--GGlluucuronidacuronidassee (GUS) (GUS)

Het E. coli enzym GUS wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in transgene planten. De GUS activiteit is een maat voor de promotoractiviteit.

Doel van het experimentDoel van het experiment

Bepaling van de kinetische parameterskinetische parameters van GUS in een plantenextract.

Deze parameters zijn nodig om de specifieke activiteitspecifieke activiteit van het enzym in de plant vast te stellen.

Reactie omReactie om GUS activiteit GUS activiteit te metente meten

MUG = 4-methylumbelliferyl-MUG = 4-methylumbelliferyl-ββ-D-glucuronide-D-glucuronideMUB = 4-methylumbelliferonMUB = 4-methylumbelliferon

GUS

-Glucuronidase (GUS)

Opdracht en Opdracht en ResultaatResultaat

• Meet de activiteit van GUS in het plantenextract als functie van de substraatconcentratie.

• Dit levert informatie op over de kinetische parameters van GUS (KM en VMAX).

• Bepaal onder gedefinieerde condities (VMAX condities) de afhankelijkheid van de activiteit van de hoeveelheid plantenextract.

• Dit levert een specifieke activiteit van GUS op. Een maat voor genexpressie. Omdat de reactiecondities bekend zijn kunnen anderen waar ook ter wereld de activiteit van GUS nameten. Dit is een vereiste voor een wetenschappelijk verantwoord experiment.

Wat zijn Wat zijn Michaelis-MentenMichaelis-Menten kinetische parameters? kinetische parameters?

• De meeste enzymen vertonen Michaelis-Menten kinetiek

• Hierbij wordt een reversibel enzym-substraat complex gevormd dat vervolgens wordt omgezet in product en vrij enzym.

-Glucuronidase-Glucuronidase (GUS)(GUS)

E + S ES E + P

k1 k2

k-1

v = k2[ES]

Snelheid als functie van [S] Vmax maximale snelheid

als S >> KM

KM Michaelis constanteMichaelis constantesubstraat conc. bij v = ½ Vmax

max0

M

[S]

[S]

VV

K

Michaelis-Menten Michaelis-Menten kinetiekkinetiek

Niet-lineare regressie analyse met een set experimentele data waarbij V0 (initiële snelheid) wordt gemeten als functie van [S]

Meest betrouwbare manier voor het bepalen van Meest betrouwbare manier voor het bepalen van KKM M and and VVMAXMAX

Een afwijkend datapunt kan de uitkomst behoorlijk beinvloeden. Metingen worden daarom vaak in triplo uitgevoerd.

max0

M

[S]

[S]

VV

K

Kinetische Kinetische data analysedata analyse

Hoe meet je de Hoe meet je de initiinitiëleële activiteit?activiteit?

• Meet de beginsnelheid bij verschillende substraat concentraties.

• Hou het volume van het cuvet en de enzymconcentratie constant.

• KM waarden kunnen sterk variëren

• KM hangt af van een specifiek substraat en van de reactiecondities (pH, T en ionsterkte)

• Vmax waarden kunnen ook sterk variëren

• Vmax geeft het turnovergetalturnovergetal van een enzym (kcat)

Betekenis van Betekenis van KKMM en VVMAXMAX

Eenheid van enzymactiviteit = Eenheid van enzymactiviteit = UnitUnit

• 1 Unit is de hoeveelheid enzym die de omzetting katalyseert van 1 mol substraat per minuut (bij bepaalde pH, T en I)

• specifieke activiteit = mol min-1 mg-1

• turnovergetalturnovergetal = aantal mol substraat omgezet per mol enzym per seconde

• eenheid van turnovergetal = s-1

DataData analyse analyse

Als de fit goed is dan weet je dat er rond de VMAX geen substraat remming optreedt.

• Meet vervolgens onder VMAX condities ([S] = 10 KM) bij minimaal drie hoeveelheden plantenextract de activiteit.

• Zet de activiteit uit tegen de hoeveelheid plantenextract. Als dit een rechte lijn is, dan is de specifieke activiteit binnen het gemeten gebied onafhankelijk van de gebruikte eiwitconcentraties, dus reproduceerbaar voor anderen. Experiment geslaagd!!

-Glucuronidase -Glucuronidase (GUS)(GUS)

-Glucuronidase -Glucuronidase (GUS)(GUS)

Hoe bereken je de specifieke activiteit?

• Stel dat GUS een activiteit vertoont van 16.9 nM MUB gevormd per 30 secondes per 20 µL extract.

• In het cuvet met 1.00 mL inhoud wordt dan 16.9 (nmol/L) x 1.00 10-3 (L) = 16.9 pmol product geproduceerd per 30 secondes.

• Het extract is gemaakt door 20 mg blad fijn te wrijven in 100 µL buffer. Per 20 µL extract is dit 20/100 (µL/µL) x 20 (mg) = 4 mg blad geweest.

• De specifieke activiteit wordt dan: 16.9 (pmol) x 2 (1/min) / 4 (per mg blad) = 8.5 pmol/min/mg blad.