Vorlesung Analytische Chemie - ETH Z

Herbstsemester 2010 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch 1

Vorlesung Analytische Chemie (für Biol./Pharm.Wiss.)

ZUSAMMENFASSUNG

Chromatographie

Grundlagen: Techniken: • Grundlegende Formeln • LC • Trenneffizienz, Peakbreite & theoretische Böden • GC • Asymmetrische Peaks (Überladungseffekte) • Elektrophorese • Auflösung & Optimierung einer Trennung • Probenvorbereitung • Quantifizierung & Kalibrierung (Probenaufarbeitung)

Herbstsemester 2010 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | schmid@org.chem.ethz.ch

Chromatographie

Definition: Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die zu trennenden Substanzen zwischen einer mobilen und einer stationären Phase verteilt werden. Die beiden Phasen sind nicht mischbar, und die Trennung beruht auf unterschiedlichen Verteilungskonstanten der verschiedenen Substanzen. Die Technik ist so konzipiert, dass sich das Verteilungsgleichgewicht in einer kontinuierlichen Abfolge mehrmals während des Trennprozesses einstellen kann.

„Chromatographie-Check“

Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein:

•  Trenntechnik

•  Zwei nicht mischbare Phasen

•  Eine mobile und eine stationäre Phase

•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen

•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen

Grundlegende Formeln zur Chromatographie

Verteilungsgesetz und Phasenverhältnis

•  Verteilungskonstante (Verteilungskoeffizient) KC:

Gleichgewichtsverteilung von Analytmolekülen in der mobilen (AM) und stationären (AS) Phase.

Nernstsches Verteilungsgesetz Bei gegebener stationärer und mobiler Phase ist KC für einen Analyten bei konstanter Temperatur eine Konstante.

KC = cScM

= Analytkonzentration in der stationären PhaseAnalytkonzentration in der mobilen Phase

•  Phasenverhältnis β:

! = VM

= Volumen der mobilen PhaseVolumen der stationären Phase

Das Chromatogramm

•  Durchflusszeit (Totzeit) tM: Retentionszeit einer Inertsubstanz

•  Lineargeschwindigkeit u:

u = LtM

= SäulenlängeDurchflusszeit

•  Retentionszeit tR •  Reduzierte Retentionszeit t’R:

! t R = tR " tM

•  Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k:

k = tR ! tM

=" t R

= KCVS

•  Trennfaktor (“Selektivität”) α:

per Definition: α ≥ 1

! = tR2 " tM

tR1" tM

= # t R2# t R1

= k2k1

= KC 2

Peakbreite (idealer Gauss-Peak)

Peakbreite zwischen den Wendepunkten wi: Breite bei e-1/2 = 0.607 bzw. 60.7% der Peakhöhe.

wi = 2!

Basisbreite wb: Breite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der x-Achse (Zeitachse).

wb = 4!

Peakbreite in halber Höhe w1/2: Breite bei 50% der Peakhöhe.

w1/ 2 = 2! 2 ln2 " 2.354!

σ ... Standardabweichung der Gauss-Funktion

Trenneffizienz, Peakbreite & theoretische Böden

Theoretische Böden & Trenneffizienz

Je mehr theoretische Böden, umso höher die Effizienz der Trennung

N = tR!

% & ' 2

= 16 ( tRwb

= 5.54 ( tRw1/ 2

H = LN

•  Anzahl der theoretischen Böden N:

•  Bodenhöhe H:

Je grösser N bzw. je kleiner H, umso effizienter die Trennung

Trenneffizienz & van-Deemter-Gleichng

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinal-Diffusion C: Massentransport-Effekte

H = A+ Bu

vanDeemter.xls

Je kleiner H, umso mehr theoretische Böden und umso effizienter die Tren- nung ( schmalere Peaks) Je höher A, B und C, umso ineffizienter die Trennung

Asymmetrische Peaks (Überladungseffekte)

Asymmetrie verstehen: Wie sind die Moleküle in der Säule verteilt? Grund für Asymmetrien: Überladungseffekte

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

Idealer Gauss- Peak

Tailing Fronting

Asymmetriefaktor oder

Abweichungen von der idealen Peakform

Unsymmetrische Peaks sind meist auf Überladungseffekte bei hohen Analytkonzentrationen zurückzuführen. Überladung der mobilen Phase: Der Analyt kondensiert auf der stationären Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer unsymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Moleküle später als im Idealfall die Säule verlässt. Überladung der stationären Phase: Die Bindungsstellen auf der stationären Phase sind mit Analyt belegt. Analytmoleküle aus der mobilen Phase können nicht mehr binden und werden schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytmoleküle verlässt die Säule also früher als bei idealer Retention.

Auflösung & Optimierung einer Trennung

Auflösung

RS = ! "1!

k21+ k2

! = f k,KC( )k = f ),KC( )N = f L,H( )

Gauss.xls

RS = tR 2 ! tR1

wb1 + wb2

2" # $

=2 tR 2 ! tR1( )wb1 + wb2

= Differenz der RetentionszeitenMittelwert der Basisbreiten

Auflösung RS zweier benachbarter Peaks: Koelution: RS < 0.75

2 Peaks erkennbar: RS > 0.75

Basisliniengetrennte Peaks: RS > 1.5

Optimierung

RS = !"1!

k21+ k2

α: Trennfaktor k: Retentionsfaktor N: Anzahl theoretischer Böden

k ! tR

N ! 1" 2

! =" t R 2" t R1

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflösung (RS > 1.5)

in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

Je höher α, k und N, umso besser die Auflösung RS

Quantifizierung & Kalibrierung

Mittelwert :

Ein kleiner Ausflug in die Statistik

Genauigkeit = Präzision + Richtigkeit

Messwerte xi

x = 1n

xii =1

!x = 1n "1

xi " x ( )2i =1

Standard- abweichung σ:

rel. Standard- abweichung:

!rel, x = !x

Kalibrierung

AAnalyt = a + b cAnalyt

b =AAnalyt ! acAnalyt

Empfindlichkeit b (Steigung der Kalibriergeraden):

NG =A0 + 3!A0( ) " a

Nachweisgrenze NG: (limit of detection = LOD):

BG =A0 + 6!A0( ) " a

Bestimmungsgrenze BG: (limit of quantification = LOQ):

Kalibriermethoden

•  Kalibrierung mit externem Standard: •  einfachstes Kalibrierverfahren

•  Kalibrierung mit internem Standard: •  Kompensation systematischer Fehler •  Interner Standard kann z.B. vor der Probenaufarbeitung oder bei der Probenahme zugegeben werden •  Einschränkung: Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt •  Matrixeffekte werden nicht kompensiert

•  Kalibrierung mittels Standardaddition •  Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als Standard •  Matrixeffekte können kompensiert werden

Zusammenfassung LC

LC: Analyten

GC: Analyten müssen unzerstört verdampfbar sein. LC: Auch geeignet für grosse und thermolabile Moleküle

•  kleine ungeladene (polare und unpolare) Moleküle •  anorganische und organische Ionen •  Polymere •  Grosse (Bio-)Moleküle Einschränkung: Analyt muss ausreichend in mobiler Phase löslich sein.

LC: Techniken

Trennmethode Trennung nach...

Normalphasen-HPLC Polarität (tR: polare > apolare Analyten)

Umkehrphasen-HPLC Polarität (tR: apolare > polare Analyten)

Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse

Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen

Affinitätschromatographie spezifische biochemische Bindungsaffinität (z.B. Antikörper–Antigen)

Chirale Chromatographie Chiralität (R- und S-Form)

Einschränkung: Analyt muss ausreichend in mobiler Phase löslich sein.

LC: Techniken

Grössenausschlusschromatographie (SEC)

RP-LC Ionen- chromatographie (IC)

LC: Detektoren

Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber RID – – + universeller Detektor ELSD o ++ universeller Detektor Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare

Analyten MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur Strukturaufklärung

Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie

LC: Detektoren

Zusätzlich: Leitfähigkeitsdetektor (mit Suppressor) in der Ionenchromatographie Weitere Kriterien:

•  Kompatibel mit der Gradientenelution? •  Preis, einfache oder komplizierte Bedienung, Aufwand für Justage, Wartung etc.

Derivatisierung: Ermöglicht den Einsatz von Detektoren, die für die vorliegenden Analyten an sich nicht geeignet oder zu unempfindlich sind. z.B. chemische Umsetzung mit starken UV-Absorbern oder Fluorophoren

LC: Trenneffizienz

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinal-Diffusion C: Massentransport-Effekte

H = A+ Bu

HPLC: Verbesserung der Effizienz durch Einsatz kleiner Partikel (µm-Bereich). Dadurch hohe Drücke erforderlich (300-400 bar)

vanDeemter.xls

LC: Auflösung

RS > 1.5

Grundlinien- getrennte

RS = ! "1!

k21+ k2

! = f k,KC( )k = f ),KC( )N = f L,H( )

HPLC: Verbesserung der Auflösung durch Verwendung kleiner Partikel (µm-Bereich) Verbesserung der Trenneffizienz (H) und Erniedrigung des Phasenverhältnisses β = VM/VS

Gauss.xls

LC: Optimierung der Trennung

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflösung (RS > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

Mobile Phase: anderes Lösungsmittel(-gemisch), Gradientenelution Stationäre Phase: Wechsel der Säule (z.B. Änderung der Polarität) Lineargeschwindigkeit, Temperatur, Säulenlänge (selten, da Analysenzeit L)

Gradiententrennung: Änderung des Eluenten während der Trennung (z.B. Acetonitril-Wasser-Gemisch in verschiedenen Konzentrationen) Oft Erhöhung der Elutionskraft im Lauf der Trennung Kürzere Analysenzeiten, schmalere Peaks bei hoher Retention

Isokratische Trennung: Lösungsmittelzusammensetzung konstant während der Trennung

Zusammenfassung GC

GC: Analyten

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (ca. 10–20% der bekannten org. Moleküle) •  v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle •  Derivatisierung: Überführung der Analyten in flüchtige Derivate Die Betriebstemperatur des Gaschromatographen muss aber nicht über dem Siedepunkt der Analyten liegen. Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:

z.B. kleine ungeladene Moleküle anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe Polymere grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)

GC: Vorteile & Probleme

Vorteile der GC gegenüber der LC: •  Kapillarsäulen haben sehr hohe Bodenzahlen (bis ca. 200 000)

•  schmale Peaks •  hohe Peakkapazität (viele basisliniengetrennte Peaks in einem Chromatogramm) •  Untersuchung komplexer Proben

•  GC-Detektoren sind sehr empfindlich •  Quantifizierung im Bereich sehr kleiner Konzentrationen möglich •  Spurenanalytik

Typisches Problem: •  Kapillarsäulen werden leicht überladen

•  Überladungseffekte, asymmetrische Peaks •  Abhilfe: Verdünnung der Proben oder Split-Injektion

GC: Mobile Phasen

•  Häufigste Trägergase: N2, He, H2

•  Mobile Phase dient nur zum Transport der Analyten durch die Säule

•  Das Trägergas beeinflusst die Trenneffizienz bzw. die Bodenhöhe

•  Viskosität: H2 < He < N2 •  Diffusionskoeffizienten der Analyten in der mobilen Phase: N2 < He < H2 •  Beste Trenneffizienz um ca. u = 1 mL/min mit H2 und He. N2 ist kostengünstiger.

H = A+ Bu

CM ! 1DM

breites Optimum bei Trägergasflüssen um 1 mL/min

GC: Stationäre Phasen (Kapillarsäulen)

Polare Phasen: Neben dem Siedepunkt ist auch die Polarität der Moleküle ein Trennkriterium.

Apolare Phasen: Trennung apolarer Analyten gemäss ihrem Siedepunkt St

CH3 100%

O Si Si

Poly(dimethylsiloxan)

Poly(5%-diphenyl-95%-dimethylsiloxan)

Poly(14%-cyanopropylphenyl-86%-dimethylsiloxan)

Polyethylenglykol

X-1701

apolar

Zunahme der P

olarität

Struktur Name Kürzel Polarität

GC: Optimierung

Ziel der Optimierung ist, eine effektive Peakauflösung (RS > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

RS = ! "1!

k21+ k2

! = f k,KC( )k = f ),KC( )N = f L,H( )

•  Polarität der stationären Phase k, α

•  Säulenlänge L N (und Analysenzeit)

•  Säuleninnendurchmesser β k

•  Filmdicke β k

•  Säulentemperatur T KC k

Gradientenelution (Temperaturprogramm):

Erhöhung der Temperatur entspricht Erhöhung der Elutionskraft

Je höher α, k und N, umso besser die Auflösung RS Aber: Je höher k und L, umso länger die Analysendauer

GC: Detektoren

Detektor Selektivität Nachweisgrenze Linearität Flammenionisations- C-haltige Moleküle 1 pg C/s > 106 detektor (FID) ⇒ fast universell

Wärmeleitfähigkeits- universell 400 pg/mL 104 detektor (WLD bzw. TCD)

Elektroneneinfang- selektiv (z.B. stark verbindungsabhängig 106 detektor (ECD) –Cl, –Br, –NO2) Flammenphotometrischer selektiv 20 pg S/s 103 (S) Detektor (FPD) (S, P, Sn) 1 pg P/s 104 (P / Sn)

Atomemissionsdetektor (AED) universell / stark elementabhängig 102–105

elementselektiv Massenselektiver universell / verbindungsabhängig Detektor (MSD) massenselektiv 10 pg–10 ng 105

Spektren, TIC, SIM

Zusammenfassung Elektrophorese

Elektrophorese

•  Gel-Elektrophorese

•  Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), Agarose-Gelelektrophorese •  Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente) •  Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)

•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) •  Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex) •  Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts

•  Kapillarelektrophorese (CE) •  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

•  Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen) •  Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)

•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) •  Trennung ungeladener, kleiner Moleküle •  Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)

Zusammenfassung

Probenvorbereitung

(Probenaufarbeitung)

Probenvorbereitung

•  Analyten in Lösung bringen

•  Abtrennen fester Störsubstanzen

•  Abtrennen gelöster Störsubstanzen

•  Anreichern der Analyten

•  Aufkonzentrieren oder Verdünnen der Probe

•  Überführen der Analyten in ein geeignetes Lösungsmittel

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