“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(as) de Glu en maíz” · Purificación de...

“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(as) de Glu

en maíz”

Trabajo de la estudiante de Doctorado en Ciencias Bioquímicas:

Giovanna Paulina Aguilera Alvarado

Tutora: Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Objetivos

1. Definir organismo modelo

2. Identificar a la Glu como molécula señal

3. Proteínas que perciben la señal por glucosa

4. Identificar la pregunta de investigación

5. Caracterizar a las HXKs de maíz

5.a. Caracterizar cinéticamente a las HXKs de maíz

5.b. Identificar a la HXK sensora de Glu en maíz.

Para iniciar una investigación, hay que escoger un modelo de estudio…

ORGANISMOS MODELO. Se asume que a través del estudio detallado de un organismo en particular, se puede obtener información suficiente que nos ayudará a entender como funcionan otros organismos. • Ser de tamaño pequeño y

fáciles de mantener en el laboratorio.

• Poseer un genoma pequeño.

• Tener un ciclo de vida relativamente corto.

doi:10.1038/nplants.2015.67, Nat Plants (2015).

Escherichia coli

Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditis elegans

Arabidopsis thaliana

Nos proporcionan

• Oxígeno

• Agua

• Alimento

• Productos para la salud, vestido y usos varios de las maderas

Las plantas no solo son bellas

Las plantas son un mosaico de tejidos autotrófos y heterótrofos

FOTOSINTÉTICO

Hojas maduras

Sistema circulatorio y vascular

HUMANOS PLANTAS

Arterias O2 del corazón a los órganos Venas CO2 de los órganos al corazón

Xilema mueve agua y minerales de la raíz hacia arriba Floema mueve azúcares, aminoácidos en todas direcciones

Raíces

El carbono fijado se distribuye en la planta

CH3COOH + NaH[14-C]CO3 CH3COONa + [14-C]CO2 + H2O

Técnica: Toma de carbono marcado radiactivamente en el C y determinación de la distribución de la marca en toda la planta

El carbono fijado se distribuye en la planta

[14-C]CO2

La marca se distribuyo en las hojas en donde se administró la marca y en los tallos, flores y raíces. PERO NO en las hojas fuente ya que estas sintetizan su propio carbono

El exceso de sacarosa se reparte desde los tejidos fotosintéticos hacia los tejidos no fotosintéticos para usarlos en su metabolismo,

almacenarlos o exudarlos

1M

Wang et al., 2013, Front. Plant Sci.,doi: 10.3389/fpls.2013.00201

Técnica: Áfidos para tomar la muestra y análisis por cromatografía para determinar la composición del floema

¿Qué hay en el floema y en que concentración se encuentran?

La abundancia de azúcares es percibida en la planta y dependiendo de está se modifica su

fisiología

CASO GLUCOSA

Price et al., Plant Cell (1994).

Glucosa el carbohidrato más

estudiado en cuanto a la señalización en plantas.

1. Fuente de Carbono y Energía

2. Señal que afecta la expresión de genes

Técnica: Análisis del RNA (RNAseq) para determinar la expresión de genes

¿Cómo se obtiene una mutante de A. thaliana? MUTAGÉNESIS AL AZAR

Etil metano sulfonato (EMS): Muy mutagénico y poco letal; alquila las bases de G provocando desapareamiento. Por otro lado, la G alquilada puede aparearse con las T provocando una transición G/C a A/T.

Maple & Moller, Methods Mol Biol (2007); http://file.scirp.org/Html/8-3000817_48085.htm

Crecimiento en presencia de Glucosa

HEXOCINASA (EC 2.7.1.1).

HXK

ATP(Mg2+) D-Hexosa ADP(Mg2+)

D-Hexosa 6-P

Primera enzima de la glucólisis

La Hexocinasa es una proteína “moonligthing”

1. Una PROTEÍNA MOONLIGHTHING es aquella que es capaz de llevar a cabo más de una función, también se le puede llamar MULTIFUNCIONAL.

2. Muchas de estas proteínas son enzimas, receptores, canales iónicos o chaperonas.

3. A través de la evolución estas enzimas adquirieron funciones no enzimáticas secundarias por ejemplo, la transducción de señales, la regulación transcripcional, de la apoptosis y estructural.

http://www.moonlightingproteins.org/results.php?search_text=hexokinase&searching=yes&search=search

La función de la hexocinasa impacta en el metabolismo y también en la señalización

Hexocinasa

G-6P

Metabolismo

Glucólisis

Vía Pentosas

Síntesis de nucleótidos

Biosíntesis de lípidos

Biosíntesis de almidón

Vía de señalización glucolítica

Inducción:

PR1 y PR5; Transportadores nitrato; factores

transcripcionales FTZ

Cambio conformacional independiente de catálisis

Vía de señalización dependiente de HXK

Represión:

1. GENES FOTOSINTÉTICOS

2. Ciclo del glioxilato

3. Algunos transportadores

Inducción:

Factores transcripcionales MYB34, MYB51, MYB122; De respuesta a ABA RAB18

HXKs contribute to regulate the plant development

Aguilera-Alvarado P

promoting germination preventing seedling supporting vegetative growth floriation and restoring transducing senescence

establishment at high male fertility signals

Glc concentration

SE NECESITA MAYOR INVESTIGACIÓN DEL PAPEL FISIOLÓGICO DE CADA HXK PARA: 1. AVANZAR EN EL ENTENDIMIENTO DE LOS MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN EN PLANTAS Y 2. RELEVANTE PARA UNA APLICACIÓN PRÁCTICA EN ESPECIES AGRONÓMICAMENTE IMPORTANTES COMO EL MAÍZ.

¿CUÁNTAS HXKS HAY EN MAÍZ? ¿CUÁL ES LA FUNCIÓN DE LAS HXK EN EL MAÍZ? ¿HAY HXKS SENSORAS EN MAÍZ?

Técnicas: 1. Búsqueda bibliográfica Artículos Karve et al., 2010 Zhang et al., 2014 Galina et al., 1995 2. Determinación de actividad de HXK Método en el que se acopla la hidrólisis de ATP a la producción de NADH

¿Cuántas HXKs hay en maíz?

Paulina Aguilera Alvarado

¿Cuántas HXKs hay en maíz?

Técnica: 1. Obtención de

extractos subcelulares de diferentes tejidos

2. Determinación de actividad en geles nativos

Hay varias HXKs en maíz, algunas en la fracción citosólica y otras en la fracción mitocondrial

Los embriones maduros de maíz son los que más formas o isoformas de HXK tienen

Pero las bandas producidas a que gen corresponden?

El embrión de maíz es el tejido que da lugar a una nueva planta y es el que tiene MÁS HXKs

SEMILLA EMBRIÓN

¿Cuáles HXK se expresan en el

embrión de maíz?

Técnica: Determinación de la expresión de las HXKs Mediante PCR tiempo real a. Se diseñaron oligonucleótidos

para amplificar una sección pequeña del gene

b. Se evaluó que solo dieran un producto de PCR

c. Se determinó que produjeran una curva de a mayor concentración de DNA más amplificación

Cytosol Mitochondrial

Caracterización funcional (catalíticas y sensoras) de las HXKs de maíz

1. ¿los genes que se propone (putativos) codifican para HXKs de acuerdo al análisis in silico codifican para HXKs

catalíticas?

Paulina Aguilera Alvarado

Predicción in silico. 1. El experimento o predicción in silico se hace con el análisis mediante

un programa de computo que puede buscar de manera específica: condiciones experimentales, comparar secuencias, hacer predicciones como de: localización subcelular, plegamiento de proteínas, unión de sustratos, entre otros.

2. Aunque también en la experimentación in silico se pueden realizar simulaciones.

Análisis filogenético de 112 secuencias. Sc: Saccharomyces cerevisiae; Mp: Marchantia polymorpha; Pp: Physcomitrella patens; Sm: Selaginella moellendorffii; Hv: Hordeum vulgare; Os: Oryza sativa ssp japonica; Sb: Sorghum bicolor; Zm: Zea mays; Ta: Triticum aestivum; At: Arabidopsis thaliana; Vv: Vitis vinifera; Sl: Solanum lycopersicum; St: Solanum tuberosum; Mt: Medicago truncatula; Nt: Nicotiana tabacum.

Del análisis filogenético: 1. Hay 9 HXK 2. Se encuentran en cuatro grupos: a) Citosol (ZmHXK7 y ZmHXK8) b) Mitocondrial (ZmHXK4, ZmHXK5, ZmHXK6) c) Mitocondrial (ZmHXK9) d) HXK-Like (HKL), (ZmHXK3a, ZmHXK3b, ZmHXK10)

Análisis de la secuencia de aminoácidos para identificar las diferencias entre cada una de las HXKs de maíz, comparando con aquellas que ya se conoce su función

ZmHXK3a, ZmHXK3b y ZmHXK10 Son más similares a las HXKs-like

¿LOS GENES QUE CODIFICAN PARA LAS HXKS QUE SE PREDICEN TIENEN ACTIVIDAD, TIENEN REALMENTE ACTIVIDAD DE HEXOCINASA?

Clonar los genes

Producir proteína recombinante

Determinar la actividad de HXK

El embrión de maíz es el tejido que da lugar a una nueva planta y es el que tiene MÁS HXKs

SEMILLA EMBRIÓN

SELECCIÓN DEL TEJIDO PARA CLONAR A LAS HXKs

CLONACIÓN MOLECULAR. La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante son producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas.

https://www.neb.com/~/media/NebUs/Files/Brochures/Cloning_Tech_Guide.pdf http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

Embrión de maíz

Se necesitaba un molde…

24h

RNA

Transcripción reversa

cDNA

TRIzol

5’UTR ORF 3’UTR

Mucha similitud entre HXKs

Diseño de primers

¡PCR!

Adenilación y ligación

Miles copias del cDNA de las

HXKs de maíz

Transformación y secuenciación HXKs

aisladas

Técnica Clonación mediante tecnología Gateway. Esta tecnología usa el sistema de recombinación del fago lamba para facilitar la transferencia de secuencias de DNA heterólogo (flanqueado por los sitios att) entre diferentes vectores. Se basa en dos reacciones de recombinación.

Para obtener la proteína hay que colocar el gen en un vector apropiado a la célula que va a producir la proteína POR EJEMPLO: Vectores de expresión para producción de proteína recombinante en: 1. E. coli (His y V5) 2. Levadura (sin tag) 3. Planta (GFP)

INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pET-DEST42 Gateway: V5, 6X His).

Inducción con IPTG

RNA pol E. coli

lacI

lacI

RNA pol T7 RNA pol T7

lacI

lacI

RNA pol T7

Gen de interés

Inducción con IPTG

pEXP42

Genoma de E. coli BL21 (DE3)

ptRNAR

ptRNAI

ptRNAL

Técnica Probar diferentes condiciones: o Temperatura o Tiempo de inducción o [IPTG] o Cepa o Tag

Purificación de proteínas con etiqueta de histidinas

Resina unida a Níquel Proteína con

etiqueta de Histidinas

NOTA: Cada proteína producida en E. coli Tenía dos tags o etiquetas: a) 6 histidinas b) Y la secuencia V5

Maize recombinant HXKs were produced in E. coli

Western Blot Anti-V5

ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6

ZmHXK7 ZmHXK8

Técnica: 1. Inducción de

proteínas con la adición de IPTG

2. Purificación de la HXK-His recombinante

3. Corrimiento electroforético en gel de poliacrilamida-SDS

4. Western-Blot usando como anticuerpo el antiV-5

Insoluble and non-active enzymes

AtHXK1 AtHXK2 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9

MEM*

Citosol

*Membrana Externa Mitocondrial Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho

et al., Plant Physiol (2009)

ZmHXK4, 5, 6 and 9 have an hydrophobic sequence at the N-terminal

Análisis in silico

Production and isolation of the truncated versions of recombinant maize HXKs.

ZmHXK430 ZmHXK530

ZmHXK630 ZmHXK930

Western blot using the anti-V5

antibody

PAGE-SDS of His tagged recombinant protein purification

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

y = 0.1435x + 0.2075 R² = 0.9998

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 1 2 3

Ab

s 34

0nm

Tiempo (min)

Curva temporal de actividad de HXK

Se detectó la actividad por la formación de un producto y la REACCIÓN ACOPLADA a ella permitió su detección

Fig. 1. Saturation curves for HXK

activity using glucose as substrate.

HXK activity of maize isoenzymes was

measured for the recombinant versions.

A) ZmHXK4Δ30, B) ZmHXK5Δ30,

C) ZmHXK6Δ30, D) ZmHXK7,

E) ZmHXK8 and F) ZmHXK9Δ30.

The reaction medium contained 2.5 µg of

purified recombinant protein, a fixed

concentration of ATP (2 mM) and Glc

concentration varied from 0.01 to 100 mM. The

data was adjusted to Michaelis-Menten

equation. The graphics were obtained with the

Origin 8.0 software.

Figure S5. Saturation curves of

HXK activity of ZmHXKΔ4-Δ6

and ZmHXKΔ9 for Fru, Man and ATP. The effect of Fru (A, D, G, J) and

Man (B, E, H, K) in the

hexokinase activity was

determined in an assay medium

containing 2 mM ATP. To

determining the Km for ATP (C,

F, I, L) 5 mM glucose was

included in the reaction medium.

A, B, C) ZmHXKΔ4 activity; D, E,

F) ZmHXKΔ5 activity; G, H, I)

ZmHXKΔ6 activity and J, K, L) ZmHXKΔ9 activity.

Kinetic parameters of recombinant maize hexokinases

Soluble proteins in full versions

Soluble proteins in truncated versions

Incorrect protein folding?

Preferencia de sustratos Man Glu Fru

Gene Name ID number Putative

function

HXK

activity

ZmHXK3a GRMZM2G068913 HKL ND

ZmHXK3b GRMZM2G467069 HKL ND

ZmHXK4 GRMZM2G058745 HXK Yes





ZmHXK9 GRMZM2G171373 HXK No

ZmHXK10 GRMZM2G046686 HKL ND

ID numbers of the maize HXK gene family, in silico assigned function and activity demonstrated.

Functional complementation assay

A mutation that confers growth defects

Successful complementation

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN: Es decir se usa un fragmento de DNA (que se sospecha tiene una función específica) que se usa para transformar un mutante (para la función deseada) para revertir el fenotipo silvestre. Se utiliza para identificar la función del gen específico.

ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 complement the function of the yeast mutant

The truncated versions grow better than the full versions, even ZmHXK9

Análisis in silico de la secuencia de aminoácidos de la proteína: Alineamientos

Adenosina(425-461) G441 AtHXK1

AtHXK2 AtHXK3 AtHKL1 AtHKL2 AtHKL3 OsHXK1 OsHXK2 OsHXK3 OsHXK4 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 OsHXK9 OsHXK10 ZmHXK3a ZmHXK3b ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9 ZmHXK10

Gouy et al., Mol Biol Evol (2010).

Maíz

Arroz

Arabidopsis

Maíz

Arroz

Arabidopsis

AtHXK1 AtHXK2 AtHXK3 AtHKL1 AtHKL2 AtHKL3 OsHXK1 OsHXK2 OsHXK3 OsHXK4 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 OsHXK9 OsHXK10 ZmHXK3a ZmHXK3b ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9 ZmHXK10

Gene Name ID number Putative

function

HXK

activity

ZmHXK3a GRMZM2G068913 HKL ND

ZmHXK3b GRMZM2G467069 HKL ND







ZmHXK10 GRMZM2G046686 HKL ND

ID numbers of the maize HXK gene family, in silico assigned function and activity demonstrated.

Aguilera-Alvarado & Sánchez-Nieto PCP 2017

Lo que se sabía en maíz…

Aguilera-Alvarado & Sánchez-Nieto PCP 2017

LAS HXK SE PUEDEN ENCONTRAR EN DIFERENTES COMPARTIMENTOS SUBCELULARES

HEXOCINASA EN PLANTAS

Citosol

Núcleo

Plastidio

Mitocondria

RE

Filamentos de actina

Tipo A

Tipo B

Tipo C

Tipo D

Cho et al., Planta (2006); Cheng et al., Biol. Plantarum (2011); Claeyssen y Rivoal, Phytochemistry (2007); Frommer et al., Science (2003); Nilsson et al., BMC Plant Biol. (2011)

Síntesis de almidón y ácidos grasos.

Tipo A

Metabolón glucolítico. Protección contra ROS.

Tipo B

Síntesis de almidón y ácidos grasos.

Energía en hipoxia.

Tipo C

Podrían tener las mismas funciones que las tipo B.

Tipo D

Two groups of HXKs are identified: Low and high sensitivity to ADP and G6P

Low or null sensitivity

PREDICCIÓN DE LA LOCALIZACIÓN CELULAR.

http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html

Se basa en la hidrofobicidad de los aminoácidos.

Se basa en la presencia de presecuencias en el N-terminal.

Cruce transmembranal

ZmHXK4 ZmHXK7

Protoplastos

Vector pEarlyGate HXK-GFP

Transformación GFP RFP Superposición

CFP YFP Superposición

Técnica: Localización subcelular de una proteína Mediante expresión en protoplastos de tejido de planta por microscopía confocal

Se pueden usar colorantes o proteínas marcadoras de cada organelo

Those HXK soluble in full version, with low sensitivity to ADP and G6P are localized at the

cytosol

Bright field GFP Mitotracker Merged

A

B

ZmHXK7 ZmHXK8 GFP alone

C

HXKs-GFP

The insoluble in full versions of ZmHXK4, 5, 6 and 9, which also are sensitive to ADP and G6P are mitocondrial proteins

ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK9 AtHXK1


A

B

C

D

E

The localization of ZmHXK4-6 and 9 greatly relies on the first 30 amino acids of the N-terminal domain

ZmHXK4Δ30 ZmHXK5Δ30 ZmHXK6Δ30 ZmHXK9Δ30


A

B

C

D

Revisión Artículo de investigación

Enviado, revisado por los revisores y ya se hicieron las correcciones y se volvió a enviar

OsHXK5 OsHXK6 ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9

Nuclear localization signal Mitochodrial target peptide

Aki & Yanagisawa, J. Proteome Res. (2009); Cho et al., Planta (2006); Cho et al., Plant Physiol. (2009);

Yanagisawa et al., Nature (2003).

Two localization sequences were identified in several plant HXKs

Alejandro Hernández Loyola

Trabajo en progreso

Nuclear localization is related to their sensor function

ZmHXK6

Δ30-GFP

ZmHXK6

Δ30-GFP

Bright field GFP Hoescht Merged

2. ¿ALGUNA HXK DE MAÍZ TIENE FUNCIÓN SENSORA?

¿CÓMO DETERMINAR QUE UNA HXK TAMBIÉN ES SENSORA?

ENSAYOS FARMACOLÓGICOS (análogos de Glu)

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN ARABIDOPSIS

Cho et al., Plant Phys (2010); Kregten et al., Nature Plants (2016); Moore et al., Science (2003).

gin2-1

A. tumefaciens

p35:ZmHXK:3HA HygR suspension

T1 Selection medium (Hyg)

Complementation assay with the maize HXKs using A. thaliana HXK1 mutant, gin 2-1

T4

Genotype: hxk1 deletion mutant Phenotype: Glu insensitive plants Develop Green cotyledons in the presence of Glu

Phenotype: Glu sensitive plants Develop purple cotyledons, anthocyanin accumulation in the presence of Glu

Ensayo de complementación en A. thaliana.

Glu 6%

Cho et al., Plant Phys (2010); Kregten et al., Nature Plants (2016); Moore et al., Science (2003).

ZmHXK5 Ler - 1 2 1 2

ZmHXK4

gin2-1

2% Glc

2% Mannitol


gin2-1


ZmHXK7

gin2-1

ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 restored the Glu sensitivity

ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 seem to be a dual function proteins

We need to have the repression of the photosynthetic genes to probe that the HXKs are sensor proteins

ZmHXK6

Colaborators Dr. Arturo Guevara Instituto de Biotecnología, Cuernavaca Morelos Dr. José Luis Hernández Mendoza Instituto de Ciencias Genómicas IPN, Tamaulipas. Dr. Javier Plasencia de la Parra, Dra. Marina Gavilanes Ruíz, Dra. Karina Durán (USAI-Microscopía confocal) Q. Laurel Fabila Ibarra Facultad de Química, UNAM Dra Sara L. Morales-Lázaro Dra. Tamara Rosenbaum Instituto de Fisiología Celular

Colaborators

M. en C. Paulina Aguilera Alvarado

Dr. Fernando Guzmán Chávez

M. en C. Roberto Carvente García

M. en C. Montserrat López Coria

pQA Alejandro Hernández Loyola

QA Itzel Palacios Vargas

QFB Mireya Flores Barrera

QFB Néstor E. Delgado Rubio

pQFB Nancy Hernández Chávez

pQA Méndez Ramírez Moisés

pQA Muñoz Chapul Daniela

M. en C. Beatriz King Díaz

Funding

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.

La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado, investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.

Eason, PNAS (2004); https://es.wikipedia.org/wiki/Gen%C3%A9tica_inversa

¿Cómo se obtiene una mutante de S. cerevisiae? Deleción

Ronda 1 PCR

Homología con el gen de interés


Primer de homología

Primer de homología

Templado 2

Ronda 2 PCR

Cassette de deleción

La levadura perdió un gen pero adquirió otro, en este caso uno que le

permite crecer en presencia de Kan

Confirmación por PCR

Primer UPTAG


Templado

Resistencia o

prototrofía

Primer DNTAG


Inserción del cassete por recombinación

homóloga

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