Bioveiligheid in het laboratorium (pdf - 1MB)

UNIVERSITEITGENT

VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUTVOOR BIOTECHNOLOGIE

Universiteit Antwerpen

Bioveiligheidin hetlaboratorium

3de herziene editie

3e herziene editie, mei 2004Uitgave van VIB,

Vlaams InteruniversitairInstituut voor Biotechnologie

Redactie:René Custers,

regulatory affairs manager, VIB

VIBRijvisschestraat 120

9052 Zwijnaardetel.: 09 244 66 11

fax.: 09 244 66 10e-mail: [email protected]

web: http://www.vib.be

Verantwoordelijke uitgever:Jo Bury, VIB

Rijvisschestraat 1209052 Zwijnaarde

Niets uit deze uitgave mag wordenverveelvuldigd en/of openbaar gemaakt

voor commerciële doeleinden.Voor educatieve doeleinden dient steeds

de bron vermeld te worden.Mei 2004

laboratoriumBioveiligheid

in het

©

Voorwoord 3

VOORWOORDDit is de derde, herziene editie van het boekje ‘Bioveiligheid in het laboratorium’. In ditboekje vindt u alle informatie terug uit de eerste en tweede editie. Er zijn slechts lichteaanpassingen en aanvullingen gedaan, met name in de tekst over ontsmetting en inacti-vatie.

Moderne biotechnologie is een belangrijke technologie in het huidige biologische en bio-medische onderzoek. Duizenden onderzoekers in de levenswetenschappen gebruikendagelijks micro-organismen, planten of dieren op zoek naar de antwoorden op relevantewetenschappelijke vragen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s)neemt daarin toe.

Het is de onderzoekswereld zelf die in het verleden gewezen heeft op het belang van hetveilig werken met GGO’s. Vandaag zijn er heel wat wetgevingen en richtlijnen van toepas-sing op GGO’s die het doel hebben mens en milieu te beschermen.

We willen het belang van het veilig en verantwoord werken met biologisch materiaal enGGO’s onderstrepen. Het behoort tot de maatschappelijke verantwoordelijkheid van deonderzoeker om de nodige veiligheidsregels na te leven. Daarnaast behoort het tot de ver-antwoordelijkheid van de onderzoeker om studenten, of andere mensen die nog weinigwerkervaring hebben, op te leiden in de theoretische en praktische aspecten van de biovei-ligheid.

We hopen dat dit boekje, samen met praktische instructies en begeleiding, een nuttigwerkinstrument blijkt om mensen op een veilige manier te verwelkomen in de fascineren-de wereld van het biotechnologisch onderzoek.

Jo Bury en Rudy Dekeyseralgemene directie VIB

Inhoudsopgave4

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

2. BIOVEILIGHEID . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

3. INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

4. DE VERSPREIDING VAN ORGANISMEN IN HET LABORATORIUM . . . . . . . . . . . . . . . . . .14

5. INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR EN WERKVOORSCHRIFTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

6. BESMETTING, ACCIDENTEN, ONTSMETTING EN INACTIVATIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29

7. WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUM-ORGANISMEN . . . . .35

8. REFERENTIES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

9. VERKLARENDE WOORDENLIJST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

BIJLAGE 1: INPERKINGSVEREISTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47

BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GGO’S . . . . . . . . .56

BIJLAGE 3 : DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE VAN ENKELE RELEVANTE PATHOGENEN . . .64

BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68

BIJLAGE 5: INFORMATIEBLAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69

BIJLAGE 6:ZELFTOETS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70

Inleiding 5

1. INLEIDINGIn veel biotechnologisch en biomedisch onderzoek wordt gewerkt met biologisch materi-aal. In steeds grotere mate wordt daarbij gebruik gemaakt van moderne moleculair biolo-gische technieken zoals recombinant-DNA technologie. In dit boekje wordt een kort over-zicht gegeven van de basisprincipes die van belang zijn voor het veilig werken met gene-tisch gemodificeerde en/of ziekteverwekkende organismen. Daarbij zijn drie typen vanbeschermende veiligheidsmaatregelen te onderscheiden:a. bescherming van de onderzoeker,b. bescherming van het experiment, enc. bescherming van mens en milieu

De verschillende maatregelen zullen in dit boekje zowel worden uitgewerkt voor micro-organismen als voor planten en dieren. Iedereen die in een laboratorium met deze organismen werkt moet de basisbegrippen van bioveiligheid kennen en er in de dagelijkselaboratoriumpraktijk naar handelen. Alleen op die manier kan een werksituatie wordengecreëerd die veilig is voor uzelf, voor de medemens en voor het milieu.

Het veilig werken met biologisch materiaal wordt bovendien vereist vanuit twee typen vanwetgeving die aan de basis liggen van de voorschriften zoals deze in dit boekje wordenuitgewerkt:1. De wetgeving voor de bescherming van de medewerker bij de uitvoering van zijn werk.2. De milieuwetgeving voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen.Voor beide bestaat een Europese wetgeving die in de nationale wetgeving is omgezet.

Figuur 1 : Het biohazard teken. Dit teken geeft aan dat er met biologischrisicohoudend materiaal wordt gewerkt (vanaf risicoklasse 2)

VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium6

2. BIOVEILIGHEIDWat is bioveiligheid?

De bioveiligheid van laboratoriumwerk staat centraal in dit boekje. Daarbij gaat het om deintrinsieke gevaren van levende organismen en hoe deze veilig te hanteren. Ook genetischmateriaal zoals ‘naakt’ DNA kan gevaarlijk zijn. Voordat werk met pathogene of genetischgemodificeerde organismen (GGO’s) in een laboratorium wordt gestart, moet stilgestaanworden bij de eigenschappen van die organismen en moeten waar nodig maatregelenworden getroffen om eventuele risico’s voor mens of milieu tot een minimum te beperken.…‘Safety first!’…

Welke gevaren?Biologisch materiaal en levende organismen zijn noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiekveilig. Eventueel gevaar hangt af van de eigenschappen van een organisme.Eigenschappen van organismen die gevaar inhouden, zijn de volgende:

• PathogeniteitDe pathogeniteit geeft aan of een organisme - bijvoorbeeld een bacterie, virus, schim-mel, of parasiet - in staat is een ziekte te veroorzaken bij een plant, dier of mens.Factoren zoals infectiedosis, virulentie en productie van toxines door de ziekteverwekkerspelen een rol in de mate waarin het organisme in staat is een ziekte te veroorzaken.

InfectiedosisBesmetting met één pathogeen betekent nog niet automatisch eeninfectie. De infectiedosis verschilt van pathogeen tot pathogeen.Hieronder volgen enkele voorbeelden van enkele voor de mens relevanteinfectiedosissen van pathogenen wanneer zij via hun natuurlijke ver-spreidingsweg verspreid worden:

Pathogeen Infectieuze dosisadenovirus > 150 pfu (intranasaal)influenza virus 790 pfu (nasopharyncheaal)tuberculose bacteriën 10 bacillen (inhalatie)typhus bacteriën 105 bacteriën (ingestie)

pfu = plaque forming units

Bron: Material Safety Data Sheets, Health Canada

• ToxiciteitToxiciteit is vergiftiging. De meeste stoffen zijn bij normaal gebruik niet in staat eenvergiftiging te veroorzaken. De mate van toxiciteit wordt meestal aangegeven in een

Bioveiligheid 7

LD50 waarde voor vertebraten uitgedrukt in gewichtseenheden per kg lichaamsgewicht.De LD50 (LD staat voor: Lethal Dose) is de waarde waarbij blootstelling aan het agenstot gevolg heeft dat 50% van de blootgestelde proefdieren dood gaat. Als het gaat omlevende organismen (voornamelijk bacteriën), dan gaat toxinevorming vaak gepaard metpathogeniteit.

• AllergeniteitAllergeniteit is een niet-toxische, door het immuunsysteem gemedieerde, ongewenstereactie van het lichaam op een stof of agens. Immuunglobuline E (IgE) en mestcellen(cellen van het immuunsysteem die onder meer heparine produceren) spelen vaak eenrol in de allergische reactie. Een allergische reactie kan zich onder meer uiten in huidirri-taties, niezen, astmatische aanvallen, chronische longaandoeningen en kan soms zelfsleiden tot een levensbedreigende shock.

Ter voorkoming van longen huidaandoeningen bij laboratoriumpersoneeldient de mogelijkheid van een allergische reactie mee in overweging geno-men te worden en dient ernaar gestreefd te worden om rechtstreeks con-tact (inademen, huidcontact) van het personeel met allergene stoffen tevermijden.

• Verstoring van ecologische evenwichtenHier is het met name van belang om mogelijke verstoringen van ecologische evenwich-ten die verband houden met activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen(GGO’s) te bespreken. Verstoring van een ecologisch evenwicht zou kunnen gebeurenwanneer een GGO met een bepaalde eigenschap zich ongewenst naar het milieu verspreidt, of wanneer er vanuit dat organisme verspreiding plaatsheeft van genetischmateriaal naar andere organismen in het milieu. Aan de potentiële gevaren die verbonden zijn aan recombinant-DNA technologie en de risico-inschatting daarrond zalverderop in dit boekje dieper worden ingegaan.

• Andere schadelijke effectenSoms zijn er ook andere ongewenste effecten die maken dat extra voorzichtigheidgeboden is bij het hanteren van biologisch materiaal. Het is niet mogelijk een limitatievelijst te maken van dergelijke effecten. Waar het echter om gaat is dat men stil moetstaan bij de eigenschappen van materiaal voor ermee te gaan werken. Als belangrijkstecategorie kunnen misschien de genen aangeduid worden die immuunmodulerendeeigenschappen bezitten. Daarbij is echter lang niet elke immuunmodulatie schadelijk.Om uitsluitsel te geven over het gevaar moeten de eventuele effecten worden nagegaanen is vaak overleg aangewezen. Ter illustratie kan het voorbeeld gegeven worden vanhet werken met een vacciniavirus waarin een gen gekloneerd is dat voor immuunsup-pressie zorgt. De immuunsuppressie zou ervoor kunnen zorgen dat het lichaam eenmogelijke infectie met dat virus niet goed kan bestrijden. Infecties met vacciniaviruskunnen in uitzonderlijke gevallen leiden tot een dodelijke encephalitis.


Werken met ‘naakt’ DNAWe worden in onze leefomgeving dagelijks geconfronteerd met DNA. Inhet laboratorium wordt vooral gewerkt met DNA in de vorm van plas-miden, gedigesteerd DNA, of primers. DNA op zich is ongevaarlijk. Maartoch is het werken met DNA niet altijd ongevaarlijk. Met name wanneerhet DNA codeert voor een cellulair oncogen. Met een oncogen wordt in ditgeval een ‘dominant transformerend’ gen bedoeld: een gen dat na incor-poratie in het genoom de transformatie* van de cel als directe gevolg heeft.Transformatie – de omvorming naar een snel en oneindig delende cel - isde belangrijkste eerste stap in tumorvorming. Een prikaccident met derge-lijk materiaal brengt een risico met zich mee. Medewerkers die met ditmateriaal werken dienen zich bewust te zijn van het risico, dienen hand-schoenen te dragen en moeten het werken met scherpe voorwerpen toteen minimum beperken. Eenmaal dit DNA in een bacterie of een cel geïncorporeerd is, brengt het niet langer een verhoogd risico met zich mee.Tenzij de cel een packagingcel is waarin het oncogen door een virale vectorkan worden opgenomen die het oncogen verder kan verspreiden. Oncogenen en virale vectorenHet kloneren van DNA dat codeert voor een dominant transformerend cel-lulair oncogen brengt met name een extra risico met zich mee wanneer hetin een virale vector wordt gezet die in het genoom integreert. Daarbijwordt onderscheid gemaakt tussen amphotrope en ecotrope virale vectorenaangezien de laatste alleen muizencellen kunnen infecteren. Amphotropevectoren kunnen ook mensen infecteren en brengen dus een hoger risicomet zich mee dan ecotrope.

*zie verklarende woordenlijst

Indeling in risicoklassen en risico-analyse 9

Pathogene organismenOrganismen worden ingedeeld in vier risicoklassen. Organismen die geen ziekten verwek-ken horen thuis in risicogroep 1. Ziekteverwekkers horen thuis in de groepen 2, 3 en 4,afhankelijk van de mate van ziekteverwekkendheid en de mate waarin therapieën beschik-baar zijn. Om een onderscheid aan te kunnen geven met de risicoklassen voor GGO’swordt de risicoklasse van een natuurlijk pathogeen vaak aangeduid als de biologische risicogroep. Hieronder volgt een overzicht van de definities van de verschillende risico-groepen:

3. INDELING IN RISICOKLASSENEN RISICO-ANALYSE

Groep 1 Zeer onwaarschijnlijk dat het agens een ziekte veroorzaakt in mensen, dieren of planten.Groep 2 Humane

pathogenen

Dierpathogenen

Fytopathogenen

Groep 3 Humanepathogenen

Dierpathogenen

Fytopathogenen

(micro-)organismen die bij de mens een ziekte kunnen verwekken eneen gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeks mee in con-tact komen. Hun verspreiding in de gemeenschap is onwaarschijnlijk.Er bestaat meestal een profylaxis of een effectieve behandeling.(micro-)organismen die bij dieren een ziekte kunnen veroorzaken endie in verschillende mate één van de volgende eigenschappen bezitten:beperkte geografische belangrijkheid, overdracht naar andere zwakkeof onbestaande species, afwezigheid van vectoren of dragers. Er is eenbeperkte economische en/of medische impact. Men beschikt meestalover profylactische middelen en/of over efficiënte behandelingen.(micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken,maar waarbij in geval van accidentele verspreiding in het Belgisch leef-milieu geen verhoogd risico voor epidemie bestaat. Het betreft overalvoorkomende pathogenen waarvoor er profylactische of therapeutischemiddelen voorhanden zijn. De niet-inheemse of exotische fytopatho-genen, (micro-)organismen die niet in staat zijn om in het Belgischeleefmilieu te overleven vanwege de afwezigheid van targetplanten ofvanwege ongunstige weersomstandigheden, behoren eveneens totdeze risicogroep.(micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen ver-wekken en een gevaar vormen voor de personen die er rechtstreeksmee in contact komen. Er is een mogelijk risico voor verspreiding in degemeenschap. Er bestaat meestal een profylaxis of een efficiëntebehandeling(micro-)organismen die bij dieren een ernstige ziekte of een epizoötiekunnen veroozaken. Er kan een belangrijke overdracht tussen verschil-lende species optreden. Bepaalde van deze pathogene agentia vereisenhet instellen van sanitaire reglementeringen voor de door de overheidvan elk land in kwestie geïnventariseerde species. Er bestaan meestalmedische en/of sanitaire profylaxen.(micro-)organismen die bij planten een ziekte kunnen veroorzaken dieeffect heeft op de economie of op het leefmilieu en waarvoor


Naast de indeling van een pathogeen in een risicogroep is het altijd van belang te vermel-den welke gastheer het pathogeen heeft. Infectieziekten zijn namelijk een wisselwerkingtussen pathogeen en gastheer. Bepaalde pathogenen hebben een breed gastheerbereik,andere kunnen slechts één of enkele gastheren infecteren. Ook kan de biologische risico-klasse van een bepaald pathogeen dat zowel de mens als het dier kan infecteren, per gast-heer verschillen. Zo is voor de mens de biologische risicoklasse van Herpes virus B klasse 3en voor het dier klasse 2.Van de indeling van pathogenen in de biologische risicoklassen zijn lijsten gepubliceerd,waarin de biologische risicoklasse van de verschillende organismen kan worden opgezocht.In België zijn de volgende lijsten relevant:• hoofdstuk 5.51. aan Vlarem II (http://www.biosafety.be), en• bijlage 1 aan het Koninklijk Besluit van 4 augustus 1996 betreffende de bescherming

van de werknemers tegen de risico’s bij blootstelling aan biologische agentia op hetwerk (alleen humaan pathogenen; Belgisch Staatsblad 01/10/1996).

In bijlage 3 is de biologische risicogroep weergegeven van enkele relevante pathogenen.Opportunistische pathogenen zijn organismen die alleen een ziekte kunnen veroorzaken inmensen of dieren waarvan het immuunsysteem onvoldoende functioneert. Deze organis-men worden ingedeeld in groep 1.

Groep 4 Humanepathogenen

Dierpathogenen

Fytopathogenequarantaineorganismen

een behandeling ofwel zeer duur uitvalt, ofwel moeilijk toe te passenis, ofwel zelfs niet bestaat. Accidentele verspreiding van deze (micro-)organismen kan het risico op lokale epidimieën doen toenemen.Exotische stammen van fytopathogene (micro-)organismen diegewoonlijk voorkomen in het Belgische leefmilieu en niet opgeno-men werden in de lijst van quarantaineorganismen maken eveneensdeel uit van deze risicogroep.(micro-)organismen die bij de mens een ernstige ziekte kunnen verwekken en een ernstig gevaar vormen voor de personen die errechtstreeks mee in contact komen. Er is een verhoogd risico voorverspreiding in de gemeenschap. Er bestaat meestal geen profylaxisof geen efficiënte behandeling.(micro-)organismen die bij dieren een uiterst ernstige panzoötie ofepizoötie kunnen veroorzaken met een erg hoog sterftecijfer of metdramatische economische gevolgen voor de getroffen teeltstreken.Ofwel beschikt men niet over medische profylaxis, ofwel is één exclu-sieve sanitaire profylaxis mogelijk of verplichtSchadelijke (micro-)organismen waarvan het gebruik is onderworpenaan de maatregelen van federale besluiten inzake de bestrijding vanvoor planten en plantaardige producten schadelijke organismen.Belgische definities van de verschillende risicogroepen. De meestedefinities zijn afgeleid van de WHO classificatie van infectieuzemicro-organismen.


Aan het werken met niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 organismen worden in dewetgeving geen eisen gesteld. Toch is het voor niet-genetisch gemodificeerde klasse 1micro-organismen en cellen sterk aanbevolen om de basisprincipes van VeiligeMicrobiologische Technieken (VMT) te hanteren (zie hst 5). Het werken met klasse 2, 3 en4 agentia mag alleen in speciaal daarvoor uitgeruste laboratoria.

Genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s)Recombinant-DNA technologie is niet meer uit moderne biologische en biomedischeonderzoekslaboratoria weg te denken. Escherichia coli K12 is daarbij het werkpaard onderde laboratoriumorganismen en wordt door bijna iedereen gebruikt als middel om DNA tekloneren of tot expressie te brengen.

Definitie van een GGOGGO’s zijn organismen waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd op eenwijze die niet mogelijk is door voortplanting of natuurlijke recombinatie.Technieken die leiden tot de vorming van een GGO zijn in ieder geval:* recombinant DNA- en RNA- technieken waarbij gebruik wordt gemaakt

van gastheer/vectorsystemen;* technieken waarbij genetisch materiaal dat buiten het organisme is

geprepareerd, rechtstreeks in een organisme wordt gebracht, daaronderbegrepen micro-injectie, macro-injectie en micro-encapsulatie;

* celfusie- of hybridisatietechnieken waarbij levende cellen met nieuwecombinaties van genetisch materiaal worden gevormd die van nature nietvoorkomen.

De volgende technieken worden niet geacht te leiden tot genetische modi-ficatie, op de voorwaarde dat bij de technieken geen gebruik gemaaktwordt van recombinant DNA moleculen of GGO’s:* in vitro bevruchting;* conjugatie, transductie, virale infectie, transformatie* polyploïde-inductie.

Uitzonderingen op de regelsDe volgende GGO’s zijn uitgezonderd van de regelgeving en vallen ook niet onder derichtlijnen in dit boekje op voorwaarde dat daarbij geen andere recombinant-nucleïne-zuurmoleculen of GGO’s worden gebruikt dan die welke geproduceerd zijn door middelvan één of meer van de hieronder genoemde technieken:* Mutagenese.* Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van prokaryotische soorten die genetisch

materiaal uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen.* Celfusie (met inbegrip van protoplastfusie) van cellen van eukaryotische soorten, met

inbegrip van de productie van hybridoma’s en de fusie van plantencellen.


* Zelfklonering, dat wil zeggen het verwijderen van nucleïnezuursequenties uit een celvan een organisme, al dan niet gevolgd door de reïnsertie van dit nucleïnezuur of eendeel daarvan (of een synthetisch equivalent) – eventueel na een aantal voorafgaandeenzymatische of mechanische bewerkingen – in cellen van dezelfde soort of cellen vaneen fylogenetisch nauw verwante soort waarmee eerstgenoemde soort genetisch materi-aal kan uitwisselen door middel van bekende fysiologische processen, voorzover hetonwaarschijnlijk mag worden geacht dat het resulterende micro-organisme een ziektekan verwekken bij mens, dier of plant. Bij zelfklonering mag gebruik worden gemaaktvan recombinante vectoren waarvan het gebruik in combinatie met de betrokken micro-organismen in de loop der tijd veilig is gebleken.

Recombinant-DNA GGO’sInmiddels kan een groot aantal organismen genetisch gemodificeerd worden, bijvoor-beeld: bacteriën, gisten, schimmels, insecten (fruitvlieg), parasieten, nematoden, planten,kikkers of zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, geiten, schapen, varkens, runderen). Bij genetische modificatie zijn altijd de volgende componenten betrokken:1. Een gastheer (het te modificeren organisme);

N.B. De term ‘gastheer’ heeft hier een andere betekenis dan in de context van pathogenen (zieverklarende woordenlijst)

2. Een donorsequentie (of insert), afkomstig uit een bepaald organisme (het donororganis-me). Ook wordt steeds vaker gewerkt met een synthetisch vervaardigde sequentie. Dezesequentie kan ofwel van nature in een bepaald organisme voorkomen, ofwel volledignieuw zijn.

3. En in veel, maar niet alle gevallen een (genetische) vector.Voor transformatie van bacteriën worden meestal plasmiden als vector gebruikt. Inandere gevallen worden virussen of virale vectoren gebruikt. Voorbeelden van gevallenwaarin geen genetische vector wordt gebruikt zijn de micro-injectie van DNA in de pro-nucleus van een bevruchte eicel, of de modificatie van een plant met behulp van hetgenenkanon. Afhankelijk van het gebruikte systeem zal een vector al dan niet aanwezigblijven in het uiteindelijke GGO.

De risico-analyseGGO’s zijn (net als niet-GGO’s) noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Daaromwordt per geval een risico-analyse uitgevoerd. De risico-analyse is een drietrapsproceswaarin achtereenvolgens:1. De eigenschappen van de gastheer, vector en donorsequenties die gevaar met zich

meebrengen zoals pathogeniteit, toxiciteit, mogelijkheden tot verspreiding van hetorganisme en overdracht van genetisch materiaal worden geïdentificeerd. Dit leidt toteen eerste identificatie van het niveau van risico.

2. Vervolgens wordt vastgesteld welke maatregelen nodig zijn om het organisme veilig tekunnen hanteren. Daarbij wordt rekening gehouden met:

Risicoklasse 1 GGO’s die geen of een verwaar- Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 1loosbaar risico inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu

te beschermenRisicoklasse 2 GGO’s die weinig risico inhouden Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 2

voldoende is om zowel de mens als het milieute beschermen

Risicoklasse 3 GGO’s die een matig risico Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 3inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu

te beschermenRisicoklasse 4 GGO’s die veel risico inhouden Activiteiten waarvoor inperkingsniveau 4 vol-

doende is om zowel de mens als het milieute beschermen


* De eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden blootgesteld.* Het type en de schaal van de activiteit.* Eventuele niet-standaard handelingen.3. Aan de hand van de uitkomst van de stappen 1 en 2 wordt dan de risicoklasse vastgesteld.

Net als bij pathogenen worden GGO’s ingedeeld in vier risicoklassen, en wel als volgt:

De risicoklassen bepaald door de Europese richtlijn 98/81/EG betreffende het ingeperktgebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen.

Er is inmiddels al heel wat ervaring met de risico-analyse van GGO’s. Dit heeft geleid totrichtlijnen voor het indelen van GGO’s. Deze richtlijnen zijn weergegeven in bijlage 2. Zezijn niet wettelijk bindend, maar het volgen van deze richtlijnen en de hierboven weerge-geven principes voor de risico-analyse vergemakkelijken de implementatie van de wettelij-ke vereisten. Afhankelijk van het type en de schaal van de activiteit dient nog nagegaan teworden of er bijzondere aanvullende maatregelen nodig zijn of dat er maatregelen van hetbasisinperkingsniveau achterwege kunnen blijven. De vier inperkingsniveaus voor laborato-ria, proefdierverblijven en serres zijn beschreven in bijlage 1.

Hieronder wordt een vergelijking gemaakt tussen de indeling van pathogenen en GGO’s inrisicoklassen en de bijbehorende basisinperkingsniveaus.

* N.B.: niveau 1 omschrijft vereisten voor zowel de infrastructuur als werkvoorschriften, ook al zijnde eisen aan de infrastructuur zeer beperkt. VMT (Veilige Microbiologische Technieken) omschrijftalleen een werkwijze.

Klasse Pathogenen GGO’s BasisinperkingRisicoklasse 1 Niet-pathogenen Geen of verwaar- Niveau 1 voor GGO’s, VMT voor

loosbaar risico niet-gemodificeerdemicro-organismen of cellen*

Risicoklasse 2 Zwak pathogenen Weinig risico Niveau 2Risicoklasse 3 Matig pathogenen Matig risico Niveau 3Risicoklasse 4 Zware pathogenen Veel risico Niveau 4


Natuurlijke besmettingswegenPathogenen hebben elk hun eigen besmettingsweg via welke ze van het ene naar hetandere organisme overgedragen worden. Hieronder volgen enkele belangrijke besmettings-wegen:

Besmettingsweg voorbeeldHuidcontact schimmelsVia de lucht of via aërosolen mazelenvirus

griepvirusPrikken (insecten, injectienaalden) malariaparasiet

gele koorts parasietBloed-bloed contact HIV-virus

hepatitis B virusVia wonden StaphylococcenVia faecaal materiaal Typhus bacteriën

Poliovirus

Al deze besmettingswegen kunnen, afhankelijk van het type werk dat gedaan wordt, inhet laboratorium voorkomen. Bij organismen die zich via de lucht kunnen verspreiden,spelen kleine druppeltjes of druppelkernen een rol, maar kan verspreiding ook plaatsvin-den via direct contact met bijvoorbeeld de handen, zakdoeken en kleren.

4. DE VERSPREIDING VANORGANISMEN INHET LABORATORIUM

Figuur 2: Verspreiding van micro-organismen via de lucht

contactdruppeltjes

druppels stof

secundaire reservoirszakdoeken

klerenbeddegoed

druppelkernen

contact contact

De verspreiding van organismen in het laboratorium 15

VerspreidingswegenBlootstelling van laboratoriummedewerkers aan organismen kan op verschillende manierengebeuren. In principe kan elke open bron van organismen (bijv. een geopende petrischaal)een bron van verspreiding van deze organismen zijn. Nu zal een houder in de praktijkalleen geopend worden wanneer er geen besmetting van het materiaal in de houder kanplaatsvinden, dus bij een vlam, of in een veiligheidskabinet. De praktijk laat zien dat vande meeste laboratoriuminfecties de oorzaak onbekend is. In de gevallen dat de oorzaakwel bekend is gaat het om prikaccidenten, morsen, kapot glaswerk, met de mond pipette-ren en om het bijten of krabben door een proefdier.

AërosolenBinnen de verschillende verspreidingswegen verdienen aërosolen bijzondere aandacht.Aërosolen zijn zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht kunnen verspreiden.Aërosolen ontstaan bijvoorbeeld bij het openen van flesjes met vloeistoffen waarop eennatte stop zit, of bij vortexen, blenden, bij het leegblazen van een pipet of het uitgloeienvan een natte entnaald. Aërosolvorming moet zoveel mogelijk worden vermeden. Bij werkmet organismen die een bepaald gevaar inhouden (vanaf risicoklasse 2) moeten aërosolpro-ducerende werkzaamheden zoveel mogelijk in een veiligheidskabinet worden uitgevoerd.

Figuur 3: aërosolproducerende handelingen

Ongewenste verspreidingvan organismen of van genetisch materiaal

Zoals hierboven duidelijk mag zijn geworden betekent de verspreiding van voor de mensgevaarlijke organismen een risico voor de medewerker (uzelf of uw collega’s). Wanneerverspreiding naar een medewerker mogelijk is, is ook verspreiding naar het milieu niet uit-gesloten. Verspreiding van organismen of van genetisch materiaal naar het milieu toe is

Gieten van vloeistof

Vallende druppels

Uitblazen van pipetten

Openen van vochtige stoppen

Centrifugeren van open buizen

te warme entogen


vaak ongewenst omdat dit een risico met zich mee kan brengen in de zin van verspreidingvan pathogeniteit, toxiciteit of verstoring van een ecologisch evenwicht. Dit geldt zekervoor de pathogenen en de GGO’s die in de risicoklassen 2, 3 en 4 thuishoren. Voor deorganismen (en hun genetisch materiaal) die thuishoren in risicoklasse 1 - zij brengengeen of een verwaarloosbaar risico met zich mee - geldt ook dat de verspreiding van het organisme of van genetisch materiaal naar het milieu toe moet worden beperkt.

Bacteriën, gisten, schimmelsBacteriën zijn in veel gevallen in staat genetisch materiaal over te dragen. Zeker wanneergewerkt wordt met vectoren die zelfoverdraagbaar zijn. Om te voorkomen dat genetischmateriaal makkelijk wordt overgedragen wordt daarom in de praktijk in de meeste gevallengewerkt met vectoren die moeilijk of helemaal niet mobiliseerbaar zijn.

The plasmid containsgenes thatcode for thesex pili-proteins

sex pili chromosome

Single stand DNA is transferred through the pilus to the receiver

Figuur 4: Overdracht van een zelfoverdraagbaar plasmide door middel van conjugatie

ZelfoverdraagbaarheidNatuurlijke plasmiden uit bacteriën bezitten soms de eigenschap om zichzelf over te kunnen dragen naar verwante bacteriën. Dit betekent datzij de genen dragen die zorgen voor de aanmaak van de structuren (‘pilli’)waarmee de ene bacterie een verbinding legt met de andere bacterie. Het plasmide wordt dan door dit kanaal overgedragen. De frequentie vanoverdracht van zelfoverdraagbare plasmiden ligt ook relatief hoog (10-3 tot10-5).

Dierlijke en menselijke cellenDierlijke en menselijke cellen kunnen zich niet zomaar naar het milieu verspreiden. Niet-besmette cellen kunnen ook geen genetisch materiaal ongewenst naar het milieu overdra-gen. Dierlijke en menselijke cellen zijn ten dode opgeschreven wanneer zij aan een niet-


steriele omgeving worden blootgesteld. Een uitzondering wordt gevormd door cellen dievan nature in een niet-steriele omgeving moeten overleven, zoals bijvoorbeeld vissen- ofkikkereicellen. In het geval van niet-besmette cellen zijn de maatregelen die getroffenworden om de celkweek te beschermen ook voldoende om het milieu te beschermen. Deoverdracht van genetisch materiaal vanuit dierlijke en menselijke cellen naar de omgevingkan alleen wanneer de cellen besmet zijn met biologische agentia - bijv. virussen - die instaat zijn het genetisch materiaal te mobiliseren. De vraag of cellen al dan niet geïnfec-teerd zijn is uit oogpunt van bioveiligheid belangrijk. Eventueel aanwezige virussen kun-nen een gevaar vormen voor de medewerker of het milieu en maatregelen dienen daaropafgestemd te zijn.

‘Besmette’ dierlijke cellen en menselijke cellenBij activiteiten met dierlijke cellen kan onderscheid gemaakt worden tussenprimaire celculturen en ‘established cell lines’. Primaire celculturen wordengemaakt door een biopt van een dier of mens in cultuur te brengen. Vaak kanvan dergelijke cellen niet op voorhand uitgesloten worden dat ze besmet zijnmet een ziekteverwekker, bijv. een virus. Daarom dient met primaire cellenaltijd enige voorzichtigheid te worden betracht. Established cell lines zijn cul-turen die al langer in kweek zijn en die geïmmortaliseerd zijn zodat ze onein-dig blijven delen. Meestal is gekend of ze vrij zijn van ongewenste besmettin-gen. De immortalisatie van dergelijke cellen kan op verschillende manieren totstand zijn gekomen: • spontaan (zoals bijv. bij NIH-3T3 cellen), • als gevolg van een natuurlijke virale infectie (bijv. HELA cellen, waarin enke-

le genen van het HPV virus aanwezig zijn),• of door de cellen te transfecteren met een factor die immortalisatie tot

gevolg heeft.Bij het hanteren van viraal geïmmortaliseerde cellijnen in combinatie met vec-toren waarin virale componenten aanwezig zijn, moet altijd nagegaan wordenof het mogelijk is dat er viruspartikels gevormd worden. Als dat zo is dient decellijn ingeschaald te worden in de risicoklasse van het betreffende virus.

VirussenBij virussen kan onderscheid gemaakt worden tussen wild type virussen en virale vectoren(van virus afgeleide virale constructies). Het gebruik van virussen of virale vectoren impli-ceert ook altijd het gebruik van gastheercellen. Zonder gastheercellen geen vermenigvuldi-ging van het virus. In de praktijk komen er drie typen handelingen voor: (1) celkweek omvirus te produceren, (2) het hanteren van virus bevattende supernatanten (voor kwaliteits-controle, etc…) en (3) het transduceren van een te onderzoeken cellijn, proefdier of plant.Zeker in de virussupernatanten kan het virus in grote hoeveelheden en geconcentreerdaanwezig zijn. Voorzichtigheid bij het hanteren van de supernatanten is geboden. Nainfectie van cellen, plant of proefdier hangt het gevaar af van de mogelijkheden van hetvirus of de virale vector om zich nog te kunnen vermenigvuldigen. Soms wordt gewerktmet replicatiedefectief virus, wat betekent dat het virus wel de cellen kan infecteren, maar


zich niet meer kan vermenigvuldigen. De verspreidings- en overlevingsmogelijkheden ver-schillen van virus tot virus. Sommige viruspartikels kunnen via de lucht verspreiden enkunnen soms buiten de gastheer lang overleven. Andere virussen, zoals bijvoorbeeld HIV,zijn buiten de gastheer zeer kwetsbaar. Plantenvirussen hebben soms een ‘vector’ nodigom zich te kunnen verspreiden: vaak een insect die het virus opzuigt en zo de verspreidingnaar andere planten bewerkstelligt.

Transgene plantenTransgene planten worden in-vitro gekweekt, in fytotrons/kweekcellen en in serres en zelopen niet zomaar weg. Toch verdient de ongewenste verspreiding naar het milieu bijzon-dere aandacht. Zonder de juiste maatregelen kunnen pollen (stuifmeel) zich via de lucht ofmet behulp van insecten naar het milieu verspreiden. Of dit een reëel risico vormt hangt afvan de vraag of de plant een zelfbevruchter is of een kruisbevruchter. Bij een strikte zelf-bevruchter blijft de verspreiding van pollen immers zonder effect. In het geval van eenkruisbevruchter is van belang na te gaan of er bloeiende verwante planten in het milieuvoorkomen waarmee de plant zou kunnen hybridiseren (kruisbevruchten). Daarnaast kun-nen zaden van transgene planten zich soms gemakkelijk ongewenst verspreiden. Zadenkunnen heel fijn of kleverig zijn en worden dan gemakkelijk meegenomen door eenonderzoeker die een kweekcel of serre verlaat.

Figuur 5: de reproductieve delen van Brassica

Niet alleen pollen en zaden kunnen aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding vangenetisch materiaal van planten. Ook bepaalde plantendelen kunnen soms, afhankelijk vande plant, nog gemakkelijk uitgroeien tot een hele plant. Zo kan een takje van een wilgnog uitgroeien tot een hele boom en kan de stronk van kool nog wortel schieten. Ditbetekent dat bij het hanteren van transgene planten of transgeen plantenmateriaal specia-le aandacht moet worden besteed aan de mogelijke verspreiding van de delen van de plantdie (nog) reproductief zijn. Indien er een reële kans bestaat dat de plant zich in het milieukan vestigen of indien uitkruising naar (bloeiende) verwanten mogelijk is, dient reproduc-tief plantenmateriaal eerst gedood te worden voordat het als afval wordt afgevoerd.

pollen

zaad

stengelbasis


Pollen Zaden Reproductieve delenZandraket In een serre is Arabidopsis een De zaden zijn erg klein. Bij aanra- Alleen pollen en zaden.

zelfbevruchter. De kans dat ver- king springen de hauwen open enspreiding van pollen een effect worden de zaden de lucht in ge-heeft is uitermate klein schoten. Speciale ‘aracons’ of andere

gelijkwaardige middelen zijn nodigom de verspreiding tegen te gaan.

Tabak Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden.spreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein.

Rijst Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden.spreiding van pollen een effect heeft is uitermate klein.

Tomaat Insectbestuiver / zelfbevruchter. Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden.Bestuivende insecten moeten worden geweerd.

Aardappel Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen De verspreiding van knollen spreiding van pollen een effect moet ook worden tegengegaan.heeft is uitermate klein.

Brassica Insectbestuiver / zelfbevruchter. Geen speciale opmerkingen De verspreiding van wortelsBestuivende insecten moeten en stronken moet ook wordenworden geweerd. tegengegaan.

Maïs Windbestuiver. De verspreiding van Geen speciale opmerkingen Alleen pollen en zaden.stuifmeel vanuit een serre is on-onwaarschijnlijk, zeker als ramenvoorzien zijn van insectengaas.

Tarwe Zelfbevruchter. De kans dat ver- Geen speciale opmerkingen De verspreiding van wortels en spreiding van pollen een effect stronken moet ook wordenheeft is uitermate klein. tegengegaan.

Transgene dierenBij transgene dieren moet voorkomen worden dat de dieren zich ongewenst verspreiden.Afhankelijk van het dier is dit gemakkelijk of soms moeilijker te voorkomen. Kleine knaag-dieren zoals de muis dienen in degelijke kooien gehuisvest te worden en de dierverblijvendienen zo ontworpen te zijn dat ontsnapping niet zomaar mogelijk is. Bij toepassing vaneen genetisch gemodificeerd micro-organisme of een wildtype pathogeen in een dier dientper geval bepaald te worden op welke wijze het micro-organisme of het pathogeen zichzou kunnen verspreiden vanuit het proefdier en dienen de inperkende maatregelen daaropafgestemd te worden. Het kan dan soms nodig zijn de dieren in individueel geventileerdekooien te huisvesten en al het materiaal dat in aanraking is geweest met de dieren te ont-smetten. Bij gebruik van cellen of ander biologisch materiaal in dieren dient bijzondereaandacht besteed te worden aan de mogelijke aanwezigheid van pathogene virussen in ditmateriaal. Sommige cellijnen zijn besmet met virussen. Zijn dergelijke virussen aanwezig,dan dienen de inperkende maatregelen aangepast te worden indien de mogelijkheidbestaat dat het virus zich verspreidt.

De verspreiding van transgene planten of transgeen plantenmateriaal


laboratory coat

sink

ventilation

closed�door

desinfection �of benches

5. INPERKING: EEN COMBINATIEVAN INFRASTRUCTUUR ENWERKVOORSCHRIFTEN

Aan de vier risicoklassen voor activiteiten met pathogene of genetisch gemodificeerdeorganismen zijn vier basisinperkingsniveaus gekoppeld. Inperking van de gevaren wordtbereikt door de toepassing van een combinatie van maatregelen van infrastructuur en hethanteren van speciale werkvoorschriften.

Inperking van gevaren=

Infrastructuur + werkvoorschriften

Wanden, deuren, veiligheidskabinet, Niet eten, drinken of roken,werkoppervlakken, etc… handen wassen, etc…

Elke trede in de inperkingsniveaus (bijv. van niveau 1 naar 2, of van 2 naar 3) voegt eenaantal eisen toe aan de eisen aan infrastructuur en werkvoorschriften van het voorgaandeniveau. Niet alleen voor laboratoria zijn deze inperkingsniveaus gedefinieerd, ook voor serres, proefdierverblijven en grootschalige procesinstallaties zijn de verschillende niveausvan inperking uitgeschreven. Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus vanlaboratoria, serres en proefdierverblijven zijn te vinden in de bijlagen aan dit boekje. De eisen voor procesinstallaties zijn op te vragen bij de bioveligheidsverantwoordelijke enterug te vinden op www.biosafety.be.

Figuur 6: inperking in een laboratorium

21

Inperking aan de bronZoals bij elke activiteit die een risico kan inhouden, dient een risico zoveel mogelijk bij debron te worden aangepakt. Dit betekent onder meer dat wanneer hetzelfde bereikt kanworden met een organisme, gastheer of vector die minder risico’s met zich mee brengt, ditaltijd de voorkeur heeft. Om inperking aan de bron te realiseren moet de onderzoekerindien mogelijk:

• een ingeperkte laboratoriumstam nemen in plaats van een wild type stam;• een niet- mobiliseerbare vector gebruiken in plaats van een

zelfoverdraagbare;• een replicatiedefectief virus of virale vector gebruiken in plaats van een

replicatiecompetent virus.

Fysische inperkingBij fysische inperking gaat het om alle fysieke maatregelen die genomen worden om eenorganisme van de buitenwereld af te schermen (en omgekeerd). Dit begint met de houderwaarin het organisme zich bevindt maar daarnaast gaat het om een laboratoriumconstruc-tie met een vloer, wanden en een plafond, en deuren en ramen die dicht kunnen. Ookgaat het om werkoppervlakken die geschikt zijn voor het werken met de betreffendepathogenen of GGO’s. Om te kunnen werken met micro-organismen moeten de werk-oppervlakken glad zijn afgewerkt en goed ontsmet kunnen worden. Een wasbak moetaanwezig zijn om na de werkzaamheden de handen te kunnen wassen. Voor de hogereinperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden er afhankelijk van het risico van de activiteit fysiekemaatregelen toegevoegd aan het basisniveau zoals bijvoorbeeld:• veiligheidskabinet (klasse I, II of III)• onderdruk in het lokaal• een sas (sluis)• een douche• HEPA-filtering van de afgevoerde lucht• speciale bekers en apparatuur om de verspreiding van aërosolen tegen te gaan• gasdichtheid van het lokaal om het met een gas te kunnen ontsmetten• etc…Een overzicht van de fysische inperkingseisen is opgenomen in de bijlage 1.

VeiligheidskabinettenEen veiligheidskabinet is een belangrijke vorm van fysische inperking. In feite wordt hier-mee een veilige werkplaats in een laboratorium gecreëerd. Veiligheidskabinetten zijn ineerste instantie ontworpen met het oog op de bescherming van de medewerker en intweede instantie met het oog op de bescherming van het milieu. Er wordt een onder-scheid gemaakt in drie klassen: I, II en III. Een klasse I veiligheidskabinet is een afzuigkast,waarbij de afgezogen lucht over een HEPA-filter wordt geleid. Dit kabinet geeft alleenbescherming aan de medewerker, maar niet aan het experiment.

Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften


Klasse IIEen veiligheidskabinet van klasse II (een ‘downflow’kast) beschermt zowel de medewerker,het experiment, als het leefmilieu. Deze kasten hebben een neerwaartse laminaire lucht-stroom. Van dit type kabinet bestaan er heel veel verschillende uitvoeringen.

A front openingB sashC exhaust HEPAD exhaust plenum

A front openingB sashC exhaust HEPA filterD rear plenumE supply HEPA filterF blower

Room air

Contaminated air

HEPA-filtered air

Room air

Contaminated air

HEPA-filtered air

De goede werking van een klasse II veiligheidskabinetDe bescherming die een veiligheidskabinet van klasse II aan de medewerker, het experi-ment en het milieu geeft, staat of valt met de goede werking van het kabinet. Hiervoor ishet noodzakelijk dat de luchtstromen in het kabinet zo min mogelijk verstoord worden.Dit betekent het volgende:

Figuur 7: Veiligheidskabinet klasse I

Figuur 8: Veiligheidskabinet klasse II

Inperking: een combinatie van infrastructuur en werkvoorschriften 23

Richtlijnen voor het correct gebruik van een veiligheidskabinet van klasse II

1. Bereid een experiment terdege voor en verzamel alle benodigde spullenvooraleer te starten;

2. Laat het kabinet 10 minuten draaien vooraleer met het experimentte starten;

3. Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters met een desinfectans (bijvoorbeeld 70% alcohol);

4. Zet alleen de noodzakelijke spullen in het kabinet;

5. Zet nooit materialen op de luchtaanzuigroosters aan weerszijden van hetwerkoppervlak;

6. Werk van links naar rechts of omgekeerd, maar zorg in ieder geval vooreen ‘schone’ kant en een ‘vuile’ kant (met kleine houder voor biologischbesmet afval zoals pipetpunten);

7. Maak rustige, beheerste bewegingen om de luchtstromen zo min mogelijkte verstoren;

8. Werk diep genoeg in het kabinet, niet er half buiten;

9. Werk nooit met een bunzenbrander, omdat deze de luchtstroom te veelverstoort, maar gebruik wegwerp-entnaalden voor het overenten.

10. Ontsmet na het experiment de materialen (aan de buitenzijde) voordatdeze uit het kabinet worden verwijderd;

11. Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters;

12. Laat het kabinet na het experiment nog minimaal 5 minuten in werking.

13. Sluit de opening van het kabinet af.


Klasse IIIEen veiligheidskabinet van klasse III geeft een optimale bescherming aan zowel mede-werker als milieu, maar geeft een iets minder goede bescherming aan het experiment vanwege het ontbreken van de neerwaartse luchtstroom in het kabinet. De klasse III kast is volledig afgesloten en manipulaties in het kabinet geschieden via afgesloten rubbermanchetten. Materiaal wordt in de kast gebracht via doorgeefautoclaaf of een kleine goederensas.

A glove ports with O-ringfor attaching arm-lenght gloves to cabinet

B sashC exhaust HEPA filterD supply HEPA filterE double-ended autoclave

or pass-through box

Room air

Contaminated air

HEPA-filtered air

Beschermingveiligheidskabinet medewerker milieu experimentKlasse I goed goed slechtKlasse II goed goed goedKlasse III uitstekend uitstekend goed

Horizontale laminaire flowkasten en crossflowkastenIn laboratoria waar met dierlijke cellen of met in-vitro plantenkweek wordt gewerkt, wordtveel gebruik gemaakt van horizontale laminaire flow- en crossflowkasten. Dit zijn kastenwaarin een steriele luchtstroom horizontaal of verticaal de kast in wordt geblazen maarwaar de ‘vuile’ lucht de laboratoriumruimte in wordt geblazen. Dit betekent dat de mede-werker in de luchtstroom zit. Dergelijke kasten geven dus geen enkele bescherming aan demedewerker en ook niet aan het milieu. Het zijn dus geen ‘veiligheidskabinetten’ en hetgebruik ervan moet in de meeste gevallen afgeraden worden. Dergelijke kasten kunnenniet gebruikt worden voor werk dat een risico voor de medewerker of voor het milieuinhoudt. Het gebruik van dergelijke kasten is uitzonderlijk toegestaan zolang er nietgewerkt wordt met open bronnen van GGO’s of met pathogenen, zoals bijvoorbeeld openpetrischalen met gemodificeerde of pathogene bacteriën of geopende erlenmeyers metbacteriekweken.

Figuur 9: Veiligheidskabinet klasse III


HEPA filtersHEPA staat voor ‘High Efficiency Particulate Air’ filter. Dit is een filterwaarin een matrix vele keren opgevouwen zit zodat een heel groot opper-vlak teruggebracht wordt tot een relatief klein volume. Een HEPA filter kanmet zeer grote efficiëntie deeltjes afvangen: slechts maximaal 0.03% vande deeltjes met een doorsnee van 0.3 micrometer mogen door het filterpasseren. De eigenschappen van de filter zijn zodanig dat zowel de deeltjesdie groter zijn als de deeltjes die kleiner zijn dan 0.3 micrometer, met eengrotere efficiëntie worden afgevangen. De werkzaamheid van HEPA filtersDe HEPA filters in veiligheidskabinetten dienen jaarlijks door specialistengecontroleerd te worden op hun werkzaamheid, en zonodig vervangen.

WerkvoorschriftenFysieke maatregelen alleen zijn niet voldoende om een veilige werksituatie te creëren. Hetgaat juist om de combinatie met een speciale werkwijze. Dit betekent dat voor elk niveauook specifieke werkvoorschriften zijn uitgeschreven.

Basiswerkvoorschriften: Veilige Microbiologische TechniekenVoor het basisinperkingsniveau vormen de werkvoorschriften de belangrijkste bijdrage aande inperking. Deze basisvoorschriften vormen de principes van “Veilige MicrobiologischeTechnieken” (VMT). Iedereen die in een laboratorium met micro-organismen en cellenwerkt moet deze voorschriften tot de dagelijkse routine maken.

A front openingB sashC supply HEPA filterD blower

horizonalelaminaire flowkast

laminaireflowkast

Room air

Contaminated air

HEPA-filtered air

Figuur 10:


Veilige Microbiologische Technieken:1. Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.

2. Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.

3. Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium zijn verboden.

4. Draag geen sieraden of horloges en houdt de handen schoon en de nagels kort.

5. Na het morsen van GGO’s wordt direct ontsmet.• Neem vloeistoffen op met tissues of papier en gooi dit in de bak voor

biologisch afval.• Ontsmet met 70% alcohol het oppervlak waarop gemorst is. Alternatieven

zijn detol of decontamine. Gebruik hiervoor een tissue of papier.• Was de handen na afloop.

6. Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd.• Centrifugeer alleen met dichte buizen.• Voorkom dat doppen van buizen nat zijn.• Gloei natte entnaalden op de juiste manier uit; d.w.z. eerst de steel en

dan pas het entoog.• Laat entnaalden eerst afkoelen voor ze weer in cultuurvloeistof te steken.• Druk pipetten niet met kracht leeg, maar laat ze leeglopen.• Giet vloeistoffen geleidelijk (en nooit van grote hoogte) uit.

7. Met de mond pipetteren is verboden.• Gebruik altijd een pipetteerballon of een mechanische pipet.• Voor kleine hoeveelheden wordt een mechanische micropipet gebruikt.

8. Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen ofhergebruikt.• Dit kan door ze te autoclaveren of door ze in gevalideerde

ontsmettende vloeistof te dompelen.

9. Biologisch afval wordt geïnactiveerd.• Deponeer hiertoe het afval in de verzamelbak voor biologisch afval. Dit

moet worden afgevoerd naar de autoclaaf of naar een verbrandings-oven die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.

10. De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.• Gebruik hierbij desinfecterende zeep.


Naast het hanteren van deze basiswerkvoorschriften zijn ook belangrijk:1. Het bijhouden van een gedetailleerd labjournaal, waarin per dag beschreven wordt met

welk biologisch materiaal u heeft gewerkt en welke handelingen u heeft verricht;2. Het controleren van het biologisch materiaal waarmee gewerkt wordt. Wanneer materi-

aal van collega-onderzoekers wordt verkregen dient eerst gecontroleerd te worden dathet inderdaad om het bedoelde materiaal gaat (stamcontrole, controle (van restrictie-patronen) van vectoren), en bovendien dienen ook de eigen stammen regelmatiggecontroleerd te worden. Een alternatief is om regelmatig vanuit een schone stock tewerken of stammen regelmatig opnieuw in te kopen.

Elk eenvoudig laboratorium waarin de VMT-werkwijze wordt toegepast, voldoet aan hetinperkingsniveau 1. Het laboratorium hoeft niet meer dan de simpele basisvoorzieningente hebben als een vloer, wanden, plafond, glad afgewerkte, goed te reinigen werkopper-vlakken en een wasbak. Voor de inperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden aan de basisvoor-schriften eisen toegevoegd zoals bijvoorbeeld:

• Tijdens de uitvoering van de werkzaamheden worden handschoenen gedragen.• Toegang tot de werkruimte is voorbehouden aan bevoegden.• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.• Inactivering van de effluenten van wasbakken en douches.• Specifieke maatregelen om de vorming van aërosolen tegen te gaan, bijvoorbeeld het

uitvoeren van mogelijks aërosolproducerende handelingen in een veiligheidskabinet.• Ontsmetting van kleren vooraleer men de inperkingszone verlaat.• etc…

Een overzicht van de eisen aan de inperkingsniveaus 1 t/m 4 is gegeven in de bijlage 1.

Het gebruik van handschoenenEr bestaan veel misverstanden over het gebruik van handschoenen en in veel gevallengeven handschoenen een vals gevoel van veiligheid. Voor risicoklasse 1 activiteiten is hetgebruik van handschoenen niet vereist. De toepassing van de Veilige MicrobiologischeTechnieken is voldoende om veilig te werken. Zelf voor risicoklasse 2 activiteiten zijnhandschoenen geen standaardvereiste. Handschoenen moeten wel gebruikt worden in hetgeval dat huidcontact met het biologisch materiaal een gevaar betekent, of wanneer prik-of snijaccidenten kunnen gebeuren, bijvoorbeeld wanneer gewerkt wordt met scalpels ofinjectienaalden in combinatie met biologisch risicovol materiaal. Handschoenen wordenook vaak gebruikt om de besmetting van onderzoeksmateriaal met micro-organismen,DNA of RNA dat op je handen zit te voorkomen. Je moet echter niet vergeten dat ditmateriaal net zo goed op de handschoenen kan zitten, vooral als ze gedurende langeretijd worden gedragen en wanneer ze in contact zijn geweest met allerlei materiaal.


Dus als handschoenen worden gebruikt moet altijd rekening worden gehouden met hetvolgende:• draag handschoenen alleen wanneer het echt nodig is, dus enkel wanneer er een reëel

gevaar bestaat dat jij of het experiment besmet raken.• Draag de handschoenen alleen wanneer je daadwerkelijk het experiment uitvoert, en

niet wanneer je allerlei ander materiaal hanteert zoals gesloten houders, of wanneer jein je labjournaal schrijft.

• Als je handschoenen draagt, vervang ze dan regelmatig.

Beperkte toegangVanaf risicoklasse 2 geldt voor de toegang tot het laboratorium een wettelijke beperking.Deze houdt in dat alleen het personeel toegang heeft tot het laboratorium dat voldoetaan specifieke toegangsvereisten. Om te voorkomen dat niet-toegelaten personeel toch indat laboratorium kan geraken, dient de deur op slot te zijn als er niet in het laboratoriumwordt gewerkt. En dat geldt zeker voor klasse 3 en 4 activiteiten.

Personeel zou enkel de toelating mogen verkrijgen om klasse 2, 3 en 4 laboratoria binnente gaan, wanneer zij voldoende kennis hebben van veilige werkpraktijken en wanneer zijalle specifieke veiligheidsprocedures voor het betreffende laboratorium kennen en wetenhoe deze in de praktijk toe te passen. Er moet altijd een up-to-date register of lijst zijnvan de mensen die toegang hebben tot het laboratorium.

Om de onopgemerkte toegang tot klasse 2, maar vooral ook klasse 3 en 4 laboratoria teverhinderen verdient het aanbeveling deze laboratoria niet dicht bij de in- of uitgang vaneen verdieping of gebouw te plaatsen.

Besmetting, accidenten, ontsmetting en inactivatie 29

Een besmetting is gauw gebeurd. Er kan gemorst worden bij het overgieten van vloeistofof er kunnen een paar druppels wegspatten. Het is zaak een besmetting direct ongedaante maken. Ook andere ongelukjes zoals het stukvallen van een glazen houder, een prikac-cident met een naald of een snijwond van een mes of scalpel zitten in een klein hoekje.Bij elke besmetting of elk ongeluk is blootstelling aan het organisme het gevolg. Dit is nietmeteen een direct gevaar wanneer het om onschadelijke organismen gaat. Toch dient ookdan een besmetting opgeruimd te worden. Gebeurt dit niet, dan betekent dit dat restenvan micro-organismen zich in het laboratorium ophopen en zo een potentiële bron vanbesmetting vormen voor het werk van anderen.Er kan echter ook sprake zijn van ongelukjes met organismen die ofwel direct voor de mede-wer-ker (alle humane pathogenen), ofwel voor het leefmilieu (GGO’s en pathogenen van risicoklasse 2, 3 en 4) een risico inhouden. Dan is het zeker zaak gemorst materiaal snel op te rui-men en oppervlakken te ontsmetten. Het morsen op niet-intacte huid of het morsen van bijvoor-beeld pathogeen-virusconcentraat op de intacte blote huid mag niet onopgemerkt voorbijgaan.

VoorkomingHet is zaak om ongelukjes zoveel mogelijk te voorkomen. Dit kan alleen door voorzichtigen doordacht te werken. Experimenten dienen zorgvuldig van tevoren te worden gepland,materialen van tevoren verzameld en na afloop dient alles weer te worden opgeruimd.Slordigheid is de belangrijkste oorzaak van ongelukjes. Scalpels niet rond laten slingeren,maar opbergen in een veilige houder. Op injectiespuiten de naalden niet herkappen, maarde naalden deponeren in een speciaal daarvoor voorziene container.

MeldingHet is zaak om accidenten waarbij medewerkers aan gevaarlijke menselijke pathogenen zijnblootgesteld te melden. En niet alleen wanneer het bloed eruit spuit. Ook wanneer er eenkleine kans op besmetting is geweest, of wanneer er twijfels zijn over de karakterisatie vanhet materiaal (denk aan niet-getest humaan bloed) moet een melding gedaan worden. Deverantwoordelijke personen voor de bioveiligheid en/of de interne dienst voor preventie enbescherming en indien nodig ook de arbeidsgeneesheer en de verzekeringsdienst (in verbandmet de eventuele terugbetaling van dure geneesmiddelen) dienen op de hoogte te wordengesteld. Na het ongeluk dienen meteen passende maatregelen te worden genomen. Antiviralegeneesmiddelen moeten bijvoorbeeld waar nodig kort na de besmetting worden ingenomen.

6. BESMETTING, ACCIDENTEN,ONTSMETTINGEN INACTIVATIE


Handelen na prik- of snijaccidentBij een prik- of snijaccident, of een spat in het oog of op de mucose met materiaal datinfectieus is voor de mens moet het volgende worden gedaan:1. De wonde laten bloeden.2. Uitwassen.3. Ontsmetten.4. Eventuele verdere verzorging.5. Noteren in het EHBO register.Afhankelijk van het type agens waaraan men is blootgesteld dienen eventueel aanvullendemaatregelen te worden genomen. Bij opname van ongekarakteriseerd menselijk bloeddient bijvoorbeeld bepaald te worden of er besmetting geweest is met Hepatitis B,Hepatitis C of HIV en moet bepaald worden hoe dit te bestrijden.

Ontsmetting van werkoppervlakken en dergelijkeVoor de ontsmetting van materialen en werkoppervlakken zijn verschillende middelenbeschikbaar die elk hun eigen werkingsmechanisme hebben. Globaal bekeken zijn er tweealgemene werkingsmechanismen:(1) door de lipide membraan van het micro-organisme aan te tasten met als gevolg dat de

celinhoud vrij komt;(2) door eiwitten en enzymen noodzakelijk voor de overleving van het micro-organisme

aan te tasten.

Ethanol, quaternaire ammoniumzouten, en oppervlakte-actieve stoffen (zoals detergentenen zepen) hanteren de eerste werkingsmethode. Sterk oxiderende stoffen zoals chloor ofwaterstofperoxide hanteren de tweede methode. Phenolen zoals lysol werken door zoweleiwitten als de lipide membraan te vernietigen.

Wat meer informatie over een aantal specifieke ontsmettingsmiddelen:

• AlcoholAlcoholen zijn effectief tegen vegetatieve bacteria, schimmels en virussen met een lipidemembraan, maar niet tegen sporen. De werkzaamheid tegen non-lipide virussen is sterkvariabel. Het moet als een 70% oplossing gebruikt worden. Mengsels met andere agen-tia zijn effectiever dan alcohol alleen, bijvoorbeeld 70% alcohol met 100g formaldehydeper liter of alcohol met 2g/liter chlorine. N.B.: de ontaarde alcohol die in laboratoriawordt gebruikt is giftig. Ook alcoholoplossingen vergaan en daarom dienen ze minimaaléén keer per maand ververst te worden.

• Natrium hypochloriet (bleekwater)Het vrijkomende chlorine werkt sterk oxiderend en is effectief tegen alle typen vanmicro-organismen. Natrium hypochloriet moet toegepast worden in een concentratie


van 20 ml/l tot 100ml/l afhankelijk van de vraag of het gaat om ‘vuile condities’ (vb. een 1 op 10 oplossing van bleekwater). Oplossingen met chlorine vergaan snel. Om er zeker van te zijn dat ze goed werken dienen de oplossingen één keer per weekververst te worden.

• FormaldehydeFormaldehyde is een gas dat werkzaam is tegen alle micro-organismen, mits gebruikt bijeen temperatuur hoger dan 20°C en een luchtvochtigheid van ten minste 70%. Het isgeschikt voor het ontsmetten van vloeistoffen en voor de decontaminatie van veilig-heidskabinetten of van hele ruimten via verneveling. N.B.: formaldehyde is een vermoedcarcinogeen. Bovendien is het irriterend en mag het niet worden ingeademd.Formaldehyde wordt alleen in uitzonderlijke gevallen gebruikt wanneer een lokaal ofeen veiligheidskabinet in zijn geheel ontsmet moet worden, bijvoorbeeld een luchtdichtL3 laboratorium waar een besmetting heeft plaatsgevonden of een luchtdicht proefdier-verblijf waar gevaarlijke micro-organismen op de vloeren en wanden kunnen zitten.Ontsmetting met formaldehyde is een tijdrovende en gevaarlijke onderneming die alleendoor specialisten veilig kan worden uitgevoerd. Overleg met de preventiedienst is daar-om aangewezen alvorens op te starten.

• WaterstofperoxideNet als hypochloriet werkt dit tegen alle typen van micro-organismen vanwege zijn oxi-derende werking. Het wordt gebruikt als een oplossing van 6%. Het is niet geschikt voorgebruik op aluminium, koper, zink of brons.

• Moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelenEr zijn vandaag veel verschillende moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelen op demarkt. De meeste bevatten een combinatie van stoffen met verschillende werkingsme-chanismen tegen micro-organismen. Ze kunnen oxiderende stoffen bevatten, quaternai-re ammoniumzouten, oppervlakte-actieve en andere stoffen. Deze middelen kunnenvoor ontsmetting gebruikt worden op voorwaarde dat ze gevalideerd zijn voor de micro-organismen waarmee je werkt. Raadpleeg niet alleen de gebruiksaanwijzing van dezemiddelen, maar controleer ook welke werkzame stoffen in welke concentratie aanwezigzijn, en welke werkingsmechanismen vertegenwoordigd zijn in het middel.

Ontsmetting, zeker als het gaat om de ontsmetting van oppervlakken, geschiedt nooitvoor de volle 100%. Ontsmetting leidt slechts tot een sterke reductie van het aantal kiemen (bij goede ontsmetting van een bacteriële besmetting om en nabij de 90%, viralebesmetting is meestal beter te verwijderen). Ook is het zo dat bij het gebruik van ontsmet-tingsmiddelen de lijken van de micro-organismen en het vuil vaak achterblijven. Daarom ishet van belang dat bij de (wekelijkse) schoonmaak van de ruimten de werkoppervlakken,vloeren en deurknoppen worden afgenomen met warm water en zeep. Twee keer ont-smetten leidt dus eigenlijk pas tot een echt goede ontsmetting.


De werkzaamheid van verschillende ontsmettingsmiddelen

schimmels bacteriën mycobacteria sporen lipide non-lipide virussen virussen

Alcohol - +++ +++ - + VHypochloriet + +++ ++ ++ + +Formaldehyde +++ +++ +++ +++* + +Peroxide + +++ ++ ++ + +

* boven de 40 °C V = variabel

InactivatieDe doding van biologisch materiaal is vaak niet eenvoudig. Bacteriesporen zijn bijvoor-beeld resistent tegen temperaturen van 100°C. Autoclaveren is dan aangewezen: verhittingvan water onder druk bij 121°C gedurende 20 minuten. Soms worden ook temperaturenvan 134°C gehanteerd. De doding van micro-organismen is zeer goed, op de voorwaardedat de hete stoom overal goed bij kan. Luchtzakken zijn een bekend probleem. Dierlijkecellen zijn soms in staat in een luchtzak de autoclavering levend te doorstaan. Het bela-den van een autoclaaf dient daarom zorgvuldig te gebeuren en deksels dienen losgedraaidte worden. Autoclavering is de aangewezen methode om bacteriën, gisten en schimmels tedoden. Voor andere organismen zoals cellen van planten en dieren en soms ook van virus-sen zijn eenvoudiger alternatieven beschikbaar. Verhitting tot 80°C of de blootstelling aaneen zeepoplossing zijn vaak voldoende om de cellen te doden. Het is van belang om na tegaan of de toe te passen methode een gevalideerde methode is: dat wil zeggen dat nage-gaan moet worden dat de doding effectief is. Inactivatie geeft een veel betere doding danontsmetting: een juist uitgevoerde inactivatie geeft een doding van 100%.

Vaak wordt voor de doding van vloeistoffen met bacteriën gebruik gemaakt van Natriumhypochloriet. Daarbij moet opgelet worden dat de finale concentratie chlorine in de oplos-sing voldoende is om de bacteriën te doden (20-100ml/l). Opgemerkt moet worden datautoclavering nog altijd een veel milieuvriendelijker methode van inactivatie is. De vloei-stoffen met chloor worden in de praktijk (te) vaak door de gootsteen gegooid. Er mogenin principe geen stoffen in het bedrijfsafvalwater terechtkomen die de werking van eenafvalwaterzuiveringsstation negatief zouden kunnen beïnvloeden.Voor een goede doding van micro-organismen is ook belangrijk dat het ontsmettingsmid-del voldoende lang in contact is met de micro-organismen. Over het algemeen geldt dateen blootstelling van 15 tot 30 minuten vereist is.


De aangewezen ontsmetting en inactivatiemethode voor enkele relevante organismen

Ontsmetting Inactivatie1% 2% 70% Formal- natte hitte droge hitte Verhit-

NaOCI glutar- ethanol dehyd 121 °C, 20’ 160 °C, 60’ tingaldehyd 60 °C

E.coli x x x x x xLactobacillus x x x x x xSalmonella x x x x x xAspergillus x x x xAdenovirus x x xInfluenzavirus x x x x x, 30’HIV x x x x, 30’Vaccinia x x x x**

* geldt alleen voor kleine volumina serum** alleen voor heat-labile antigen vaccinia

Biologisch afvalBiologisch afval moet afgevoerd worden. Een belangrijk onderscheid moet gemaakt worden tussen biologisch afval dat geïnactiveerd is voordat het wordt afgevoerd en biolo-gisch afval dat niet geïnactiveerd is voordat het wordt afgevoerd. Deze laatste categoriemoet als risicohoudend medisch afval worden beschouwd en afgevoerd worden naar eenvuilverbrandingsinstallatie die geschikt is voor de verbranding van risicohoudend medischafval.

Onder biologisch afval wordt verstaan:Wel:• alle genetisch gewijzigd en/of pathogeen biologisch materiaal: celculturen, culturen van

micro-organismen, weefsel, bloed….• typisch labo-afval van organische aard: gels………• alle mogelijks biologisch besmet materiaal: handschoenen, doekjes of papier, wegwerp

kweekrecipiënten, pipetten, ….• en alle zaken die niet noodzakelijk besmet zijn, maar die niet in een gewone vuilzak

mogen worden geworpen omdat ze scherp zijn, of er vies uitzien (beenderen, bloed,…)Niet:• radio-actief besmet afval (dit dient apart te worden afgevoerd).

Hoe met biologisch afval om te gaanEr kan een onderscheid gemaakt worden tussen vast (en pasteus) en vloeibaar biologischafval. Afhankelijk van de vragen of het afval geïnactiveerd is en/of chemisch verontreinigd,wordt het biologisch afval op de volgende manier ingedeeld:


Risicohoudend medisch afval (RMA) wordt verzameld in speciale gele containers diegeschikt zijn voor het transport van dit afval. Eenmaal gesloten, kunnen deze containersniet meer geopend worden. Ze zijn bovendien zo stevig dat het vallen van hoogtes geenprobleem vormt. Deze speciale RMA containers moeten op regelmatige basis door eenerkende vervoerder afgevoerd worden naar een vuilverbrandingsoven die geschikt is voorde verbranding van ziekenhuisafval. De volgende richtlijnen gelden voor de tijdelijkeopslag van de containers, voor afvoer naar de vuilverbranding:- maximaal 2 maanden, bij een maximale temperatuur van 4 °C;- maximaal 2 weken, bij een maximale temperatuur van 20 °C- maximaal 1 week, indien de temperatuur van de opslagruimte boven de 20 °C uit kan komen.

Biologisch afval afkomstig uit proefdierverblijvenHet afval afkomstig uit proefdierverblijven behoort tot dezelfde categorieën als hierboven aan-gegeven. Transgene laboratoriumdieren zoals ratten en muizen moeten worden gedood en ineen RMA container worden afgevoerd naar de vuilverbranding. Het beddingmateriaal en de uit-werpselen van deze transgene dieren hoeven niet als GGO-afval te worden beschouwd. Dit kanafgevoerd worden als restafval of GFT, zonder het vantevoren te inactiveren. Het wordt echteranders wanneer het gaat om materiaal van dieren die behandeld zijn met genetisch gemodifi-ceerde en/of pathogene micro-organismen. De gebruikte micro-organismen kunnen dan hetbeddingmateriaal en de uitwerpselen besmetten. Voor de met micro-organismen behandeldedieren geldt hetzelfde als voor de transgene dieren: ze moeten worden gedood en als RMAworden afgevoerd. Al het beddingmateriaal en de uitwerpselen moeten verzameld worden engeïnactiveerd. Dit kan ofwel in-huis worden gedaan, of het materiaal wordt verzameld in RMAcontainers en afgevoerd naar de vuilverbranding.

Afval van plantenEr moet ook voorzichtig worden omgegaan met afval van transgene planten. Alle bloemen (die stuifmeel bevatten), zaden, en – afhankelijk van de plantensoort – de reproductieve delen(zie hst 4 van dit boekje) moeten worden verzameld en geïnactiveerd. Er zijn verschillende mogelijkheden om dit materiaal te doden: sterilisatie is de meest rigoreuzemethode, maar ook eenvoudiger methoden kunnen soms volstaan, zoals het verhakselen vanmateriaal. Ook stomen is voor plantaardig materiaal en voor grond die in contact is gekomenmet transgeen plantenmateriaal, een uiterst geschikte methode van inactivatie.Al het niet-reproductief materiaal kan worden gecomposteerd (nat of droog) en kan na decompostering worden afgevoerd als restafval of tuinafval. Wanneer planten zijn geïnfecteerd of behandeld met genetisch gemodificeerde en/of pathoge-ne micro-organismen dan moeten ze als geheel worden geïnactiveerd, zowel als de grond enander materiaal dat mogelijks besmet is.

Soort afval Geïnactiveerd Chemisch verontreinigd BestemmingVast/pasteus + - => restafvalVast/pasteus + + => chemisch afvalVast/pasteus - + of - => risicohoudend medisch afvalVloeibaar + - => bedrijfsafvalwaterVloeibaar + + => chemisch afvalVloeibaar - + of - => risicohoudend medisch afval

Werken met enkele veelgebruikte laboratoriumorganismen 35

Werken met genetisch gemodificeerdeEscherichia coli en met fagen

InschalingGenetisch gemodificeerde E.coli K12, B en C stammen en alle fagen kunnen onder L1omstandigheden (zie bijlage 1) gehanteerd worden op de voorwaarde dat:• de gebruikte vectoren niet zelfoverdraagbaar zijn• de gekloneerde genen geen schadelijke genproducten aanmaken (bijv. een toxine), of

niet tot expressie komenDeze K12, B en C stammen zijn geattenueerde (verzwakte) laboratoriumstammen die tenopzichte van de wildtype E.coli stammen biologisch ingeperkt zijn en niet langer patho-geen zijn. Hieronder zijn enkele inschalingen gegeven, waarbij ter illustratie is aangegevenvolgens welke inschalingsregel uit bijlage 2 deze inschaling tot stand is gekomen. Omdatdeze inschalingen uitgaan van onschadelijke inserts is uit bijlage 2 het subartikel steeds eof j (afhankelijk van de vraag of het insert al gekarakteriseerd is). Het spreekt voor zich dathet insert sterk medebepalend is voor de inschaling. Dit betekent dat in het geval metinserts gewerkt wordt die niet-onschadelijk zijn, bijvoorbeeld wanneer het insert codeertvoor de productie van een toxine, een ander subartikel van toepassing wordt en dan gaatde inschaling minimaal één trede omhoog.

* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse

7. WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUMORGANISMEN

Stam vectoren inschaling* Inschalings- Opmerkingenregel**

Behorend tot Niet-zelfoverdraagbare L1 1.e of j bijna alle gebruikteE. coli K12, vectoren (tra-) coli systemen vallenB of C hieronderBehorend tot zelfoverdraagbare L2 2.e of j een voorbeeld isE. coli K12, vectoren (tra+) sommige miniTn5 B of C systemenOverige E. coli Niet-zelfoverdraagbare L2 3.e of j er moet vanuit wordenstammen vectoren (tra-) gegaan dat deze

stammen nogpathogeen zijn

** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel


LaboratoriumvoorzieningenIn veel gevallen wordt met E.coli K12, B of C stammen gewerkt in combinatie met niet-zelfoverdraagbare vectoren en dan is een eenvoudig L1 laboratorium met basisvoorzienin-gen voldoende. Vanzelfsprekend moeten de werkoppervlakken goed ontsmet kunnen wor-den. Open handelingen met E. coli kunnen op een bench gebeuren, mits de vorming vanaërosolen geminimaliseerd wordt (zie VMT voorschriften). Enten en dergelijke kunnen bijeen vlam. Een alternatief voor het werken met open bronnen op de bench is om dezehandelingen in een veiligheidskabinet uit te voeren. De voorschriften van VeiligeMicrobiologische Technieken dienen te worden nageleefd.

AfvalAlle vaste materialen (voedingsbodems) en alle vloeistoffen die gemodificeerde coli’sbevatten en alle met coli’s besmette materialen dienen geïnactiveerd of ontsmet te worden. Er mag geen levende coli in het huishoudelijk afval terechtkomen. Zorg daaromvoor afvalbakken die duidelijk gemarkeerd zijn voor biologisch afval. Vloeistoffen dienengeautoclaveerd te worden voordat ze door de gootsteen verdwijnen. Een alternatief isinactivatie met hypochloriet, maar dit is een minder milieuvriendelijk alternatief. Een uit-zondering op deze regel zijn E.coli K12 stammen die een vector dragen die niet mobili-seerbaar (mob-) en goed gekarakteriseerd is, een gen dragen dat goed gekarakteriseerd is(herkomst, grootte, genproduct, functie, etc…) en bovendien een genproduct aanmakendat volstrekt onschadelijk is. In dat geval is inactivering niet nodig. Dit behoort echter totde uitzonderingsgevallen die in een researchsetting nauwelijks voorkomen. Bovendien iseen expliciete en specifieke toelating vereist die bevestigt dat inactivatie niet nodig is.

BijzonderhedenMet enige regelmaat (2x per jaar) dienen de gebruikte stammen gecontroleerd te worden(stamcontrole). Een alternatief is om regelmatig opnieuw te starten vanuit een schone cul-tuurstock.

Een praktisch voorbeeldOm de bepaling van de risicoklasse en de inperkingsmaatregelen te illustreren en tevensaan te geven hoe dit boekje kan worden gebruikt worden hieronder enkele concrete prak-tijkvoorbeelden van risico-inschattingen uitgewerkt.

Een voorbeeld van de bepaling van de inschaling in de praktijk

1. De klonering van een chymosine-gen in pUC18 met E. coli stam JM109 als gastheer,waarbij alleen kleinschalige standaardlaboratoriumhandelingen zullen worden uitgevoerd

Stap 1: Is de combinatie van gastheer en vector geschikt voor risicoklasse 1? Daarvoor moeteerst nagegaan worden of de gebruikte E.coli stam geschikt is voor risicoklasse 1. Alle E. coli


K12, B of C-stammen zijn geschikt voor risicoklasse 1 en dus is het voldoende om in catalogi,bij de leveranciers, of in stammendatabases (bijv. ATCC of DSMZ) na te gaan of JM109 tot dezestammen behoort. Het antwoord is in dit geval: ja, JM109 is een E.coli K12.Daarna moet nagegaan worden of de vector geschikt is voor risicoklasse 1. PUC18 is een goedgekarakteriseerde vector zonder schadelijke eigenschappen die bovendien niet-zelfoverdraag-baar is. De vector is geschikt voor risicoklasse 1. (Een gedetailleerde beschrijving van de eisenaan vectoren is te vinden in bijlage 2 aan deze brochure, in hst A. Ook is daar te vinden wat´goed gekarakteriseerd´ inhoudt). De gastheer-vector combinatie zijn dus geschikt voor risicoklasse 1.

Stap 2: Nu kan in bijlage 2 het bijbehorende inschalingsartikel worden opgezocht. In dit gevalis uit hst A van bijlage 2, in de ‘eerste richting’ de categorie 1 van toepassing (gastheer-vec-torsysteem voldoen immers aan de criteria voor indeling in risicoklasse 1). Maar voor de inscha-ling dient eerst nog het risico van het insert ingeschat te worden.

Stap 3: In dit geval wordt gewerkt met een stukje erfelijk materiaal uit rund dat verantwoorde-lijk is voor de productie van chymosine, een eiwit dat zorgt voor de stremming van kaas. Het isin dit geval goed gekarakteriseerd, is geen toxine, heeft niets te maken met virussen of metpathogeniteit, en is ook niet op een andere wijze schadelijk. Dus is uit hst A van bijlage 2, in de‘tweede richting’, categorie j van toepassing, hetgeen een eerste identificatie van het inscha-lingsniveau oplevert: L1

Stap 4: Zijn er nog bijzonderheden in verband met: (1) het milieu dat zou kunnen wordenblootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard han-delingen. In dit geval worden er bijvoorbeeld alleen kleinschalige, reguliere handelingen gedaanzoals: transformatie, kleinschalige kweek in erlenmeyers, centrifugatie, eiwitisolatie, gelelectro-forese. Een activiteit wordt pas als grootschalig gezien als het gaat om grote kweekvolumes ineen productiefaciliteit. Toch vereisen ook kleine fermentoren vaak bijzondere aandacht als hetgaat om afdichting en fysische inperking van de down-stream processing.Er zijn in dit geval geen bijzondere handelingen die ofwel een extra risico met zich meebren-gen ofwel een bijzondere vorm van additionele inperking vereisen. De finale inschaling komtdaarom neer op het hanteren van de standaard L1-voorschriften. Hierover kan het volgendein dit boekje worden teruggevonden:• L1-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje• Gedetailleerde VMT-basisvoorschriften: hst 5 van dit boekje• Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje

Een mogelijke variatie op dit voorbeeld:

1a. De klonering van het chymosine gen in een zelfoverdraagbaar plasmide in E. coli JM109en het aanbrengen van de gemodificeerde bacteriën op een kunststof matrix waarbij nietvermeden kan worden dat aërosolen ontstaan.In dit geval verandert de inhoud van stap 2: de vector voldoet niet aan de eisen voor risicoklas-se 1. Dit betekent dat van hst A, bijlage 2, in de ‘eerste richting’ nu categorie 2 van toepassingwordt. Het genproduct is nog steeds goed gekend en niet schadelijk, dus blijft in de ‘tweederichting’ j van toepassing, wat een L2 inschaling oplevert.Er wordt bovendien een bijzondere aërosolproducerende handeling uitgevoerd. Hiervoor is eenadditionele inperkende maatregel nodig, bovenop de standaard L2 voorschriften: er moet eenveiligheidskabinet van klasse II aanwezig zijn waarin de aërosolproducerende handeling wordtuitgevoerd. Finaal wordt de inschaling dus L2 mét gebruik van veiligheidskabinet klasse II.Hierover kan het volgende in dit boekje worden teruggevonden:


• L2-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje• Beschrijving hoe te handelen in een veiligheidskabinet: hst 5 van dit boekje• Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje

Zijn er gevallen aan te wijzen waarin er bijzondere aandacht nodig is voor eventueel extrate nemen maatregelen? Hieronder volgen enkele voorbeelden:1. Het ontstaan en de verspreiding van aërosolen kan niet worden geminimaliseerd (dit is het

voorbeeld hierboven beschreven onder 1a). Het gebruik van een veiligheidskabinet van klasseII is dan al gauw noodzakelijk.

2. GGO´s of pathogenen worden in een niet-destructieve meting gedurende langere tijd openen bloot gehanteerd. Als de organismen gevaarlijk zijn, dient nagegaan te worden of ze zichzouden kunnen verspreiden. Zo ja, dan dienen in veel gevallen de ruimte en de medewerkerextra beschermd te zijn (bijv. onderdruk en HEPA-filtering op afgevoerde lucht en/of hand-schoenen en gelaatsbescherming).

3. GGO´s of pathogenen worden in fermentoren gehanteerd en in een downstream-procesopgezuiverd. Sommige fermentoren zijn dichter dan andere en dit geldt zeker ook voordownstream-procesapparatuur. Bij organismen van klasse 2 en hoger dient er bijvoorbeeldook een hydrofoob absoluut filter of een HEPA-filter aanwezig te zijn op de fermentorgasaf-voer.

4. GGO´s of pathogenen worden in of op een plant of proefdier gebracht. Er dient per geval zorg-vuldig te worden nagegaan of verspreiding naar het milieu van het GGO of het pathogen moetworden tegengegaan. De maatregelen hangen sterk af van plant tot plant en van dier tot dier.Vaak bepaalt de toedieningswijze of en hoe een micro-organisme zich kan verspreiden.

Wat te doen bij twijfel over de inschaling of eventueel toe te passen maatregelen?

In achtereenvolgende stappen, indien de voorgaande stap geen uitsluitsel heeft gegeven:1. Zoek eventueel ontbrekende informatie op om een betere inschatting te kunnen maken.2. Raadpleeg uw hiërarchische overste.3. Raadpleeg uw groepsleider.4. Win eventueel advies in bij interne experts op het terrein van bioveiligheid (zie bijlage 5 van

dit boekje), of win anders eventueel extern advies in bij de sectie bioveiligheid en biotechno-logie van het WIV (http://www.biosafety.be).

Werken met niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten

InschalingNiet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten zoals Saccharomyces cerevisiae, Schizo-saccharomyces pombe en Pichia pastoris kunnen allemaal onder L1 conditiesgehanteerd worden op voorwaarde dat er geen genen in zijn gekloneerd die gevaarlijkeproducten aanmaken. De in laboratoria gebruikte stammen van gist zijn allemaal op deéén of andere wijze deficiënt en hebben een speciaal voedingsmedium nodig waaraan eenbepaalde essentiële stof is toegevoegd. Vaak gaat het om aminozuurdeficiënties.


LaboratoriumvoorzieningenDezelfde standaard laboratoriumvoorzieningen als voor E.coli zijn voldoende. Het verdientechter aanbeveling open handelingen met gisten uit te voeren in een veiligheidskabinet.Gisten kunnen gedurende lange tijd in de lucht overleven en kunnen op deze wijze allerleikweken besmetten. Daarnaast is er bij gesensibiliseerde mensen kans op een allergischereactie na blootstelling aan gist of zijn sporen. Daarom wordt gistwerk vaak in een apartlokaal gedaan.

AfvalOp dezelfde manier als voor E. coli dient alle afval dat genetisch gemodificeerde gistenbevat geïnactiveerd of ontsmet te worden.

BijzonderhedenOok hier geldt dat bij het kloneren van een gen dat codeert voor een schadelijk genpro-duct zoals een toxine, de risicoklasse omhoog gaat en dat alle bijbehorende maatregelenmoeten worden opgetrokken naar dat niveau.

Werken met genetisch gemodificeerde cellijnen

InschalingDe inschaling van dierlijke of menselijke cellijnen is niet eenvoudig. De bepalende factor isof de cellen schadelijke biologische agentia kunnen produceren, en dan met name virus-sen. Ten eerste dient een onderscheid te worden gemaakt tussen primaire cellen en ‘esta-blished cell lines’. De minimum inschaling van primaire cellen is L2. Bij established celllines moet vastgesteld worden of ze eventueel een virus zouden kunnen produceren.Daarbij moet rekening gehouden worden met virale sequenties die in de vector aanwezigzijn. Enkele voorbeelden:

Cellijn Virale Vector (dient Inschaling* Inschalings- Opmerkingsequenties slechts als regel**in cellijn voorbeeld)

Primaire onbekend niet relevant L2 - Inschaling kan pas om-muizen- laag als aangetoondcellijn is dat de cellen geen

schadelijke biologischeagentia produceren

NIH-3T3 geen SV40ori vector L1 4, e of j kans op vorming van virus is nul

HELA E6E7 genen SV40ori vector L1 4, e of j combinatie viraleuit HPV sequenties in cellijn

en vector kan geenvirus opleveren


* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse!** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel

LaboratoriumvoorzieningenDe benodigde laboratoriumvoorzieningen variëren naargelang de inschaling. EenvoudigeL1 laboratoria voldoen voor cellen zoals NIH-3T3. In de praktijk is het zo dat voor hetenten en opgroeien van dergelijke cellen goed uitgeruste celkweeklaboratoria wordengebruikt die qua inrichting veel meer zijn dan een L1 laboratorium. Er is meestal een vei-ligheidskabinet klasse II aanwezig om bij de open handelingen met de cellen de cellen tebeschermen tegen infecties van buitenaf. In plaats van een veiligheidskabinet klasse IIwordt vaak gebruik gemaakt van een horizontale laminaire flowkast. Een dergelijke kast isgeschikt voor L1 activiteiten met celkweken. Voor cellen die een L2 inschaling vereisen, iseen horizontale laminaire flowkast niet geschikt. In dat geval is alleen een veiligheidskabi-net van klasse II geschikt om zowel de medewerker, het milieu en de celkweek te bescher-men. De eisen van L2 in vergelijking met die van L1 zijn vooral strenger voor wat betreftde toegang tot het laboratorium en de uitvoering van werkzaamheden waarbij aërosolengevormd kunnen worden.

AfvalAl het biologisch afval van genetisch gemodificeerde cellen dient te worden geïnactiveerd.Er is echter een onderscheid tussen de celkweken van L1 niveau en die van L2 niveau.Voor celculturen van L1 niveau is het voldoende om ze bloot te stellen aan een zeepop-lossing en vervolgens door de gootsteen te spoelen. Ook besmette materialen kunnen opdeze manier behandeld worden. Voor celculturen op L2 niveau dienen meer rigoureuzemaatregelen te worden genomen om ervan verzekerd te zijn dat ook mogelijke schadelijkebiologische agentia gedood zijn. Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.

BijzonderhedenWerk nooit met autologe cellen. Zeker wanneer daar groeifactoren of oncogenen in geklo-neerd zouden worden bestaat het gevaar dat een besmetting leidt tot ongewenste gevolgen.De cellen worden immers niet door het immuunsysteem als vreemd herkend.

293 E1 en stuk E1 gedeleteerde L2 8, e of j recombinatie tussenE4 uit adenovirale sequenties in cellijnadenovirus vector en vector kan repli-

catie competentevirusdeeltjes geven

EBV geïm- cellen bevat- niet relevant L2 - de inschaling van demortaliseerde ten compleet cellen volgt de in-lymfocyten EBV virus schaling van het

virus dat erin aan-wezig is


Werken met genetisch gemodificeerde virussen of virale vectoren

InschalingDe indeling van genetisch gemodificeerde virussen in risicoklassen volgt in het algemeende biologische risicoklassen van de virussen (zie bijlage 5.51.8 aan Vlarem II, www.biosafe-ty.be), tenzij het insert zorgt voor een verhoging van het risico. In dat geval dient deinschaling hoger uit te vallen dan de biologische risicoklasse van het virus. Het gebruik vanvirussen en virale vectoren kan niet los gezien worden van het gebruik van cellijnen. En ditbetekent dat ook hier gekeken moet worden naar de combinatie van virussequenties in devector en in de cellijn. Bij de productie van replicatiedefectieve viruspartikels wordt gebruikgemaakt van cellijnen die de ontbrekende virale sequenties bezitten die nodig zijn omviruspartikels gevormd te krijgen. Pas wanneer er in dergelijke systemen geen kans bestaatop vorming van replicatiecompetente partikels kan de inschaling een trede omlaag.

Packaging Virale sequenties Vector (dient Inschaling* Inschalings- Opmerkingcellijn in cellijn als voorbeeld) regel**293 E1 gen en stuk van E1 gedeleteerde L2 8 e of j combinatie virale

E4 gen uit adenovirale sequenties in adenovirus vector cellijn en vector

kunnen resulteren i/d formatie van een replicatie-competentvirus

PER.C6 E1 gen van E1 gedeleteerde L1 9 e of j kans op vorming vanadenovirus adenovirale vector replicatie competente

zonder sequentie- virusdeeltjes is nuloverlap

PA317 gag-pol-env van retrovirale vector L2 8 e of j kans op vorming van amfotroop muizen- zonder gag-pol- RCR’s is klein, maarretrovirus env genen niet nul. Er is vaak

nog wat sequentie- overlap

Y-CRE gag-pol en env retrovirale L1 7 e of j kans op vorming vangenen van ecotroop vector zonder RCR’s is kleiner danmuizen-retrovirus als gag-pol-env bij PA317 en boven-twee gescheiden genen dien is het virus eco-constructen troop dus kan het de

mens niet infecterenPhoenix- E1/E4 van adeno- retrovirale vector L2 8 e of j kans op vorming van ampho virus, largeT van zonder gag-pol- RCR’s kleiner dan bij

SV40, en episomaal env genen PA317, maar doorgag-pol en env episomale aanwezig-genen van amfo- heid van gag-pol entroopmuizen env in meerdere kopie-retrovirus ën is de kans op vor-

ming van RCR’s niet nul* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse!** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel


LaboratoriumvoorzieningenVoor het opgroeien van adenovirale of muizenretrovirale partikels, of ze nu replicatiedefec-tief zijn of niet, is een laboratorium met inperkingsniveau 2 aangewezen. Bovendien is eenveiligheidskabinet van klasse II nodig, een horizontale laminaire flowkast geeft onvoldoen-de bescherming aan de medewerker en het milieu. Strikte toegangsregels gelden voor detoegang tot de ruimte.

AfvalAl het vast, vloeibaar en besmet materiaal dient geïnactiveerd of ontsmet te worden voor-dat het wordt weggegooid of hergebruikt. Autoclaveren is hiervoor de aangewezenmethode, of afvoeren van het materiaal in speciale biohazardafvalcontainers naar een vuil-verbranding die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.

BijzonderhedenWerkzaamheden met de verschillende virale vectoren kunnen niet gelijktijdig in eenzelfderuimte, laat staan in eenzelfde veiligheidskabinet worden uitgevoerd. Na beëindiging vanwerkzaamheden met een bepaald virus dienen de werkoppervlakken en het veiligheidska-binet te worden opgeruimd en ontsmet voordat het wordt vrijgegeven voor werkzaamhe-den met een ander virus.In het bovenstaande wordt uitgegaan van onschadelijke inserts. Bij het gebruik van viralevectoren, zeker wanneer het gaat om vectoren die hun erfelijk materiaal in het genoomvan de cel inbouwen, moet extra opgepast worden met bijvoorbeeld het gebruik vandominant cellulaire oncogenen. De inschaling gaat dan een klasse omhoog. Ook genenvoor sommige immuunmodulerende eiwitten kunnen in virale vectoren als schadelijk wor-den aangemerkt. Een risicoklasse 3 inschaling is in sommige gevallen nodig en daarvoorgelden strikte inperkingsvoorzieningen en werkvoorschriften die in de praktijk nogal watmet zich meebrengen.Er zijn steeds meer systemen voor de productie van virale vectoren waarbij het partikel datgeproduceerd wordt bestaat uit componenten afkomstig van verschillende virussen. Hetmeest bekende voorbeeld is de pseudotypering van retrovirale vectoren met het VSV-Geiwit. Dergelijke combinaties van virale componenten verdienen bijzondere aandacht.Gastheerspecificiteit kan veranderen, bijvoorbeeld van niet-infectieus voor de mens naarwel-infectieus voor de mens. De risicoklasse dient aangepast te worden aan het actuelerisico.


Werken met genetisch gemodificeerde Agrobacterium

InschalingOver het algemeen wordt gewerkt met A. tumefaciens stammen die ‘disarmed’ zijn, dat wilzeggen dat ze niet langer oncogeen zijn. Ze veroorzaken geen ‘crown galls’ meer. Deze stam-men vallen in risicoklasse 1. Dit geldt niet voor wildtype stammen of voor A. rhizogenes.

Stam vectoren Inschaling* Inschalings- Opmerkingenregel**

Disarmed A. Binaire en andere L1 1 e of j de stammen zijn biologischtumefaciens plant transformatie ingeperkt ten opzichte van stammen vectoren de wildtype stammenNot disarmed A. Binaire en andere L2 3 e of j deze stammen zijntumefaciens plant transformatie pathogeenstammen vectorenA. rhizogenes Binaire en andere L2 3 e of j deze stammen zijn

plant transformatie pathogeenvectoren

* uitgaande van onschadelijke inserts** het gaat hierbij om de uit bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel

LaboratoriumvoorzieningenStandaard L1 laboratoriumvoorzieningen volstaan voor disarmed A. tumefaciens stammen.Dezelfde regels kunnen gevolgd worden voor E. coli K12. Voor de niet-disarmed tumefa-ciens of A. rhizogenes stammen volstaat een standaard L2 laboratorium. In geval van L2werkzaamheden waarbij de vorming van aërosolen niet kan worden vermeden, dient eenveiligheidskabinet klasse II aanwezig te zijn.

AfvalAl het materiaal, vast of vloeibaar, dient ontsmet te worden net als voor E. coli.Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.

BijzonderhedenVaak worden kleine, recent getransformeerde plantjes overgezet op verse media. Dezeplantjes zijn (nog) niet vrij van A. tumefaciens. Meestal wordt dit gedaan in horizontalelaminaire en crossflowkasten. Dit is toegestaan zolang er niet gewerkt wordt met echteopen bronnen van Agrobacterium.


Werken met transgene planten

Bij het werken met transgene planten kunnen de volgende vuistregels gehanteerd worden:

1. Kweek in fytotrons of kweekcellen:• Kweekcellen moeten dicht zijn en mogen niet direct op de buitenlucht openen.• Plantenmateriaal moet geautoclaveerd worden voordat het als restafval wordt

afgevoerd (in het geval het nog niet vrij is van genetisch gemodificeerdeAgrobacterium tumefaciens).

• De verspreiding van zaden moet worden tegengegaan en reproductieve delen vanplanten moeten geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.

2. Kweek in serres:• Bij gebruik van bloeiende insectenbestuivers moeten openingen voorzien zijn van

insectengaas en mag de serre niet direct op de buitenlucht openen (er moet een saszijn); bij gebruik van bloeiende zelfbevruchters, apomicten of windbestuivers hoeft ergeen insectengaas op de openingen en is een sas niet echt nodig.

• Ook hier geldt dat de verspreiding van zaden tegengegaan moet worden. Zaden moeten zorgvuldig worden verzameld. Grond die zaden kan bevatten mag pas nainactivering worden afgevoerd als afval. Reproductieve delen van planten moetengeïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.

Referenties 45

Begrip voor Veilige Microbiologische Techniek; theoretische inleiding voor de practischecursus, Commissie ad hoc recombinant-DNA werkzaamheden, 1987

Veilig werken met micro-organismen en cellen in laboratoria en werkruimten; theorie enpraktijk; concept, oktober 1997; Nederlandse Vereniging voor Microbiologie.

Laboratory Biosafety Manual, second edition, WHO, Geneva, 1993

Leidraad voor een Handboek GGO ingeperkt gebruik, BVF-platform, 2001

Richtlijn 90/219/EEG, zoals gewijzigd door richtlijn 98/81/EEG

Vlarem I en II, rubriek 51

Biosafety cabinets, CDC, Atlanta, USA

http://www.biosafety.be

http://www.hc-sc.qc.ca/hpb/lcdc/biosafty/msds/index.html

http://www.ebsa.be

http://www.cdc.gov/od/ohs

8. REFERENTIES

Verklarende woordenlijst46

9. VERKLARENDE WOORDENLIJST

Aërosol: minuscule vloeistofdruppeltjes die zich door de lucht kunnen verplaatsenAmfotroop: in staat om zowel muize- als humane cellen te infecterenBiologisch agens: in zijn wettelijke definitie betekent dit ziekteverwekker (zie welzijnswet-geving)Donorsequentie: het stukje erfelijk materiaal dat uit een bepaald organisme – de donor –wordt overgebracht naar een ander organisme, ook wel insert genaamd. In veel gevallen isechter geen sprake meer van het overbrengen van een sequentie uit een ‘donor’, maarwordt een stuk erfelijk materiaal synthetisch aangemaaktEcotroop: enkel in staat om muizecellen te infecterenGastheer:(1) in de context van natuurlijke pathogenen betekent gastheer het organisme dat van

nature door de ziekteverwekker wordt geïnfecteerd,(2) in de context van genetische modificatie betekent gastheer het te modificeren organis-

me: het organisme waarin het nieuwe stukje erfelijk materiaal wordt ondergebracht.HEPA: High Efficiency Particulate Air (filter)Pathogeniteit: ziekteverwekkendheidReproductief: in staat uit te groeien tot een zelfstandig functionerend organismeToxiciteit: vergiftigingTransductie: staat in feite gelijk aan virale infectie. Wordt in de praktijk vooral gebruiktom de infectie van bacteriën door fagen en om de infectie van cellen door een virale vec-tor aan te duidenTransformatie:(1) in de context van tumoren betekent transformatie de omvorming van een normale cel

naar een oneindig delende tumorcel,(2) transformatie wordt in de genetische modificatie ook als algemene term gebruikt om

het proces van genetische modificatie aan te duiden (transformeren is dan gelijk aangenetisch modificeren).

Vector: letterlijk betekent dit ‘drager’(1) in het kader van genetische modificatie is dit het plasmide, cosmide, artificial chromo-

some of ander genetisch element dat de genetische modificatie – het insert – draagten binnenbrengt in het te modificeren organisme,

(2) in de context van virale infectie van planten duidt het begrip vector het organisme aandat zorgdraagt voor de overdracht van het virus van de ene naar de andere plant. Insommige gevallen zijn dit bladluizen.

Virale vector: een van een wild-type virus afgeleide virale constructie dat een vreemdDNA-fragment kan opnemen of in zich heeft en zich ofwel autonoom kan gedragen,indien hij de sequenties bezit die nodig zijn voor zijn verspreiding van cel tot cel, ofweldefectief, indien hij één of meer sequenties mist voor zijn verspreiding.

Inperkingsvereisten 47

In deze bijlage zijn de wettelijk vereiste Belgische inperkingseisen gegeven voor laboratoria, proefdierver-blijven en serres. De vereisten voor ziekenhuiskamers en grootschalige procesapparatuur zijn niet weerge-geven, maar kunnen teruggevonden worden op www.biosafety.be. Ook de vereisten voor zogenoemdequarantaine-organismen zijn niet weergegeven. Wanneer je wilt werken met een pathogeen dat voor-komt op de lijsten van quarantaine-organismen van het FAVV, moet je bij hen navragen welke vereistengelden om met deze organismen te mogen werken.

Belgische inperkingseisen voor L1-L4 laboratoriavoor werk met pathogenen en/of genetisch gewijzigde organismen

1. Inrichting en technische vereisten

BIJLAGE 1: INPERKINGSVEREISTEN

Maatregelen InperkingsniveauL1 L2 L3 L4

1 het laboratorium is gescheiden van niet vereist niet vereist vereist vereistandere werkzones in hetzelfde gebouwof is in een afzonderlijk gebouw gelegen

2 toegang tot het laboratorium via sas niet vereist niet vereist vereist, of als alternatief vereistenkel toegang via L2

3 Vergrendelbare toegangsdeur(en) niet vereist vereist vereist vereist4 zelfsluitende toegangsdeur(en) niet vereist optioneel vereist vereist5 vaste ramen niet vereist niet vereist, maar aan- vereist vereist (en onbreekbaar)

bevolen om te sluiten tijdens de proefneming

6 luchtdicht lokaal dat decontaminatie niet vereist niet vereist vereist vereistmet een gas mogelijk maakt

7 meubelen zijn dusdanig ontworpen dat niet vereist aanbevolen vereist vereisteen controleprogramma voor insectenen knaagdieren vergemakkelijkt wordt

8 kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat niet vereist optioneel aanbevolen vereisttoelaat te zien wie zich in het lokaal bevindt

9 was- en decontaminatievoorzieningen vereist (wasbakken) vereist (wasbakken) vereist (wasbakken in vereist (wasbakken envoor het personeel het sas of nabij de douche, deze laatste met

uitgang) chemische besprenkelingin geval van gebruik vanisolerend pak dat onder

positieve luchtdruk staat)10 wasbakken met niet-manuele bediening niet vereist optioneel vereist vereist11 kapstokken of kleedkamer voor aanbevolen vereist vereist vereist

beschermende kledij12 toevoerbuizen voor vloeistoffen niet vereist niet vereist aanbevolen vereist

voorzien van een terugvloeibeveiliging13 oppervlakken bestand tegen zuren, vereist (werktafel) vereist (werktafel) vereist (werktafel, vereist (werktafel,

basen, organische oplosmiddelen, vloer) vloer, muren, zoldering)waterondoordringbaar en gemakkelijkschoon te maken

14 autonoom electrisch systeem bij panne niet vereist niet vereist aanbevolen vereist



15 brandalarmsysteem (onder voorbehoud niet vereist niet vereist vereist vereistvan plaatselijke reglementering inzake brand)

16 interfoon, telefoon of elk ander systeem niet vereist niet vereist vereist vereist (niet manuelewaarmee communicatie buiten de bediening)inperkingszone mogelijk isVENTILATIE

17 luchttoevoersysteem gescheiden van de niet vereist niet vereist aanbevolen vereistaangrenzende lokalen

18 luchtafvoersysteem gescheiden van de niet vereist niet vereist aanbevolen vereistaangrenzende lokalen

19 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem niet vereist niet vereist vereist vereistonderling verbonden om accidenteleoverdruk te vermijden

20 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem niet vereist niet vereist vereist vereistafsluitbaar door middel van kleppen

21 onderdruk in de gecontroleerde zone ten niet vereist niet vereist vereist (controle- en vereist (controle- en opzichte van de druk in de omliggende alarmsystemen) alarmsystemen)zones

22 HEPA-filtratie van de lucht1 niet vereist niet vereist vereist (bij de afvoer) vereist (bij de toevoeren dubbele filtratie bij

de afvoer)23 systeem dat toelaat filters te vervangen - - vereist vereist

en daarbij besmetting te vermijden24 HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in - - optioneel niet toegelaten

omloop gebracht worden25 specifieke maatregelen om dusdanig te optioneel optioneel vereist2 vereist

ventileren dat daardoor de luchtbesmet-ting tot een minimum herleid wordt

1 Bij gebruik van virussen die niet tegengehouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen vereist voor de uit het laboratorium afgevoerde lucht.

2 De kennisgever moet deze maatregelen specificeren in het bioveiligheidsdossier, en de bevoegde instantie moet deze maatregelen in detoelating bepalen.


26 microbiologische niet vereist optioneel (klasse I of II) vereist (klasse I of II) vereist (klasse III;veiligheidskast/isolatieruimte indien klasse II,

isolerend pak dat onderpositieve luchtdruk staat)

27 autoclaaf indien autoclaaf, in het gebouw in het laboratorium of in het laboratoriumdan op de site aangrenzende lokalen3

28 doorgeefautoclaaf niet vereist niet vereist optioneel vereist29 centrifuge in de ingeperkte zone niet vereist vereist; niet vereist vereist vereist

indien lekvrije buizenworden gebruikt

30 vacuümgenerator voorzien niet vereist niet vereist aanbevolen vereistvan een HEPA-filter

2. Veiligheidsuitrusting

3 In dit geval zijn gevalideerde procedures nodig, die een equivalent niveau van bescherming bieden, voor de veilige overbrenging vanmateriaal naar een autoclaaf gesitueerd buiten het laboratorium.


3. Werkvoorschriften en beheer van afval


31 beperkte toegang aanbevolen vereist vereist (en controle) vereist (en controle)32 vermelding op de deur: aanbevolen (b, c) vereist(a, b, c) vereist (a, b, c, d, e, f) vereist (a, b, c, d, e, f)

a: biorisicotekenb: coördinaten van de verantwoordelijkec: inperkingsniveaud: aard van het biologisch risicoe: lijst van de toegelaten personenf: criteria voor toegang tot de inperkingszone

33 laboratorium met eigen specifieke uitrusting niet vereist niet vereist vereist vereist34 beschermende kleding vereist vereist vereist (en specifiek voor vereist (en specifiek voor

de inperkingszone) + de inperkingszone)optioneel geschikt schoeisel volledige omkleding

inclusief schoeisel bijbinnen- en buiten gaan

35 ontsmetting van kleding vooraleer ze de niet vereist niet vereist aanbevolen vereistinperkingszone verlaat

36 handschoenen niet vereist optioneel vereist vereist37 ademhalingsmasker niet vereist niet vereist optioneel vereist38 gelaatsbescherming (ogen/slijmvliezen) niet vereist optioneel vereist vereist39 fysische inperking van levensvatbare micro- aanbevolen vereist vereist vereist

organismen (gesloten systeem)40 vorming van spatten of aërosolvorming minimaliseren minimaliseren beletten beletten41 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) niet vereist aanbevolen vereist vereist

om vorming van spatten of verspreidingvan aërosols tegen te gaan

42 mechanische pipettering vereist vereist vereist vereist43 drinken, eten, roken, gebruik van cosmetica, vereist vereist vereist vereist

manipulatie van contactlenzen en opslag vanvoedsel voor menselijke consumptie is verboden

44 beschikken over geschikte registers vereist vereist vereist vereist45 toezicht op controlemaatregelen en vereist vereist vereist vereist

veiligheidsuitrusting46 nota voor gebruiksaanwijzing van vereist vereist vereist vereist

doeltreffende ontsmettingsmiddelen47 ontsmettingsmiddelen in de hevels niet vereist niet vereist aanbevolen vereist48 opleiding van het personeel vereist vereist vereist vereist49 schriftelijke instructies inzake procedures met vereist vereist vereist vereist

betrekking tot bioveiligheid50 doeltreffende controle van vectoren (bv. om de aan- niet vereist aanbevolen vereist vereist

wezigheid van insecten of knaagdieren op te sporen)51 rondlopen van dieren verboden verboden verboden verboden52 in geval van manipulatie van zoöpathogenen, niet vereist niet vereist aanbevolen

4vereist

4

periode waarbinnen elk contact van het personeelmet het(de) gastheerdier(en) moet worden vermedenAFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S

53 gevalideerde inactivering van biologisch afval vereist vereist vereist vereisten/of biologische residu’s volgens een geschiktemethode vóór verwijdering

54 gevalideerde inactivering van besmet materiaal vereist vereist vereist vereist(glaswerk, enz.) volgens een geschikte methodevóór het schoonmaken, hergebruiken of vernietigen

55 gevalideerde inactivering van de effluenten van niet vereist niet vereist optioneel vereistde wasbakken en douches volgens een geschik-te methode vóór eindafvoer

4 De bevoegde instantie bepaalt de periode in de toelating.


Belgische inperkingseisen voor A1-A4 proefdierverblijven


Maatregelen InperkingsniveauA1 A2 A3 A4

1 het animalarium is gescheiden van de niet vereist vereist vereist vereistandere werkzones in hetzelfde gebouwof is in een afzonderlijk gebouw gelegen

2 toegang via sas niet vereist aanbevolen vereist vereist (met driecompartimenten)

3 vergrendelbare toegangsdeur(en) vereist vereist vereist vereist4 zelfsluitende toegangsdeur(en) niet vereist vereist vereist vereist5 vaste ramen niet vereist niet vereist, maar vereist vereist (en onbreekbaar)

aanbevolen om te sluitentijdens de proefneming

6 luchtdicht lokaal dat decontaminatie met niet vereist optioneel vereist vereisteen gas mogelijk maakt

7 gebouw dusdanig ontworpen dat aanbevolen vereist vereist vereistaccidentele ontsnapping van dierenvermeden wordt

8 kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat toe- aanbevolen aanbevolen vereist vereistlaat te zien wie zich in het lokaal bevindt

9 was- en decontaminatie-voorzieningen vereist (wasbakken) vereist (wasbakken) vereist (wasbakken vereist (wasbakken envoor het personeel nabij de uitgang of in douche, deze laatste

het sas, een douche met chemische besproeiingis aanbevolen) in geval een isolerend

pak dat onder positieveluchtdruk staat)

10 wasbakken met niet-manuele bediening niet vereist aanbevolen vereist vereist11 kapstokken of kleedkamer voor vereist vereist vereist vereist

beschermende kleding12 toevoerbuizen voor vloeistoffen voorzien niet vereist niet vereist aanbevolen vereist

van een terugvloeibeveiliging13 afzonderlijke ruimte voor opslaan van aanbevolen vereist vereist vereist

propere kooien, voeder en strooisel14 oppervlakken waterondoordringbaar, vereist (kooien, vereist (kooien, vereist (kooien, vereist (kooien,

gemakkelijk schoon te maken en bestand werkoppervlakken) werkoppervlakken en vloer) werkoppervlakken, vloer werkoppervlakken, vloertegen ontsmettingsmiddelen muren, zoldering) muren, zoldering)

15 wasplaats voor kooien vereist vereist vereist vereist16 autonoom elektrisch systeem bij panne niet vereist niet vereist aanbevolen vereist17 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van niet vereist niet vereist vereist vereist

plaatselijke reglementering inzake brand)18 interfoon, telefoon of elk ander systeem niet vereist niet vereist vereist vereist (niet-manuele

waarmee communicatie buiten de bediening)inperkingszone mogelijk isVENTILATIE

19 luchttoevoersysteem gescheiden van niet vereist niet vereist aanbevolen vereistde aangrenzende lokalen

20 luchtafvoersysteem gescheiden van de niet vereist optioneel aanbevolen vereistaangrenzende lokalen

21 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem niet vereist optioneel vereist vereistonderling verbonden om accidenteleoverdruk te vermijden

22 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem niet vereist optioneel vereist vereistafsluitbaar door middel van kleppen

23 onderdruk in de gecontroleerde zone niet vereist optioneel vereist (controle en vereist (controle enten opzichte van de druk in de alarmsystemen) alarmsystemen)omliggende zones



24 HEPA-filtratie van de lucht5

niet vereist optioneel vereist (bij de afvoer) vereist (bij de toevoeren dubbele filtratie bij

de afvoer)25 systeem dat toelaat filters te vervangen - - vereist vereist

en daarbij besmetting te vermijden26 HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in - - optioneel verboden

omloop gebracht worden27 specifieke maatregelen om dusdanig te optioneel optioneel vereist6 vereist6

ventileren dat daardoor de lucht-besmetting tot een minimum herleid wordt

5 Bij gebruik van virussen die niet weerhouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen vereist voor de uit het laboratoriumafgevoerde lucht

6 De kennisgever moet deze maatregelen speciferen in het bioveiligheidsdossier, en de overheid bepaalt deze maatregelen in de toelating.



28 Microbiologische veiligheidskast niet vereist optioneel (klasse I of II) optioneel (klasse I of II) optioneel (klasse III of klasse II met isolerendpak dat onder positieve

luchtdruk staat)29 dieren ondergebracht in kooien of in een optioneel optioneel optioneel optioneel

gelijkwaardige geschikte inperking(omheinde ruimte, aquarium, enz)

30 isolatoren voorzien van HEPA-filtratie niet vereist optioneel vereist vereist31 autoclaaf op de site in het gebouw in het animalarium in het animalarium

of aangrenzende lokalen7

32 doorgeefautoclaaf niet vereist niet vereist aanbevolen vereist33 fumigatiesysteem of ontsmettingsbad niet vereist aanbevolen vereist vereist

7 In dit geval zijn gevalideerde procedures nodig, die een equivalent niveau van bescherming bieden, voor de veilige overbrenging van materiaal naar een autoclaaf gesitueerd buiten het animalarium.


3. Werkvoorschriften en afvalbeheer


34 beperkte toegang vereist vereist vereist (en controle) vereist (en controle)35 vermelding op de deur: biorisicoteken, vereist, behalve vereist vereist vereist

inperkingsniveau, aard van het biologisch biorisicotekenrisico, coördinaten van de verantwoordelijke,lijst van de toegelaten personen, criteria voortoegang tot de inperkingszone

36 animalarium met eigen specifieke uitrusting niet vereist aanbevolen vereist vereist37 beschermende kleding, specifiek voor de vereist vereist vereist + optioneel vereist volledige om-

inperkingszone geschikt schoeisel kleding bij binnen- en bui- tengaan, inclusief schoeisel

38 ontsmetting van kleding vooraleer de niet vereist niet vereist vereist vereistinperkingszone te verlaten

39 handschoenen optioneel aanbevolen vereist vereist40 ademhalingsmasker niet vereist optioneel optioneel vereist41 gelaatsbescherming (ogen/slijmvliezen) niet vereist optioneel optioneel vereist42 vorming van spatten en aërosols minimaliseren minimaliseren vermijden vermijden43 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) niet vereist aanbevolen vereist vereist

om vorming van spatten en verspreiding vanaërosols te controleren

44 mechanische pipettering vereist vereist vereist vereist45 verboden te drinken, te eten en te roken, vereist vereist vereist vereist

cosmetica te gebruiken, contactlenzen temanipuleren, of etenswaren bestemd voormenselijke consumptie op te slaan

46 register(s) waarop alle handelingen vermeld vereist vereist vereist vereistworden (binnenbrengen en buitenbrengenvan proefdieren, inoculatie van GGM’s enz.)

47 nazicht van controlemaatregelen en vereist vereist vereist vereistveiligheidsuitrusting

48 nota met gebruiksaanwijzing voor doel- vereist vereist vereist vereisttreffende ontsmettingsmiddelen

49 ontsmettingsmiddelen in de hevels niet vereist aanbevolen vereist vereist50 opleiding van het personeel vereist vereist vereist vereist51 schriftelijke instructies van procedures voor vereist vereist vereist vereist

bioveiligheid52 doeltreffende controle van vectoren (bv. aanbevolen vereist vereist vereist

voor detectie van de aanwezigheid vaninsecten en knaagdieren)

53 isolatie van proefdieren gebruikt bij de vereist vereist vereist vereistproefneming (afzonderlijk lokaal) (afzonderlijk lokaal) (afzonderlijk lokaal)

54 in geval van manipulatie van zoöpatho- niet vereist niet vereist aanbevolen8 vereist8

genen, periode waarbinnen elk contact vanhet personeel met het(de) gastheerdier(en)vermeden moet wordenAFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S

55 gevalideerde inactivering van biologisch vereist vereist vereist vereistafval en/of biologische residu’s (besmettekadavers, uitwerpselen*, strooisel*,...) volgenseen geschikte methode vóór verwijdering

56 gevalideerde inactivering van besmet mater- vereist vereist vereist vereistiaal* (glaswaren, kooien, enz...) volgens eengeschikte methode voor het schoonmaken,hergebruiken of vernietigen

57 gevalideerde inactivering van effluenten van niet vereist niet vereist aanbevolen vereistwasbakken en douches volgens eengeschikte methode vóór eindafvoer

8 De bevoegde instantie bepaalt de periode in de toelating* faeces van transgene dieren hoeven niet te worden geinactiveerd.


9 De serre moet een duurzame constructie zijn met een naadloze waterdichte bekleding, gelegen op een plek waarvan het talud van die aard is datde instroming van oppervlaktewater wordt voorkomen en voorzien van zelfsluitende, vergrendelbare deuren.

10 Onder constructie worden de wanden, het dak en de vloer verstaan.11 Als transmissie via de grond mogelijk is.12 In geval van gebruik van virussen die niet weerhouden worden door een HEPA-filter zijn speciale maatregelen van toepassing op de uit het

laboratorium afgevoerde lucht.

Belgische vereisten voor G1-G3 kweekcellen en serres

G4-vereisten zijn in de Belgische wetgeving niet gedefinieerd.


Maatregelen Inperkingsniveau

G1 G2 G31 de serre is een permanente constructie9 niet vereist vereist vereist2 kanten van de serre: zone in beton of van niet vereist vereist vereist

plantengroei gezuiverd over een breedte van 1,5mrondom de kas

3 beveiligde omheining niet vereist niet vereist vereist4 gangpaden gestabiliseerde hard materiaal hard materiaal

grond5 toegang via een afzonderlijke ruimte waarvan de niet vereist optioneel vereist

twee deuren een gekoppelde vergrendeling hebben6 vergrendelbare toegangsdeur(en) niet vereist vereist vereist7 constructie10 bestand tegen schokken niet vereist aanbevolen aanbevolen8 constructie9 waterbestendig en gemakkelijk schoon niet vereist aanbevolen vereist

te maken9 vaste ramen niet vereist niet vereist vereist10 hermetische constructie9 die decontaminatie met niet vereist niet vereist vereist

een gas mogelijk maakt11 decontaminatie-voorzieningen voor het personeel vereist (wasbakken) vereist (wasbakken) vereist (wasbakken in de lucht-

sluis of nabij de uitgang),douche in voorkomend geval)

12 wasbakken met niet-manuele bediening niet vereist niet vereist vereist13 toevoerbuizen voor vloeistoffen voorzien van niet vereist niet vereist aanbevolen

een terugvloeibeveiliging14 oppervlakken bestand tegen zuren of basen, niet vereist aanbevolen vereist

organische oplosmiddelen en ontsmettingsmiddelen15 waterondoordringbare vloer niet vereist aanbevolen vereist16 maatregelen met betrekking tot de afvloeiing van optioneel afvloeiing beperken11 afvloeiing beletten

verontreinigd water17 autonoom elektrisch systeem bij panne niet vereist niet vereist vereist18 brandalarmsysteem (onder voorbehoud van niet vereist optioneel vereist

plaatselijke reglementering inzake brand)19 interfoon, telefoon of elk ander systeem waarmee niet vereist optioneel vereist

communicatie buiten de inperkingszone mogelijk isVENTILATIE

20 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem onderling niet vereist optioneel vereistverbonden om accidentele overdruk te vermijden

21 luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar door niet vereist optioneel vereistmiddel van kleppen

22 onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte niet vereist niet vereist optioneelvan de druk in de omliggende zones

23 HEPA-filtratie van de lucht12 niet vereist niet vereist vereist (bij de toe- en afvoer)24 systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij - - vereist

besmetting te vermijden


G1 G2 G328 beperkte toegang vereist vereist vereist (en controle)29 signalisatie van het biologisch risico niet vereist vereist vereist30 specifieke uitrusting niet vereist niet vereist vereist31 beschermende kleding vereist vereist vereist (en specifiek

voor de inperkingszone)32 ontsmetting van de kleding vooraleer de niet vereist niet vereist vereist

inperkingszone te verlaten33 handschoenen niet vereist optioneel optioneel34 overschoenen of ontsmettingsbad voor schoenen niet vereist optioneel optioneel35 vorming van spatten en aërosols minimaliseren minimaliseren beletten36 specifieke maatregelen (inclusief uitrusting) om niet vereist aanbevolen vereist

vorming van spatten te beperken en verspreiding vanaërosols tegen te gaan

37 mechanische pipettering vereist vereist vereist38 verboden te drinken, te eten en te roken, cosmetica te vereist vereist vereist

gebruiken, contactlenzen te manipuleren, of etenswarenbestemd voor menselijke consumptie op te slaan

39 register(s) waarop alle handelingen vermeld worden vereist vereist vereist(binnenbrengen en buitenbrengen van planten,inoculatie van GGM’s enz.)

40 nazicht van controlemaatregelen en veiligheidsuitrusting vereist vereist vereist41 nota met gebruiksaanwijzing voor doeltreffende vereist vereist vereist

ontsmettingsmiddelen42 opleiding van het personeel vereist vereist vereist43 schriftelijke instructies van procedures voor bioveiligheid vereist vereist vereist44 rondlopen van dieren verboden verboden verboden45 maatregelen ter bestrijding van ongewenste vereist vereist vereist

organismen zoals insecten en andere arthropoden,knaagdieren, …

46 zichzelf verspreidende organismen:- transport binnen de inrichting tussen container, optioneel container dubbele container

de inperkingszones- vermelding op het register niet vereist aanbevolen vereist- decontaminatie van containers voor transport niet vereist vereist vereist

47 maatregelen met betrekking tot afvloeiing van besmet water optioneel afvloeiing minimaliseren14 afvloeiing belettenAFVAL EN/OF BIOLOGISCHE RESIDU’S

48 gevalideerde inactivering van biologisch afval vereist vereist vereisten/of biologische residu’s (besmette planten,besmette substraten, …) volgens een geschiktemethode vóór verwijdering




G1 G2 G325 autoclaaf op de site in het gebouw in de serre26 doorgeefautoclaaf niet vereist niet vereist optioneel27 fumigatiekamer of immersietank voor niet vereist niet vereist optioneel

transfer van levend materiaal

3. Werkvoorschriften en beheer van afval

14 Als transmissie via de grond mogelijk is.



G1 G2 G349 gevalideerde inactivering van besmet materiaal vereist vereist vereist

(glaswerk enz.) volgens een geschikte methodevóór reiniging, hergebruik en/of vernietiging

50 inactivering van de effluenten van wasbakken en niet vereist niet vereist optioneeldouches volgens een geschikte methode vóóreindafvoer


BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALINGVAN ACTIVITEITEN MET GGO’S

SitueringDeze richtlijnen hebben tot doel hulp te bieden bij de vaststelling van de benodigde inperkingsni-veaus bij activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen. In deze bijlage wordt onderscheidgemaakt tussen activiteiten met micro-organismen en cellen (hst. A), activiteiten met planten (hst. B)en activiteiten met dieren (hst. C). De transformatie van planten met behulp van Agrobacteriumstammen wordt ingeschaald als een activiteit met het micro-organisme.

Gebruik van deze richtlijnenDeze richtlijnen bieden met name hulp bij de inschatting van de benodigde inperkingsmaatregelenvoor activiteiten met micro-organismen en cellen (hst A van deze richtlijnen). In dit hoofdstuk A staateen beschrijving hoe de inschalingsschema’s te gebruiken. Daarnaast zijn de benodigde definities vantoxines en de eisen aan gastheren en vectoren voor risicoklasse 1 weergegeven. Indien het gaat omactiviteiten met transgene planten, dan geeft hst. B een leidraad. Activiteiten met transgene dieren envooral activiteiten waarin het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen of cellengecombineerd wordt met dieren zijn niet eenvoudig in te schalen. Hst C geeft hierin een leidraad.

Er zijn natuurlijk gevallen waarin deze richtlijnen niet voorzien. In een dergelijk geval is het vooradvies raadzaam contact op te nemen met de bioveiligheidsexperten intern en extern zoals weerge-geven in bijlage 5 van dit boekje.

BronnenDe richtlijnen zijn afgeleid van de Richtlijnen van de Nederlandse Commissie Genetische Modificatie(COGEM) voor zover die toepasbaar zijn in België. Daarnaast is gebruik gemaakt van de inschalings-voorschriften zoals deze zijn opgenomen in de bijlagen bij hoofdstuk 5.51 van Vlarem II.

HST A. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN METGENETISCH GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN EN CELLEN

InschalingsregelsOp de volgende pagina’s zijn schema’s weergegeven waarin een eerste identificatie van het inper-kingsniveau kan worden afgeleid. Zoals aangegeven in hoofdstuk 3 en in het voorbeeld in hoofdstuk7, dient daarna nog gekomen te worden tot een finale vaststelling van de benodigde maatregelenwaarbij rekening gehouden wordt met (1) de eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zoukunnen worden blootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-stan-daard handelingen. Het inschalingsschema is in vier stukken verdeeld:• Deel A1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1 en

activiteiten met niet virale pathogene gastheren.

VIB Richtlijnen voor inschaling van activiteiten met GGO’s 57

• Deel A2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en activiteiten met baculovirussen.• Deel A3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren.• Deel A4: Activiteiten met plantencellen.

De schema’s werken als volgt: Eerst worden de vier deelschema’s in de ‘eerste richting’ langsgelopenen wordt bepaald welk type van gastheer en vector van toepassing is. In tweede instantie wordt inde ‘tweede richting’ bepaald of het gaat om activiteiten met ongekarakteriseerd of gekarakteriseerdgenetisch materiaal. In derde instantie wordt dan binnen de van toepassing zijnde categorie (geka-rakteriseerd of ongekarakteriseerd) bepaald welk type van insertie van toepassing is. In het geval vanongekarakteriseerd genetisch materiaal is het een keuze tussen een van de categorieën a t/m e, inhet geval van gekarakteriseerd genetisch materiaal is het een keuze tussen de categorieën f t/m j. Uitde combinatie van de van toepassing zijnde categorie van gastheer/vector en van toepassing zijndecategorie van insert kan dan de inschaling worden afgelezen.

Definitie van klassen van toxinesa. Een toxine van klasse T-3 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van minder dan 100 nano-

gram per kg lichaamsgewicht;b. Een toxine van klasse T-2 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 100 nanogram tot

1 microgram per kg lichaamsgewicht;c. Een toxine van klasse T-1 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 1 tot 100 microgram

per kg lichaamsgewicht;

Eisen aan gastheer/vector systemen voor indeling in risicoklasse IEisen voor kleinschalige laboratoriumhandelingen(kleinschalig is <100 liter effectief kweekvolume)1. De gastheer is niet pathogeen.2. De gastheer is vrij van gekende biologische agentia die potentieel schadelijk zijn.3. De vector is goed gekarakteriseerd, dit wil zeggen: het type vector moet gedefinieerd zijn (plasmi-

de, cosmide, minichromosoom, etc.), grootte moet gekend zijn, functie en herkomst van structu-rele genen en merkergenen moet gekend zijn, evenals restrictiesites, en replicon. Commercieelverkrijgbare vectoren zijn in het algemeen goed gekarakteriseerd.

4. De vector mag geen schadelijke gevolgen hebben (geen virulentie- en toxinebepalende elementenoverbrengen).

5. De omvang van de vector is zoveel mogelijk beperkt tot die elementen die noodzakelijk zijn.6. De vector mag de stabiliteit van het GGO in het milieu niet doen toenemen.7. De vector moet moeilijk te mobiliseren zijn (Tra-).8. De vector mag geen resistentiemerkers overdragen naar micro-organismen die deze niet van natu-

re opnemen, indien dergelijke opname het gebruik van geneesmiddelen ter bestrijding van ziekte-verwekkers in gevaar brengt.

Risicogroepen (biologische riscioklassen)Met organismen van risicogroep 4, 3 en 2 wordt bedoeld organismen die respectievelijk ingedeeldzijn in de pathogeniteitsklassen 4, 3 en 2 als weergegeven in bijlage 5.51 van Vlarem II.


Activ

iteite

n wa

arbi

j ong

ekar

akte

risee

rd g

enet

isch

mat

eriaa

l is t

oege

voeg

d

eerste richting

twee

de r

icht

ing

Activ

iteite

n wa

arbi

j gek

arak

teris

eerd

gen

etisc

hm

ater

iaal i

s toe

gevo

egd

1.

Activ

iteite

n in

een

gas

thee

r/vec

torsy

steem

die

vold

oen

aan

de cr

iteria

voo

r ind

eling

inris

icokla

sse

1

2.

Activ

iteite

n in

een

gas

thee

r/vec

torsy

steem

dat

niet

vol

doet

aan

de

crite

ria v

oor i

ndeli

ng in

risico

klass

e 1

3.

Activ

iteite

n in

pat

hoge

ne g

asth

eren

, vira

lepa

thog

enen

uitg

ezon

derd

. De

gasth

eer i

s een

path

ogee

n va

n re

spec

tieve

lijk ri

sicog

roep

4, 3

, 2

a. De donor produceert een toxine van T3 L4 L4 Resp: L4, L4, L4:respectievelijk klasse T2 L3 L4 Resp : L4, L4, L4

T1 L2 L3 Resp: L4, L3, L3b. De donor is een voor eukaryote cellen Risicogroep 4 L3 L4 Resp: L4, L4, L4

infectieus virus van respectievelijk Risicogroep 3 L2 L3 Resp: L4, L3, L3Risicogroep 2 L1 L2 Resp: L4, L3, L2

c. De donor is een defect voor eukaryote Risicogroep 4 L2 L2 Resp: L4, L3, L3cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L1 L2 Resp: L4, L3. L2respectievelijk: Risicogroep 2 L1 L2 Resp: L4, L3, L2

d. De donor is een niet-viraal pathogeen Risicogroep 4 L3 L3 Resp: L4, L4, L4van respectievelijk Risicogroep 3 L2 L2 Resp: L4, L3, L3

Risicogroep 2 L1 L2 Resp: L4, L3, L2e. De donor is een organisme van risicogroep 1, L1 L2 Resp: L4, L3, L2

of een plant of een dier

f. De sequentie bevat genetische infor- T3 L4 L4 Resp: L4, L4, L4matie die codeert voor een toxine van T2 L3 L4 Resp: L4, L4, L4respectievelijk klasse T1 L2 L3 Resp: L4, L3, L3

g. De sequentie bevat genetische infor- Risicogroep 4 L3 L4 Resp: L4, L4, L4matie voor de vorming van een voor Risicogroep 3 L2 L3 Resp: L4, L3, L3eukaryotische cellen infectieus virus, Risicogroep 2 L1 L2 Resp: L4, L3, L2van respectievelijk:

h. De sequentie bevat genetische infor- Risicogroep 4 L2 L2 Resp: L4, L3, L3matie voor de vorming van een defect, Risicogroep 3 L1 L2 Resp: L4, L3, L2voor eukaryotische cellen infectieus Risicogroep 2 L1 L2 Resp: L4, L3, L2virus, van respectievelijk:

i. De sequentie bevat genetische informatie L1 of L2 L2 of L3 Resp: L4, L3, L2die codeert voor een schadelijk genproduct,anders dan in f1.

j. De sequentie bevat geen genetische informatie L1 L2 Resp: L4, L3, L2die codeert voor een schadelijk genproduct.

1 De vraag wat een schadelijk genproduct is, is een van de moeilijkste vragen voor de inschaling. Virulentiegenenkunnen een voorbeeld zijn van een schadelijk genproduct. De uiteindelijke indeling hangt af van het vermoede effect van het genproduct in het gebruikte gastheerorganisme.

A1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1en activiteiten met niet-virale pathogene gastheren


A2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en met baculovirussen

a. De donor produceert een toxine van T3 L1 L2 L3respectievelijk klasse T2 L1 L1 L2

T1 L1 L1 L2b. De donor is, of is afgeleid van, een voor Risicogroep 4 L4 L4 L4

eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L3 L3 L3respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 L2 L2 L2aanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan leidentot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes

c. De donor is, of is afgeleid van, een defect Risicogroep 4 L3 L2 L3voor eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L2 L2 L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 L1 L1 L2aanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan nietleiden tot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes

d. De donor is een niet-viraal pathogeen Risicogroep 4 L3 L2 L3van respectievelijk Risicogroep 3 L2 L2 L2

Risicogroep 2 L1 L1 L2e. De donor is een organisme van biologische L1 L1 L2

risicoklasse 1, of een plant of een dier

f. De sequentie bevat genetische informatie T3 L1 L2 L3die codeert voor een toxine van T2 L1 L1 L2respectievelijk klasse T1 L1 L1 L2

g. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 L4 L4 L4voor de vorming van een voor Risicogroep 3 L3 L3 L3eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 L2 L2 L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 enaanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan leidentot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes

h. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 L3 L2 L3voor de vorming van een defect, voor Risicogroep 3 L2 L2 L2eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 L1 L1 L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, enaanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes:

i. De sequentie bevat genetische informatie die codeert L1 L1 L2voor een schadelijk genproduct, anders dan in f.

j. De sequentie bevat geen genetische L1 L1 L2informatie die codeert voor eenschadelijk genproduct

4.Ac

tivite

iten

in

anim

ale ce

llen

waarb

ijge

en vi

rale v

ecto

rwo

rdt g

ebru

ikt

5.De

viral

e vec

tor i

s, of

is afg

eleid

van,

een

bacu

lo-vir

us da

t bio

logisc

h ing

eperk

tis

of da

t doo

r de

verva

ardigi

ng

ingep

erkt w

ordt

6.De

viral

e vec

tor i

s, of

is afg

eleid

van,

een

biolog

isch n

iet-

ingep

erkt b

aculo

virus

dat d

oor d

e ve

rvaard

iging

even

min

word

t ing

eperk

t

Activ

iteite

n w

aarb

ij ge

kara

kter

iseer

d ge

netis

ch m

ater

iaal

is t

oege

voeg

dAc

tivite

iten

waa

rbij

onge

kara

kter

iseer

d ge

netis

ch m

ater

iaal

is

toeg

evoe

gd

eerste richting

twee

de r

icht

ing


a. De donor produceert een toxine van T3 L2 Resp. L4, L4, L4 Resp. L3, L3, L3respectievelijk klasse T2 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2

T1 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2b. De donor is, of is afgeleid van, een voor Risicogroep 4 L4 Resp. L4, L4, L4 Resp. L4, L4, L4

eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2aanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan leidentot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes

c. De donor is, of is afgeleid van, een defect Risicogroep 4 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3voor eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1aanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan nietleiden tot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes

d. De donor is een niet-viraal pathogeen Risicogroep 4 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3van respectievelijk Risicogroep 3 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2

Risicogroep 2 L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1e. De donor is een organisme van biologische L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1

risicoklasse 1, of een plant of een dierf. De sequentie bevat genetische informatie T3 L2 Resp. L4, L4, L4 Resp. L3, L3, L3

die codeert voor een toxine van T2 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2respectievelijk klasse T1 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2

g. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 L4 Resp. L4, L4, L4 Resp. L4, L4, L4voor de vorming van een voor Risicogroep 3 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2 enaanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan leidentot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes

h. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3voor de vorming van een defect, voor Risicogroep 3 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, enaanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoomreplicerende virusdeeltjes:

i. De sequentie bevat genetische informatie L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2die codeert voor een schadelijkgenproduct, anders dan in f.

j. De sequentie bevat geen genetische L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1informatie die codeert voor eenschadelijk genproduct

7.De

vira

le ve

ctor

is e

en

com

plee

t of d

efec

t eco

troop

mui

zenr

etro

virus

8.De

vira

le ve

ctor

is e

en m

ens-

of

dier

path

ogee

n au

tono

omre

plice

rend

infe

ctieu

s viru

s van

re

spec

tieve

lijk ri

sicog

roep

4, 3

of 2

of e

en d

aarv

an a

fgele

idde

fect

viru

s en

de m

ogeli

jkheid

dat a

uton

oom

repl

icere

nde

virus

deelt

jes g

evor

md

word

enbe

staat

9.De

vira

le ve

ctor

is, o

f is

afge

leid

van,

een

sate

lliet-

virus

,of

is e

en d

efec

t viru

s afg

eleid

van

een

men

s- o

f dier

path

o-ge

en v

an re

spec

tieve

lijk ri

sico-

groe

p 4,

3 o

f 2 ;

de m

ogeli

jk-he

id d

at a

uton

oom

repl

icere

nde

virus

deelt

jes g

evor

md

word

enbe

staat

niet

Activ

iteite

n w

aarb

ij ge

kara

kter

iseer

dge

netis

ch m

ater

iaal

is t

oege

voeg

dAc

tivite

iten

waa

rbij

onge

kara

kter

iseer

d ge

netis

ch m

ater

iaal

is

toeg

evoe

gd

A3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren

eerste richting

twee

de r

icht

ing


a. De donor produceert een toxine van T3 L2 L3respectievelijk klasse T2 L1 L2

T1 L1 L2b. De donor is, of is afgeleid van, een voor Risicogroep 4 L4 L4

eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L3 L3respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 L2 L2aanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan leiden totde vorming van autonoom replicerendevirusdeeltjes

c. De donor is, of is afgeleid van, een defect Risicogroep 4 L1 L2voor eukaryote cellen infectieus virus van Risicogroep 3 L1 L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, en Risicogroep 2 L1 L2aanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan niet leidentot de vorming van autonoom replicerendevirusdeeltjes

d. De donor is een niet-viraal pathogeen van Risicogroep 4 L1 L2respectievelijk Risicogroep 3 L1 L2

Risicogroep 2 L1 L2e. De donor is een organisme van risicogroep 1, L1 L2

of een plant of een dier

f. De sequentie bevat genetische informatie die T3 L2 L3codeert voor een toxine van respectievelijk T2 L1 L2klasse T1 L1 L2

g. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 L4 L4voor de vorming van een voor eukaryotische Risicogroep 3 L3 L3cellen infectieus virus, van respectievelijk Risicogroep 2 L2 L2risicogroep 4, 3 of 2 en aanwezigheid vanhet genetisch materiaal van de donor in degastheer kan leiden tot de vorming vanautonoom replicerende virusdeeltjes

h. De sequentie bevat genetische informatie Risicogroep 4 L1 L2voor de vorming van een defect, voor Risicogroep 3 L1 L2eukaryotische cellen infectieus virus, van Risicogroep 2 L1 L2respectievelijk risicogroep 4, 3 of 2, enaanwezigheid van het genetisch materiaalvan de donor in de gastheer kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerendevirusdeeltjes:

i. De sequentie bevat genetische informatie L1 L2die codeert voor een schadelijk genproduct,anders dan in f.

j. De sequentie bevat geen genetische informatie L1 L2die codeert voor een schadelijk genproduct

10.

De v

irale

vec

tor i

s, of

isaf

gele

id v

an, e

en

plan

tenv

irus e

n is

biol

ogisc

h in

gepe

rkt.

11.

De v

irale

vec

tor i

s, of

is

afge

leid

van

, een

pl

ante

nviru

s en

is ni

et

biol

ogisc

h in

gepe

rkt

Activ

iteite

n wa

arbi

j gek

arak

teris

eerd

gen

etisc

hm

ater

iaal i

s toe

gevo

egd

Activ

iteite

n wa

arbi

j ong

ekar

akte

risee

rd g

enet

isch

mat

eriaa

l is t

oege

voeg

d

A4: Activiteiten in plantencellen

eerste richting

twee

de r

icht

ing


HST B. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN INSERRES MET PLANTEN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCHGEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN DRAGEN

Niveau G1:• De steriele of gesteriliseerde planten.• De strikt autogame planten (zelfbevruchters).• De planten die niet in staat zijn om in het ecosysteem te overleven (zoals banaan).• De planten die in het ecosysteem geen interfertiele soorten hebben (zoals banaan).• De planten die door een virus van biologische risicoklasse 2, door een genetisch gemodificeerd virus

van biologische risicoklasse 1 of 2 of door een virale vector van biologische risicoklasse 1 of 2 zijngeïnfecteerd, of die een viraal genoom van biologische risicoklasse 1 of 2 vertonen.

• De planten die drager zijn van een zichzelf niet verspreidend fytopathogeen van biologische risicoklas-se 1 of 2.

Niveau G2:• De allogame (kruisbevruchters) of autogame (zelfbevruchters), anemofiele (windbestuivers) of entomo-

fiele (insectenbestuivers) planten.• De planten waarvan de volledige ontwikkelingscyclus enkel kan plaatsvinden in het ecosysteem en

waarvan de zaden een lange overlevingsduur hebben (naargelang het geval en de verworven ervaring).• De planten die door een virus van biologische risicoklasse 3, door een virale vector van biologische risi-

coklasse 3 zijn geïnfecteerd of die een viraal genoom van biologische risicoklasse 3 vertonen.• De planten die drager zijn van een zichzelf verspreidend fytopathogeen of van een GGO van biologi-

sche risicoklasse 2 of van een fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 3.

Niveau G3:• De planten die gelijkaardige eigenschappen hebben als degene die beschreven zijn in niveau 2 en die,

hetzij een gevaarlijk vreemd gen (dat bijvoorbeeld voor een toxine codeert), hetzij een virus van biolo-gische risicoklasse 4, hetzij een viraal genoom van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen.

• De planten die onderworpen zijn aan eerste proeven van overdracht van genen, die afkomstig zijn vaneen voor de mens of het milieu gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet bekendzijn.

• De planten die drager zijn van een fytopathogeen of van een GGO van biologische risicoklasse 4.

Niveau G4:• De planten die een virus van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen, dat een bijzonder hoog

gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is) of een gen bevatdat verantwoordelijk is voor de synthese van voor de mens of het dier bijzonder gevaarlijke stoffen.

• De planten die drager zijn van een fytopathogeen of een GGO van biologische risicoklasse 4, dat eenbijzonder groot gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is).

• De planten die vreemde genen bevatten, afkomstig van een voor de mens, het dier of het milieu bij-zonder gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet bekend zijn.


HST C. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN INDIERVERBLIJVEN MET DIEREN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCHGEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN OF CELLEN DRAGEN

Niveau A1:• de zichzelf niet verspreidende dieren (varkens, schapen, runderen) die een vreemd DNA-fragment in

hun genoom hebben opgenomen zonder de hulp van een virale vector;• de zichzelf niet verspreidende dieren die drager zijn van GGO’s van risicoklasse 1.

Niveau A2:• de zichzelf verspreidende dieren (kleine knaagdieren, konijnen, insecten, vissen) die een vreemd DNA-

fragment hebben opgenomen, zonder de hulp van een virale vector;• de zichzelf verspreidende dieren die drager zijn van een GGO van risicoklasse 1 of 2.

OpmerkingenDe inschaling van activiteiten met dieren die genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGM’s) ofcellen dragen is gecompliceerder dan de inschaling van genetisch gemodificeerde micro-organismen opzich. Dit komt omdat bij activiteiten in dierverblijven niet alleen de risicoklasse van het GGM van belangis, ook de specifieke combinatie proefdier/micro-organisme, de wijze van toediening en de mogelijkeverspreiding van het micro-organismen naar het milieu spelen een zeer belangrijke rol. Bij werkzaamhe-den met GGM’s in een laboratorium wordt het micro-organisme altijd gehanteerd in een gesloten hou-der, en wanneer deze houder geopend wordt en de kans daarbij bestaat dat micro-organismen zich ver-spreiden (bijv. via aërosolen), gebeurt dit veelal in een veiligheidskabinet (klasse 2 en hoger). Het proef-dier kan niet gezien worden als een gesloten houder. Dit betekent dat voor elke combinatieproefdier/micro-organisme zorgvuldig bepaald moet worden of eventueel bijzondere maatregelen nodigzijn om verspreiding van het micro-organisme tegen te gaan. Deze bijzondere maatregelen zijn in debeschrijving van de inperkingsniveaus A1 t/m A4 aangeduid met “aanbevolen” of “optioneel”.

Een voorbeeld: een genetisch gemodificeerd adenovirus van risicoklasse 2 moet in een laboratoriumonder standaard L2-condities worden gehanteerd. Wanneer dit virus in de longen van een muis wordttoegediend in de vorm van een aërosol, zijn standaard A2 condities niet voldoende om verspreiding vanhet virus tegen te gaan. Er zal een veiligheidskabinet aanwezig moeten zijn voor de toediening van hetvirus, de muizen moeten gehuisvest worden in speciale filtertopkooien, en al het afval (faeces, urine,bedding, etc.) moet geïnactiveerd worden. Wanneer het niet om een muis zou gaan, maar om een var-ken, zijn weer andere maatregelen nodig omdat een varken niet in een filtertopkooi gehuisvest kan wor-den. Het verblijf in zijn geheel moet dan de benodigde inperking geven. Dit betekent dat er een sas zalmoeten zijn, onderdruk, de ruimte zal moeten geschikt zijn om te kunnen worden gefumigeerd, mede-werkers zullen speciale beschermende kleding moeten dragen die na de werkzaamheden in de sas ach-terblijft en er zullen speciale voorzieningen moeten getroffen worden voor de inactivatie van faeces enurine (gesloten opvangsysteem gekoppeld aan een installatie voor inactivatie).


M D M D3 3 Bacillus anthracis 3 3 Mycobacterium tuberculosis

OP OP Bacillus cereus 2 Neisseira gonorrhoeae2 Bacillus lentimorbus 2 Neisseira meningitidis2 Bacillus popiliae 2 2 Neisseira spp.2 Bacillus sphaericus 2 Pseudomonas aeruginosa2 Bacillus thuringiensis 2 3 Salmonella Abortusequi2 Bordetella avium 2 3 Salmonella Abortusovis

2 3 Bordetella bronchiseptica 2 2 Salmonella choleraesuis (enterica)2 Bordetella parapertussis subsp. arizonae2 Bordetella pertussis 2 3 Salmonella Dublin2 2 Campylobacter coli 2 2 Salmonella Enteritidis2 2 Campylobacter fetus subsp. fetus 2 3 Salmonella Gallinarum

3 Campylobacter fetus subsp. venerealis 2 Salmonella Paratyphi A,B,C2 2 Campylobacter jejuni 2 3 Salmonella Pullorum2 2 Campylobacter spp. 3 (*) Salmonella Typhi2 Chlamydia pneumoniae 2 2 Salmonella Typhimurium2 2 Clostridium botulinum 2 Shigella boydii2 2 Clostridium tetani 3 (*) Shigella dysenteriae (Type I)2 Enterobacter spp. 2 Shigella flexneri 2 Enterococcus faecalis 2 Shigella sonnei2 2 Escherichia coli (uitgezonderd niet pathogene stammen) 2 2 Staphylococcus aureus

2 Helicobacter hepaticus 2 Staphylococcus epidermidis2 Helicobacter pylori 2 2 Streptobacillus moniliformis2 Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes) 2 2 Streptococcus agalactiae2 Klebsiella oxytoca 2 Streptococcus dysgalactiae2 2 Klebsiella pneumoniae 3 Streptococcus equi2 2 Klebsiella spp. 2 Streptococcus pneumoniae2 2 Listeria ivanovii 2 Streptococcus pyogenes2 2 Listeria monocytogenes 2 2 Streptococcus spp.2 3 Mycobacterium avium 2 2 Streptococcus suis

subsp.paratuberculosis 2 Streptococcus uberis3 3 Mycobacterium bovis (behalve de stam BCG) 2 Vibrio cholerae (El Tor inbegrepen)3 Mycobacterium leprae 3 3 Yersinia pestis

Mens en dierpathogenen: bacteriën en aanverwanten

BIJLAGE 3: DE BIOLOGISCHERISICOKLASSE VAN ENKELERELEVANTE PATHOGENEN

In deze bijlage zijn de biologische risicoklassen weergegeven van enkele relevante pathogenen. Deze lijstis een verkorte versie van de bijlage 5.51.8 van Vlarem II. Enkel de meest relevant geachte pathogenenzijn op deze lijst weergegeven. Wordt er gewerkt met een ander pathogeen dat niet op deze lijst voor-komt, dan kunnen de lijsten van Vlarem geraadpleegd worden. Komt het pathogeen ook daar niet opvoor, dan dient u contact op te nemen met de interne of externe deskundigen (zie bijlage 4), of met deSectie Bioveiligheid en Biotechnologie van het WIV (http://www.biosafety.be).

M = biologische risicoklasse voor mensenD = biologische risicoklasse voor dierenP = biologische risicoklasse voor plantenOP = opportunistisch pathogeen(*) = vertonen een beperkt infectierisico, omdat ze niet overdraagbaar zijn via de lucht+ = virus waarvan het biologisch risico afhangt van het gastheer-dier

LET OP!: dit is een verkorte lijst. De volledige lijst is terug te vinden in Vlarem, rubriek 51, en op www.biosafety.be

De biologische risicoklasse van enkele relevante pathogenen 65

M DAdenoviridae

2 Animal adenoviruses2 Human adenoviruses

4 African swine fever virusArenaviridae

3 Flexal virus4 + Junin virus4 + Lassa virus4 + Machupo virus

3 Equine arteritis3 Simian haemorrhagic fever virus

Astroviridae2 2 Astroviruses

Baculoviridae2 Invertebrate baculoviruses

Birnaviridae2 Drosophila X virus3 Infectious pancreatic necrosis virus

Bunyaviridae3 2 California encephalitis virus3 Hantaan virus (Korean haemorrhagic

fever)Filoviridae

4 4 Ebola virus4 4 Marburg virus

Flaviviridae3 Dengue virus 1-43 + Japanese encephalitis virus3 + Yellow fever virus3 Hepatitis C virus

3 Border disease virus3 Bovine diarrhoea virus4 Hog cholera virus

Herpesviridae3 Avian herpesvirus 1 (ILT)3 Marek’s disease3 Bovine herpesvirus 12 Bovine herpesvirus 22 Bovine herpesvirus 32 Bovine herpesvirus 42 Chimpanzee herpesvirus

(pongine herpesvirus 1)2 Cytomegalovirus

(Human herpesvirus 5)2 Cytomegaloviruses of mouse,

guinea pig and rat2 Epstein-Bar virus

(EBV, Human herpesvirus 4)3 2 Herpes virus B

Orthomyxoviridae2 3 Avian influenza virus A-Fowl plague2 2 Equine influenza virus 1 (H7N7)

and 2 (H3N8)2 3 Influenza viruses (Types A, B & C)

Papovaviridae2 Animal papillomaviruses

2 Human papillomaviruses (HPV)2 Bovine polyomavirus (BPoV)2 Monkey (SV40, SA-12, STMV, LPV)

Paramyxoviridae2 Measles virus2 Mumps virus

M D2 2 Parainfluenza viruses types 1-4

Parvoviridae2 Adeno-associated viruses AAV2 Canine parvovirus (CPV)

2 Human parvovirus (B 19)Picornaviridae

2 Coxsackieviruses2 Polioviruses2 3 Swine vesicular disease virus

2 Bovine rhinoviruses (types 1-3)2 Human rhinoviruses

Poxviridae2 Entomopoxviruses3 Fowlpox virus2 Other avipoxviruses3 Camelpox virus

2 2 Cowpox virus2 3 Horsepox virus3 3 Monkeypox virus2 3 Rabbitpox virus-variant of vaccinia2 2 Vaccinia virus4 Variola (major & minor)virus4 + White pox (Variola virus)

2 Swinepox virusReoviridae

2 2 (ortho)reoviruses2 2 Human rotaviruses

2 Mouse rotaviruses (EDIM, epizootic diarrhoea of infant mice)

2 2 Rat rotavirusRetroviridae

3 Avian leucosis viruses (ALV)3 Avian sarcoma viruses (Rous

sarcoma virus, RSV)2 Bovine foamy virus3 Bovine immunodeficiency virus (BIV)2 Equine infectious anemia virus3 Feline immunodeficiency virus (FIV)3 Feline sarcoma virus (FeSV)

3 Human immunodeficiency viruses (HIV) types 1 & 2

3 Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) types 1 & 2

3 Leukomogenic murine oncovirus (Murine lymphosarcoma virus:MuLV)

3 Lymphosarcoma viruses of nonhuman primates

3 Monkey mammary tumor viruses (MPTV)

3 Murine mammary tumor viruses (MMTV)

3 Murine sarcoma viruses (MuSV)3 Porcine sarcoma virus3 Rat lymphosarcoma virus

(Rat LSA)2 Reticuloendotheliosis viruses

(REV)2 Simian foamy virus3 Simian immunodeficiency viruses

(SIV)3 Simian sarcoma viruses (SSV)

Mens en dierpathogene virussen


M DRhabdoviridae

3 3 Rabies virus2 3 Vesicular stomatitis virus (VSV)

Togaviridae2 + Semliki Forest virus2 2 Sindbis virus2 Rubella virus

Not classified3 Blood-borne hepatitis viruses not

identified yet3 Borna diseases virus

M DUnrelated agents connected with

3 Bovine spongiform encephalopathy (BSE)

3 Chronic wasting disease of deer3 Creutzfeldt–Jakob disease3 Gerstmann-Sträussler-Scheinker

syndrome3 Kuru

3 Mink encephalopathy3 Scrapie

M D M D2 2 Aspergillus flavus 2 2 Cryptococcus neoformans2 2 Aspergillus fumigatus 2 Fusarium coccophilum

OP OP Aspergillus nidulans 3 2 Penicillium marneffei2 Aspergillus parasiticus OP OP Pneumocystis carinii

OP OP Aspergillus terreus OP 2 Rhizomucor pusillusOP OP Aspergillus versicolor 2 Rhizopus cohnii2 2 Candida albicans 2 Rhizopus microspous

Mens en dierpathogene schimmels

M D M D3 Eimeria acervulina 3 Theileria hirei3 Eimeria burnetti 2 Theileria mutans3 Eimeria maxima 2 Theileria ovis3 Eimeria necratix 3 Theileria parva3 Eimeria spp. 2 Theileria taurotragi

3 3 Leishmania brasiliensis 2 3 Toxoplasma gondii3 3 Leishmania donovani 3 Trichomonas foetus2 Leishmania ethiopica 2 Trichomonas vaginalis3 Leishmania major 3 Trypanosoma brucei brucei2 3 Leishmania mexicana 3 Trypanosoma brucei gambiense2 Leishmania peruviana 3 3 Trypanosoma brucei rhodesiense2 Leishmania spp. 3 Trypanosoma congolense3 3 Leishmania tropica 3 Trypanosoma cruzi3 Plasmodium falciparum 3 Trypanosoma equiperdum2 Plasmodium spp. (bij mensen en apen) 3 Trypanosoma evansi2 Pneumocystis carinii 2 Trypanosoma vivax

3 Theileria annulata

Mens en dierpathogene parasieten

FytopathogenenN.B.: Hieronder is de pathogeniteit van enkele fytopathogenen aangeduid. Sommige fytopathogenenzijn bovendien onderworpen aan bepalingen van de federale besluiten voor de bestrijding van voor plan-ten of plantaardige producten schadelijke organismen (quarantaineregels).


De biologische risicoklasse van enkele relevante pathogenen 67

P P2 Alfalfa mosaic virus 2 Potato virus M2 Apple chlorotic leaf spot virus 2 Potato virus S2 Apple mosaic virus 2 Potato virus X2 Apple stem grooving virus 2 Potato virus Y2 Barley yellow mosaic virus 2 Tobacco mosaic virus2 Beet western yellows virus 2 Tobacco necrosis virus2 Carnation ringspot virus 2 Tobacco rattle virus2 Cucumber mosaic virus 3 Tobacco streak virus3 Hop american latent virus 2 Tobacco stunt virus2 Hop mosaic virus 3 Tomato bushy stunt virus3 Lettuce mosaic virus 2 Tomato mosaic virus2 Maize dwarf mosaic virus 3 Tomato yellow leaf curf virus2 Melon necrotic spot virus 2 Tulip breaking virus2 Papaya ringspot virus 2 Turnip crinkle virus2 Pea early-browning virus 2 Turnip mosaic virus2 Potato leafroll virus 3 Wheat dwarf virus2 Potato virus A 3 Wheat spindle steak mosaic virus

Fytopathogene virussen

P P2 Agrobacterium rhizogenes 3 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola2 Agrobacterium rubi 3 Pseudomonas syringae pv. pisi2 Agrobacterium tumefaciens 2 Pseudomonas syringae subsp. syringae2 Erwinia carotovora subsp. betavasculorum 2 Rhodococcus fascians2 Erwinia chrysanthemi pv. chrysanthemi 3 Xanthomonas campestris pv. aberrans3 Erwinia salicis 2 Xanthomonas campestris pv. alfalfae3 Erwinia tracheiphila 3 Xanthomonas populi2 Pseudomonas cichorii2 Pseudomonas fluorescens

Fytopathogene bacteriën en aanverwanten

P P2 Alternaria dauci 3 Mucor circinelloides3 Alternaria solani 3 Mucor piriformis2 Botrytis allii 3 Mucor racemosus2 Botrytis elliptica 3 Mucor strictus3 Botrytis fabae 2 Penicillium corymbiferum2 Botrytis hyacynthi 2 Penicillium cyclopium2 Botrytis tulipae 2 Penicillium digitatum2 Cladosporium phlei 2 Penicillium expansum2 Cladosporium variabile 2 Penicillium italicum3 Claviceps gigantea 2 Phytophthora infestans2 Claviceps purpurea 2 Phytophthora megasperma2 Fusarium arthrosporioides 2 Rhizoctonia carotae3 Fusarium coeruleum 2 Rhizoctonia fragariae2 Fusarium culmorum 2 Rhizoctonia tuliparum2 Fusarium graminum 2 Rhizopus arrhizus2 Fusarium oxysporum f. sp. betae 2 Rhizopus stolonifer3 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici 2 Sclerophthora macrospora2 Fusarium oxysporum f. sp. pisi 2 Sclerospora graminicola3 Fusarium oxysporum f. sp. trifolii 2 Sclerotinia minor3 Fusarium solani f. sp. cucurbitae 2 Sclerotinia trifoliorum3 Fusarium solani f. sp. phaseoli 3 Septoria apiicola3 Fusarium solani f. sp. pisi 2 Septoria azaleae2 Glomerella cingulata 3 Septoria chrysanthemella

(anamorph Colletotrichum gloeosporioides) 2 Septoria lactucae2 Glomerella graminicola 3 Septoria lycopersici var. lycopersici

(anamorph Colletotrichum graminicola)2 Glomerella tucamanensis

(anamorph Colletotrichum falcatum)

Fytopathogene schimmels


P3 Heterodera glycines

Fytopathogene parasieten

Leescommissie68

BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIEHierbij betuigen wij onze dank aan onderstaande personen die bij de totstandkoming van eerdereversies van dit boekje nuttige commentaren hebben geleverd.

Ann Van Gysel, communicatiemanager VIBBernadette Van Vaerenbergh, WIV, Sectie Bioveiligheid en BiotechnologieGreet Van Eetvelde, milieucoördinator, Universiteit GentHuub Schellekens, Klankbordcommissie VIB, Universiteit UtrechtKim De Rijck, Mieke Van Lijsebettens, VIB departement Planten Systeembiologie, Universiteit GentHilde Revets, VIB departement Moleculaire en Cellulaire InteractiesPeter Brouckaert, VIB departement voor Moleculair Biomedisch Onderzoek, Universiteit GentThierry Vandendriessche, VIB departement Transgene Technologie en Gentherapie, KULeuvenWim Van de Ven, VIB departement Menselijke Erfelijkheid, KULeuvenHubert Backhovens, VIB departement Moleculaire Genetica, UA

Informatieblad 69

BIJLAGE 5: INFORMATIEBLADNamen en coördinaten van verantwoordelijken

Deze lijst dient als overzicht van de voor uw afdeling geldende contactpersonen inzake (bio)veiligheid.Contactpersonen verschillen vaak per afdeling. Vul de onderstaande gegevens zelf in en zorg dat u ze inhet labo bij de hand heeft.

Naam Telefoon Overige

Noodnummer

Laboratorium- verantwoordelijke

EHBO- verantwoordelijke

Locatie EHBOverzorgingskast

Coördinator bioveiligheid

Contactpersoon Preventiedienst

Arbeidsgeneesheer

Contactpersoonafval

RegulatoryAffairs Manager VIB René Custers 09 244 66 11 [email protected]

Als u algemene vragen heeft over inschalingen of te nemen maatregelen, raadpleeg dan eerst uw hië-rarchische overste, en indien dit geen uitsluitsel geeft achtereenvolgens uw groepsleider, interne biovei-ligheidsexpert of externe bioveiligheidsexpert.

BIJLAGE 6: ZELFTOETS


Vraag 1: Wat is de definitie van een genetisch gemodificeerd organisme?

Vraag 2: Hoeveel biologische risicoklassen bestaan er voor de indeling vanziekteverwekkende organismen?

Vraag 3: Noem drie gevaren die verbonden kunnen zijn met levende en/of gemodificeerdeorganismen.

Vraag 4: Tot welke risicogroep (of biologische risicoklasse) behoort wild type E.coli?

Vraag 5: Tot welke risicogroep (of biologische risicoklasse) behoren E.coli K12 stammen?

Vraag 6: Beschrijf de verschillende stappen van de risicoanalyse voor GGO’s

Vraag 7: Wat is een aerosol?

Vraag 8: Op welke wijze kan de combinatie van een geïmmortaliseerde cellijn met een viralevector aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van genetisch gemodificeerd materiaal?

Vraag 9: Noem vier belangrijke fysieke inperkingsmaatregelen.

Vraag 10: Juist of niet juist: risicoklasse 1 GGO’s mogen na het experiment gewoon viade wasbak geloosd worden.

Vraag 11: Welke van de volgende ontsmettingsmiddelen werkt niet tegen sporen? (1) chloor, (2) formaldehyde, of (3) ethanol.

Vraag 12: Juist of niet juist: besmette materialen die worden hergebruikt hoeven alleengewassen te worden. Ze hoeven niet te worden ontsmet.

Vraag 13: Wat moet je doen als je genetisch gemodificeerde bacteria op een laboratoriumtafelhebt gemorst?

Vraag 14: Noem vijf belangrijke werkvoorschriften voor het werken in een veiligheidskabinetvan klasse II.

Zelftoets 71

Vraag 1: Een genetisch gewijzigd organisme is een organisme waarvan het genetisch materiaal is gewijzigdop een wijze die niet mogelijk is door middel van voortplanting of natuurlijke recombinatie.

Vraag 2: Er zijn vier biologische risicoklassen (1 tot 4). Klasse 1 organismen kunnen geen ziekten veroorza-ken, klasse 2, 3 en 4 organismen wel.

Vraag 3: Onder andere: ziekteverwekkendheid, giftigheid, of verstoring van ecologische evenwichten.

Vraag 4: Wild type E.coli behoort tot risicogroep 2 en kan dus ziekte veroorzaken.

Vraag 5: E.coli K12 stammen zijn geattenueerd (kreupel gemaakt) en zijn niet langer in staat ziekte te ver-oorzaken. Daarom behoren ze tot risicogroep 1.

Vraag 6: (1) Lijst alle potentiele gevaren op verbonden aan de gastheer, insert en vector. (2) Hiermee bepaalje een eerste idée van de risicoklasse (3) Identificeer vanuit deze risicoklasse de benodige inper-kingsmaatregelen, rekening houdend met het omringende milieu, het type en de schaal van de acti-viteit, en eventuele niet-standaard handelingen. (4) Bepaal de definitieve risicoklasse.

Vraag 7: Een aerosol bestaat uit zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht verspreiden. De druppel-tjes kunnen levensvatbare micro-organismen bevatten en op die manier zorgdragen voor de ver-spreiding van deze organismen naar de omgeving.

Vraag 8: Een geïmmortaliseerde cellijn kan soms virussequenties bevatten (bv HELA cellen bevatten de E6E7genen van HPV) die tesamen met de virussequenties aanwezig in de vector aanleiding kan geventot de vorming van infectieuze viruspartikels.

Vraag 9: voorbeelden zijn: gesloten ramen en deuren, goed ontsmetbare werktafels, een veiligheidskabinetvan klasse II, onderdruk, een sas, HEPA gefilterde luchtafvoer, etc.

Vraag 10: Niet juist, ook risicoklasse I GGO’s moeten geïnactiveerd worden. Er zijn slechts enkele uitzonde-ringen mogelijk waarvoor je de expliciete toelating nodig hebt van de bevoegde overheid.

Vraag 11: Ethanol werkt niet tegen bacteriële sporen. Dus als je bijv met Lactococcen werkt moet je een anderontsmettingsmiddel gebruiken.

Vraag 12: Niet juist: Potentieel besmette materialen moeten eerst ontsmet worden (dmv sterilisatie of eenandere gevalideerde methode) voordat ze worden gewassen.

Vraag 13: De gemorste bacteriën moeten met tissues worden verwijderd die vervolgens in het biologischbesmet afval worden gegooid. De werktafel moet vervolgens grondig worden ontsmet met tissuesdie gedrenkt zijn in een ontsmettingsmiddel, bijvoorbeeld ethanol.

Vraag 14: Belangrijke werkvoorschriften zijn:(1) Sluit de deur van het L2 laboratorium (2) laat het veiligheids-kabinet 10 minuten draaien alvorens te beginnen (3) ontsmet het werkblad en de luchtafzuigroostersvan het kabinet alvorens te beginnen (4) zet alleen strikt noodzakelijke materialen in het kabinet, (5)zet geen materialen op de luchtafzuigroosters, (6) werk diep genoeg in het kabinet, (7) beweeg rustigom de luchtstroom zo min mogelijk te verstoren, (8) ontsmet het werkblad en de luchtroosters na hetexperiment (9) laat het kabinet nog 5 minuten draaien na het experiment, (10) vul het logboek vanhet kabinet in (naam, datum, gebruikt biologisch materiaal, teken af dat je het kabinet ontsmet hebt)

ANTWOORDEN

Bioveiligheid in het laboratorium (pdf - 1MB)

Documents

Transcript of Bioveiligheid in het laboratorium (pdf - 1MB)