Post on 21-May-2020
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Synthese van 5-hydroxyalkylamino- en 5-methoxyalkylamino-1,7-diarylhepta-1,4,6-triëen-3-onen als nieuwe
stikstofanaloga van curcumine
Lore Vannecke Promotor: Prof. dr. ir. Matthias D’Hooghe Tutor: ir. Rob De Vreese
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: chemie en bioprocestechnologie
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Synthese van 5-hydroxyalkylamino- en 5-methoxyalkylamino-1,7-diarylhepta-1,4,6-triëen-3-onen als nieuwe
stikstofanaloga van curcumine
Lore Vannecke Promotor: Prof. dr. ir. Matthias D’Hooghe Tutor: ir. Rob De Vreese
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: chemie en bioprocestechnologie
De auteur en de promotor geven toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en
delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van
het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te
vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts
of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specially the source must
be extensively specified when using results from this thesis.
Gent, januari 2016
De promoter, De auteur,
Prof. dr. ir. M. D’Hooghe L. Vannecke
Woord vooraf Deze Masterproef is het sluitstuk van mijn studiejaren aan de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
van de Universiteit Gent. Het waren super boeiende jaren: er werd heel veel bijgeleerd,
vriendschappen voor het leven gesloten, hard gestudeerd, enorm veel plezier gemaakt en de grote
stad Gent werd mijn tweede thuis. Ik zal deze periode steeds blijven koesteren en altijd een beetje
missen. Maar nu is het tijd voor een nieuw hoofdstuk in mijn leven, het werkleven.
Deze Masterproef was misschien toch al een voorsmaakje van het echte werkleven. Voor het
bekomen van deze thesis werd iedere werkdag, van ‘s ochtends tot ‘s avonds, in het labo gewerkt. Er
werd hard gewerkt. Maar er werd ook gelachen. Het zijn er niet velen die dit kunnen zeggen maar ik
heb echt genoten van mijn thesisperiode.
In dit woord zou ik graag enkele mensen bedanken. De twee belangrijkste personen voor het
bekomen van deze Masterproef zijn mijn promotor en mijn tutor.
Mijn promotor, Professor Matthias D’Hooghe, bedankt om te mogen thesissen aan uw vakgroep. Ik
werd uitstekend begeleid. De raad, ideeën en chemische kennis die u bood tijdens de maandelijkse
meetings zorgden ervoor dat ik steeds doelgericht kon werken. U weet uw studenten enorm te
motiveren!
Mijn tutor, Rob De Vreese, vanaf dag één wist ik dat je een goede begeleider zou zijn. Je stelde mij
meteen op mijn gemak. Je stond altijd onmiddellijk klaar om vragen te beantwoorden, hulp te bieden
en nieuwe voorstellen te doen. Bovendien weet je het perfecte evenwicht te geven tussen
zelfstandig en begeleid werken. Ook een grote dank voor de vele verbeterrondes van deze thesis.
Jouw kennis, inzicht en ervaring hebben mij enorm veel geholpen!
Verder zou ik graag alle doctoraat- en thesisstudenten bedanken. Jullie stonden altijd paraat om te
antwoorden en te helpen bij slimme en minder slimme vragen.
Mijn labotafel bevond zich in het kleine labo. De sfeer in het kleine labo was echt gezellig, maar die
was er niet geweest zonder de mensen die er werkten. Rob, Yves, Melissa, Laurens, Jeroen en Benz,
bedankt voor de goede sfeer en alle hulp die jullie boden. Flore, Dries en Tim, mijn medestudenten
uit het kleine labo, met jullie heb ik zoveel plezier gehad. Iedere dag waren we blij om elkaar terug te
zien. We houden contact, dit staat vast.
Bruno, mijn vriend, ik zou je graag bedanken, gewoon al om er altijd te zijn voor mij. Jij kan mij als
geen ander kalmeren, maar je maakt mij vooral supergelukkig.
Als laatste zou ik graag mijn papa, mama, mijn zussen Annelies en Lotta en mijn broer Tom willen
bedanken. Het leven in Gent was leuk, maar in het weekend kwam ik maar al te graag naar huis om
jullie te zien. Papa en mama, bedankt om mij zo goed te steunen tijdens deze studiejaren en door te
zeggen dat ik het wél kan.
Lore Vannecke, januari 2016
Inhoudsopgave 1 Situering en doel.............................................................................................................................. 1
1.1 Situering .................................................................................................................................. 1
1.2 Doel ......................................................................................................................................... 3
2 Literatuuroverzicht .......................................................................................................................... 6
2.1 Synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 ................................................................ 6
2.1.1 Zuur-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen ........................... 7
2.1.2 Base-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen ........................... 8
2.2 1,5-Diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 met potentiële antikanker-activiteit ......................... 12
2.2.1 (1E,4E)-1,5-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)penta-1,4-dieen-3-on 15 ........................ 14
2.2.2 Gehalogeneerde analogen ............................................................................................ 14
2.2.3 Analogen met trimethoxyfenylgroepen ........................................................................ 15
2.2.4 Heteroaromatische analogen ........................................................................................ 16
2.3 Conclusie ............................................................................................................................... 18
3 Bespreking van de resultaten ........................................................................................................ 19
3.1 Synthese van nieuwe stikstofanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 ..... 19
3.1.1 Synthese van enamineanalogen van curcuminoïden door nucleofiele aditie van
aminoalcoholen ............................................................................................................................. 21
3.1.2 Synthese van enamineanalogen van curcuminoïden door nucleofiele aditie van
aminoëthers .................................................................................................................................. 30
3.2 Oplosbaarheid en biologische testing ................................................................................... 34
4 Samenvatting en besluit ................................................................................................................ 38
4.1 Samenvatting ......................................................................................................................... 38
4.2 Besluit .................................................................................................................................... 40
5 Experimenteel deel........................................................................................................................ 43
5.1 Methodologie ........................................................................................................................ 43
5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC) ................................................................................... 43
5.1.2 Kolomchromatografie ................................................................................................... 43
5.1.3 Vloeistofchromatografie ............................................................................................... 43
5.1.4 Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) ............................................. 43
5.1.5 Massaspectrometrie (MS) ............................................................................................. 43
5.1.6 Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) ................................................................ 43
5.1.7 Smeltpuntbepaling ........................................................................................................ 44
5.1.8 Microgolfreactor ............................................................................................................ 44
5.2 Veiligheid ............................................................................................................................... 44
5.2.1 Algemene veiligheidsmaatregelen in het chemisch labo .............................................. 44
5.2.2 Risico’s verbonden aan gebruikte reagentia en solventen ........................................... 44
5.3 Beschrijving van de experimenten ........................................................................................ 46
5.3.1 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,4,6-
heptatriëen-3-onen 56 en 64 ........................................................................................................ 46
5.3.2 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-onen 58
en 66…….. ...................................................................................................................................... 48
5.3.3 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57b, 59a en 67b ........................................... 51
Bronnen ................................................................................................................................................. 53
Situering en doel
1
1 Situering en doel
1.1 Situering Curcumine is de gele kleurstof van het kruid kurkuma, een poeder bekomen uit de gedroogde
wortelstokken van Curcuma longa, een plant die tot de gemberfamilie behoort. Kurkuma geeft de
typisch gele kleur aan kerriepoeder en wordt zeer veel gebruikt in de oosterse keuken.1 Het
kurkumapoeder bevat oliën, proteïnen, mineralen, koolhydraten, vocht en curcuminoïden.
Curcuminoïden zijn een mengsel van ondermeer drie componenten: curcumine 1 (77 %),
demethoxycurcumine 2 (17 %) en bisdemethoxycurcumine 3 (3 %).2, 3
De IUPAC- (International Union of Pure and Applied Chemistry) naam van curcumine 1 is 1,7-bis-(4-
hydroxy-3-methoxyfenyl)-hepta-1,6-diëen-3,5-dion. De pKa-waarden van de drie zure protonen,
waaronder twee fenolische protonen en één proton op het C4-koolstofatoom, van curcumine 1
bedragen respectievelijk 9,0, 8,5 en 7,8.4 Curcumine 1 is zo goed als onoplosbaar in water maar is
oplosbaar in methanol, ethanol, dimethylsulfoxide en aceton.2, 5 De moleculaire configuratie van de
stof bestaat uit twee tautomere vormen, namelijk een diketo- 4 en enolvorm 5. Onder zure en
neutrale omstandigheden en in vaste vorm domineert de diketovorm 4 en onder basische
omstandigheden de enolvorm 5.3, 6
Bij een basische pH is curcumine 1 onstabiel en ondergaat de verbinding snelle hydrolytische
degradatie. Curcumine 1 valt dan uiteen in volgende metabolieten: feruloylmethaan 6 (IUPAC-naam:
E-4-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)but-3-een-2-on), ferulinezuur 7 en vanilline 8. Deze laatste is het
secundair degradatieproduct van feruloylmethaan 6, gevormd door hydrolyse.4
Situering en doel
2
De biologische activiteiten van curcumine 1 zijn zeer breed en omvatten antioxidant-, anti-
inflammatoire-, antibacteriële-, antivirale-, antifungale- en antikankeractiviteiten. De stof werkt in op
zeer veel moleculaire targets die een rol spelen in (inflammatoire) ziekten zoals bijvoorbeeld kanker.
Deze targets zijn ondermeer transcriptiefactoren, groeifactoren, bepaalde celreceptoren, cytokinen,
kinasen, bepaalde enzymen, moleculen die een rol spelen in de metastase (of uitzaaiing) van kanker,
en moleculen die van belang zijn bij de apoptose (of geprogrammeerde celdood) van cellen, en
worden weergegeven in Figuur 1. Door de grote verscheidenheid aan moleculaire targets waarop
ingewerkt wordt, kan curcumine 1 tussenkomen in bijna elk kankerstadium. Curcumine 1 zou dus een
veelbelovende verbinding kunnen zijn in 'Targeted Molecular Therapy' bij de behandeling van kanker
omdat de stof meerdere signaaltransducties in kankercellen kan onderdrukken, maar niet gaat
inwerken op normale cellen. Dit in tegenstelling tot een kankerbehandeling met chemotherapie,
waar een chemische verbinding alle snel delende cellen gaat vernietigen en dus ook snel delende
normale cellen.1
Figuur 1. Verschillende targets die gereguleerd kunnen worden door curcumine 11
Situering en doel
3
Naast al deze positieve biologische activiteiten hierboven weergegeven heeft curcumine 1 toch één
groot nadeel, dat zorgt voor een belemmering in het medicinale gebruik van de verbinding, en dit is
de lage biologische beschikbaarheid of biobeschikbaarheid. De belangrijkste redenen voor deze lage
biobeschikbaarheid zijn: lage absorptie, snelle biodegradatie, inactiviteit van de metabolieten 6, 7 en
8, en snelle excretie.7 Om deze problemen te overkomen, werden reeds meerdere oplossingen
onderzocht.
Een eerste mogelijke oplossing omvat het gebruik van hulpstoffen die ervoor zorgen dat
metabolische pathways van curcumine 1 geblokkeerd worden. Een voorbeeld van zo’n hulpstof is
piperine, beter gekend als zwarte peper. Bij toediening van piperine als hulpstof bij curcumine,
zorgde dit voor een verhoging van 2000% in serumconcentratie van curcumine 1 bij de mens. Dit
betekent dat de biobeschikbaarheid sterk kan toenemen door toediening van een hulpstof.8
Waar eveneens uitvoerig onderzoek naar verloopt, is het gebruik van nanopartikels
(nanocurcumine), liposomen, micellen en fosfolipiden om de beschikbaarheid te verhogen. Deze
methoden worden dikwijls toegepast om de opname van stoffen in biologisch weefsel te
vergemakkelijken.
Een laatste interessante oplossing voor de lage biobeschikbaarheid van curcumine 1 is het gebruik
van curcumineanalogen: het curcuminemolecule ondergaat een structurele modificatie met als doel
de biobeschikbaarheid te verhogen en de bioactiviteit te behouden of zelfs te verhogen.1, 7 De waaier
aan bekende curcumineanalogen is reeds zeer breed. In deel twee (Literatuuroverzicht) van deze
Masterproef wordt één groep van deze analogen besproken, met name de monocarbonylanalogen.
1.2 Doel De “SynBioC Research Group” van de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) doet al enkele
jaren onderzoek naar de synthese en activiteit van curcumineanalogen. Zoals in deel 1.1 Situering
weergegeven, bezit curcumine 1 een lage oplosbaarheid in water en een daarmee gepaard gaande
lage biologische beschikbaarheid. Door het invoeren van stikstofatomen in de molecule zullen de
chemische eigenschappen van de molecule veranderen, hetgeen de biobeschikbaarheid mogelijk ten
goede kan komen. In voorgaande Masterproeven 9, 10 aan de “SynBioC Research Group” werden
enaminederivaten 9 en 10 van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 gesythetiseerd uitgaande
van volgende alkylaminen: propylamine, isopropylamine, allylamine, butylamine, sec-butylamine,
isobutylamine en cyclohexylamine. In onderstaand schema worden deze reacties in detail
weergegeven.
Situering en doel
4
Uit biologische testing 11 bleek de wateroplosbaarheid van deze gesynthetiseerde stikstofderivaten
van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 niet beter te zijn dan die van curcumine 1. Daarom
doelt voorliggende Masterproef op de synthese van meer polaire enamineanalogen 11 en 12 van
curcumine door gebruik te maken van meer polaire aminen 13, zoals aminoalcoholen, aminoëthers,
aminozuren en aminoësters, om zo de partitiecoëfficiënt (logP) van deze analogen te doen dalen met
een mogelijk beter farmacologisch profiel tot gevolg.
Situering en doel
5
In voorafgaande Masterproeven werd reeds gezocht naar een methode voor de synthese van
enamineanalogen 9, 10 en toen bleek de reactie het best te lukken onder invloed van
microgolfbestraling (MW). Deze Masterproef zal van deze methode gebruik maken om curcumine 1
en bisdemethoxycurcumine 3 te imineren met polaire aminen 13 ter vorming van nieuwe
enamineanalogen 11 en 12 van curucmine 1 en bisdemethoxycurcumine 3.
De enamineanalogen 9 en 10 van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 gesynthetiseerd in
vorige twee Masterproeven werden eerder ook reeds in vitro getest op enkele kankercellijnen.9, 10, 11
Niettegenstaande dat de oplosbaarheid van deze enamineanalogen niet verbeterd was tegenover
curcumine 1, vertoonden ze wel een verhoogde cytotoxiciteit in vergelijking met curcumine 1, met
de bisdemethoxycurcuminederivaten 10 als de best scorende verbindingen. De enamineanalogen 11
en 12 die in deze Masterproef gesynthetiseerd zullen worden, gaan in een volgende stap ook getest
worden op hun biologische activiteit en aan de hand van de bekomen resultaten zal een SAR
(Structure Activity Relationship) opgesteld worden.
Literatuuroverzicht
6
2 Literatuuroverzicht Curcumine 1 blijkt in vitro en in vivo een fragiele, zwak farmacokinetische verbinding te zijn. Eén van
de mogelijke oorzaken is de aanwezigheid van een -diketolinker in de structuur, die onstabiel is bij
neutrale en basische pH.12, 13 Daarnaast is in verschillende studies aangetoond dat de beta-diketo-
eenheid mogelijk een substraat kan zijn van aldo-ketoreductasen, waardoor curcumine wellicht snel
afgebroken wordt.14, 15 De affiniteit tussen deze enzymen en curcumine wordt echter wel geprezen
bij de behandeling van diabetes, waar curcumine een rol zou kunnen spelen als non-competitieve
inhibitor en zo de opstapeling van sorbitol verlaagt.16 Monocarbonylanalogen van curcumine, en
meer specifiek symmetrische 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14, met meest eenvoudige vorm
verbinding 15, bezitten deze onstabiele -diketostructuur niet en kunnen mogelijk farmacokinetisch
stabiele bioisosteren zijn van curcumine. Het bestuderen van de synthese, biologische activiteit en
farmacokinetische eigenschappen van deze verbindingen is een belangrijk topic in de medicinale
chemie gezien de veelbelovende eigenschappen van curcumine. In deze literatuurstudie zal dieper
ingegaan worden op de verschillende manieren om symmetrische 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen
14 van curcumine aan te maken, en vervolgens wordt een overzicht gegeven van de meest potentiële
antikanker verbindingen, de meest bestudeerde toepassing van dit type verbindingen.
2.1 Synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 Er werden reeds een duizendtal monocarbonylanalogen 14 van curcumine gesynthetiseerd. De
synthese kan op verschillende manieren gebeuren, maar verloopt voornamelijk via een
gekatalyseerde Claisen-Schmidtcondensatie. Via deze methode zal een (cyclisch) keton 16 tweemaal
een condensatiereactie ondergaan met een aromatisch aldehyde 17, waarbij tweemaal water wordt
uitgestoten.
De toegepaste ketonen 16 en aldehyden 17 zijn omvangrijk. Voorbeelden van ketonen zijn enerziijds
de lineaire en cyclische alkanonen: aceton, cyclopentanon, cyclohexanon,… en anderzijds de
heterocysclische alkanonen: piperidin-4-onen, tetrahydro(thio)pyran-4-onen,… Ook de waaier aan
gebruikte aldehyden is enorm breed. Het gaat om arylaldehyden en heteroarylaldehyden (Ar = aryl of
Literatuuroverzicht
7
heteroaryl) die gesubstitueerd kunnen zijn met alkyl-, aryl-, hydroxy-, alkoxy-, halogeen- en nog tal
van andere groepen.
In ondergaande subsecties zullen de verschillende syntheseroutes besproken worden, waarbij een
onderscheid gemaakt wordt tussen zuur-gekatalyseerde methoden en base-gekatalyseerde
methoden.
2.1.1 Zuur-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen
Reeds veel monocarbonylanalogen 14 van curcumine zijn bereid via een zuur-gekatalyseerde
methode. De methode bestaat uit een aldolcondensatiereactie tussen het gewenste aldehyde 17 en
keton 16 in de aanwezigheid van een zure katalysator (HA).
Hieronder is het reactiemechanisme om verbindingen 14 te synthetiseren weergegeven. Het bestaat
uit een opeenvolging van evenwichtsreacties en start met de activering van het keton 16 door middel
van een protonering door de zure katalysator. Vervolgens wordt dit keton gedeprotoneerd op het -
koolstofatoom en wordt een enol 18 gevormd. Daarna wordt het geprotoneerde aldehyde 17
aangevallen door het enol en wordt een positief geladen intermediair 19 gevormd. In de volgende
stap wordt het gevormde intermediair gedeprotoneerd en ontstaat een aldolproduct 20. De laatste
stap is de dehydratatie doordat een protonering van de alcoholgroep plaatsvindt en zo een goede
leavinggroep ontstaat. Het eindresultaat is een ,-onverzadigd keton 21. Deze reactie vindt
tweemaal plaats, namelijk aan beide zijden van het keton 16.24
Er zijn reeds verschillende reactieomstandigheden toegepast voor de synthese van
monocarbonylanalogen 14 van curcumine, waar telkens waterstofchloride als zure katalysator wordt
Literatuuroverzicht
8
gebruikt. Sardjiman et al.17 waren de eersten die verschillende monocarbonylanalogen 14 van
curcumine synthetiseerden met behulp van een zuurgekatalyseerde methode, gebaseerd op het
patent van Rumpel (1954),25 en behaalden rendementen van 43 tot 100 procent.17 Deze methode
was echter nog niet optimaal want de reactie duurde twee tot zeven dagen en de verhouding keton-
aldehyde was ook zeer uiteenlopend. Een ander protocol dat werd toegepast maakt gebruik van
ultrasone bestraling die de reactietijd sterk reduceerde tot twee uur.22 Maar de hedendaags, meest
toegepaste zuurgekatalyseerde methode is deze volgens Du et al., die een gemodificeerde vorm is
van de procedure volgens Sardjiman.18 Het grote verschil is dat de reactie gebeurt in ijsazijn en
telkens eenzelfde verhouding van aldehyde 17 en keton 16 wordt gebruikt, respectievelijk 2:1.
Daarnaast wordt nog waterstofchloride toegevoegd als zure katalysator en ontstaan verbindingen 14
in een opbrengst van 45 tot 98 procent.
In onderstaand schema wordt één representatief voorbeeld weergegeven van de hierboven
beschreven methode. De gesubstitueerde arylaldehyden 22a-e worden gekoppeld met een halve
equivalent tetrahydropyran-4-on door middel van een aldolcondensatie, die gekatalyseerd wordt
door een verzadigde oplossing van zoutzuur in ijsazijn. Op deze manier worden verbindingen 23a-e
gevormd. In Tabel 1 worden de verschillende substituenten weergegeven van verbindingen 23a-e
met hun bijhorende rendementen.21
Tabel 1. Substituenten en rendementen van de verkregen monocarbonylanalogen 23a-e uit een zuur-gekatalyseerde aldolcondensatie
21
Verbinding R1 R
2 R
3 R
4 Rendement na zuivering (%)
23a H H OH H 75
23b H H OCH3 H 78
23c H OCH3 OH OCH3 63
23d H OCH3 OCH3 OCH3 61
23e OCH3 OCH3 OCH3 H 53
2.1.2 Base-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen
De base-gekatalyseerde synthese van monocarbonylanalogen 14 van curcumine verloopt
voornamelijk via een aldolcondensatie, maar er werd ook één recent artikel in de literatuur
Literatuuroverzicht
9
teruggevonden waar een andere methode beschreven wordt, namelijk de synthese via de Horner-
Wadsworth-Emmons-reactie. Deze twee methodes worden hieronder toegelicht.
2.1.2.1 Base-gekatalyseerde synthese via een aldolcondensatie
De base-gekatalyseerde synthese via een aldolcondensatiereactie gebeurt tussen het gewenste
aldehyde 17 en keton 16 in de aanwezigheid van een basische katalysator (:B).
Het reactiemechanisme voor de base-gekatalyseerde synthese van monocarbonylanalogen 14, die
hieronder weergegeven wordt, is wederom een opeenvolging van evenwichtsreacties en start met
een deprotonering van het -koolstofatoom van keton 16 zodat een enolaatanion 24 gevormd
wordt. Dit enolaatanion gaat vervolgens nucleofiel aanvallen op de carbonylfunctie van het aldehyde
17 met vorming van een alkoxide 25. De volgende stap bestaat uit de protonering van dit alkoxide
waardoor het aldolproduct 26 ontstaat. De laatste stap is een E1cb-eliminatie, die bewerkstelligd
wordt door -deprotonering door de base met vorming van een enolaat 27 die dan een hydroxideion
gaat uitstoten. Verbinding 28 ondergaat dit mechanisme nog een tweedemaal met vorming van het
monocarbonylanaloog 14 van curcumine.24
Voor deze reacties worden verscheidene reactieomstandigheden gerapporteerd. Als basische
katalysatoren worden natriumhydroxide,20, 21, 23, 26, 27, 29 – 31, 33, 34 natriumbicarbonaat,28, 30
ammoniumacetaat 32 en kaliumcarbonaat gebruikt.29, 35 Bovendien kunnen de reacties plaatsvinden
in verschillende solventen, namelijk ethanol,20, 21, 23, 27, 29 - 34 methanol 28, 30 en het ternaire solvent,
tolueen-ethanol-water (4:4:2).29 Gedurende de reacties wordt ook soms een hoeveelheid
Literatuuroverzicht
10
cetyltrimethylammoniumbromide toegevoegd als emulgator om het monocarbonylanaloog 14
efficiënt te bekomen.20, 31
De eerste monocarbonylanalogen 14 van curcumine, gesynthetiseerd in basische
reactieomstandigheden, werden bereid via de gepatenteerde procedure van Borsche en Geyer.26, 36
Daarna werd de procedure steeds verder geoptimaliseerd tot Lee et al. een procedure vond met een
kortere reactietijd (10 – 24 uur, in vergelijking met 2 dagen), waarbij het gewenste aldehyde 17 en
keton 16 in een 2:1 verhouding reageren.27, 37 Het merendeel van de reeds bestaande
monocarbonylanalogen 14 werd dan ook op deze manier gesynthetiseerd.
Ter illustratie wordt hieronder het reactieschema gegeven van verbindingen 30a-m, gesynthetiseerd
volgens deze methode. Aan een mengsel van twee equivalenten arylaldehyde 29 en één equivalent
1-methylpiperidin-4-on in ethanol werd één molair oplossing van natriumhydroxide (1,33
equivalenten) in water toegevoegd. Op deze manier werden verbindingen 30a-m gevormd. In Tabel
2 wordt informatie gegeven omtrent de arylgroepen en de rendementen.
Tabel 2. Arylgroepen en rendementen van de verkregen monocarbonylanalogen 30a-m uit een base-gekatalyseerde aldolcondensatie
30
Verb. Ar Rendement na zuivering
(%) Verb. Ar
Rendement na zuivering
(%) Verb. Ar
Rendement na zuivering
(%)
30a
-a
30f
-a 30k
41
30b
-a 30g
-
a 30l
66
30c
-a 30h
63 30m
-a
30d
-a 30i
-a
30e
-a 30j
35
a rendement niet gerapporteerd in de literatuur
Literatuuroverzicht
11
2.1.2.2 Base-gekatalyseerde synthese via de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie
Recent werd een nieuwe methode toegepast voor de synthese van monocarbonylanalogen 14 van
curcumine die gebruik maakt van de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie. In deze reactie reageert
tetraethyl-(2-oxopropaan-1,3-diyl)-bisfosfonaat met aldehyde 17, in het bijzijn van de basische
katalysator kaliumcarbonaat, ter vorming van gewenste monocarbonylanalogen 14 in rendementen
van 34 tot 99 procent.35, 38
Het reactiemechanisme start met de deprotonering van tetraethyl-(2-oxopropaan-1,3-diyl)-
bisfosfonaat 31, waardoor een carbanion gevormd wordt. Dit carbanion gaat nucleofiel adderen aan
de carbonylgroep van het aldehyde 17 met vorming van een negatief geladen intermediair 32.
Daarna wordt het intermediair omgezet naar een cyclische vorm 33 door de vorming van een zeer
stabiele zuurstof-fosforbinding. Vervolgens vindt in de laatste stap gemakkelijk eliminatie van
diëthylfosfaat plaats waardoor verbinding 34, die een dubbele binding bevat, gevormd wordt. Dit
mechanisme gebeurt tweemaal.39, 40
Deze methode werd onlangs toegepast voor de synthese van een specifieke groep van
monocarbonylanalogen, namelijk deze met heteroaromatische ringen (Ar = heteroaryl), omdat men
ondervond dat de synthese van zulke derivaten minder gemakkelijk verloopt via de gebruikelijke
aldolcondensatie in vergelijking met derivaten met gewone aromatische ringen. Enkele voorbeelden
van heteroarylgroepen die gebruikt worden zijn: imidazolyl, pyrazolyl, (iso)-oxazolyl, (iso)thiazolyl of
pyridinyl. Daarenboven kunnen deze heteroarylgroepen gesubstitueerd zijn met bijvoorbeeld alkyl-
alkoxy-, aryl-, heteroaryl- en nog tal van andere groepen.
Literatuuroverzicht
12
In onderstaand schema wordt een voorbeeld weergegeven van een monocarbonylanaloog 37 dat
gesynthetiseerd wordt m.b.v. de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie. Eerst wordt het gewenste
aldehyde 36 gevormd door alkylering van 1H-imidazool-2-carbaldehyde 35. Vervolgens ondergaat
verbinding 36 de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie met vorming van analoog 37 in 99 %
rendement.35
2.2 1,5-Diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 met potentiële antikanker-
activiteit Ten gevolge van het interessant biologisch en farmacokinetisch profiel van monocarbonylanalogen
van curcumine werden reeds honderden van deze verbindingen gesynthetiseerd en getest op hun
biologische activiteit. Aan deze monocarbonylanalogen worden heel wat biologische activiteiten
toegeschreven, zoals bijvoorbeeld de inductie van apoptose en inhibitie van groei en proliferatie.
Deze activiteiten kunnen via verschillende biochemische pathways tot uiting komen. Zo kunnen deze
monocarbonylanalogen bijvoorbeeld de activatie van NF-B inhiberen en de generatie van ‘reactive
oxygen species’ (ROS) bewerkstelligen.41 Gezien het volledig bespreken van alle activiteiten van deze
verbindingen te uitgebreid zou zijn voor een literatuurstudie binnen deze Masterproef, zal deze
sectie zich toespitsen op de meest belovende antikankerverbindingen en zal, indien informatie
beschikbaar is, dieper ingegaan worden op de farmacokinetische eigenschappen van deze
verbindingen. Bovendien wordt bij het testen op potentiële antikankeractiviteit van
monocarbonylanalogen, vooral gebruik gemaakt van fenotypische testen zoals antiangiogenese en
apoptose van cellen, veel eerder dan het identificeren van pathways of specifieke targetproteïnen.42
In Tabel 3 worden de in vitro resultaten van de cytotoxiciteit van veelbelovende
monocarbonylanalogen en curcumine weergegeven. Deze monocarbonylanalogen zullen hieronder
meer in detail toegelicht worden. Bij het bekijken van de tabel is het belangrijk om de waarde van
het monocarbonylanaloog te vergelijken met de waarde voor curcumine. Daarenboven is het ook
interessant om de waarde voor de kankercel te vergelijken met de waarde voor een normale
epitheelcel, namelijk MCF-10A, indien die beschikbaar is, om zo een beeld te krijgen van de
selectiviteit.
Literatuuroverzicht
13
Tabel 3. IC50-waarden (in µM) voor 3 dagen blootstelling
Verb x LNCaP PC-3 DU145 MCF-7 MDA-MB-231 Panc-1 BxPC-3 HT-29 MCF-10A RPMI 7951 H1299 heLa NF-B Ref.
1 19,6 +/- 3,7 19,8 +/- 2,1; 1,98
a 0,3a 21,5 +/-
4,7 25,6 +/- 4,8; 0,88a 30,1 +/- 3,7 4,5 +/- 2,1 12,11 +/- 0,67;
12,6a
15 +/- 5 20, 21, 23, 29, 30, 35
15 2,7 +/- 0,4 3,9 +/- 1,1 2,4 +/- 0,4 2,8 +/- 1,0 12
38 0,8 +/- 0,4 0,7 +/- 0,0 23
39 0,49 +/- 0,1 0,50 +/- 0,1
0,47 +/- 0,1
0,41 +/-0,1 19
40 4,63 +/- 1,0 3,38 +/- 0,4
21
41 0,5 +/- 0,1 2,1 +/- 1,1 0,4 +/- 0,1 0,6 +/- 0,1 1,68 +/- 0,2
>50 20
42 > 30 30
43 0,3 0,9 +/- 0,1
30
44 1,88 +/- 0,3 3,24 +/- 0,6
3,28 +/- 0,2
21
45 0,52 +/- 0,1 0,70 +/- 0,1
0,76 +/- 0,1
21
46
47 0,8 1,0 +/- 0,3
30
48 1,1 1,5 +/- 0,2
30
49 0,033 0,02 0,097 0,12 29
50 0,52 +/- 0,1 0,70 +/- 0,1
0,76 +/- 0,1
21
51 0,96 +/- 0,2 0,51 +/- 0,1
0,79 +/- 0,1
21
52 0,041a 0,016a 0,156a b 0,19a 29
53 0,046a 0,057a 0,15a b 0,39a 29
54 0,063a 0,035a 0,13a b 0,062a 29
55
0,60 +/-0,05
0,71 +/- 0,04 1,14 +/- 0,00
0,47 +/- 0,26 35
a IC50-waarden voor 5 dagen blootstelling
b vertonen geen cytotoxiciteit naar MCF-10A voor 1 µM
MDA-MB-231 en MCF-7 = borstkankercellen; RPMI 7951 = melanoomcel; PC-3, DU145 en LNCap = prostaatkankercellen; H1299 = longkankercel; Panc-1 en BxPC-3 = pancreaskankercellen; HT-29 = darmkankercel; hela = baarmoederhalskankercel; MCF-10A = normale epitheelcel
Literatuuroverzicht
14
2.2.1 (1E,4E)-1,5-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)penta-1,4-dieen-3-on 15
Monocarbonylanaloog 15 met hetzelfde substitutiepatroon op de aromaten als curcumine (3-
methoxy, 4-hydroxy) vertoont reeds een antiproliferatieve activiteit voor verschillende
kankercellijnen bij een concentratie die 5 tot 6 keer lager is dan van curcumine 1.20 Dit bevestigt
onmiddellijk het grote potentieel van monocarbonylanalogen.
2.2.2 Gehalogeneerde analogen
Een groep van verbindingen die zeker het vermelden waard is, zijn de gehalogeneerde analogen.
Halogeenatomen worden ingebouwd in farmaceutische stoffen om o.a. de membraanpermeabiliteit
te verhogen en metabolische degradatie te verlagen.43 Dit zijn twee eigenschappen waar curcumine
minder goed op scoort, en die dus verbeterd kunnen worden. Bovendien zijn vijftig procent van de
meest toonaangevende medicijnen op de markt gehalogeneerd.44
Er zijn reeds veel gehalogeneerde monocarbonylanalogen van curcumine gesynthetiseerd en in vitro
getest. In deze groep vallen voornamelijk gehalogeneerde derivaten 38 en 39 op gezien hun
uitstekend antikankerpotentieel.
Verbinding 38 is een gefluoreerd bis-benzylideen-piperidinon (als azijnzuurzout), dat in vitro getest
werd op anti-angiogeneseactiviteit in melanoom- en borstkankercellen (zie bovenstaande tabel).23
Verder werd fluorderivaat 38 ook in vivo getest op borsttumoren van muizen. Men liet de tumor
twee weken groeien en daarna diende men gedurende twee weken een dosis van 100 mg/kg
subcutaan toe. Na 2 weken van toediening was het tumorgewicht gemiddeld 55% gedaald en werden
geen schadelijke neveneffecten waargenomen. Verbinding 38 lijkt dus veel potentieel te hebben als
chemotherapeutische stof en veel veiliger te zijn dan het hedendaags gebruikt antitumormiddel
Cisplatin.23 Wat de structuur-activiteitrelatie betreft, leidt fluorering op de orthopositie van beide
fenylgroepen tot een verbeterde cytotoxiciteit tegen kankercellen in vergelijking met curcumine.
Literatuuroverzicht
15
Fluorering op de meta- en/of parapositie daarentegen niet.23 Dit betekent dat zowel de natuur van
de substituenten als hun positie een rol speelt bij de activiteit.19
Een ander interessant gehalogeneerd analoog is verbinding 39.19 Deze gehalogeneerde verbinding
heeft een drie keer sterkere cytoxiciteit dan zijn niet gehalogeneerde variant. Daarenboven zorgen
de drie methoxygroepen, gesubstitueerd op de aromatische ringen, ook voor een sterk verhoogde
activiteit in vergelijking met de mono-, en di-gesubstitueerde varianten. Het belang van de drie
methoxygroepen wordt uitgebreider besproken in sectie 2.2.3
2.2.3 Analogen met trimethoxyfenylgroepen
Na evaluatie van de literatuur werd duidelijk dat de aanwezigheid van meerdere elektronenrijke
methoxygroepen op de aromatische ringen een positieve invloed heeft op de activiteit van
curcumine-analogen, daarom wordt een specifieke subsectie aan deze analogen besteed. Ohori et al.
(2006) waren de eersten die een analyse maakten omtrent de invloed van het aantal
methoxygroepen op de aromatische ringen. Ze concludeerden dat een toename leidde tot een hoger
potentieel tot groeionderdrukking van kankercellen en chemopreventie. Ze synthetiseerden
verbinding 40, die de eerste is in de reeks van monocarbonylanalogen met drie methoxygroepen.45
Bovendien is de plaats van de methoxygroepen ook niet onbelangrijk. Uit structuur-activiteitanalysen
werd geconcludeerd dat 3,4,5-trimethoxyfenylgroepen zorgen voor een sterk verhoogde
cytotoxiciteit (IC50 < 1 µM), veel meer dan bij verbindingen met methoxygroepen op de 2-, 3- en 4-
plaats.21
Later werd verbinding 41 gesynthetiseerd en geëvalueerd op groei-inhibitie van kankercellen en
selectiviteit (IC50 normale cel/IC50 kankercel).20 Deze stof heeft een zeer hoge selectiviteit van 25 en
een sterke anti-proliferatieve activiteit met IC50 waarden lager dan 1 micromolair.
Gezien de positieve resultaten die verbinding 40 en 41 opleverden, werd verder onderzoek gevoerd
naar hun specifieke effecten in de cel.46 Hun antikankeractiviteit uit zich ondermeer in de
Literatuuroverzicht
16
overproductie van ROS. ROS zijn reactieve zuurstofspecies, die enerzijds kanker kunnen veroorzaken
door hun inwerking op DNA, maar anderzijds wanneer ze in enorm grote hoeveelheid aanwezig zijn
in kankercellen kunnen leiden tot apoptose van de cel. Verbindingen 40 en 41 zijn zachte
elektrofielen, of meer bepaald Michaelacceptoren, waardoor ze gemakkelijk covalent gaan binden
met nucleofiele eiwitten, die een rol spelen in de werking van het redoxbuffersysteem van
kankercellen. Wanneer eiwitten gebonden zijn met deze analogen, wordt dit redoxbuffersysteem
verstoord, wat zorgt voor de overproductie van ROS. Verbinding 41 is een minder sterke ROS-
generator dan verbinding 40, maar is wel een betere Michaelacceptor in de destabilisatie van
tubuline en is bovendien beter opneembaar door de cel, waardoor verbinding 41 in het algemeen
een hogere cytotoxiciteit heeft (zie tabel).
Verbindingen 42, 43, 44 en 45 zijn ook hexagemethoxyleerde monocarbonylanalogen.21, 30 Deze
verbindingen bezitten een cyclische ketonlinker, waarvan verbindingen 43, 44 en 45 een
heterocyclische linker bevatten. Wanneer naar de cytotoxicteit gekeken wordt, is het zeer opvallend
dat deze drie heterocyclische analogen een veel sterkere cytotoxiciteit bezitten dan verbinding 42.
Dit zou mogelijk te wijten zijn aan een hogere curcumine-DNA-interactie van de heterocyclische
analogen.
2.2.4 Heteroaromatische analogen
Heteroaromatische analogen kunnen mogelijk een oplossing bieden voor de slechte
biobeschikbaarheid van curcumine en worden daarom frequent bestudeerd.35 Daarnaast beschrijft
Samaan et al. (2014) dat stikstofbevattende heteroaromatische ringen kunnen dienen als
veelbelovende bioisosteren van gesubstitueerde fenylringen.29 Over verschillende jaren heen zijn
honderdtallen heteroaromatische monocarbonylanalogen gesynthetiseerd en getest. Onderstaande
verbindingen 46 tot en met 55 blijken na screening naar cytotoxiciteit, selectiviteit en NF-B-
activatie-inhibitie naar voor te komen als meest interessante analogen.21, 29, 30, 35
Literatuuroverzicht
17
Verbinding 55 bezit een goed farmacologisch profiel (door de aanwezigheid van thiazoolringen en
trifluoromethylgroepen), en werd tezamen met verbinding 53 reeds verder onderworpen aan in vivo
testen. De farmacokinetische eigenschappen van deze verbindingen werden bepaald door een dosis
van één mg/kg van de te onderzoeken stof oraal toe te dienen aan testmuizen. Hierna werd de
concentratie van de stof in het bloed gemeten 30 min, 1, 2, 4 en 24 h na toediening. Verbinding 53
vertoonde in deze test een licht verbeterde biobeschikbaarheid, met een 2- tot 10-voudige toename
in plasmaconcentratie na 4 en 24 h, in vergelijking met curcumine. Een beter score werd bekomen
voor verbinding 55, waarbij een grote toename in concentratie van de stof in het bloedplasma werd
waargenomen in vergelijking met curumine (58-, 21-, 28-, 533- en 653-maal hogere plasma
concentratie na 0.5, 1, 2, 4, 24 h). Uit de test op kankercellijnen blijkt daarenboven dat verbinding 55
een 11 tot 36 keer sterker inhibitie-effect heeft dan curcumine. Deze combinatie van verhoogde
biobeschikbaarheid en activiteit zorgt ervoor dat verbinding 55 de therapeutische efficiëntie bezit om
cytotoxisch te zijn voor kankercellen.
Verbinding 46 en 50 werden, samen met verbinding 38 verder onderzocht op hun mogelijke inhibitie
van 50 soorten kinasen, relevant in vele vormen van kanker. Kinasen zijn enzymen die een
fosforylering kunnen uitvoeren van een specifiek doeleiwit en zo het eiwit gaan activeren, en dit
zorgt ervoor dat er bepaalde chemische reacties en vervolgens signaaltransducties in de (kanker)cel
Literatuuroverzicht
18
gaan plaatsvinden. De fosforylering gaat gepaard met verbruik van energie (ATP). Uit dit onderzoek
kwam verbinding 46 naar voor als beste inhibitor en vertoonde meer dan 85 procent inhibitie voor
10 van de enzymen bij 5 µM, terwijl 22 andere enzymen voor meer dan 40 procent geblokkeerd
werden bij die concentratie. Er zijn verscheidene redenen voor de inhibitie van de kinasen door
monocarbonylanalogen, maar de belangrijkste reden is de competitie met ATP. Deze studie kwam
dus tot de conclusie dat monocarbonylanalogen pleiotrope inhibitoren kunnen zijn op verschillende
plaatsen in verschillende pathways in de cel.47
2.3 Conclusie Door de eliminatie van het zwakke ‘hart’ van curcumine, namelijk de diketostructuur, blijken
monocarbonylanalogen zeer interessante bioisosteren te zijn van curcumine die reeds uitgebreid
werden onderzocht. In het algemeen worden deze analogen op eenzelfde manier gevormd, namelijk
via een zuur- of base-gekatalyseerde aldolcondensatiereactie tussen een al dan niet commercieel
beschikbaar keton en aromatisch aldehyde. In het tweede deel van deze literatuurstudie werd aan de
hand van enkele veelbelovende 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen aangetoond dat
monocarbonylanalogen veel potentieel bezitten als antikankergeneesmiddelen. Hierin is het duidelijk
geworden dat het soort linker en het substitutiepatroon op de aromatische ringen een belangrijke
invloed hebben op de mate van antikankeractiviteit. Roth et al. citeerde dat, door het toenemende
belang van “omen” (genoom, kinoom, proteoom, transcriptoom) en onze kunde om de complexe
pathways te verstaan en in kaart te brengen, deze monocarbonylanalogen een moleculaire klasse is
die in staat kan zijn meerdere enzymen te raken met een ‘magic shotgun’.48
Deze Masterproef haakt ook in op de synthese van analogen zonder een biologisch zwakke
diketogroep, door onderzoek te voeren naar de synthese van enamineanalogen van curcumine. De
synthese en evaluatie van monocarbonylanalogen zijn reeds zeer uitgebreid onderzocht, zoals blijkt
uit deze literatuurstudie. Daarentegen is het onderzoek naar enamineanalogen van curcumine een
quasi onontgonnen terrein. Desalniettemin bezitten enamineanalogen van curcumine evenzeer een
zeer interessant profiel. De aanwezigheid van een enaminestructuur in de verbinding zorgt voor de
vorming van een sterke interne waterstofbinding tussen de carbonylgroep en de aminogroep,
hetgeen mogelijk leidt tot een stabielere structuur dan curcumine. Daarnaast leidt de introductie van
een stikstof in de structuur tot een verhoogde polariteit. Beide fenomenen kunnen bijdragen ter de
vorming van meer stabiele en biobeschikbare analogen van curcumine.
Bespreking van de resultaten
19
3 Bespreking van de resultaten Deze Masterproef heeft als doel nieuwe enamineanalogen 11 en 12 van curcumine 1 en
bisdemethoxycurcumine 3 aan te maken met behulp van polaire aminen, om zo mogelijk de
oplosbaarheid van de verbindingen in water te verhogen. Voorgaande Masterproeven aan de
“SynBioC Research Group” van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) slaagden reeds in
de synthese van enamineanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met behulp van
minder polaire aminen, namelijk alkylaminen. Deze vertoonden echter geen verbeterde
wateroplosbaarheid in vergelijking met curcumine 1, maar wel een verhoogde activiteit en dan
voornamelijk de enamineanalogen van bisdemethoxycurcumine 3.9, 10, 11 Met het oog op de aanmaak
van enamineanalogen met een verhoogde wateroplosbaarheid en bioactiviteit werd in deze scriptie
gebruik gemaakt van meer polaire aminen. In dit hoofdstuk Bespreking van de resultaten, zal het
onderzoek naar de synthese van deze enamineanalogen toegelicht worden: In een eerste deel zullen
de reacties, met hun reactieomstandigheden, opwerking en zuivering in detail besproken worden,
waarbij een opdeling gemaakt wordt volgens het gebruikte polair amine. Vervolgens zullen in een
tweede deel de bekomen resultaten op een rijtje gezet worden en punten worden aangehaald
waarop gelet moeten worden bij de biologische testing van de gesynthetiseerde derivaten.
3.1 Synthese van nieuwe stikstofanalogen van curcumine 1 en
bisdemethoxycurcumine 3 In preliminair onderzoek betreffende de synthese van enamineanalogen van curcumine werd
gezocht naar een optimale methode voor de iminering van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine
3.9, 10 Na vele experimenten bleek de iminering van curcumine 1 met het gewenste alkylamine het
best te lukken onder microgolfbestraling (MW) in chloroform als solvent en met montmorillonietklei
en azijnzuur als katalysatoren. De iminering van bisdemethoxycurcumine 3 verliep niet goed in
chloroform, daarom werd gezocht naar een alternatief solvent om de reactie in uit te voeren. Na
grondige screening bleek 2-methyltetrahydrofuran een geschikt solvent.10
Bespreking van de resultaten
20
De toevoeging van een overmaat amine en azijnzuur bleek essentieel te zijn voor de volledige
omzetting van curcumine 1 of bisdemethoxycurcumine 3. Wat de zuivering van het reactiemengsel
betreft werden problemen ondervonden voor de bisdemethocurcuminedervaten 10a-c. Deze konden
niet gezuiverd worden via kolomchromatografie over silica (Hex/EtOAc 3/2) daar ze afgebroken
werden op de zure silicakolom. Daarom werd steeds kristallisatie toegepast, met lagere
rendementen tot gevolg (11-40 %), ten opzichte van de curcuminederivaten 9e-g (48-58 %).10
In deze Masterproef werd voor de synthese van enamineanalogen 11 en 12 van curcumine 1 en
bisdemethoxycurcumine 3 met polaire aminen vertrokken vanuit bovenstaande geoptimaliseerde
methode. In het algemeen bestaat het reactiemechanisme voor de synthese van enamineanalogen
van curcumine uit een nucleofiele additie van het amine aan één van de carbonylgroepen van
curcumine 1 of bisdemethoxycurcumine 3 en een daaropvolgende eliminatie van water. Azijnzuur is
als zure katalysator nodig om de carbonylgroep te activeren. De montmorillonietklei doet ook dienst
als zure katalysator en eveneens als droogmiddel.
Hieronder zullen de pogingen tot en de synthese van de verschillende enamineanalogen van
curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met gebruik van polaire aminen in detail toegelicht
worden. Door middel van de variabelen tijd en temperatuur werd gezocht naar de optimale
omstandigheden om de eindproducten te bekomen. De reacties werden steeds uitgevoerd op kleine
schaal: 1 mmol beginproduct en 5 ml solvent. Onderstaande bespreking is opgedeeld volgens het
soort polair amine dat gebruikt werd. In deze Masterproef werden twee typen van polaire aminen
onderzocht, namelijk aminoalcoholen en aminoëthers. In de toekomst zouden nog tal van andere
aminen kunnen worden onderzocht, zoals beschreven in deel 1.2 Doel.
Bespreking van de resultaten
21
3.1.1 Synthese van enamineanalogen van curcuminoïden door nucleofiele aditie van
aminoalcoholen
De iminering van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 werd uitgevoerd met twee soorten
aminoalcoholen, namelijk 2-amino-1-ethanol en 3-amino-1-propanol.
Zoals te zien in onderstaand reactieschema voor de synthese van enamineanalogen van curcumine 1
werd tijdens deze reactie niet enkel het gewenste enamineanaloog 56 gevormd maar ook een
cyclisch nevenproduct 57 met een 2,3-dihydropyridinonstructuur.
In Tabel 4 worden de verschillende pogingen die ondernomen werden om analogen 56a en b te
synthetiseren weergegeven. In de tabel worden onder meer de reactieomstandigheden, de
omzetting, de verhouding enamineanaloog/nevenproduct (56/57) en het rendement na zuivering
weergegeven.
Tabel 4. Verschillende pogingen tot synthese van analogen 56a en 56b
Reactie n Equiv. amine
Temp. (°C)
Tijd Solvent Equiv. Azijn-zuur
MK10 (massa-equiv.)
Omzet-ting (%)
a
Verhou-ding
56/57b
Rende-ment 56 (%)
1 1 5 80 1h30 2-Me-THF 1,2 1 0 -c
-d
2 1 10 100 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 0 -c
-d
3 1 10 100 1h30 EtOH 2,4 1,6 100
59/41 -d
4 1 10 80 1h30 EtOH 2,4 1,6 100 -c
10
5 1 10 80 1h EtOH 2,4 1,6 100 87/13 3
6 1 10 70 1h EtOH 2,4 1,6 100 59/41 9
7 1 10 50 1h EtOH 2,4 1,6 100 -c
-d
8 1 10 80 30min EtOH 2,4 1,6 100 63/37 -e
9 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,6 100 82/18 11
10 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,6 100 -c 8
(57 = 12) a bepaald aan de hand van LC-MS en
1H-NMR
b bepaald aan de hand van
1H-NMR
c verhouding moeilijk te bepalen door overlappende signalen
d zuivering niet gelukt
e zuivering niet uitgevoerd
Bespreking van de resultaten
22
In voorafgaand onderzoek bleek de iminering van curcumine 1 het best te lukken in chloroform als
solvent.10 Aangezien het gebruik van gehalogeneerde solventen zoveel mogelijk moet vermeden
worden, werd bij de start van deze Masterproef gebruik gemaakt van 2-methyltetrahydrofuran (2-
methyl-THF) om de eerste reacties in uit te voeren. Dit solvent werd in voorgaande Masterproef
reeds gebruikt voor synthese van enamineanalogen 10a-c van bisdemethoxycurcumine 3. Al snel
werd duidelijk dat 2-methyl-THF niet het geschikte solvent was voor de synthese van
enamineanalogen 56a en b met behulp van aminoalcoholen (reactie 1-2, Tabel 4). De
aminoalcoholen, en meer algemeen polaire aminen, lossen minder goed op in 2-methyl-THF dan
minder polaire aminen, hetgeen ervoor zorgde dat het reactiemengsel onmiddellijk veranderde in
een viskeus mengsel en de reactie niet goed doorging. Daarom werd overgestapt naar het meer
polaire ethanol als solvent, en daarin verliep de reactie wel vlot (reactie 3-10, Tabel 4).
In reactie 3, Tabel 4 werd als reactietemperatuur 100 °C en een reactietijd van 90 minuten gebruikt.
Dit resulteerde echter in zeer onzuivere 1H-NMR-spectra (d6-DMSO) en LC-MS-spectra. Vervolgens
werden de reacties uitgevoerd bij lagere temperaturen (reactie 4-8) en een kortere reactietijd
(reactie 5-8). Steeds werd een omzetting van 100 % bekomen. Aan de hand van 1H-NMR-spectra (d6-
DMSO) en LC-MS-spectra kon geconcludeerd worden dat 80 °C en een reactieduur van één uur de
beste reactieomstandigheden zijn. Daarnaast kon opgemerkt worden dat bij deze
reactieomstandigheden de kleur van het reactiemengsel het best aansloot bij de kleur van het
uiteindelijk bekomen zuiver eindproduct, namelijk oranje. Daarom werden voor de synthese van
enamineanaloog 56b deze geoptimaliseerde reactieomstandigheden eveneens toegepast (reactie 9-
10, Tabel 4).
Zoals kan opgemerkt worden uit Tabel 4 werden enamineanalogen 56a en b in lage rendementen
bekomen na zuivering. De lage rendementen zijn te verklaren door verschillende factoren, namelijk
een moeilijke opwerking van het reactiemengsel, de vorming van nevenproduct 57a en b, en de
moeilijke zuivering van enamineanalogen 56a en b. Deze factoren zullen hieronder in detail worden
besproken.
De enamineanalogen 56a en b lossen enkel op in ethanol, methanol, dimethylsulfoxide en
dimethylformamide en hadden een minder goede oplosbaarheid in aceton, 2-methyl-THF en
ethylacetaat. Door deze slechte oplosbaarheid was de opwerking van het reactiemengsel een lastige
stap die vaak leidde tot rendementsverlies. De opwerking bestond uit het wassen van het
reactiemengsel (d.m.v. extractie) met een verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat in water en
pekel om onzuiverheden uit het reactiemengsel te halen. Het gebruik van zuiver ethanol, het solvent
waarin reacties 3 tot en met 10 (Tabel 4) doorgingen, als organische fase is niet mogelijk aangezien
Bespreking van de resultaten
23
ethanol een polair protisch organisch solvent is dat mengt met organische solventen maar ook met
water. Wanneer het reactiemengsel in ethanol gewassen zou worden met een verzadigde oplossing
van natriumbicarbonaat in water en pekel, zou er vervolgens geen scheiding optreden. Om een
scheiding te krijgen moest daarom een grote overmaat aan organisch solvent, dat niet mengt met
water, toegevoegd worden bij de extractie zodat ethanol samen met het gewenste product
grotendeels naar deze organische fase getrokken werd. Daarom werd een grote overmaat
ethylacetaat toegevoegd. Maar door de minder goede oplosbaarheid van de enamineanalogen 56a
en b in ethylacetaat en de aanwezigheid van een minimale hoeveelheid ethanol, om de
oplosbaarheid van de analogen te waarborgen, ging er steeds een deel van de gewenste analogen
naar de waterige fase, gezien ethanol een polair protisch solvent is. De waterige fase moest daarom
meerdere malen gewassen worden met ethylacetaat, en dan nog werd het gewenste product niet
volledig uit de waterige fase onttrokken.
In het algemeen werd ieder reactieproduct in deze Masterproef, op enkele uitzonderingen na,
gezuiverd via kolomchromatografie over silica met een daaropvolgende herkristallisatie in een
geschikt solvent(mengsel). In de 1H-NMR-spectra (d6-DMSO) van de gewenste fractie na
kolomchromatografie waren meestal nog ongewenste signalen aanwezig, waardoor een
daaropvolgende herkristallisatie noodzakelijk was. Deze dubbele zuivering is één van de redenen
voor de lage rendementen van de bekomen enamineanalogen. Verschillende solventmengsels
werden uitgeprobeerd voor de zuivering van verbindingen 56a en b via kolomchromatografie over
silica (aceton: reactie 3, Tabel 4; EtOAc: reactie 4, 5 en 9, Tabel 4; EtOAc/MeOH 99/1: reactie 6 en 7,
Tabel 4; PE/EtOAc/MeOH 9/9/2: reactie 10, Tabel 4). De beste resultaten werden bekomen wanneer
als eluens, EtOAc/MeOH 99/1 of PE/EtOAc/MeOH 9/9/2 werd gebruikt (reactie 6 en 10, Tabel 4). De
daaropvolgende herkristallisatie vond telkens plaats in methanol of in ethanol/hexaan (15/1). Dit
leverde de gewenste verbindingen in rendementen gaande van 3 tot 11 procent. In reactie 10, Tabel
4 werd cyclisch nevenproduct 57b zuiver bekomen in een rendement van 12 %. In 3.1.1.1 worden de
cyclische nevenproducten meer in detail besproken.
Vervolgens werd de iminering van bisdemethoxycurcumine 3 met aminoalcoholen uitgevoerd,
wederom 2-amino-1-propanol en 3-amino-1-propanol. Hieronder staat het reactieschema afgebeeld
en in Tabel 5 worden de verschillende pogingen die ondernomen werden om analogen 58a en b te
synthetiseren weergegeven.
Bespreking van de resultaten
24
Tabel 5. Verschillende pogingen tot synthese van analogen 58a en 58b
Reactie n Equiv. amine
Temp. (°C)
Tijd Solvent Equiv. Azijn-zuur
MK10 (massa- equiv.)
Omzet-ting (%)
a
Verhou-ding
58/59b
Rende-ment 58
(%)
1 1 10 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 67/33 -d
2 1 10 50 1h EtOH 2,4 1,9 100 -c
-d
3 1 10 90 1h EtOH 2,4 1,9 100 63/37 -d
4 1 10 90 1h30 EtOH 2,4 1,9 100 63/37 -d
5 1 5 90 1h EtOH 2,4 1,9 100 -c
8
6 2 10 70 1h EtOH 2,4 1,9 100 -c
-d
7 2 10 90 1h30 EtOH 2,4 1,9 100 63/37 -d
8 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 63/37 18
a bepaald aan de hand van LC-MS en
1H-NMR
b bepaald aan de hand van
1H-NMR
c verhouding moeilijk te bepalen door overlappende signalen
d zuivering niet gelukt
e zuivering niet uitgevoerd
Opnieuw werd gezocht naar de optimale reactieomstandigheden om verbindingen 58a en b te
synthetiseren. In reactie 3, Tabel 5 werd een reactietijd van 60 minuten toegepast, terwijl in reactie
4, Tabel 5 een tijd van 90 minuten gebruikt werd. Er was geen verschil in LC-MS- en 1H-NMR-spectra
(d6-DMSO) na reactie voor beide pogingen, waardoor één uur volstaat als reactietijd. Uiteindelijk kan
geconcludeerd worden dat de reactie het best doorgaat bij een temperatuur van 90 °C en een tijd
van één uur.
Opnieuw vormde de opwerking van bisdemethoxycurcuminederivaten 58a en b een lastige stap, die
reeds besproken werd voor analogen 56a en b. De zuivering was evenzeer een zeer moeilijke stap.
Sterker nog, de zuiveringen van analogen 58a en b waren de moeilijkste van heel deze scriptie. Zoals
reeds weergegeven in de inleiding, was in voorgaande Masterproef zuivering van
bisdemethoxyderivaten 10a-c door middel van kolomchromatografie niet mogelijk door afbraak van
Bespreking van de resultaten
25
de enamineanalogen op silica. Aangezien de 1H-NMR-spectra na opwerking van alle reacties uit Tabel
5 niet zuiver waren en bijgevolg kristallisatie onmogelijk was, was er geen andere mogelijkheid dan
zuivering door middel van kolomchromatografie toe te passen voor enamineanalogen 58a en b.
Meerdere pogingen (reactie 1, 2 en 6, Tabel 5) van zuivering met kolomchromatografie over silica
mislukten echter, door afbraak van het product op de silicakolom. Daarna werd zuivering via
'reversed phase' kolomchromatografie toegepast met een initieel eluens van methanol/water 40/60
die gradueel steeg in de tijd tot honderd procent methanol. Na meerdere pogingen (reactie 3, 4 en 7,
Tabel 5) voor 58a en b was het resultaat negatief. Dit zou kunnen te wijten zijn aan een
onmiddellijke afbraak van de verbindingen door water, dat ofwel het imine hydrolyseert naar een
keton ofwel een retroaldolcondesatie kan veroorzaken, met dissociatie van het enamineanaloog 58
tot gevolg.
Na vele pogingen van zuivering door middel van kolomchromatografie en het testen van
verschillende eluensen kon volgende vaststelling gemaakt worden: aangezien methanol één van de
enige solventen is waar enamineanalogen 58a en b van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3
goed in oplossen, moet het eluens een hoeveelheid methanol bevatten (‘normal phase’
kolomchromatografie laat een maximale hoeveelheid van 10 % toe), waardoor de slaagkans op
zuivering vergroot en een beter rendement kan bekomen worden. Verbinding 58a (reactie 5, Tabel 5)
en 58b (reactie 8, Tabel 5) werden uiteindelijk zuiver bekomen door middel van ‘normal phase’
kolomchromatografie over silica met PE/EtOAc/MeOH (9/9/2) en EtOAc/MeOH (98/2) als eluens, in
rendementen van 8 en 18 procent respectievelijk. Dit laatste rendement is relatief hoog aangezien
geen herkrsitallisatie nodig was na kolomchromatografie.
In volgende subsectie zal de synthese van de cyclische nevenproducten met een 2,3-
dihydropyridinonstructuur in detail worden toegelicht.
3.1.1.1 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57 en 59
Bij de analyse van de LC-MS-spectra van de ruwe reactiemengsels (van alle reacties uit Tabel 4 en 5)
viel op dat er niet één, maar twee signalen (met een verschillende retentietijd) correspondeerden
met de massa van het verwachte product. Eén van de twee signalen kwam overeen met het
verwachte product 56a, 56b, 58a of 58b en het andere signaal correspondeerde met het
nevenproduct 57a, 57b, 59a of 59b.
Bespreking van de resultaten
26
In de literatuur werd een studie teruggevonden waarin de synthese van zo’n 2,3-hydropyridin-4-onen
werd beschreven uitgaande van zuiver curcumine 1 en een alkylamine (methyl-, ethyl-, propyl-,
butyl-, hexyl-, benzyl-, fenyl- en tolylamine).49 De 2,3-hydropyridin-4-onen 61 worden gevormd door
een intramoleculaire 1,4-additie of Michaëladditie van het nucleofiel stikstofatoom van het
enamineanaloog 60 aan de ,-onverzadigde binding naast de carbonylfunctie van enamineanaloog
60 met vorming van een 2,3-hydropyridin-4-on-structuur.
Enamineanalogen van curcumine 1, die het doel waren van deze Masterproef, werden in deze
literatuurstudie enkel vermeld als tussenproducten 60, zoals in het schema weergegeven. De
rendementen na zuivering van de 2,3-hydropyridin-4-onen 61 lagen tussen de 7 en 41 procent.49 Uit
deze lage waarden kan met een grote waarschijnlijkheid geconcludeerd worden dat de
enamineanalogen 60 ook aanwezig waren in het ruwe mengsel na reactie, maar deze werden dus
niet gezuiverd en beschreven.
In Tabel 6 worden karakteristieke 1H-NMR-waarden (in d6-DMSO) van 2,3-hydropyridin-4-onen 61,
die beschreven staan in dit artikel, weergegeven.49 Aan de hand van deze karakteristieke 1H-NMR-
waarden werd voor iedere imineringsreactie in deze Masterproef, waar mogelijk, op basis van 1H-
Bespreking van de resultaten
27
NMR-spectra (d6-DMSO) een benaderde verhouding enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on
bepaald. De verhoudingen staan weergegeven in voorgaande Tabellen 4 en 5 en volgende Tabellen 8
en 9.
Tabel 6. Karakteristieke 1H-NMR-waarden (d6-DMSO) van 2,3-hydropyridin-4-onen 61
H ppm Multiplet Koppelingsconstante J (Hz)
2-H +/- 4,70 M -
3-Ha +/- 2,40 d × d 16, 5
3-Hb +/- 2,80 d × d 16, 5
5-H +/- 5,05 S -
In voorgaande Masterproef10 werd het cyclisch nevenproduct niet opgemerkt. Daarom werden de
1H-NMR-spectra (CDCl3) van deze eerdere studies terug bovengehaald en werden, waar mogelijk, aan
de hand van de karakteristieke 1H-NMR-signalen uit Tabel 6 de verhoudingen enamineanaloog/2,3-
hydropyridin-4-on (9/62 of 10/63) bepaald, dewelke terug te vinden zijn in Tabel 7.
Bespreking van de resultaten
28
Tabel 7. Verhoudingen van enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on (9/62 of 10/63) voor verschillende reactiemengsels
Startproduct Eindproduct Equiv. Azijnzuur Solvent Verhouding 9/62 of 10/63a
1 9e 5 CHCl3 80/20 1 9f 5 CHCl3 91/9 1 9g 5 CHCl3 -
b
3 10a 5 2-Me-THF 67/33 3 10b 10 2-Me-THF -
b
3 10c 7 2-Me-THF 97/3 a bepaald aan de hand van
1H-NMR
b verhouding moeilijk te bepalen door overlappende signalen
In Tabel 7 valt het op dat in het algemeen minder nevenproduct 62 of 63 gevormd werd dan in de
reacties uitgevoerd in deze Masterproef. Dit zou kunnen verklaard worden door het gebruik van
ethanol, het toegepaste solvent in deze Masterproef, in vergelijking met chloroform of 2-methyl-THF,
de gebruikte solventen in voorgaande Masterproef. Nog een opvallend fenomeen is dat de
verhouding enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on voor isobutylamine relatief laag is in vergelijking
met sec-butylamine en cyclohexylamine. Dit kan te wijten zijn aan de hogere graad van sterische
hinder bij het 2,3-hydropyridin-4-onanaloog in het geval van sec-butyl- en cyclohexylamine.
In deze Masterproef werd getracht de cyclische nevenproducten zuiver te bekomen gezien hun
mogelijke biologische relevantie. Heterocyclische ringen zijn alomtegenwoordig in het onderzoek
naar verbindingen met antikankeractiviteit. In een studie wordt de aanwezigheid van
stikstofbevattende heterocyclische ringen in structuren vermeld als één van de redenen voor
antikankeractiviteit van verbindingen.50 Bovendien wanneer teruggegaan wordt naar het tweede
deel van deze scriptie, Literatuurstudie, bleken de monocarbonylanalogen 14 met een piperidin-4-
on-linker in de structuur veelbelovende verbindingen te zijn.
a) 2,3-Dihydropyridin-4-on 57b bekomen als nevenproducten bij de synthese van
enamineanalogen 56b
In reactie 10, Tabel 4 werd het 2,3-dihydropyridinonanaloog 57b, als nevenprocuct bekomen van het
enamineanaloog 56b.
Bespreking van de resultaten
29
Verbinding 57b werd bekomen in een rendement van 12 % na kolomchromatografie over silica met
PE/EtOAc/MeOH (9/9/2) als eluens en een daaropvolgende herkrisallisatie in methanol. Bij de
preparatieve TLC had het cyclisch nevenproduct 57b een Rf-waarde van 0,08 en het enamineanaloog
57b had een Rf-waarde van 0,20. In het algemeen elueren de cyclische nevenproducten altijd later
dan de enamineanalogen tijdens ‘normal phase’ kolomchromatografie.
b) 2,3-Dihydropyridin-4-on 59a bekomen d.m.v. geoptimaliseerde omstandigheden
In het onderzoek naar de synthese van de 2,3-dihydropyridinonanalogen van curcumine 1 en
bisdemethoxycurcumine 3 als beoogde reactieproducten werden reeds enkele routes getest.
De procedure voor de synthese van 2,3-dihydropyridinonanalogen van curcumine 1 beschreven in
eerder besproken studie 49 werd toegepast op curcumine 1 en 2-amino-1-ethanol als amine.
Net zoals in deze studie werd het reactiemengsel geroerd gedurende 24 uur zonder solvent.
Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende 120 seconden onder microgolfbestraling gebracht bij
300 Watt. In het artikel werd een commerciële microgolfoven gebruikt met een wattage van 400,
maar deze apparatuur was niet beschikbaar. Er werd een gespecialiseerd toestel, specifiek voor
chemische experimenten, met een maximaal bereik van 300 Watt gebruikt. Uit het LC-MS- en 1H-
NMR-spectrum (d4-MeOD) na reactie bleek geen volledige omzetting te hebben plaatsgevonden.
Aan de hand van het 1H-NMR-spectrum werd de omzetting bepaald en die bedroeg 44 procent. Er
werd eveneens vastgesteld dat niet enkel 2,3-dihydropyridinonanaloog 57a aanwezig was, zoals in de
studie gesuggereerd werd, maar ook enamineanaloog 56a in een verhouding van 55/45
(enamineanaloog/2,3-dihydropyridinon 56a/57a). In de studie werd het enamineanaloog immers
enkel als intermediair reactieproduct vermeld. Het reactiemengsel werd verder niet gezuiverd
aangezien er geen volledige omzetting plaatsvond.
Bespreking van de resultaten
30
In een volgende poging ter vorming van het 2,3-dihydropyridinonanaloog als hoofdproduct werd de
gebruikelijke procedure voor de synthese van enamineanaloog 58a in deze Masterproef aangepast
door de reactie uit te voeren bij een langere reactietijd. De reactie werd uitgevoerd gedurende 4 uur
onder microgolfstraling.
.
Aan de hand van het 1H-NMR-spectrum (d4-MeOD) werd bepaald dat er volledige omzetting
plaatsvond en dat de verhouding enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on (58a/59a) 50/50 bedroeg.
Deze waarde is iets lager dan de waarden in Tabel 4 en 5 maar hieruit kunnen nog geen verdere
conclusies getrokken worden, aangezien het verschil niet significant is. Het cyclische nevenproduct
59a werd zuiver bekomen in een rendement van 9 procent, daarenboven werd het enamineanaloog
58a ook zuiver bekomen in een rendement van 8 procent, beiden na kolomchromatografie over silica
met PE/EtOAc/MeOH (9/9/2) als eluens en een daaropvolgende herkristallisatie in methanol.
Wegens tijdsgebrek kon niet verder ingegaan worden op de verdere optimalisatie van de methode
voor de synthese van de 2,3-dihydropyridinonen. Maar indien na biologisch testen van 59a zou
blijken dat deze een hogere activiteit bezit dan het enamineanaloog 58a, zou in de toekomst kunnen
worden gezocht naar optimale reactieomstandigheden om de cyclische nevenproducten als
hoofdproducten te bekomen.
3.1.2 Synthese van enamineanalogen van curcuminoïden door nucleofiele aditie van
aminoëthers
In 3.1.1 werd de iminering van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met aminoalcoholen
uitvoerig besproken. Een tweede groep van polaire aminen die gebruikt werd, zijn de aminoëthers,
respectievelijk 2-methoxyethylamine en 3-methoxypropylamine. Hieronder wordt het reactieschema
gegeven voor de synthese van enamineanalogen 64a en b van curcumine 1 met 2-
methoxyethylamine en 3-methoxypropylamine. Wederom werden de cyclische nevenproducten 65a
en b waargenomen. In Tabel 8 zijn de verschillende pogingen te vinden voor deze reactie.
Bespreking van de resultaten
31
Tabel 8. Verschillende pogingen tot synthese van analogen xa en xb
Reactie
n Equiv. amine
Temp. (°C)
Tijd Solvent
Equiv. Azijn-zuur
MK10 (massa-equiv.)
Omzet- ting (%)
a
Verhou-ding
64/65b
Rende- ment 64 (%)
1 1 10 100 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 100 -c
2
2 1 10 100 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 100 67/33 9
3 1 5 80 1h15 2-Me-THF 2,4 1,6 46
-d
-e
4 1 10 80 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 50 -c
-e
5 1 10 100 1h 2-Me-THF 2,4 1,6 100 -c
-d
6 1 10 70 1h EtOH 2,4 1,6 100 -c
40
7 2 10 90 1h EtOH 2,4 1,6 100 53/47 -d
8 2 10 90 1h DMF 2,4 1,6 100 80/20 3
9 2 10 90 1h DMF 2,4 1,6 100 -c
11
a bepaald aan de hand van LC-MS en
1H-NMR
b bepaald aan de hand van
1H-NMR
c verhouding moeilijk te bepalen door overlappende signalen
d zuivering niet gelukt
e zuivering niet mogelijk wegens onvolledige omzetting
In reactie 1 tot en met 5 (Tabel 8) werd de reactie uitgevoerd in 2-methyl-THF. De reactie bleek
volledig door te gaan bij een temperatuur vanaf 100 °C. In het algemeen waren de enamineanalogen
van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met aminoëthers beter oplosbaar in verschillende
solventen dan deze met aminoalcoholen. Dit is de reden waarom de reactie voor de vorming van
analogen 64a en b doorging in 2-methyl-THF, terwijl dit voor analogen 56a en b niet het geval was. In
reactie 6 (Tabel 8) werd ethanol gebruikt als solvent. Dit solvent liet toe de reactie uit te voeren bij
mildere omstandigheden. Het enamineanaloog 64a werd zuiver bekomen door middel van
kolomchromatogafie over silica (EtOAc/PE 4/1) in een mooi rendement van 40 procent. Dit relatief
hoog rendement is wederom te wijten aan het feit dat geen herkristalliatie nodig was tijdens de
zuivering. Tevens is door de betere oplosbaarheid van enamineanalogen 64a en b in verschillende
solventen geen methanol vereist in het eluens gebruikt bij de kolomchromatografie.
Bespreking van de resultaten
32
In reactie 7 tot en met 10 (Tabel 8) werd 3-methoxypropylamine gebruikt voor de iminering van
curcumine 1. De reactie werd eerst uitgevoerd in ethanol. Door oplosbaarheidproblemen tijdens de
opwerking, bleek ethanol echter geen geschikt solvent voor de synthese van derivaat 64b. Daarom
werd overgeschakeld naar dimethylformamide (DMF) als solvent om problemen tijdens de
opwerking van het reactiemengsel te omzeilen. Wanneer gekeken wordt naar reactie 7 en 8 (Tabel 8)
waar dezelfde reactieomstandigheden toegepast werden, behalve het solvent, valt het op dat de
verhoudingen 64/65 verschillend zijn. In reactie 7, waar ethanol gebruikt wordt, wordt veel meer
nevenproduct gevormd dan in reactie 8, waar DMF gebruikt wordt. Dus ethanol heeft
hoogstwaarschijnlijk een stimulerend effect op vorming van het cyclisch nevenproduct 65b. Dit werd
hiervoor (in sectie 3.1.1.1) reeds als reden aangehaald waarom in vorige Masterproef minder
nevenproduct werd gevormd, gezien de reacties daar uitgevoerd werden in chloroform en 2-methyl-
THF en niet in ethanol. De sterkere nevenproductvorming in ethanol zou kunnen verklaard worden
door waterstofbrugvorming. In het algemeen zijn enamineanalogen gestabiliseerd door een
intramoleculaire waterstofbinding tussen de aminogroep en de carbonylgroep, weergegeven als een
stippenlijn in het eerste intermediair in onderstaande figuur. Wanneer het enamineanaloog echter in
ethanol opgelost wordt kan ethanol intermoleculaire waterstofbindingen gaan vormen met het
enamineanaloog waardoor de tweede intermediaire toestand gestabiliseerd zal worden en bijgevolg
de vorming van het cyclisch nevenproduct gemakkelijker zal gebeuren. In solventen die geen
waterstofbindingen kunnen vormen, zoals DMF, kan deze tweede intermediaire toestand niet
gestabiliseerd worden waardoor cyclische nevenproducten minder gemakkelijk zullen gevormd
worden.
Vervolgens wordt in onderstaand schema de iminering van het curcuminoïde
bisdemethoxycurcumine 3 met aminoëthers, ter vorming van enamineanalogen 66a en b en
cyclische nevenproducten 67a en b, afgebeeld. In Tabel 9 worden de verschillende pogingen in detail
weergegeven.
Bespreking van de resultaten
33
Tabel 9. Verschillende pogingen tot synthese van analogen 66a en 66b
Reactie n Equiv. amine
Temp. (°C)
Tijd Solvent Equiv. Azijn-zuur
MK10 (massa-equiv.)
Omzet-ting (%)
a
Verhou-ding
66/67
Rende-ment 66
(%)
1 1 10 100 1h 2-Me-THF 2,4 1,9 100 -c
-d
2 1 10 90 1h EtOH 2.4 1,9 100 71/29 32 3 1 10 70 1h EtOH 2,4 1,9 100 50/50 -
e
4 2 10 90 1h EtOH 2,4 1,9 100 67/33 -d
5 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 63/37 (67 = 2)
6 2 5 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 53/47 22
(67 = 3)
a bepaald aan de hand van LC-MS en
1H-NMR
b bepaald aan de hand van
1H-NMR
c verhouding moeilijk te bepalen
d zuivering niet gelukt
e zuivering niet uitgevoerd
Reactie 1, Tabel 9 vond plaats in 2-methyl-THF en gaf een omzetting van 100 procent. De zuivering
door middel van kolomchromatografie over silica (EtOAc) mislukte echter. Wederom vond afbraak
van het product plaats door de algemene gevoeligheid van bisdemethoxycurcuminederivaten op
silica. Bij reactie 2 in ethanol werd het bekomen product gezuiverd via 'reversed phase'
kolomchromatografie met als initieel eluens methanol/water 40/60 die gradueel steeg in de tijd tot
honderd procent methanol. Via deze methode werd verbinding 66a zuiver bekomen in een
rendement van 32 procent. Opnieuw een relatief hoog rendement gezien herkristallisatie niet nodig
was, dit in tegenstelling tot de rendementen waarbij wel een extra zuivering met behulp van
herkristallisatie nodig was.
In reacties 4, 5 en 6 (Tabel 9) werden imineringsreacties uitgevoerd op bisdemethoxycurcumine 3
met 3-methoxypropylamine. In reactie 4 kon het enamineanaloog 66b niet zuiver bekomen worden
na kolomchromatografie over silica (EtOAc/MeOH 99/1) en herkristallisatie. In reactie 5 en 6 werd
Bespreking van de resultaten
34
het methanolpercentage in het eluensmengsel voor kolomchromatografie opgedreven tot
respectievelijk 2 en 10 procent. In reactie 5 werd enkel nevenproduct 67b zuiver verkregen na
herkristallisatie in methanol en in reactie 6 werden enamineanaloog 66b en nevenproduct 67b zuiver
bekomen na herkristallisatie in methanol, in rendementen van 22 en 3 procent respectievelijk.
3.1.2.1 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 65 en 67
Bij de imineringsreacties uitgevoerd met aminoëthers kon aan de hand van de LC-MS- en 1H-NMR-
spectra (d6-DMSO) geconcludeerd worden dat ook hier de cyclische nevenproducten met een 2,3-
dihydropyridinonstructuur prominent aanwezig waren. De verhoudingen enamineanaloog/2,3-
hydropyridin-4-on, bepaald aan de hand van 1H-NMR-spectra (d6-DMSO), zijn terug te vinden in
Tabellen 8 en 9. In reactie 5 en 6 (Tabel 9) werd het 2,3-dihydropyridin-4-on 67b zuiver verkregen als
nevenproduct van de imineringsreactie in rendementen van 2 en 3 procent. Verbinding 67b (Rf-
waarde = 0,18) elueerde opnieuw na het hoofdproduct (Rf-waarde = 0,44) tijdens de
kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH 9/9/2) en vertoonde dus de grootste affiniteit voor de
polaire silicakolom.
3.2 Oplosbaarheid en biologische testing Met succes werden acht nieuwe enamineanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3,
met een polaire aminogroep, gesynthetiseerd. Er werd tevens in geslaagd, door een onverwachte
wending in dit onderzoek, drie cyclische nevenproducten met een 2,3-dihydropyridinonstructuur
zuiver te bekomen. Deze samen vormen een mooie bibliotheek van elf nieuwe curcumineanalogen,
hieronder weergegeven in Figuur 2, die in een volgende stap getest kunnen worden op hun
bioactiviteit en wateroplosbaarheid.
Zoals reeds aangegeven in 1.2 Doel, was de intentie van deze Masterproef de synthese van
enamineanalogen met een verhoogde oplosbaarheid in water, en een daarmee gepaard gaande
verlaagde partitiecoëfficiënt, in vergelijking met reeds gesynthetiseerde enamineanalogen in vorig
onderzoek.9, 10 De partitiecoëfficiënt is de verhouding van de concentraties van een bepaalde stof in
oplossing in respectievelijk 1-octanol en water, bij gelijke temperatuur. Hoe lager de verhouding, hoe
meer hydrofiel de stof is. Aan de hand van het computerprogramma ‘ChemDraw’ kan de (logaritme
Bespreking van de resultaten
35
van) de partitiecoëfficiënt van stoffen benaderd worden. De theoretische logaritme van de
partitiecoëffiënt (LogP) werd op deze manier bepaald voor curcumine 1, bisdemethoxycurcumine 3,
de acht nieuwe enamineanalogen (56a,b, 58a,b, 64a,b en 66a,b), de drie 2,3-dihydropyridinanalogen
(57b, 59a en 67b), en de enamineanalogen (9a-g en 10a-c), gesynthetiseerd in voorgaand
onderzoek.9, 10 Deze waarden zijn weergegeven in Tabel 10.
Tabel 10. Theoretische partitiecoëfficiënten van curcumine, bisdemethoxycurcumine, enamineanalogen en 2,3-dihydropyridinanalogen
Verb. LogP Verb. LogP Verb. LogP
1 2,56 9g 3,85 64a 2,04 3 2,81 10a 3,78 64b 2,15
9a 3,13 10b 3,70 66a 2,40 9b 2,96 10c 4,11 66b 2,51 9c 3,14 56a 1,79 57b 1,61 9d 3,55 56b 1,89 59a 1,76 9e 3,53 58a 2,15 67b 2,23 9f 3,45 58b 2,26
Uit Tabel 10 kan geconcludeerd worden dat de nieuw-gesynthetiseerde enamine- en 2,3-
dihydropyridinonanalogen in deze Masterproef een lagere theoretische partitiecoëfficiënt bezitten
dan curcumine 1, bisdemethoxycurcumine 3 en enaminanalogen (9 en 10) gesynthetiseerd in
voorgaand onderzoek.9, 10 Dit betekent dat de oplosbaarheid in water van de nieuwe analogen van
curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 beter zou moeten zijn.
Om hiervan een bevestiging te bekomen werd de wateroplosbaarheid van de acht nieuwe
enamineanalogen en drie nieuwe 2,3-dihydropyridinanalogen vervolgens ook experimenteel
onderzocht. Hiervoor werd gebruikt gemaakt van eenvoudig experiment waarin 1 mg analoog in een
vial met 1,5 ml water werd gebracht. Vervolgens werd dit mengsel gedurende 1 minuut verwarmd
met een haardroger. Daarna werd de oplosbaarheid van het analoog in water geanalyseerd aan de
hand van de kleur van het mengsel, aangezien curumineanalogen doorgaans een sterkere
geel/oranje verkleuring van het solvent vertonen bij hogere oplosbaarheid. De waarnemingen zijn
weergegeven in Tabel 11, waarin voor iedere verbinding de kleur van de verbinding en de kleur van
het mengsel (verbinding/water) te vinden is.
Bespreking van de resultaten
36
Tabel 11. Waarneming van de oplosbaarheid van curcumine, bisdemethoxycurcumine, enamineanalogen en 2,3-dihydropyridinonanalogen
Verb. Kleur Verb. Kleur Opl. Verb. Kleur Verb. Kleur Opl.
1 oranje geen verkleuring 64b oranje geen verkleuring 3 oranje geen verkleuring 66a oranje zeer lichtgeel
56a oranje lichtgeel 66b oranje lichtgeel 56b oranje donkergeel 57b geel donkergeel 58a oranje licht - donkergeel 59a geel lichtgeel 58b oranje donkergeel 67b geel geen verkleuring 64a oranje zeer lichtgeel
Zoals verwacht loste geen enkele verbinding volledig op in water, maar de oplosbaarheid was wel
duidelijk verschillend voor de verschillende verbindingen. Uit Tabel 11 valt het op dat enamine- en
2,3-dihydropyridinonanalogen gevormd met een hydroxylgroep (56a,b, 58a,b, 57b en 59a) een
betere oplosbaarheid in water vertonen dan curcumine 1, bisdemethoxycurcumine 3 en enamine- en
2,3-dihydropyridinonanalogen met een methoxygroep (64a,b en 66a,b en 67b), daar verbindingen
56a,b, 58a,b, 57b en 59a een sterkere verkleuring (lichtgeel tot donkergeel) van water vertoonden in
vergelijking met de andere verbindingen (geen verkleuring tot lichtgeel). Wanneer teruggekeken
wordt naar Tabel 10 zijn het ook deze verbindingen die de laagste theoretische partitiecoëfficiënt
hebben en dus het meest hydrofiel zijn. In de nabije toekomst zal de oplosbaarheid van de elf nieuwe
verbindingen nog verder onderzocht worden met een gespecialiseerde test, maar aan de hand van
dit experiment kunnen verbindingen 56a en b, 58a en b, 57b en 59a met een hydroxylgroep, op basis
van hun wateroplosbaarheid, beschouwd worden als meest belovende nieuwe analogen van
curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3.
Naast de oplosbaarheid, zal ook de biologische activiteit van de elf nieuwe verbindingen getest
worden op verschillende kankercellijnen. Dit zal vervolgens inzicht geven in het effect van analogen
met enerzijds een alcoholgroep (56a,b en 58a,b) versus een methoxygroep (64a,b en 66a,b) en
anderzijds een gesubstitueerde 2-ethylaminogroep (56a, 58a, 64a en 66a) versus een
gesubstitueerde 3-propylaminogroep (56b, 58b, 64b en 66b). Daarenboven zal voor iedere
enamineanaloog het verschil curcumine (56 en 64) versus bisdemethoxycurcumine (58 en 66)
kunnen bestudeerd worden. Als laatste zullen de bekomen cyclische nevenproducten 57b, 59a en
67b kunnen vergeleken worden met hun niet cyclische enaminepartner 56b, 58a en 66b.
Bespreking van de resultaten
37
Figuur 2. Analogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 gesynthetiseerd in deze Masterproef
Samenvatting en besluit
38
4 Samenvatting en besluit Curcumine is het actieve bestanddeel in het kruid kurkuma, het populairste kruid in de Indische
keuken en het hoofdbestanddeel in kerriepoeder. Curcumine bezit een waaier aan biologische
activiteiten, met als belangrijkste de anti-oxidant-, anti-inflammatoire- en antikankeractiviteit. Eén
groot nadeel echter is de lage biobeschikbaarheid van de stof. Daarom is het onderzoek naar de
synthese van curcumineanalogen, met als doel de verbetering van de biobeschikbaarheid, een ‘hot
issue’ in de medicinale chemie. Met bijna 4000 pre-klinische testen daaromtrent is curcumine één
van de meest onderzochte verbindingen in de medicinale chemie.51 Deze Masterproef knoopte aan
bij het onderzoek naar curcumineanalogen en spitste zich toe op de synthese van enamineanalogen
van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3. In preliminair onderzoek aan de “SynBioC Research
Group” van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) werden reeds verschillende
enamineanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3, met gebruik van alkylaminen,
gesynthetiseerd en getest op hun bioactiviteit en oplosbaarheid in water. Deze analogen vertoonden
een verhoogde activiteit in vergelijking met curcumine 1, waarbij de
bisdemethoxycurcumineanalogen het best scoorden. De wateroplosbaarheid van de
enamineanalogen was echter niet verbeterd. Daarom had deze Masterproef als doel het onderzoek
naar de synthese van meer polaire enamineanalogen 11 en 12 van curcumine 1 en
bisdemethoxycurcumine 3 door gebruik te maken van polaire aminen zoals aminoalcoholen,
aminoëthers, aminozuren en aminoësters om de oplosbaarheid in water te verhogen en zo mogelijk
het farmacologisch profiel te verbeteren.
4.1 Samenvatting In voorgaande Masterproeven werden reeds de eerste fundamentele bouwstenen gelegd voor de
synthese van enamineanalogen, waardoor in deze Masterproef kon vertrokken worden vanuit deze
eerder bekomen methode, die gebruik maakte van microgolfbestraling.9, 10 Na enkele veranderingen
aan de methode werd een geschikte procedure gevonden voor de synthese van enamineanalogen
met het gebruik van polaire aminen. Voor de polaire aminen werd gebruik gemaakt van twee types,
namelijk aminoalcoholen en aminoëthers. Onder microgolfbestraling voerde het polair amine een
nucleofiele additie uit op curcumine 1 (of bisdemethoxycurcumine 3) (1 mmol) in ethanol (5 ml) als
Samenvatting en besluit
39
solvent en in aanwezigheid van montmorillonietklei en azijnzuur als katalysatoren. Tijdens deze
imineringsreactie werd niet enkel het gewenste enamineanaloog i gevormd maar ook het cyclisch
nevenproduct ii met een 2,3-dihydropyridinonstructuur. Gezien het interessant farmacologisch
profiel van de cyclische nevenproducten ii werden ook getracht deze zuiver te bekomen. Details van
de reactie staan weergegeven in onderstaand reactieschema.
De reacties onder microgolfbestraling verliepen steeds vlot, met meestal een omzetting van 100
procent, maar de opwerking en zuivering van de reactiemengsels waren minder gemakkelijk. Iedere
reactie werd, op enkele uitzonderingen na, gezuiverd via kolomchromatografie over silica met een
daaropvolgende herkristallisatie in een geschikt solvent(mengsel). In de 1H-NMR-spectra van de
bekomen fracties na kolomchromatografie waren meestal nog ongewenste signalen aanwezig
waardoor herkristallisatie noodzakelijk was. Indien toch geen herkristallisatie nodig was, is dit te
merken aan het relatief hoge rendement (ic, if en ig).
De zuivering van de enamineanalogen met aminoëthers ic, d, g en h verliep gemakkelijker dan die
van de enamineanalogen met aminoalcoholen ia, b, e en f. Dit komt doordat verbindingen ic, d, g en
h beter oplossen in organische solventen zoals ethylacetaat, chloroform, dichloormethaan, ethanol
en methanol terwijl verbindingen ia, b, e en f enkel oplossen in methanol en ethanol. Daarenboven
ging de zuivering van curcuminederivaten ia-d beter dan die van de
bisdemethoxycurcuminederivaten ie-h, omdat deze laatste gevoeliger zijn voor afbraak op de
silicakolom.
Samenvatting en besluit
40
De acht mogelijke enamineanalogen ia-h werden zuiver bekomen in rendementen van 8 tot 40
procent. De vorming van nevenproduct, moeilijke opwerking en dubbele zuivering liggen aan de
basis voor deze lage rendementen.
Daarnaast konden drie nevenproducten (iia, b en c) zuiver worden bekomen in rendementen van 3
tot 12 procent. Gezien dit effectief nevenproducten zijn, was het niet verwonderlijk dat deze
verbindingen in lage rendementen werden bekomen.
Van deze acht nieuwe enamineanalogen i en drie nieuwe 2,3-dihydropyridinonanaolgen ii bezitten
diegenen met een hydroxygesubstitueerd amine (ia, b, e en f, en iia en b) de hoogste oplosbaarheid
in water.
4.2 Besluit Ter uitbreiding van een reeks verbindingen die in preliminair onderzoek aan de “SynBioC Research
Group” van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) werden gesynthetiseerd, werd met
succes geslaagd in de synthese van 11 nieuwe stikstofanalogen van curcumine. Deze elf nieuwe
verbindingen zullen in de nabije toekomt getest worden op hun bioactiviteit en oplosbaarheid. Van
de elf nieuwe stikstofanalogen zijn er acht verbindingen ia-h met een enaminestructuur.
Tijdens de testing op bioactiviteit en oplosbaarheid kan een mooie vergelijkende studie gemaakt
worden door verschillende structurele elementen te vergelijken. Ten eerste kan de activiteit en
oplosbaarheid van derivaten van curcumine (ia-d) versus bisdemethoxycurcumine (ie-h) vergeleken
Samenvatting en besluit
41
worden. Ten tweede kan het effect van analogen met enerzijds een alcoholgroep (ia, b, e en f) versus
een methoxygroep (ic, d, g en h) bestudeerd worden. Een laatste structureel element dat kan
vergeleken worden bij de analogen is de gesubstitueerde 2-ethylaminogroep (ia, c, e en g) versus
een gesubstitueerde 3-propylaminogroep (ib, d, f en h). Op basis van deze drie vergelijkingen kan
dan een SAR (Structure Activity Relationship) opgesteld worden. Wanneer de enamineanalogen i een
verhoogde activiteit én oplosbaarheid in vergelijking met curcumine 1 en voorgaande
gesynthetiseerde enamineanalogen bezitten kan in de toekomst gezocht worden naar een methode
om deze verbindingen efficiënter te bekomen. Enerzijds zou minder cyclisch nevenproduct moeten
gevormd worden en anderzijds zou de opwerking en zuivering vlotter moeten verlopen. Beide zaken
zouden misschien al kunnen verbeterd worden door gebruik te maken van een ander solvent waarin
de reacties kunnen in plaats vinden. De reacties zouden ook moeten opgeschaald worden om meer
product te bekomen om nog meer testen op biologische activiteit te kunnen uitvoeren. Daarenboven
kunnen ook nog tal van andere enamineanalogen aangemaakt worden door gebruik te maken van
andere polaire aminen zoals aminozuren of aminoësters.
Naast bovenstaande acht enamineanalogen i werden tevens drie 2,3-dihydropyridinonanalogen ii
gesynthetiseerd en geïsoleerd in hoge zuiverheid.
Deze drie verbindingen zullen in de nabije toekomst ook getest worden op hun bioactiviteit en
oplosbaarheid, en kunnen daarbij vergeleken worden met hun enaminepartner (ib, ie, ih). Uit de
theoretische partitiecoëfficiënt en een eerste experimentele test blijkt reeds een verhoogde
wateroplosbaarheid van deze verbindingen. Tevens bleek uit vroegere literatuurstudies, en ook
weergegeven in hoofdstuk 2 Literatuurstudie, dat de aanwezigheid van heterocyclische ringen
aanleiding kan geven tot een verhoogde bioactiviteit van verbindingen. Deze twee bevindingen doen
Samenvatting en besluit
42
hoopvolle verwachtingen rijzen en indien uit biologische testing blijkt dat 2,3-
dihydropyridinonanalogen ii effectief een betere wateroplosbaarheid en bioactiviteit bezitten dan de
overeenkomstige enamineanalogen i kan dan in de toekomst een optimale syntheseroute gezocht
worden om de 2,3-dihydropyridinonanalogen ii als hoofdproducten te verkrijgen. Daarenboven
kunnen ook nog andere 2,3-dihydropyridinonanalogen gesynthetiseerd worden door gebruik te
maken van andere polaire aminen zoals aminozuren en aminoësters.
Experimenteel deel
43
5 Experimenteel deel
5.1 Methodologie
5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC)
Dunnelaagchromatografie werd gebruikt voor het bepalen van het geschikte eluens voor
kolomchromatografie. Daarenboven werden de fracties die verkregen werden bij
kolomchromatografie ook met behulp van dunnelaagchromatografie geanalyseerd. Hiervoor werd
gebruik gemaakt van silicaplaatjes (Merck Silicagel 60F254; dikte 0,25 mm). Voor de detectie van de
verschillende ‘spots’ werden UV-licht en/of kaliumpermanganaat (KMnO4) aangewend.
5.1.2 Kolomchromatografie
Voor de preparatieve zuivering van een reactiemengsel werd silica (korreldiameter 0,035-0,070 mm;
poriëndiameter ca. 6 nm) als stationaire fase gebruikt. Bij de elutie van het te zuiveren
reactiemengsel bedroeg de loopsnelheid ongeveer 3 cm/min.
5.1.3 Vloeistofchromatografie
Vloeistofchromatografie werd uitgevoerd met een Agilent 1200 series toestel, uitgerust met een
Supelco Ascentic Express C18 kolom (L 3cm × I.D. 4,6 mm) met 2,7 µm fused-core partikels met 90 Å
poriëngrootte. De mobiele fase die standaard wordt toegepast, is een mengsel van water en
acetonitril, maar ook andere combinaties zijn mogelijk zoals bijvoorbeeld de combinatie water en
methanol. Voor de analyse van de LC-stalen in deze Masterproef werd deze laatste toegepast.
Detectie van de verbindingen gebeurt via een UV-DAD-detector. Het toestel is gekoppeld aan een
massaspectrometer met elektrospray ionisatie geometrie (ESI 70 eV) en een quadrupool detector.
5.1.4 Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR)
Voor de 1H-NMR-spectra werd gebruik gemaakt van een Bruker Avance Nanobay III (400 MHz) NMR
spectrometer. De 13C-NMR-spectra werden eveneens met dit toestel opgenomen en dit bij 100,6
MHz. De te analyseren verbindingen werden opgelost in een gedeutereerd solvent (CDCl3, d6-DMSO
of d4-methanol) met tetramethylsilaan als interne standaard. De chemische verschuiving werd
gerapporteerd als een -waarde in ppm.
5.1.5 Massaspectrometrie (MS)
Massaspectra werden opgenomen met een Agilent 1100 MSD SL series massaspectrometer met
electrospray ionisatie geometrie (ESI 70 eV) en een quadrupool detector.
5.1.6 Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS)
Hoge resolutie ‘electrospray (ES)’ massaspectra (HRMS) werden opgenomen met een Agilent
Technologies 6210 Series Time-of-flight massaspectrometer.
Experimenteel deel
44
5.1.7 Smeltpuntbepaling
Het smeltpunt van een vaste stof werd bepaald met een Kofler WME smeltbank van Wager & Munz.
De vaste stof werd aangebracht op het verwarmingselement (bij 50°C) en vervolgens met een spatel
richting hogere temperaturen verplaatst (max 260°C) totdat de verbinding smolt.
5.1.8 Microgolfreactor
De microgolfreacties werden uitgevoerd in een CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System, Model
Discover, met een maximaal vermogen van 300 W, die toelaat de temperatuur en tijd van de reactie
in te stellen. Als recipiënt werd gebruik gemaakt van speciale dikwandige glazen flacons, voorzien
van een aangepast septum met kliksysteem. De temperatuur werd gecontroleerd door middel van
een infraroodsensor en een magnetische, roterende plaat aan de onderkant van de reactor zorgde
voor menging van het reactiemengsel. Finale koeling gebeurde door middel van aangezogen lucht.
5.2 Veiligheid
5.2.1 Algemene veiligheidsmaatregelen in het chemisch labo
Bij het aanvatten van het onderzoek voor deze Masterproef werden drie documenten omtrent de
veiligheid gelezen en ondertekend: Interne richtlijnen van de SynBioC Research Group,
Veiligheidsinstructies, waarin algemene veiligheidsvoorschriften voor het hanteren van verschillende
(klassen van) chemische verbindingen geschreven staan, en de Ugent Welzijns- en Milieugids.
Daarenboven werd een rondleiding gegeven in het labo waarbij toegelicht werd hoe men efficiënt
moet handelen in noodsituaties. Bij het betreden van het chemisch labo zijn het dragen van een
labojas en labobril elementair. Tevens moeten veiligheidshandschoenen gedragen worden wanneer
gewerkt wordt met schadelijke stoffen, maar bij het hanteren van apparatuur en bij het verlaten van
het labo moeten deze handschoenen afgedaan worden. Verder is het ook essentieel om de MSDS-
fiches te hebben gelezen bij het aanvatten van een nieuwe reactie met nieuwe reagentia, stoffen en
solventen.
5.2.2 Risico’s verbonden aan gebruikte reagentia en solventen
In deze sectie wordt een overzicht gegeven van de risico’s verbonden aan reagentia, solventen, en
andere chemische stoffen die veel gebruikt werden tijdens het onderzoek voor deze Masterproef. De
informatie werd gehaald uit MSDS-fiches.
2-Amino-1-ethanol, 3-amino-1-propanol, 2-methoxyethylamine en 3-methoxypropylamine zijn licht
ontvlambare vloeistoffen waarvan de dampen ook licht ontvlambaar zijn. De stoffen zijn schadelijk
bij inslikken, contact met de huid en bij inademing. Ze kunnen ernstige brandwonden en oogletsels
veroorzaken. Bij gebruik worden ze dus best weggehouden van warmte, vuur, of hete oppervlakken
Experimenteel deel
45
en moet inademing vermeden worden. Bovendien zijn ze schadelijk voor in water levende
organismen, met langdurige gevolgen.
Azijnzuur is een schadelijke ontvlambare vloeistof en damp. Bij contact met de huid kan het ernstige
brandwonden veroorzaken. Maar ook bij inhalatie heeft het een corrosief effect op de longen. Wat
de chronische schade betreft, kan het mutaties veroorzaken in somatische cellen, voornamelijk in
volgende lichaamsdelen: nieren, huid, slijmvliezen en tanden.
Silica komt voor als witte kristallen en is zeer schadelijk voor de longen bij inademing. Silica heeft
verschillende negatieve effecten op de gezondheid. Bij inhalatie van zeer grote concentraties op een
korte tijd (enkele maanden) kan silica silicose veroorzaken, die fataal kan zijn. Veder kan het ook
kanker, auto-immuunziekten, tuberculose en nefrotoxiciteit veroorzaken.
Celiet of diatomeeënaarde komt voor onder de vorm van een fijn grijs poeder en is een amorfe vorm
van silica. Het kan irritatie van luchtwegen veroorzaken en is schadelijk voor de longen. Het is minder
schadelijk dan kristallijne silica maar moet toch met de nodige voorzichtigheid gehanteerd worden
door te werken in de trekkast of door een stofmasker te dragen.
Montmorillonietklei (K10) is wederom een fijn grijs poeder, waarvan de inademing moet vermeden
worden. Maar verder worden geen ernstige effecten gerapporteerd voor deze stof.
Ethanol is een vloeistof waarvan de vloeibare- en dampvorm ontvlambaar zijn. Bij contact met de
huid heeft het een matig schadelijk effect, maar bij inademing werkt het in op het centrale
zenuwstelsel wat zich uit in duizeligheid, hoofdpijn, misselijkheid, en het kan zelfs leiden een tot een
comateuze toestand. Verstikking is ook een mogelijk effect bij inademing van ethanoldamp.
Methanol is een vloeistof waarvan de vloeibare- en dampvorm ontvlambaar zijn en matige irritatie
geven bij contact met de huid. Bij inname en inhalatie zijn de effecten wel zeer schadelijk. Bij inname
wordt het gastrointestinaal stelsel beschadigd wat misselijkheid, overgeven en diarree veroorzaakt.
Het zenuwstelsel wordt ook beschadigd en dit leidt tot hoofdpijn, duizeligheid, slaperigheid. Daarna
kan dit leiden tot bewusteloosheid en zelfs tot het belanden in een comateuze toestand, met sterfte
tot gevolg. Inname kan ook blindheid veroorzaken. Bij inademing kunnen volgende symptomen
voorkomen: duizeligheid, hoofdpijn, misselijkheid en mogelijk comateuze toestand, blindheid en
aantasting van de slijmvliezen.
Dimethylsulfoxide (DMSO) is een kleurloze vloeistof waarvoor in het algemeen een lage toxiciteit
gerapporteerd staat.
Experimenteel deel
46
Gehalogeneerde solventen zoals chloroform en dichloormethaan worden zoveel mogelijk vermeden
omwille van effect op het milieu. Ze zorgen namelijk voor de afbraak van de ozonlaag. Bovendien zijn
deze stoffen carcinogeen voor de mens. Wanneer deze solventen toch dienen gebruikt te worden in
het labo, wordt de exacte hoeveelheid van gebruik genoteerd in een schrift en worden deze na
gebruik gedeponeerd in aparte vaten.
5.3 Beschrijving van de experimenten
5.3.1 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,4,6-
heptatriëen-3-onen 56 en 64
De synthese van (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-
heptatriëen-3-on 56a wordt hieronder beschreven als representatief voorbeeld voor de synthese van
(1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-onen 56 en 64.
Curcumine 1 (1 mmol, 368 mg) werd opgelost in 5 ml ethanol in een microgolfovenflacon van 10 ml.
Vervolgens werden 1,6 massa-equivalenten montmorillonietklei (600 mg) toegevoegd als katalysator
en droogmiddel. Daarna werden 10 equivalenten 2-amino-1-ethanol (10 mmol, 0,60 ml) en 2,4
equivalenten azijnzuur (2,4 mmol, 0,14 ml) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende één uur
geroerd bij 70 °C onder invloed van microgolfbestraling. In een volgende stap werd het
reactiemengsel gefiltreerd over celiet en werd de filterkoek grondig nagespoeld met ethanol (300
ml). Hierna werd de ethanol uit het filtraat ingedampt aan de rotavapor tot nog ongeveer 50 ml
overbleef. Vervolgens werd 500 ml ethylacetaat toegevoegd en werd dit mengsel gewassen met een
verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat (50 ml) en pekel (50 ml). Daarna werd het mengsel
gedroogd over magnesiumsulfaat, gefiltreerd en ingedampt aan de rotavapor. Na
kolomchromatografie over silica (EtOAc/MeOH (100/1)) en een daaropvolgende herkristallisatie
(EtOH/hexaan 15/1) resulteerde dit in 38 mg (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-
hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 56a (9 %).
Voor de synthese van verbinding 64a werd gebruik gemaakt van 2-methyltetrahydrofuran als
solvent, 90 minuten als reactietijd en 100 °C als reactietemperatuur. Verbindingen 56b en 64b
werden bekomen bij een reactietemperatuur van respectievelijk 80 en 90 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on
56a
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 3,48 - 3,52 (2H,
m, NHCH2CH2O); 3,56 - 3,59 (2H, m, NHCH2CH2O);
3,82 en 3,83 (2 × 3H, 2 × s, 2 × CH3O); 4,93 (1H, s
Experimenteel deel
47
(br), CH2OH); 5,60 (1H, s, COCHCN); 6,73 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,80
(1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,94 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,00 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 7,11 (1H, d, J =
8,2 Hz, CHarom); 7,21 (1H, s, CHarom); 7,24 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,27 - 7,31 (2 × 1H, m, 1 × CHarom en 1
× CH); 9,39 (2 × 1H, s (br), 2 × OH); 11,46 (1H, t, J = 5,8 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 45,7
(HNCH2CH2);56,0 en 56,2 (2 × CH3O);60,9 (CH2OH);92,8 (COCHCN);110,8, 111,6, 116,0 en 116,1 (4 ×
HCarom);117,9 (HC);122,4 en 122,5 (2 × HCarom);127,3 (HC);127,6 en 127,7 (2 × Cquat,arom);136,5 en
137,8 (2 x HC);148,3, 148,4 en 148,8 (4 x Cquat,arom);162,6 (CquatN);184,6 (C=O). MS (70 eV): m/z (%):
412 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C23H26NO6: 412,1755 [M+H]+, gevonden: 412,1772.
Oranje kristallen. Rendement na kolomchromatografie (EtOAc/MeOH (100/1); Rf(SiO2) = 0,10) en
herkristallisatie in ethanol/hexaan (15/1): 9%. Tm = 194 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(3-hydroxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on
56b
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,72 (2H, quint, J =
6,0 Hz, CH2CH2CH2); 3,48 - 3,52 (2 × 2H, m,
NHCH2CH2CH2O); 3,82 en 3,83 (2 x 3H, 2 x s, 2 x
CH3O); 4,64 (1H, s (br), CH2OH); 5,61 (1H, s,
COCHCN); 6,73 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,80 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom);
6,96 (1H, d, J = 16,1 Hz, CH); 7,00 (1H, d × d, J = 8,2, 1,5 Hz, CHarom); 7,11 (1H, d × d, J = 8,2, 1,5 Hz,
CHarom); 7,21 (1H, d, J = 1,5 Hz, CHarom); 7,25 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,29 (1H, d, J = 1,5 Hz, CHarom);
7,32 (1H, d, J = 16,1 Hz, CH); 9,40 (2 x 1H, s (br), 2 x OH); 11,49 (1H, t, J = 6,0 Hz, NH). 13C-NMR (100
MHz, d6-DMSO): 33,6 (CH2CH2CH2);39,8 (NHCH2CH2); 56,0 en 56,2 (2 × CH3O); 58,2 (CH2CH2O); 92,7
(COCHCN);110,8, 111,5, 116,0 en 116,1 (4 × HCarom);117,6 (HC);122,4 (2 × HCarom);127,2 (HC);127,6
en 127,7 (2 × Cquat,arom);136,6 en 137,9 (2 × HC);148,3, 148,4, 148,5 en 148,9 (4 × Cquat,arom);162,7
(CquatN);184,6 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 426 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C24H28NO6:
426,1911 [M+H]+, gevonden: 426,1902. Oranje kristallen. Rendement na kolomchromatografie
(PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,23) en herkristallisatie in methanol: 8%. Tm = 112 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-methoxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on
64a
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 3,43 (3H, s, CH2OCH3);
3,60 (4H, s, NH(CH2)2O); 3,93 en 3,95 (2 × 3H, 2 × s,
2 × CH3O); 5,54 (1H, s, COCHCN); 5,77 en 5,83 (2 ×
1H, 2 × s, 2 × OH); 6,63 (1H, d, J = 15,6 Hz, CH); 6,74
(1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 6,90 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,93 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,99 – 7,09 (4H,
Experimenteel deel
48
m, 4 × CHarom); 7,19 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,47 (1H, d, J = 15,6 Hz, CH); 11,51 (1H, s (br), NH). 13C-
NMR (100 MHz, ref = CDCl3): 43,7 (HNCH2CH2);56,1 en 56,2 (2 × CH3O);59,4 (CH2OCH3);71,9
(CH2CH2O);93,9 (COCHCN);109,3, 109,4, 114,8 en 115,0 (4 × HCarom);118,6 (HC);121,9 en 122,5 (2 ×
HCarom);127,0 (HC);128,4 en 128,9 (2 × Cquat,arom);137,4 en 137,6 (2 × HC);146,8, 146,9, 147,0 en
147,4 (4 × Cquat,arom);163,0 (CquatN);186,0 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 426 (M++1, 100). HRMS (ESI):
berekend voor C24H28NO6: 426,1911 [M+H]+, gevonden: 426,1905. Oranje kristallen. Rendement na
kolomchromatografie (PE/EtOAc (1/4); Rf(SiO2) = 0,10) en herkristallisatie in ethanol/hexaan (15/1):
9%. Tm = 174 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(3-methoxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on
64b
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,81 (2H, quint, J =
6,0 Hz, CH2CH2CH2); 3,25 (3H, s, CH2OCH3); 3,42 (2H,
t, J = 6,0 Hz, CH2CH2O); 3,50 (2H, q, J = 6,0 Hz,
NHCH2CH2); 3,82 en 3,83 (2 x 3H, 2 x s, 2 x CH3O);
5,61 (1H, s, COCHCN); 6,73 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHarom); 6,81 (1H, d, J = 8,1
Hz, CHarom); 6,93 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,01 (1H, d × d, J = 8,1, 1,6 Hz, CHarom); 7,12 (1H, d × d, J =
8,1, 1,6 Hz, CHarom); 7,22 - 7,28 (3 × 1H, m, 2 × CHarom en 1 × CH); 7,32 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 9,40 (2 x
1H, s (br), 2 x OH); 11,46 (1H, t, J = 6,0 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 30,5
(CH2CH2CH2);39,8 (NHCH2CH2); 56,0 en 56,1 (2 × CH3O); 58,5 (CH2OCH3); 69,4 (CH2CH2O); 92,8
(COCHCN);110,9, 111,6, 116,0 en 116,1 (4 × HCarom);117,4 (HC);122,4 en 122,5 (2 × HCarom);127,2
(HC);127,6 en 127,7 (2 × Cquat,arom);136,7 en 138,0 (2 × HC); 148,3, 148,4 en 148,8 (4 ×
Cquat,arom);162,6 (CquatN);184,7 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 440 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend
voor C25H30NO6: 440,2068 [M+H]+, gevonden: 440,2073. Oranje kristallen. Rendement na
kolomchromatografie (PE/EtOAc en MeOH (1/5 en 2%); Rf(SiO2) = 0,24) en herkristallisatie in
methanol/hexaan (15/1): 11%. Tm = 141 °C.
5.3.2 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-
onen 58 en 66
De synthese van (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on
58a wordt hieronder beschreven als representatief voorbeeld voor de synthese van (1E,4Z,6E)-5-
amino-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-onen 58 en 66.
Bisdemethoxycurcumine 3 (1 mmol, 308mg) werd opgelost in 5 ml ethanol in een
microgolfovenflacon van 10 ml. Vervolgens werden 1,9 massa-equivalenten montmorillonietklei (600
mg) toegevoegd als katalysator en droogmiddel. Daarna werden 5 equivalenten 2-amino-1-ethanol
Experimenteel deel
49
(5 mmol, 0,3 ml) en 2,4 equivalenten azijnzuur (2,4 mmol, 0,14 ml) toegevoegd. Het mengsel werd
gedurende één uur geroerd bij 90 °C onder invloed van microgolfbestraling. In een volgende stap
werd het reactiemengsel gefiltreerd over celiet en werd de filterkoek grondig nagespoeld met
ethanol (300 ml). Hierna werd de ethanol uit het filtraat ingedampt aan de rotavapor tot ongeveer 50
ml overbleef. Vervolgens werd 500 ml ethylacetaat toegevoegd en werd dit mengsel gewassen met
een verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat (50 ml) en pekel (50 ml). Daarna werd het mengsel
gedroogd over magnesiumsulfaat, gefiltreerd en ingedampt aan de rotavapor. Na
kolomchromatografie over silica (PE/EtOAc/MeOH 9/9/2) en een daaropvolgende herkristallisatie in
methanol resulteerde dit in 28 mg (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-
heptatriëen-3-on 58a (8 %).
Voor de synthese van verbinding 58b werd gebruik gemaakt van 10 equivalenten 3-amino-1-
propanol en een reactietemperatuur van 80 °C. Voor het bekomen van verbinding 66a werden 10
equivalenten 2-methoxyethylamine gebruikt en verbinding 66b werd bekomen bij een
reactietemperatuur van 80 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 58a
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 3,48 (2H, ~t, J = 5,1
Hz, NHCH2CH2O); 3,56 (2H, q, J = 5,1 Hz, NHCH2CH2O);
4,92 (1H, t, J = 5,1 Hz, CH2OH); 5,59 (1H, s, COCHCN);
6,67 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,6 Hz,
CHarom); 6,80 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,91 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,25 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,30
(1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,43 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 7,53 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 9,80 (2 × 1H, s
(br), 2 × OH); 11,47 (1H, t, J = 5,1 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 45,7 (HNCH2CH2);60,9
(CH2CH2O); 92,9 (COCHCN);116,2 (4 × HCarom); 117,6 (HC); 127,0 (HC);127,1 en 127,2 (2 ×
Cquat,arom);129,7 en 129,9 (4 × HCarom);136,2 en 137,4 (2 × HC);159,0 en 159,3 (2 × Cquat,arom);162,8
(CquatN);184,8 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 352 (M++1, 100). Oranje kristallen. Rendement na
kolomchromatografgie (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,19) en herkristallisatie in methanol: 8%.
Tm = 132 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(3-hydroxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 58b
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,70 (2H, quint, J =
6,3 Hz, CH2CH2CH2); 3,48 (2H, q, J = 6,3 Hz, NHCH2CH2);
3,50 (2H, q, J = 6,3 Hz, CH2CH2O); 4,61 (1H, t, J = 6,3
Hz, CH2OH); 5,60 (1H, s, COCHCN); 6,66 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 6,80
Experimenteel deel
50
(2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 6,91 (1H, d, J = 16,1 Hz, CH); 7,25 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,32 (1H, d, J =
16,1 Hz, CH); 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 7,54 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 9,76 en 9,87 (2 × 1H, 2 × s,
2 × OH); 11,50 (1H, t, J = 6,3 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 33,6 (CH2CH2CH2);39,8
(NHCH2CH2); 58,2 (CH2OH);92,6 (COCHCN);116,2 (4 × HCarom); 117,2 (HC); 126,9 (HC);127,1 en
127,2 (2 × Cquat,arom);129,7 en 130,0 (4 × HCarom);136,3 en 137,6 (2 × HC);159,0 en 159,4 (2 ×
Cquat,arom);162,7 (CquatN);184,6 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 366 (M++1, 100). Oranje kristallen.
Rendement na kolomchromatografie (EtOAc/MeOH (100/2); Rf(SiO2) = 0,29): 18%. Tm = 144 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-methoxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 66a
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 3,31 (3H, s,
CH2OCH3); 3,50 (2H, t, J = 5,4 Hz, NHCH2CH2O); 3,60
(2H, q, J = 5,4 Hz, NHCH2CH2O); 5,60 (1H, s, COCHCN);
6,67 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,6 Hz,
CHarom); 6,80 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,90 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,26 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,31
(1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,44 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 7,53 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 9,76 (2 × 1H, s
(br), 2 x OH); 11,47 (1H, t, J = 5,4 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 42,9 (HNCH2CH2);58,7
(CH2OCH3); 71,6 (CH2CH2O); 92,8 (COCHCN);116,2 (4 × HCarom); 117,4 (HC); 126,9 (HC);127,1 en
127,2 (2 × Cquat,arom);129,7 en 130,0 (4 × HCarom);136,4 en 137,6 (2 × HC);159,0 en 159,4 (2 ×
Cquat,arom);162,5 (CquatN);184,7 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 366 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend
voor C22H24NO4: 366,1700 [M+H]+, gevonden: 366,1705. Oranje kristallen. Rendement na ‘reversed
phase’ kolomchromatografie (MeOH/H2O 40/60 naar 100/0): 32%. Tm = 196 °C.
(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(3-methoxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 66b
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,78 (2H, quint, J =
6,2 Hz, CH2CH2CH2); 3,25 (3H, s, CH2OCH3); 3,41 (2H, t,
J = 6,2 Hz, CH2CH2O); 3,48 (2H, q, J = 6,2 Hz,
NHCH2CH2); 5,60 (1H, s, COCHCN); 6,67 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,80
(2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,89 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,26 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,32 (1H, d, J =
16,0 Hz, CH); 7,44 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 7,53 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 9,77 en 9,87 (2 × 1H, 2 × s,
2 × OH); 11,48 (1H, t, J = 6,2 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 30,5 (CH2CH2CH2);39,7
(NHCH2CH2); 58,5 (CH2OCH3); 69,3 (CH2CH2O); 92,7 (COCHCN);116,1 en 116,2 (4 × HCarom); 117,2
(HC); 126,9 (HC);127,1 en 127,2 (2 × Cquat,arom);129,7 en 130,0 (4 × HCarom);136,4 en 137,6 (2 ×
HC);159,0 en 159,4 (2 × Cquat,arom);162,6 (CquatN);184,7 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 380 (M++1, 100).
Oranje kristallen. Rendement na kolomchromotografie (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,44) en
herkristallisatie in methanol: 22%. Tm = 161 °C.
Experimenteel deel
51
5.3.3 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57b, 59a en 67b
De synthese van E-2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-6-(4-hydroxy-3-methoxystyryl)-1-(3-
hydroxypropyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 57b wordt hieronder beschreven als representatief
voorbeeld voor de synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57b, 59a en 67b.
Curcumine 1 (1 mmol, 368mg) werd opgelost in 5 ml ethanol in een microgolfovenflacon van 10 ml.
Vervolgens werden 1,6 massa-equivalenten montmorillonietklei (600 mg) toegevoegd als katalysator
en droogmiddel. Daarna werden 10 equivalenten 3-amino-1-propanol (10 mmol, 0,76 ml) en 2,4
equivalenten azijnzuur (2,4 mmol, 0,14 ml) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende één uur
geroerd bij 80 °C onder invloed van microgolfbestraling. In een volgende stap werd het
reactiemengsel gefiltreerd over celiet en werd de filterkoek grondig nagespoeld met ethanol (300
ml). Hierna werd de ethanol uit het filtraat ingedampt aan de rotavapor tot ongeveer 50 ml
overbleef. Vervolgens werd 500 ml ethylacetaat toegevoegd en werd dit mengsel gewassen met een
verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat (50 ml) en pekel (50 ml). Daarna werd het mengsel
gedroogd over magnesiumsulfaat, gefiltreerd en ingedampt aan de rotavapor. Na
kolomchromatografie over silica (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2)) en een daaropvolgende herkristallisatie in
methanol resulteerde dit in 50 mg E-2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-6-(4-hydroxy-3-methoxystyryl)-1-
(3-hydroxypropyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 57b (12 %).
Voor de synthese van verbindingen 59a en 67b werd gebruik gemaakt van bisdemethoxycurcumine 3
en van 5 equivalenten 2-amino-1-ethanol en 3-methoxypropylamine. Daarenboven werd voor de
synthese van 59a een reactieduur van 4 uur en een reactietemperatuur van 90 °C toegepast en werd
één equivalent azijnzuur gebruikt.
E-2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-6-(4-hydroxy-3-methoxystyryl)-1-(3-hydroxypropyl)-2,3-
dihydropyridin-4-onen 57b
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,63 - 1,73 (2H, m,
CH2CH2CH2); 2,41 (1H, d × d, J = 16,2, 5,0 Hz, 3-Ha); 2,86
(1H, d × d, J = 16,2, 5,0 Hz, 3-Hb); 3,09 - 3,16 (1H, m,
N(HCH)); 3,42 - 3,43 (2H, m, CH2CH2O); 3,74 en 3,81 (2 ×
3H, 2 × s, 2 × OCH3); 3,81 - 3,85 (1H, m, N(HCH)); 4,63
(1H, s (br), CH2OH); 4,72 - 4,74 (1H, m, 2-H); 5,08 (1H, s, 5-H); 6,66 (1H, d × d, J = 8,1, 1,5 Hz, CHarom);
6,71 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHarom); 6,78 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHarom); 6,84 (1H, d, J = 1,5 Hz, CHarom); 7,05 (1H,
d, J = 15,8 Hz, CH); 7,07 (1H, d × d, J = 8,1, 1,6 Hz, CHarom); 7,18 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,28 (1H, d, J =
1,6 Hz, CHarom); 8,93 en 9,38 (2 × 1H, 2 × s (br), 2 × OH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 32,8
(CH2CH2CH2);43,4 (3-CH2); 47,6 (NCH2CH2); 56,2 (2 × OCH3); 58,1 (CH2CH2O); 61,2 (2-CH); 96,0 (5-
Experimenteel deel
52
CH);111,3, 111,4, 115,7, 116,0 en 119,1 (5 × HCarom); 119,5 (HC); 122,3 (HCarom);127,8 en 130,9 (2 ×
Cquat,arom); 137,6 (HC); 146,3, 148,1, 148,3 en 148,6 (4 × Cquat,arom); 161,0 (6-CH);188,3 (C=O). MS (70
eV): m/z (%): 426 (M++1, 100). Gele kristallen. Rendement na kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH
(9/9/2); Rf(SiO2) = 0,08) en herkristallisatie in methanol: 12%. Tm = 146 °C.
E-2-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-hydroxystyryl)-1-(2-hydroxyethyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 59a
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 2,33 (1H, d × d, J = 15,9, 4,4
Hz, 3-Ha); 2,92 (1H, d × d, J = 15,9, 4,4 Hz, 3-Hb); 3,03 - 3,10
(1H, m, N(HCH)); 3,49 - 3,54 (2H, m, CH2OH); 3,83 - 3,89 (1H,
m, N(HCH)); 4,77 - 4,80 (1H, m, 2-H); 4,89 (1H, s (br),
CH2OH); 5,07 (1H, s, 5-H); 6,71 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom);
6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 6,99 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,07 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 7,16 (1H,
d, J = 15,8 Hz, CH); 7,50 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 9,35 en 9,80 (2 × 1H, 2 × s, 2 × OH). 13C-NMR (100
MHz, d6-DMSO): 43,0 (3-CH2); 52,9 (NCH2CH2); 60,3 (CH2CH2O); 61,1 (2-CH);96,3 (5-CH);115,6 en
116,1 (4 × HCarom); 119,5 (HC);127,3 (Cquat,arom);127,9 en 129,8 (4 × HCarom); 130,0 (Cquat,arom);137,2
(HC);157,0, 159,1 en 160,9 (2 × Cquat,arom en 1 × 6-CH);188,5 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 352 (M++1,
100). Gele kristallen. Rendement na kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,18)
en herkristallisatie in methanol: 9%. Tm = 149 °C.
E-2-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-hydroxystyryl)-1-(3-methoxypropyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 67b
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,74 - 1,76 (2H, m,
CH2CH2CH2); 2,34 (1H, ~d, J = 15,7 Hz, 3-Ha); 2,89 (1H, d × d,
J = 15,7; 6,1 Hz, 3-Hb); 3,04 - 3,07 (1H, m, N(HCH)); 3,18 (3H,
s, CH2OCH3); 3,29 - 3,34 (2H, m, CH2OCH3); 3,81 - 3,84 (1H,
m, N(HCH)); 4,70 - 4,72 (1H, m, 2-H); 5,08 (1H, s, 5-H); 6,71
(2H, d, J = 7,5 Hz, CHarom); 6,79 (2H, d, J = 7,5 Hz, CHarom);
6,94 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,07 (2H, d, J = 7,5 Hz, CHarom); 7,19 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,50 (2H, d, J
= 7,5 Hz, CHarom); 9,37 en 9,80 (2 × 1H, 2 × s, 2 × OH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 29,6
(CH2CH2CH2);43,3 (3-CH2); 47,6 (NCH2CH2); 58,3 (CH2OCH3); 60,7 (2-CH); 69,2 (CH2CH2O); 96,1 (5-
CH);115,7 en 116,1 (4 × HCarom); 119,1 (HC);127,3 (Cquat,arom);128,0 en 129,8 (4 × HCarom); 130,1
(Cquat,arom);137,4 (HC);157,1 en 159,1 en 160,8 (2 × Cquat,arom en 1 × 6-CH);188,3 (C=O). MS (70 eV):
m/z (%): 380 (M++1, 100). Gele kristallen. Rendement na kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH
(9/9/2); Rf(SiO2) = 0,18) en herkristallisatie in methanol: 3%. Tm = 252 °C.
Bronnen
53
Bronnen 1. Prasad, S.; Gupta, S.C.; Tyagi, A.K.; Aggarwal, B.B. Biotech. Adv. 2014, 32, 1053.
2. Goel, A.; Kunnumakkara, A.B.; Aggarwal B.B. Biochem. Pharmacol. 2008, 75, 787.
3. Strimpakos, A.S.; Sharma, R.A.; Antioxid. Redox. Signal. 2008, 10, 511.
4. Tønnesen, H.H.; Karlsen, J.; Z Lebensm. Unters. Forsch. 1985, 180, 132.
5. Aggarwal, B.B.; Kumar, A.; Bharti, A.C. Anticancer Res. 2003, 23, 363.
6. Wang, Y.J.; Pan, M.H.; Cheng, A.L.; Lin, L.I.; Ho, Y.S.; Hsieh, C.Y. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 1997,
15, 1867.
7. Anand, P.; Kunnumakkara, A.B.; Newman, R.A.; Aggarwal, B.B. Mol. Pharmaceut. 2007, 4, 807.
8. Shoba, G.; Joy, D.; Joseph, T.; Majeed, M.; Rajendran, R.; Srinivas, P. S. Planta. Med. 1998, 64, 353.
9. Van Bogaert, M. Ingenieurstesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2013.
10. Van Damme, S. Ingenieurstesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2014.
11. D’Hoore, S. Ingenieurstesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2015.
12. Wang, Y.J.; Pan, M.H.; Cheng, A.L.; Lin, L.I.; Ho, Y.S.; Hsieh, C.Y.; Lin, J.K. J. Pharm. Biomed. Anal.
1997, 15, 1867.
13. Tomren, M.A.; Masson, M.; Loftsson, T.; Hjorth Tønnesen, H. Int. J. Pharm. 2007, 338, 27.
14. Straganz, G.D.; Glieder, A.; Brecker, L.; Ribbons, D.W.; Steiner, W. Biochem. J. 2003, 369, 573.
15. Rosemonda, M.J.C.; St. John-Williams, L.; Yamaguchi, T.; Fujishita, T.; Walsh, S.J. Chem. Biol.
Interact. 2004, 147, 129.
16. Muthenna, P.; Suryanarayana, P.; Gunda, S.K.; Petrash, J.M.; Reddy, G.B. FEBS Letters. 2009, 583,
3637.
17. Sardjiman, S. S.; Reksohadiprodjo, M. S.; Hakim, L.; Goot, H.; Timmerman, H. Eur. J. Med. Chem.
1997, 32, 625.
18. Du, Z. Y.; Liu, R. R.; Shao, W. Y.; Mao, X. P.; Ma, L.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S.; Chan, A. S. Eur. J. Med.
Chem. 2006, 41, 213.
19. Zhou, D.Y.; Zhang, K.; Conney, A.H.; Ding, N.; Cui, X.-X.; Wang, H.; Verano, M.; Zhao, S.Q.; Fan,
Y.X.; Zheng, X.; Du, Z.Y. Chem. Pharm. Bull. 2013, 61, 1149.
20. Fuchs, J.R.; Pandit, B.; Bhasin, D.; Etter, J.P.; Regan, N.; Abdelhamid, D.; Li, C.; Lin, J.; Li, P.K.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 2065.
21. Wei, X.; Du, Z.Y.; Zheng, X.; Cui, X.X.; Conney, A.H.; Zhang, K. Eur. J. Med. Chem. 2012, 53, 235.
Bronnen
54
22. Suarez, J.A.Q.; Rando, D.G.; Santos, R.P.; Gonçalves, C.P.; Ferreira, E.; Ernesto de Carvalho, J.;
Kohn, L.; Maria, D.A.; Faião-Flores, F.; Michalik, D.; Marcucci, M.C.; Vogel, C. Bioorg. Med. Chem.
2010, 8, 6275.
23. Adams, B.K.; Ferstl, E.M.; Davis, M.C.; Herold, M.; Kurtkaya, S.; Camalier, R.F.; Hollingshead, M.G.;
Kaur, G.; Sausville, E.A.; Rickles, F.R.; Snyder, J.P.; Liotta, D.C.; Shoji, M. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12,
3871.
24. Nali, H. Ingenieurstesis, Faculteit Ingenieurswetenschappen en Architectuur, Universiteit Gent.
2014
25. Rumpel, W. Austrian Pat. Appl., 1954, 180, 258, AT 180258.
26. Dinkova-Kostova, A. T.; Abeygunawardana, C.; Talalay, P. J. Med. Chem. 1998, 41, 5287.
27. Lee, K.; Aziz, F.H.A.; Syahida, A.; Abas, F.; Shaari, K.; Israf, D.A.; Lajis, N.H. Eur. J. Med. Chem. 2009,
44, 3195.
28. Liang, G.; Shao, L.; Wang, Y.; Zhao, C.; Chu, Y.; Xiao, J.; Zhao, Y.; Li, X.; Yang, S. Bioorg. Med.
Chem. 2009, 17, 2623.
29. Samaan, N.; Zhong, Q.; Fernandez, J.; Chen, G.; Hussain, A.M.; Zheng, S.; Wang, G.; Chen, Q.H.
Eur. J. Med. Chem, 2014, 75, 123.
30. Yadav, B.; Taurin, S.; Rosengren, R.J.; Schumacher, M.; Diederich, M.; Somers-Edgar, T.J.; Larsen,
L. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 6701.
31. Lin, L.; Qian Shi, Q.; Nyarko, A.K.; Bastow, K.F.; Wu, C.C.; Su, C.Y.; Shih,C.C.Y.; Lee, K.H. J. Med.
Chem. 2006, 49, 3963.
32. Karthikeyan, N.S.; Sathiyanarayanan, K.I.; Aravindan, P.G.; Giridharan, P. Med. Chem. Res. 2011,
20, 81.
33. Liang, G.; Li, X.; Chen, L.; Yang, S.; Wu, X.; Studer, E. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 1525.
34. Liang, G.; Yang, S.; Xiao, J. Eur. J. Med. Chem. 2008. doi:10.1016/j.ejmech.2008.01.031.
35. Wang, R.; Chen, C.; Zhang, X.; Zhang, C.; Zhong, Q.; Chen, G.; Zhang, Q.; Zheng, S.; Wang, G.;
Chen, Q.H. J. Med. Chem. 2015, 58, 4713.
36. Borsche, W.; Geyer, A. Ann. 1912, 393, 29.
37. Yin, S.; Zheng, X.; Yao, X.; Wang, Y.; Liao, D. J. Cancer Ther. 2013, 4.
38. Sehnal, P.; Taghzouti, H.; Fairlamb, I.J. S.; Jutand, A.; Lee, A.F.; Whitwood, A.C. Organometallics
2009, 28, 82.
39. Larsen, R.O.; Aksnes, G. Phosphorus Sulfur 1983, 15, 218.
40. Lefèbvre, G.; Seyden-Penne, J. J. Chem. Soc .1970, 1308.
Bronnen
55
41. Weber, W.M.; Hunsaker, L.A.; Roybal, C.N.; Bobrovnikova-Marjon, E.V.; Abcouwer, S.F.; Royer,
R.E.; Deck, L.M.; Vander Jagt, D.L. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 2450.
42. Shetty, D.; Kim, Y.J.; Shim, H.; Snyder, J.P. Molecules. 2015, 20, 249.
43. Lu, Y.; Wang, Y.; Zhu, W. Phys. Chem. Chem. Phys. 2010, 12, 4543.
44. Xu, Z.; Yang, Z.; Liu, Y.; Lu, Y.; Chen, K.; Zhu, W. J. Chem. Inf. Model. 2014, 54, 69.
45. Ohori, H.; Yamakoshi, H.; Tomizawa, M.; Shibuya, M.; Kakudo, Y.; Takahashi, A.; Takahashi, S.;
Kato, S.; Suzuki, T.; Ishioka, C.; Iwabuchi, Y.; Shibata H. Mol. Cancer Ther. 2006, 5, 2563.
46. Li, Y.; Zhang, L.P.;Dai, F.; Yan, W.J.; Wang, H.B.; Tu, Z.S.; Zhou, B. J. Agric. Food Chem. 2015, 63,
7731.
47. Andrew Brown, A.; Shi, Q.; Moore, T.W.; Yoon, Y.; Prussia, A.; Maddox, C. Liotta, D.C.; Shim, H.;
Snyder, J.P. J. Med. Chem. 2013, 56, 3456.
48. Roth, B. L.; Sheffler, D. J.; Kroeze, W. K. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 353.
49. Elias, R.S.; Saeed, B.A.; Saour, K.Y.; Al-Masoudi, N.A. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3049.
50. Amr, A.G.E; Mohamed, A.M.; Mohamed, S.F.; Abdel-Hafez, N.A.; Hammam, A.E.F.G. Bioorg.
Med. Chem. 2006, 16, 5481.
51. Jurenka, S.J. Altern. Med. Rev. 2009, 14, 141.