’, de verschillende geteste Nanobodies, de negatieve Nb controle: anti-Matrix MetalloProtease 8 (MMP) en de negatieve controle: 1x TBS. Afkortingen: Nb: Nanobody; OD: Optische Densiteit; ref: referentiemeting; Ab: Antilichaam: mTNFR1: muis Tumor Necrosis Factor Receptor 1.


29

3.1.18 Weefselkweek L929 NF-ϰB/luc cellen

Om de inhibitiecapaciteit van de Nbs na te gaan werd een in vitro test uitgevoerd op L929 cellen. DMEM medium werd aangemaakt met 1% L-Glutamine, 20% FCS, 0,2% Penicilline/Streptomycine, 0,1% Na-pyruvaat en 1% NEAA (Non Essential Amino Acids). De cellen werden ontdooid en in 15 ml medium gebracht. De cellen werden gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min. Vervolgens werd het medium afgezogen. De pellet werd opnieuw opgelost in 1 ml medium en overgebracht naar een 25 cm² falcon met gesloten dop, gevuld met 5 ml medium. De falcon werd geflushed met CO2 en overnacht geïncubeerd bij 37°C.

De volgende dag werden de cellen losgemaakt met EDTA-trypsine en geïncubeerd bij 37°C. Na ongeveer 10 min werd medium toegevoegd en het geheel werd overgebracht naar een

15 ml tube. De cellen werden gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 1200 rpm. De pellet werd opnieuw opgelost in 3 ml medium. Hiervan werd telkens 1 ml overgebracht naar een 75 cm² falcon met gesloten dop gevuld met medium, die vervolgens geflushed werd met CO2. De cellen werden geïncubeerd bij 37°C tot ze confluent zijn. Vervolgens werden ze gesplitst volgens een splitsingsfactor in meer/grotere falcons zoals hierboven beschreven.

3.1.19 In vitro inhibitietest

De L929 NF-ϰB/luc cellen werden uitgezaaid in een 96-well plaat met 40.000 cellen per well en overnacht geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. De volgende dag werd een 1/4 verdunning

van Nbs 1, 3, 7, 10, 10N (nieuw aangemaakt), 15, 62, 64 en 86, controle Nb en puur medium op de plaat gebracht, startend van een concentratie van 6 µg/200 µl Nb. Vervolgens werd de plaat gedurende 30 min geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. De cellen werden gestimuleerd met 1000 IU/ml mTNF, waarna de plaat opnieuw 3 u geïncubeerd werd bij 37°C. Vervolgens werden de cellen gelyseerd en werd een luciferase-assay uitgevoerd.

Deze test werd een eerste maal uitgevoerd en moet zeker nog herhaald worden eer definitieve conclusies getrokken kunnen worden. Deze eerste resultaten werden uitgezet in de onderstaande 10 grafieken (Figuur 13). Bij Nb 1 is het luciferasesignaal laag bij een hoge concentratie Nb, terwijl het signaal toeneemt bij lagere concentraties Nb. Hieruit is af te leiden dat Nb 1 een goede inhibitiecapaciteit heeft. De overige Nbs inhiberen TNFR1 niet.


30


31


32

Figuur 13: Grafieken inhibitietest: De bovenstaande 10 grafieken werden bekomen na een inhibitietest. Hierbij werden L929 NF-ϰB/luc cellen eerst behandeld met Nbs en na 1 u incubatie gestimuleerd met 1000 IU/ml TNF. Vervolgens werd een luciferase-assay uitgevoerd. Dit resultaat werd uitgezet in de bovenstaande grafieken. Afkortingen: Nb: Nanobody; NF- ϰB: Nuclear Factor ϰB; mTNF: muis Tumor Necrosis Factor.


33

3.2 miRNA’s

3.2.1 Selectie kandidaat TNFR1 inhiberende miRNA’s

Een nieuwe invalshoek om de signalisatie via TNFR1 te verminderen, is het gebruik van miRNA’s. Hierbij wordt gezocht naar miRNA’s die mogelijks het TNFR1 expressieniveau beïnvloeden. De miRNA’s werden geselecteerd op basis van in silico predictieprogramma’s (zie 7.4). Deze programma’s voorspellen welke miRNA’s een invloed kunnen uitoefenen op het TNFR1 expressieniveau. Deze programma’s testen één of meerdere van de volgende criteria: de sequentiecomplementariteit tussen het miRNA en de 3’-UTR sequentie, de thermodynamica en de conservatie van de miRNA sequentie. De miRNA’s-29a, -29b1, -29b2,

-29c, -125a, -125b1, -125b2, -146a, -149, -211, -335, -351, -511 en -763 werden voorspeld door meerdere programma’s en werden geselecteerd voor verdere experimenten (Tabel 7).

Ch

rom

oso

om

mic

roC

osm

miR

an

da

miR

Gen

NB

miR

Ta

r

Targ

etS

can

miR

DB

DIA

NA

-mic

roT

mic

roIn

sp

ecto

r

miR

Wa

lk

PIC

TA

R

PIT

A

RN

A22

RN

Ah

yb

rid

so

m

mmu- miRNA-10a 11 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

mmu- miRNA -29a/b1 6 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 8

mmu- miRNA -29b2/c 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 8

mmu- miRNA -125a 17 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 8

mmu- miRNA -125b 9 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 6

mmu- miRNA -128-1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

mmu- miRNA -138-1 9 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

mmu- miRNA -142 11 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

mmu- miRNA -146a 11 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

mmu- miRNA -149 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 6

mmu- miRNA -181c 8 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2

mmu- miRNA -203 12 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2

mmu- miRNA -211 7 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 4

mmu- miRNA -296 2 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 2

mmu- miRNA -335 6 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 2

mmu- miRNA -351 X 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 7

mmu- miRNA -511 2 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 6

mmu- miRNA -592 6 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2

mmu- miRNA -680-1 6 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 8

mmu- miRNA -763 10 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 7

mmu- miRNA -5126 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1

Tabel 7: miRNA predictieprogramma’s: De tabel toont het resultaat van de afzonderlijke miRNA predictieprogramma’s . In de eerste kolom staan de miRNA’s opgelijst met in de tweede kolom het chromosoom waarop ze gelegen zijn. Bovenaan zijn de verschillende gebruikte predictieprogramma’s te zien. Een groen vakje duidt aan dat het programma voorspelt dat het miRNA het expressieniveau van TNFR1 zou beïnvloeden. Een rood vakje betekent dat het miRNA geen effect zou hebben op het TNFR1 expressieniveau. De miRNA’s aangeduid in blauw werden geselecteerd voor verdere experimenten. Afkortingen: mmu-miRNA: Mus musculus microRNA; TNFR1: Tumor Necrosis Factor Receptor 1.


34

3.2.2 Transformatie: hitte shock

De miRNA constructen werden besteld bij GeneCopeia. Ze werden geleverd in de pEZX-MR04 vector. Deze vector bevat onder meer het ampicilline resistentiegen en de verschillende miRNA constructen onder controle van de CMV promotor, die zorgt voor expressie in Mammalia. MC 1061 (E. coli) chemisch competente cellen werden met deze plasmiden getransformeerd door middel van een hitte shock. Hierbij werden de cellen ontdooid op ijs, vervolgens werden de plasmiden bij de cellen gebracht. Deze mix werd gedurende 30 min op ijs geplaatst en nadien gedurende 50 s bij 42°C geïncubeerd. De cellen werden opnieuw gedurende 2 min op ijs geplaatst en er werd 1 ml SOC-medium aan toegevoegd. Dit werd geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm gedurende 1 u. Tenslotte werd 20 µl hiervan uitgeplaat op selectieve LB-agar met 100 µg/µl ampicilline, de ampicilline zal enkel

de groei van de cellen die het construct bevatten, toelaten. Deze platen werden overnacht geïncubeerd bij 37°C. De volgende ochtend waren er kolonies zichtbaar op deze platen.

3.2.3 Kolonie-PCR

Een kolonie-PCR werd uitgevoerd om na te gaan of de kolonies het correcte plasmide bevatten. Hierbij werden Taq DNA polymerase en primers pEZX-MR04 forward (CCGACAACCACTACCTGA) en pEZX-MR04 reversed (CGTGAAGAATGTGCGAGAC) gebruikt, die de vector sequentie rond het miRNA construct binden. Per construct werden 5 kolonies getest. Deze werden opgepikt van de selectieve plaat en in een PCR-tube met BIDI gebracht, vervolgens werden ze geënt op een streepplaat (LB-agar met 100 µg/µl ampicilline). Deze

streepplaat werd overnacht geïncubeerd bij 37°C. De mastermix met de primers, het Taq DNA polymerase, dXTP’s en MgCl2 werden aan de PCR-tubes toegevoegd en de reactie werd uitgevoerd in de C-1000 thermal cycler (Bio-Rad) (5.2.2).

Het gevolgde reactieschema wordt weergegeven in Tabel 8.

Stap Temperatuur (°C) Tijdsduur (min:sec)

Cellyse 95 10:00

Startdenaturatie 95 5:00

Denaturatie 95 0:30

Aanhechting (Annealing) 55 0:30

Elongatie 72 1:00

Eindelongatie 72 5:00

Afkoeling 10 Oneindig

Aantal cycli denaturatie – aanhechting - elongatie: 35

Tabel 8: Temperatuurprofiel kolonie-PCR miRNA’s: Er werd nagegaan of de kolonies het correcte plasmide bevatten d.m.v. een kolonie-PCR volgens het bovenstaande schema.


35


De bekomen DNA-fragmenten werden gescheiden op een 2% agarosegel met Sybr Safe. Hierbij werd 5 µl 6x LB toegevoegd aan 25 µl staal. Hiervan werd 12,5 µl geladen per laantje. De elektroforese met de ‘Small Fragments’ ladder werd gedurende 1 u uitgevoerd in 1x TBE buffer bij 100 V. Het resultaat is te zien in Figuur 14.

Het voorspelde bandje van ongeveer 1000 bp lang is zichtbaar bij bijna alle geteste kolonies. Ze bevatten met andere woorden het correcte plasmide.

3.2.5 Zuivering

Eén kolonie per construct werd geselecteerd en opgegroeid in 7 ml TB met 100 µg/µl ampicilline bij 37°C en 200 rpm. Na 6 u werd 3 ml van deze precultuur geënt in 500 ml TB met 100 µg/µl ampicilline. Deze cultuur werd overnacht geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm.

De volgende dag werden de cellen gecentrifugeerd en gelyseerd via alkalische lyse. Het DNA werd geïsoleerd en opgezuiverd via fenol-chloroform extractie. De DNA-pellet werd opgelost in 500 µl 1x PBS. De concentratie en zuiverheid van het DNA werden nagegaan met de Nanodrop (5.1.5). Hierbij werd veel DNA bekomen. Eerder werd miRNA-511 al bereid door Leen Puimège.

Bij een eerste meting van het DNA bleek de zuiverheid niet goed genoeg te zijn voor in vivo gebruik (resultaat niet weergegeven). NaAc en ethanol werden aan het DNA toegevoegd om het neer te slaan en deze mix werd overnacht geïncubeerd bij -20°C. De volgende dag werd

Figuur 14: Kolonie-PCR miRNA’s: De figuur toont de agarosegels na de kolonie-PCR en agarosegelelektroforese. Rechts is de ‘Small Fragments’ ladder weergegeven in aantal baseparen.


36

het DNA gecentrifugeerd gedurende 30 min bij 4°C en 14.000 rpm. De pellet werd gewassen

met ethanol en opgelost in 500 µl 1x PBS. De DNA concentratie en zuiverheid werden opnieuw nagegaan via meting met de Nanodrop. Het bekomen DNA was veel zuiverder en geschikt voor in vivo gebruik (Tabel 9).

3.2.6 Weefselkweek C57BL/6-MEF cellen

C57BL/6-MEF (Mouse Embryonic Fibroblast) cellen (Figuur 15) werden ter voorbereiding van een in vitro test uitgezaaid in een 25 cm² falcon met filterdop en geïncubeerd bij 37°C onder hypoxische condities. De cellen werden opgegroeid in DMEM medium met 1% L-Glutamine, 20% FCS, 0,2% Penicilline/Streptomycine, 0,1% Na-pyruvaat en 1% NEAA (Non Essential Amino Acids). Als de cellen confluent waren, werden ze 1/3 gesplitst. Ze werden losgemaakt met EDTA-trypsine en gedurende 10 min geïncubeerd bij 37°C. Vervolgens werd een gelijke hoeveelheid medium toegevoegd om het trypsine te neutraliseren en werd het totale volume overgebracht naar een 15 ml tube. De cellen werden gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 1200 rpm en het medium werd afgezogen. De pellet werd opnieuw opgelost in 3 ml medium en verdeeld over meerdere en/of grotere falcons.

miRNA Concentratie (ng/µl) 260:280 ratio 260:230 ratio 29a 1097,66 1,99 2,43

29b1 253,66 2,00 2,65

29b2 1708,33 2,05 2,61

29c 664,94 1,96 2,42

125a 469,87 1,93 2,43

125b1 3310,12 1,81 2,24

125b2 634,31 2,01 2,50

146a 400,17 1,92 2,41

149 864,53 2,00 2,44

211 971,26 1,93 2,37

335 1324,77 2,09 2,64

351 1260,93 2,08 2,60

763 3474,44 1,91 2,37

Tabel 9: Concentratie en zuiverheid van miRNA’s: De tabel geeft de DNA concentratie na opzuivering weer, alsook de zuiverheid van het DNA.

Figuur 15: C57BL/6-MEF cellen: Microscopisch beeld van C57BL/6-MEF cellen bij een 20x vergroting.


37

3.2.7 In vitro test miRNA-511

Om de invloed van miRNA-511 op het TNFR1 expressieniveau na te gaan werd een in vitro experiment uitgevoerd op C57BL/6-MEF. Hierbij werden 100.000 cellen per well uitgezaaid in vier 24-well platen. Van zodra de cellen aangehecht waren, werd per plaat een transfectie uitgevoerd met één van de premiRNA precursoren, respectievelijk miRNA-511 en miRNA-CTR (controle) (ABI) of een Locked Nucleic Acid (LNA), respectievelijk anti-miRNA-511 en anti-miRNA-CTR (Exiqon). Deze precursoren werden verdund tot een concentratie van 50 µM. Voor de transfectie werd 13 µl 50 µM miRNA precursor of LNA in 1300 µl OPTIMEM medium gebracht. Dit werd 5 min op kamertemperatuur geïncubeerd. Tegelijkertijd werd 26 µl RNAiMAX in 1300 µl OPTIMEM medium gebracht en eveneens 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Om de transfectiemix samen te stellen, werd het RNAiMAX bij de miRNA

precursor gebracht en 20 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het medium werd afgezogen van de cellen en 400 µl OPTIMEM werd in de wells gebracht. Vervolgens werd 100 µl miRNA-precursor oplossing in de wells gedruppeld. Dit werd 24 u geïncubeerd bij 37°C. Nadien werd het medium van deze 4 platen overgebracht naar een 96-well plaat en bewaard bij -20°C. De cellen werden gelyseerd en het lysaat werd overgebracht naar een 96-well plaat en bewaard bij -20°C.

De aanwezige hoeveelheid mTNFR1-eiwit werd bepaald door een ELISA uit te voeren met de ‘mouse sTNF RI/TNFRSF1A duoset ELISA kit’ (R&D) (5.2.5). Uit de verkregen resultaten werd de hoeveelheid mTNFR1 bepaald.

Figuur 16: In vitro test miRNA-511: C57BL/6 cellen werden getransfecteerd met premiRNA precursor moleculen van respectievelijk miRNA-511 en controle-miRNA of LNA moleculen van respectievelijk anti-miRNA-511 en anti-miRNA-CTR. De cellen werden na 24 u gelyseerd en een ELISA werd uitgevoerd om het TNFR1 expressieniveau te bepalen. Deze waarden werden uitgezet in een grafiek. Afkortingen: TNFR1: Tumor Necrosis Factor Receptor 1; CTR: Controle; miRNA: microRNA; LNA: Locked Nucleic Acid.


38

De significantie werd nagegaan met een ongepaarde, tweezijdige t-test. In Figuur 16 is te

zien dat het TNFR1 expressieniveau significant gedaald is na transfectie met miRNA-511 in vergelijking met de controle. Bij transfectie met de anti-miRNA-511 is het TNFR1 expressieniveau significant gestegen in vergelijking met de controle. De anti-miRNA-511 bindt miRNA-511 en verhindert zo de werking van het miRNA, waardoor het TNFR1 niveau stijgt.

3.2.8 Hydrodynamische staartader injectie

Om het effect van miRNA-511 op het TNFR1 expressieniveau na te gaan werd een in vivo experiment uitgevoerd, dat drie maal herhaald werd op in totaal 19 muizen. De bekomen

miRNA precursor plasmiden (3.2.5) werden verdund tot een concentratie van 5 µg/ml in 1x steriel PBS. Hiervan werd 2 ml onder hoge druk geïnjecteerd via de staartader. Na 24 u werden de muizen gedood en werd de bovenste leverlob geïsoleerd. Deze stalen werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare N2 om eiwitdegradatie te voorkomen. Vervolgens werd lysebuffer toegevoegd en werden de stalen gehomogeniseerd. Nadien werd een eiwitbepaling uitgevoerd. Na toevoeging van lysebuffer werden de levers gehomogeniseerd. Vervolgens werd een ELISA op 500 µg levereiwit uitgevoerd om het mTNFR1-eiwitniveau te bepalen zoals beschreven bij 5.2.5 (Figuur 17).

Uit de bekomen grafiek is af te leiden dat het niveau van TNFR1 significant gedaald is na behandeling met miRNA-511, in vergelijking met de controlebehandeling. De significantie werd nagegaan met een ongepaarde, tweezijdige t-test.

Om het effect van de overige miRNA constructen op het TNFR1 expressieniveau na te gaan werd een tweede experiment uitgevoerd, dat 1 keer herhaald werd op 3 muizen per construct. De muizen werden geïnjecteerd met 2 ml 5 µg/ml miRNA precursor plasmide in 1x

Figuur 17: TNFR1 level bij miRNA-511: De relatieve verhouding van TNFR1 expressieniveau wordt weergegeven na behandeling met miRNA-511 en miRNA-CTR precursor plasmide. Met elk construct werden 19 muizen geïnjecteerd via hydrodynamische staartader injectie. Afkortingen: miRNA: microRNA; CTR: controle; TNFR1: Tumor Necrosis Factor Receptor 1.


39

steriel PBS (3.2.5) via hydrodynamische staartader injectie. Na 24 u werden de muizen

gedood en werd de bovenste lob van de lever geïsoleerd. Deze stalen werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare N2 om eiwitdegradatie te voorkomen. Vervolgens werd lysebuffer toegevoegd en werden de stalen gehomogeniseerd. Nadien werd een eiwitbepaling uitgevoerd. De concentratie TNFR1 werd bepaald via mTNFR1 ELISA zoals beschreven bij 5.2.5. Hierbij werd 500 µg levereiwit op de plaat gebracht. De resultaten zijn te zien in Figuur 18 en werden geanalyseerd met een ongepaarde, eenzijdige t-test.

De resultaten van dit experiment laten toe de werking van de nieuw opgezuiverde miRNA’s te vergelijken met de controle (CTR) en miRNA-511, die al uitvoeriger getest werd. De TNFR1 concentratie na behandeling met miRNA-125b1 en miRNA-125a is lager dan na behandeling

met miRNA-511. miRNA-29a en -29b1 hebben weinig tot geen invloed op het TNFR1 niveau. De overige miRNA’s vertonen een effect dat zich situeert tussen het wild-type TNFR1 niveau en het miRNA-511 TNFR1 niveau. Door de grote variantie van de CTR is het echter zeer moeilijk om signifante resultaten te bekomen. Uit de ongepaarde, eenzijdige t-test werd enkel een significant verschil tussen miRNA-125b1 en CTR bekomen. Bij dit experiment zijn echter nog te weinig muizen getest om definitieve conclusies te trekken, herhaling is zeker

aangewezen.

3.2.9 TNF/LPS letaliteitexperiment

Om na te gaan of de daling in TNFR1 ook bescherming biedt tegen een dosis TNF en LPS (1.9.3) werd een letaliteitexperiment uitgevoerd. Hierbij werd 2 ml 5 µg/ml in 1x steriel PBS van de miRNA precursor plasmiden via hydrodynamische staartaderinjectie toegediend aan C57BL/6 muizen. Na 24 u werd een LD50 (letale dosis voor 50% van de muizen) van 20 µg TNF of 200 µg LPS intraperitoneaal geïnjecteerd. Vervolgens werd op bepaalde tijdstippen de temperatuur van de muizen nagegaan en de letaliteit vastgesteld.

Figuur 18: TNFR1 level na toediening miRNA’s: per miRNA construct werden 3 muizen geïnjecteerd met 2 ml 5 µg/ml miRNA precursor plasmide. Op de afgezonderde leverstalen werd een mTNFR1 ELISA uitgevoerd om de TNFR1 concentratie te bepalen. Afkortingen: miRNA: microRNA; TNFR1: Tumor Necrosis Factor Receptor 1; CTR: controle.


40

Figuur 19: Letaliteit en temperatuursmeting na toediening TNF: 12 muizen werden geïnjecteerd met miRNA-511 of miRNA-CTR (controle) precursor plasmide en 24 u later geïnjecteerd met 20 µg TNF. De letaliteitcurve wordt weergegeven in figuur A. Figuur B toont het verloop van de gemeten lichaamstemperatuur en de tijdstippen waarop metingen verricht zijn. Afkortingen: miRNA: microRNA; TNF: Tumor Necrosis Factor; CTR: controle.

A

B


41

Figuur 20: Letaliteit en temperatuursmeting na toediening LPS: 16 muizen werden geïnjecteerd met miRNA-511 of miRNA-CTR (controle) precursor plasmide en 24 u later geïnjecteerd met 200 µg LPS. De letaliteitcurve wordt weergegeven in figuur A. Figuur B toont het verloop van de gemeten lichaamstemperatuur en de tijdstippen waarop metingen verricht zijn. Afkortingen: miRNA: microRNA; LPS: LipoPolySaccharide; CTR: controle.

A

B


42

Na het toedienen van TNF en LPS wordt eenzelfde ziektebeeld en letaliteit bekomen. Het

verschil ligt echter ter hoogte van de signalisatie. Waar TNF TNFR1 direct stimuleert, gebeurt dit bij LPS slechts indirect. LPS is een endotoxine dat na injectie endotoxemie veroorzaakt met secretie van grote hoeveelheden TNF. Dit TNF bindt op beide TNF-receptoren en oefent zo zijn functie uit bij de immuunrespons. Uit beide experimenten is af te leiden dat het toedienen van miRNA-511 bescherming biedt tegen deze symptomen.

Figuur 19A toont de letaliteitcurve na toediening van TNF. De muizen, geïnjecteerd met miRNA-511 precursor plasmide, zijn resistent tegen de toegediende LD50 dosis TNF, terwijl de dosis bij meer dan 40% van de controlemuizen letaal is. Indien de muizen geïnjecteerd werden met LPS (LipoPolySaccharide) in plaats van TNF, is ongeveer hetzelfde effect waar te nemen (Figuur 20A). Muizen, behandeld met miRNA-511, zijn over het algemeen resistent tegen de toegediende dosis LPS. Dit is niet het geval bij de muizen die behandeld werden

met het controle miRNA, waar een sterfte van meer dan 40% te zien was. De significantie werd nagegaan met een Log-rank Mantel Cox test en was significant na het toedienen van zowel TNF en als LPS.

Bij de temperatuurcurves (Figuur 19B en Figuur 20B) werd de temperatuur op verschillende tijdstippen bij de muizen gemeten. Muizen die gestorven waren, werden ingegeven als 20°C. Uit deze curves is af te leiden dat muizen, behandeld met miRNA-511, eenzelfde reactie vertonen als controlemuizen. Beide categorieën reageren op de TNF/LPS en vertonen ziektesymptomen. Eén van deze symptomen is het dalen van de lichaamstemperatuur. Muizen die geïnjecteerd werden met miRNA-511 herstellen echter van deze symptomen, waar controlemuizen dit slechts in ongeveer 60% van de gevallen doen. De significantie van deze data werd nagegaan met een ongepaarde, tweezijdige t-test. Er was een significant

verschil na het toedienen van TNF. Dit was echter niet het geval na het toedienen van LPS.

Om na te gaan of het beschermend effect van miRNA-511 te wijten is aan de neerregulatie van TNFR1 wordt een volgend experiment met TNFR1 knock-out muizen uitgevoerd. Deze muizen werden via hydrodynamische staartader injectie geïnjecteerd met 2 ml 5 µg/ml miRNA-511 of miRNA-CTR in 1x steriel PBS en na 24 u intraperitoneaal geïnjecteerd met 500 µg LPS. Deze dosis komt overeen met een LD50 voor TNFR1 knock-out muizen. Vervolgens werden de temperatuur en letaliteit nagegaan op bepaalde tijdstippen.

Figuur 21A toont aan dat de sterfte bij de TNFR1 knock-out muizen, die behandeld werden met miRNA-511 even hoog en zelfs hoger ligt dan bij muizen die behandeld werden met

miRNA-CTR. De resultaten werden geanalyseerd met een Log-rank Mantel Cox test. Er was geen significant verschil. De temperatuurscurve (Figuur 21B) na het toedienen van LPS volgt eenzelfde verloop bij de CTR als na het toedienen van miRNA-511. De temperatuur bij muizen die behandeld werden met miRNA-511, ligt lager dan bij de controlemuizen. Na analyse met een ongepaarde, tweezijdige t-test was hier eveneens geen significant verschil waar te nemen.

Uit het letaliteitexperiment met wild-type muizen is af te leiden dat miRNA-511 bescherming biedt tegen endotoxemie. Indien miRNA-511 bescherming biedt door neerregulatie van TNFR1, wordt bij de knock-out muizen geen beschermend effect van miRNA-511 verwacht, aangezien deze muizen geen TNFR1 bezitten. Indien de miRNA-511 bescherming (deels) te wijten is aan de neerregulatie van een ander target, wordt eveneens een beschermend


43

effect verwacht bij TNFR1 knock-out muizen. In Figuur 21 is te zien dat TNFR1 knock-out

muizen, behandeld met miRNA-511 een hogere sterfte vertonen dan knock-out muizen die behandeld werden met miRNA-CTR en eenzelfde verloop van lichaamstemperatuur kennen na toediening van LPS. Hieruit is af te leiden dat miRNA-511 een beschermend effect biedt door de specifieke neerregulatie van TNFR1.

Figuur 21: Letaliteit en temperatuursmeting na toediening LPS bij TNFR1 knock-out muizen: 7 muizen werden geïnjecteerd met miRNA-511 en 5 muizen werden geïnjecteerd met miRNA-CTR (controle) precursor plasmide en 24 u later geïnjecteerd met 500 µg LPS. De letaliteitcurve wordt weergegeven in figuur A. Figuur B toont het verloop van de gemeten lichaamstemperatuur en de tijdstippen waarop metingen verricht zijn. Afkortingen: miRNA: microRNA; LPS: LipoPolySaccharide; CTR: controle.

A

A

B

Hoofdstuk 4: Discussie

45

4. Discussie

TNF speelt een belangrijke rol in vele processen, waaronder inflammatie. Dysregulatie van TNF kan chronische auto-immuunziektes induceren, zoals bijvoorbeeld reumatoïde artritis, multiple sclerose en inflammatoire darmziektes. Tijdens deze ziekteprocessen oefent TNF via twee verschillende receptoren een tegenstrijdige functie uit. Enerzijds is TNF verantwoordelijk voor het induceren en in stand houden van de inflammatie door signalisatie via TNFR1. Anderzijds is TNF verantwoordelijk voor het beëindigen van de inflammatie en inductie van een herstelreactie door signalisatie via TNFR2. In de behandeling van deze chronische auto-immuunziektes is vandaag een belangrijke rol

weggelegd voor TNF-blokkers. Deze TNF-blokkers, gevormd uit monoklonale antilichamen, zorgen voor de neutralisatie van TNF. Door deze neutralisatie wordt evenwel de signalisatie via beide receptoren verhinderd, wat zowel de schadelijke/inflammatoire als de beschermende/herstellende effecten van TNF neutraliseert. De behandeling met deze TNF-blokkers kan daarom leiden tot neveneffecten zoals verminderde weerstand en risico’s op demyelinisatie of lupus-achtige symptomen.

Tijdens dit onderzoek focussen we ons op de vraag of met de specifieke blokkering van TNFR1 een beter therapeutisch effect kan bekomen worden dan met de huidige generatie TNF-blokkers. Met andere woorden, of de specifieke blokkering van TNFR1 leidt tot een blokkering van de pro-inflammatoire functie en/of het behoud van de beschermende functie van TNFR2 het herstel kan bespoedigen.

Tijdens ons onderzoek naar een specifieke blokkering van TNFR1 volgen we 2 strategieën: Nanobodies en miRNA’s.

De onderzoekslijn van de Nanobodies startte met 12 Nb plasmiden die verkregen werden van de Nanobody Core Facility van het VIB: Nbs 1, 3, 7, 10, 15, 25, 29, 42, 62, 64, 81 en 86. Na herklonering en sequentie-analyse bleken 9 constructen (Nbs 1, 3, 7, 10, 15, 42, 62, 64, 86) de correcte sequentie te bevatten. Deze 9 Nanobodies werden geëxpresseerd en opgezuiverd. Bindingscapaciteit en inhibitie capaciteit zijn twee aparte eigenschappen van een Nb. Een Nb met een hoge bindingscapaciteit heeft niet automatisch een hoge inhibitie capaciteit. Uit de resultaten van de uitgevoerde ELISA kan afgeleid worden dat Nbs 15, 42 en 62 de hoogste bindingscapaciteit vertonen, gevolgd door Nb 1, Nb 3 en -86, Nb 10 en -64, en

Nb 7. De inhibitiecapaciteit van de Nbs werd nagegaan in een in vitro test in L929 NF-ϰB/luc

cellen. Uit deze test bleek dat Nb 1 een goede inhibitiecapaciteit bezit. De overige Nbs bezitten geen inhibitiecapaciteit. Deze test is echter maar éénmaal uitgevoerd en moet herhaald worden eer definitieve conclusies kunnen getrokken worden. Nbs die enkel binden en niet inhiberen, kunnen de werking van TNFR1 beïnvloeden door de trimerisatie van de receptor te verhinderen (Chan, 2000), mogelijks kunnen deze Nbs gekoppeld worden aan het enzym TACE, dat door klieving de transmembranaire receptor van het celmembraan kan losmaken. Hierdoor wordt de signalisatie verhinderd en capteert de oplosbare receptor sTNF, wat voor een daling in TNF concentratie zorgt. Inhiberende Nbs daarentegen gaan rechtstreeks de binding van TNF aan de receptor verhinderen, zodat geen signalisatie kan plaatsvinden.


46

Door zijn geringe grootte heeft een Nb een korte halfwaardetijd. In de behandeling van

auto-immuunziektes is echter een langere halfwaardetijd gewenst. Een multivalent Nb kan hieraan voldoen. Hierbij worden één of meerdere Nbs via een linker aan elkaar gekoppeld. (Ablynx, 2010; Jahnichen et al, 2010; Roovers et al, 2011). De keuze van de gebruikte Nbs hangt af van de capaciteiten van de afzonderlijke Nbs. Een voor de hand liggende keuze is de koppeling van sterke inhibitors aan elkaar. Hierbij wordt de inhibitiecapaciteit van het multivalent Nb best opnieuw nagegaan, aangezien deze inhibitors elkaar sterisch kunnen hinderen. Een andere combinatie is bijvoorbeeld een sterke binder met een sterke inhibitor.

Tijdens het verdere onderzoek kan het effect van deze Nbs nagegaan worden in muismodellen van bovengenoemde ziektes: het Collagen Induced Arthritis model (RA), Experimental Autoimmune Encephalitis model (MS) en het Dextran Sodium Sulfate model (IBD). Indien de Nbs in deze modellen de symptomen verlichten zonder ernstige

neveneffecten, kan gestart worden met testen bij mensen.

Uit ons onderzoek is gebleken dat onze 9 Nbs niet werkzaam zijn tegen humaan TNFR1. Indien de andere Nbs eveneens niet ‘crossreactief’ zijn, moet een nieuwe reeks Nbs, ditmaal gericht tegen humaan TNFR1 geproduceerd worden en in vitro getest worden op bindings- en inhibitiecapaciteit. Eventueel kan bij in vivo testen gebruik gemaakt worden van gehumaniseerde muizen die de humane TNFR1 bezitten.

Bij testen op mensen kunnen complicaties optreden. Aangezien de Nbs geproduceerd worden in Camelidae, kan een allergische reactie optreden bij patiënten. Gezien de grote sequentiehomologie tussen Nbs en de conventionele VH genen, is dit echter weinig waarschijnlijk. Indien Nbs toch immunogeen blijken te zijn, kunnen dezelfde technieken gebruikt worden die al toegepast worden op conventionele antilichamen zoals vb.

humanisatie. Tot op heden is nog geen immunogene reactie vastgesteld in muismodellen (Coppieters et al, 2006; Cortez-Retamozo et al, 2002) en is nog geen melding gemaakt van immunogeniciteit bij de mens. Een ander, potentieel probleem is de korte halfwaardetijd door de geringe grootte van de Nbs. Dit kan opgevangen worden door een multivalent Nb te creëren zoals eerder reeds aangehaald. Dit multivalent Nb kan bestaan uit één of meerdere TNFR1-bindende en/of inhiberende Nbs gekoppeld aan een anti-albumine Nb of een anti-immunoglobuline Nb, die allebei een lange halfwaardetijd bezitten. De binding van het Nb aan één van deze eiwitten kan de halfwaardetijd verhogen. Een andere mogelijkheid is de rechtstreekse koppeling van (een deel van) deze eiwitten aan het Nb, wat eveneens de halfwaardetijd verlengt (Harmsen et al, 2005; Roovers et al, 2007; Smith et al, 2001). De koppeling aan albumine kan een extra voordeel opleveren bij de behandeling van RA. Bij RA

is namelijk aangetoond dat albumine gerekruteerd wordt naar de ontstoken gewrichten (Wilkinson et al, 1965). Door de koppeling van de Nbs aan albumine, fungeert dit laatste als een ‘drug-carrier’ (Coppieters et al, 2006; Wunder et al, 2003), wat zorgt voor specifieke targeting van het Nb naar de inflammatoire site.

Bij de miRNA onderzoekslijn werden met miRNA predictieprogramma’s miRNA’s geselecteerd die mogelijks het TNFR1-eiwit expressieniveau kunnen verlagen, namelijk miRNA-29a, -29b1, -29b2, -29c, -125a, -125b1, -125b2, -146a, -149, -211, -335, -351, -511 en -763.


47

Een eerste test werd uitgevoerd met miRNA-511, aangezien vroeger onderzoek reeds

aantoonde dat miRNA-511 het TNFR1 eiwitniveau verlaagde. Bij de in vitro test worden premiRNA precursor moleculen respectievelijk voor miRNA-511 en miRNA-CTR of LNA voor respectievelijk anti-miRNA-511 en anti-miRNA-CTR getransfecteerd in de C57BL/6-MEF cellen. Na analyse is het TNFR1 expressieniveau bij miRNA-511 significant gedaald ten opzichte van de miRNA-controle, terwijl het bij anti-miRNA-511 significant verhoogd is. Deze test werd enkel uitgevoerd met miRNA-511 wegens de hoge kostprijs voor de miRNA-precursor moleculen.

In een tweede stap, werd van de miRNA precursor plasmiden een grote hoeveelheid zeer zuiver DNA bereid zodat ze geschikt zijn voor in vivo gebruik. De plasmiden werden toegediend onder hoge druk via hydrodynamische staartader injectie. Hierdoor worden de plasmiden voornamelijk opgenomen door hepatocyten en worden de plasmiden tot

expressie gebracht, waarna matuur miRNA geproduceerd wordt. Bij de in vivo testen, werden telkens 19 C57BL/6 muizen geïnjecteerd met miRNA-511 en het controle-miRNA. Na 24 u werd de lever afgezonderd en het TNFR1 expressieniveau bepaald. Uit de resultaten bleek dat TNFR1 expressie significant gedaald was na toediening van miRNA-511 in vergelijking met het toedienen van een controle-miRNA. Deze in vivo test werd vervolgens met alle geselecteerde miRNA’s uitgevoerd, waarbij de lever na 24 u afgezonderd werd. Bij deze test werden in een eerste fase per miRNA slechts 3 muizen geïnjecteerd. Vooraleer definitieve conclusies te trekken moet deze test zeker nog eens herhaald worden. Uit de eerste resultaten blijkt dat het TNFR1 expressieniveau na toediening van miRNA-125b1 het sterkst gedaald is, gevolgd door respectievelijk miRNA-125a, -511, -29b2, -146a, -335, -351, -763, -29c, -211, -149a, -125b2, -29b1 en -29a. Door de grote variatie bij de miRNA-controle is

enkel het verschil tussen de controle en miRNA-125b1 significant.

Bij een tweede in vivo test wordt de rol van miRNA-511 nagegaan in de ontwikkeling van inflammatie na toediening van TNF of LPS. Indien miRNA-511 inderdaad het TNFR1 expressieniveau verlaagt, moet dit resulteren in een verminderde gevoeligheid aan TNF/LPS. In deze test wordt eerst via hydrodynamische staartader injectie respectievelijk miRNA-511 of miRNA-controle toegediend, 24 u later gevolgd door een intraperitoneale injectie met een LD50 dosis TNF of LPS. Op regelmatige tijdstippen werd bij de muizen de lichaamstemperatuur gemeten en de letaliteit nagegaan. Uit dit experiment blijkt dat de sterfte bij de controlegroep significant hoger ligt dan bij de miRNA-511 groep. Dit duidt op een beschermende rol van miRNA-511 tegen de effecten van TNF en LPS.

Om na te gaan of de bescherming van miRNA-511 specifiek te wijten is aan de verlaagde

TNFR1 expressie, werd dit letaliteitexperiment herhaald in TNFR1 knock-out muizen. Bij deze muizen, die geen TNFR1 expresseren, bood miRNA-511 geen extra bescherming ten opzichte van miRNA-CTR. Uit dit experiment kunnen we afleiden dat de bescherming van miRNA-511 tegen TNF en LPS specifiek te wijten is aan de neerregulatie van TNFR1.

Gezien de resultaten met miRNA-511, loont het de moeite om deze stappen nogmaals uit te voeren met de miRNA’s die het TNFR1 expressieniveau eveneens verlaagden, zoals miRNA-125b1.

In een volgende stap van het onderzoek wordt nagegaan of de miRNA’s rechtstreeks binden op het mRNA van TNFR1. Dit kan gecontroleerd worden door de 3’-UTR regio van TNFR1 mRNA te kloneren voor een rapporteergen zoals het Renilla luciferasegen. Een vuurvlieg


48

luciferase gen onder controle van een HSV-TK promotor, gelegen op hetzelfde plasmide, laat

toe om te corrigeren voor een verschillende transfectie-efficiëntie. De miRNA precursor plasmiden worden gecotransfecteerd. Indien een miRNA bindt op de 3’-UTR regio, verlaagt de expressie van het rapporteergen ten opzichte van de controles. Dit is meetbaar door een luciferase-assay met Renilla luciferase substraat (coelenterazine) uit te voeren. Indien het miRNA niet bindt op de 3’-UTR regio zal het luciferase-expressieniveau vergelijkbaar zijn met de miRNA-controle.

In de toekomst kan het effect van miRNA-511 in specifieke levermuismodellen zoals het Concanavaline A (ConA) hepatitis model bestudeerd worden (Tiegs et al, 1992). Hierbij kan nagegaan worden of miRNA-511 de symptomen van deze ziekte vertraagt, vermindert of volledige bescherming biedt.

Bij de mens zijn miRNA’s als behandeling voorlopig nog niet mogelijk, omwille van de nog ongekende risico’s. Aangezien een miRNA meerdere targets kan hebben, is het mogelijk dat deze miRNA’s niet alleen een effect uitoefenen op TNFR1 maar ook op andere targets. Vele van deze targets zijn echter nog niet gekend. Hierdoor worden miRNA’s nog niet gebruikt als therapie.

Een andere mogelijkheid is dat miRNA’s een rol kunnen spelen als biomerker. Hierbij is het mogelijk om de miRNA-concentratie uit plasmastalen te bepalen (Kim et al, 2012). Enkel als bepaalde miRNA’s een verhoogde of verlaagde expressie kennen bij patiënten met bijvoorbeeld RA, IBD of MS, kunnen deze aangewend worden bij de diagnose van deze ziektes. Een betrouwbare biomerker zal voor de patiënt zeker een meerwaarde zijn en de diagnose bespoedigen, gezien de diagnostiek van deze ziektes niet steeds evident is door de verscheidenheid aan symptomen (Bernstein et al, 2010; McDonald et al, 2001; Rindfleisch &

Muller, 2005).

Hoofdstuk 5: Materiaal en methode

49

5. Materiaal en methode

5.1 Nanobodies

5.1.1 pHen4 en pHen6c vector

De coderende sequenties voor de Nanobodies (Nbs), aangemaakt door de VIB Nanobody Service Facility, worden geleverd in de pHen4 vector. Deze vector codeert voor een haemagglutininetag, die aan de Nbs gekoppeld wordt. Onze voorkeur gaat uit naar een His-tag, zodat de Nbs via een IMAC-kolom opgezuiverd kunnen worden. Daarom kloneren we de

Nbs naar de pHEN6c vector die codeert voor deze tag. Deze vector bezit meerdere genen en sequenties die een rol spelen bij de klonering en expressie van het Nb (Figuur 22). De Plac operator speelt een rol bij de inductie van de Nb productie. univ Rev en univ For zijn de sequenties waar de universele primers binden. De pelB sequentie zorgt voor het transport van het geëxpresseerde Nb naar het periplasma. Nb1 toont de positie van het gekloneerde Nb op de vector. Aan de Nb-sequentie wordt een His-tag gekoppeld, gecodeerd door his-tag. PstI en BstEII geven de restrictiesites weer van de enzymen, gebruikt tijdens het kloneringsproces. De f1 ori maakt replicatie van de vector in fagen mogelijk. Het ampicilline resistentiegen (AmpR), onder controle van de bla promotor, maakt selectie van kolonies mogelijk na transformatie met de vector. Het pMB1 replicon maakt de replicatie van het plasmide in bacteriën mogelijk.

Figuur 22: pHen6c vector: Op de vector worden de belangrijkste genen en sequenties weergegeven. Afkortingen: Plac: lac operator sequentie; univ rev: Universal reversed primer bindingssequentie; nb 1: Nanobody sequentie 1; his-tag: HexaHistidine-tag; univ For: Universal forward primer bindingssequentie; bla: lac promotor; AmpR: ampicilline resistentiegen; rep(pMB1): pMB1 replicon.


50

5.1.2 PCR

Om een His-tag aan de Nbs te koppelen wordt een klonering van de Nbs uit de pHen4 naar de pHen6c vector uitgevoerd. De coderende sequenties van de Nbs worden geamplificeerd via PCR (Polymerase Chain Reaction). Hierbij worden 200 ng DNA template, 10 mM dXTPs, een ‘Universal Forward’ en ‘Universal Reversed’ primer elk aan 0,5 µM, 1,5 mM MgCl2, 0,5 U Taq DNA polymerase, 0,5 U Pfu DNA polymerase, 1x polymerase buffer en BIDI (BI-DIstilled water) samengevoegd in een PCR-tube. Deze mix wordt in een C-1000 thermal cycler (Bio-Rad) opgewarmd tot 95°C gedurende 5 min waardoor het dsDNA denatureert. Hierna wordt de mix afgekoeld tot 55°C (30 sec) waardoor de primers kunnen binden op het template ssDNA. Vervolgens wordt gedurende 1 min bij 72°C de DNA sequentie verlengd vanaf de primers. Deze cyclus wordt 34 maal herhaald. De mix wordt vervolgens gedurende 5 min op

72°C gebracht, waarbij het enzym de kans krijgt om onafgewerkte DNA-kopieën af te werken. Tenslotte wordt de mix afgekoeld bij 10°C (Tabel 3).


Ter controle van de PCR-reactie wordt de lengte van de bekomen DNA-fragmenten nagegaan d.m.v. een agarosegelelektroforese. Omwille van het kleine DNA-fragment van 400 bp wordt een 2% agarosegel met Sybr Safe gegoten. 2 µl staal, 2 µl 6x ladingsbuffer en 8 µl BIDI worden samengevoegd en geladen op de gel, dit om zoveel mogelijk DNA te behouden. De gel wordt gelopen in 1x TBE buffer bij 100 V gedurende 40 min. Hierbij trekt de positieve pool de negatief geladen DNA fragmenten aan. Het netwerk van agarose

hindert de migratie van het DNA doorheen de gel, waardoor grote fragmenten meer worden tegengehouden dan kleinere. De fragmenten en de ladder worden hierdoor op grootte gescheiden. Aan de hand van de ‘Small Fragments’ ladder wordt de grootte van het bekomen DNA fragment geschat.

5.1.4 Zuivering

Het geamplificeerde DNA wordt opgezuiverd uit de PCR-mix met de ‘Nucleospin Gel and PCR clean-up kit’ (M&N) (7.6.1). Hierbij bindt het DNA op een silicakolom door interacties tussen de negatieve fosfaatgroepen van het DNA met de positief geladen silica-ionen. Door opeenvolgende wasstappen in buffers met chaotrope zouten worden de overige

componenten van de mix doorheen de kolom weggewassen, terwijl het DNA gebonden blijft op de kolom. Tenslotte wordt het DNA geëlueerd in 20 µl BIDI, waardoor de watermantel rondom het DNA hersteld wordt en het DNA loskomt van de kolom.

5.1.5 Nanodrop

De zuiverheid en concentratie van het DNA worden gemeten met de ‘Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer’ (Thermo Scientific). Een meting bij verschillende golflengtes spoort eventuele contaminatie op. Bij een golflengte van 260 nm absorbeert DNA het licht, hieruit kan de concentratie berekend worden d.m.v. de wet van Lambert-Beer. Bij 280 nm absorberen vooral eiwitten. Uit de 260:280 ratio kan de ernst van de contaminatie met


51

eiwitten nagegaan worden, een waarde van ≥ 1,8 wordt als zuiver beschouwd. Guanidine

thiocyanaat, EDTA, carbohydraten en fenolen absorberen vooral bij 230 nm. Eventuele contaminatie met deze componenten kan afgeleid worden uit de 260:230 ratio, een waarde tussen 2 en 2,2 wordt als ideaal beschouwd.

5.1.6 Restrictiedigest

De coderende sequentie voor de Nbs en de pHen6c vector worden vervolgens geknipt met restrictie-enzymen. Hierbij wordt eerst 1 µg DNA template samengevoegd met 25 U PstI, 1x buffer H, 5 µg BSA (Bovine Serum Albumin) en BIDI tot een volume van 50 µl. Vervolgens wordt deze mix geïncubeerd bij 37°C gedurende 4 u. De stalen worden opgezuiverd met de ‘Nucleospin Gel and PCR clean-up kit’ (M&N)(7.6.1). Op het bekomen DNA wordt een

restrictiedigest uitgevoerd met 25 U BstEII, 1x buffer D, 5 µg BSA en BIDI tot een volume van 50 µl. Dit wordt gedurende 4 u geïncubeerd bij 50°C. Nadien wordt het DNA opnieuw opgezuiverd met de ‘Nucleospin Gel and PCR clean-up kit’ (M&N). Vervolgens wordt de DNA concentratie en de zuiverheid nagegaan met de Nanodrop (5.1.5). Door het dubbele restrictiedigest worden overhangende eindjes aan de coderende sequentie van de Nbs gegenereerd die overeenkomen met de overhangende eindjes van de opengeknipte pHen6c vector.

5.1.7 Ligatie

Bij de ligatiereactie wordt 17 ng geknipt DNA samengevoegd met 100 ng opengeknipte

vector (Vergelijking 1), 1 U T4 ligase, 1x T4 ligase buffer en BIDI. Deze mix wordt overnacht geïncubeerd op kamertemperatuur. Tijdens de ligatiereactie binden de compatibele uiteinden aan elkaar, waarbij het enzym deze sequenties met elkaar verbindt en de breuken in het DNA herstelt.

5.1.8 Transformatie: elektroporatie

Elektrocompetente WK6 (E. coli) cellen worden getransformeerd met het bekomen plasmide d.m.v. een elektroshock. De cellen worden ontdooid op ijs en vervolgens samen met 5 µl ligatiemix in een elektroporatiekuvet gebracht en in het Gene pulser II elektroporatietoestel geplaatst (Bio-Rad). Door een elektrische shock van 2,5 kV ontstaan poriën in het membraan

waarlangs het DNA in de cellen opgenomen wordt. Hierna worden de cellen gedurende 1 u geïncubeerd bij 37°C in 1 ml rijk SOC-medium zodat het membraan herstelt en het ampicilline resistentiegen op het plasmide geëxpresseerd wordt. Nadien wordt 200 µl van deze cultuur uitgeplaat op LB-agar met 100 µg/µl ampicilline waardoor geselecteerd wordt voor cellen die de vector opgenomen hebben en het resistentiegen tot expressie brengen. Deze platen worden overnacht geïncubeerd bij 37°C.


52

5.1.9 Kolonie-PCR

De volgende ochtend zijn kolonies zichtbaar, die getest worden d.m.v. kolonie-PCR. Een kolonie wordt opgepikt van de geïncubeerde platen en in een PCR-tube, gevuld met 10 µl BIDI, gebracht. Dezelfde kolonie wordt geënt op een nieuwe plaat LB-agar met 100 µg/µl ampicilline, de streepplaat, die overnacht geïncubeerd wordt bij 37°C. Een mastermix met dezelfde bestanddelen als bij een standaard PCR (5.1.2) wordt aan de PCR-tube toegevoegd, er wordt echter geen Pfu DNA polymerase toegevoegd. De mix wordt gedurende 10 min verhit bij 94°C zodat de cellen opengebroken worden. Vervolgens verloopt een kolonie-PCR zoals een standaard PCR (Tabel 3). Vervolgens wordt een agarosegelelektroforese uitgevoerd ter controle. Omwille van de kleine DNA fragmenten van 550 bp lang wordt een 2% agarosegel met Sybr Safe gegoten. 12,5 µl staal wordt met 2,5 µl LB geladen op de gel,

samen met de ‘Small Fragments’ ladder. Deze gel wordt in 1x TBE buffer gelopen bij 100 V gedurende 40 min. De grootte van de fragmenten kan nagegaan worden aan de hand van de ladder.

5.1.10 Sequentie-analyse

Kolonies die het plasmide met de Nb sequenties bezitten, worden vervolgens getest op de juistheid van de Nb sequentie. Hiervoor wordt een kolonie opgepikt van de streepplaat en overnacht opgegroeid bij 37°C en 200 rpm in 3 ml vloeibaar LB medium met 100 µg/µl ampicilline. Van deze bacteriecultuur wordt vervolgens plasmide-DNA geïsoleerd met de ‘Plasmid purification mini-kit’ (Qiagen) (7.6.1). Deze plasmiden (50 ng/µl) worden samen met

de Universal Forward en Universal Reversed primers (1 nmol/µl) opgestuurd naar de Genetic Service Facility van het VIB, die de analyse uitvoeren.

5.1.11 Expressie

Indien het plasmide de correcte Nb-coderende sequentie bevat, wordt de kolonie opgepikt van de streepplaat en wordt een uitdunningsenting uitgevoerd op LB agar met 100 µg/µl ampicilline en 1% glucose, zodat nieuwe aparte kolonies bekomen worden. Na overnacht incuberen bij 37°C wordt een precultuur ingezet door één kolonie in 15 ml vloeibaar LB medium met 100 µg/µl ampicilline en 0,1% glucose te enten. Na een incubatieperiode van 6 u bij 37°C en 200 rpm, wordt 3 ml van deze precultuur toegevoegd aan 500 ml TB met 100

µg/µl ampicilline, 2 mM MgCl2 en 0,1 % glucose, dit wordt herhaald zodat in totaal 1 liter cultuur bekomen wordt. Deze cultuur wordt geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm tot een OD600 (optische densiteit bij 600 nm) van 0,6-0,9 bekomen wordt. Nadien wordt IPTG toegevoegd tot een finale concentratie van 1 mM om de expressie van de Nbs te induceren. Tijdens deze inductiefase wordt de cultuur geïncubeerd bij 28°C en 200 rpm om de correcte opvouwing van de Nbs te promoten. Na ongeveer 20 u incubatie (OD600= 25-30) wordt de cultuur gedurende 8 min gecentrifugeerd aan 8000 rpm bij 4°C en worden de cellen gelyseerd d.m.v. koude osmotische shock. Hierbij wordt de pellet, bekomen uit 1 liter cultuur, opgelost in 12 ml TS (7.7) en wordt dit 1 u geschud op ijs. Vervolgens wordt 18 ml 1/4 verdunde TS toegevoegd en wordt het opnieuw overnacht geschud op ijs. De periplasmatische fractie wordt afgezonderd door 30 min te centrifugeren aan 8000 rpm bij 4°C.


53

5.1.12 SDS-PAGE

1 ml cultuur wordt geanalyseerd. De cellen worden gecentrifugeerd bij 14.000 rpm gedurende 1 min. De eiwitten uit het cultuurmedium worden neergeslagen met 250 µl 100% TCA en gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 14.000 rpm. De pellet wordt gewassen door 200 µl koude aceton toe te voegen en opnieuw te centrifugeren (S1). De cellen worden gelyseerd door eerst 1 ml buffer A (7.7) toe te voegen, 10 min te incuberen op ijs en de pellet 1 min te centrifugeren bij 14.000 rpm. Vervolgens wordt de pellet opgelost in 1 ml buffer B (7.7), 10 min geïncubeerd op ijs en 1 min gecentrifugeerd bij 14.000 rpm. Het supernatans bevat de periplasmatische fractie, de pellet bevat de cellulaire restfractie. De eiwitten uit het periplasma worden neergeslagen door 250 µl 100% TCA toe te voegen aan het bekomen supernatans, 10 min te incuberen op ijs en vervolgens 5 min te centrifugeren bij 14.000 rpm

gedurende 5 min. De pellet wordt gewassen met 200 µl koude aceton en opnieuw gecentrifugeerd (S2). De eiwitten uit de cellulaire restfractie worden afgezonderd door de eerder bekomen pellet op te lossen in lysebuffer (7.7) en 5 min te incuberen bij kamertemperatuur, waarna de cellulaire debris verwijderd wordt door 2 min te centrifugeren bij 14.000 rpm. Het supernatans wordt overgebracht naar een nieuw epje (P2). De eiwitstalen (S1, S2, P2) worden opgelost in 5x LB met β-mercaptoethanol en worden gedenatureerd door ze op te koken bij 95°C. Ze worden geladen op een 15% polyacrylamidegel die 0,1% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) bevat. SDS bindt over de hele, ontvouwde eiwitstreng en zorgt ervoor dat de eiwitten gedenatureerd blijven gedurende de looptijd van de gel en dat het onderlinge ladingsverschil verwaarloosbaar klein wordt. SDS is negatief geladen waardoor de eiwitten aangetrokken worden door de positieve pool en doorheen de gel migreren. Zo worden de eiwitten niet op lading, maar enkel volgens grootte

gescheiden. De gel wordt gelopen in 1x EB buffer bij 100 V gedurende 20 min en bij 120 V gedurende 1 u.

5.1.13 Coomassie kleuring

De gel, bekomen na SDS-PAGE, wordt gekleurd met 1x Coomassie Briljant Blue. Coomassie vormt complexen met de eiwitten in de gel en wordt hierdoor gestabiliseerd in zijn anionische (blauwe) vorm. De polyacrylamidegel wordt vervolgens ontkleurd, zodat de eiwitbandjes zichtbaar worden. Dit gebeurt door de gel gedurende een paar uur te wassen in destain (7.7). Een papieren zakdoekje neemt de overtollige kleurstof op waardoor het proces versneld wordt.

5.1.14 Western Blotting

Bij Western Blotting worden de eiwitten na SDS-PAGE geblot op een 0,22 µm nitrocellulosemembraan voor kleine eiwitten, dat eiwitten op een niet-specifieke manier bindt. Voor het blotten wordt de SDS-PAGE gel op het membraan gelegd, tussen filterpapier. Het geheel wordt gedrenkt in blotbuffer (7.7). Door een elektrische stroom van 50 mA (0.8 mA/cm²) gedurende 1 u migreren de eiwitten uit de gel en binden ze op het nitrocellulosemembraan met behoud van hun onderlinge conformatie. De vrije plaatsen op het membraan worden vervolgens overnacht geblokkeerd met 2% BSA in 1x TBS bij 4°C.


54

Nadien wordt 10 µl/10 ml muis-α-hexaHistag (1 mg/ml) (AbD Serotec) antilichaam in 1x TBS,

dat bindt op de His-tag van de Nbs, aan het membraan toegevoegd en gedurende 1 u samen met het membraan geïncubeerd op kamertemperatuur. Vervolgens wordt het membraan 3x gedurende 5 min gewassen met 1x TBS-T. Het muis antilichaam wordt op zijn beurt gedetecteerd d.m.v. 1 µl/ 10 ml IRDye 680 Goat Anti-Mouse IgG (1 mg/ml) (Li-Cor) in 1x TBS. Het membraan wordt samen met het antilichaam gedurende 1 u op kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens 3x 5 min met 1x TBS-T, 3x 5 min met 1x TBS en 3x 5 min met BIDI gewassen. De Nbs kunnen nu gevisualiseerd worden m.b.v. de Odyssey Infrared Imaging Scanner (Li-Cor biosciences) bij een golflengte van 680 nm.

5.1.15 Opzuivering

De periplasmatische fractie (5.1.11) wordt doorheen een cell strainer overgebracht naar een 50 ml tube. De Nbs worden opgezuiverd m.b.v. IMAC kolomopzuivering (His-GraviTrap kit, GE Healthcare) (7.6.1). Hierbij gaat de His-tag van het Nb een interactie aan met de Ni+-kolom, waardoor het tijdens de wasstappen gebonden blijft aan de kolom. Door het toevoegen van een buffer met hoge imidazoolconcentratie worden de Nbs van de kolom geëlueerd. Vervolgens worden de Nbs gedialyseerd naar 1x PBS m.b.v. Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes met 3500 kDa cut-off, zodat het imidazool verwijderd wordt. De cassettes worden gedrenkt in 1x PBS en nadien worden de stalen met een injectienaald in de cassettes gebracht. De gevulde cassettes worden in 1x PBS geïncubeerd bij 4°C. Na 2 u wordt het 1x PBS vervangen door nieuw 1x PBS. Dit wordt overnacht geïncubeerd bij 4°C. De volgende ochtend wordt het staal met een injectienaald uit de cassette gehaald en overgebracht naar

een 15 ml tube.

5.1.16 Eiwitbepaling

De eiwitconcentratie van de Nbs wordt vervolgens bepaald met de ‘Dc Protein Assay Kit’ (Bio-Rad). 20 µl reagens S wordt toegevoegd aan 1 ml A, wat oplossing A’ oplevert. Per well wordt 20 µl A’ toegevoegd. Na toevoeging van 10 µl staal of van 10 µl 10 mg/ml BSA standaard wordt een 1/3 verdunningsreeks aangemaakt. Vervolgens wordt 135 µl oplossing B toegevoegd aan de wells. Onder alkalische omstandigheden vormen eiwitten met Cu-tartraat een Cu-eiwitcomplex. Bij het toevoegen van Folin reagens wordt dit door het Cu-eiwitcomplex gereduceerd waardoor een blauwe kleur ontstaat. Deze kleuromslag wordt

gemeten met een MicroPlate Reader spectrofotometer (Bio-Rad) bij 655 nm. De concentratie wordt bepaald aan de hand van de standaard.

5.1.17 Bindingsaffiniteit ELISA

De bindingsaffiniteit van de Nbs voor mTNFR1 wordt nagegaan d.m.v. een ELISA. Hierbij wordt een Maxisorp plaat (Nunc) overnacht gecoat met 100 µl 1 ng/µl recombinant mTNFR1 bij 4°C, waarna de plaat gedurende 1 u geblokkeerd wordt met 2% BSA in 1x TBS-T bij kamertemperatuur. 100 µl van een 1/4 verdunningsreeks van de Nbs, startende van 1 ng/µl wordt op de plaat gebracht en gedurende 1 u geïncubeerd bij kamertemperatuur. Deze Nbs gaan de mTNFR1 binden. Vervolgens wordt de plaat 3x met 400 µl 1x TBS-T gewassen en


55

wordt 10 µl/ 10 ml muis-antiHis antilichaam (1 mg/ml)(AbD Serotec) op de plaat gebracht.

Dit antilichaam bindt de His-tag van de Nbs. De plaat wordt 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd en 3x gewassen met 400 µl 1x TBS-T. De detectie vindt plaats met 1 µl/ 10 ml anti-muis antilichaam gekoppeld aan HRP (1 mg/ml) (Li-Cor) in 1x TBS dat 1 u geïncubeerd wordt bij kamertemperatuur. De plaat wordt 3x met 400 µl 1x TBS-T gewassen. 50 µl TMB-substraat wordt aan de wells toegevoegd en door HRP geoxideerd waardoor een blauwe kleur ontstaat. De reactie wordt na 20 min gestopt door 1 M H2SO4 toe te voegen, waardoor een gele kleuromslag ontstaat. Deze kleuromslag wordt gemeten d.m.v. Microplate Reader (Bio-Rad) bij 450 nm met een referentiemeting bij 595 nm. Door de kleuromslag van de Nbs onderling te vergelijken kan de relatieve bindingsaffiniteit bepaald worden. Als positieve

controle werd 1 ng/μl ‘anti-mouse sTNFRI/TNFSF1A antibody’ gebruikt. 1 ng/μl anti-MMP-7

(Matrix MetalloProtease) Nb en 1x TBS werden gebruikt als negatieve controle.

5.1.18 Weefselkweek L929 NF-ϰB/luc cellen

De L929 NF-ϰB/luc cellen worden uit de vloeibare N2 genomen en ontdooid. Onmiddellijk na het ontdooien worden de cellen overgebracht in een tube met 10 ml DMEM-medium met 1% L-Glutamine, 20% FCS, 0,2% Penicilline/Streptomycine, 0,1% Na-pyruvaat en 1% NEAA. Vervolgens wordt de tube 5 min gecentrifugeerd bij 1200 rpm. Het medium wordt afgezogen en de pellet wordt opnieuw opgelost in 1 ml nieuw medium. Dit werd overgebracht in een 25 cm² falcon, gevuld met medium die geflushed wordt met CO2. De cellen worden geïncubeerd bij 37°C. Indien de cellen na een aantal dagen confluent zijn, worden ze gesplitst. Hierbij worden ze losgemaakt door het medium af te zuigen en gedurende 10 min

EDTA-trypsine te laten inwerken in een warme omgeving. Daarna wordt een gelijke hoeveelheid medium toegevoegd om de werking van trypsine te neutraliseren. De cellen worden vervolgens overgebracht naar een 15 ml tube. Deze tube wordt 5 min gecentrifugeerd bij 1200 rpm en het medium wordt afgezogen. De pellet wordt opnieuw opgelost in 1 ml medium en de cellen worden verdeeld over meerdere en/of grotere falcons, gevuld met medium, afhankelijk van de splitsingsfactor (doorgaans 1/3). De falcons worden geflushed met CO2 en de cellen worden geïncubeerd bij 37°C.

5.1.19 In vitro inhibitietest

L929 NF-ϰB/luc cellen worden uitgezaaid in een 96-well plaat met 40.000 cellen per well.

Deze cellen worden overnacht geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 zodat ze aanhechten op de plaat. Vervolgens worden de afzonderlijke Nbs en een controle Nb in een 1/4 verdunningsreeks (startende van 6 µg/ 200 µl) op de cellen gebracht. De Nbs binden aan de TNFR1 receptor en kunnen deze inhiberen. De cellen worden gedurende 30 min geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Nadien wordt 1000 IU/ml mTNF aan de wells toegevoegd. Het mTNF induceert de transcriptie van het vuurvlieg luciferasegen, onder controle van de NF-ϰB promotor, afhankelijk van de inhibitie van de TNFR1 receptor. Na 3 u incubatie bij 37°C en 5% CO2 wordt het medium afgenomen en worden de cellen gelyseerd met 60 µl lysebuffer (7.7). Vervolgens wordt 30 µl luciferase substraatbuffer (7.7) aan 50 µl cellysaat toegevoegd. Het luciferasegen zet dit substraat om naar een lichtsignaal dat onmiddellijk gemeten wordt met de Luminometer (Perkin Elmer). Dit lichtsignaal is evenredig met de aanwezige


56

hoeveelheid luciferase. Indien een Nb TNFR1 inhibeert, ligt het signaal lager dan wanneer

een Nb TNFR1 niet inhibeert.

5.2 miRNA’s

5.2.1 Transformatie: hitte shock

De miRNA constructen (GeneCopoeia) worden geleverd in de pEZX-MR04 vector (Figuur 23). Deze vector bevat de coderende sequentie voor de miRNA’s en het eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) rapporteergen onder controle van de eukaryote CMV-promotor (CytoMegaloVirus). Verder bevat de vector het puromycine resistentiegen onder controle

van de humane fosfoglyceraat kinase promotor en het ampicilline resistentiegen onder controle van de lac promotor. De pUC ori maakt replicatie in E.coli mogelijk. Het SV40 (Simian virus 40) polyA signaal zorgt voor een verhoogde transcriptie.

Chemisch competente MC1061 (E. coli) cellen worden door een hitte shock getransformeerd met de miRNA-plasmiden. Hierbij worden de cellen ontdooid op ijs. Nadien worden de plasmiden (50 ng) toegevoegd aan de cellen en wordt deze mix op ijs geplaatst gedurende 30 min. Vervolgens wordt de mix 50 s bij 42°C geplaatst. Door de plotse

temperatuursverhoging wordt het celmembraan beschadigd, waardoor het DNA in de cellen opgenomen wordt. Onmiddellijk hierna worden de cellen opnieuw op ijs geplaatst en wordt 1 ml rijk SOC medium toegevoegd. Tijdens een incubatieperiode van 1 u bij 37°C en 200 rpm kunnen de cellen herstellen van de hitte shock en het ampicilline resistentiegen op het plasmide tot expressie brengen. Nadien wordt 200 µl van deze cultuur uitgeplaat op LB agar met 100 µg/µl ampicilline.

Figuur 23: pEZX-MR04 vector: De figuur geeft een schematisch overzicht van de vector waarin de miRNA coderende sequentie zich bevindt (GeneCopeia). Afkortingen: CMV: CytoMegaloVirus promotor; eGFP: enhanced Green Fluorescent Protein; hPGK:humaan FosfoGlyceraat Kinase promotor ; PuroR: Puromycine Resistentiegen; SV40 polyA: Simian Virus 40 poly Adenylatie signaal; bla: lac promotor; AmpR: Ampicilline Resistentiegen.


57

5.2.2 Kolonie-PCR

De kolonie-PCR en gelelektroforese worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven (zie 5.1.9).

5.2.3 Zuivering

Het volgende protocol werd gevolgd om een hoge opbrengst van zeer zuiver DNA te bekomen dat geschikt is voor in vivo gebruik. Eén positieve kolonie per construct wordt geselecteerd. Deze kolonie wordt geënt in een precultuur van 7 ml TB met 100 mg/ml ampicilline, zodat de cellen in de exponentiële groeifase terechtkomen. Deze precultuur wordt geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm. Na 6 u wordt 500 ml TB met 100 mg/ml ampicilline geïnoculeerd met 3 ml precultuur en overnacht geïncubeerd bij 37°C en 200 rpm. Dit wordt

herhaald zodat in totaal 1 liter cultuur bekomen wordt. De cellen worden 10 min afgedraaid bij 5000 rpm en 4°C, en de pellet wordt opnieuw opgelost in 10 ml koude buffer 1 (7.7). Vervolgens worden de cellen gelyseerd d.m.v. alkalische lyse met 20 ml buffer 2 (7.7). De tubes worden geschud en vervolgens 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Nadien wordt 10 ml neutraliserende buffer 3 toegevoegd (7.7) en wordt de oplossing 10 min op ijs geïncubeerd. De mix wordt 15 min gecentrifugeerd bij 8000 rpm bij 4°C zodat de eiwitten neergeslagen worden. Het supernatans wordt doorheen een cell strainer overgebracht naar een nieuwe 50 ml tube, waardoor het cellulaire debris verder verwijderd wordt. Om het DNA te laten neerslaan, wordt 25 ml isopropanol toegevoegd en wordt de mix 10 min op kamertemperatuur geïncubeerd. Het DNA wordt 10 min gecentrifugeerd bij 5000 rpm bij kamertemperatuur. De pellet wordt opnieuw opgelost in 3 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8).

Vervolgens wordt 3 ml 5 M LiCl toegevoegd om het aanwezige RNA neer te slaan, na 10 min centrifugeren bij 8000 rpm bij kamertemperatuur wordt het supernatans overgebracht naar een nieuwe tube. Het DNA wordt opnieuw neergeslagen met 6 ml isopropanol en 10 min gecentrifugeerd bij 5000 rpm bij kamertemperatuur. De pellet wordt opgelost in 500 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8). 10 µl 2,5 µg/µl RNase A wordt toegevoegd en de mix wordt 1 u geïncubeerd bij 37°C. Vervolgens worden proteïnase K en SDS toegevoegd tot een finale concentratie van respectievelijk 100 µg/ml en 0,1%. Dit wordt 1 u geïncubeerd bij 56°C, om het overige RNA en de resterende eiwitten af te breken. Nadien wordt het DNA 2x geëxtraheerd met 400 µl fenol en vervolgens 2x met 400 µl chloroform (7.6.2). 40 µl 3 M NaAc (pH 5,2) wordt toegevoegd, gevolgd door 800 µl ijskoude 100% ethanol. Dit wordt 1 u geïncubeerd bij -20°C. Het DNA wordt 10 min gecentrifugeerd bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur. De bekomen DNA pellet wordt gewassen met 500 µl 70% ethanol en 5

min gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. De pellet wordt gedroogd en tenslotte opgelost in 500 µl 1x PBS. De DNA concentratie en de zuiverheid worden nagegaan met de Nanodrop (zie 5.1.5).

5.2.4 Weefselkweek C57BL/6 MEF cellen

De cellen worden uit de vloeibare N2 genomen en ontdooid. Onmiddellijk na het ontdooien worden de cellen overgebracht in een 15 ml tube met 10 ml DMEM-medium met 1% L-Glutamine, 20% FCS, 0,2% Penicilline/Streptomycine, 0,1% Na-pyruvaat en 1% NEAA. Vervolgens wordt de tube 5 min gecentrifugeerd bij 1200 rpm. Het medium wordt


58

afgezogen. De cellen worden opgelost in 1 ml nieuw medium en overgebracht in een, met

medium gevulde, 25 cm² falcon met filterdop. De cellen worden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 3% O2. Indien de cellen na een aantal dagen confluent zijn, worden ze gesplitst. Hierbij worden ze losgemaakt door het medium af te zuigen en gedurende 10 min EDTA-trypsine te laten inwerken bij 37°C. Daarna wordt een gelijke hoeveelheid DMEM-medium toegevoegd om de werking van trypsine te neutraliseren en de cellen worden overgebracht naar een 15 ml tube. Deze tube wordt 5 min gecentrifugeerd bij 1200 rpm en het medium wordt afgezogen. De pellet wordt opnieuw opgelost in 1 ml medium. De cellen worden verdeeld over meerdere of grotere, met medium gevulde falcons met filterdop, afhankelijk van de splitsingsfactor (doorgaans 1/3) en geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 3% O2.

5.2.5 In vitro test miRNA-511

C57BL/6-MEF (Mouse Embryonic Fibroblast) cellen worden uitgezaaid in vier 24-well plaat met 100.000 cellen per well. Deze cellen worden geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 tot ze aangehecht zijn op de plaat. 13 µl 50 µM miRNA precursor of LNA wordt samengevoegd met 1300 µl OPTIMEM; 26 µl RNAiMAX wordt samengevoegd met 1300 µl OPTIMEM. Beiden worden 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur en vervolgens samengevoegd. Deze transfectiemix wordt 20 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Het medium van de cellen wordt afgenomen en 400 µl OPTIMEM wordt aan de wells toegevoegd. Vervolgens wordt 100 µl van de transfectiemix in de wells gedruppeld. De cellen worden 24 u geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Nadien wordt het medium van de vier platen overgebracht naar een 96-well plaat. De cellen worden gelyseerd met 200 µl lysebuffer (7.7). De eiwitconcentratie van de

stalen van het medium en van het lysaat wordt bepaald zoals beschreven bij 5.1.16. Een mTNFR1 ELISA wordt uitgevoerd op zowel het medium als het cellysaat met de ‘mouse sTNF RI/TNFRSF1A duoset ELISA kit’ (R&D). Hierbij wordt een Maxisorp plaat (Nunc) overnacht gecoat met 100 µl 2 µg/ml ‘capture’ antilichaam in 1x PBS per well. De volgende dag wordt de plaat eerst 3x gewassen met 250 µl wasbuffer (7.7) en gedurende 1 u geblokkeerd bij

kamertemperatuur met 300 µl Reagent Diluent (RD) vooraleer 500 µg van de eiwitstalen in RD op de plaat gebracht worden. De plaat wordt 2 u geïncubeerd bij kamertemperatuur, zodat het ‘capture’ antilichaam het aanwezige mTNFR1 kan binden. Vervolgens wordt de plaat 3x gewassen. Nadien wordt 100 µl 200 ng/ml detectie antilichaam in RD in elke well gebracht. Na 2 u incubatie bij kamertemperatuur wordt de plaat opnieuw 3x gewassen. Per well wordt 100 µl 50 µl/ml streptavidine-HRP toegevoegd en de plaat wordt 20 min

geïncubeerd bij kamertemperatuur, afgeschermd van het licht. De plaat wordt 3x gewassen. 50 µl TMB substraatoplossing wordt toegevoegd, waardoor blauwkleuring ontstaat. De reactie wordt na 20 min gestopt door 1 M H2SO4 toe te voegen waardoor een gele kleuromslag ontstaat. Deze wordt gemeten met de Microplate Reader (Bio-Rad) bij 450 nm met een referentiemeting bij 570 nm (zie 5.1.17).

5.2.6 Hydrodynamische staartader injectie

Wild-type C57BL/6 muizen (Janvier) worden geïnjecteerd met 5 µg/ml miRNA precursor plasmiden in 2 ml 1x steriele PBS. Dit gebeurt d.m.v. een hoge druk staartader injectie. De muizen worden ongeveer 5 min onder een warmtelamp geplaatst, zodat de staartader


59

opzwelt en makkelijker geïnjecteerd kan worden. Vervolgens worden de miRNA precursor

plasmiden geïnjecteerd in de staartader. 24 u later worden de muizen gedood. De bovenste leverlob wordt geïsoleerd en onmiddellijk ingevroren in vloeibare N2 zodat de eiwitten goed bewaard worden. Na het toevoegen van 200 µl lysebuffer (7.7) worden de levers gehomogeniseerd met de Dounce tissue grinder (Kontes). De stalen worden 20 min op ijs geplaatst zodat het eiwit niet degradeert en nadien 30 min gecentrifugeerd bij 14.000 rpm en 4°C. Het supernatans wordt overgebracht naar een nieuw epje.

Op deze stalen wordt de totale hoeveelheid eiwit bepaald (zie 5.1.16). Nadien wordt op 500 µg levereiwit een ‘mouse sTNF RI/TNFRSF1A duoset ELISA’ (R&D Systems) uitgevoerd om het expressieniveau van mTNFR1 na te gaan (zie 5.2.5).

5.2.7 TNF/LPS letaliteitexperiment

Om het effect van de miRNA’s na te gaan wordt een letaliteitexperiment uitgevoerd. De muizen worden 5 min onder een warmtelamp geplaatst waardoor de staartader opzwelt,

zodat die makkelijker injecteerbaar is. Vervolgens wordt 2 ml 5 µg/ml van de miRNA precursor plasmiden in 1x steriele PBS onder hoge druk in de staartader geïnjecteerd in wild-type C57BL/6 muizen en TNFR1 knock-out muizen. Na 24 u wordt een LD50 (letale dosis voor 50% van de muizen) TNF (20 µg) of LPS (LipoPolySaccharide) (200 µg voor wild-type, of 500 µg voor TNFR1 knock-out muizen) intraperitoneaal geïnjecteerd. De reactie van de muizen op deze dosis TNF/LPS wordt gevolgd door de lichaamstemperatuur te meten en de letaliteit te registreren op regelmatige tijdstippen.

Hoofdstuk 6: Referenties

61

6. Referenties

Ablynx (2010) Jaarverslag 2010.

Abu-Amer Y, Erdmann J, Alexopoulou L, Kollias G, Ross FP, Teitelbaum SL (2000) Tumor necrosis factor receptors types 1 and 2 differentially regulate osteoclastogenesis. The Journal of biological chemistry 275: 27307-27310

Abulrob A, Sprong H, Van Bergen en Henegouwen P, Stanimirovic D (2005) The blood-brain barrier transmigrating single domain antibody: mechanisms of transport and antigenic epitopes in human brain endothelial cells. Journal of neurochemistry 95: 1201-1214

Aggarwal BB, Gupta SC, Kim JH (2012) Historical perspectives on tumor necrosis factor and its superfamily: 25 years later, a golden journey. Blood 119: 651-665

Aggarwal BB, Kohr WJ, Hass PE, Moffat B, Spencer SA, Henzel WJ, Bringman TS, Nedwin GE, Goeddel DV, Harkins RN (1985) Human tumor necrosis factor. Production, purification, and characterization. The Journal of biological chemistry 260: 2345-2354

Alsalameh S, Winter K, Al-Ward R, Wendler J, Kalden JR, Kinne RW (1999) Distribution of TNF-alpha, TNF-R55 and TNF-R75 in the rheumatoid synovial membrane: TNF receptors are localized preferentially in the lining layer; TNF-alpha is distributed mainly in the vicinity of TNF receptors in the deeper layers. Scandinavian journal of immunology 49: 278-285

Armaka M, Apostolaki M, Jacques P, Kontoyiannis DL, Elewaut D, Kollias G (2008) Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. The Journal of experimental medicine 205: 331-337

Astarci E, Erson-Bensan AE, Banerjee S (2012) Matrix metalloprotease 16 expression is downregulated by microRNA-146a in spontaneously differentiating Caco-2 cells. Development, growth & differentiation 54: 216-226

Balakrishnan A, Stearns AT, Park PJ, Dreyfuss JM, Ashley SW, Rhoads DB, Tavakkolizadeh A (2012) Upregulation of Proapoptotic MicroRNA mir-125a After Massive Small Bowel Resection in Rats. Annals of surgery 255: 747-753

Berezikov E, Chung WJ, Willis J, Cuppen E, Lai EC (2007) Mammalian mirtron genes. Molecular cell 28: 328-336

Bernatsky S, Renoux C, Suissa S (2010) Demyelinating events in rheumatoid arthritis after drug exposures. Annals of the rheumatic diseases 69: 1691-1693

Bernstein CN, Fried M, Krabshuis JH, Cohen H, Eliakim R, Fedail S, Gearry R, Goh KL, Hamid S, Khan AG, LeMair AW, Malfertheiner, Ouyang Q, Rey JF, Sood A, Steinwurz F, Thomsen OO, Thomson A, Watermeyer G (2010) World Gastroenterology Organization Practice Guidelines for the diagnosis and management of IBD in 2010. Inflammatory bowel diseases 16: 112-124


62

Bluml S, Binder NB, Niederreiter B, Polzer K, Hayer S, Tauber S, Schett G, Scheinecker C, Kollias G, Selzer E, Bilban M, Smolen JS, Superti-Furga G, Redlich K (2010) Antiinflammatory effects of tumor necrosis factor on hematopoietic cells in a murine model of erosive arthritis. Arthritis and rheumatism 62: 1608-1619

Bluml S, Scheinecker C, Smolen JS, Redlich K (2012) Targeting TNF receptors in rheumatoid arthritis. International immunology

Boldin MP, Taganov KD, Rao DS, Yang L, Zhao JL, Kalwani M, Garcia-Flores Y, Luong M, Devrekanli A, Xu J, Sun G, Tay J, Linsley PS, Baltimore D (2011) miR-146a is a significant brake on autoimmunity, myeloproliferation, and cancer in mice. J Exp Med 208: 1189-1201

Bullough P (2004) Orthopaedic Pathology, 4th edn.: Mosby/Elsevier.

Cabal-Hierro L, Lazo PS (2012) Signal transduction by tumor necrosis factor receptors. Cellular signalling

Caminero A, Comabella M, Montalban X (2011) Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), anti-TNF-alpha and demyelination revisited: an ongoing story. Journal of neuroimmunology 234: 1-6

Chan K (2000) The pre-ligand binding assembly domain: a potential target of inhibition of tumour necrosis factor receptor function. Annals of the rheumatic diseases 59(suppl): i50-53

Chassin C, Kocur M, Pott J, Duerr CU, Gutle D, Lotz M, Hornef MW (2010) miR-146a mediates protective innate immune tolerance in the neonate intestine. Cell host & microbe 8: 358-368

Chen X, Hamano R, Subleski JJ, Hurwitz AA, Howard OM, Oppenheim JJ (2010) Expression of costimulatory TNFR2 induces resistance of CD4+FoxP3- conventional T cells to suppression by CD4+FoxP3+ regulatory T cells. Journal of immunology 185: 174-182

Chen ZJ (2005) Ubiquitin signalling in the NF-kappaB pathway. Nature cell biology 7: 758-765

Clement SL, Scheckel C, Stoecklin G, Lykke-Andersen J (2011) Phosphorylation of tristetraprolin by MK2 impairs AU-rich element mRNA decay by preventing deadenylase recruitment. Molecular and cellular biology 31: 256-266

Conrath K, Wernery U, Muyldermans S, Nguyen VK (2003) Emergence and evolution of functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Developmental and comparative immunology 27: 87-103

Coppieters K, Dreier T, Silence K, de Haard H, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Van de Wiele C, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P (2006) Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. Arthritis and rheumatism 54: 1856-1866

Cortez-Retamozo V, Lauwereys M, Hassanzadeh Gh G, Gobert M, Conrath K, Muyldermans S, De Baetselier P, Revets H (2002) Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels. International journal of cancer Journal international du cancer 98: 456-462

Cortez MA, Nicoloso MS, Shimizu M, Rossi S, Gopisetty G, Molina JR, Carlotti C, Jr., Tirapelli D, Neder L, Brassesco MS, Scrideli CA, Tone LG, Georgescu MM, Zhang W, Puduvalli V, Calin GA (2010) miR-29b and miR-125a regulate podoplanin and suppress invasion in glioblastoma. Genes, chromosomes & cancer 49: 981-990


63

Cowden Dahl K, Dahl R, Kruichak J, Hudson L (2009) The epidermal growth factor receptor responsive miR-125a represses mesenchymal morphology in overian cancer cells. Neoplasia 11: 1208-1215

Cui Y, Su WY, Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, Shen ZY, Cao H, Lu YY, Fang JY (2011) MiR-29a inhibits cell proliferation and induces cell cycle arrest through the downregulation of p42.3 in human gastric cancer. PloS one 6: e25872

Curtale G, Citarella F, Carissimi C, Goldoni M, Carucci N, Fulci V, Franceschini D, Meloni F, Barnaba V, Macino G (2010) An emerging player in the adaptive immune response: microRNA-146a is a modulator of IL-2 expression and activation-induced cell death in T lymphocytes. Blood 115: 265-273

Ding DP, Chen ZL, Zhao XH, Wang JW, Sun J, Wang Z, Tan FW, Tan XG, Li BZ, Zhou F, Shao K, Li N, Qiu B, He J (2011) miR-29c induces cell cycle arrest in esophageal squamous cell carcinoma by modulating cyclin E expression. Carcinogenesis 32: 1025-1032

Dixon WG, Hyrich KL, Watson KD, Lunt M, Galloway J, Ustianowski A, Symmons DP (2010) Drug-specific risk of tuberculosis in patients with rheumatoid arthritis treated with anti-TNF therapy: results from the British Society for Rheumatology Biologics Register (BSRBR). Annals of the rheumatic diseases 69: 522-528

Dixon WG, Watson K, Lunt M, Hyrich KL, Silman AJ, Symmons DP (2006) Rates of serious infection, including site-specific and bacterial intracellular infection, in rheumatoid arthritis patients receiving anti-tumor necrosis factor therapy: results from the British Society for Rheumatology Biologics Register. Arthritis and rheumatism 54: 2368-2376

Dyment DA, Ebers GC, Dessa Sadovnick A (2004) Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology 3: 104-110

Ebach DR, Riehl TE, Stenson WF (2005) Opposing effects of tumor necrosis factor receptor 1 and 2 in sepsis due to cecal ligation and puncture. Shock (Augusta, Ga) 23: 311-318

Eck MJ, Sprang SR (1989) The structure of tumor necrosis factor-alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor binding. J Biol Chem 264: 17595-17605

Ellison D, Love S, Chimelli L, Harding B, Lowe J, Vinters H (2004) Neuropathology. Second Edition Mosby/Elsevier.

Flynn JL, Goldstein MM, Chan J, Triebold KJ, Pfeffer K, Lowenstein CJ, Schreiber R, Mak TW, Bloom BR (1995) Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity 2: 561-572

Flynt AS, Greimann JC, Chung WJ, Lima CD, Lai EC (2010) MicroRNA biogenesis via splicing and exosome-mediated trimming in Drosophila. Molecular cell 38: 900-907

Gambari R, Fabbri E, Borgatti M, Lampronti I, Finotti A, Brognara E, Bianchi N, Manicardi A, Marchelli R, Corradini R (2011) Targeting microRNAs involved in human diseases: a novel approach for modification of gene expression and drug development. Biochemical pharmacology 82: 1416-1429

Gebeshuber CA, Zatloukal K, Martinez J (2009) miR-29a suppresses tristetraprolin, which is a regulator of epithelial polarity and metastasis. EMBO reports 10: 400-405


64

Gerrits A, Walasek M, Olthof S, Weersing E, Ritsema M, Zwart E, Van Os R, Bystrykh L, de Haan G (2012) Genetic screen identifies microRNA cluster 99b/let-7/125a as a regulator of primitive hematopoietic cells. Blood 119: 377-387

Group TLMSSGaTUoBCMMA (1999) TNF neutralization in MS: results of a randomized, placebo-controlled multicenter study. . Neurology 53: 457-465

Guma M, Stepniak D, Shaked H, Spehlmann ME, Shenouda S, Cheroutre H, Vicente-Suarez I, Eckmann L, Kagnoff MF, Karin M (2011) Constitutive intestinal NF-kappaB does not trigger destructive inflammation unless accompanied by MAPK activation. The Journal of experimental medicine 208: 1889-1900

Han J, Lee Y, Yeom KH, Kim YK, Jin H, Kim VN (2004) The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev 18: 3016-3027

Hand NJ, Horner AM, Master ZR, Boateng LA, LeGuen C, Uvaydova M, Friedman JR (2012) MicroRNA profiling identifies miR-29 as a regulator of disease-associated pathways in experimental biliary atresia. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 54: 186-192

Harmsen MM, Van Solt CB, Fijten HP, Van Setten MC (2005) Prolonged in vivo residence times of llama single-domain antibody fragments in pigs by binding to porcine immunoglobulins. Vaccine 23: 4926-4934

Heyn H, Engelmann M, Schreek S, Ahrens P, Lehmann U, Kreipe H, Schlegelberger B, Beger C (2011) MicroRNA miR-335 is crucial for the BRCA1 regulatory cascade in breast cancer development. International journal of cancer Journal international du cancer 129: 2797-2806

Horiuchi T, Mitoma H, Harashima S, Tsukamoto H, Shimoda T (2010) Transmembrane TNF-alpha: structure, function and interaction with anti-TNF agents. Rheumatology 49: 1215-1228

Hua Z, Chun W, Fang-Yuan C (2011) MicroRNA-146a and hemopoietic disorders. International journal of hematology 94: 224-229

Iqbal U, Trojahn U, Albaghdadi H, Zhang J, O'Connor-McCourt M, Stanimirovic D, Tomanek B, Sutherland G, Abulrob A (2010) Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. British journal of pharmacology 160: 1016-1028

Jacobs M, Brown N, Allie N, Chetty K, Ryffel B (2000) Tumor necrosis factor receptor 2 plays a minor role for mycobacterial immunity. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology 68: 68-75

Jahnichen S, Blanchetot C, Maussang D, Gonzalez-Pajuelo M, Chow KY, Bosch L, De Vrieze S, Serruys B, Ulrichts H, Vandevelde W, Saunders M, De Haard HJ, Schols D, Leurs R, Vanlandschoot P, Verrips T, Smit MJ (2010) CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 20565-20570

Jiang L, Huang Q, Chang J, Wang E, Qiu X (2011) MicroRNA HSA-miR-125a-5p induces apoptosis by activating p53 in lung cancer cells. Experimental lung research 37: 387-398

Jones J, Stroud R, Quinn E, Black L, Barth J, Elefteriades J, Bavaria J, Gorman J, Gorman R, Spinale F, Ikonomidis J (2011) Selective microRNA suppression in human thoracic aneurysms. Circ Cardiovasc Genet: 605-603


65

Keffer J, Probert L, Cazlaris H, Georgopoulos S, Kaslaris E, Kioussis D, Kollias G (1991) Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. The EMBO journal 10: 4025-4031

Kim DJ, Linnstaedt S, Palma J, Park JC, Ntrivalas E, Kwak-Kim JY, Gilman-Sachs A, Beaman K, Hastings ML, Martin JN, Duelli DM (2012) Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. The Journal of molecular diagnostics : JMD 14: 71-80

Kim EY, Priatel JJ, Teh SJ, Teh HS (2006) TNF receptor type 2 (p75) functions as a costimulator for antigen-driven T cell responses in vivo. Journal of immunology 176: 1026-1035

Kim YK, Kim VN (2007) Processing of intronic microRNAs. EMBO 26: 775-783

Kirchhofer A, Helma J, Schmidthals K, Frauer C, Cui S, Karcher A, Pellis M, Muyldermans S, Casas-Delucchi CS, Cardoso MC, Leonhardt H, Hopfner KP, Rothbauer U (2010) Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nature structural & molecular biology 17: 133-138

Klooster R, Eman MR, le Duc Q, Verheesen P, Verrips CT, Roovers RC, Post JA (2009) Selection and characterization of KDEL-specific VHH antibody fragments and their application in the study of ER resident protein expression. Journal of immunological methods 342: 1-12

Kobayashi K, Takahashi N, Jimi E, Udagawa N, Takami M, Kotake S, Nakagawa N, Kinosaki M, Yamaguchi K, Shima N, Yasuda H, Morinaga T, Higashio K, Martin TJ, Suda T (2000) Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. The Journal of experimental medicine 191: 275-286

Kontoyiannis D, Pasparakis M, Pizarro T, Cominelli F, Kollias G (1999) Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-Rich Elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity 10: 387-398

Kuusisto H, Kaprio J, Kinnunen E, Luukkaala T, Koskenvuo M, Elovaara I (2008) Concordance and heritability of multiple sclerosis in Finland: study on a nationwide series of twins. European journal of neurology : the official journal of the European Federation of Neurological Societies 15: 1106-1110

Lauwereys M, Ghahroudi M, Desmyter A, Kinne J, Hölzer W, De Genst E, Wyns L, Muyldermans S (1998) Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain antibodies. EMBO 17: 3512-3520

Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek S, Kim VN (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO 23: 4051-4060

Levy C, Khaled M, Iliopoulos D, Janas MM, Schubert S, Pinner S, Chen PH, Li S, Fletcher AL, Yokoyama S, Scott KL, Garraway LA, Song JS, Granter SR, Turley SJ, Fisher DE, Novina CD (2010) Intronic miR-211 assumes the tumor suppressive function of its host gene in melanoma. Molecular cell 40: 841-849

Li X, Feng R, Huang C, Wang H, Wang J, Zhang Z, Yan H, Wen T (2012) MicroRNA-351 regulates TMEM 59 (DCF1) expression and mediates neural stem cell morphogenesis. RNA biology 9

Lin RJ, Lin YC, Yu AL (2010) miR-149* induces apoptosis by inhibiting Akt1 and E2F1 in human cancer cells. Molecular carcinogenesis 49: 719-727


66

Lin S-L, Chang D, Wu D-Y, Ying S-Y (2003) A novel RNA splicing-mediated gene silencing mechanism potential for genome evolution. Biochemical and Biophysical Research Communications 310: 754-760

Liu J, Carmell MA, Rivas FV, Marsden CG, Thomson JM, Song JJ, Hammond SM, Joshua-Tor L, Hannon GJ (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305: 1437-1441

Long J, Wang Y, Wang W, Chang BH, Danesh FR (2011) MicroRNA-29c is a signature microRNA under high glucose conditions that targets Sprouty homolog 1, and its in vivo knockdown prevents progression of diabetic nephropathy. J Biol Chem 286: 11837-11848

Louis D, Frosch M, Mena H, Rushing E, Judkins A (2009) Non-Neoplastic Diseases of the Central Nervous System., Vol. 8, Washington DC: American Registry of Pathology in collaboration with Armed Forces Institute of Pathology

Lu LF, Boldin MP, Chaudhry A, Lin LL, Taganov KD, Hanada T, Yoshimura A, Baltimore D, Rudensky AY (2010) Function of miR-146a in controlling Treg cell-mediated regulation of Th1 responses. Cell 142: 914-929

MacGregor AJ, Snieder H, Rigby AS, Koskenvuo M, Kaprio J, Aho K, Silman AJ (2000) Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins. Arthritis and rheumatism 43: 30-37

Macrae IJ, Zhou K, Li F, Repic A, Brooks AN, Cande WZ, Adams PD, Doudna JA (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195-198

Mahieu T, Park JM, Revets H, Pasche B, Lengeling A, Staelens J, Wullaert A, Vanlaere I, Hochepied T, van Roy F, Karin M, Libert C (2006) The wild-derived inbred mouse strain SPRET/Ei is resistant to LPS and defective in IFN-beta production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 2292-2297

Matsumoto M, Fu YX, Molina H, Chaplin DD (1997) Lymphotoxin-alpha-deficient and TNF receptor-I-deficient mice define developmental and functional characteristics of germinal centers. Immunol Rev 156: 137-144

Mayer L (2010) Evolving paradigms in the pathogenesis of IBD. Journal of gastroenterology 45: 9-16

McDonald W, Hartung H-P, Polman C, Sibley W, Lublin F, Thompson A, Compston A, Reingold S, Edan G, McFarland H, van den Noort S, Wolinsky J, Goodkin D, Paty D, Sandberg-Wollheim M, Weinshenker B (2001) International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis. Ann Neurol 50: 121-127

Meister G, Landthaler M, Patkaniowska A, Dorsett Y, Teng G, Tuschl T (2004) Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell 15: 185-197

Mohan N, Edwards ET, Cupps TR, Oliverio PJ, Sandberg G, Crayton H, Richert JR, Siegel JN (2001) Demyelination occurring during anti-tumor necrosis factor alpha therapy for inflammatory arthritides. Arthritis and rheumatism 44: 2862-2869

Muramatsu F, Kidoya H, Naito H, Sakimoto S, Takakura N (2012) microRNA-125b inhibits tube formation of blood vessels through translational suppression of VE-cadherin. Oncogene

Murphy K, Travers P, Walport M (2007) Janeway's Immunobiology, 7 edn.


67

Muyldermans S, Lauwereys M (1999) Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies. Journal of molecular recognition 12: 131-140

Nadkarni S, Mauri C, Ehrenstein MR (2007) Anti-TNF-alpha therapy induces a distinct regulatory T cell population in patients with rheumatoid arthritis via TGF-beta. The Journal of experimental medicine 204: 33-39

Nenci A, Becker C, Wullaert A, Gareus R, van Loo G, Danese S, Huth M, Nikolaev A, Neufert C, Madison B, Gumucio D, Neurath MF, Pasparakis M (2007) Epithelial NEMO links innate immunity to chronic intestinal inflammation. Nature 446: 557-561

Nguyen T, Kuo C, Nicholl MB, Sim M-S, Turner RR, Morton DL, Hoon DSB (2011) Downregulation of microRNA-29c is associated with hypermethylation of tumor-related genes and disease outcome in cutaneous melanoma. Epigenetics 6: 388-394

Noffsinger A, Fenoglio-Preiser C, Maru D, Gilinsky N (2007) Gastrointestinal Diseases, Vol. 5, Washington DC: American Registry of Pathology in collaboration with Armed Forces Institute of Pathology.

Notley CA, Inglis JJ, Alzabin S, McCann FE, McNamee KE, Williams RO (2008) Blockade of tumor necrosis factor in collagen-induced arthritis reveals a novel immunoregulatory pathway for Th1 and Th17 cells. The Journal of experimental medicine 205: 2491-2497

O'Malley W, Betty Achinstein, Murray JS (1963) Action of Bacterial Polysaccharide on Tumors III: Repeated response of Sarcoma 37, in tolerant mice, to Serratia marcescens endotoxin. Cancer Research 23: 890-895

Ooi AG, Sahoo D, Adorno M, Wang Y, Weissman IL, Park CY (2010) MicroRNA-125b expands hematopoietic stem cells and enriches for the lymphoid-balanced and lymphoid-biased subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107: 21505-21510

Orholm M, Binder V, Sorensen TI, Rasmussen LP, Kyvik KO (2000) Concordance of inflammatory bowel disease among Danish twins. Results of a nationwide study. Scandinavian journal of gastroenterology 35: 1075-1081

Perruchini C, Pecorari F, Bourgeois JP, Duyckaerts C, Rougeon F, Lafaye P (2009) Llama VHH antibody fragments against GFAP: better diffusion in fixed tissues than classical monoclonal antibodies. Acta neuropathologica 118: 685-695

Ramos-Casals M, Brito-Zeron P, Munoz S, Soria N, Galiana D, Bertolaccini L, Cuadrado MJ, Khamashta MA (2007) Autoimmune diseases induced by TNF-targeted therapies: analysis of 233 cases. Medicine 86: 242-251

Rindfleisch J, Muller D (2005) Diagnosis and Management of Rheumatoid Arthritis. American Academy of Family Physicians 72: 1037-1047

Roovers RC, Laeremans T, Huang L, De Taeye S, Verkleij AJ, Revets H, de Haard HJ, van Bergen en Henegouwen PM (2007) Efficient inhibition of EGFR signaling and of tumour growth by antagonistic anti-EFGR Nanobodies. Cancer immunology, immunotherapy : CII 56: 303-317


68

Roovers RC, Vosjan MJ, Laeremans T, El Khoulati R, de Bruin RC, Ferguson KM, Verkleij AJ, van Dongen GA, van Bergen En Henegouwen PM (2011) A biparatopic anti-EGFR nanobody efficiently inhibits solid tumour growth. International journal of cancer Journal international du cancer

Roulis M, Armaka M, Manoloukos M, Apostolaki M, Kollias G (2011) Intestinal epithelial cells as producers but not targets of chronic TNF suffice to cause murine Crohn-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108: 5396-5401

Rutgeerts P, Vermeire S, Van Assche G (2009) Biological therapies for inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 136: 1182-1197

Saba R, Gushue S, Huzarewich RL, Manguiat K, Medina S, Robertson C, Booth SA (2012) MicroRNA 146a (miR-146a) Is Over-Expressed during Prion Disease and Modulates the Innate Immune Response and the Microglial Activation State. PloS one 7: e30832

Salmon-Ceron D, Tubach F, Lortholary O, Chosidow O, Bretagne S, Nicolas N, Cuillerier E, Fautrel B, Michelet C, Morel J, Puechal X, Wendling D, Lemann M, Ravaud P, Mariette X (2011) Drug-specific risk of non-tuberculosis opportunistic infections in patients receiving anti-TNF therapy reported to the 3-year prospective French RATIO registry. Annals of the rheumatic diseases 70: 616-623

Schneider DJ, Seibold I, Saxer-Sekulic N, Paredes BE, Saurer L, Mueller C (2009) Lack of TNFR2 expression by CD4(+) T cells exacerbates experimental colitis. European journal of immunology 39: 1743-1753

Schur P (2011) Epidemiology, risk factors for, and possible causes of rheumatoid arthritis. UpToDate

Sengupta S, den Boon JA, Chen IH, Newton MA, Stanhope SA, Cheng YJ, Chen CJ, Hildesheim A, Sugden B, Ahlquist P (2008) MicroRNA 29c is down-regulated in nasopharyngeal carcinomas, up-regulating mRNAs encoding extracellular matrix proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 5874-5878

Smith BJ, Popplewell A, Athwal D, Chapman AP, Heywood S, West SM, Carrington B, Nesbitt A, Lawson AD, Antoniw P, Eddelston A, Suitters A (2001) Prolonged in vivo residence times of antibody fragments associated with albumin. Bioconjugate chemistry 12: 750-756

Smits M, Wurdinger T, van Het Hof B, Drexhage JA, Geerts D, Wesseling P, Noske DP, Vandertop WP, de Vries HE, Reijerkerk A (2012) Myc-associated zinc finger protein (MAZ) is regulated by miR-125b and mediates VEGF-induced angiogenesis in glioblastoma. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology

Staelens J, Wielockx B, Puimege L, Van Roy F, Guenet JL, Libert C (2002) Hyporesponsiveness of SPRET/Ei mice to lethal shock induced by tumor necrosis factor and implications for a TNF-based antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 9340-9345

Steiner G, Studnicka-Benke A, Witzmann G, Hofler E, Smolen J (1995) Soluble receptors for tumor necrosis factor and interleukin-2 in serum and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis, reactive arthritis and osteoarthritis. The Journal of rheumatology 22: 406-412

Taylor PC (2010) Pharmacology of TNF blockade in rheumatoid arthritis and other chronic inflammatory diseases. Current opinion in pharmacology 10: 308-315


69

Thalayasingam N, Isaacs JD (2011) Anti-TNF therapy. Best practice & research Clinical rheumatology 25: 549-567

Tiegs G, Hentschel J, Wendel A (1992) A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A. The Journal of clinical investigation 90: 196-203

Tili E, Michaille J-J, Cimino A, Costinean S, Dumitru CD, Adair B, Fabbri M, Alder H, Liu CG, Calin GA, Croce CM (2007) Modulatio of miR-155 and miR-125b levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stiulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock. Journal of immunology 179: 5082-5089

Toussirot E, Roudier J (2008) Epstein-Barr virus in autoimmune diseases. Best practice & research Clinical rheumatology 22: 883-896

Tsakiri N, Papadopoulos D, Denis MC, Mitsikostas DD, Kollias G (2012) TNFR2 on non-haematopoietic cells is required for Foxp3+ Treg-cell function and disease suppression in EAE. European journal of immunology 42: 403-412

Tserel L, Runnel T, Kisand K, Pihlap M, Bakhoff L, Kolde R, Peterson H, Vilo J, Peterson P, Rebane A (2011) MicroRNA expression profiles of human blood monocyte-derived dendritic cells and macrophages reveal miR-511 as putative positive regulator of Toll-like receptor 4. J Biol Chem 286: 26487-26495

Van Hauwermeiren F (2011-2012) New strategies to prevent TNF-induced toxicity in TNF/IFN gamma-based anti-tumor models. Thesis

van Oosten BW, Barkhof F, Truyen L, Boringa JB, Bertelsmann FW, von Blomberg BM, Woody JN, Hartung HP, Polman CH (1996) Increased MRI activity and immune activation in two multiple sclerosis patients treated with the monoclonal anti-tumor necrosis factor antibody cA2. Neurology 47: 1531-1534

Vandenbroucke K, de Haard H, Beirnaert E, Dreier T, Lauwereys M, Huyck L, Van Huysse J, Demetter P, Steidler L, Remaut E, Cuvelier C, Rottiers P (2010) Orally administered L. lactis secreting an anti-TNF Nanobody demonstrate efficacy in chronic colitis. Mucosal immunology 3: 49-56

Verrier JD, Lau P, Hudson L, Murashov AK, Renne R, Notterpek L (2009) Peripheral myelin protein 22 is regulated post-transcriptionally by miRNA-29a. Glia 57: 1265-1279

Wilkinson P, Jeremy R, Brooks FP, Hollander JL (1965) THE MECHANISM OF HYPOALBUMINEMIA IN RHEUMATOID ARTHRITIS. Annals of internal medicine 63: 109-114

Wolfe F, Michaud K (2004) Lymphoma in rheumatoid arthritis: the effect of methotrexate and anti-tumor necrosis factor therapy in 18,572 patients. Arthritis and rheumatism 50: 1740-1751

Wunder A, Müller-Ladner U, Stelzer E, Funk J, Neumann E, Stehle G, Pap T, Sinn H, Gay S, Fiehn C (2003) Therapeutic Approach for Rheumatoid Albumin-Based Drug Delivery as Novel Arthritis. The Journal of Immunology 170: 4793-4801

Xu Y, Zhao F, Wang Z, Song Y, Luo Y, Zhang X, Jiang L, Sun Z, Miao Z, Xu H (2012) MicroRNA-335 acts as a metastasis suppressor in gastric cancer by targeting Bcl-w and specificity protein 1. Oncogene 31: 1398-1407


70

Yi R, Qin Y, Macara IG, Cullen BR (2003) Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17: 3011-3016

Zhang YH, Heulsmann A, Tondravi MM, Mukherjee A, Abu-Amer Y (2001) Tumor necrosis factor-alpha (TNF) stimulates RANKL-induced osteoclastogenesis via coupling of TNF type 1 receptor and RANK signaling pathways. The Journal of biological chemistry 276: 563-568

Zhao A, Zeng Q, Xie X, Zhou J, Yue W, Li Y, Pei X (2012) MicroRNA-125b induces cancer cell apoptosis through suppression of Bcl-2 expression. Journal of genetics and genomics = Yi chuan xue bao 39: 29-35

Hoofdstuk 7: Bijlagen

71

7. Bijlagen

7.1 Nanobody sequenties

* 20 * 40 * 60 * 80 *

4MTNFR86 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA : 95

4MTNFR7 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA : 95

4MTNFR10 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA : 95

4MTNFR64 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCCAAAATAGTAA : 95

4MTNFR62 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA : 95

4MTNFR1 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAACCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTAGTGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGATA : 95

4MTNFR15 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGACACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA : 95

4MTNFR3 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTTTGGACGCACCTTCAGTACGTA : 95

4MTNFR25 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTTTGGACGCACCTTCAGTACGTA : 95

4MTNFR29 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA : 95

4MTNFR42 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTA : 95

4MTNFR81 : CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGTGGCGCCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCCGCCTCTGGACGCACCTTCTTTATCTA : 95

100 * 120 * 140 * 160 * 180 *

4MTNFR86 : TGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGCTGGTTGCAGCTATTACCTGGAGTGGAGGTAGTACATATTATACAGACTCCG : 190




4MTNFR62 : TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGGCGGAGCGTGAGTTTGTTGCAGCTATCAGCAGGAGTGGTGGTGTCACATACTATGCAGACTCCG : 190

4MTNFR1 : TTCTATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAAATTGTGGCAGCTATTAGTCGGAGAAGTAGCGCCGTATTCTATGCAAACTTCG : 190

4MTNFR15 : TGCCACGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAAATTGTGGCAGCTATTATTCGGAGAAGTAGCACCGTATTCTATGCAAACTTCG : 190

4MTNFR3 : TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTCGCAGCTATTAGCAGGAATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCG : 190

4MTNFR25 : TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTCGCAGCTATTAGCAGGAATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCCG : 190

4MTNFR29 : TGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTGGCCGGAGTGGTGGTAGTACATACTATGCAGACTCCG : 190

4MTNFR42 : TGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTAGCTGGAGGGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCG : 190

4MTNFR81 : TGCCGCGGGCTGGTTCCCCCCCGCTCCCCGGAAAGAGCGTGAGTTTGTATCACCTATTATCTGGAGGGGGGTGATCACATACTATGCGCACTCCG : 190

200 * 220 * 240 * 260 * 280

4MTNFR86 : TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGTCAAGAAGATACTGTATCTGCAAATGAACTTCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTAC : 285

4MTNFR7 : TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGTCAAGAAGATACTGTATCTGCAAATGAACTTCCTGAAACCTGAGGACACGGCCACATATTAC : 285

4MTNFR10 : TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGTCAAGAAGATACTGTATCTGCAAATGAACGACCTGAAACCTGAAGACACGGCCGTCTATTAC : 285

4MTNFR64 : TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTAC : 285

4MTNFR62 : TGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATACCAAGAACACCATGTATCTACAAATGAGCAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTATATTAC : 285

4MTNFR1 : CGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGACAAGAACACGGTAATTCTGCAAATGGACAAACTGAAACCTGAGGATACGGCCATCTATTAT : 285

4MTNFR15 : CGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCTCATGAGTAACCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC : 285

4MTNFR3 : TGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCAGATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC : 285

4MTNFR25 : TGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGACACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCATATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC : 285

4MTNFR29 : TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAGATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC : 285

4MTNFR42 : TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTTCAGATGAGTAGCCTGAAAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC : 285

4MTNFR81 : CGAAGGGGCGATTCTCCATCTCCCCAGACAACACCGAGAACACGGTATATCTTCACATGAGTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTCTACTAC : 285

* 300 * 320 * 340 * 360 * 380

4MTNFR86 : TGTAATTACCGA----------------GACA-AT----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 359

4MTNFR7 : TGTAAC-GTAGA----------------TTCATAT----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 359

4MTNFR10 : TGTAAT-ATAGA----------------CTCATAC----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 359

4MTNFR64 : TGTAATGGCGGAAGAGGTGGGAACCCGCCCTATATCATCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 380

4MTNFR62 : TGTAACGTGAGG----------------GGTA-AC----TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 359

4MTNFR1 : TGTAAC-GTAGAC--------------TCGAAT------TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 359

4MTNFR15 : TGTAAT-GCTAATAC--------CCCACCGAATGGGGCCTGGGGCCAGGGGACCCAAGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCGGTACGAAGTTCC : 371

4MTNFR3 : TGTAAT-GCTAATAC--------CCAACCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 371




4MTNFR81 : TGTGAT-GCTAATAC--------CCACCCGAATGGGTCCTGGGGCCAGGGGACCCCTGTCACCGTGTCCCCCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCC : 371

* 400 * 420

4MTNFR86 : GGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG--------------- : 384






4MTNFR15 : GGACTACTGTTCCGGGCCAGCATACACTGTTAAAAGCTGA : 411


4MTNFR25 : GGACTACGGTTCCGGCCGATCGTAG--------------- : 396



4MTNFR81 : AGACTACAGTTCCGGCCGAACATAG--------------- : 396

Figuur 24: Nanobody sequenties: De figuur toont de alignering van de sequenties van de 12 Nanobodies, gericht tegen muis Tumor Necrosis Factor Receptor 1. De gaps zijn toegevoegd om de sequenties te kunnen aligneren.


72

7.2 Nanobody sequentie-analyse

7.2.1 Nanobody 10

Figuur 25: Sequentie-analyse Nanobody 10: De figuur toont de bekomen sequentie na analyse en vergelijkt deze met de correcte sequentie. Universal forward en Universal Reversed zijn de sequenties bekomen na sequeneren met respectievelijk de Universal forward primer en de Universal Reversed primer. 4MTNFR10 toont de correcte sequentie.


73

7.2.2 Nanobody 15



74

7.2.3 Nanobody 42



75

7.2.4 Nanobody 62



76

7.2.5 Nanobody 64

Figuur 29: Sequentie-analyse Nanobody 64: De figuur toont de bekomen sequentie na analyse en vergelijkt deze met de correcte sequentie. Universal Reversed is de sequentie die bekomen is na sequeneren met de Universal Reversed primer. 4MTNFR64 toont de correcte sequentie.


77

7.2.6 Nanobody 86



78

7.3 Coomassie kleuring Nanobody fracties

Figuur 31: Coomassie kleuring Nanobody fracties: Uit de expressiecultuur werd 1 ml afgezonderd. Van dit staal werden het cultuurmedium, de periplasmatische fractie en de cellulaire restfractie afgezonderd. De eiwitten werden geïsoleerd en gescheiden via SDS-PAGE, samen met de ‘Precision Plus Protein’ ladder (kDa). Afkortingen: S2: eiwitten neergeslagen uit periplasmatische fractie; P2: eiwitten geïsoleerd uit de cellulaire restfractie; S1: eiwitten neergeslagen uit het cultuurmedium; 86.1, 15.5 en 42.4: Nanobodies.


79

7.4 miRNA predictieprogramma’s

Bronnen miRNA predictieprogramma’s: http://mirdb.org/miRDB/ http://www.microrna.org/microrna/home.do http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/ http://www.mirnabodymap.org/ http://mirtar.mbc.nctu.edu.tw/human/ http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/ http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_dyn_data.html http://pictar.mdc-berlin.de/ http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/ http://www.targetscan.org/mmu_50/ http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/

Tabel 10: miRNA predictieprogramma’s: De tabel toont de verschillende gebruikte miRNA predictieprogramma’s. De kolommen tonen de verschillende methodes waarop deze predictieprogramma’s gebaseerd zijn. Bronnen: zie onderaan de pagina.


80

7.5 Productenlijst

In Tabel 11 worden de gebruikte producten opgelijst.

Product Merk

Aceton Fiers N.V.

Acrylamide 40% Biosolve

Agarose Invitrogen

Ampicilline (100 µg/ml) A-9518 Sigma

Anti-mTNFR1 R&D systems

Anti-muis 680 nm Li-Cor

Anti-muis IgG-HRP VWR International

APS ICN

ATP GE healthcare

Azijnzuur Chem-Lab

Bactoagar BD Biosciences

Bactotryptone BD Biosciences

Bactoyeast BD Biosciences

Beta-mercaptoethanol Sigma

Broomfenolblauw Sigma

BSA Sigma

BstEII Promega

Buffer D Promega

Buffer H Promega

CDTA Sigma

Cell strainer BD Falcon

CHAPS Sigma

Chloroform Invitrogen

CoA ICN

COMPLETE Roche

Coomassie Briljant Blue Merck

Dc protein assay kit Bio-Rad

Dextrose Sigma

Dialysecassette Pierce

Dissociatiebuffer Sigma

DMEM Gibco

DMSO Sigma

DTT Calbiochem

Duoset ELISA development system R&D systems

dXTP Gibco

EDTA-trypsine Gibco

Elektroporatiekuvet Equibio

Ethanol Merck

FCS Sigma

Fenol Invitrogen

Filterpapier Protan whatman

Glacial acetic acid Merck

Glu Biowhittaker

Glucose Sigma

Glycerol Biosolve

Glycine Merck

H2SO4 Merck

IMAC-kolomopzuivering GE healthcare

Imidazole Sigma

IPTG ImmunoSource

Isopropanol Sigma

K2HPO4 Vel

Kac Normapur

KCl Merck

KH2PO4 Vel

L-Gln eigen aanmaak TC

LiCl Merck

Lipofectamine Invitrogen

LTX Invitrogen

Luciferine Duchefa

Lysozyme 0,1% Santa Cruz

Maxisorp plates Nunc

MC1061 cellen VIB Nanobody Core Facility

C57BL/6-MEF eigen aanmaak

MEF-Spretus eigen aanmaak

MEF-WT eigen aanmaak

Methanol Merck

MgCl2 Promega

(MgCO3)4Mg(OH)2.H2O Sigma

MgSO4 Sigma

Mini plasmid kit Qiagen

mTNF DMBR PSF-core

Muis anti-His IgG AbD Serotec

Na2HPO4.12H2O Sigma

NaAc Vel

NaCl Merck

NaOH Merck

NaPO4 Merck

Na-pyruvaat Sigma


81

NEAA Gibco

Nitrocellulosemembraan Schleicher & Schuell

NotI Promega

Nucleospin PCR and gel DNA clean-up Clontech

OPTIMEM Gibco

Penicilline/Streptomycine Sigma

Pancreatic Rnase A Qiagen

PBS Gibco

PCR buffer Promega

pHen6c vector VIB Nanobody Core Facility

Plasmid purification mini-kit Qiagen

Precision Plus Protein ladder Bio-Rad

Primer Universal Forward Invitrogen

Primer Universal Reversed Invitrogen

Primer pEZX-MR04 reversed Invitrogen

Primer pEZX-MR04 forward Invitrogen

Primer 38 Invitrogen

Primer A6E Invitrogen

Proteinase K Merck

PstI Promega

Raw blue cellen Invivogen

Recombinant TNFR1 R&D systems

RNAiMAX Invitrogen

Scanner Western blot Odyssey Infrared Imaging System

SDS Sigma

Smartladder SF Fermentas

Sucrose Sigma

Sybr safe (10000x in DMSO) Invitrogen

T4 ligase Promega

T4 ligase buffer Promega

Taq DNA polymerase Invitrogen

Temed Bio-Rad

TMB substraat reagent set BD OptEIA

TriChloro Acid Sigma

Tricine Sigma

Tris-HCl Sigma

Trypan blue ICN

Tween-20 Sigma

WK6 cellen VIB Nanobody Core Facility

Tabel 11: Productenlijst: In bovenstaande tabel staan de gebruikte producten en hun merken opgelijst.


82

7.6 Protocols

7.6.1 Nanobodies

Herklonering -Amplicifieer het Nanobody gen via PCR 10 µl template DNA (20 ng/µl) 2,5 µl 10x PCR buffer 0,5 µl 10 mM dXTPs 0,5 µl 10 µM primer A6E 0,5 µl 10 µM primer 38 0,75 µl 50 mM MgCl2

0,1 µl 5 U/µl Taq DNA polymerase 0,1 µl 5 U/µl Pfu DNA polymerase 10,05 µl BIDI -PCR-reactie 94°C 5 min 94°C 30 s 55°C 30 s 72°C 1 min Stap 2 tot 4 : 35x 72°C 5 min -Laad 2 µl staal + 8 µl BIDI + 2 µl ladingsbuffer samen met de ‘Small Fragments’ ladder op een 2% agarosegel met 10 µl/ 100 ml 10.000 U Sybr Safe -Laat de gel lopen op 100 V gedurende 40 min in 1x TBE buffer -Zuiver het PCR product op met de ‘Nucleospin Gel and PCR extract II kit’

-Voeg 2 volumes NT1 buffer toe -Laad het staal op de Nucleospin kolom -Centrifugeer 1 min bij 11000 g -Was 2x met 700 µl NT3 buffer en centrifugeer telkens gedurende 1 min bij 11000 g -Giet de ‘flow-through’ weg en centrifugeer een extra min bij 11000 g -Elueer het DNA in 20 µl BIDI

-Meet de DNA concentratie met de Nanodrop -Voer een restrictiedigest uit op het Nanobody DNA en de pHen6c vector. 1 µg DNA 5 µl 10x buffer H 0,5 µl 10 mg/ml BSA 2,5 µl 10 U/µl PstI X µl BIDI (aanlengen tot 50 µl) -Incubeer gedurende 4 u bij 37°C -Zuiver het DNA op met de ‘Nucleospin Gel and PCR extract II kit’ -Voer een restrictiedigest uit op het Nanobody DNA en de pHen6c vector. 1 µg DNA 5 µl 10x buffer D


83

0,5 µl 10 mg/ml BSA 2,5 µl 10 U/µl BstEII X µl BIDI (aanlengen tot 50 µl) -Incubeer gedurende 4 u bij 50°C -Zuiver het DNA op met de ‘Nucleospin Gel and PCR extract II kit’ -Ligeer het Nanobody gen in de pHen6c vector 2 µl 10x T4 ligase buffer 1 µl T4 ligase 269 ng pHen6c vector 84,6 ng Nanobody insert -Incubeer overnacht op kamertemperatuur -Transformeer elektrocompetente WK6 cellen met 5 µl ligatiemix Ontdooi 50 µl elektrocompetente WK6 cellen op ijs Voeg 5 µl DNA oplossing toe 1 min op ijs Breng over in een elektroporatiekuvet en plaats deze in het toestel Elektroporeer bij 25 mF; 2,5 kV Voeg 1 ml SOC medium toe Incubeer gedurende 1 u bij 37°C -Plaat 200 µl uit op LB-agar met 1% ampicilline (100 µg/ml) -Incubeer overnacht bij 37°C -Screen positieve kolonies met kolonie-PCR Pik een kolonie op en breng deze in 10 µl BIDI en vervolgens op een streepplaat 10 µl Template DNA 2,5 µl 10x PCR buffer 0,5 µl 10 mM dXTPs 0,5 µl 10 µM primer Universal Forward 0,5 µl 10 µM primer Universal Reversed 0,75 µl 50 mM MgCl2 0,1 µl 5 U/µl Taq DNA polymerase 10,15 µl BIDI -PCR-reactie 94°C 10 min 94°C 5 min 94°C 30 s 55°C 30 s 72°C 1 min Stap 2 tot 4 : 34x 72°C 5 min -Voeg 12,5 µl staal samen met 2,5 µl 6x ladingsbuffer -Laad de stalen en de ‘Small Fragments’ ladder (Fermentas) op een 2% agarosegel met 10 µl/100 ml 10.000 U Sybr Safe -Laat de gel lopen bij 100 V gedurende 40 min in 1x TBE buffer -Groei 1 kolonie op in 3 ml LB medium met 100 µg/µl ampicilline -Incubeer overnacht bij 37°C en 200 rpm


84

-Isoleer de plasmiden met de ‘Plasmid Mini Kit’ van Qiagen -Centrifugeer 15 min bij 6000 rpm bij 4°C -Los de pellet op in 300 µl P1 -Voeg 300 µl P2 toe, inverteer 4-6x en incubeer 5 min bij kamertemperatuur -Voeg 300 µl koude P3 toe, inverteer 4-6x en incubeer 5 min op ijs -Centrifugeer 10 min bij 14.000 rpm, neem het supernatans af -Equilibreer een QIAGEN-tip 20 kolom met 1 ml QBT buffer -Breng het supernatans op de kolom -Was de kolom met 2x 2 ml QC buffer -Elueer het DNA in 800 µl QF buffer -Precipiteer het DNA door 560 µl isopropanol toe te voegen en mix -Centrifugeer 30 min bij 10000 rpm, giet het supernatans voorzichtig weg -Was de pellet met 1 ml 70% ethanol -Centrifugeer 10 min bij 10000 rpm, giet het supernatans voorzichtig weg -Laat de pellet drogen aan de lucht -Los de pellet opnieuw op in 20 µl BIDI -Verdun het plasmide naar een concentratie van 50 ng/µl -Verdun de primers naar een concentratie van 1 nmol/µl -Stuur de plasmiden en primers op naar de VIB Genetic Service Facility (Antwerpen) -Voer een sequentie-analyse uit Expressie en opzuivering Nanobodies -Voer een uitdunningsenting uit op LB-agar met 1% ampicilline en 1% glucose -Incubeer overnacht bij 37°C -Inoculeer een enkele kolonie in 15 ml LB medium met 1% ampicilline en 1% glucose -Incubeer de precultuur bij 37°C en 200 rpm gedurende 6 u -Voeg 3 ml precultuur toe aan 500 ml TB met 1% ampicilline, 2 mM MgCl2 en 0,1% glucose -Herhaal dit zodat in totaal 1 liter cultuur bekomen wordt -Incubeer bij 37°C en 200 rpm tot een OD600 van 0,6-0,9 bekomen wordt -Voeg 1 mM IPTG toe en incubeer bij 28°C en 200 rpm gedurende 20u (OD600= 25-30) -Neem 1 ml cultuur als staal Centrifugeer het staal gedurende 1 min bij 14.000 rpm Precipiteer het supernatans met 250 µl 100% TCA en incubeer 10 min op ijs Centrifugeer voor 5 min bij 14.000 rpm Was de pellet met 200 µl koude aceton Centrifugeer voor 5 min bij 14.000 rpm Droog de pellet en los op in 5 µl ladingsbuffer (S1) Los de pellet op in 1 ml koude buffer A en incubeer 10 min op ijs Centrifugeer 1 min bij 14.000 rpm Verwijder het supernatans Los de pellet op in 1 ml koude buffer B en incubeer 10 min op ijs Centrifugeer 1 min bij 14.000 rpm Precipiteer het supernatans met 250 µl 100% TCA Incubeer 10 min op ijs


85

Centrifugeer 5 min bij 14.000 rpm Was de pellet met 200 µl koude aceton Centrifugeer 5 min bij 14.000 rpm Droog de pellet en los op in 5 µl ladingsbuffer (S2) Los de pellet op in 200 µl lysebuffer Incubeer 5 min op kamertemperatuur Verwijder de cellulaire debris door 2 min centrifugatie bij 14.000 rpm Voeg 20 µl supernatans samen met 5 µl ladingsbuffer (P2) -Kook het supernatans uit S1, S2 en de pellet uit P2 voor 5 min bij 95°C -Laad de stalen op twee 15% polyacrylamidegels -Plaats de gels in een elektroforesetoestel en vul het met 1x EB -Loop de gel gedurende 20 min bij 100 V en gedurende 1 u bij 120 V

Kleur één gel overnacht met 1x Coomassie in Destain bij kamertemperatuur Ontkleur de volgende dag de gel door te wassen in Destain Verpak en droog de gel in cellofaan met 20% methanol Blot één gel gedurende 1 u bij 50 mA op een nitrocellulosemembraan Blokkeer het membraan overnacht met 2% BSA in TBS bij 4°C Breng het primair antilichaam op het membraan en incubeer 1 u bij

kamertemperatuur Was het membraan 3x met TBS-T gedurende 5 min Breng het secundair antilichaam op het membraan, incubeer 1 u bij

kamertemperatuur Was 3x met TBS-T, 3x met TBS en 3x met BIDI gedurende 5 min. Scan het membraan met het Odyssey Infrared Imaging toestel bij 680 nm

-Centrifugeer de cultuur gedurende 8 min bij 8000 rpm op 14°C -Los de pellet van 1 liter cultuur op in 12 ml TS en schud op ijs gedurende 1 u -Voeg 18 ml TS/4 toe en schud overnacht op ijs -Centrifugeer het periplasmatisch extract gedurende 30 min en 8000 rpm bij 4°C -Breng het supernatans over doorheen een cell strainer over naar een nieuwe tube -Zuiver de Nanobodies op met de His-GraviTrap kit (GE Healthcare)

-Snij de tip van de kolom af en laat de vloeistof doorlopen -Equilibreer de kolom met 10 ml IMAC bindingsbuffer -Breng het supernatans op de kolom -Was de kolom met 10 ml IMAC bindingsbuffer -Elueer de kolom met 2 x 3 ml IMAC elutiebuffer

-Dompel de dialysecassette onder in 1x PBS gedurende 2 min -Injecteer het geëlueerde staal in de cassette -Laat de cassette drijven in 1x PBS en incubeer bij 4°C -Vervang na 2 u de 1x PBS buffer en incubeer overnacht bij 4°C -Haal de stalen met een injectienaald uit de cassette


86

Eiwitbepaling

-‘Dc protein assay kit’ (Bio-Rad)

-Voeg 20 µl S bij 1 ml A= A’ -Breng 20 µl A’ in elke well van een 96-well plaat -Breng 10 µl staal of 10 mg/ml BSA standaard op de plaat -Maak een 1/3 verdunning van de stalen en de standaard -Breng 135 µl reagens B in elke well -Lees de absorbantie af bij 655 nm in de Microplate Reader (Bio-Rad) -Bereken de eiwitconcentratie

Bindingsaffiniteit-ELISA -Coat een Maxisorp 96-well plaat van Nunc met 100 µl 1ng/µl recombinant mTNFR1 -Incubeer overnacht bij 4°C -Was de plaat 3x met 300 µl 1x TBS-T -Blokkeer de vrije plaatsen met 200 µl TBS-T met 2% BSA -Incubeer 1 u op kamertemperatuur -Voeg 100 µl 1/4 Nanobody verdunning of standaard toe aan de wells, startend van 1 ng/µl -Incubeer 1 u op kamertemperatuur -Was de plaat 3x met 1x TBS-T -Voeg 100 µl 10 µl/10 ml muis-anti-His antibody (1 mg/ml) toe per well -Incubeer 1 u bij kamertemperatuur -Was de plaat 3x met 1x TBS-T -Voeg 100 µl 1 µl/10 ml secundair antilichaam anti-muis HRP (1 mg/ml) toe -Incubeer 1 u bij kamertemperatuur -Was de plaat 3x met 1x TBS-T -Voeg 50 µl TMB substraatoplossing toe en incubeer 30 min bij kamertemperatuur -Voeg 50 µl 1 M H2SO4 stopoplossing toe -Lees de absorbantie af bij 450 nm met referentiemeting bij 595 nm -Bereken de bindingsaffiniteit L929 NF-ϰB/ luc cellen -Neem de cellen uit vloeibaar N2 en ontdooi ze in het warmwaterbad -Zaai de cellen uit in een 25 cm² falcon met gesloten dop in DMEM medium met 1% L-Glutamine, 20% FCS, 0,2% Penicilline/Streptomycine, 0,1% Na-pyruvaat en 1% NEAA -Flush de falcon gedurende 20 s met CO2 -Incubeer bij 37°C -Maak de cellen los met EDTA-trypsine en incubeer 10 min bij 37°C -Voeg een gelijke hoeveelheid medium toe en breng alles over naar een 15 ml tube -Centrifugeer 5 min bij 1200 rpm -Zuig het medium af en los de pellet op in nieuw medium -Breng de cellen over naar een nieuwe falcon, flush met CO2 en incubeer bij 37°C


87

Inhibitietest -Zaai de cellen uit in een 96-well plaat met 40.000 cellen per well -Incubeer 24 u bij 37°C en 5% CO2 -Verdun de Nbs naar 6 µg/200 µl -Maak een 1/4 verdunningsreeks in 200 µl medium -Zuig het medium van de cellen af -Breng de verdunningsreeks op de cellen en incubeer 30 min bij 37°C en 5% CO2 -Voeg 1000 IU/ml mTNF toe aan de cellen en incubeer 3 u bij 37°C en 5% CO2 -Zuig het medium af en voeg 60 µl lysebuffer toe -Breng 50 µl cellysaat over naar een 96-well Luminex plaat -Voeg 30 µl luciferine substraat toe -Meet het lichtsignaal in een Luminometer (Perkin Elmer) met het 1 s protocol

7.6.2 miRNA’s

Transformatie -Ontdooi de cellen op ijs -Voeg 1 µl DNA toe -Incubeer 30 min op ijs -Plaats 50 s bij 42°C -Incubeer 2 min op ijs -Voeg 1 ml SOC medium toe -Incubeer 1 u bij 37°C en 200 rpm -Plaat 20 µl uit op LB agar met 1% ampicilline -Incubeer overnacht bij 37°C -Screen positieve kolonies met kolonie-PCR Pik een kolonie op en breng deze in 10 µl BIDI en vervolgens op een streepplaat 10 µl Template DNA 2,5 µl 10x PCR buffer 0,5 µl 10 mM dXTPs 0,5 µl 10 µM primer pEZX-MR04 forward 0,5 µl 10 µM primer pEZX-MR04 reversed 0,75 µl 50 mM MgCl2 0,1 µl 5 U/µl Taq DNA polymerase 10,15 µl BIDI -PCR-reactie 94°C 10 min 94°C 5 min 94°C 30 s 55°C 30 s 72°C 1 min Stap 2 tot 4 : 34x 72°C 5 min


88

-Laad 2 µl staal + 8 µl BIDI + 2 µl ladingsbuffer samen met de ‘Small Fragments’ ladder op een 2% agarosegel met 10 µl 10.000 U Sybr Safe/100 ml -Laat de gel lopen op 100 V gedurende 40 min in 1x TBE buffer -Pik 1 kolonie op en ent in 7 ml TB met 1% ampicilline, incubeer 6 u bij 37°C en 200 rpm -Inoculeer 500 ml TB met 1% ampicilline met 3 ml precultuur -Incubeer overnacht bij 37°C en 200 rpm -Centrifugeer 10 min bij 5000 rpm en 4°C -Verwijder het supernatans en los de pellet op in 10 ml buffer 1 -Voeg 20 ml buffer 2 toe -Incubeer op ijs en schud tot de oplossing doorzichtig geworden is -Incubeer 5 min op ijs -Voeg 10 ml ijskoude buffer 3 toe -Schud op ijs en laat 10 min rusten -Centrifugeer 15 min bij 4°C en 8000 rpm -Breng het supernatans doorheen een cell strainer over naar een nieuwe 50 ml tube -Voeg 25 ml isopropanol op kamertemperatuur toe. -Incubeer 10 min bij kamertemperatuur -Centrifugeer 10 min op 5000 rpm bij kamertemperatuur -Los de pellet op in 3 ml 10 mM Tris-HCl pH 8 -Voeg 3 ml koude 5 M LiCl toe -Centrifugeer 10 min bij 8000 rpm bij kamertemperatuur -Voeg 6 ml isopropanol toe -Centrifugeer 10 min bij 5000 rpm bij kamertemperatuur -Verwijder het supernatans en laat de pellet drogen -Los de pellet op in 500 µl 10 mM Tris-HCl pH 8 -Voeg 10 µl 2,5 µg/µl pancreatic RNase A toe en incubeer 1 u bij 37°C -Voeg 5 µl proteinase K (finale concentratie 100 µg/ml) met SDS (finale concentratie 0,1%) toe en incubeer 1 u bij 56°C -Voeg 500 µl fenol toe -Centrifugeer 5 min bij 14.000 rpm -Neem de bovenste fase af en breng deze over naar een nieuw epje -Voeg 400 µl fenol toe -Centrifugeer 5 min bij 14.000 rpm -Neem de bovenste fase af, voeg 400 µl chloroform toe en centrifugeer 5 min bij 14.000 rpm -Voeg 400 µl chloroform toe en centrifugeer 5 min bij 14.000 rpm -Neem de bovenste fase af en breng deze over naar een nieuw epje -Voeg 40 µl 3 M NaAc pH 5,2 toe -Voeg 800 µl ijskoude 100% ethanol toe en inverteer voorzichtig -Centrifugeer 10 min bij 13.000 rpm op kamertemperatuur -Giet het supernatans af en was de pellet 2x met 500 µl 70% ethanol bij 4°C -Centrifugeer 5 min bij 13.000 rpm op kamertemperatuur -Giet de ethanol af en laat de pellet drogen -Los de pellet op in 100 µl PBS -Meet de DNA concentratie met de Nanodrop -Verdun het DNA naar 500 µg/µl in PBS


89

C57BL/6-MEF-cellen -Zaai de cellen uit in een 25 cm² falcon met filterdop in DMEM medium met 1% L-Glutamine, 20% FCS, 0,2% Penicilline/Streptomycine, 0,1% Na-pyruvaat en 1% NEAA -Incubeer bij 37°C, 5% CO2 en 3% O2 -Maak de cellen los met EDTA-trypsine en incubeer 10 min bij 37°C -Voeg een gelijke hoeveelheid medium toe en breng alles over naar een 15 ml tube -Centrifugeer 5 min bij 1200 rpm -Zuig het medium af en los de pellet op in nieuw medium -Breng de cellen over naar een nieuwe falcon en incubeer bij 37°C, 5% CO2 en 3% O2 In vitro test miRNA-511 -Zaai 100.000 cellen per well uit in een 24-well plaat -Incubeer bij 37°C tot de cellen vastgehecht zijn -Voeg 13 µl 50 µM miRNA precursor of LNA bij 1300 µl OPTIMEM -Incubeer 5 min bij kamertemperatuur -Voeg 26 µl 50 µM RNAiMAX bij 1300 µl OPTIMEM -Incubeer 5 min bij kamertemperatuur -Voeg het RNAiMAX bij de miRNA precursor = transfectiemix -Incubeer 20 min bij kamertemperatuur -Zuig het medium van de cellen af -Breng 400 µl OPTIMEM op de cellen -Druppel 100 µl transfectiemix op de cellen -Incubeer 24 u bij 37°C en 5% CO2 -Neem het medium af en breng het over naar een nieuwe plaat, bewaar bij -20°C -Lyseer de cellen met 200 µl 1x PBS met 0,05% CHAPS en COMPLETE -Breng het lysaat over naar een nieuwe plaat en bewaar bij -20°C -Voer een eiwitbepaling uit op het afgezonderde medium en de lysaten zoals hierboven beschreven. Mouse sTNF R1/TNFRSF1A ELISA (R&D systems) -Coat een Maxisorp 96-well plaat met 100 µl 2 µg/ml ‘Capture’ antilichaam in 1x PBS -Incubeer overnacht bij 4°C -Was de wells 3x met 400 µl wasbuffer (0,05% Tween20 in 1x PBS) -Blokkeer de plaat met 300 µl Reagent Diluent (1% BSA in 1x PBS) -Incubeer 1 u bij kamertemperatuur -Voeg 100 µl stalen of standaard toe, verdund in Reagent Diluent -Incubeer 2 u bij kamertemperatuur -Was 3x met 400 µl wasbuffer -Voeg 100 µl 200 ng/ml Detectie antilichaam in Reagent Diluent toe -Incubeer 2 u bij kamertemperatuur -Was 3x met 400 µl wasbuffer -Voeg 100 µl 50 µl/10 ml Streptavidine-HRP toe -Incubeer 20 min bij kamertemperatuur, scherm de plaat af van het licht -Was 3x met 400 µl wasbuffer -Voeg 100 µl substraat oplossing (1:1 reagens A/H2O2 en reagens B/TMB) toe


90

-Incubeer 20 min bij kamertemperatuur en scherm af van het licht -Voeg 50 µl stopoplossing toe (1 M H2SO4) -Bepaal de optische densiteit bij 450 nm met referentiemeting bij 570 nm met de Microplate Reader (Bio-Rad) In vivo test miRNA’s -Plaats de muizen onder een warmtelamp gedurende ongeveer 5 min -Injecteer 2 ml 5 µg/ml miRNA precursor in 1x PBS in de staartader -Dood de muizen na 24 u en isoleer de bovenste leverlob -Vries de bovenste leverlob onmiddellijk in in vloeibare N2 -Voeg 200 µl lysebuffer toe en homogeniseer de stalen -Voer een eiwitbepaling uit zoals hierboven beschreven -Bepaal het mTNFR1 expressieniveau met de Mouse sTNF R1/TNFRSF1A kit zoals hierboven beschreven In vivo letaliteittest -Plaats de muizen onder een warmtelamp gedurende ongeveer 5 min -Injecteer 2 ml 5 µg/ml miRNA precursor in 1x PBS in de staartader -Injecteer 24 u later een LD50 dosis TNF of LPS -Meet op regelmatige tijdstippen de lichaamstemperatuur en ga de letaliteit na


91

7.7 Samenstelling buffers en media

TB medium

Nb expressie: Buffer A

IMAC bindingsbuffer

Bactotrypton 12g

Tris pH 8 20 mM

NaPO4 20 mM Bactoyeast 24g

EDTA pH 8 10 mM

NaCl 500 mM

Glycerol 4 ml

Sucrose 0,2

Imidazole 20 mM

Aanlengen tot 900 ml met BIDI Steriele fosfaatoplossing 100 ml

Nb expressie: Buffer B

IMAC elutiebuffer

KH2PO4 2,31g

Tris pH 8 20 mM

NaPO4 20 mM K2HPO4 12,54g

EDTA pH 8 10 mM

NaCl 500 mM

filter sterilisatie

Imidazole 500 mM

Lysebuffer

SOC medium

CHAPS 0,50%

High Quality DNA: 1

Bactotryptone 20g

EDTA 1 mM

Dextrose 50 mM Bactoyeast 5g

COMPLETE (1 tablet/50 ml)

Tris pH 8 25 mM

NaCl 10 mM

PBS 1x

EDTA pH 8 10 mM

KCl 2,5 mM Mg2+ oplossing: 1 ml bij 100 ml

5x EB

High Quality DNA: 2

MgSO4 1 M

Tris-HCl pH 7,5 30 g/l

NaOH 0,2M MgCl2 1 M

Glycine 144 g

SDS 0,01

Glucose 2 M

SDS 15 g

High Quality DNA: 3

LB agar

5x Ladingsbuffer eiwit

Kac 5M 600 ml

Bactotryptone 10g

Tris pH 6,8 1M 3,125 ml

Ijsazijnzuur 115,2 ml Bactoyeast 5g

B-mercaptoethanol 4 ml

Aanlengen tot 1l met BIDI

NaCl 10g

Glycerol 10 ml Bactoagar 15g

SDS 2 g

Luciferase substraat buffer

aanlengen tot 1l

Broomfenolblauw snuifje

Tricine 0,716g

Aanlengen tot 20 ml

(MgCO3)4Mg(OH)2.H2O 0,104g

LB medium

MgSO4 0,131g

Bactotryptone 10g

Destain

DTT 1,03g

Bactoyeast 5g

Methanol 300 ml

EDTA 0,5M 40 µl NaCl 10g

Azijnzuur 70 ml

Aanvullen tot 100ml

aanlengen tot 1l

Aanlengen tot 1l

In 38 ml oplossen:

CoA 15,2 mg

6x Ladingsbuffer DNA

Blotbuffer

ATP 15,37 mg

Ficoll 400 20g

Glycine 39 mM

Luciferine 10 mg

Tris pH 7,5 10 mM

Tris-HCl 48 mM EDTA pH 8 50 mM

SDS 0,04%

Luciferase Lysebuffer

Broomfenolblauw 0,25%

20% methanol 200 ml

Tris pH 7,8 25 mM

Xyleencyanol 0,25%

DTT 2 mM Aanlengen tot 200 ml

10x TBS

CDTA 2 mM

Tris-HCl pH 7,4 200 mM

Glycerol 10%

10x TBE buffer

NaCl 1500 mM

Triton X-100 1%

Tris 108g Boric Acid 55g

1x TBS-T

ELISA wasbuffer

EDTA pH 8 0,5 M 40 ml

TBS 1x

Tween-20 0,05%

Tween-20 0,0005

PBS 1x

TS Tris pH 8 0,2 M

10x PBS

ELISA Reagent Diluent

Sucrose 0,5 M

NaCl 100 g

BSA 1%

KCl 2,5 g

PBS 1x

Na2HPO4.12H2O 36,1 g

KH2PO4 2,5 g

De ontwikkeling van een nieuwe generatie TNF-blokkers ...

Documents

Transcript of De ontwikkeling van een nieuwe generatie TNF-blokkers ...