Uitgewerkte colleges Eggen – 10/11/12 december ’13 – MBMB COLLEGE 1 Voortplanting/reproductie: Ongeslachtelijk → bacteriën, gisten: het genoom van de oude is gelijk aan het genoom van de nieuwe o Voordelen: er hoeft geen partner gezocht te worden; geen energie kwijt daaraan. o Nadelen: genomen gelijk → minder uitwisseling genetisch materiaal en flexibiliteit; geen selectie mogelijk, want geen variatie. Geslachtelijk → meeste planten/dieren: genoom van twee dieren komt bij elkaar en wordt gemengd. Er zijn altijd haploïde en diploïde cellen aanwezig. Kiemcellen bevatten één kopie van het genoom (haploïd – n) en versmelten met elkaar tot een diploïd organisme (2n).

Haploïde/diploïde fase Lagere eukaryoten zijn bijna altijd haploïd. Bij voortplanting versmelten 2 haploïde cellen en vormen een diploïde zygote → delen weer (meiose) en vormen weer haploïde cellen. Hogere eukaryoten zijn grotendeels diploïd, op set voortplantingscellen na: kiembaancellen produceren zaad- en eicellen (haploïd). Samensmelting van deze twee vormt een diploïde zygote → diploïd organisme. Alle cellen zijn weer diploïd, behalve de kiembaan. Gameten delen niet, maar versmelten wel! Somatische cellen → in dienst van reproductie. Kiembaancellen → vormen gonaden: weefsel verantwoordelijk voor seksuele voortplanting. Mitose Bij celdeling wordt DNA gedupliceerd door replicatievorken op origins of replication. Elk chromosoom is verdubbeld (4n). Aan het centromeer hechten spoeldraden (kinetochoor); zijn verankerd aan mitotisch spoelfiguur (spindle) en aan de celwand → trekken chromosomen uit elkaar. Gedupliceerde chromosomen worden verdeeld over de dochtercellen. Chromosoomaantallen (2n) → autosomen + sex chromosomen. In totaal is dit bij de mens 46. Chromosomen zijn gerangschikt op grootte: 1 is het grootst, 21 het kleinst (22 was toen nog niet ontdekt). De grootte van het genoom bepaalt niet altijd de complexiteit v/h organisme. Planten zijn heel complex → stationaire organismen; kunnen niet bewegen en moeten wel vele omstandigheden doorstaan → groot genoom. Vissen/amfibieën/planten kunnen wel tot 6n gaan: dit heet polyploïdie. Fasen van de mitose Profase: moment waarop het DNA condenseert. De kernenvelop is nog intact. Prometafase: kernenvelop wordt afgebroken. Spoeldraden kunnen hechten aan het centromeer en de chromosomen. Hechting van microtubili (spoeldraden) aan de kinetochoor. Metafase: alles ligt in één vlak (metafaseplaat). Microtubili worden verkort en chromosomen uit elkaar getrokken. Telofase: chromosomen worden uit elkaar getrokken, kernenvelop vormt. Cytokinese: cellen delen. Cytoplasma wordt verdeeld over 2 cellen door een samenknijpende ring.

Mitose vs meiose Meiose II lijkt erg op mitose. Eind mitose → cel eindigt met één kopie v moeder en één kopie v vader. - Meiose I → begint met een moeder- en vaderchromosoom: DNA replicatie → homologe chromsomen vormen paren → bivalent vormt: bestaat uit 4 chromosomen bij elkaar. Genetisch materiaal wordt uitgewisseld (crossing-over) → 1e meiotische deling: twee paternale en twee maternale chromosomen gaan samen in een cel. - Meiose II → chromosomen worden verdeeld over dochtercellen: er ontstaan haploïde cellen. Dit proces lijkt erg op mitose.

Er is speciale organisatie van het bivalent vereist voor het uit elkaar halen van paternale en maternale chromosomen. Meiose I Beginsituatie: één moeder- en één vaderchromosoom. DNA wordt gedupliceerd. De 4 chromosomen moeten elkaar vinden en een complex (bivalent) vormen: dit proces heet “pairing” en duurt lang. Crossing-over van erfelijk materiaal in de bivalent. Scheiding van de homologen in anafase I.

Meiose II Beginsituatie: 2 cellen met een chromosoompaar (één met moeder, één met vader). Zusterchromatiden worden gescheiden in aparte cellen: dit zijn gameten met één chromosoom per gameet.

23 chromosomen, dus er kunnen 8.4x106 gameten geproduceerd worden met een andere genetische samenstelling (crossing-over niet meegenomen!). Bivalent vorming X en Y → klein gedeelte van Y is homoloog aan een klein deel van X: hiertussen vindt pairing plaats. Disjunctie = segregatie van de chromosomen. Foutieve disjunctie leidt tot aneuploïdie: hierdoor ontstaat bijv. het Down syndroom → 3 kopieën van chromosoom 21 (trisomie). Met ouderdom neemt de kans op foutieve/nondisjunctie toe, dus kans op kinderen met bijv. het syndroom van Down stijgt ook. Sommige mensen hebben trisomie in een deel van hun cellen (mozaïek). De meeste trisomieën zijn lethaal. Crossing-over Door pairing kan het proces van crossing-over plaatsvinden. Er wordt een breuk in het DNA gemaakt → uitwisseling genetisch materiaal → DNA wordt weer geligeerd. Als eerst pairen DNA-sequenties die homoloog zijn aan elkaar. Gemiddeld 2-3x crossing-over per chromosoom. Er zijn “hotspots” op het genoom waar recombinatie vaker voorkomt; treedt zelden op aan het einde v/e chromosoom en bij het centromeer (heterochromatine). Elk geval van crossing-over remt de kans op een volgende crossing-over. Genetische variatie Het aantal verschillende mogelijke gameten is enorm → 223 verschillende gameten, crossing-over/recombinatie niet meegenomen.

Genetica veel gebruikt voor opsporen van ziekten in families: veel markers bekend voor het DNA, uniek voor het individu; deze zijn te volgen in families → kijken of ze overerven bij aangedane/niet-aangedane familieleden. Het gebied waarmee de marker overerft wordt steeds kleiner: het gemeenschappelijk deel DNA tussen familieleden wordt steeds kleiner door recombinaties. “Pairing” van homologe chromosomen Bij pairing wordt er een soort ladderstructuur aangelegd tussen de homologen: cohesine brengt de ladders bij elkaar → stabiel complex. 5 stadia (tijdens profase meiose I): 1. Leptoteen = homologen condenseren, pairing begint. 2. Zygoteen = vorming v/h synaptonemale complex. 3. Pachyteen = ladderachtige eiwitten houden beide homologe zusterchromatiden bij elkaar (duurt lang). 4. Diploteen = afbraak synaptonemale complex. 5. Diakinese = overgang naar metafase I.

Verschillen in meiose bij man/vrouw - Vrouw → foetale ovaria bevatten al oöcyten (precursor eicellen): beginnen al met meiose en stoppen in dyploteen tot de vrouw de sexueel rijpe leeftijd bereikt (menstruatie) → meiose wordt afgemaakt tijdens ovulatie. Kans op verkeerde segregatie (gameten met 3 chromatiden en gameten met 1) stijgt met ouderdom, dus bij oudere vrouw grotere kans op kind met syndroom v Down. - Man → spermatozoa (precursor zaadcellen) zitten in de testis. Als de man vruchtbaar wordt treedt meiose op, maar zonder stop-start mechanisme. Meiose duurt 24 dagen.

Consequenties van deze verschillen: Vrouw → geen checkpoint, dus verhoogde kans op aneuploïdie (20% bijdrage v/d vrouw, 3- 4% v/d man). Man → meer mitotische delingen (geen stop-start): verhoogde bijdrage aan nieuwe mutaties door recombinatie/crossing-over. Dit zijn de novo mutaties, niet aanwezig in ouders maar wel in kind, afkomstig v/d vader. 25% van humane foetussen is aneuploïd: meeste levert geen levensvatbaar embryo op, dus wordt verstoten binnen enkele weken. Kans op trisomie voor een chromosoom is voor elk chromosoom hetzelfde, maar niet alle zijn levensvatbaar als trisomie op 21 (Down). Primordiale kiemcellen → worden vroeg tijdens embryonale ontwikkeling “apart” gezet; dit zijn cellen die uiteindelijk door het embryo migreren naar de plek waar gonaden worden aangelegd. Ze differentiëren tot oöcyten (vrouw) of zaadcellen (man). Primordiale kiemcellen en geslachtsbepaling Na migratie ondergaan de cellen mitotische proliferatie. Als de gonaden zijn aangelegd ondergaan ze differentiatie tot oöcyten/zaadcellen. Eicellen zijn pluripotent, kunnen alle weefsels vormen als ze bevrucht worden. Isolatie primordiale kiemcellen (PGCs) uit embryo → cellijnen gemaakt; lijken erg op ES cellen (pluripotent). SRY en geslachtsbepaling Sry-gen ligt op het Y-chromosoom (sex-determining region of Y). Sry bepaalt (met Sox9) de ontwikkeling van de gonaden. Het is een essentieel gen voor geslachtsbepaling; bij zoogdieren komt het gen in alle cellen tot expressie. Sry codeert voor een transcriptiefactor: testis determining factor (TDF).

Één van de targetgenen van TDF is Sox9 (hox-gen) → wordt geactiveerd door TDF. Vrouwen (XX) hebben dus geen Sry-gen, waardoor ze zich niet mannelijk ontwikkelen. Andere variaties: XO → vrouw ontwikkelt door gebrek aan Sry-gen XY met mutatie in Sry-gen → vrouw ontwikkelt, ook al is een Y-chromosoom aanwezig. XXY → mannelijke ontwikkeling door het Sry-gen, maar vrouwelijke kenmerken. XX muis met SRY gen → muis met testis, maar zonder zaadcellen: genen op het Y-chromosoom buiten Sry om coderen voor eiwitten voor zaadcelproductie: deze info ontbreekt, ook al ontstaat het mannelijke systeem.

De genital ridge in het embryo groeit uit tot gonaden. PGCs zijn vroeg apart gezet en migreren door het embryo naar de genital ridge → 2 mogelijkheden: gonaden hebben nog niet beslist of het man/vrouw systeem wordt: - Man (XY) → in de genital ridge wordt het Sry-gen tot expressie gebracht: cel gaat moleculen produceren die differentiatie naar mannelijk systeem induceert. Cel met Sry-gen tot expressie wordt Sertolli cel en gaat anti-Müllerian hormoon produceren. PGCs differentiëren tot spermacellen. - Vrouw (XX) → genital ridge differentieert in vrouwelijk systeem door afwezigheid van Sry-gen en signaalmoleculen. PGCs differentiëren tot eicellen. Cellen van de genital ridge specialiseren tot follikelcellen (tegenhanger Sertolli) die differentiatie van PGCs stimuleren. Productie van oestrogeen door follikelcellen begint pas in de puberteit.

Testosteron (T) is belangrijk bij de ontwikkeling! Geen T → Mullerian duct wordt aangelegd en er is regressie van de Wolffian duct. Mullerian duct ontwikkelt in oviduct, uterus, deel vagina, follikelcellen en theca cellen. Ontwikkeling van genitaliën is onafhankelijk van het sexhormoon, maar differentiatie is wel afhankelijk hiervan! Aan-/afwezigheid van T stimuleert ontwikkeling/afbraak van bepaalde structuren. Wel T → Wolffian duct wordt aangelegd, en Mullerian duct in regressie. Wolffian duct ontwikkelt prostaat, seminal vesicles.

Samengevat:

Parthenogenese Zoogdieren kennen geen parthenoten: geen bevruchting mogelijk zonder mannetje. Imprinting → van genen wordt één v/d kopieën gebruikt, andere staat uit: afhankelijk of je het gen van je moeder of vader hebt gekregen staat het aan of uit. Er zijn dus genen met monogenetische expressie. Hierom kan parthenogenese niet bij de mens → sommige genen zouden dan uitstaan; je krijgt een onderontwikkeld (lethaal) organisme. Eicellen Oögonia zijn voorlopers van eicellen. Eicellen zijn groot: omdat er nog geen placenta aanwezig is moeten ze zelf zorgen voor aanvoer van voedingsstoffen. Om de eicel zit de zona pellucida: eiwitten met suikermodificaties die laag om de eicel vormen; speelt belangrijke rol bij bevruchting. Ook wel vitelline membraan genoemd. Oögenese = ontwikkeling van eicellen. PGCs (dan: oögonia) komen aan bij de gonaden en nemen toe in aantal door mitose (proliferatie). Meiose I begint (tot dyploteen) → primaire oöcyt. Primaire oöcyt rijpt uit; afhankelijk van oestrogeen (dus na puberteit). Na uitrijping ontwikkelt het zich tot secundaire oöcyt → bestaat uit 2 cellen; vrijwel het hele cytoplasma gaat naar één van de twee, de rest is soort van “afval” (polar body). Bevruchting v/d secundaire oöcyt. Na bevruchting pas de tweede meiotische deling in de eileider!

Follikel en oögenese Tijdens de profase is de eicel 4n (verdubbeld genoom); ze nemen enorm toe in grootte: om de eicel heen zit een laag granulosacellen, gekoppeld aan de eicel via gap junctions. Door gap junctions kunnen geen grote moleculen, wel bouwstenen die eiwitten kunnen produceren. Follikel → granulaire en thecacellen. Ontwikkelende follikel groeit (→ antraal follikel) onder invloed van FSH. 10-12 follikels ontwikkelen zich en gaan oestrogeen produceren; endometrium (epitheel baarmoederwand) verdikt voor evt. bevruchte eicel. Hypofyse piekt met LH → één dominante follikel barst open en een secundaire oöcyt komt vrij → eileider → mogelijke bevruchting. Niet bevrucht → oöcyt verdwijnt samen met het corpus luteum → menstruatie: endometrium afgebroken en afgescheiden. Wel bevrucht → snelle productie van hCG; houdt het corpus luteum in stand. Placenta gaat daarna hCG produceren waardoor het blijft bestaan. Corpus luteum produceert progesteron, belangrijk bij embryonale ontwikkeling; placenta neemt dit later over.

Hormoonhuishouding v/d vrouw Hypofyse piekt maandelijks in FSH. Één dominant follikel produceert oestrogeen waardoor het endometrium verdikt. Halverwege de menstruatiecyclus piekt LH (luteïniserend hormoon) → ovulatie, corpus luteum (maakt progesteron). Anticonceptiepil → bevat progestogenen/oestrogenen waardoor ovulatie uitblijft. Rijping v oöcyten wordt voorkomen → geen ovulatie. Veel pillen bevatten wel oestrogenen, waardoor de normale cyclus van het endometrium wordt nagebootst. In veel eicellen zit een dooier met veel cholesterol. Vliegeneieren bevatten vele nurse cells die via cytoplasmatische verbindingen zijn gekpopeld aan de eicel: deze produceren bouwstenen die worden toegevoerd aan de oöcyt.

Zaadcellen: eenvoudige cellen tov eicellen; hebben een flagel nodig om te kunnen bewegen. Het cellichaam bevat eigenlijk alleen mitochondriën → zaadcellen gebruiken veel energie. Hebben een haploïde kern en acrosomale vesikels die vrijkomen bij bevruchting; zijn nodig voor fusie met de eicel en bevatten hydrolytische enzymen. Zaadcellen hebben ook geen histonen: DNA ligt in het lichaam zonder histonen. Het zijn kleine/minimale cellen met veel ATP door oxidatieve fosforylering in de mitochondriën. Flagel → complexe organisatie van microtubili. Spermatogenese Seminifere tubili → buisstructuur in de testis met iets lagere lichaamstemperatuur. Spermatogoniale stamcellen liggen in deze buis met Sertolli cellen ertussen: ze migreren naar het lumen en rijpen in de volgende stadia: - Spermatogonia (stamcellen) - Primaire spermatocyten - Secundaire spermatocyten - Spermatiden (n) - Spermatozoa

Ze gaan door het lumen en verzamelen zich in de bijbal (epididymis). Sertolli cellen ondersteunen uitrijping van de stamcellen. Leydig cellen produceren testosteron → hierom is de concentratie T in de testis heel hoog. Via het lumen komen de rijpe cellen in de bijbal. Ong. 100-200 miljoen/dag. Hormoonhuishouding v/d man Spermatogenese begint bij de puberteit. Leydig cellen maken testosteron onder invloed van FSH en LH uit de hypofyse. Ontwikkeling spermatozoa Na meiose II vindt geen cytokinese plaats!! Er ontwikkelt een syncytium: groot aantal cellen verbonden door cytoplasmatische contacten → één grote “veelkernige” cel. Rijping vindt plaats na de meiose: ze gebruiken het diploïd genoom voor rijping → haploïde cellen met het Y-chromosoom krijgen nog steeds essentiële producen van het X-chromosoom. Aan het eind van differentiatie ontstaan individuele spermatozoa: ze komen uit het syncytium en residual bodies blijven over. Bevruchting Wordt getriggerd in de vagina door albumine, Ca2+ en HCO3--: doen iets met de zaadcellen. Cholesterol wordt geëxtraheerd door albumine, calcium en HCO3- zorgen voor productie van cAMP via adenylyl cyclase → verhoogde flagelactiviteit v/d zaadcel. De spermatocyt bindt de zona pellucida v/d eicel → bestaat vooral uit eiwitten ZP1-3. ZP3 stimuleert de acrosomale reactie: fusie van de vesikels in de kop van de zaadcel → secretie van de acrosomale vesikels v/d spermatocyt door een Ca2+-influx. Hydrolytische enzymen uit de vesikels breken lokaal de zona pellucida af: de zaadcel gaat met z’n flank tegen het membraan v/d eicel aanliggen → membranen fuseren. De zaadcel injecteert inhoud in de cel (haploïde genoom + centromeer). Corticale reactie → voorkomt polyspermie: meerdere zaadcellen bevruchten één eicel. Zodra één zaadcel bindt kunnen andere dit niet meer; samenstelling v/d extracellulaire matrix verandert → snelle depolarisatie na penetratie.

Penetratie zaadcel → spermatozoïde brengt PLZζ in ovum: exocytose van corticale granules. ZP3 verandert en ZP1/2 worden afgebroken. Samenstelling zodanig veranderd dat zaadcellen niet meer kunnen binden. Na bevruchting → DNA van beide ouders is nog niet versmolten: er zitten 2 pronuclei in de zygote. Dan treedt 2e meiotische deling op → 2 kernenveloppen versmelten en worden daarna afgebroken; centromeer verdubbelt en paternaal en maternaal DNA gaat samen in metafaseplaat liggen → eerste mitotische deling. Hier is het DNA samengenomen.

COLLEGE 2 Definities zenuwstelsel CZS bestaat uit ong. 1011 neuronen, met elk >1000 verbindingen (zeer complex netwerk). Aantal verbindingen is flexibel en kan variëren → plasticiteit. Alle verbindingen hebben een bepaalde overgeleverde informatieoverdracht. Kracht v/d verbinding is ook variabel: input die neuronen krijgen/leveren varieert ook. Sommige ziektebeelden worden geassocieerd met verlies van een type neuronen: Parkinson → dopaminerge neuronen, SCA → cerebellaire neuronen. Ontwikkeling v/h zenuwstelsel → complex systeem Vroeg in embryonale ontwikkeling worden cellen gespecificeerd tot toekomstig neuron (neurogenese); ontstaan op verschillende plaatsen in het embryo. Ook targetcellen v/d neuronen ontstaan. Neuronen gaan dendrieten/axonen door het embryo sturen op zoek naar targetcellen. Daarna worden (diffuse) connecties gevormd, daarna is er verfijning van synapsen. Tijdens uitgroei van synapsen differentiëren neuronen zich in het juiste type neuron. Structuren ontwikkelen sequentieel, worden daarna verbonden!

Spemann’s organizer Experiment: stukjes weefsel uit kikker getransplanteerd → consequenties? Kikkerembryo op pun van gastrulatie: vlak daar in de buurt groepje cellen transplanteren naar de andere kant van een ander embryo → resultaat: daar vindt ook gastrulatie plaats! Er ontstaat een dubbel embryo. Komt door een organizer: structuur dat moleculen secreteert die hun omgeving instrueren een bepaald celtype te worden. Organizer zit ook in muizen/mensen, belangrijk bij gastrulatie → inductie v/d lichaamas. Bij aanleg van kiembladen worden ook het ecto-/endo-/mesoderm aangelegd. Endoderm aan de binnenkant (→ maag-/darmstelsel), ectoderm aan de buitenkant en mesoderm (→ spieren, organen) er tussenin.

Ectoderm → twee typen weefsel aan de buitenkant van het embryo: - Huid - Zenuwweefsel

Afbeelding: paars geeft het ectoderm aan, geel het endoderm en oranje het mesoderm. Cellen dichter bij de organiser worden meer blootgesteld aan de moleculen v/d organizer → deze cellen v/h ectoderm (donkerpaars) worden zenuwweefsel, cellen verder weg (lichtpaars) de huid. Voor gastrulatie is dus aan te geven welke cellen welk weefseltype worden. Splitsing v weefsels geldt ook voor andere kiembladen onder invloed v/d organiser. Signalen v/d organiser veranderen over tijd. Neurale inductie in amfibieën Stofje vanuit de organiser bepaalt het weefseltype. Cellen in het ectoderm signaalmoleculen, BMP’s: remmen neurale differentiatie. Als cellen in het ectoderm BMP’s binden komt transductie op gang. Organisers halen BMP’s weg, dus donkerpaarse cellen krijgen minder BMP’s dan lichtpaarse cellen → endogeen systeem op gang wat voor neurale differentiatie zorgt bij donkerpaars. Dus: ectoderm wordt in principe zenuwweefsel, tenzij blootgesteld aan BMP’s → huid.

Neurale buis Gastrulatie → huid + toekomstig zenuwweefsel komt aan de buitenkant van het embryo te liggen. Cellen kruipen het embryo in (daar vormt later de anus): aan het einde hiervan ontstaat de mond. Aan de zijkant en onderkant ontwikkelt de huid. Neurale plaat.

Cellen in neurale plaat veranderen van structuur: cellen trekken samen, plaat rolt op en vormt de neurale buis. Aangrenzend ectoderm sluit over de buis → zenuwweefsel komt aan de binnenkant te liggen. Dorsaal ontwikkelt de neurale lijst, extra kiemblad → bijnieren, schildklier, tanden, kaak, enz. Sluiten neurale buis kan fout gaan → open ruggetje (spina bifida) of anencephalie (geen cerebrum). Ontwikkeling v/d neurale buis Centraal kanaal → CSF (cerebrospinale vloeistof). Snel na neurulatie ontwikkelt de neurale buis. Aan de kant waar hersenen gevormd worden gaan cellen delen/prolifereren → cellaag verdikt. 3 regio’s: prosencephalon, mesencephalon, rhombencephalon: ontwikkelt in structuren van het brein → gecondenseerde hersenstructuur. Onderdelen: - Telencephalon: cerebrale cortex, basale ganglia, hippocampus - Diencephalon: thalamus, hypothalamus, retina - Mesencephalon: midbrain - Metencephalon: cerebellum, pons - Myelencephalon: medulla - Caudal neural tube: ruggenmerg

Oorsprong v/h zenuwstelsel Neurale buis → centraal zenuwstelsel (CZS), ruggenmerg, retina. Neurale lijst → perifeer zenuwstelsel (PZS), bijnieren, kraakbeen gezicht, melanocyten (pigmentcellen v/d huid).

Neurale specificatie Uniforme cellen in de neurale plaat moeten specificeren naar andere celtypen (differentiatie, patroonvorming). Belangrijk is de Notch-Delta pathway. Notch wordt geactiveerd (receptor): aan de binnenkant wordt een stukje afgeknipt en krijg je intracellulair Notch → activeert signaaltransductieroute en stimuleert het hairless-gen. Hairless onderdrukt achate scute genes (Asc): transcriptiefactoren die nodig zijn om de Delta-ligand tot expressie te brengen. Notch activatie → cel maakt geen Delta. Cellen brengen normaliter Notch en Delta tot expressie in gelijke hoeveelheden: om 1 of andere reden (random) gaat de cel A tijdelijk meer Delta produceren. Notch-receptor van cel B wordt meer geactiveerd door meer Delta → door intrinsieke pathway is er verminderde Delta-expressie van cel B. Hierdoor wordt cel A weer minder geactiveerd. Zelfversterkend systeem! Cellen worden compleet asymmetrisch doordat de ene cel even meer v/d ene stof produceert dan de andere.

Dorsoventrale patterning v/d neurale buis Van hoofd- → staartgebied treden verschillen op in neurale buis. Doorsnede van de neurale buis: of cellen aan de rug- of buikkant liggen v/d buis maakt verschil → dorsaal-ventraal (dorsoventrale patterning). 2 belangrijke signaalmoleculen: Sonic Hedgehog (SHH) en Bone Morphogenetic Protein (BMP). Onder de neurale plaat ligt de notochord: primitieve ruggenwervelkolom, ligt door het embryo van voor naar achter. Notochord produceert SHH. Cellen aan de zijkant die later de huid vormen produceren BMP’s Plaat rolt op tot neurale buis → BMP-producerende cellen liggen boven en notochord die SHH produceert ligt onder. Cellen aan de rugkant zien veel BMP (roofplate), cellen aan de buikkant (floorplate) zien veel SHH. Cellen zien verschillende concentraties van SHH/BMP → verwerven verschillende eigenschappen!

Ventrale neuronen → motorneuronen (sturen uitlopers het lichaam in op spieren). Dorsale neuronen → sensorische neuronen (tast, zicht, enz.). Tussen de specifieke neuronen in worden ook interneuronen gevormd. SHH (ventraal) Specificatie ontstaat doordat cellen verschillende concentraties SHH zien. De SHH-receptor is PTC: PTC remt een ander molecuul: Smoothened. Als SHH bindt, valt remming op Smoothened weg en kan het zijn werk doen → activatie van Gli-proteins: transcriptiefactoren die naar de kern gaan en expressie van allerlei genen activeren. Deze genen specificeren neuronen in een bepaald type, afhankelijk v/d sterkte v/d pathway. TENTAMENVRAAG BMP (dorsaal) BMP diffundeert ook door neurale buis → differentiatie van neuronen naar neurale lijst cellen roofplate cellen en interneuronen.

BMP’s binden de BMP-receptor → activatie signaaltransductieroute → activatie v transcriptiefactoren SMADs → gaan naar de kern en activeren genen voor specificatie van het juiste neurontype. (zelfde verhaal als bij SHH, maar andere stoffen en ontstane celtypen) Cellen worden door verschillende concentraties transcriptiefactoren aangezet tot differentiatie naar een bepaald celtype.

Morfogen signaaltransductie Morfogenen bestaan uit signaalmoleculen: Wnt, Hedgehog, ephrine, etc: zijn aanwezig buiten de cel (worden uitgescheiden), vaak in verschillende concentraties. Ze binden verschillende receptoren op de cel → activatie signaaltransductieroute → activatie van verschillende genen in de cel: genen geven identiteit aan de cel en sturen differentiatie in een bepaalde richting. Concentraties van morfogenen zorgen voor een verschillende output. Hox-genen Rhombomeren → stukken die leiden tot verschillende hersengebieden; in mammalia 4 clusters. Bij de midbrain + forebrain spelen hox-genen geen organiserende rol: deze hebben een neurale organizing center. Hindbrain: wel hox-genen → signaalmoleculen worden uitgescheiden en activeren hox-genen: segmentaal komen dan allerlei transcriptiefactoren tot expressie. Migratie neuronen in de neurale buis In de neurale buis ontstaan radiale glia → gliacellen met een cellichaam aan de inner surfase van de buis: zijn lange cellen die weer vastzitten aan de buitenkant v/d buis; vormen een soort “steigerwerk” waarlangs geboren neuronen omhoog kunnen migreren naar de buitenkant. Aan de lumenkant zitten delende cellen: nakomelingen gebruiken radiale glia om te migreren. Neurale buis wordt steeds dikker. Eerst migratie, dan differentiatie (migratie kan niet met axonen/dendrieten)!!

Productie van neuronen in cortex Voorlopercellen delen en produceren nakomelingen: deze migreren en vormen de cortex. Met de tijd verandert het celtype dat geproduceerd wordt. Signaalmoleculen + genetisch programma → productie ander soort nakomelingen: het volgende celtype migreert langs het eerder gevormde type en vormt een nieuwe laag neuronen. Zo ontstaat een gelaagde cortex van verschillende celtypen!

Laatst geboren cellen liggen aan de buitenkant: geboren aan lumenkant, migratie naar buitenkant. Moment waarop ze geboren worden bepaalt de eigenschappen v/d cellen! Afhankelijk v/h hersengebied op de cortex zijn er verschillende eigenschappen in de lagen. Groei v axonen Uitlopers van neuronen zijn op zoek naar hun target, afhankelijk v/h celtype v/h neuron. Punt van een axon is de groeiconus: heeft een hoop groeireceptoren die de omgeving waarnemen en reageren op signalen uit de omgeving → migratie naar een bepaalde plek./ Chemoattractanten/-repulsanten spelen hierbij een rol. Groeiconus meet stoffen die aanwezig zijn maar groeien ook over andere cellen heen: brengen moleculen tot expressie: adhesie/guidance factors (+/-).

Als je in de tijd op een plaats de juiste combinatie van factoren tot expressie brengt, kun je axonen helemaal door een ontwikkelend embryo sturen. Groeiconus → sensorisch/motorisch apparaat (meten/kruipen). Axonen en dendrieten verschillen: dendrieten krijgen input, axonen sturen input naar andere structuren. Groeiconus groeit 1 mm/dag; heeft een substraat nodig om te kunnen groeien. Axonen groeien uit in bundels (vasciculatie). De mens heeft +- 100 cadherines → komen op verschillende momenten/plaatsen tot expressie; zorgen voor sturing van axonale groei; als je controleert wanneer welke tot expressie komt kun je een groeiconus een bepaalde kant op sturen. Laminines → extracellulaire matrixmoleculen die axonale uitgroei sturen. Chondroitine sulfaat proteoglycanen remmen axonale uitgroei. Ontwikkeling neuronale connecties Experiment → kikker, optische zenuw doorsnijden, oog roteren en terugzetten waarna de optische zenuw weer uitgroeit; kan niet bij de mens, zenuw regenereert dan niet. Bij het geroteerde oog ging de tong v/d kikker de andere kant op bij het vangen van een vliegje. Activiteit reguleert aangelegde circuits.

Connecties retina ↔ optisch tectum Beeld projecteert op bepaald deel van de retina. Retinaneuronen projecteren op bepaalde gebieden van het brein → verschillende cellen hebben andere projecties. Geroteerd oog: rotatie beïnvloedt de projectie niet. Projectie blijft hetzelfde (naar de hersengebieden), maar alles wordt 180 graden andersom gezien → kikker raakt in de war. Sturing van commissurale (kruisende) axonen Unc’s genen (uncoordinated) coderen voor netrines → zorgen ervoor dat hele zenuwnetwerk gedesoriënteerd raakt. Homologen van deze genen zijn gevonden in verschillende organismen. Als je op het juiste moment juiste genen tot expressie brengt (unc’s, slit, commissureless) is er goede ontwikkeling van het zenuwnetwerk. Netrines → chemoattractanten die ervoor zorgen dat axonen daarheen groeien. Als cellen geen netrine meer maken, produceren ze slit: groeiconus steekt over, waarna slit wordt geproduceerd: repellent → axon kan die kant niet meer opgroeien. M.b.v. verschillende attractant/repellents vindt de groeiconus zijn weg. Groeiconus: filopodia Groeiconus: motorische structuur die het cytoskelet kan veranderen; heeft een substraat nodig waar het aan kan verankeren. Een membraan is nodig om de cel te veranderen: het axon kan zich over een bepaald substraat voorbewegen. Als de celoppervlakmoleculen attractief zijn groeit het axon die kant op.

Groeiconus beweegt door filopodia uit te steken en te bewegen naar bepaalde moleculen. Actine, myosine en microtubili spelen ook een rol bij beweging van het axon. Pathfinding v/d groeiconus: verschillende fasen: - Extracellulaire matrix adhesie; hierover kan het axon groeien. - Celoppervlak adhesie door aanwezigheid oppervlakmoleculen. - Fasciculatie. - Chemoattractie. - Contactinhibitie buij andere cellen. - Chemorepulsie.

Door verschillende signaalmoleculen komt het uitgroeiend axon bij het gewenste celtype terecht. Neurotrophines → groeifactoren voor neuronen: zorgen voor overleving van neuronen en voor regulatie van uitgroei van axonen/dendrieten. Neuronen moeten continu ondersteund worden door signaalmoleculen, anders degenereren ze en is er verlies van neuronaal weefsel. Retinotectale kaart → kaart van retinale projecties op het brein; deze is gedefinieerd door eliminatie van verschillende synapsen. Tijdens ontwikkeling heeft de groeiconus targetcellen gevonden en verbindingen gelegd (projecties). In de retina liggen neuronen die grofweg in het gebied van het tectum waar ze moeten projecteren dat doen: actieve retinaneuronen projecteren op de juiste plek van het tectum: blijven actief, gaan meer ruimte innemen en projecteren ook op andere cellen. Inactieve neuronen degenereren → competitie voor territorium. Er treedt verfijning van projecties op → “what fires together, wires together”; remodeling door synaptische activiteit. In het begin is projectie van retina naar het tectum diffuus → bij gebruik van het oog gaan linker- en rechtoog ruimte innemen in het oog: er ontstaat een territorium van beide ogen (gestreept). 1 oog afgeplakt voordat zicht gebruikt wordt → netwerk v dat oog wordt niet getriggerd; niet-afgeplakte oog is veel meer aanwezig in het tectum en wordt dominant: neemt meer ruimte in beslag in de visuele cortex. Lui oog → oog projecteert relatief weinig naar het tectum; verfijning kan worden bijgestuurd door het luie oog af te plakken → herstel v/h evenwicht: luie oog krijgt meer input. Af en toe wel afplakking weghalen! Anders alle projecties verloren. TENTAMENVRAAG Synaptische plasticiteit → belangrijk voor leerprocessen: vormen van nieuwe connecties tussen neuronen. Waarde van connecties kan ook veranderen waardoor in-/output in netwerken verandert. Elektrische stimulatie van cellen (nabootsing leerproces) → op synaptische terminals ontwikkelen boutons: plekken waar neurotransmitters worden gemaakt en uitgescheiden. Neuronale stamcellen: ontdekt in vogels; mannetjesvogels zingen in de lente → zangcentrum neuronen nemen toe in aantal, verdwijnen daarna weer. Neurogenese = aanmaak van nieuwe neuronen: komt ook voor in muizen-/mensenbrein! Dit gebeurt vooral in 2 plekken: - Subventriculaire zone - Hippocampus

Ongeveer 20 000 nieuwe neuronen/dag.

COLLEGE 3 Principe v/e stamcel Stamcel kan bij deling twee kanten op: - Zelfvernieuwing (self-renewal) - Differentiatie: dochtercellen ondergaan amplificatie en differentiëren uit tot een bepaald celtype.

Balans tussen deze twee wordt nauwkeurig gereguleerd → anders verlies/overschot aan stamcellen. Stamcelpopulaties delen langzaam, relatief weinig celdeling. Transit amplifying cells hebben wel grote delingsactiviteit. Verschillende potenties v/e stamcel Totipotent → kunnen alle celtypen worden. Omnipotent → kunnen alle celtypen worden. Pluripotent → kunnen een heleboel, maar niet meer alle celtypen worden.

Blastocyst ontstaat na 3/4 dagen: eerste moment waarop je twee celtypen kunt onderscheiden: inner cell mass (ICM → embryo) en trofectoderm oftewel extraembryonisch weefsel (EE → vliezen, placenta, navelstreng etc.). ICM is pluripotent; is in kweekschaal te brengen → kunnen ES cellen uit gemaakt worden (embryonale stamcellen) met dezelfde eigenschappen als de ICM: alle celtypen die in de mens aanwezig zijn, zijn te maken. In veel weefsels zitten stamcellen: zijn in functie wel beperkt tot het weefsel waarin ze zitten → multipotent: beperkter in output. In volwassen individuen zitten geen pluripotente cellen, cellen die dit alleen nog kunnen zijn kiembaancellen (→ geslachtscellen). Embryonale stamcellen (ES cellen) ES-cellen v/d muis zijn het beste gekarakteriseerd: het is bekend welke groeifactoren nodig zijn om uit een pluripotente stamcel bepaalde celtypen te kunnen maken. Homologe recombinatie → gebeurt in veel cellen; wordt ook gebruikt als je een gen wil uitschakelen en bij “gene targeting”. Er komt een breuk in het ene chromatide, andere is wel intact: op de plek van de breuk wordt een stuk van de DNA-streng afgebroken: stuk enkelstrengs DNA wisselt uit met een ander stuk enkelstrengs DNA op een ander chromosoom. De strengen worden weer geligeerd → 2 nieuwe chromosomen zijn ontstaan. Functies van een bepaald gen kan worden bestudeerd door knockouts mbv homologe recombinatie → verwijdering van het gen uit het genoom. Veel toegepaste techniek. Gene targeting in ES cellen In gene targeting is het gen v interesse vervangen door een antibioticum resistentiegen. Als je het stuk DNA introduceert in een ES cel, komt de targeting vector in de kern en zoekt zijn homologe stuk DNA op → uitwisseling van DNA-strengen: bij 1 v/d 2 strengen is jouw gen vervangen door het antibioticum resistentiegen. Toevoegen antibioticum → alle cellen gaan dood, behalve degene met het resistentiegen. Je hebt dan een targeted ES cel.

Experiment → injectie van gemodificeerde ES cellen (+- 10-15) in de blastocyst v/e vrouwtjesmuis. ES cellen komen oorspronkelijk uit de ICM, dus voelen zich wel thuis in de blastocyst → er ontstaat een chimeer embryo wat je implanteert in draagmoeder. De ontwikkelde muis is chimeer: bestaat gedeeltelijk uit ICM v/d blastocyst en gedeeltelijk uit ingespoten ES cellen. Kruisen chimere muizen → dieren die geheel knockout zijn op één v/d chromosomen, in alle cellen ipv een deel. In werkelijkheid doe je dit ook met dieren met verschillende vachtkleur: makkelijk te zien wat voor dieren het zijn. ES cellen in de muis Stamcellen ontwikkelen door allerlei signaalmoleculen in verschillende celtypen. Belangrijke signaalmoleculen → BMP4 en LIF: zetten celcyclus aan en remmen differentiatie in verschillende richting: LIF remt richting endoderm, BMP remmen richting trofectoderm. Stamcellen delen snel → geen G1/G2-fase, alleen S- en M-fase; duurt ong. 6 uur. Voordat cellen geïmplanteerd worden zijn er dus geen checkpoints. Eiwitten SOX2-OCT4 → transcriptiefactoren die tot expressie komen in ES cellen: als je deze eiwitten uitschakelt verdwijnt pluripotentie in stamcellen. Nanog en STAT3 spelen ook een rol, niet weten voor tentamen. ES cellen in de mens Huidig idee over humane pluripotentie: chromatine in ES cellen (DNA) is erg open, overal op het genoom vindt transcriptie plaats. Alle genen komen een klein beetje tot expressie, maar niet hoog, want dan zou het de cel één kant op sturen. Betrokken eiwitnetwerken bij pluripotentie verschilt wel van de muis: Nanog en SMAD belangrijk! Humane ES cellen zijn pluripotenten, maar er zijn relatief weinig humane ES cellijnen. Probleem met transplantatie → willekeurige cel transplanteren niet mogelijk. Dit komt doordat het in sommigelande verboden is humane ES cellen te produceren, omdat je restembryo’s moet vernietigen. Daarnaast praktisch lastig ivm subsidies (heel duur). Somatic cell nuclear transfer (kernoverdracht – SCNT) Het is ook mogelijk kernen uit het genoom van een patiëntmuis te transplanteren: je neemt somatische cellen waar je de kern uithaalt. Neem uit een vrouwtje eicellen zonder kern, waarin je de kern v/d somatische cel brengt. Eitje is nu diploïd door de nieuwe kern → ontwikkeling tot embryo: ES cellijn te maken met het genoom v/d patiëntmuis. Een andere route is implantatie v/d eicel in een draagmoeder → gekloonde muis. De eicel reprogrammeert de kern waardoor een nieuw organisme kan uitgroeien, ook al is de genomen cel al gedifferentieerd → ontwikkeling begint opnieuw. Kernoverdracht in andere diersoorten - Reproductieve kloning → kikker, karper, muis, rhesusaap, nog meer diersoorten. - Therapeutische kloning → rhesusaap, niet succesvol bij de mens: wel blastocysten, ES derivatie niet gelukt.

Reproductieve klonering → gepaard met problemen: linkerembryo (rood) zat in dezelfde uterus maar is 2x zo groot als een normaal muizenembryo: het resetten van het genoom was incompleet en er werden problemen gemaakt in imprinting → genen waarbij het uitmaakt of het van je vader/moeder komt of het tot expressie komt. Epigenetica wijkt in deze cellen af.

Imprinting Van <1% v/d genen komt maar één allel tot expressie; of v/d moeder of v/d vader. In de kiembaan vindt imprinting plaats → als de ei- en zaadcel elkaar tegenkomen komt maar 1 allel tot expressie. Organismen waarbij imprinten misgaat (beide/geen) zijn vaak niet levensvatbaar. Tijdens ontwikkeling → genen v/d moeder zetten genen aan die het embryo klein houden, genen uit die het embryo groot maken (voor de vader vice versa). Heet de “parental conflict theory”.

Somatisch reprogrammeren Neem een fibroblast en introduceer een aantal factoren → gereprogrammeerde cel ontstaat die lijkt op een ES cel. Dit heet een iPS cel.

→ Fibroblast ES-celachtig Fusie van een somatische cel met ES-cel → ES-achtige cel. ES cel moet dus pluripotente factoren bevatten die kernen kan reprogrammeren (hypothese). - ES cel transcriptiefactoren → pluripotentie. - (Proto)oncogenen → proliferatie. - ES cel specifieke eiwitten?

Een lijstje van genen die deze factoren kunnen produceren werd bekeken → misschien kan één daarvan een gedifferentieerde cel reprogrammeren. Transgene muis → antibioticumresistentiegen inbrengen met promotor van het Fbx15 gen. Fbx15 gen komt alleen tot expressie in stamcellen, zorgt voor afschrijven van β-geo; in de fibroblast dus niet actief: er wordt dan geen β-geo afgeschreven en zijn cellen gevoelig voor het antibioticum (G418). Als je de fibroblast kunt reprogrammeren nara stamcel, wordt de promotor actief en wordt β- geo afgeschreven → cellen worden wel resistent. 24 factoren geselecteerd die mogelijk konden reprogrammeren → antibioticum toevoegen aan groep fibroblasten, cocktail van 24 genen toevoegen → heleboel cellen sterven, maar op sommige plekken ontstaan kolonies. Na 10 dagen +- 5/6 kolonies, na 16 dagen kwamen er kolonies bij. Steeds cocktails toegevoegd waarin één v/d genen waren weggehaald. Weghalen gen 14, 15, 20 of (beetje) 22 → geen kolonies meer!

Deze 4 eiwitten (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-myc) → Yamanaka-cocktail: gebruiken mensen vervolgens om cellen te reprogrammeren. Toevoegen van de cocktail aan fibroblasten → iPS cellen na 2 weken. Meestal wordt c-myc achterwege gelaten: oncogen, als het blijft zitten ontwikkelen er tumoren. Karakterisatie iPS cellen → bewijzen dat het om iPS cellen gaat. Yamanaka had cellen gereprogrammeerd en de gevormde iPS cellen voorzien van GFP; met een micropipet iPS cellen met GFP inspuiten in een blastocyst met inner cell mass en implanteren in draagmoeder → embryo bekijken onder de microscoop of cellen in de weefsels groen waren. Te zien dat iPS cellen bijdroegen aan alle weefsels → ze waren dus pluripotent.

Ultieme proef → embryo geboren laten worden en nakomelingen laten krijgen; zijn die weefsels nog groen, dan hebben iPS cellen bijgedragen aan de kiembaan (dus pluripotent). Somatisch reprogrammeren – voorbeeld Reprogrammeren DBA fibroblasten (bruine muizen). Selectie iPS cellen (mbv Nanog-selectie). iPS injectie in blastocyst in uterus van zwarte muis. Muizen worden geboren → bruin-zwart gekleurd; hopen dat chimere muis in de kiembaan ook chimeer is → kruisen met zwarte muis: F1. F1 onderling kruisen. F2: 25% kans op muizen met volledig bruine kleur (de “knockout”).

Versimpeld: chimeer → DBA (bruin) of B6 (zwart). B6 x B6 → B6B6 en DBA x B6 → DBAB6. DBAB6 x DBAb6 (onderling F1) → DBADBA, DBAB6, B6DBA, B6B6 (B6 = dominant). Als je muizen ziet met een bruine vacht in ratio 1:3 (dus 25%), weet je dat iPS cellen bijgedragen hebben aan de kiembaan. Uiteindelijk kun je een muis kweken die volledig uit iPS cellen is gemaakt. Vachtkleur ligt vast in de genen, als de iPS cel ontwikkelt naar bijv. neuron wordt dit gen gewoon uitgeschakeld; ontwikkelt de iPS cel naar huidcel, dan komt het wel tot expressie.

Ontwikkelingen iPS cellen De eerste iPS cellen zijn gemaakt mbv virussen → integreren in het genoom; veranderen deze dus ook! Tegenwoordig wordt een manier gebruikt waarop het genoom niet veranderd wordt, bijv. met een transposon of niet-integrerend DNA construct, of virussen die niet integreren in het genoom (adenovirus bijv.). Ook kun je cellen reprogrammeren mbv RNA coderend voor Oct3/4, Sox2, c-myc en Klf4. Wordt nu ook gekeken naar moleculen die deze genen kunnen vervangen. Resultaten met iPS cellen Nog geen resultaten bij mensen; wel experimenten met gebruik van iPS cellen bij bepaalde ziekten in muizen. Kunstmatige sikkelcelanemie bij muis (door knockout; humanized sikkel cell model) → fibroblasten afgenomen, gereprogrammeerd tot iPS cellen, genreparatie bij iPS door homologe recombinatie, differentiatie en uiteindelijk transplantatie terug in de “zieke” muis. De muis was hierdoor tijdelijk (!) genezen van sikkelcelanemie!

Ander voorbeeld: dopaminerge neuronen maken uit iPS cellen: terugplaatsen in de rat: rat had minder Parkinson symptomen. Ontwikkelingen in de mens gaande, geen klinische trials bij de mens. iPS wordt nu veel gebruikt voor disease modeling: in kweek een ziekte nabootsen; medicijnen loslaten op cellen en kijken of het werkt.

Directe conversie van het ene naar andere celtype is nu ook opkomend veld. Issues die nog moeten worden opgelost: - Zeker weten dat bij reprogrammeren het genoom niet wordt verandert. - iPS cellen leveren tumoren op!

Uitgewerkte colleges Linskens COLLEGE 1 Universele ontwikkeling Ontwikkeling van meercellige organismen → vele overeenkomsten: veel dezelfde principes en processen. VB – ontwikkeling van het cerebellum bij de muis: Weghalen gen Engrailed (betrokken bij ontwikkeling) → cerebellum ontwikkelt niet. Kloneren van homoloog gen uit Drosophila en plaatsen in de muis (transgeen) → Drosophila homoloog van Engrailed zorgt ervoor dat het cerebellum wel ontwikkelt. Dus: fruitvlieg heeft hetzelfde eiwitproduct van Engrailed dat cerebellum (o.a.) ontwikkelt als de muis.

Drosophila → gen Eyeless: zorgt voor de ontwikkeling van het oog. Dit gen tot expressie brengen in een ander deel van het lijf van de vlieg → oogcellen op andere plekken. Genen moeten dus wel op de goede plek tot expressie komen. Eyeless gen van bijv. octopus doet hetzelfde in de vlieg als die van de vlieg zelf. Delingspatronen van zygotes Meercellige organismen beginnen ook met één cel. Delingen van 1 → 2 → 4… cellen komt bij veel organismen op hetzelfde patroon uit. Uiteindelijke klomp cellen heet de blastula: hieruit ontstaat het lichaam. Bij deze celdelingen groeit vaak de cel niet, maar deelt alleen: ze worden vaak juist kleiner. Materiaal voor de eerste paar delingen zit al in de 1e (ei)cel. Gastrulatie = blastula deelt terug “in zichzelf”/draait zichzelf naar binnen (invagineert). Het is nu niet meer één bol met een lege ruimte, maar een ineengetrokken bol met binnen- en buitenbuis. Ontstaan 3 delen: Endoderm → binnendeel van het embryo Ectoderm → buitendeel van het embryo Mesoderm → tussen ecto-/endoderm

Dit is het basisprincipe van alle meercellige organismen! Celdifferentiatie vanuit de gastrula Zygote (delende cel) vormt de blastula (bol cellen), die uitgroeit tot de gastrula: “buis in een buis”-structuur met 3 celtypen +1! De laatste structuur zijn de kiemcellen (germ cells), cellen die reproductie mogelijk maken. Ieder van de 3 lagen geeft aanleiding tot delen van het lichaam: - Endoderm → binnenkant v/d darm, longcellen, pancreas, alvleesklier. - Ectoderm → huid, centraal zenuwstelsel (neuronen, hersenweefsel, ruggenmerg). - Mesoderm → notochord (voorloper botstructuur), spieren, aantal organen (bijv. nier), bloed, gezichtsspieren.

Bloed wordt ook als orgaan gezien, omdat zorgt voor het transport van O2/nutriënten/afvalstoffen van/naar organen en daarmee zorgt voor werkende organen!

Universele mechanismen v dierlijke ontwikkeling Voor bouw van ieder meercellig organisme is nodig: Celproliferatie → genoeg cellen nodig. Celspecialisatie Celcommunicatie → interactie tussen cellen, samenwerking. Celmigratie → cellen moeten kunnen bewegen, zodat er een variëteit aan vormen kan worden gemaakt.

TENTAMENVRAAG Verschillen tussen een-/meercelligen zit in: - Celadhesie en signalering: meercelligen kennen een grote hoeveelheid sinaalmoleculen/receptoren, die niet nodig zijn in eencelligen. - Transcriptiefactoren: meercelligen hebben meer transcriptiefactoren dan prokaryoten.

Universele ontwikkelingen: overeenkomsten in genoom? H. sapiens → +- 25 000 genen | C. elegans → +- 20 000 genen | D. melanogaster +- 14 000 genen. 50% van humane genen hebben homologen in andere soorten; veel van deze homologen coderen voor “bouwstenen” van het organisme. Toen het humane genoom werd gesequenced, bleek het minder genen te hebben dan verwacht (dat was rond 100 000-150 000 genen). Organisme A: een genregulerend eiwit activeert gen 1, dat een eiwitproduct 1 is. Eiwitproduct 1 is ook een regulator en grijpt aan op de promotor van gen 3: deze maakt eiwitproduct 3, wat ook weer een regulator is en op andere genen kan aangrijpen. Via zo’n proces komen genen tot expressie in een embryo; er is veel variatie mogelijk als er regulatoreiwitten er zijn en aangrijpen op verschillende genen. Experimentele embryologie = het vakgebied dat zich bezighoudt met de interactie tussen cellen en weefsels in relatie tot ontwikkeling van organismen. Voorbeelden: transplantatie, lineage tracing. Bij dit vakgebied spuit je bijv. verschillende cellen met verschillende kleurstoffen in een embryo in → wat gebeurt er met die cellen tijdens ontwikkeling? Volgen van de kleurstoffen → bepaalde cellen geven aanleiding tot bepaalde lagen in het embryo. Er valt iets te zeggen over wanneer cellen “weten” wat ze worden. Ontwikkelingsgenetica = rol van genen in relatie tot ontwikkeling; effecten van mutaties bekijken mbv mutanten en genetische screens. Groot gebruik van modelorganismen. Begrippen experimentele embryologie: Cell fate = het “lot” van de cel: welke kant gaat de cel uit. Specified/committed = cel is “op weg” een bepaald celtype te worden, maar kan nog switchen van celtype! Nog niet gedetermineerd. Determinatie = bepaalt welk celtype een cel zal worden, maar ziet er dan nog niet zo uit.

Embryo zal ontwikkelen tot een organisme met hoofd (groen) en thorax (rood). Uit zo’n embryo stukjes transplanteren naar ander embryo → wat gebeurt er met het stukje? - Transplantatie in niet gedetermineerd embryo → embryo ontwikkelt normaal. - Transplantatie in gedetermineerd embryo → op het hoofd ontstaat een stuk ander weefsel wat op thoraxweefsel lijkt; komt doordat er al een celverdeling was gemaakt.

Embryogenese: verschillende stappen: Inductie: signalen naar de cel. Specificatie: bepaalde richting, nog geen determinatie. Determinatie: duidelijke bepaling van celtype. Differentiatie: uiteindelijke verschijningsvorm van de cel.

Regional determination = positie-specifieke eigenschappen van een cel; een bepaald stuk weefsel weet al of het bij de voor-/achterkant van het dier hoort, maar nog niet wát voor deel (denk teen, knie, etc.). Tijdens embryogenese ontstaan uitstulpingen met bepaalde factoren die bepalen of het bijv. een vleugel/been wordt. Afbeelding: neem stuk mesoderm weefsel dat dijbeenstructuren zou vormen en breng het in vleugeluitstulping in → ontwikkeling van het weefsel verandert richting klauwen i.p.v. vleugels. Hoe worden cellen verschillend? Asymmetrische/symmetrische deling - Asymmetrische deling = kan d.m.v. stoffen die in de cel zitten: met één asymmetrische deling krijg je 2 celtypen. Één dochtercel krijgt de stof uit de oorspronkelijk cel mee, de ander niets → 2 verschillende cellen. - Symmetrische deling = dochtercellen uit een deling gaan verschillen door invloeden vanuit verschillende omgevingen waarin ze zitten. - Laterale inhibitie = tussen dezelfde cellen die met elkaar in contact staan. Is een soort communicatiewedstrijd tussen 2 cellen: één v/d cellen produceert meer van een stofje; positieve feedback → versterking tot het punt dat de cellen zo verschillend zijn dat ze niet meer teruggaan naar oorspronkelijk type. Het is een zelfversterkend effect → bistabiele situatie: de ene cel heeft bijna geen stof meer en de andere heel veel; deze situatie blijft gehandhaafd. De stoffen die hier een rol spelen zitten vast aan de cellen en diffunderen niet!

Inductieve interactie: cellen scheiden bepaalde stoffen uit, welke diffunderen over een gradiënt. Stof heeft effect op andere cellen; afhankelijk van de hoeveelheid + afgelegde afstand heeft het groot/klein effect. Contact tussen cellen iets verder weg gaat over een morfogenetisch veld: d.m.v. stoffen die wel kunnen diffunderen (morfogenen) en invloed kunnen uitoefenen op andere cellen!

Morfogenfamilies: Receptor tyrosine kinases (RTK)

TGF-β familie: vele variaties en vele receptoren.

Wnt (Wingless) familie

Hedgehog familie

Notch familie: zorgt ook voor laterale inhibitie: Notch is receptor, Delta het ligand.

Dit zijn 5 families van genen die coderen voor receptoren/liganden die belangrijk zijn bij ontwikkelingsbiologie. Morfogenen: graduele effecten, diffunderen vanuit een centrum. Diffusie gaat over een bepaalde afstand, max een paar mm. Bepaalde stoffen scheiden morfogenen uit, die zich verspreiden over de omgeving en daarmee met afstand afnemen in concentratie. Concentratieverandering per afstand wordt bepaald door: - Diffusiesnelheid - Halveringstijd van het morfogen

Voorbeeld is het Sonic Hedgehog morfogen (SHH). Sequentiële inductie Verschillende gradiënten Celtype C kan ontstaan door effecten van cel B op cel A. Cel C scheidt vervolgens een morfogen uit, wat kan reageren op cel A en cel B, waaruit celtype D en celtype E ontstaan. Dit heet sequentiële inductie. C. elegans Klein wormpje (+-1 mm.) met 18 000 genen. Heeft een vast aantal somatische cellen (959) en heel veel geslachtscellen. Het heeft 2 geslachten; hermafrodiet of mannelijk. Door zijn transparantie en een vast aantal zijn cellen makkelijk te volgen. Is een simpele “buis in een buis”-structuur: ectoderm vormt bescherming tegen buitenwereld, binnenste buis (endoderm) vormt de darm met opening aan de voorkant, daaromheen enkele weefsels uit het mesoderm (spierweefsel etc.). Cellen zijn vroeg gedetermineerd, maar pas na laatste deling gedifferentieerd in hun uiteindelijke functie. Goed modelorganisme voor genetisch onderzoek. P-granules → stoffen die aan één kant van de eicel zitten: het zijn RNA-eiwitriboproteïncomplexen. Tijdens celdeling gaan ze geheel naar één dochtercel: voorbeeld van asymmetrische deling! P-granules zijn door de moeder in de eicel gelegd (maternaal effect). Door de P-granules is die cel al specifiek anders dan andere cellen: voorloper van geslachtscellen.

Cel-cel interacties → leidt tot complexere patronen. Voor- en achterkant van de eicel zijn aan te wijzen door P-granules. AB-cel zit anterior (→ huid, neuronen, pharynx, etc.) en de P1-cel zit posterior (→ geslachtscellen). Deze 2 cellen zitten in een vlies. Bij volgende deling ontstaan er 4 cellen: P1 → P2 en EMS AB → ABa en ABp

ABa heeft nu geen contact meer met P2, wel met de andere twee cellen. Door een volgende deling ontstaat een klompje van 6 cellen met elk een verschillend celtype. 4-cellig stadium P-granules zijn anders, P2-cellen dus ook. ABp cellen → Notch-receptoren voor ligand Delta. EMS cellen → Frizzled-receptoren voor ligand Wnt. P2 scheidt de liganden (Delta en Wnt) uit, waardoor beide cellen anders reageren, omdat ze verschillende receptoren hebben. Wnt-Frizzled → receptor-ligandinteractie: alleen daar waar Wnt de receptor activeert zal omzetting komen: er ontstaan 2 verschillende celtypen → de E-cel zal anders zijn dan de MS-cel: er ontstaan verschillende weefsels. Ook een voorbeeld van asymmetrische deling!

Mutaties → een cel kan niet meer Wnt uitzenden, Frizzled wordt niet gebonden: één van de twee celtypen in EMS cel wordt niet geactiveerd, bijv. E → E-cel ontwikkelt niet en er wordt nooit darm (E) gevormd, maar wel meer spier (mesoderm, MS). Mutanten zijn niet levensvatbaar; te volgen onder microscoop! Apoptose = geprogrammeerde celdood. Tijdens ontwikkeling van C. elegans moeten cellen verdwijnen (teveel cellen); in dit model werd apoptose als eerste herkend. Cellen kunnen uit elkaar spatten/kapotgaan → necrose: nadelig, alle inhoud komt vrij en zorgt voor ontstekingen. Apoptose geeft de cel een signaal waardoor de cel zich van binnen uit opeet. Het is een onderdeel van normale ontwikkeling. Drosophila melanogaster Fruitvlieg; gemakkelijk genen manipuleren/muteren → verschillende mutanten met morfologische/fysiologie mutaties. Heeft 14 000 genen en 100 000 somatische cellen. Ontwikkeling: - Dag 0 → bevruchting eicel - Dag 1 → gehele embryonale ontwikkeling gehad: larve (3 stadia) - Dag 5 → verpopping - Dag 9 → metamorfose: Drosophila vlieg

Tijdens de ontwikkeling ontstaat een syncytium: meerkernige cel door fusie van verschillende normale cellen. Kernen migreren naar de periferie en er vormen celgrenzen → verdeling van somatische en primordiale kiemcellen. Syncytium gastruleert en vormt een embryo met segmenten.

Blastoderm (blastula v/d vlieg) → mogelijke voorspelling van celtypen; in het begin al een specificatie van in welke regio welke cellen zitten (segmentatie). Je kunt een “fate-map” maken van het blastoderm. Voor-/achterkant en buik-/rug- en laterale zijde van het embryo zijn bepaald. Segmenten, extraembryonaal weefsel en mesoderm weefsel zijn te herkennen. Interne gradiënten: zorgen voor de eerste organisatie in de eicel. Eicel zit in een asymmetrische follikel met eromheen voedingscellen (nurse cells). Organisatie A-P as: in de eicel worden lokaal mRNA’s neergelegd: nanos en bicoid, resp. posterior en anterior.

Deze mRNA’s zorgen voor eerste organisatie → er ontstaat asymmetrie in de eicel. Nanos en bicoid bepalen: Germ cellen vs somatische cellen Hoofd vs uiteinde Lichaamssegmenten Organisatie D-V as: cellen om de eicel heen zorgen ook voor aanleg van transmembrane receptoren: Torso en Toll, resp. voor het terminale systeem en het dorsoventrale systeem; zorgen voor: Ectoderm vs endoderm vs mesoderm Terminale structuren

Verdere patroonvorming embryo Door verschillende gradiënten ontwikkelen structuren nog meer. Eiwit Dorsal geeft een gradiënt waardoor bepaalde cellen wel/niet een fenotype aannemen. Dorsal hoog → zygotische genexpressie: afschrijving van Twist (hoog), Sog (gemiddeld) en Dpp (laag). Hierdoor ontstaan 3 verschillende celtypen.

Eiwitproducten van de genen diffunderen en vormen een gradiënt: zorgt voor verdere differentiatie door receptorbinding. Zo worden aantal regio’s gespecificeerd (1e organisatie): komt allemaal van morfogenfamilies die interacties aangaan met receptoren. Ontwikkeling insecten ↔ vertebraten Na gastrulatie: primaire embryo’s zien er vrij hetzelfde uit; enige verschil is omkeer van buik- en rugzijde. Voor de rest is lichaamsbouw geconserveerd tussen insect en zoogdier. D. melanogaster – ontwikkeling langs de AP-as Morfogenenfamilie activeert genen van de volgende morfogenenfamilie, enz. Afbeelding → egg-polarity genes zorgen voor een gradiënt, waardoor verschillende regio’s met verschillende transcriptiefactoren ontstaan d.m.v. gap genes. Gap genes activeren pair-rule genes → celtypen ontstaan met wel/niet een bepaalde expressie door de transcriptiefactoren van de gap genes. Genexpressie zorgt voor vorming van segmenten in het embryo door segment-polarity genes, versterkt door gen Engrailed.

Alles staat onder invloed van homeotische selectorgenen (hox-genen)! Alle cellen een eigen identiteit en cellen weten of ze voor-/achtersegment zijn. Zorgen ook voor celgeheugen. AP-segmentatie Door opeenvolgende groepen van regulatiegenen wordt organisatie steeds meer verfijnd. Vier transcriptiefactoren spelen een rol: Bicoid, Giant, Hunchback en Krüppel; vormen allemaal gradiënten op verschillende plekken v/h embryo → overal verschillende combinatie van concentraties v/d transcriptiefactoren. Zo ontstaat verdere ontwikkeling v/h embryo!

Het gen “Eve” Dit gen heeft naast een coderende regio ook veel herkenningselementen voor transcriptiefactoren. Als dit goed aangeschakeld wordt, komt Eve tot expressie. Eve wordt dus geactiveerd door een set transcriptiefactoren: juiste combinatie → Eve wordt afgeschreven (anders niet). Eve komt in banden tot expressie in het embryo door verschillende gradiënten v transcriptiefactoren. VB → regulator voor band 2 staat aan in aanwezigheid v Bicoid en Hunchback, maar zonder Giant of Krüppel Homeobox genen (hox genen) Deze genen zorgen voor identiteit van segmenten. Regulatie van hox genen zorgt voor “long-term memory” van cellen. Verschillende hox-genen liggen op volgorde als hoe de segmenten liggen op het chromosoom. Genen bepalen uiteindelijk karakter van elk segment in het embryo. Producten van hox-genen vormen een gen-regulatoire eiwitfamilie: hebben een 60 aa groot DNA-bindend domein (homeodomein). Homeobox = de DNA-sequentie dat codeert voor het homeodomein. Hox-genen worden aangeschakeld wanneer alle genen die aanwezig zijn in het embryo worden aangezet: egg-polarity, gap- en pair-rule genes. Ze zorgen dat hun eigen expressie bewaard blijft → onderdrukt expressie van hox-genen voorgaand in het rijtje; deze worden niet meer getranscribeerd. Imprinting genes worden geactiveerd: komen tot expressie in het hox-complex. Genen die daar tot expressie komen, zal dat blijven doen; genen die niet tot expressie komen, zullen dat daar nooit meer doen. Zo ontstaat een positioneel geheugen (werkt langdurig)! Betrokken genen hierbij zijn: - Polycomb → repressie van hox-genen (chromatine remodeling); alles wat toen niet tot expressie kwam wordt opgesloten door histon modificatie. - Trithorax → handhaven van hox-gentranscriptie in juiste segmenten; regio’s die actief worden afgeschreven blijven open; transcriptie blijft aanstaan.

Kunnen bij iedere cel transcriptioneel patroon van het hox-complex vastleggen. Hox-complex in insecten Bij Drosophila (popstadium) hebben de cellen een stukje geheugen ingeprint: alleen dan kan de volwassen vlieg ontstaan.

Rommelen in expressie van Polycomb/Trithorax → problemen met ontwikkeling van het dier: alle hox-genen komen tot expressie, dus alle hox-genen naar voren worden uitgeschakeld en het achterste hox-gen wordt dominant → alle segmenten zien eruit als het laatste segment. Hox-complex in zoogdieren Insecten hebben één hox-complex: bij zoogdieren wordt het complex 4 keer herhaald. Hox-genen en ontwikkeling Mechanisme hox-genen: Hox-genexpressie → productie hox-eiwit (transcriptiefactor) → komt in de kern, bindt DNA en initieert transcriptie → expressie van weefselspecifieke genen → weefsels ontwikkelen op goede volgorde op het goede moment. Transcriptiefactoren kunnen allerlei genen activeren: ook schakelen ze voorgaande hox-genen uit. Door verschillende genen is er differentiatie naar goede celtypen. VB – knockout van A11 → geen “gele” expressie meer: op het stuk waar de ellepijp zou moeten ontwikkelen, is geen expressie van het hox-gen door de mutatie (knockout). Over het gehele stuk waar “geel” (ellepijp) tot expressie zou moeten komen blijft “blauw” (bovenarm) tot expressie komen. Resultaat: een abnormaal ontwikkelde arm met erg lang bovenarm (door meer expressie van “blauw” ipv “geel”).

Ontwikkeling van organen/ledematen is een verdere verfijning van patroonformatie: hierbij worden compartimenten van cellen gevormd. Cellen specialiseren volgens het “programma” van dat compartiment. Regulatoire genen/morfogengradiënten spelen hierbij ook een rol. VB – vleugelformatie en “borstontwikkeling” bij Drosophila, ledemaatformatie bij vertebraten. Vleugelformatie bij Drosophila De vorming van vleugelcompartimenten worden gereguleerd door genen engrailed en apterous. Verdere ontwikkeling v/d compartimenten komt door wingless, hedgehog, Dpp en Notch gereguleerd. Expressie van de genen op verschillende plaatsen/momenten zorgt voor ontwikkelingen. Compartimentgrootte regulatie (insecten) De grootte van organismen/organen/ledematen/compartimenten is strak gereguleerd; onbekend waardoor. Cel-aantal lijkt geen grote rol te spelen, mogelijk een rol voor factoren die van oorsprong aanwezigheid van nutriënten registreerden. Kan ook zo zijn dat fysieke afstand wordt gemeten, bijv. door stijlheid v/e morfogen gradiënt.

Compartimentgrootte regulatie (vertebraten) Vorming van compartimenten in de ledematen wordt door precies dezelfde genen gereguleerd als bij Drosophila. Tast-haar ontwikkeling Ontwikkeling van tastharen bij Drosophila laat zien dat zelfs op het kleinste niveau (4 cellen) dezelfde ontwikkelingsprincipes/mechanismen worden toegepast. Ontwikkeling gaat dmv laterale inhibitie: selectie van de precursorcel (sensory mother cell) bij borstelontwikkeling gaat door competitie in de Notch pathway. Elke cel kan een buurtcel remmen: meer Delta zorgt voor meer binding van de Notch-receptor, wat bij die cel zorgt voor een verminderde Delta-productie, waardoor de andere cel minder wordt geactiveerd op de Notch-receptor → ontstaat een “mozaïek” → moedercel. Wnt-Frizzled interacties kunnen ook zorgen voor een polariteit in de cel: uitstulpingen staan daarom altijd dezelfde kant op. Principes, patronen en mechanismen worden in tijd/ruimte/verschillende soorten een aantal keer herhaald waardoor uiteindelijk het “lot” van iedere cel in het organisme wordt bepaald. Kleine veranderingen in expressiepatronen → grote invloed op ontwikkeling organisme. Ontwikkeling v/d klauwpad (Xenopus laevis) Vormt het beste model voor studie van ontwikkeling. - Eerste 6/7 uur: geen groei, ~12 celdeling zonder G1/G2-fase. - Na 7 uur: celdeling met G1/G2-fase, groei komt langzaam op gang en er is gastrulatie. - Na 18/20 uur: lichaamsvorm ontstaat met kop/staart, rug/buik en links/rechts oriëntatie.

Er zijn asymmetrische verdelingen van mRNA en eiwitten in de eicel: er ontstaat polariteit, waardoor een “sperm entry point” wordt gevormd (marker voor polariteit in bevruchte eicel). Zo ontstaan er ook gradiënten in de bevruchte eicel waardoor verschillende celtypen kunnen ontstaan. In de blastula al 3 basistypen cellen herkenbaar; ecto-/endo-/mesoderm. Gastrulatie → door bewegingen invagineren cellen door de “pole” heen, waardoor een typische “buis in een buis”-structuur ontstaat. Signalen die de organisatie van gastrulatie besturen zijn afkomstig van de moeder. Tijdens neurulatie ontstaat de ruggengraat. Mus musculus (muis) → zoogdier dat dicht bij de mens staat qua genen (veel gelijkenissen), maar ook evolutionair gezien. Ze hebben een snelle reproductie. 80-90% identiek aan de mens qua aminozuuridentiteit. Muis wordt gezien als goed modelsysteem voor menselijke ontwikkeling en medicijnontwikkeling.

Muizen vormen vaak de eerste ronden van medicijntesten. Het is geen perfect modelorganisme → verschillen, zeker in regulatie van genexpressie. Alle resultaten in medicijnonderzoek op de muis dus niet noodzakelijkerwijs hetzelfde in de muis. Door een korte levensduur (5-6 jaar) zijn ze snel door te kruisen en vormen ze een goed organisme voor genetisch onderzoek door bijv. het aan/uit zetten van genen. Eerste ontwikkeling bij de muis - Eicel v/d muis (80 μm doorsnee → fractie v/h volume van eicel v amfibie): hierin zijn de maternale/paternale pronucleus nog gescheiden in aanwezig. - Cel gaat delen, niet groeien: tempo van delen is veel lager dan bijv. bij de kikker. - Midblastula transitie bij 2-cellig stadium → productie mRNA. - Na 4 dagen: blastocyst → bestaat uit trophectoderm en inner cell mass.

Trophectoderm (extra-embryonische structuren) ontwikkelen in amnion, chorion, navelstreng en placenta; worden geen onderdeel van het muisembryo. Inner cell mass ontwikkelt verder tot het embryo. Ontwikkeling wordt snel gereguleerd door genen die tot expressie komen door genen van de cellen zelf. 8-cellig stadium → alle cellen zijn nog hetzelfde en kunnen alles worden. Experiment: twee 8-cellige embryo’s: een van een muis met witte en een van muis met zwarte vacht. De zona pellucida (omhulsel om cellen) wordt verwijderd en de 2 embryo’s laten ze fuseren → klompje van 16 cellen van 2 verschillende “moeders”. Moeders zijn isogeen: ze verschillen alleen in vachtkleur! Blastula vormt met verschillende cellen → cellen mengen gelijkelijk: zwarte en witte cellen worden beide onderdeel van de nieuwe muis; de helft v/d muis is wit, de helft zwart. Chimere muis!

Inner cell mass cellen zijn pluripotent: ze kunnen nog alle soorten celtypen worden! Pluripotente embryonale stamcellen (ES cellen): zijn intrinsiek onsterfelijk en kunnen nog alle celtypen worden. Ze vormen een potentiële bron voor transplantaties/weefsel repair. Precieze genetische modificatie is ook mogelijk. Cellen uit de inner cell mass van een embryo kun je in een kweekschaaltje doen: met juiste factoren kunnen cellen groeien zonder pluripotente karakter te verliezen. Ze kunnen fuseren met inner cell mass van een ander embryo, omdat deze mass zijn cellen niet telt → groeit gewoon uit tot een blastula. Voortplantingscellen kunnen dan ontwikkelen uit de oorspronkelijke cellen of de geïnjecteerde ES cellen. Stamcellen zijn theoretisch oneindig te delen: genen zijn weg te halen uit het genoom van cellen die daar groeien. Genetisch gemodificeerde ES lijnen zijn zo te maken → zijn te injecteren in een embryo: een embryo met op bepaalde plekken van het lijf een knockout van dat gen ontwikkelt: dit zijn transgene muizen. F1 is chimeer, door een keer door te kruisen heb je 25% kans op homozygoot knockout muis in F2. Teratoma → als je een embryo in de nieren/testis van een volwassen dier injecteert, ontstaat er (door goede groeifactoren) een klomp cellen die denken dat ze aan het differentiëren zijn → er ontstaan klompjes cellen met verschillende eigenschappen door misopgevatte signalen. Leidt tot tumoren, kanker.

Transgene muizen maken Patroon-ontwikkeling → ontstaan van vertakte structuren (longen, bloedvaten etc.). Gaat altijd om een interactie tussen twee weefsels (bijv. endo-/mesoderm) die door elkaar heen gaan. Epitheel (groen) heeft receptoren voor groeifactoren uit het mesenchym (blauw). Epitheel groeit richting de plek waar die factoren worden uitgescheiden; weefsel 1 zendt signaal uit, weefsel 2 groeit ernaartoe. Het groeiende epitheelweefsel gaat remmers uitscheiden → remt groeien van het epitheelweefsel op die plek. Twee nieuwe bronnen van groeifactor worden gecreëerd waar het epitheel weer naartoe groeit. Interactie van verschillende signalen zorgt voor vorming van vertakkingen.

De huid Enorm orgaan dat beschermt tegen het extern milieu (droogte/kou/warmte) en schadelijke invloeden. Cellen zijn gezamenlijk een orgaan geworden van behoorlijke grootte en belang. Voor beweging moet de huid ook flexibel zijn → moet kunnen buigen/bewegen. De huid geeft informatie over de externe omgeving. Bloedvoorziening gaat via bloedvaten van endotheelcellen; zorgen voor aanvoer van nutriënten/O2 en afvoer van afvalstoffen/CO2. Liggen vlak onder de huid → makkelijke warmte-uitwisseling. Cellen van het immuunsysteem bereiken de huid via het bloed (macrofagen/dendritische cellen/lymfocyten).

Zenuwvezels in de huid zorgen voor sensorische/motorische informatie (contractie, secretie). Keratinocyten: dominante cellen in het epidermis, ook wel “basale cellen” genoemd. Het epidermis is 6/7 cellagen dik, daartussendoor zitten ook nog cellen als dendritische cellen van het immuunsysteem. De dermis (lossere/dichtere vorm) bestaat uit een heleboel fibers (collageen) en een hoop macrofagen, belangrijke immuuncellen. Fibroblasten groeien ook in de dermis en vormen collageenfibers. Keratinocyten worden met de tijd langwerpiger en gaan minder/niet meer delen, gaan er minder gezond uit zien en ontwikkelen tot cellen met hoop granules → vormen granulaire laag (waterdicht). Ontwikkelen verder tot tegelcellen, laag met verschillende connecties naar elkaar; bijna alleen bestaan uit keratine → laag van 6-10 cellagen: vormt de opperhuid. Hier vanaf vallen ook huidschilfers. De laag wordt continu vernieuwd. Stamcellen: zijn niet terminaal gedifferentieerd en kan (theoretisch) oneindig delen. Na deling kunnen dochtercellen kiezen: - Zelfvernieuwing → dochtercel is exact hetzelfde als de oorspronkelijk delende cel. - Differentiatie → dochtercel ondergaat ontwikkeling → terminaal gedifferentieerde cel; is niet meer hetzelfde als de stamcel. Differentiatie v/d stamcel kan door omgevingsinvloeden of asymmetrische delingen.

Als de ratio zelfvernieuwing:differentiatie altijd 1:1 is zal een populatie stamcellen nooit vermeerderen. VB – beschadiging van de huid → stamcellen gaan meer delen: meer cellen om de lesie op te vullen. Basale laag: laag waarin de stamcellen zitten. Huid zit meestal in plooien: stamcellen zitten hier bovenop, want daar is integrine-β1

expressie: dit zorgt voor karakter van de cellen als zijnde stamcel. Cellen delen door: sommige cellen worden door delingen naar beneden gedrukt en worden transit amplifying cells (tijdelijk delende cellen). Transit amplifying cells zorgen voor meer weefsel. Dan verliezen ze contact met de basale lamina omdat er teveel cellen zijn: cellen drukken zich uit die laag, verliezen een stukje karakter → pad van terminale differentiatie in werking. Deze cellen gaan differentiëren; kunnen geen stamcel meer worden meer wel veel andere celtypen. Contact met basale lamina nodig voor behoud stamceleigenschappen!

Zonder zelfvernieuwing kun je stamcellen kwijtraken: als in de niche per ongeluk stamcellen verloren gaan, kunnen daar wel nieuwe stamcellen ontstaan → 2 dochtercellen doen zelfvernieuwing. Tijd tussen delen van stamcellen en vormen van de laag is een vaststaand patroon. Als je dit patroon verandert (→ meer groeifactoren) is er een grotere flux van cellen → meer cellen door het hele systeem → psoriasis = proliferatiesnelheid basale cellen. Cellen hebben niet kunnen differentiëren, er ontstaan dan een rode, dikkere huid. Sommige stamcellen houden hun originele DNA: systeem in de cel zorgt ervoor dat het originele chromatiden in één cel blijft, niet dat chromatiden mixen. Voorkomt dat mutaties die met replicatie kunnen optreden onderdeel worden van de stamcel. Melkklieren Buiten zwangerschap zijn melkklieren in rust: tijdens zwangerschap groeien alveoli cellen vanuit stamcellen (alleen dan!). Productie van melk gebeurt pas na geboorte. Na het stoppen met zogen is er melkaccumulatie → inductie van apoptose → teruggaan naar rustende klier. Reuk Reukorganen zijn ook uit het ectoderm afgeleid. Reukcellen: cellen die met een receptor stoffen kunnen herkennen (meestal organisch met ringstructuur); ze zitten in de neusholte en zijn één v/d primitiefste organen. Reukcellen raken snel beschadigd door direct contact met de externe omgeving → continue vervanging door stamcellen in de basale laag. Stamcellen zorgen voor regeneratie van deze cellen. Reukcellen krijgen signalen binnen en sturen hun axonen naar het brein. Er zijn 100’en verschillende receptoren, want 100’en verschillende stoffen: één cel herkent één stof. Integratie van alle axonen van de cellen vindt plaats in de bulbus olfactorius in het brein. Gehoor Bestaat uit een aantal ondersteunende cellen en cellen met cilia aan de buitenkant (maken het gehoor) → zijn te bewegen door membraan in het oor. Cellen zijn verbonden aan een zenuw, wat signalen doorstuurt in de vorm van actiepotentialen. Gehoorcellen worden nooit vernieuwd: geen stamcellen → bij lange belasting verdwijnen cellen en komen nooit meer terug. Mechanische beweging wordt vertaald in membraandepolarisatie: ionenkanalen openen en er is flux van bepaalde ionen die zorgen voor een axonpotentiaal in de zenuw naar het brein. Zicht Het oog heeft ook geen stamcellen, moet het hele leven mee. Licht gaat dwars door neuronen/axonen heen en komt dan pas op kegeltjes/staafjes. Daaronder zit een epitheellaag met pigment. Staafjes/kegeltjes zijn de fotoreceptoren: hebben een kern en verbinding met het brein. Lichtgevoelige stoffen, bijv. rodopsine, zorgen voor reactie op licht. Cellen worden niet vernieuwd, rodopsine wel. Rodopsine = een molecuul dat aangeslagen wordt door licht en een signaal afgeeft; gevoelig voor afbraak, want het wordt steeds in een andere toestand gebracht.

Je kunt cellen radioactieve aminozuren geven en kijken wat er mee gebeurt: ze gaan eerst rond de kern zitten om eiwitten te maken. Als alle radioactieve aminozuren zijn gebruikt om bijv. rodopsine te maken, schuiven ze langzaam naar boven, rodopsine wordt door epitheelcellen gefagocyteerd en afgebroken → continu proces van afbraak van rodopsine. Longen Door vertakkingen ontstaan longblaasjes: heel dunne/holle cellen. Alveolicellen kennen twee typen, 1 en 2: zorgen voor structuur en oppervlaktespanningverlaging. Alveolicellen zitten om bloedvaten heen om bescherming te bieden (type 2): scheiden een soort surfactant (oppervlaktespanningverlager) uit. Surfactant → bij ademhaling komen alveoli dicht bij elkaar; zonder surfactant zouden ze aan elkaar plakken. Embryo’s na 25 wkn pas levensvatbaar, want dan wordt de surfactant aangemaakt!

De long kent ook geen stamcellen: longcellen delen een x aantal keer. Longepitheel wordt dikker hoger in de longen. Soms zitten er al macrofagen in de long; maar meeste aan binnenkomend materiaal wordt bovenin opgevangen mbv goblet cells (produceren slijm) en cellen die beweging omhoog mogelijk maken (ciliated cells). In de longen zit een slijmlaag → deeltjes omhoog zodat het uitgehoest kan worden met slijm. Als macrofagen in de alveoli hun werk hebben gedaan, kan dat ook naar boven → buiten worden gebracht. Darmen In de darm is er continue vernieuwing van cellen. Darm heeft vili en crypten → zorgen voor oppervlaktevergroting van de darm; zorgen er ook voor dat cellen op een gespecialiseerde manier kunnen werken. Turnover van de darm is 7 dagen → cellen staan aan veel mogelijke beschadigingen. VB – stralingsziekte: alle stamcellen in de darmen vernietigd → geen herstel meer van darmweefsel: darmen gaan eraan.

In crypten zitten stamcellen, die enzymen uitscheiden naar de zijkant. Daarboven zitten sneldelende cellen die naar boven gaan en op de punt van een vili terecht komen. Vili → 4 celtypen: Absorberende cellen → nemen stoffen uit de omgeving op. Goblet cellen → zitten ook in de long, scheiden slijm uit voor betere doorvoer van voedsel. Enteroendocriene cellen → produceren vanuit de darm stoffen die weefsels ingaan en zorgen voor signaalcommunicatie vanuit de darm naar andere weefsels. Paneth cellen → scheiden specifieke antibiotica uit (algemeen werkend).

Darmadenoom → uitgroeiing van het colon; gebeurt door een fout Wnt-signaal. Wnt speelt bij dit soort ontwikkelingen een belangrijke rol: Wnt-pathway is actief bij de crypten, inactief bij de vili. Als overal wel Wnt tot expressie wordt gebracht wordt er gewoon door gedeeld en is er geen/minder differentiatie.

Wnt-/Notch-signalering in de darm Wnt-signalering reguleert groei, Notch-signalering reguleert differentiatie. Wnt zit dus in de crypte en Notch in/op de vili. Transit amplifying cells worden naar buiten gedrukt (uit de crypte). Als het Wnt-signaal verdwijnt, komt er laterale inhibitie. Een kleine variatie in expressie kan worden versterkt tot het punt waarbij de ene cel Notch heeft en de ander niet. EphB-signaling → bepaalt migratie van darmepitheelcellen. Geen Wnt = geen celdeling: vanuit de crypte tot aan het puntje van een vili varieert EphB-expressie. Op de vili komt ephrine tot expressie → zorgt dat cellen niet meer in de crypten kunnen komen. Cellen in de crypte brengen EphB tot expressie → cellen blijven in de crypte. Als Wnt-signaling verdwijnt, verandert expressie van die transmembrane signaalmoleculen; crypteigenschappen kunnen nu ook op de vili terechtkomen. Hedgehog en Wnt signalen vanuit de crypte zorgt dat in de vili BMP4 tot expressie komt. BMP eiwitten remmen expressie van Wnt en Hedgehog in het vilusepitheel, waardoor de cellen niet meer terug naar de crypte gaan. EphB mutanten → geforceerd EphB in alle cellen tot expressie; alle cellen gedragen zich als cryptecellen. Lever Één celtype, vele functies. Hepatocyten zijn onderling verbonden door dunne kanaaltjes die zorgen voor afvoer van gal. Ze zorgen o.a. voor absorptie van nutriënten, synthese van eiwitten/vetten en productie van gal. Hepatocyten kunnen blijven delen, zijn gedifferentieerd en zorgen voor herstel van de beschadigde lever → kunnen dus delen en zelfvernieuwen zonder stamcellen! Als er iets gebeurt met de lever, vindt meestal herstel plaats door celdeling. Bloedvaten Endotheelcellen vormen de binnenwand van arteriën en capillairen. Om het bloedvat kunnen spierlagen, lamina’s en bindeiwitten liggen. Lamina’s kunnen ontstaan uit één cel of uit meerdere cellagen. Één cel krult dan om zichzelf heen vormt een buisje (→ capillairen). Endotheelcellen moeten groeien. Herstel van beschadigingen in vaten → meer endotheelcellen nodig voor herstel en het proces van angiogenese (vorming nieuwe capillairen). Endotheelcellen kunnen reageren op signalen door vorming van pseudopoden (nepvoetje) waaruit ze kunnen groeien → aftakking uit het bloedvat. Angiogenese wordt gereguleerd door groeistoffen, bijv. VEDF. Bij weefselschade is er veel angiogenese op plaats van schade → meer aanvoer van bloed, dus meer uitstulpingen uit bloedvaten. Tijdens zuurstofgebrek is de groeifactor HIF-1. Diffusie van O2 is bij >1 mm niet meer mogelijk. Op een bepaald moment zal een weefsel genoeg O2 hebben, maar te weinig groeifactor. Een weefsel ver weg met weinig O2 scheidt hoge levels HIF-1 uit → hoge uitscheiding VEGF → angiogenese: vorming van een capillair. Kankercellen willen dit proces ook in gang zetten om groter te worden dan 1mm!

Bloed Veel verschillende celtypen in het bloed; bloed wordt gezien als orgaan. Het bloed bevat rode bloedcellen (erythrocyten), witte bloedcellen en bloedplaatjes; van erythrocyten zijn er het meest. Witte bloedcellen komen in meerdere vormen: origineel gedefinieerd op morfologie: - Monocyten - Macrofagen - Lymfocyten - Granulocyten

Allemaal cellen die betrokken zijn bij het immuunsysteem. Verhouding rode cellen:witte cellen:vloeistof = 45:1:54 Rode cellen → O2/CO2-vervoer. Witte cellen → afweer, fagocytose, antilichamen. Plaatjes → bloedstolling. Bloedsamenstelling wordt ook gebruikt bij samenstellen van EPO-gebruik bij wielrenners. Ontstaan bloed Bloed ontwikkelt uit multipotente stamcellen onder invloed van CSF’s (colony stimulating factors); hieruit worden anders voorlopers gevormd die aanleiding geven tot verschillende celtypen. Ieder celtype kan, afhankelijk van signalen, apart worden gemaakt in het beenmerg. Witte bloedcellen kunnen zelfs migreren vanuit het bloedsysteem naar de weefsels mbv cytokinen/chemokinen → kunnen door de celwand dringen om ontstekingen tegen te gaan. Demonstratie bestaan stamcellen → neem een muis, doodt alle stamcellen → muis sterft. Maar als je één stamcel injecteert, blijkt dat uit die ene cel het volledige bloed kan worden hersteld: bewijs voor de theorie dat bloedcellen ontstaan uit stamcellen. Stamcellen voor bloed De stamcel voor het bloed heeft een niche op het stroma van het beenmerg (“docking cell”). Het gen Kit is één van de componenten die de stamceleigenschappen behouden. De stamcellen hebben Kit en de stromacellen het Kit-ligand. Alle stamcellen weggehaald → één stamcel komt → alle stromacellen met Kit-ligand zorgen ervoor dat de stamcel geactiveerd wordt en deelt tot 2 nieuwe stamcellen; dit totdat de niches zijn aangevuld. Repopulatie van stamcelniches in de “lege” muis!

CSF’s CSF’s delen vaak subunits van receptoren voor verdere signaaltransductie. CSF’s kunnen invloed hebben op alle stadia van hematopoiese; sommige induceren apoptose. Stamcel “engineering” Stamcellen die gemaakt worden uit een inner cell mass kunnen gebruikt worden om verschillende celtypen te maken, bijv. proberen nieuwe neuronen/macrofagen te maken. Sommige celtypen zijn nu al wel zo te maken, andere niet. Levercellen hebben waarschijnlijk toch hematopoietische stamcellen waaruit levercellen te maken zijn. Embryonale/humane stamcellen kunnen mogelijk gebruikt worden bij ziekten (vervanging van defecte cellen, bijv. dopaminerge neuronen bij Parkinson) of weefsel repair; probleem bij dat laatste is nu nog afstoting van de cellen → mogelijke oplossing: therapeutisch kloneren?

Neurale stamcellen → stamcel voor bloed die terug kan migreren naar een hoger stamcelniveau om daarna een stamcel voor neuronen te worden. Worden gebruikt voor neurogenese in het brein, met name in de subventriculaire zone en de hippocampus. Hippocampale stamcellen zijn te kweken in vitro; na transplantatie differentiëren ze zich tot cellen die passen bij de nieuwe locatie, bijv. bulbus olfactorius. Transdifferentiatie = het differentiëren van bepaalde cellen in een ander celtype; bijv. van neurale stamcel tot hematopoietische stamcel of spiercel.

COLLEGE 1 ROTS Volgorde van gebeurtenissen is voor elk gen en stimulus anders. Ook kunnen verschillende gebeurtenissen samen zorgen voor een samengenomen gevolg: bijv. binding van transcriptiefactor A initieert 1 unit van transcriptie, transcriptiefactor B 2 units, maar als ze tegelijk binden initiëren ze wel 100 units van transcriptie. Transcriptionele synergie.

Genrepressie eiwitten → remmen transcriptie; 6 manieren: - Competitieve DNA-binding; binden en competitie aangaan met een activator; blokkeert diens werking. - Blokkeren van activatieoppervlak. - Directe interactie met de algemene transcriptiefactoren. - Recrutering van chromatine remodeling complexen. - Recrutering van histon deacetylases. - Recrutering van histon methyl transferase.

Start transcriptie → toegankelijkheid (histonen) en beschikbaarheid van juiste transcriptiefactor. Transcriptiefactoren kunnen wel aanwezig zijn, maar niet kunnen binden door DNA methylatie; biochemische toevoeging v/e methylgroep aan cytosine, mits voor guanine (CpG). CpG DNA methylatie → veel hypermethylatie; onderdrukt expressie van transposons. CpG eilanden → gebieden met veel CpG; meestal niet gemethyleerd. Een gemethyleerde C kan heel spontaan deanimeren: lijkt dan op een T, heeft gevolgen voor de genexpressie. Dichtbij promotors van 40% (ong.) v/d genen: - Actieve genen → weinig CpG-methylatie. - Inactieve genen → CpG-hypermethylatie.

DNA methylatie → remt transcriptie: - Preventie van DNA-binding door transcriptiefactor (herkenningsplaats). - Methyl-CpG-binding proteins (MBPs) recruteren co-repressor moleculen. - Recruteren van histonmodificerende enzymen.

DNA methylatie wordt doorgegeven: omdat de gemethyleerde C voor een G zit, zit aan de andere strand ook een gemethyleerde C voor een G; DNA-molecuul gaat delen; moedermoleculen hebben nog methylgroep, dochtermolecuul niet. Maintenance enzymen zien dit en voegen de methylgroep ook toe aan de dochterstrand. Stabiele genrepressie/-activatie.

Hetzelfde proces geldt ongeveer voor het doorgeven van histonmodificatie patronen. Imprinting → vorm van stabiele genrepressie; allel van moeder actief, van vader inactief (of vice versa). Mechanismen: - DNA methylatie → voorkomt binding TF, in geval van positieve TFs → repressie; voorkomt ook functioneren van elementen: in geval van insulator element → activatie.

COLLEGE 2 ROTS Celcylus → duplicatie en deling: bestaat uit 4 fasen. Zitten controlesystemen op; zorgen ervoor dat celcyclus niet misgaat; basisprincipe vergelijkbaar tussen modelorganismen: - Componenten - Regulering

Checkpoints kijken of er iets fout gaat → fout = apoptose. Defecte checkpoints kunnen kanker veroorzaken. Cyclus: de cel groeit, DNA wordt gedupliceerd, alle macromoleculen worden gedupliceerd, histonen worden aangemaakt (dan kopie van alles) → cel deelt in 2 dochtercellen. Strenge controlesystemen zitten in de cel, maar ook van buiten wordt de omgeving gesensored. Belangrijkste fasen → M- en S-fase. - S-fase → DNA gedupliceerd, duurt vrij lang (10-12 uur); 50% v/d cyclus. - M-fase → mitose (kerndeling) en cytokinese (werkelijke celdeling); ong. 1 uur. o Gedupliceerde chromosoomparen condenseren o Kernenvelop breekt o Zusters alignen in metafaseplaat o Zusters worden uit elkaar getrokken o Verpakt in 2 afzonderlijke kernen

Overlap tussen mitose en cytokinese → splitsen v/d 2 dochtercellen gebeurt al zodra kernen zich splitsen. Fasen: profase → prometafase → metafase → anafase → telofase → interfase →… Metafase-naar-anfase transitie gaat heel abrupt: chromosoomparen worden uit elkaar getrokken. G-fase, “gap” → voor groei en communicatie met externe/interne omgevingscontrole. G0 → rustfase, kan de cel zich jaren in bevinden: geen activiteiten tijdens G0. Restriction point → punt waarop de cel geen externe signalen nodig heeft om in de celcyclus te blijven of komen. Controlesysteem → 3 checkpoints: 1. Start checkpoint: begin v/d celcyclus. 2. G2/M checkpoint: chromosoom alignment. 3. M/A checkpoint: chromatideseparatie.

Cdk-cyclinecomplexen: Cyclines: 1) activeren Cdk’s en 2) brengen Cdk’s naar doeleiwitten. Cdk’s: fosforyleren (en dus activeren) doeleiwitten. Zijn 3 verschillende Cdk-cyclinecomplexen: - G1-S cycline: activeren Cdk’s aan einde v G1, helpen progressie door start checkpotint. - S-cycline: binden Cdk’s snel na progressie door start, stimuleren chromosoomduplicatie; blijft hoog tot mitose. - M-cycline; activeren Cdk’s die begin v mitose stimuleren op de G2/M checkpoint.

Er zijn ook G1-cyclines die G1-S cyclines helpen, zit niet in alle wel in meeste cellen. Na begin v/d M-fase worden alle cyclines afgebroken. Verschillende cyclines binden/activeren verschillende Cdk’s; zorgen voor start v verschillende processen. Zijn complexe eiwitsystemen die met elkaar praten op verschillende niveaus. Gentranscriptie vormt extra controle.

Binding van cycline zorgt niet alleen voor activatie van Cdk maar ook van specifieke targeteiwitten. Cdk-cycline complexactivatie Cyclines worden gemaakt, binden Cdk: cycline gaat iets meer open staan (T-loop) en bindt het Cdk: dit zorgt voor gedeeltelijke activatie. CAK (Cdk-activerende kinasen) fosforyleren actief het complex → volledig actief Cdk-cycline complex. Inactivatie v/h complex - Inhiberende fosforylatie: Wee1 kinase kan een remmende, 2e fosfaatgroep op het Cdk zetten. Activatie en remming dus allebei door fosforylatie, alleen ander soort. - CKIs (Cdk-inhibitors): zijn ook wel tumorsepressorgenen. Ze binden het actieve cycline-Cdk complex en inactiveren het → blokkering v/d actieve site of blokkering van ATP.

Cdk-activiteit → afhankelijk v/d volgende factoren: - Cyclineconcentratie: genexpressie, ubiquitilatie. - Cdk activating kinase (CAK). - (De)fosforylering, vooral belangrijk voor M-Cdk. - CKI, vooral belangrijk voor S-Cdk en G1-S cycline.

M/A transitie → wordt getriggerd door vernietiging van eiwitten; hoofdregulator hiervan is APC/C (cyclosoom – anaphase-promoting complex): dit soort regulatoreiwit zorgt voor destructie van andere specifieke regulatoreiwitten door kleine kopieën ubiquitine aan te brengen op die eiwitten → destructie door proteasoom. Ubiquitilatie!

APC/C katalyseert ubiquitilatie en destructie van 2 belangrijke eiwitten → securine (destructie activeert een protease dat zorgt voor scheiding zusterchromatiden) en S- en M-cyclines (destructie inactiveert de meeste Cdk’s in de cel). Targets van deze Cdk’s worden gedefosforyleerd → geïnactiveerd → nodig voor complete M-fase. APC/C blijft actief tot aan het eind van de G1. APC/C → normaliter inactief; moet reageren met Cdc20 (activerende subunit) om actief APC/C te worden. APC/C-Cdc20 complex herkent dan specifieke sequenties op targeteiwitten (cycline-Cdk’s) → met hulp van hulpeiwitten E1 en E2 brengt APC/C polyubiquitineketen op de complexen: dit wordt herkend en afgebroken door het proteasoom. Controle van activatie van cycline-Cdk complexen door afbraak van het complex.

Afbraak CKI’s: door SCF → ubiquitine ligase; activiteit hangt af van de substraatbindende subunits, F-box proteins. Fosforylatie van een CKI zorgt ervoor dat F-box proteins de target (CKI) kunnen herkennen en het SCF het kan ubiquitinleren → afbraak CKI door proteasoom. Controle van activatie van S-Cdks door afbraak van remmers (CKIs).

Begin celcyclus → DNA heeft pre-replicatiecomplex op de origins of replication. Elk chromosoom heeft meerdere origins: hier begint DNA replicatie. Initiatior proteins unwinden op deze plekken het DNA en brengen replicatie-enzymen op de 2 enkelstrengs templates → vorming van replicatievorken. Komt maar één keer per cyclus voor! Initiatie hierom verdeeld in 2 fasen.

In S-fase → S-Cdk actief, pre-initiatie complex gevormd; uiteindelijk DNA-replicatie wat gedeeld wordt → assemblage nieuwe prereplicatiecomplexen.

- Late mitose, vroege G1 → pre-replicative complex vormt: alleen hier initiatie van DNA replicatie mogelijk. - Start S-fase → vorming pre-initiatie complex: ontwindt het DNA en brengt DNA polymerase en andere replicatie-enzymen op de strand → initiatie DNA-synthese.

Wordt gereguleerd door componenten v/d celcyclus regulatie. Na replicatie → preRC eraf. Replicatiestart Origin recognition complex (ORC) → zit tijdens hele cyclus op het chromosoom, Late mitose, vroege G1 → eiwitten Cdc6 en Cdt1 binden het ORC → recruteren Mcm eiwitten → resulteert in pre-RC replicatie nu mogelijk! Grootste rol van pre-RC is laden van helicasen die het DNA unwinden. Eind v/d cyclus → eiwitten op ORC zijn gefosforyleerd; kunnen net weer opnieuw eiwitten/helicasen recruteren. S-Cdk - Formatie van het pre-initiatie complex - Blokkeert re-replicatie door: o Cdc6 → afbraak o ORC → inactivatie

APC speelt hier ook nog een rol bij: wordt hoog in de M-fase en remt dan geminin; Cdt1 wordt normaliter geremd door geminin, nu dus niet meer; Cdt1 is beschikbaar wat dus weer op het ORC kan zitten. Interfase (G1-S-G2) → gebeurtenissen helpen mee om het daadwerkelijke celdelingsproces te kunnen doen; voorbereiding op M-fase: - Replicatie van het DNA. - Duplicatie van het centrosoom (microtubili organising center) → nodig voor de 2 polen v/h spoelfiguur; vanuit centrosoom “stralen” de microtubili. - Groei van cytoplasma, organellen…

Centrosoom duplicatie → geïnitieerd door G1/S Cdk. Net als bij het DNA fungeren 2 helften als template voor dochtercentriden. In G0 zitten ze bij elkaar; zodra de cel in G1 komt worden de centrosomen gedupliceerd → uit elkaar getrokken in de M-fase. M-fase: mitose + cytokinese 5 fasen: - Profase → gedupliceerde chromosomen condenseren, centromeren bewegen naar 2 zijden, mitotische spoelfiguur vormt. - Prometafase → afbraak kernenvelop, chromosomen hechten microtubili. - Metafase - Anafase - Telofase

Celdeling → 6e fase: begint in anafase (overlappend met telofase) en eindigt in G1. M-Cdk’s → intiatie mitose. Betrokken bij: - Vorming van mitotisch spoelfiguur. - Binding chromosomen aan spoelfiguur. - Chromosoom condensatie (condensine activatie → fosforylatie). - Afbraak kernenvelop. - Herschikking actineskelet. - Voorbereiding chromosomen op separatie.

APC/C initieert zusterchromatideseparatie door afbraak securine. Zusterchromatiden worden bij elkaar gehouden door cohesine, en worden daarna gecondenseerd door condensine. Cohesine → structuren van 4 eiwitonderdelen die om de zusterchromatide heen zitten. Zitten op meerdere posities per chromosoom, zijn nodig voor goede verdeling in 2 stukken. Condensine → kan het DNA verpakken tot een hele compacte, mitotische chromosoom; wordt gefosforyleerd door M-Cdk. Kinetochoor → aanhechtingsplaats op chromosoom voor microtubili. Als er een stabiele configuratie is, dus kinetochoor links interacteert met spoelfiguur links en vice versa → geeft een stabiele spanning: bi-oriëntatie. Zo worden er geen negatieve signalen afgegeven; vallen weg. M-A checkpoint → alle chromosomen gebonden aan beide polen van het spoelfiguur? Geen negatieve signalen → APC/C stijgt. 3 typen microtubili - Kinetochore microtubili → aan de kinetochoor. - Astrale microtubili → aan de celcortex. - Interpolaire microtubili → zitten aan elkaar vast; migreren naar elkaar toe en binden aan elkaar; gaan een soort interactie met elkaar aan → motoreiwitten.

Interactie van astrale en interpolare microtubili kunnen de centromeren uit elkaar drijven. Anaphase promoting complex (APC/C) M→A transitie start abrupt door activatie van het APC/C complex. Functies APC/C: - Inactivatie M- en S-cyclines. - Inactivatie securines → activatie separases.

M-Cdk, nodig voor beginnen M-fase, kan ervoor zorgen dat APC/C geactiveerd wordt door binding aan zijn actieve subunit Cdc20. Actief APC/C ubiquitinileert ook het securine-separase complex. Als APC/C geactiveerd wordt breekt het securine af → separase niet meer geremd en dus actief → scheiding zusterchromatiden. Anafase → 2 delen, A en B: - Anafase A → chromosoomseparatie mbv kinetochore microtubili. - Anafase B → polen worden uit elkaar getrokken.

Zitten wel overlappende processen in A en B. Telofase → 2 dochter interfasekernen. Spoelfiguur moet worden afgebroken, en er moeten 2 nucleaire enveloppen gemaakt worden door fusie van kernenvelop fragmenten. Begin mitose → fosforylatie van de effectoreiwitten. Eind mitose → defosforylatie van de effectoreiwitten, met name door inactivatie van Cdk’s door afbraakcyclines, maar kan ook door activatie van fosfotases. M-fase → van einde G2 tot begin G1

Bevat de mitose met 5 verschillende fasen en cytokinese (tijdens ana- en telofase). Cytokinese → begint in anafase, eindigt in telofase. Wordt gemedieerd door de contractile ring.

Stadia v cytokinese: - Initiatie (juiste tijd, juiste plek) - Contractie - Membraan insertie (intracellulaire vesikels) - Completie

Bij het stadium van de midbody zitten ze nog een heel klein beetje aan elkaar vast, geen overblijfselen contractile ring. Kanker → ongecontroleerde celproliferatie; iets gaat niet goed op de checkpoints. Kanker bestaat uit verschillende stadia; vaak accumulerende mutaties die de agressie van de kanker versterken. Begint vrij mild; als het gaat invaseren en accumulaties ophopen dan wordt het ernstig. Is ook verminderde apoptose. Homeostase → normale celdeling, normale apoptose. Tumoren kunnen ontstaan door normale celdeling met verminderde apoptose, OF verhoogde celdeling met normale apoptose. Er zijn veel kankers die door virussen geïnduceerd worden. Virussen bevatten oncogenen, maar inactiveren ook tumorsepressor genen. CKI is nodig in het normale proces van een cel, als deze gemuteerd is en niet het cycline-Cdk complex kan inactiveren, dan gaat het celdelingsproces gewoon door. Humaan papilloma virus (HPV)→ baarmoederhalskanker. Celproliferatiefactor (retinoblastoma-eiwit) bindt over een transcriptiefactor heen; op dat moment is de transcriptiefactor niet actief. Het virus bevat eiwitten, E6/E7, dat retinoblastoma wegvangt. De transcriptiefactor kan niet geremd worden, dus gaat celproliferatie in gang. P53 → schadesensor; zorgt ervoor dat cel in apoptose gaat bij schade. Hierbij kan E6 ook binden aan p53 → inactief p53; komt heel vaak voor. Kan genetisch geïnactiveerd worden of viraal → effect is hetzelfde. Oncogenen → gain of function genen; activerende mutatie zorgt ervoor dat het oncogen celproliferatie stimuleert. Tumor sepressorgenen → loss of function genen; 2 nodig, als het ene gen gemuteerd is kan het ander zijn werk nog wel doen. P16 → transcriptiefactor (E2F) zet cyclines aan; E2F wordt gebonden door retinoblastoma; Rb wordt geremd door cycline-Cdk complex en dat complex kan geremd worden door p16: een CKI. Controlesysteem dat in al onze cellen bestaat voor regulatie van de celcyclus.

P16 geïnactiveerd door mutatie/niet tot expressie door epigenetica/weggevangen door viraal eiwit → geen remmend proces van transcriptie van targetgenen die de S-fase stimuleren. Stimulatie kankergroei!

Als er per ongeluk een mutatie komt bijv. door carcinogene stoffen worden die mutaties doorgegeven in DNA-sequenties met celdeling. Meerdere mutaties in één cel → ongecontroleerd groeien. Cancer epigenetics → wordt niet alleen gekeken naar diagnostische benaderingen (want is stabiel), ook therapeutisch. C13Orf18 → methylatiemarker; gehypermethyleerd bij vrouwen met baarmoederhalskanker, niet bij gezonde mensen.

Uitgewerkte colleges Scheffers COLLEGE 1 Ziekteverwekkers → eiwitten, virussen, bacteriën, schimmels en protozoa. Bacteriën alleen ziekteverwekkend als ze virulentiegenen/-factoren hebben. Schimmels/protozoa/parasieten → complexe levenscyclus; verschillende verschijningsvormen die te maken hebben met deel v/d cyclus. Virussen → afhankelijk v/d gastheer. Eiwitten kunnen ook infectueus zijn (prionen).

Rol bij ontwikkeling van kanker en chronische ziekten.

Kenmerken van pathogenen Primaire pathogenen → lichaamsvreemd, gespecialiseerd om ziek te maken; vaak een manier om gebruik te maken v/d gastheer. 3 verschillende soorten (tentamenvraag): o Obligaat → veroorzaakt altijd ziekte, heeft andere cel nodig voor overleving: bijv. Coxiella, Q-koorts. o Facultatief → kunnen prima in hun eigen wereldje zitten, maar als ze iemand tegenkomen kunnen ze die infecteren; komen normaliter niet op/in gastheer voor, komen van buitenaf: bijv. Legionella, veteranenziekte. o Opportunistisch → zitten in/op het lichaam en vormen normaal (op goede plek) geen probleem; op andere plekken zorgen ze voor infectie: bijv. S.aureus, MRSA Eigenschappen van pathogenen: o Kolonisatie gastheer. o Vinden van een niche in de gastheer; sommige pathogenen hebben specifieke locatie in het lichaam. o Vermijden/ontduiken van het immuunsysteem v/d gastheer (verworven + aangeboren IS). o Vermenigvuldigen mbv de gastheer; virussen hebben geen machinerie om belangrijke eiwitten aan te maken; ook nodig voor voedsel. o Verspreiding door verlaten v/d gastheer en het vinden van een nieuwe; bijv. acute epidemieën (de Pest, ebola) en persistente infecties (TBC). Symptomen komen door dan wel de pathogeen, dan wel reactie v/h immuunsysteem op de pathogeen.

Prionen → eiwitten die normaal in het lichaam zitten met bepaalde vouwing; kunnen makkelijk misvouwen en worden dan niet direct afgebroken (door proteosoom); komen ze een goed gevouwen eiwit tegen, dan zorgt het ervoor dat die zich ook verkeerd vouwt. Bacteriën: zijn er in allerlei soorten; zijn eencellig met een klein genoom en weinig DNA. (+- 1,5 miljoen baseparen – mens 3 miljard). Hebben geen intronen/exonen. Bacteriële celenvelop 2 soorten celenvelop: - Gram-positief → hebben maar één (binnen)membraan; schermt het cytosol af v/d buitenkant. In het cytosol zitten geen organellen, DNA ligt gewoon los. In het membraan zitten stoffen die bijv. helpen bij (actief) transport. Om alles heen zit een dikke celwand van peptidoglycaan, met daarop teichoïnezuur; karakteristiek voor gram-positief. - Gram-negatief: hebben een buiten- en binnenmembraan; buitenmembraan bevat LPS (lipopolysacchariden); wordt in de mens herkend als “lichaamsvreemd”; belangrijk signaal dat er bacteriën aanwezig zijn.

Flagellen en pili zorgen ervoor dat de bacterie zich kan voortbewegen en aanhechten. Pili wordt ook gebruikt voor uitwisseling van genetisch materiaal (conjugatie). Meerderheid v/d bacteriën is niet pathogeen (99.5%). Pathogeniciteit hangt af v.d kieskeurigheid v/d pathogeen voor de gastheer. Sommige zijn specifiek en willen maar in een bepaald soort gastheren zitten. Virulentiegenen → coderen voor virulentiefactoren; eiwitten die betrokken zijn bij virulentie v/h pathogeen. Sommige bacteriën hebben plasmiden die kunnen integreren in het chromosoom v/d bacterie → maakt het pathogeen; kunnen ook pathogeniciteitseilandjes door ontstaan. Virulentiefactoren gaan een directe interactie aan met gastheercellen → kolonisatie/replicatie. Kunnen naast eiwitten ook zijn: - Toxines - Type III secretiesystemen (T3SS) → injectiespuit voor eiwitten, lijkt op flagel. - Type IV secretiesystemen (T4SS) → injectiespuit voor eiwitten/DNA, lijkt op conjugatiemachinerie (pili).

Toxines en secretiesystemen V. cholerae → veroorzaakt cholera door het cholera toxine: het toxine heeft 2 subunits: A en B. B zorgt voor een gat in het membraan v/d gastheercel, waardoor A naar binnen kan. A bindt een G-eiwit → stimuleert adenylyl cyclase → ophoping cAMP → activatie CFTR-kanaal (Cl—kanaal; betrokken bij cystic fibrosis) → osmostische inbalans → uitscheiding van veel Na+ en water: enorme diarree. Geen contact met de cel nodig.

Via secretiesystemen kunnen toxines ook de cel in. Wel contact met de cel nodig.

V.cholerae De normale variant van deze bacterie is niet pathogeen; is al een vreemde bacterie, heeft 2 chromosomen ipv 1. Heeft een klein stukje DNA afkomstig van een bacteriofaag (virus dat bacteriën infecteert) waarop genen zitten die coderen voor cholera toxine (subunit A en B): dit is CTXΦ. VPI zorgt voor kolonisatie v/d darm en “integron island” voor opname/insertie/transcriptie v nieuw DNA. Verschillende pathogeniciteits-eilandjes die zorgen voor virulentie v/d bacterie!

Fungi/protozoa Fungi – gisten en schimmels → 2 verschijningsvormen: multicellulaire schimmeldraden of eencellige gistachtige organismen. Protozoa – eencellige eukaryoten: bijv. Plasmodium (→ malaria). Hebben meestal meer dan één gastheer en verschillende levensvormen. Tijdens “reis” door gastheren en verschillende levensstadia is er andere afschrijving van genen.

Virussen Geen cellen, geen leven; hebben een gastheer nodig voor vermenigvuldiging. Hebben een klein genoom (RNA/DNA) in allerlei vormen → ss/ds, lineair/circulair, alleen géén circulair RNA. Grote variatie in de grootte van virussen, kunnen heel klein zijn (20 nm). DNA is altijd verpakt door eiwitten, eventueel met lipide envelop eromheen.

Levenscyclus (eenvoudig): virus met DNA (of RNA) en eiwitten bindt aan de cel, fuseert met het membraan en wordt opgenomen met de cel. DNA komt vrij en wordt afgeschreven door eiwitten uit de cel → replicatie. Codering voor coat-eiwitten komt ook uit viraal DNA; worden door mechanismen uit de cel ook gevormd. Nieuwe partikels worden uitgescheiden. “Enveloped” virussen → hebben DNA, eiwit en nog een membraan(envelop): kan afgeleid zijn van het plasmamembraan, hoeft niet. Virussen zonder envelop zorgen voor lysis van de gastheer → virusdeeltjes komen vrij. Virussen met envelop niet → hebben bepaalde eiwitten (membraaneiwitten) laten afschrijven door de gastheer die bij het plasmamembraan komen; eiwitten worden herkend, gaan een knopje vormen met een viruspartikel en “budden” af → membraan gaat dus niet stuk, gaat alleen een stukje af. In ieder geval de meeste virussen een capside: gevormd uit eiwitten uit het cytosol. Bestrijden virussen → lastig, want virus gebruikt de gastheercel voor replicatie v/h genoom en productie v eiwitten; blokkeren van dit proces is toxisch voor de gastheer. Wel te bestrijden met vaccinatie → inspuiten van een deel v/h virus waardoor het IS “getraind” wordt het te herkennen als lichaamsvreemd; gaat werken als virus echt binnenkomt. Poliovirus → dachten dat het uitgeroeid was; momenteel bezig aan opmars in Syrië; had een uitstekende vaccinatiegraad, maar het land ligt nu overhoop → mensen nemen minder snel vaccinaties. Virale/bacteriële infecties → verantwoordelijk voor chronische aandoeningen! - Rous sarcoma virus: veroorzaakt kanker in kippen. - HPV: veroorzaakt baarmoederhalskanker op latere leeftijd; nog geen echt geslaagde vaccinatie. - EBV: veroorzaakt de ziekte v Pfeiffer, remt apoptose in geïnfecteerde cellen → Burkitt’s lymphoma. - Helicobacter pylori: veroorzaakt maagzweren en kanker.

Mechanisme van infectie → begint vaak met vastgrijpen v/d gastheer. Er zijn wel belangrijke beschermingsmechanismen (belangrijkst: huid). Sommige plekken is deze minder dik (oog, darm), maar daar zitten ook andere factoren zoals de pH in het maag-/darmstelsel. Pathogenen hebben wel mechanismen om toch de cel in te komen. Virus → bindt celoppervlak en bepaalde eiwitten op een oligosaccharide v/d cel → opname via endocytose (= receptor-mediated endocytosis).

Gebonden celeiwit heeft vaak andere functie, maar het virus kan er wel aan binden. Bacteriën → gebruiken ook eiwitten (soms), maar ook andere routes; kunnen cel aanzetten tot opname v/d bacterie.

Protozoa → te groot om de cel te triggeren tot endocytose: hebben actieve invasiemechanismen nodig; moet een gunstige niche vinden (binnen/buiten de cel).

Huid → eerste “line of defense”, beschermt tegen indringers. Op de huid zitten ook veel micro-organismen die indringers verdrijven; deze kunnen ook eiwitten uitscheiden waardoor andere bacteriën doodgaan → defensines. Wondjes op de huid → invasie van opportunistische pathogenen, vaak normale flora. Pathogenen kunnen ook binnendringen via een vector, bijv. insect. Kolonisatie van het epitheel met adhesines Epitheel is steriel en wordt beschermd; in de longen zit slijm, wordt continu getransporteerd. In de darmen is ook veel beweging door vertering: aanhechting moet sterk zijn → gaat mbv adhesines: eiwitten die oppervlaktemoleculen op de gastheercel herkennen. Bijv. op pili kunnen adhesines worden geplakt → kunnen gastheercellen binden. Specificiteit v/h adhesine bepaalt het gastheerceltype! VB → Helicobacter pylori: 5 verschillende adhesines die stevig binden, vervolgens produceert het toxines die maagzweren veroorzaken. Produceren ook enzym urease: in maagzuur zit veel urea (ontvouwt eiwitten): urease zet urea om in ammonium → bufferende werking om de bacterie heen; kan beter omgaan met lage pH. VB – Bordetella pertussis: veroorzaakt kinkhoest; 4 adhesines die glycolipiden binden op ciliated cells in de luchtpijp (voor slijmtransport), waarna toxines worden gevormd en kinkhoest ontstaat. Kolonisatie van epitheel zonder adhesines VB – enteropathogene E.coli → maakt een eiwitje, Tir en een type III secretiesysteem. Tir wordt ingespoten in de gastheer, vouwt en gaat in plasmamembraan v/d gastheer zitten Intimin (ander eiwit) zit in het membraan van E.coli → bindt Tir in membraan v gastheer → stevige binding tussen 2 cellen ontstaat. Tir wordt gefosforyleerd door tyrosine kinase in de gastheer: fosforylatie op tyrosine (Tir) komt in bacteriën zelf niet voor, wel in de gastheer. Gastheereiwitten worden gerecruteerd → polymerisatie van actinemoleculen → actinefilamenten → pedestal (voetstuk): E.coli wordt naar de buitenkant v/d cel geduwd en daar vastgehouden; zit zo in goede omgeving met veel voedsel. Intracellulaire pathogenen → pathogenen moeten ook overleven in de cel en er weer uit ontsnappen. Cellen hebben mechanismen om dit tegen te gaan. Entry van virussen Virusreceptor: eiwit (meestal), kan veelvoorkomend (influenza) of specifiek voor een celtype zijn. Kan zijn dat verschillende eiwitten op het oppervlak zitten die worden gebruikt voor verschillende virussen; meestal moeten er meerdere eiwitten gebonden worden: primaire en secundaire co-receptor voor effectieve infectie. VB – HIV bindt CD4 en chemokinereceptoren (CCR5 → signalen binnen de cel; β-variant). HIV infecteert eerst macrofagen in het bloed, en heeft hiervoor deze receptoren nodig. HIV kan andere celtypen infecteren door andere chemokinereceptor te binden die op dit andere celtype zit: bijv. CXCR4 op T-cellen; α-variant van CCR5. Door mutaties bindt HIV na een tijdje bijv. de β-variant niet meer, alleen nog maar α; verspreiding van HIV en minder goede bescherming.

Mensen met minder goed werkend CCR5 → niet gevoelig voor HIV-infectie; niet de juiste receptor.

Virussen – binnenkomen v/d cel Verschillende manieren: - Enveloped virussen: o Membraanfusie plasma (bijv. HIV) → moeten hun envelop laten fuseren met celmembraan; HIV bindt het oppervlak v/d cel en brengt met fusie-eiwit membranen bij elkaar → fusie: daarna uncoating v/h viruspartikel. o Via endosomaal membraan (bijv. influenza) → bindt de cel, wordt opgenomen in een endosoom (endocytose); endosoom gaat de cel in en verzuurt → trigger voor uncoating v/h genetisch materiaal v/h virus plus fusie van membraanenvelop met membraan v/h endosoom → materiaal wordt vrijgelaten. - Non-enveloped virussen: Porie in het endosoommembraan of lysis van het endosoom.

Fagocytose Bacteriën → te groot voor endocytose, dus ander mechanisme. Macrofagen ruimen normaliter bacteriën op (deel van aangeboren IS). 2 mechanismen van geïnduceerde fagocytose: Zipper-mechanisme → eiwitten binden celoppervlak (zijn vaak cadherins, integrins – zorgen er normaliter voor dat cellen dicht tegen elkaar zitten). Cel kruipt met membraan om bacterie heen → opname in de gastheercel. Mbv actinefilamenten vormt het membraan eromheen. VB – Listeria monocytogenes. Trigger-mechanisme → werkt met type III-secretieapparaat; spuit eiwitten in waardoor gastheercel actine laat polymeriseren; cel gaat “membrane ruffles” vormen (uitstulpingen) rondom de bacterie → wordt opgenomen. VB – Salmonella enterica

Eukaryote parasieten → actieve invasie: te groot om endocytose te triggeren. VB – Toxoplasma gondii: gebruikt eigen cytoskelet om zich gastheercel in te duwen. Heeft een conoid: structuurtje waarmee hij cel bindt en ertegen gaat duwen; duwt zichzelf naar binnen en membraan vormt zich eromheen → membraan sluit weer en Toxoplasma is binnen in een vesikel: ander dan endosoom! Is willekeurig gastheermembraan dat ook vol zit met dat soort eiwitten; normaliter wordt het membraan herkend omdat het eiwitten bevat door lysosomen zodat het gaat fuseren etc. Nu verwijdert Toxoplasma eiwitten uit het gastheermembraan v/d vesikel waardoor de cel niet denkt dat de vesikel naar de lysosoom moet. Toxoplasma vermenigvuldigt in vesikel → cel knapt.

VB – Trypanosoma cruzi, “kissing bug” → dragger van trypanosomen die ziekten veroorzaken; veroorzaakt ziekte van Chagas. Poep v/d kissing bug in het lichaam → trypanosomen binnen. Trypanosomen → binden gastheercel en laten zich opnemen in lysosoom door hoge Ca2+: lysosomen fuseren met het plasmamembraan en trypanosomen worden opgenomen → trypanosoom scheidt porievormend eiwit uit → lysis v/h lysosoom → release pathogeen. Trypanosoom vermomt zich als lichaamseigen met siaalzuur uit celmembraan! Dus geen beschermingsmechanismen v/d cel.

Microsporidia → kunnen infectie veroorzaken bij insecten/mensen met verslechterd IS. Zijn soort “opgewonden veer” in een spore; knalt eruit als een cel moet worden binnengedrongen; “veer” schiet cel in → kernmateriaal cel ingespoten.

Pathogeen in de cel → pathogenen in endosoom → fusie met lysosoom → fagolysosoom → einde pathogeen. Pathogeen heeft hiervoor survivalmechanismen: - Ontsnapping uit het lysosoom; o.a. Trypanosoma cruzi, Listeria - Voorkoming van fusie endosoom met lysosomen; o.a. Salmonella enterica - Overleven in het fagolysosoom; o.a. Coxiella burnettii

VB – Listeria: doet aan attachment: opname via het zipper-mechanisme. Komt fagosoom binnen → Listeria scheidt eiwit uit dat het membraan afbreekt (listeriolysine). Bacterie komt vrij, vermenigvuldigt; listeriolysine afgebroken, want anders celmembraan ook kapot → cel klapt uit elkaar en omgeving + voedselbron verdwijnt. Lysteriolysine = enzym dat poriën in membraan vormt; wordt afgebroken door proteasoom v/d cel zelf. Mycobacterium/Salmonella blokkeren endosoommaturatie in verschillende stadia; - Salmonella in vesikels dicht bij Golgi - Legionella in vesikels omgeven door ruw ER - Chlamydia in vesikels afgeleid van secretievesikels uit TGN (exocytose)

Gebruik gastheermembraan → wordt gebruikt bij “budding” als envelop om het nieuwe viruspartikel wanneer ze de cel verlaten. Virusenvelopeiwitten geïnserteerd in ER, transport via Golgi naar plasmamembraan → gebruik als envelop. Kan ook lastiger: VB – Herpes virus → nucleocapside (genetisch materiaal + eiwit) wordt in de celkern gemaakt. Gaat naar het ER en komt eruit zonder membraanjasje → wordt door eiwitten in Golgi herkend; maakt er een membraan omheen → fusie met plasmamembraan → exocytose met alleen Golgi-membraanjasje aan. Vaccinia virus → komt met 3 verschillende membranen naar buiten; reden onbekend. COLLEGE 2 Diffusie in het cytosol → in de cel moeilijk door alle stoffen/structuren heen te komen als bacterie. Bacteriën die repliceren in het cytosol gebruiken meestal het cytoskelet, bijv. actinedraden. Virussen doen dit ook. Listeria in het cytosol Listeria wil door de cel bewegen om zo andere te infecteren → maakt gebruik v actineskelet en –eiwitten uit cytosol. Bacterie kan aan één pool actine recruteren: signaal aan de cel om een staart te vormen waarmee het door de cel kan bewegen. Cel kan hiermee andere cellen infecteren → duwen tegen membraan, als dit naast een ander membraan ligt v/e naburige cel kan de cel zich naar de andere cel bewegen (fagocytose).

Vorming actinestaart Pathogeen zorgt voor polymerisatie van actine door de gastheer mbv het ARP-complex: - Listeria → ActA (eiwit) recruteert ARP, wat actine polymeriseert. - Shigella (gram-negatieve bacterie) → gebruikt een ander eiwit, IcsA: zit aan één pool en recruteert ARP indirect: eerst N-WASp en WIP die samen ARP recruteren. - Vaccinia virus → wordt gefosforyleerd op een eiwitje dat ARP recruteert.

Het ARP complex, bestaande uit verschillende eiwitten, vormt een kapje waarop actinemonomeren kunnen binden, zodat polymeren niet zomaar uiteenvallen; complex zorgt ook voor polymerisatie. Transport mbv microtubili → niet alleen transport mbv actine, ook langs axonen via microtubili. Microtubili vormen lange draden in de cel waarover transporteiwitten lopen (Kinesin, Dynein): - Dynein → op weg naar de kern, voor transcriptie. - Kinesin → op weg naar uiteinde axon, na replicatie.

Wolbachia → insectenpathogeen; bindt microtubili (spoelfiguur) tijdens mitose, waardoor het verspreid wordt over verschillende cellen; wordt doorgegeven tijdens chromosoomsegregatie. Zo komt het ook in eicellen, niet in zaadcellen (geen spoelfiguur): gaat dus over van moeder op nageslacht. Gastheergebruik → niet alleen voor voedingsstoffen! Ook gebruik van eiwitten voor processen v/d pathogeen. Virussen hebben reverse transcriptase: vooromzetting RNA → DNA. RNA virus: brengt RNA in gastheer → omzetting door reverse transcriptase → één streng DNA → gastheer maakt door virus een 2e complementaire streng, wordt in gastheergenoom gezet → productie nieuwe viruspartikels.

Eiwitmachinerie voor replicatie (behalve reverse transcriptase) v/d gastheer wordt gebruikt door het virus! Bacterie heeft alleen voedingsstoffen nodig. Overname gastheermetabolisme → “optimaal” gebruik v/d gastheer: Knippen TATA binding factor van transcriptiefactor IID → stopt transcriptie van gastheer DNA in RNA. Blokkeren RNA modificatie → geen vorming polyA staart; RNA wel afgeschreven, maar kan kern niet uit. Verwijderen 5’-cap van gastheer mRNA → geen herkenning door translation initiation factors die overschrijving van mRNA → eiwit beginnen. Gebruiken 5’-cap als primer voor virus-RNA synthese → “cap-snatching”. Afbraak translation initiation factors door virale proteases → gastheer mRNA niet meer overgeschreven. Verstoring celcyclus om te zorgen voor hoge DNA-polymerase productie → adenovirus.

Verandering gedrag gastheer/vector → zorgt voor infectie: - Trypanosomen → zorgen dat tsetsevlieg honger blijft hebben, blijft bijten en infecteert. - Inductie hoesten/niezen/diarree → verspreiding pathogenen. - Hondsdolheid → rabiesvirus in speeksel; bijtgraag en agressief gedrag.

Antigeenvariatie → komt veel voor bij pathogenen. Verworven immuunrespons is aanmaak van antilichamen tegen (vooral) oppervlaktemoleculen v/d pathogeen; kan tijdens infectie van samenstelling oppervlakmoleculen veranderen → geen effectieve immuunrespons. VB – slaapziekte door Trypanosoma brucei: gecoat met variant-specific glycoprotein; eiwitten met suikergroepen die kunnen variëren; door aanzetting van andere genen wordt er een ander gen afgeschreven en verandert samenstelling. Bacteriële oppervlakteverandering Neisseria sp. → pili op oppervlak; samenstelling kan veranderen, en kan ook DNA uit omgeving opnemen; ook weinig herstelmechanismen voor het DNA → fouten worden niet gerepareerd, grotere kans op mutaties: kan voordelig zijn voor de bacterie, niet voor de mens! Horizontal gene transfer → meest gebruikte aanpassing bij bacteriën door natuurlijke competentie/plasmide/bacteriële virusinfectie (cholera toxine) → overdracht grote stukken DNA. Error-prone replication: virussen muteren snel, retrovirus gemiddeld 1 puntmutatie per replicatie → virus verandert van genoom. Receptoren kunnen ook veranderen, bijv. co-receptoren bij HIV. → snelle respons op antivirale middelen! Te hoge mutatierate niet altijd goed → teveel mutaties = stop (ophoping nadelige mutaties). Door mutaties wel beperkte gastheerkeuze. Uitzondering: influenza! Genoom bestaat uit 8 RNA-moleculen.

Recombinatie van RNA-virussen van mens/diersoorten → nieuwe,

virulente griepvirussen!

Naamgeving: H..N..; Mexicaanse Griep H1N1, vogelgriep H5N1.

H (hemaglutinine) zorgt voor fusie van influenzavirus met endosoommembraan.

N (neuraminidase) knipt siaalzuurmoleculen.

Spaanse Griep: op basis v longsamples virale genoom gereconstrueerd: met o.a. PCR virale DNA bij elkaar gezocht: gevonden dat in RNA-polymerase een mutatie zit tov huidige griepvirussen. Inbrengen gemuteerd enzym in bekend virus → virussen kunnen delen v/d longen infecteren waar ze normaliter niet komen. Antibiotica → doodt bacteriën, laten eigen cellen ongemoeid; grijpen aan op targets die niet in het lichaam voorkomen, wel specifiek op bacteriën: Celwandsynthese → peptidoglycaan is specifiek voor bacteriecelwand; verschillende antibiotica remmen synthese hiervan. Vancomycine; “laatste redmiddel”. Eiwitsynthese → bacteriën gebruiken 30S/50S ribosomen, anders dan de mens; worden ook niet geremd door antibiotica, die v/d bacterie wel.

Wordt nu ook gekeken naar vetzuursynthese (membraan) voor nieuwe antibiotica.

Antibioticum resistentie Ontstaat heel snel → strijd tussen ontwikkelen van antibiotica en bacteriën die ertegen kunnen. Multidrug resistente bacterie → kan tegen verschillende soorten antibioticum. Zijn verschillende mechanismen waarom bacteriën resistent kunnen worden tegen antibioticum: - Afbraak v/h antibioticum door productie van een eiwit dat een antibioticum afbreekt: bijv. β-lactamases. - Uitpompen van een bacterie: ribosoomremmers bijv. moeten de cel in, zijn er ook weer uit de pompen. - Targetverandering: plek waar antibioticum bindt verandert enigszins.

Antibioticum bindt een bepaald eiwit, doodt de bacterie. 4e strategie → vancomycineresistentie werkt als variatie op het veranderen v/d target: target kan een eiwit zijn of een stofwisselingsproduct (wat geen eiwit is). Hoe ontstaat resistentie? - Spontane mutaties - Horizontal gene transfer → vaak al resistentie voor handen, omdat er in de natuur al continu een strijd is tussen verschillende organismen (schimmels – bacteriën) die competeren voor ruimte → scheiden stofjes uit waar de ander niet zo goed tegen kan.

Overmatig antibioticumgebruik, zowel door mensen als veeteelt → veel resistente MRSA-infecties. Verdediging tegen pathogenen Verworven immuniteit is langzaam en komt alleen maar voor in gewervelde dieren. Aangeboren immuniteit komt wel voor bij ongewervelde dieren en planten; kent 3 verdedigingslinies: - Fysisch/chemisch (huid, tight junctions, mucus, normale flora) - Celspecifiek (fagolysosoom, RNA-afbraak) - Witte bloedcellen + complementsysteem

Verdediging 1 – vermijden pathogenen Afbeelding → geosmine wordt uitgescheiden door schimmels, bijv. Pencillium sp. Niet voor consumptie geschikt, ook vliegen houden er niet van. Veel dingen die je ruikt/opmerkt worden als signalen doorgegeven naar de hersenen. Voor geosmine hebben vliegen een bepaald neuron (Or56a): de respons (wegwezen) is hard-wired in het vliegenbrein. Van deze specifieke stof waarvan ze weten dat het heel verkeerd is, is er meteen een respons. Feromonen zijn minder direct, gaan via verschillende neuronen. Wegblijven van pathogenen via reukorgaan.

Bescherming door epitheel: fysieke barrières (primair): Huid/epitheel

Slijm/mucus → beschermt tegen adhesie, verwijdering v pathogenen, bevat defensines.

Defensines Mechanisme van defensines is vrij onbekend; op basis van de structuur wist men niet hoe defensines een pathogeen konden doden. Men zuiverde steeds het stofje bij de verkeerde pH → zuivering gereduceerde conformatie; kan goed in membranen zitten. Antimicrobiële peptiden en waarschijnlijk defensines vormen gaten in het membraan; kunnen moleculen in het membraan binden (lipid 2): de bouwsteen van peptidoglycaan.

Nirsine pakt lipid 2 vast en duikt het membraan in → veel nirsines bij elkaar vormt een gat in het membraan → cel klapt in elkaar. Onderscheiden zelf/niet-zelf: belangrijk in bescherming tegen pathogenen. Herkenning van pathogenen gebeurt door beide immuunsystemen (aangeboren/verworven). - Aangeboren IS → herkent bijv. PAMPs (Pathogen-Associated Moleculair Patterns); verschillende soorten moleculen: o Geformyleerde methionine; hebben nog een formyl-groep; gebeurt niet in eukaryote cellen. o Oppervlaktemoleculen v/d bacteriën: peptidoglycaan, techoïnezuur, LPS, verschillende suikergroepen (mannan, glucan, chitine). o DNA: CpG motief → viraal DNA heeft met name dit motief; gemethyleerde CG voorafgegaan door purine purine (A/G) en daarna een pyrimidine pyrimidine (C/T). - Onderscheid pathogenen vs normale flora → concentratie of vreemd plek v/e stofje die daar normaal niet zit. - Respons → vaak ontsteking. In je lichaam zitten cellen die als taak hebben indringers op te ruimen: professionele fagocyten en dendritische cellen → gevolg: T-celactivatie.

Lipopolysaccharide (LPS) → sterke immunostimulans Komt voor in de celwand van gram-negatieve bacteriën; samenstelling van suikers verschilt tussen verschillende bacteriën. Pattern Recognition Receptors Herkennen de PAMPs. Toll-like receptors (TLRs) → op de cel. NOD-receptors → intracellulair.

Toll-like receptors (TLRs) Leucinerijke repeats (LRRs) kunnen binden aan dingen die ze herkennen: zitten in de TLR; bindt een ander eiwit dat LPS bindt. TLR wordt geactiveerd waardoor NF-kB signaaltransductieroute geactiveerd wordt; effecten: Transcriptie van pro-inflammatoire genen Transcriptie van interfon inducerende genen

Leusinerijke repeats zijn flexibel; herkennen verschillende liganden. TLR’s zitten altijd op membranen.

NOD-receptoren Vergelijkbare receptoren die intracellulair (in de cel) zitten. NODs herkennen o.a. fragmenten peptidoglycaan; moeten niet alleen in het bloed zitten maar ook de cel binnenkomen waarna ze herkend worden. Ziekte van Crohn → geassocieerd met anders functionerend NOD2. Verschillende genetische defecten in deze receptoren zijn geassocieerd met vatbaarheid voor infectie. Complementsysteem Bestaat uit een set eiwitten die voorkomen in het bloed en vloeistof buiten de cellen, voornamelijk aangemaakt in de lever en inactief! Vrij agressieve eiwitten. Het zijn zgn. pro-enzymen, geactiveerd door geknipt te worden: proteolyse → proteolytische cascade treedt op; 1 complementeiwit knipt een volgende, kan er meerdere knippen, die weer eiwitten knippen, enz. (→ sneeuwbaleffect). Als eiwitten geknipt worden vallen ze uit elkaar in a- en b-fragmenten: a is signaal, b is fragment die volgende knipt. B bindt ook membraan v/d indringende cel; wordt vervolgens gebruikt als herkenning. 3 routes - Klassieke pathway → herkennen oppervlaktes van pathogenen - Lectine pathway → herkennen oppervlaktes van pathogenen via mannose-binding lectin; herkent suikergroepen van mannose die veel voorkomen op oppervlak van bacteriën/schimmels. - Alternatieve pathway

Signalen worden doorgegeven tot uiteindelijk C3 wordt geknipt: hier komt alles samen. C3 wordt geknipt → verschillende gevolgen: - Opsonisatie: pathogenen worden gecoat door geknipte complementeiwitten → inductie van fagocytose door macrofagen bijv. (betere herkenning). - Signaleringsroutes (interferonen) worden gestimuleerd waardoor anti-inflammatoire cellen worden gerecruteerd: cytotoxische T-cellen, macrofagen… - Immuunrespons gestimuleerd. - C3 knipt andere eiwitten → pore-vorming en lysis.

Membraan Attack Complexes Eiwitten knippen en binden het membraan → recruteert eiwit C9 en maakt porie in het membraan: MAP (Membrane Attack Complex). Complement – zelfbescherming Tamelijk agressieve eiwitten dus moeten uitgezet worden. Zelfbescherming door: - Gastheercellen zelf: oppervlak kan voorkomen dat complement bindt: komt o.a. door siaalzuur, suikermolecuul dat veel zit op oppervlakte v eiwitten. Trypanosomen kunnen zich coaten met siaalzuur en doen alsof ze v/d gastheer komen → minder goed gebonden door complement; pathogeen wapent zich tegen afweer v/h lichaam. - Reactie gestopt door: o Eiwitten zijn instabiel → doven zichzelf uit o Remmereiwitten die geactiveerde eiwitten (complement) binden om ze te remmen → voorkomen van schade aan eigen organisme

Macrofagen/neutrofiele granulocyten Macrofagen → lange levensduur, komen in weefsel voor: nemen pathogenen op via fagocytose. Neutrofielen → kortere levensduur, in bloed, niet in weefsel!

Cellen zitten vol met receptoren voor pathogenen (PRRs → TLRs, C3b receptoren voor complementsysteem en antilichaam receptoren). Als een pathogeen gecoat is met C3b of gebonden is door antilichaam binden deze cellen de pathogeen. Binding cellen aan pathogeen → membraandeformatie door actine polymerisatie (lokaal) en pathogeen wordt opgenomen in fagosoom. Fagocytose is te vermijden via capsules (Streptococcus pneumoniae) of toxines (Yersinia). Fagocytose Pathogen wordt opgenomen → cellen komen terecht in fagosoom dat fuseert met lysosoom (vol met eiwitten die de pathogeen afbreken) → fagolysosoom. Hierin zitten ook defensines en proteases (knippen eiwitten kapot), lysozymen, enz. Pathogeen gaat hierdoor dood. NADPH-oxidase zit ook in het membraan van het fagolysosoom: - Productie radicalen die er ook voor zorgen dat er chemische reacties ontstaan waar de pathogeen niet tegen kan. - Verhoging pH → activatie neurale proteases.

Gebeurt door macrofaag en neutrofiel → neutrofiel neemt pathogeen op en gaat dan zelf dood (→ pus). Macrofagen overleven het wel, resultaat: macrofaag presenteert fragmenten bacterieel materiaal aan het oppervlak als antigeen. Pathogeen te groot? → groep van fagocytotische cellen rond de indringer → doen collectieve zelfmoord, klappen open en scheiden eiwitten die structuren afbreken uit → voldoende om de indringer tegen te gaan. Ze scheiden ook DNA uit → veelzijdig materiaal, ook te gebruiken om dingen op hun plek te houden als soort van “spinnenweb” → bacteriën kunnen op hun plek worden gehouden voor meer immuuncellen om ze af te breken. Antigeenpresentatie → activatie T-cellen door APC’s (antigeenpresenterende cellen) Pathogeen opgenomen → zorgt voor aantal reacties, waaronder het presenteren van antigenen (stukjes pathogeen) aan T-cellen. T-cellen gaan antilichamen maken die kunnen binden aan de pathogenen. Dendritische cellen: vormen link tussen aangeboren – verworven immuniteit; dicht onder de oppervlakte van de huid en darmepitheel bijv. Nemen microben op, breken ze af, presenteren ze aan de buitenkant samen met een IS-stimulerend eiwit (MHC). Ze bewegen dan van net onder de huid naar lymfeknopen: komen daar T-cellen tegen die zo geactiveerd worden. Ontstekingsresponse - Verwijding bloedvaten, ophoping complementfactoren, stollingseiwitten, aanwezigheid neutrofielen/macrofagen. - Signaalafgifte – cytokines, prostaglandines - Koorts → hitte slecht voor pathogeen; goed voor adaptieve immuunrespons. - Overreactie: o Bij verspreide infectie in bloed → septische shock. o Lokaal → astma, reuma. - Sommige pathogenen overleven in macrofaag en gebruiken deze voor verspreiding. - Sommige pathogenen remmen reponse → cytokine antagonisten.

Bescherming tegen virussen Virussen komen over het algemeen van een andere gastheer die ze gebruiken om moleculen te maken (op het oppervlak) → gastheer herkent die moleculen vaak niet als lichaamsvreemd omdat ze zelf gemaakt zijn. Virus eenmaal binnen → wel vreemde elementen, bijv. dsRNA. dsRNA wordt afgebroken door de cel (Dicer) → afbraak van ssRNA (viraal). Als de cel ssRNA ziet worden interferonen α en β geproduceerd: o Signaal voor geïnfecteerde/omliggende cellen. o Stimulering transcriptie via Jak-STAT (ong. 300 genen).

Hoeft niet dsRNA te zijn, ook andere virale componenten triggeren mogelijk zo’n respons. Zoogdieren → RNA virus komt binnen en schrijft RNA om in DNA → systeem APOBEC, normaal betrokken bij corrigeren van RNA gaat nu zorgen voor mutaties in het virale cDNA → zorgen ervoor dat het geen goede virussen meer oplevert. dsRNA herkenning is belangrijk!! Dicer → afbraak dsRNA Dicer (eiwit) herkent dsRNA wat in de cel komt: knipt het om in kleine fragmenten RNA. Fragmenten worden gebonden door een ander eiwit dat RNA kan knippen (RISC): kleine stukjes binden dan aan mRNA wordt gebonden wat gevormd wordt → wordt daarna afgebroken. Dit proces wordt gebruikt in RNAinterference (RNAi). NK-cellen/cytotoxische T-cellen NK-cellen worden geactiveerd door interferonen (bijv. IFN-γ). Natural Killer cellen en cytotoxische T-cellen herkennen geïnfecteerde cellen aan MHC-I: - Cyt. T-cellen → veel MHC-eiwitten met fragmenten viruseiwit. - NK-cellen → weinig MHC op oppervlak = kenmerk van remming MHC door virus (om cyt. T-celherkenning te voorkomen!).

Als een cel antigeen presenteert worden ze gebonden door een NK-cel of cytotoxische T-cel. Reactie van virussen: Influenza: brengt eiwitten tot expressie die zorgen dat Dicer niet werkt. HIV: ubiquitinatie en afbraak van APOBEC complex. Blokkeren interferon productie/signalering. EBV: remmen van apoptose: mogelijk gevolg = kanker!

COLLEGE 3 Het microbioom → de naam voor de verzameling van micro-organismen in/op ons lichaam. 1013 menselijke cellen, 1014 microben. Microbioom Naam voor de verzamelde microflora die je meedraagt; zorgt ook voor 100x zoveel extra genen v/d extra organismen. Bacteriën zitten overal; soort bacterie verschilt met plaats. Darmbacteriën worden geassocieerd met obesitas, gedrag, weerstand, vermogen om voedsel op te nemen/af te breken, vitamineproductie. Bacteriën in maag-darmkanaal In de maag niet veel vanwege streng milieu, wel veel Helicobacter pylori (→ maagzweren). Van maag naar anus verandert de pH en de bacteriële loop ook; steeds meer bacteriën in het stelsel. Totaal ~1,5 kg aan bacteriën. E.coli is maar een klein deel van je darmflora (<1%), groep proteobacteria. Sommige bacteriën (zoals E.coli) groeien goed in het lab, andere minder. Over het algemeen zijn bacteriën in het maag-darmstelsel anaeroob. Klassieke microbiologie → uitplaten en identificeren/determineren. Nieuwe technologie → 16S rRNA (ribosomaal) sequencen: soorten zijn te identificeren door genetische verschillen; je moet wel zorgen dat je een gen pakt dat iedere bacterie heeft; ribosomen hebben ze allemaal, 16S is één v/d componenten v/h bacteriële ribosoom (~1530 bp); klein genoeg om makkelijk te sequencen, groot genoeg om af en toe verschillen te hebben. Op basis van verschillen in 16S rRNA sequenties soorten te determineren.

Human Microbiome Project (HMP) Sequencen alles v/e fecaal monster → aan de hand van gesequenced DNA kun je de samenstelling, complete genomen v alle bacteriën in het darmstelsel karakteriseren. Heeft o.a. geleid tot HMP; verschillende consortia en verschillende vragen: - Is er een “gedeeld” kernmicrobioom? - Correlatie tussen gezondheid en microbioom? - Hoe belangrijk zijn verschillen in samenstelling microbioom?

Bleek dat iedereen ong. 500-1000 verschillende soorten microben in hun maag-darmstelsel heeft, 1% archaea. Enterotypes – 3 ‘wereld’wijd Samples van HMP → ook vanuit andere delen v/d wereld (1e wereldlanden). Resultaat → 3 verschillende samenstellingen v/h microbioom = enterotypen. Er zijn best veel bacteriën die je sowieso bij je hebt. 3 enterotypes (bacterie dominant); - Bacteroides - Prevotella - Ruminococcus

Die typen waren niet specifiek voor leeftijd/geslacht/lichaamsgewicht of locatie. Wel verschil bij activiteit van bepaalde genen → oudere mensen zwakkere immuunrespons, wel beter in afbraak van zetmeel; kleine verschillen in vitamineproductie – dominantie in zetmeelafbrekende bacteriën. Apen → chimpansees: hoe zit het met de verdeling? Ook hier 3 groepen (enterotypen), maar anders genoemd vanwege andere bacteriën. Afhankelijk v dieet of fysiologie/immuunsysteem v/d darmen? Lijkt wel geconserveerd systeem. Conclusie v/d paper → evolutionair geconserveerd. Wat ook naar voren kwam is dat er een variatie kan zijn → enterotype kan veranderen in de gastheer. Geeft aan dat we te maken hebben met een “vloeiende grens”. Nieuwe studies in mensen Andere studie → niet alleen darmsamples, ook andere. Laat een grote variatie in soorten en genen op verschillende plekken zien. 2 studies, USA en Europa → hoop genen gevonden in Europees project die niet in Amerikaans project zaten en andersom; idee met hoe het zit met microben in ons lichaam. Er was geen één bacterie die in alle proefpersonen voorkwam; kerngenoom moeilijk te definiëren. USA → ander dieet, mensen uit vreemde staat: enterotypen niet terug te vinden, bacteroides en prevotella overheersend. Microbioom is dieetafhankelijk; bacteroides eiwit-/vetrijk. Prevotella meer plantaardig/zetmeelrijk.

Ontstaan microbioom Manier van bevallen heeft invloed op microbioom van de baby. Vaginaal → baby komt door hoop melkzuurbacteriën; “starter”culture mee v/d moeder met veel melkzuurbacteriën. Keizersnee → baarmoeder niet volledig steriel; bacteriën v/d moeder worden vermeden; komen allemaal bacteriën voor in het microbioom die van de huid komen (niet alleen v/d moeder afkomstig), komen vanuit de omgeving v/h ziekenhuis of van ziekenhuispersoneel.

Geen variatie in huid/maag-darm/darm in de eerste 24 uur. Één v/d grote ontwikkelingen in het leven van een kind is overgang v vloeibare → vaste voeding; grote verschuivingen in samenstelling maag-darmstelsel. Keizersnee → verhoogde kans op MRSA-infectie + mogelijk hogere kans op allergie (vermindering door probiotica), mogelijk latere vestiging normale darmflora, mogelijk iets minder goed in vertering moedermelk (door afwezigheid melkzuurbacteriën). Invloed van voeding op het microbioom Moedermelk → bestaat uit eiwitten, gecoat met suikergroepen die hetzelfde zijn als de suikergroepen op het oppervlak v/d cellen, hechten ook veel pathogenen aan → decoy (“afweer”) tegen pathogenen → binden ergens aan, zit niet vast aan de cel en dus gemakkelijk af te voeren. Er zijn ook bepaalde bacteriesoorten die bij baby wel aanwezig zijn om moedermelk te kunnen verteren, bijv. Bifidobacteria spp. Infantis.

Experiment: 5 dagen of plantaardig dan eiwit-/vetrijk (dierlijk); poepmonsters genomen: 5 dagen v/e bepaald dieet was genoeg om de samenstelling v/d darmflora volledig te veranderen. Darmflora kan zich snel aanpassen op verandering in dieet.

Horizontal gene transfer → nodig voor evolutie v/h microbioom. VB – Agar: suikerverbinding waar de mens niets mee kan, komt wel voor in zeewier; Japanners eten dit veel (sushi); er zijn bacteriën die deze stoffen wel kunnen afbreken. Bacteroides plebeius → darmbacterie, heeft ook een gen om agarstoffen af te breken; ze zagen dat deze bacteriën kwamen uit microbioomsamples van Japanse proefpersonen. Amerikaanse samples hadden dit gen niet. Hypothese: genen van Zobellia meegekomen met zeewier en niet voldoende gedood → bij eten van sushi komen de bacteriën uit de diepzee in de darmen terecht waar ze waarschijnlijk kapot gaat; DNA zweeft nog rond, wordt opgenomen door een darmbacterie → horizontal gene transfer; neemt DNA op in genoom → volgende x dat sushi gegeten wordt kun je meer energie halen uit dezelfde hoeveelheid.

Obesitas: obese muis maakt geen leptine → stopt niet met eten. Vergeleken met normale muis: vergelijken van microbiomen; zitten verschillen in. Ob/ob muis tov normale muis → grote verschuiving in darmbacteriën. In de mens → obese mensen 1 jaar op vet- of koolhydraatarm dieet. Hier veranderde ook verhouding v/d firmicutes tov bacteroides in de proefpersonen. Met name een sterke correlatie in koolhydraatarm dieet, minder in vetarm dieet. Weer in de muis → te kweken in steriele omgeving: vervolgens te injecteren met microbioom. Transplantatie in muis zonder darmflora → muis wordt altijd dikker, omdat het helpt bij vertering van voedsel. Steriele muis injecteren met darmflora v normale muis → muis wordt iets dikker. Steriele muis injecteren met darmflora v obese muis → muis wordt veel dikker.

Blijkt dat microbioom v/d obese muis beter is in het onttrekken van energie uit hun voedsel, blijft minder energie over dan bij de normale muis in de poep. Obese microbioom is beter in het onttrekken van energie aan voedsel. Met hetzelfde dieet als een normaal persoon halen ze alsnog meer energie uit hun voedsel. Enterotypes zijn niet gerelateerd aan BMI.

Recent studies - Ontsteking in de darm → meer bacteriën betrokken bij evt ontwikkeling bij kanker in de darm. - Microbioom v/e zwangere vrouw lijkt op die v/e diabeet; zwangerschapsdiabetes bestaat ook → als dit niet meer herstelt kan dat de oorzaak v diabetes type II zijn. - Diversiteit v microbioom in oudere mensen gelinkt aan wat ze eten, hoe gezond ze zijn; minder divers = minder gezond.

Microbioom – invloed op gedrag? Samenstelling heeft invloed op verschillende fysiologische processen, maar nog meer: ook belangrijk voor gedrag. Fruitvlieg → voorkeur voor partner gebaseerd op dieet; groepen op zetmeel of stroop. Aantal generaties → fruitvliegen op zetmeel hebben voorkeur voor fruitvliegen met zetmeel, en andersom.

Geef je de vliegen een rondje antibiotica, dan is de voorkeur weg. Fruitvliegen op zetmeel hebben vooral Lactobacillus plantarum : als je deze bacterie geeft na antibioticum in probiotica is de zetmeelvoorkeur terug! Samenstelling v/d darmflora beïnvloedt productie van feromonen (aantrekkkingsmoleculen) en daarmee gedrag!!

VB - steriele muis → beweeglijker, minder stress. Steriele muis + microbioom-injectie → minder beweeglijker, meer stress. Transplantatie microbioom als baby → niet veel verschil. Transplantatie microbioom bij volwassen → worden wel dikker, beter met voedsel omgaan, gedrag blijft hetzelfde.

Andere voorbeelden: - Muizen bepaalde probiotica voeren → hogere niveaus van GABA; lage niveaus van GABA zijn gelinkt aan depressie. - Doorsnijden nervus vagus (parasympathisch systeem) → effect van probiotica is weg; gedrag kan beïnvloed worden met probiotica → weg bij weghalen link tussen brein en darmen.

Probiotica → bacteriën, toe te dienen via yoghurt bijv. (Activia, Yakult); je voegt levende bacteriën toe aan de voeding en gaat er vanuit dat deze de passage van de maag overleeft en in de darm terecht komt. Kunnen ook sporen zijn in de vorm van poeder. Prebiotica → voedingsstoffen die de bacteriën/flora stimuleren. Bananen, gefermenteerde producten; vezelrijke voedselproducten die in de darm komen en bij voorkeur worden afgebroken door bacteriën die goed voor je zijn. Veel beïnvloeding mogelijk met voeding. Schijnt beter te zijn dan pro. Nodig? → niet als je gezond bent! Studie met tweelingen en gnoto-biotische muizen (met microbioom die lijkt op die van mens); verschillende voeding gekregen → tweelingen kregen beide yoghurtjes, de ene wel met probiotica, andere niet → invloed? Invloed was niet noemenswaardig; wel enige verschillen in welke genen werden overgeschreven en welke metabolieten in de urine kwamen, maar invloeden miniem. Wel zin bij antibioticakuur, diarree, voedselvergifitiging.

CDAD (Clostridium infectie) → bacterie die normaal wel in het microbioom zit, maar niet zwaar vertegenwoordigd is; kan wel goed tegen antibiotica. Mensen die geopereerd moeten worden krijgen vaak een AB kuur om infecties rond de wond te voorkomen; heeft ook effecten op de normale flora → als deze verzwakt is kan Clostridium opkomen, veroorzaakt nare vorm van diarree en ontstekingen in maag-/darmkanaal waaraan je kunt overlijden. Produceert ook sporen. ► “Poep-transplantatie” → transplantatie van het microbioom bij een ernstige infectie; bepaling microbioom voor en na de transplantatie; succesrate is 90%; microbioom na gelijk aan die v/d donor.

Binnenkant v/d darm → verschillende celtypen: - Enterocyt: epitheelcel, microvili voor voedselopname,. - Enterochromaffin cells (EECs): hormoonsecretie (o.a. serotonine) als respons op toxines. - Paneth cellen: secretie defensines, lysozymen, fosfolipase A2, TNF. - Goblet cellen: secretie mucus; binnenste laag steriel, buitenste laag commensalen. - M-cellen: transport bacteriën, MAMPs naar immuuncellen

Alle cellen scheiden anti-microbials uit; sommige cellen kunnen hier tegen, andere worden afgebroken. Bacteriën verteren voedsel, maken metabolieten en vitaminen en produceren afvalstoffen. Mutualisten

Peyer’s patches → steriele muis; darmen gaan zich niet volledig ontwikkelen en ook geen volledige immuunrespons. Competitie microbioom vs pathogenen Productie anti-bacteriële toxines door microbioom; remming van pathogenen.

Competitie voor voeding → gedachte van prebiotica: balans één kant op sturen.

Microbioom conditioneert immuunrespons.

Co-evolutie Muis zonder microbioom: - Humaan microbioom → microbioom ontwikkelt, geen goede immuunrespons. - Ratten microbioom → weer geen goede

immuunrespons. - Muizen microbioom → alles ontwikkelt naar behoren; alleen deze reageerden goed op een Salmonella-infectie

MAMPs en PRRs In de darmen is ook een continue sensing van bacteriën; MAMPs en PRRs spelen hier een rol bij. Verschillende TLRs en NODs reageren op moleculen in bacteriën. Nod1 → komt voornamelijk voor in gram-negatieve bacteriën. Nod2 → algemeen alarmsysteem voor bacteriën. NF-kB respons Receptoren betrokken bij respons tegen de bacterie. Route door bacteriën in de microbiota → NF-kB; transductieroute! In het lumen v/d darm zit een TLR → herkent signaal; wordt doorgegeven, in het geval van microbiota wordt het eiwit dat het signaal doorgeeft omlaag gereguleerd → minder NF-kB response. Microbiota zorgen ook voor productie van reactive oxygen species. Plek v/d TLR van belang voor de respons! TLR9 herkent de CpG: als deze aan de apicale zijde (bij de vili) de epitheelcellen raakt zorgt die ervoor dat NF-kB omlaag gereguleerd wordt. Als de receptor aan de andere zijde van de cel gestimuleerd wordt, wordt NF-kB omhoog reguleerd; locatie maakt dus uit. Apicaal = goed → geen probleem. Basolateraal = niet goed → daar horen ze niet te zitten → andere reactie.

► Verschillende TLRs zitten om bovenstaand verhaal op verschillende plekken in de darm. Sensing vindt op verschillende plekken plaats; cel weet waar mogelijke problemen zijn.

TLR5 → TLR die aanslaat op flagelline; hoofdbestanddeel van een flagel. Muizen zonder TLR5 worden ziek; hebben een permanente ontsteking v/d darm (40%), rest wordt dikker. Muizen hebben ander microbioom, weer was het op soortniveau, niet phylumniveau.

Behandeling: Antibiotica → niet meer obees. Microbioomtransplantatie van k/o naar wt → obees, dus afwezigheid van receptor zorgt ook voor verschillende darmflora.

Sensing van bacteriën erg belangrijk voor darmontwikkeling. Obesitas/metabool syndroom Ligt obesitas aan capaciteit v/d voedselopname of samenstelling v/h microbioom? Nog niet bekend of verstoorde interactie aangeboren IS ↔ microbioom oorzaak is. Inflammatory bowel disease → overexpressie TLRs; denken continu dat het mis is, waardoor onsteking ontstaat.

Toevoegen antibiotica veevoer → dieren maken uit zichzelf meer vet aan; oorzaak onbekend; leidt niet tot hele hoge concentraties maar leidt wss tot andere samenstelling darmflora → leidt tot meer korte vetzuurketens die makkelijk opgenomen kunnen worden door de gastheer; meer vet. Microflora en immuunsysteem – interactie stopt niet in maag-/darmkanaal Afgebroken stukjes bacteriën (o.a. peptidoglycaan) gaat vanuit de darmen via het bloed bij neutrofielen in het beenmerg; zorgen voor “priming”: neutrofielen hebben de pathogeen al een keer gezien, dus worden vervolgens goed herkend en hun “killing capacity” stijgt misschien. SCFA ook effect op IS. Microbioom tijdens ziekte/infectie Tijdens ziekte is er verstoring v/d normale homeostase. Als het IS aangaat, krijg je o.a. verwijding v/d verbindingen tussen epitheelcellen → bacteriën kunnen beter binnendringen, vloeistof gaat eruit en ontsteking kan verdergaan/ontwikkeling; ook apoptose dus dood van cellen. Verdere versterking v/d ziekte.

Microbioom en antibiotica Tegengaan ontstekingsproces → antibioticumkuur: secundaire effecten: - Normale balans wordt mogelijk verstoord. - Doden bacteriën die afhankelijk zijn van door antibiotica gedode bacteriën. - Geen verwijdering giftige fermentatieproducten.

Alvleesklierkankerpatiënten → probiotica gegeven; studie afgeblazen omdat patiënten met probiotica nog eerder dood dan andere patiënten.