Synthese van 5-hydroxyalkylamino- en 5-methoxyalkylamino...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2015 – 2016

Synthese van 5-hydroxyalkylamino- en 5-methoxyalkylamino-1,7-diarylhepta-1,4,6-triëen-3-onen als nieuwe

stikstofanaloga van curcumine

Lore Vannecke Promotor: Prof. dr. ir. Matthias D’Hooghe Tutor: ir. Rob De Vreese

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: chemie en bioprocestechnologie

De auteur en de promotor geven toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en

delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van

het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te

vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts

of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specially the source must

be extensively specified when using results from this thesis.

Gent, januari 2016

De promoter, De auteur,

Prof. dr. ir. M. D’Hooghe L. Vannecke

Woord vooraf Deze Masterproef is het sluitstuk van mijn studiejaren aan de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

van de Universiteit Gent. Het waren super boeiende jaren: er werd heel veel bijgeleerd,

vriendschappen voor het leven gesloten, hard gestudeerd, enorm veel plezier gemaakt en de grote

stad Gent werd mijn tweede thuis. Ik zal deze periode steeds blijven koesteren en altijd een beetje

missen. Maar nu is het tijd voor een nieuw hoofdstuk in mijn leven, het werkleven.

Deze Masterproef was misschien toch al een voorsmaakje van het echte werkleven. Voor het

bekomen van deze thesis werd iedere werkdag, van ‘s ochtends tot ‘s avonds, in het labo gewerkt. Er

werd hard gewerkt. Maar er werd ook gelachen. Het zijn er niet velen die dit kunnen zeggen maar ik

heb echt genoten van mijn thesisperiode.

In dit woord zou ik graag enkele mensen bedanken. De twee belangrijkste personen voor het

bekomen van deze Masterproef zijn mijn promotor en mijn tutor.

Mijn promotor, Professor Matthias D’Hooghe, bedankt om te mogen thesissen aan uw vakgroep. Ik

werd uitstekend begeleid. De raad, ideeën en chemische kennis die u bood tijdens de maandelijkse

meetings zorgden ervoor dat ik steeds doelgericht kon werken. U weet uw studenten enorm te

motiveren!

Mijn tutor, Rob De Vreese, vanaf dag één wist ik dat je een goede begeleider zou zijn. Je stelde mij

meteen op mijn gemak. Je stond altijd onmiddellijk klaar om vragen te beantwoorden, hulp te bieden

en nieuwe voorstellen te doen. Bovendien weet je het perfecte evenwicht te geven tussen

zelfstandig en begeleid werken. Ook een grote dank voor de vele verbeterrondes van deze thesis.

Jouw kennis, inzicht en ervaring hebben mij enorm veel geholpen!

Verder zou ik graag alle doctoraat- en thesisstudenten bedanken. Jullie stonden altijd paraat om te

antwoorden en te helpen bij slimme en minder slimme vragen.

Mijn labotafel bevond zich in het kleine labo. De sfeer in het kleine labo was echt gezellig, maar die

was er niet geweest zonder de mensen die er werkten. Rob, Yves, Melissa, Laurens, Jeroen en Benz,

bedankt voor de goede sfeer en alle hulp die jullie boden. Flore, Dries en Tim, mijn medestudenten

uit het kleine labo, met jullie heb ik zoveel plezier gehad. Iedere dag waren we blij om elkaar terug te

zien. We houden contact, dit staat vast.

Bruno, mijn vriend, ik zou je graag bedanken, gewoon al om er altijd te zijn voor mij. Jij kan mij als

geen ander kalmeren, maar je maakt mij vooral supergelukkig.

Als laatste zou ik graag mijn papa, mama, mijn zussen Annelies en Lotta en mijn broer Tom willen

bedanken. Het leven in Gent was leuk, maar in het weekend kwam ik maar al te graag naar huis om

jullie te zien. Papa en mama, bedankt om mij zo goed te steunen tijdens deze studiejaren en door te

zeggen dat ik het wél kan.

Lore Vannecke, januari 2016

Inhoudsopgave 1 Situering en doel.............................................................................................................................. 1

1.1 Situering .................................................................................................................................. 1

1.2 Doel ......................................................................................................................................... 3

2 Literatuuroverzicht .......................................................................................................................... 6

2.1 Synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 ................................................................ 6

2.1.1 Zuur-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen ........................... 7

2.1.2 Base-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen ........................... 8

2.2 1,5-Diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 met potentiële antikanker-activiteit ......................... 12

2.2.1 (1E,4E)-1,5-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)penta-1,4-dieen-3-on 15 ........................ 14

2.2.2 Gehalogeneerde analogen ............................................................................................ 14

2.2.3 Analogen met trimethoxyfenylgroepen ........................................................................ 15

2.2.4 Heteroaromatische analogen ........................................................................................ 16

2.3 Conclusie ............................................................................................................................... 18

3 Bespreking van de resultaten ........................................................................................................ 19

3.1 Synthese van nieuwe stikstofanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 ..... 19

3.1.1 Synthese van enamineanalogen van curcuminoïden door nucleofiele aditie van

aminoalcoholen ............................................................................................................................. 21


aminoëthers .................................................................................................................................. 30

3.2 Oplosbaarheid en biologische testing ................................................................................... 34

4 Samenvatting en besluit ................................................................................................................ 38

4.1 Samenvatting ......................................................................................................................... 38

4.2 Besluit .................................................................................................................................... 40

5 Experimenteel deel........................................................................................................................ 43

5.1 Methodologie ........................................................................................................................ 43

5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC) ................................................................................... 43

5.1.2 Kolomchromatografie ................................................................................................... 43

5.1.3 Vloeistofchromatografie ............................................................................................... 43

5.1.4 Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) ............................................. 43

5.1.5 Massaspectrometrie (MS) ............................................................................................. 43

5.1.6 Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) ................................................................ 43

5.1.7 Smeltpuntbepaling ........................................................................................................ 44

5.1.8 Microgolfreactor ............................................................................................................ 44

5.2 Veiligheid ............................................................................................................................... 44

5.2.1 Algemene veiligheidsmaatregelen in het chemisch labo .............................................. 44

5.2.2 Risico’s verbonden aan gebruikte reagentia en solventen ........................................... 44

5.3 Beschrijving van de experimenten ........................................................................................ 46

5.3.1 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,4,6-

heptatriëen-3-onen 56 en 64 ........................................................................................................ 46

5.3.2 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-onen 58

en 66…….. ...................................................................................................................................... 48

5.3.3 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57b, 59a en 67b ........................................... 51

Bronnen ................................................................................................................................................. 53

Situering en doel

1

1 Situering en doel

1.1 Situering Curcumine is de gele kleurstof van het kruid kurkuma, een poeder bekomen uit de gedroogde

wortelstokken van Curcuma longa, een plant die tot de gemberfamilie behoort. Kurkuma geeft de

typisch gele kleur aan kerriepoeder en wordt zeer veel gebruikt in de oosterse keuken.1 Het

kurkumapoeder bevat oliën, proteïnen, mineralen, koolhydraten, vocht en curcuminoïden.

Curcuminoïden zijn een mengsel van ondermeer drie componenten: curcumine 1 (77 %),

demethoxycurcumine 2 (17 %) en bisdemethoxycurcumine 3 (3 %).2, 3

De IUPAC- (International Union of Pure and Applied Chemistry) naam van curcumine 1 is 1,7-bis-(4-

hydroxy-3-methoxyfenyl)-hepta-1,6-diëen-3,5-dion. De pKa-waarden van de drie zure protonen,

waaronder twee fenolische protonen en één proton op het C4-koolstofatoom, van curcumine 1

bedragen respectievelijk 9,0, 8,5 en 7,8.4 Curcumine 1 is zo goed als onoplosbaar in water maar is

oplosbaar in methanol, ethanol, dimethylsulfoxide en aceton.2, 5 De moleculaire configuratie van de

stof bestaat uit twee tautomere vormen, namelijk een diketo- 4 en enolvorm 5. Onder zure en

neutrale omstandigheden en in vaste vorm domineert de diketovorm 4 en onder basische

omstandigheden de enolvorm 5.3, 6

Bij een basische pH is curcumine 1 onstabiel en ondergaat de verbinding snelle hydrolytische

degradatie. Curcumine 1 valt dan uiteen in volgende metabolieten: feruloylmethaan 6 (IUPAC-naam:

E-4-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)but-3-een-2-on), ferulinezuur 7 en vanilline 8. Deze laatste is het

secundair degradatieproduct van feruloylmethaan 6, gevormd door hydrolyse.4

Situering en doel

2

De biologische activiteiten van curcumine 1 zijn zeer breed en omvatten antioxidant-, anti-

inflammatoire-, antibacteriële-, antivirale-, antifungale- en antikankeractiviteiten. De stof werkt in op

zeer veel moleculaire targets die een rol spelen in (inflammatoire) ziekten zoals bijvoorbeeld kanker.

Deze targets zijn ondermeer transcriptiefactoren, groeifactoren, bepaalde celreceptoren, cytokinen,

kinasen, bepaalde enzymen, moleculen die een rol spelen in de metastase (of uitzaaiing) van kanker,

en moleculen die van belang zijn bij de apoptose (of geprogrammeerde celdood) van cellen, en

worden weergegeven in Figuur 1. Door de grote verscheidenheid aan moleculaire targets waarop

ingewerkt wordt, kan curcumine 1 tussenkomen in bijna elk kankerstadium. Curcumine 1 zou dus een

veelbelovende verbinding kunnen zijn in 'Targeted Molecular Therapy' bij de behandeling van kanker

omdat de stof meerdere signaaltransducties in kankercellen kan onderdrukken, maar niet gaat

inwerken op normale cellen. Dit in tegenstelling tot een kankerbehandeling met chemotherapie,

waar een chemische verbinding alle snel delende cellen gaat vernietigen en dus ook snel delende

normale cellen.1

Figuur 1. Verschillende targets die gereguleerd kunnen worden door curcumine 11

Situering en doel

3

Naast al deze positieve biologische activiteiten hierboven weergegeven heeft curcumine 1 toch één

groot nadeel, dat zorgt voor een belemmering in het medicinale gebruik van de verbinding, en dit is

de lage biologische beschikbaarheid of biobeschikbaarheid. De belangrijkste redenen voor deze lage

biobeschikbaarheid zijn: lage absorptie, snelle biodegradatie, inactiviteit van de metabolieten 6, 7 en

8, en snelle excretie.7 Om deze problemen te overkomen, werden reeds meerdere oplossingen

onderzocht.

Een eerste mogelijke oplossing omvat het gebruik van hulpstoffen die ervoor zorgen dat

metabolische pathways van curcumine 1 geblokkeerd worden. Een voorbeeld van zo’n hulpstof is

piperine, beter gekend als zwarte peper. Bij toediening van piperine als hulpstof bij curcumine,

zorgde dit voor een verhoging van 2000% in serumconcentratie van curcumine 1 bij de mens. Dit

betekent dat de biobeschikbaarheid sterk kan toenemen door toediening van een hulpstof.8

Waar eveneens uitvoerig onderzoek naar verloopt, is het gebruik van nanopartikels

(nanocurcumine), liposomen, micellen en fosfolipiden om de beschikbaarheid te verhogen. Deze

methoden worden dikwijls toegepast om de opname van stoffen in biologisch weefsel te

vergemakkelijken.

Een laatste interessante oplossing voor de lage biobeschikbaarheid van curcumine 1 is het gebruik

van curcumineanalogen: het curcuminemolecule ondergaat een structurele modificatie met als doel

de biobeschikbaarheid te verhogen en de bioactiviteit te behouden of zelfs te verhogen.1, 7 De waaier

aan bekende curcumineanalogen is reeds zeer breed. In deel twee (Literatuuroverzicht) van deze

Masterproef wordt één groep van deze analogen besproken, met name de monocarbonylanalogen.

1.2 Doel De “SynBioC Research Group” van de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) doet al enkele

jaren onderzoek naar de synthese en activiteit van curcumineanalogen. Zoals in deel 1.1 Situering

weergegeven, bezit curcumine 1 een lage oplosbaarheid in water en een daarmee gepaard gaande

lage biologische beschikbaarheid. Door het invoeren van stikstofatomen in de molecule zullen de

chemische eigenschappen van de molecule veranderen, hetgeen de biobeschikbaarheid mogelijk ten

goede kan komen. In voorgaande Masterproeven 9, 10 aan de “SynBioC Research Group” werden

enaminederivaten 9 en 10 van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 gesythetiseerd uitgaande

van volgende alkylaminen: propylamine, isopropylamine, allylamine, butylamine, sec-butylamine,

isobutylamine en cyclohexylamine. In onderstaand schema worden deze reacties in detail

weergegeven.

Situering en doel

4

Uit biologische testing 11 bleek de wateroplosbaarheid van deze gesynthetiseerde stikstofderivaten

van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 niet beter te zijn dan die van curcumine 1. Daarom

doelt voorliggende Masterproef op de synthese van meer polaire enamineanalogen 11 en 12 van

curcumine door gebruik te maken van meer polaire aminen 13, zoals aminoalcoholen, aminoëthers,

aminozuren en aminoësters, om zo de partitiecoëfficiënt (logP) van deze analogen te doen dalen met

een mogelijk beter farmacologisch profiel tot gevolg.

Situering en doel

5

In voorafgaande Masterproeven werd reeds gezocht naar een methode voor de synthese van

enamineanalogen 9, 10 en toen bleek de reactie het best te lukken onder invloed van

microgolfbestraling (MW). Deze Masterproef zal van deze methode gebruik maken om curcumine 1

en bisdemethoxycurcumine 3 te imineren met polaire aminen 13 ter vorming van nieuwe

enamineanalogen 11 en 12 van curucmine 1 en bisdemethoxycurcumine 3.

De enamineanalogen 9 en 10 van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 gesynthetiseerd in

vorige twee Masterproeven werden eerder ook reeds in vitro getest op enkele kankercellijnen.9, 10, 11

Niettegenstaande dat de oplosbaarheid van deze enamineanalogen niet verbeterd was tegenover

curcumine 1, vertoonden ze wel een verhoogde cytotoxiciteit in vergelijking met curcumine 1, met

de bisdemethoxycurcuminederivaten 10 als de best scorende verbindingen. De enamineanalogen 11

en 12 die in deze Masterproef gesynthetiseerd zullen worden, gaan in een volgende stap ook getest

worden op hun biologische activiteit en aan de hand van de bekomen resultaten zal een SAR

(Structure Activity Relationship) opgesteld worden.

Literatuuroverzicht

6

2 Literatuuroverzicht Curcumine 1 blijkt in vitro en in vivo een fragiele, zwak farmacokinetische verbinding te zijn. Eén van

de mogelijke oorzaken is de aanwezigheid van een -diketolinker in de structuur, die onstabiel is bij

neutrale en basische pH.12, 13 Daarnaast is in verschillende studies aangetoond dat de beta-diketo-

eenheid mogelijk een substraat kan zijn van aldo-ketoreductasen, waardoor curcumine wellicht snel

afgebroken wordt.14, 15 De affiniteit tussen deze enzymen en curcumine wordt echter wel geprezen

bij de behandeling van diabetes, waar curcumine een rol zou kunnen spelen als non-competitieve

inhibitor en zo de opstapeling van sorbitol verlaagt.16 Monocarbonylanalogen van curcumine, en

meer specifiek symmetrische 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14, met meest eenvoudige vorm

verbinding 15, bezitten deze onstabiele -diketostructuur niet en kunnen mogelijk farmacokinetisch

stabiele bioisosteren zijn van curcumine. Het bestuderen van de synthese, biologische activiteit en

farmacokinetische eigenschappen van deze verbindingen is een belangrijk topic in de medicinale

chemie gezien de veelbelovende eigenschappen van curcumine. In deze literatuurstudie zal dieper

ingegaan worden op de verschillende manieren om symmetrische 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen

14 van curcumine aan te maken, en vervolgens wordt een overzicht gegeven van de meest potentiële

antikanker verbindingen, de meest bestudeerde toepassing van dit type verbindingen.

2.1 Synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 Er werden reeds een duizendtal monocarbonylanalogen 14 van curcumine gesynthetiseerd. De

synthese kan op verschillende manieren gebeuren, maar verloopt voornamelijk via een

gekatalyseerde Claisen-Schmidtcondensatie. Via deze methode zal een (cyclisch) keton 16 tweemaal

een condensatiereactie ondergaan met een aromatisch aldehyde 17, waarbij tweemaal water wordt

uitgestoten.

De toegepaste ketonen 16 en aldehyden 17 zijn omvangrijk. Voorbeelden van ketonen zijn enerziijds

de lineaire en cyclische alkanonen: aceton, cyclopentanon, cyclohexanon,… en anderzijds de

heterocysclische alkanonen: piperidin-4-onen, tetrahydro(thio)pyran-4-onen,… Ook de waaier aan

gebruikte aldehyden is enorm breed. Het gaat om arylaldehyden en heteroarylaldehyden (Ar = aryl of

Literatuuroverzicht

7

heteroaryl) die gesubstitueerd kunnen zijn met alkyl-, aryl-, hydroxy-, alkoxy-, halogeen- en nog tal

van andere groepen.

In ondergaande subsecties zullen de verschillende syntheseroutes besproken worden, waarbij een

onderscheid gemaakt wordt tussen zuur-gekatalyseerde methoden en base-gekatalyseerde

methoden.

2.1.1 Zuur-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen

Reeds veel monocarbonylanalogen 14 van curcumine zijn bereid via een zuur-gekatalyseerde

methode. De methode bestaat uit een aldolcondensatiereactie tussen het gewenste aldehyde 17 en

keton 16 in de aanwezigheid van een zure katalysator (HA).

Hieronder is het reactiemechanisme om verbindingen 14 te synthetiseren weergegeven. Het bestaat

uit een opeenvolging van evenwichtsreacties en start met de activering van het keton 16 door middel

van een protonering door de zure katalysator. Vervolgens wordt dit keton gedeprotoneerd op het -

koolstofatoom en wordt een enol 18 gevormd. Daarna wordt het geprotoneerde aldehyde 17

aangevallen door het enol en wordt een positief geladen intermediair 19 gevormd. In de volgende

stap wordt het gevormde intermediair gedeprotoneerd en ontstaat een aldolproduct 20. De laatste

stap is de dehydratatie doordat een protonering van de alcoholgroep plaatsvindt en zo een goede

leavinggroep ontstaat. Het eindresultaat is een ,-onverzadigd keton 21. Deze reactie vindt

tweemaal plaats, namelijk aan beide zijden van het keton 16.24

Er zijn reeds verschillende reactieomstandigheden toegepast voor de synthese van

monocarbonylanalogen 14 van curcumine, waar telkens waterstofchloride als zure katalysator wordt

Literatuuroverzicht

8

gebruikt. Sardjiman et al.17 waren de eersten die verschillende monocarbonylanalogen 14 van

curcumine synthetiseerden met behulp van een zuurgekatalyseerde methode, gebaseerd op het

patent van Rumpel (1954),25 en behaalden rendementen van 43 tot 100 procent.17 Deze methode

was echter nog niet optimaal want de reactie duurde twee tot zeven dagen en de verhouding keton-

aldehyde was ook zeer uiteenlopend. Een ander protocol dat werd toegepast maakt gebruik van

ultrasone bestraling die de reactietijd sterk reduceerde tot twee uur.22 Maar de hedendaags, meest

toegepaste zuurgekatalyseerde methode is deze volgens Du et al., die een gemodificeerde vorm is

van de procedure volgens Sardjiman.18 Het grote verschil is dat de reactie gebeurt in ijsazijn en

telkens eenzelfde verhouding van aldehyde 17 en keton 16 wordt gebruikt, respectievelijk 2:1.

Daarnaast wordt nog waterstofchloride toegevoegd als zure katalysator en ontstaan verbindingen 14

in een opbrengst van 45 tot 98 procent.

In onderstaand schema wordt één representatief voorbeeld weergegeven van de hierboven

beschreven methode. De gesubstitueerde arylaldehyden 22a-e worden gekoppeld met een halve

equivalent tetrahydropyran-4-on door middel van een aldolcondensatie, die gekatalyseerd wordt

door een verzadigde oplossing van zoutzuur in ijsazijn. Op deze manier worden verbindingen 23a-e

gevormd. In Tabel 1 worden de verschillende substituenten weergegeven van verbindingen 23a-e

met hun bijhorende rendementen.21

Tabel 1. Substituenten en rendementen van de verkregen monocarbonylanalogen 23a-e uit een zuur-gekatalyseerde aldolcondensatie

21

Verbinding R1 R

2 R

3 R

4 Rendement na zuivering (%)

23a H H OH H 75

23b H H OCH3 H 78

23c H OCH3 OH OCH3 63

23d H OCH3 OCH3 OCH3 61

23e OCH3 OCH3 OCH3 H 53

2.1.2 Base-gekatalyseerde synthese van 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen

De base-gekatalyseerde synthese van monocarbonylanalogen 14 van curcumine verloopt

voornamelijk via een aldolcondensatie, maar er werd ook één recent artikel in de literatuur

Literatuuroverzicht

9

teruggevonden waar een andere methode beschreven wordt, namelijk de synthese via de Horner-

Wadsworth-Emmons-reactie. Deze twee methodes worden hieronder toegelicht.

2.1.2.1 Base-gekatalyseerde synthese via een aldolcondensatie

De base-gekatalyseerde synthese via een aldolcondensatiereactie gebeurt tussen het gewenste

aldehyde 17 en keton 16 in de aanwezigheid van een basische katalysator (:B).

Het reactiemechanisme voor de base-gekatalyseerde synthese van monocarbonylanalogen 14, die

hieronder weergegeven wordt, is wederom een opeenvolging van evenwichtsreacties en start met

een deprotonering van het -koolstofatoom van keton 16 zodat een enolaatanion 24 gevormd

wordt. Dit enolaatanion gaat vervolgens nucleofiel aanvallen op de carbonylfunctie van het aldehyde

17 met vorming van een alkoxide 25. De volgende stap bestaat uit de protonering van dit alkoxide

waardoor het aldolproduct 26 ontstaat. De laatste stap is een E1cb-eliminatie, die bewerkstelligd

wordt door -deprotonering door de base met vorming van een enolaat 27 die dan een hydroxideion

gaat uitstoten. Verbinding 28 ondergaat dit mechanisme nog een tweedemaal met vorming van het

monocarbonylanaloog 14 van curcumine.24

Voor deze reacties worden verscheidene reactieomstandigheden gerapporteerd. Als basische

katalysatoren worden natriumhydroxide,20, 21, 23, 26, 27, 29 – 31, 33, 34 natriumbicarbonaat,28, 30

ammoniumacetaat 32 en kaliumcarbonaat gebruikt.29, 35 Bovendien kunnen de reacties plaatsvinden

in verschillende solventen, namelijk ethanol,20, 21, 23, 27, 29 - 34 methanol 28, 30 en het ternaire solvent,

tolueen-ethanol-water (4:4:2).29 Gedurende de reacties wordt ook soms een hoeveelheid

Literatuuroverzicht

10

cetyltrimethylammoniumbromide toegevoegd als emulgator om het monocarbonylanaloog 14

efficiënt te bekomen.20, 31

De eerste monocarbonylanalogen 14 van curcumine, gesynthetiseerd in basische

reactieomstandigheden, werden bereid via de gepatenteerde procedure van Borsche en Geyer.26, 36

Daarna werd de procedure steeds verder geoptimaliseerd tot Lee et al. een procedure vond met een

kortere reactietijd (10 – 24 uur, in vergelijking met 2 dagen), waarbij het gewenste aldehyde 17 en

keton 16 in een 2:1 verhouding reageren.27, 37 Het merendeel van de reeds bestaande

monocarbonylanalogen 14 werd dan ook op deze manier gesynthetiseerd.

Ter illustratie wordt hieronder het reactieschema gegeven van verbindingen 30a-m, gesynthetiseerd

volgens deze methode. Aan een mengsel van twee equivalenten arylaldehyde 29 en één equivalent

1-methylpiperidin-4-on in ethanol werd één molair oplossing van natriumhydroxide (1,33

equivalenten) in water toegevoegd. Op deze manier werden verbindingen 30a-m gevormd. In Tabel

2 wordt informatie gegeven omtrent de arylgroepen en de rendementen.

Tabel 2. Arylgroepen en rendementen van de verkregen monocarbonylanalogen 30a-m uit een base-gekatalyseerde aldolcondensatie

30

Verb. Ar Rendement na zuivering

(%) Verb. Ar

Rendement na zuivering

(%) Verb. Ar

Rendement na zuivering

(%)

30a

-a

30f

-a 30k

41

30b

-a 30g

-

a 30l

66

30c

-a 30h

63 30m

-a

30d

-a 30i

-a

30e

-a 30j

35

a rendement niet gerapporteerd in de literatuur

Literatuuroverzicht

11

2.1.2.2 Base-gekatalyseerde synthese via de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie

Recent werd een nieuwe methode toegepast voor de synthese van monocarbonylanalogen 14 van

curcumine die gebruik maakt van de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie. In deze reactie reageert

tetraethyl-(2-oxopropaan-1,3-diyl)-bisfosfonaat met aldehyde 17, in het bijzijn van de basische

katalysator kaliumcarbonaat, ter vorming van gewenste monocarbonylanalogen 14 in rendementen

van 34 tot 99 procent.35, 38

Het reactiemechanisme start met de deprotonering van tetraethyl-(2-oxopropaan-1,3-diyl)-

bisfosfonaat 31, waardoor een carbanion gevormd wordt. Dit carbanion gaat nucleofiel adderen aan

de carbonylgroep van het aldehyde 17 met vorming van een negatief geladen intermediair 32.

Daarna wordt het intermediair omgezet naar een cyclische vorm 33 door de vorming van een zeer

stabiele zuurstof-fosforbinding. Vervolgens vindt in de laatste stap gemakkelijk eliminatie van

diëthylfosfaat plaats waardoor verbinding 34, die een dubbele binding bevat, gevormd wordt. Dit

mechanisme gebeurt tweemaal.39, 40

Deze methode werd onlangs toegepast voor de synthese van een specifieke groep van

monocarbonylanalogen, namelijk deze met heteroaromatische ringen (Ar = heteroaryl), omdat men

ondervond dat de synthese van zulke derivaten minder gemakkelijk verloopt via de gebruikelijke

aldolcondensatie in vergelijking met derivaten met gewone aromatische ringen. Enkele voorbeelden

van heteroarylgroepen die gebruikt worden zijn: imidazolyl, pyrazolyl, (iso)-oxazolyl, (iso)thiazolyl of

pyridinyl. Daarenboven kunnen deze heteroarylgroepen gesubstitueerd zijn met bijvoorbeeld alkyl-

alkoxy-, aryl-, heteroaryl- en nog tal van andere groepen.

Literatuuroverzicht

12

In onderstaand schema wordt een voorbeeld weergegeven van een monocarbonylanaloog 37 dat

gesynthetiseerd wordt m.b.v. de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie. Eerst wordt het gewenste

aldehyde 36 gevormd door alkylering van 1H-imidazool-2-carbaldehyde 35. Vervolgens ondergaat

verbinding 36 de Horner-Wadsworth-Emmons-reactie met vorming van analoog 37 in 99 %

rendement.35

2.2 1,5-Diarylpenta-1,4-dieen-3-onen 14 met potentiële antikanker-

activiteit Ten gevolge van het interessant biologisch en farmacokinetisch profiel van monocarbonylanalogen

van curcumine werden reeds honderden van deze verbindingen gesynthetiseerd en getest op hun

biologische activiteit. Aan deze monocarbonylanalogen worden heel wat biologische activiteiten

toegeschreven, zoals bijvoorbeeld de inductie van apoptose en inhibitie van groei en proliferatie.

Deze activiteiten kunnen via verschillende biochemische pathways tot uiting komen. Zo kunnen deze

monocarbonylanalogen bijvoorbeeld de activatie van NF-B inhiberen en de generatie van ‘reactive

oxygen species’ (ROS) bewerkstelligen.41 Gezien het volledig bespreken van alle activiteiten van deze

verbindingen te uitgebreid zou zijn voor een literatuurstudie binnen deze Masterproef, zal deze

sectie zich toespitsen op de meest belovende antikankerverbindingen en zal, indien informatie

beschikbaar is, dieper ingegaan worden op de farmacokinetische eigenschappen van deze

verbindingen. Bovendien wordt bij het testen op potentiële antikankeractiviteit van

monocarbonylanalogen, vooral gebruik gemaakt van fenotypische testen zoals antiangiogenese en

apoptose van cellen, veel eerder dan het identificeren van pathways of specifieke targetproteïnen.42

In Tabel 3 worden de in vitro resultaten van de cytotoxiciteit van veelbelovende

monocarbonylanalogen en curcumine weergegeven. Deze monocarbonylanalogen zullen hieronder

meer in detail toegelicht worden. Bij het bekijken van de tabel is het belangrijk om de waarde van

het monocarbonylanaloog te vergelijken met de waarde voor curcumine. Daarenboven is het ook

interessant om de waarde voor de kankercel te vergelijken met de waarde voor een normale

epitheelcel, namelijk MCF-10A, indien die beschikbaar is, om zo een beeld te krijgen van de

selectiviteit.

Literatuuroverzicht

13

Tabel 3. IC50-waarden (in µM) voor 3 dagen blootstelling

Verb x LNCaP PC-3 DU145 MCF-7 MDA-MB-231 Panc-1 BxPC-3 HT-29 MCF-10A RPMI 7951 H1299 heLa NF-B Ref.

1 19,6 +/- 3,7 19,8 +/- 2,1; 1,98

a 0,3a 21,5 +/-

4,7 25,6 +/- 4,8; 0,88a 30,1 +/- 3,7 4,5 +/- 2,1 12,11 +/- 0,67;

12,6a

15 +/- 5 20, 21, 23, 29, 30, 35

15 2,7 +/- 0,4 3,9 +/- 1,1 2,4 +/- 0,4 2,8 +/- 1,0 12

38 0,8 +/- 0,4 0,7 +/- 0,0 23

39 0,49 +/- 0,1 0,50 +/- 0,1

0,47 +/- 0,1

0,41 +/-0,1 19

40 4,63 +/- 1,0 3,38 +/- 0,4

21

41 0,5 +/- 0,1 2,1 +/- 1,1 0,4 +/- 0,1 0,6 +/- 0,1 1,68 +/- 0,2

>50 20

42 > 30 30

43 0,3 0,9 +/- 0,1

30

44 1,88 +/- 0,3 3,24 +/- 0,6

3,28 +/- 0,2

21

45 0,52 +/- 0,1 0,70 +/- 0,1

0,76 +/- 0,1

21

46

47 0,8 1,0 +/- 0,3

30

48 1,1 1,5 +/- 0,2

30

49 0,033 0,02 0,097 0,12 29

50 0,52 +/- 0,1 0,70 +/- 0,1

0,76 +/- 0,1

21

51 0,96 +/- 0,2 0,51 +/- 0,1

0,79 +/- 0,1

21

52 0,041a 0,016a 0,156a b 0,19a 29

53 0,046a 0,057a 0,15a b 0,39a 29

54 0,063a 0,035a 0,13a b 0,062a 29

55

0,60 +/-0,05

0,71 +/- 0,04 1,14 +/- 0,00

0,47 +/- 0,26 35

a IC50-waarden voor 5 dagen blootstelling

b vertonen geen cytotoxiciteit naar MCF-10A voor 1 µM

MDA-MB-231 en MCF-7 = borstkankercellen; RPMI 7951 = melanoomcel; PC-3, DU145 en LNCap = prostaatkankercellen; H1299 = longkankercel; Panc-1 en BxPC-3 = pancreaskankercellen; HT-29 = darmkankercel; hela = baarmoederhalskankercel; MCF-10A = normale epitheelcel

Literatuuroverzicht

14

2.2.1 (1E,4E)-1,5-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)penta-1,4-dieen-3-on 15

Monocarbonylanaloog 15 met hetzelfde substitutiepatroon op de aromaten als curcumine (3-

methoxy, 4-hydroxy) vertoont reeds een antiproliferatieve activiteit voor verschillende

kankercellijnen bij een concentratie die 5 tot 6 keer lager is dan van curcumine 1.20 Dit bevestigt

onmiddellijk het grote potentieel van monocarbonylanalogen.

2.2.2 Gehalogeneerde analogen

Een groep van verbindingen die zeker het vermelden waard is, zijn de gehalogeneerde analogen.

Halogeenatomen worden ingebouwd in farmaceutische stoffen om o.a. de membraanpermeabiliteit

te verhogen en metabolische degradatie te verlagen.43 Dit zijn twee eigenschappen waar curcumine

minder goed op scoort, en die dus verbeterd kunnen worden. Bovendien zijn vijftig procent van de

meest toonaangevende medicijnen op de markt gehalogeneerd.44

Er zijn reeds veel gehalogeneerde monocarbonylanalogen van curcumine gesynthetiseerd en in vitro

getest. In deze groep vallen voornamelijk gehalogeneerde derivaten 38 en 39 op gezien hun

uitstekend antikankerpotentieel.

Verbinding 38 is een gefluoreerd bis-benzylideen-piperidinon (als azijnzuurzout), dat in vitro getest

werd op anti-angiogeneseactiviteit in melanoom- en borstkankercellen (zie bovenstaande tabel).23

Verder werd fluorderivaat 38 ook in vivo getest op borsttumoren van muizen. Men liet de tumor

twee weken groeien en daarna diende men gedurende twee weken een dosis van 100 mg/kg

subcutaan toe. Na 2 weken van toediening was het tumorgewicht gemiddeld 55% gedaald en werden

geen schadelijke neveneffecten waargenomen. Verbinding 38 lijkt dus veel potentieel te hebben als

chemotherapeutische stof en veel veiliger te zijn dan het hedendaags gebruikt antitumormiddel

Cisplatin.23 Wat de structuur-activiteitrelatie betreft, leidt fluorering op de orthopositie van beide

fenylgroepen tot een verbeterde cytotoxiciteit tegen kankercellen in vergelijking met curcumine.

Literatuuroverzicht

15

Fluorering op de meta- en/of parapositie daarentegen niet.23 Dit betekent dat zowel de natuur van

de substituenten als hun positie een rol speelt bij de activiteit.19

Een ander interessant gehalogeneerd analoog is verbinding 39.19 Deze gehalogeneerde verbinding

heeft een drie keer sterkere cytoxiciteit dan zijn niet gehalogeneerde variant. Daarenboven zorgen

de drie methoxygroepen, gesubstitueerd op de aromatische ringen, ook voor een sterk verhoogde

activiteit in vergelijking met de mono-, en di-gesubstitueerde varianten. Het belang van de drie

methoxygroepen wordt uitgebreider besproken in sectie 2.2.3

2.2.3 Analogen met trimethoxyfenylgroepen

Na evaluatie van de literatuur werd duidelijk dat de aanwezigheid van meerdere elektronenrijke

methoxygroepen op de aromatische ringen een positieve invloed heeft op de activiteit van

curcumine-analogen, daarom wordt een specifieke subsectie aan deze analogen besteed. Ohori et al.

(2006) waren de eersten die een analyse maakten omtrent de invloed van het aantal

methoxygroepen op de aromatische ringen. Ze concludeerden dat een toename leidde tot een hoger

potentieel tot groeionderdrukking van kankercellen en chemopreventie. Ze synthetiseerden

verbinding 40, die de eerste is in de reeks van monocarbonylanalogen met drie methoxygroepen.45

Bovendien is de plaats van de methoxygroepen ook niet onbelangrijk. Uit structuur-activiteitanalysen

werd geconcludeerd dat 3,4,5-trimethoxyfenylgroepen zorgen voor een sterk verhoogde

cytotoxiciteit (IC50 < 1 µM), veel meer dan bij verbindingen met methoxygroepen op de 2-, 3- en 4-

plaats.21

Later werd verbinding 41 gesynthetiseerd en geëvalueerd op groei-inhibitie van kankercellen en

selectiviteit (IC50 normale cel/IC50 kankercel).20 Deze stof heeft een zeer hoge selectiviteit van 25 en

een sterke anti-proliferatieve activiteit met IC50 waarden lager dan 1 micromolair.

Gezien de positieve resultaten die verbinding 40 en 41 opleverden, werd verder onderzoek gevoerd

naar hun specifieke effecten in de cel.46 Hun antikankeractiviteit uit zich ondermeer in de

Literatuuroverzicht

16

overproductie van ROS. ROS zijn reactieve zuurstofspecies, die enerzijds kanker kunnen veroorzaken

door hun inwerking op DNA, maar anderzijds wanneer ze in enorm grote hoeveelheid aanwezig zijn

in kankercellen kunnen leiden tot apoptose van de cel. Verbindingen 40 en 41 zijn zachte

elektrofielen, of meer bepaald Michaelacceptoren, waardoor ze gemakkelijk covalent gaan binden

met nucleofiele eiwitten, die een rol spelen in de werking van het redoxbuffersysteem van

kankercellen. Wanneer eiwitten gebonden zijn met deze analogen, wordt dit redoxbuffersysteem

verstoord, wat zorgt voor de overproductie van ROS. Verbinding 41 is een minder sterke ROS-

generator dan verbinding 40, maar is wel een betere Michaelacceptor in de destabilisatie van

tubuline en is bovendien beter opneembaar door de cel, waardoor verbinding 41 in het algemeen

een hogere cytotoxiciteit heeft (zie tabel).

Verbindingen 42, 43, 44 en 45 zijn ook hexagemethoxyleerde monocarbonylanalogen.21, 30 Deze

verbindingen bezitten een cyclische ketonlinker, waarvan verbindingen 43, 44 en 45 een

heterocyclische linker bevatten. Wanneer naar de cytotoxicteit gekeken wordt, is het zeer opvallend

dat deze drie heterocyclische analogen een veel sterkere cytotoxiciteit bezitten dan verbinding 42.

Dit zou mogelijk te wijten zijn aan een hogere curcumine-DNA-interactie van de heterocyclische

analogen.

2.2.4 Heteroaromatische analogen

Heteroaromatische analogen kunnen mogelijk een oplossing bieden voor de slechte

biobeschikbaarheid van curcumine en worden daarom frequent bestudeerd.35 Daarnaast beschrijft

Samaan et al. (2014) dat stikstofbevattende heteroaromatische ringen kunnen dienen als

veelbelovende bioisosteren van gesubstitueerde fenylringen.29 Over verschillende jaren heen zijn

honderdtallen heteroaromatische monocarbonylanalogen gesynthetiseerd en getest. Onderstaande

verbindingen 46 tot en met 55 blijken na screening naar cytotoxiciteit, selectiviteit en NF-B-

activatie-inhibitie naar voor te komen als meest interessante analogen.21, 29, 30, 35

Literatuuroverzicht

17

Verbinding 55 bezit een goed farmacologisch profiel (door de aanwezigheid van thiazoolringen en

trifluoromethylgroepen), en werd tezamen met verbinding 53 reeds verder onderworpen aan in vivo

testen. De farmacokinetische eigenschappen van deze verbindingen werden bepaald door een dosis

van één mg/kg van de te onderzoeken stof oraal toe te dienen aan testmuizen. Hierna werd de

concentratie van de stof in het bloed gemeten 30 min, 1, 2, 4 en 24 h na toediening. Verbinding 53

vertoonde in deze test een licht verbeterde biobeschikbaarheid, met een 2- tot 10-voudige toename

in plasmaconcentratie na 4 en 24 h, in vergelijking met curcumine. Een beter score werd bekomen

voor verbinding 55, waarbij een grote toename in concentratie van de stof in het bloedplasma werd

waargenomen in vergelijking met curumine (58-, 21-, 28-, 533- en 653-maal hogere plasma

concentratie na 0.5, 1, 2, 4, 24 h). Uit de test op kankercellijnen blijkt daarenboven dat verbinding 55

een 11 tot 36 keer sterker inhibitie-effect heeft dan curcumine. Deze combinatie van verhoogde

biobeschikbaarheid en activiteit zorgt ervoor dat verbinding 55 de therapeutische efficiëntie bezit om

cytotoxisch te zijn voor kankercellen.

Verbinding 46 en 50 werden, samen met verbinding 38 verder onderzocht op hun mogelijke inhibitie

van 50 soorten kinasen, relevant in vele vormen van kanker. Kinasen zijn enzymen die een

fosforylering kunnen uitvoeren van een specifiek doeleiwit en zo het eiwit gaan activeren, en dit

zorgt ervoor dat er bepaalde chemische reacties en vervolgens signaaltransducties in de (kanker)cel

Literatuuroverzicht

18

gaan plaatsvinden. De fosforylering gaat gepaard met verbruik van energie (ATP). Uit dit onderzoek

kwam verbinding 46 naar voor als beste inhibitor en vertoonde meer dan 85 procent inhibitie voor

10 van de enzymen bij 5 µM, terwijl 22 andere enzymen voor meer dan 40 procent geblokkeerd

werden bij die concentratie. Er zijn verscheidene redenen voor de inhibitie van de kinasen door

monocarbonylanalogen, maar de belangrijkste reden is de competitie met ATP. Deze studie kwam

dus tot de conclusie dat monocarbonylanalogen pleiotrope inhibitoren kunnen zijn op verschillende

plaatsen in verschillende pathways in de cel.47

2.3 Conclusie Door de eliminatie van het zwakke ‘hart’ van curcumine, namelijk de diketostructuur, blijken

monocarbonylanalogen zeer interessante bioisosteren te zijn van curcumine die reeds uitgebreid

werden onderzocht. In het algemeen worden deze analogen op eenzelfde manier gevormd, namelijk

via een zuur- of base-gekatalyseerde aldolcondensatiereactie tussen een al dan niet commercieel

beschikbaar keton en aromatisch aldehyde. In het tweede deel van deze literatuurstudie werd aan de

hand van enkele veelbelovende 1,5-diarylpenta-1,4-dieen-3-onen aangetoond dat

monocarbonylanalogen veel potentieel bezitten als antikankergeneesmiddelen. Hierin is het duidelijk

geworden dat het soort linker en het substitutiepatroon op de aromatische ringen een belangrijke

invloed hebben op de mate van antikankeractiviteit. Roth et al. citeerde dat, door het toenemende

belang van “omen” (genoom, kinoom, proteoom, transcriptoom) en onze kunde om de complexe

pathways te verstaan en in kaart te brengen, deze monocarbonylanalogen een moleculaire klasse is

die in staat kan zijn meerdere enzymen te raken met een ‘magic shotgun’.48

Deze Masterproef haakt ook in op de synthese van analogen zonder een biologisch zwakke

diketogroep, door onderzoek te voeren naar de synthese van enamineanalogen van curcumine. De

synthese en evaluatie van monocarbonylanalogen zijn reeds zeer uitgebreid onderzocht, zoals blijkt

uit deze literatuurstudie. Daarentegen is het onderzoek naar enamineanalogen van curcumine een

quasi onontgonnen terrein. Desalniettemin bezitten enamineanalogen van curcumine evenzeer een

zeer interessant profiel. De aanwezigheid van een enaminestructuur in de verbinding zorgt voor de

vorming van een sterke interne waterstofbinding tussen de carbonylgroep en de aminogroep,

hetgeen mogelijk leidt tot een stabielere structuur dan curcumine. Daarnaast leidt de introductie van

een stikstof in de structuur tot een verhoogde polariteit. Beide fenomenen kunnen bijdragen ter de

vorming van meer stabiele en biobeschikbare analogen van curcumine.

Bespreking van de resultaten

19

3 Bespreking van de resultaten Deze Masterproef heeft als doel nieuwe enamineanalogen 11 en 12 van curcumine 1 en

bisdemethoxycurcumine 3 aan te maken met behulp van polaire aminen, om zo mogelijk de

oplosbaarheid van de verbindingen in water te verhogen. Voorgaande Masterproeven aan de

“SynBioC Research Group” van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) slaagden reeds in

de synthese van enamineanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met behulp van

minder polaire aminen, namelijk alkylaminen. Deze vertoonden echter geen verbeterde

wateroplosbaarheid in vergelijking met curcumine 1, maar wel een verhoogde activiteit en dan

voornamelijk de enamineanalogen van bisdemethoxycurcumine 3.9, 10, 11 Met het oog op de aanmaak

van enamineanalogen met een verhoogde wateroplosbaarheid en bioactiviteit werd in deze scriptie

gebruik gemaakt van meer polaire aminen. In dit hoofdstuk Bespreking van de resultaten, zal het

onderzoek naar de synthese van deze enamineanalogen toegelicht worden: In een eerste deel zullen

de reacties, met hun reactieomstandigheden, opwerking en zuivering in detail besproken worden,

waarbij een opdeling gemaakt wordt volgens het gebruikte polair amine. Vervolgens zullen in een

tweede deel de bekomen resultaten op een rijtje gezet worden en punten worden aangehaald

waarop gelet moeten worden bij de biologische testing van de gesynthetiseerde derivaten.

3.1 Synthese van nieuwe stikstofanalogen van curcumine 1 en

bisdemethoxycurcumine 3 In preliminair onderzoek betreffende de synthese van enamineanalogen van curcumine werd

gezocht naar een optimale methode voor de iminering van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine

3.9, 10 Na vele experimenten bleek de iminering van curcumine 1 met het gewenste alkylamine het

best te lukken onder microgolfbestraling (MW) in chloroform als solvent en met montmorillonietklei

en azijnzuur als katalysatoren. De iminering van bisdemethoxycurcumine 3 verliep niet goed in

chloroform, daarom werd gezocht naar een alternatief solvent om de reactie in uit te voeren. Na

grondige screening bleek 2-methyltetrahydrofuran een geschikt solvent.10


20

De toevoeging van een overmaat amine en azijnzuur bleek essentieel te zijn voor de volledige

omzetting van curcumine 1 of bisdemethoxycurcumine 3. Wat de zuivering van het reactiemengsel

betreft werden problemen ondervonden voor de bisdemethocurcuminedervaten 10a-c. Deze konden

niet gezuiverd worden via kolomchromatografie over silica (Hex/EtOAc 3/2) daar ze afgebroken

werden op de zure silicakolom. Daarom werd steeds kristallisatie toegepast, met lagere

rendementen tot gevolg (11-40 %), ten opzichte van de curcuminederivaten 9e-g (48-58 %).10

In deze Masterproef werd voor de synthese van enamineanalogen 11 en 12 van curcumine 1 en

bisdemethoxycurcumine 3 met polaire aminen vertrokken vanuit bovenstaande geoptimaliseerde

methode. In het algemeen bestaat het reactiemechanisme voor de synthese van enamineanalogen

van curcumine uit een nucleofiele additie van het amine aan één van de carbonylgroepen van

curcumine 1 of bisdemethoxycurcumine 3 en een daaropvolgende eliminatie van water. Azijnzuur is

als zure katalysator nodig om de carbonylgroep te activeren. De montmorillonietklei doet ook dienst

als zure katalysator en eveneens als droogmiddel.

Hieronder zullen de pogingen tot en de synthese van de verschillende enamineanalogen van

curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met gebruik van polaire aminen in detail toegelicht

worden. Door middel van de variabelen tijd en temperatuur werd gezocht naar de optimale

omstandigheden om de eindproducten te bekomen. De reacties werden steeds uitgevoerd op kleine

schaal: 1 mmol beginproduct en 5 ml solvent. Onderstaande bespreking is opgedeeld volgens het

soort polair amine dat gebruikt werd. In deze Masterproef werden twee typen van polaire aminen

onderzocht, namelijk aminoalcoholen en aminoëthers. In de toekomst zouden nog tal van andere

aminen kunnen worden onderzocht, zoals beschreven in deel 1.2 Doel.


21


aminoalcoholen

De iminering van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 werd uitgevoerd met twee soorten

aminoalcoholen, namelijk 2-amino-1-ethanol en 3-amino-1-propanol.

Zoals te zien in onderstaand reactieschema voor de synthese van enamineanalogen van curcumine 1

werd tijdens deze reactie niet enkel het gewenste enamineanaloog 56 gevormd maar ook een

cyclisch nevenproduct 57 met een 2,3-dihydropyridinonstructuur.

In Tabel 4 worden de verschillende pogingen die ondernomen werden om analogen 56a en b te

synthetiseren weergegeven. In de tabel worden onder meer de reactieomstandigheden, de

omzetting, de verhouding enamineanaloog/nevenproduct (56/57) en het rendement na zuivering

weergegeven.

Tabel 4. Verschillende pogingen tot synthese van analogen 56a en 56b

Reactie n Equiv. amine

Temp. (°C)

Tijd Solvent Equiv. Azijn-zuur

MK10 (massa-equiv.)

Omzet-ting (%)

a

Verhou-ding

56/57b

Rende-ment 56 (%)

1 1 5 80 1h30 2-Me-THF 1,2 1 0 -c

-d

2 1 10 100 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 0 -c

-d

3 1 10 100 1h30 EtOH 2,4 1,6 100

59/41 -d

4 1 10 80 1h30 EtOH 2,4 1,6 100 -c

10

5 1 10 80 1h EtOH 2,4 1,6 100 87/13 3

6 1 10 70 1h EtOH 2,4 1,6 100 59/41 9

7 1 10 50 1h EtOH 2,4 1,6 100 -c

-d

8 1 10 80 30min EtOH 2,4 1,6 100 63/37 -e

9 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,6 100 82/18 11

10 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,6 100 -c 8

(57 = 12) a bepaald aan de hand van LC-MS en

1H-NMR

b bepaald aan de hand van

1H-NMR

c verhouding moeilijk te bepalen door overlappende signalen

d zuivering niet gelukt

e zuivering niet uitgevoerd


22

In voorafgaand onderzoek bleek de iminering van curcumine 1 het best te lukken in chloroform als

solvent.10 Aangezien het gebruik van gehalogeneerde solventen zoveel mogelijk moet vermeden

worden, werd bij de start van deze Masterproef gebruik gemaakt van 2-methyltetrahydrofuran (2-

methyl-THF) om de eerste reacties in uit te voeren. Dit solvent werd in voorgaande Masterproef

reeds gebruikt voor synthese van enamineanalogen 10a-c van bisdemethoxycurcumine 3. Al snel

werd duidelijk dat 2-methyl-THF niet het geschikte solvent was voor de synthese van

enamineanalogen 56a en b met behulp van aminoalcoholen (reactie 1-2, Tabel 4). De

aminoalcoholen, en meer algemeen polaire aminen, lossen minder goed op in 2-methyl-THF dan

minder polaire aminen, hetgeen ervoor zorgde dat het reactiemengsel onmiddellijk veranderde in

een viskeus mengsel en de reactie niet goed doorging. Daarom werd overgestapt naar het meer

polaire ethanol als solvent, en daarin verliep de reactie wel vlot (reactie 3-10, Tabel 4).

In reactie 3, Tabel 4 werd als reactietemperatuur 100 °C en een reactietijd van 90 minuten gebruikt.

Dit resulteerde echter in zeer onzuivere 1H-NMR-spectra (d6-DMSO) en LC-MS-spectra. Vervolgens

werden de reacties uitgevoerd bij lagere temperaturen (reactie 4-8) en een kortere reactietijd

(reactie 5-8). Steeds werd een omzetting van 100 % bekomen. Aan de hand van 1H-NMR-spectra (d6-

DMSO) en LC-MS-spectra kon geconcludeerd worden dat 80 °C en een reactieduur van één uur de

beste reactieomstandigheden zijn. Daarnaast kon opgemerkt worden dat bij deze

reactieomstandigheden de kleur van het reactiemengsel het best aansloot bij de kleur van het

uiteindelijk bekomen zuiver eindproduct, namelijk oranje. Daarom werden voor de synthese van

enamineanaloog 56b deze geoptimaliseerde reactieomstandigheden eveneens toegepast (reactie 9-

10, Tabel 4).

Zoals kan opgemerkt worden uit Tabel 4 werden enamineanalogen 56a en b in lage rendementen

bekomen na zuivering. De lage rendementen zijn te verklaren door verschillende factoren, namelijk

een moeilijke opwerking van het reactiemengsel, de vorming van nevenproduct 57a en b, en de

moeilijke zuivering van enamineanalogen 56a en b. Deze factoren zullen hieronder in detail worden

besproken.

De enamineanalogen 56a en b lossen enkel op in ethanol, methanol, dimethylsulfoxide en

dimethylformamide en hadden een minder goede oplosbaarheid in aceton, 2-methyl-THF en

ethylacetaat. Door deze slechte oplosbaarheid was de opwerking van het reactiemengsel een lastige

stap die vaak leidde tot rendementsverlies. De opwerking bestond uit het wassen van het

reactiemengsel (d.m.v. extractie) met een verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat in water en

pekel om onzuiverheden uit het reactiemengsel te halen. Het gebruik van zuiver ethanol, het solvent

waarin reacties 3 tot en met 10 (Tabel 4) doorgingen, als organische fase is niet mogelijk aangezien


23

ethanol een polair protisch organisch solvent is dat mengt met organische solventen maar ook met

water. Wanneer het reactiemengsel in ethanol gewassen zou worden met een verzadigde oplossing

van natriumbicarbonaat in water en pekel, zou er vervolgens geen scheiding optreden. Om een

scheiding te krijgen moest daarom een grote overmaat aan organisch solvent, dat niet mengt met

water, toegevoegd worden bij de extractie zodat ethanol samen met het gewenste product

grotendeels naar deze organische fase getrokken werd. Daarom werd een grote overmaat

ethylacetaat toegevoegd. Maar door de minder goede oplosbaarheid van de enamineanalogen 56a

en b in ethylacetaat en de aanwezigheid van een minimale hoeveelheid ethanol, om de

oplosbaarheid van de analogen te waarborgen, ging er steeds een deel van de gewenste analogen

naar de waterige fase, gezien ethanol een polair protisch solvent is. De waterige fase moest daarom

meerdere malen gewassen worden met ethylacetaat, en dan nog werd het gewenste product niet

volledig uit de waterige fase onttrokken.

In het algemeen werd ieder reactieproduct in deze Masterproef, op enkele uitzonderingen na,

gezuiverd via kolomchromatografie over silica met een daaropvolgende herkristallisatie in een

geschikt solvent(mengsel). In de 1H-NMR-spectra (d6-DMSO) van de gewenste fractie na

kolomchromatografie waren meestal nog ongewenste signalen aanwezig, waardoor een

daaropvolgende herkristallisatie noodzakelijk was. Deze dubbele zuivering is één van de redenen

voor de lage rendementen van de bekomen enamineanalogen. Verschillende solventmengsels

werden uitgeprobeerd voor de zuivering van verbindingen 56a en b via kolomchromatografie over

silica (aceton: reactie 3, Tabel 4; EtOAc: reactie 4, 5 en 9, Tabel 4; EtOAc/MeOH 99/1: reactie 6 en 7,

Tabel 4; PE/EtOAc/MeOH 9/9/2: reactie 10, Tabel 4). De beste resultaten werden bekomen wanneer

als eluens, EtOAc/MeOH 99/1 of PE/EtOAc/MeOH 9/9/2 werd gebruikt (reactie 6 en 10, Tabel 4). De

daaropvolgende herkristallisatie vond telkens plaats in methanol of in ethanol/hexaan (15/1). Dit

leverde de gewenste verbindingen in rendementen gaande van 3 tot 11 procent. In reactie 10, Tabel

4 werd cyclisch nevenproduct 57b zuiver bekomen in een rendement van 12 %. In 3.1.1.1 worden de

cyclische nevenproducten meer in detail besproken.

Vervolgens werd de iminering van bisdemethoxycurcumine 3 met aminoalcoholen uitgevoerd,

wederom 2-amino-1-propanol en 3-amino-1-propanol. Hieronder staat het reactieschema afgebeeld

en in Tabel 5 worden de verschillende pogingen die ondernomen werden om analogen 58a en b te

synthetiseren weergegeven.


24



Temp. (°C)


MK10 (massa- equiv.)

Omzet-ting (%)

a

Verhou-ding

58/59b

Rende-ment 58

(%)

1 1 10 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 67/33 -d

2 1 10 50 1h EtOH 2,4 1,9 100 -c

-d

3 1 10 90 1h EtOH 2,4 1,9 100 63/37 -d

4 1 10 90 1h30 EtOH 2,4 1,9 100 63/37 -d

5 1 5 90 1h EtOH 2,4 1,9 100 -c

8

6 2 10 70 1h EtOH 2,4 1,9 100 -c

-d

7 2 10 90 1h30 EtOH 2,4 1,9 100 63/37 -d

8 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 63/37 18

a bepaald aan de hand van LC-MS en

1H-NMR


1H-NMR




Opnieuw werd gezocht naar de optimale reactieomstandigheden om verbindingen 58a en b te

synthetiseren. In reactie 3, Tabel 5 werd een reactietijd van 60 minuten toegepast, terwijl in reactie

4, Tabel 5 een tijd van 90 minuten gebruikt werd. Er was geen verschil in LC-MS- en 1H-NMR-spectra

(d6-DMSO) na reactie voor beide pogingen, waardoor één uur volstaat als reactietijd. Uiteindelijk kan

geconcludeerd worden dat de reactie het best doorgaat bij een temperatuur van 90 °C en een tijd

van één uur.

Opnieuw vormde de opwerking van bisdemethoxycurcuminederivaten 58a en b een lastige stap, die

reeds besproken werd voor analogen 56a en b. De zuivering was evenzeer een zeer moeilijke stap.

Sterker nog, de zuiveringen van analogen 58a en b waren de moeilijkste van heel deze scriptie. Zoals

reeds weergegeven in de inleiding, was in voorgaande Masterproef zuivering van

bisdemethoxyderivaten 10a-c door middel van kolomchromatografie niet mogelijk door afbraak van


25

de enamineanalogen op silica. Aangezien de 1H-NMR-spectra na opwerking van alle reacties uit Tabel

5 niet zuiver waren en bijgevolg kristallisatie onmogelijk was, was er geen andere mogelijkheid dan

zuivering door middel van kolomchromatografie toe te passen voor enamineanalogen 58a en b.

Meerdere pogingen (reactie 1, 2 en 6, Tabel 5) van zuivering met kolomchromatografie over silica

mislukten echter, door afbraak van het product op de silicakolom. Daarna werd zuivering via

'reversed phase' kolomchromatografie toegepast met een initieel eluens van methanol/water 40/60

die gradueel steeg in de tijd tot honderd procent methanol. Na meerdere pogingen (reactie 3, 4 en 7,

Tabel 5) voor 58a en b was het resultaat negatief. Dit zou kunnen te wijten zijn aan een

onmiddellijke afbraak van de verbindingen door water, dat ofwel het imine hydrolyseert naar een

keton ofwel een retroaldolcondesatie kan veroorzaken, met dissociatie van het enamineanaloog 58

tot gevolg.

Na vele pogingen van zuivering door middel van kolomchromatografie en het testen van

verschillende eluensen kon volgende vaststelling gemaakt worden: aangezien methanol één van de

enige solventen is waar enamineanalogen 58a en b van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3

goed in oplossen, moet het eluens een hoeveelheid methanol bevatten (‘normal phase’

kolomchromatografie laat een maximale hoeveelheid van 10 % toe), waardoor de slaagkans op

zuivering vergroot en een beter rendement kan bekomen worden. Verbinding 58a (reactie 5, Tabel 5)

en 58b (reactie 8, Tabel 5) werden uiteindelijk zuiver bekomen door middel van ‘normal phase’

kolomchromatografie over silica met PE/EtOAc/MeOH (9/9/2) en EtOAc/MeOH (98/2) als eluens, in

rendementen van 8 en 18 procent respectievelijk. Dit laatste rendement is relatief hoog aangezien

geen herkrsitallisatie nodig was na kolomchromatografie.

In volgende subsectie zal de synthese van de cyclische nevenproducten met een 2,3-

dihydropyridinonstructuur in detail worden toegelicht.

3.1.1.1 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57 en 59

Bij de analyse van de LC-MS-spectra van de ruwe reactiemengsels (van alle reacties uit Tabel 4 en 5)

viel op dat er niet één, maar twee signalen (met een verschillende retentietijd) correspondeerden

met de massa van het verwachte product. Eén van de twee signalen kwam overeen met het

verwachte product 56a, 56b, 58a of 58b en het andere signaal correspondeerde met het

nevenproduct 57a, 57b, 59a of 59b.


26

In de literatuur werd een studie teruggevonden waarin de synthese van zo’n 2,3-hydropyridin-4-onen

werd beschreven uitgaande van zuiver curcumine 1 en een alkylamine (methyl-, ethyl-, propyl-,

butyl-, hexyl-, benzyl-, fenyl- en tolylamine).49 De 2,3-hydropyridin-4-onen 61 worden gevormd door

een intramoleculaire 1,4-additie of Michaëladditie van het nucleofiel stikstofatoom van het

enamineanaloog 60 aan de ,-onverzadigde binding naast de carbonylfunctie van enamineanaloog

60 met vorming van een 2,3-hydropyridin-4-on-structuur.

Enamineanalogen van curcumine 1, die het doel waren van deze Masterproef, werden in deze

literatuurstudie enkel vermeld als tussenproducten 60, zoals in het schema weergegeven. De

rendementen na zuivering van de 2,3-hydropyridin-4-onen 61 lagen tussen de 7 en 41 procent.49 Uit

deze lage waarden kan met een grote waarschijnlijkheid geconcludeerd worden dat de

enamineanalogen 60 ook aanwezig waren in het ruwe mengsel na reactie, maar deze werden dus

niet gezuiverd en beschreven.

In Tabel 6 worden karakteristieke 1H-NMR-waarden (in d6-DMSO) van 2,3-hydropyridin-4-onen 61,

die beschreven staan in dit artikel, weergegeven.49 Aan de hand van deze karakteristieke 1H-NMR-

waarden werd voor iedere imineringsreactie in deze Masterproef, waar mogelijk, op basis van 1H-


27

NMR-spectra (d6-DMSO) een benaderde verhouding enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on

bepaald. De verhoudingen staan weergegeven in voorgaande Tabellen 4 en 5 en volgende Tabellen 8

en 9.

Tabel 6. Karakteristieke 1H-NMR-waarden (d6-DMSO) van 2,3-hydropyridin-4-onen 61

H ppm Multiplet Koppelingsconstante J (Hz)

2-H +/- 4,70 M -

3-Ha +/- 2,40 d × d 16, 5

3-Hb +/- 2,80 d × d 16, 5

5-H +/- 5,05 S -

In voorgaande Masterproef10 werd het cyclisch nevenproduct niet opgemerkt. Daarom werden de

1H-NMR-spectra (CDCl3) van deze eerdere studies terug bovengehaald en werden, waar mogelijk, aan

de hand van de karakteristieke 1H-NMR-signalen uit Tabel 6 de verhoudingen enamineanaloog/2,3-

hydropyridin-4-on (9/62 of 10/63) bepaald, dewelke terug te vinden zijn in Tabel 7.


28

Tabel 7. Verhoudingen van enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on (9/62 of 10/63) voor verschillende reactiemengsels

Startproduct Eindproduct Equiv. Azijnzuur Solvent Verhouding 9/62 of 10/63a

1 9e 5 CHCl3 80/20 1 9f 5 CHCl3 91/9 1 9g 5 CHCl3 -

b

3 10a 5 2-Me-THF 67/33 3 10b 10 2-Me-THF -

b

3 10c 7 2-Me-THF 97/3 a bepaald aan de hand van

1H-NMR

b verhouding moeilijk te bepalen door overlappende signalen

In Tabel 7 valt het op dat in het algemeen minder nevenproduct 62 of 63 gevormd werd dan in de

reacties uitgevoerd in deze Masterproef. Dit zou kunnen verklaard worden door het gebruik van

ethanol, het toegepaste solvent in deze Masterproef, in vergelijking met chloroform of 2-methyl-THF,

de gebruikte solventen in voorgaande Masterproef. Nog een opvallend fenomeen is dat de

verhouding enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on voor isobutylamine relatief laag is in vergelijking

met sec-butylamine en cyclohexylamine. Dit kan te wijten zijn aan de hogere graad van sterische

hinder bij het 2,3-hydropyridin-4-onanaloog in het geval van sec-butyl- en cyclohexylamine.

In deze Masterproef werd getracht de cyclische nevenproducten zuiver te bekomen gezien hun

mogelijke biologische relevantie. Heterocyclische ringen zijn alomtegenwoordig in het onderzoek

naar verbindingen met antikankeractiviteit. In een studie wordt de aanwezigheid van

stikstofbevattende heterocyclische ringen in structuren vermeld als één van de redenen voor

antikankeractiviteit van verbindingen.50 Bovendien wanneer teruggegaan wordt naar het tweede

deel van deze scriptie, Literatuurstudie, bleken de monocarbonylanalogen 14 met een piperidin-4-

on-linker in de structuur veelbelovende verbindingen te zijn.

a) 2,3-Dihydropyridin-4-on 57b bekomen als nevenproducten bij de synthese van

enamineanalogen 56b

In reactie 10, Tabel 4 werd het 2,3-dihydropyridinonanaloog 57b, als nevenprocuct bekomen van het

enamineanaloog 56b.


29

Verbinding 57b werd bekomen in een rendement van 12 % na kolomchromatografie over silica met

PE/EtOAc/MeOH (9/9/2) als eluens en een daaropvolgende herkrisallisatie in methanol. Bij de

preparatieve TLC had het cyclisch nevenproduct 57b een Rf-waarde van 0,08 en het enamineanaloog

57b had een Rf-waarde van 0,20. In het algemeen elueren de cyclische nevenproducten altijd later

dan de enamineanalogen tijdens ‘normal phase’ kolomchromatografie.

b) 2,3-Dihydropyridin-4-on 59a bekomen d.m.v. geoptimaliseerde omstandigheden

In het onderzoek naar de synthese van de 2,3-dihydropyridinonanalogen van curcumine 1 en

bisdemethoxycurcumine 3 als beoogde reactieproducten werden reeds enkele routes getest.

De procedure voor de synthese van 2,3-dihydropyridinonanalogen van curcumine 1 beschreven in

eerder besproken studie 49 werd toegepast op curcumine 1 en 2-amino-1-ethanol als amine.

Net zoals in deze studie werd het reactiemengsel geroerd gedurende 24 uur zonder solvent.

Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende 120 seconden onder microgolfbestraling gebracht bij

300 Watt. In het artikel werd een commerciële microgolfoven gebruikt met een wattage van 400,

maar deze apparatuur was niet beschikbaar. Er werd een gespecialiseerd toestel, specifiek voor

chemische experimenten, met een maximaal bereik van 300 Watt gebruikt. Uit het LC-MS- en 1H-

NMR-spectrum (d4-MeOD) na reactie bleek geen volledige omzetting te hebben plaatsgevonden.

Aan de hand van het 1H-NMR-spectrum werd de omzetting bepaald en die bedroeg 44 procent. Er

werd eveneens vastgesteld dat niet enkel 2,3-dihydropyridinonanaloog 57a aanwezig was, zoals in de

studie gesuggereerd werd, maar ook enamineanaloog 56a in een verhouding van 55/45

(enamineanaloog/2,3-dihydropyridinon 56a/57a). In de studie werd het enamineanaloog immers

enkel als intermediair reactieproduct vermeld. Het reactiemengsel werd verder niet gezuiverd

aangezien er geen volledige omzetting plaatsvond.


30

In een volgende poging ter vorming van het 2,3-dihydropyridinonanaloog als hoofdproduct werd de

gebruikelijke procedure voor de synthese van enamineanaloog 58a in deze Masterproef aangepast

door de reactie uit te voeren bij een langere reactietijd. De reactie werd uitgevoerd gedurende 4 uur

onder microgolfstraling.

.

Aan de hand van het 1H-NMR-spectrum (d4-MeOD) werd bepaald dat er volledige omzetting

plaatsvond en dat de verhouding enamineanaloog/2,3-hydropyridin-4-on (58a/59a) 50/50 bedroeg.

Deze waarde is iets lager dan de waarden in Tabel 4 en 5 maar hieruit kunnen nog geen verdere

conclusies getrokken worden, aangezien het verschil niet significant is. Het cyclische nevenproduct

59a werd zuiver bekomen in een rendement van 9 procent, daarenboven werd het enamineanaloog

58a ook zuiver bekomen in een rendement van 8 procent, beiden na kolomchromatografie over silica

met PE/EtOAc/MeOH (9/9/2) als eluens en een daaropvolgende herkristallisatie in methanol.

Wegens tijdsgebrek kon niet verder ingegaan worden op de verdere optimalisatie van de methode

voor de synthese van de 2,3-dihydropyridinonen. Maar indien na biologisch testen van 59a zou

blijken dat deze een hogere activiteit bezit dan het enamineanaloog 58a, zou in de toekomst kunnen

worden gezocht naar optimale reactieomstandigheden om de cyclische nevenproducten als

hoofdproducten te bekomen.


aminoëthers

In 3.1.1 werd de iminering van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met aminoalcoholen

uitvoerig besproken. Een tweede groep van polaire aminen die gebruikt werd, zijn de aminoëthers,

respectievelijk 2-methoxyethylamine en 3-methoxypropylamine. Hieronder wordt het reactieschema

gegeven voor de synthese van enamineanalogen 64a en b van curcumine 1 met 2-

methoxyethylamine en 3-methoxypropylamine. Wederom werden de cyclische nevenproducten 65a

en b waargenomen. In Tabel 8 zijn de verschillende pogingen te vinden voor deze reactie.


31

Tabel 8. Verschillende pogingen tot synthese van analogen xa en xb

Reactie

n Equiv. amine

Temp. (°C)

Tijd Solvent

Equiv. Azijn-zuur

MK10 (massa-equiv.)

Omzet- ting (%)

a

Verhou-ding

64/65b

Rende- ment 64 (%)

1 1 10 100 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 100 -c

2

2 1 10 100 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 100 67/33 9

3 1 5 80 1h15 2-Me-THF 2,4 1,6 46

-d

-e

4 1 10 80 1h30 2-Me-THF 2,4 1,6 50 -c

-e

5 1 10 100 1h 2-Me-THF 2,4 1,6 100 -c

-d

6 1 10 70 1h EtOH 2,4 1,6 100 -c

40

7 2 10 90 1h EtOH 2,4 1,6 100 53/47 -d

8 2 10 90 1h DMF 2,4 1,6 100 80/20 3

9 2 10 90 1h DMF 2,4 1,6 100 -c

11


1H-NMR


1H-NMR



e zuivering niet mogelijk wegens onvolledige omzetting

In reactie 1 tot en met 5 (Tabel 8) werd de reactie uitgevoerd in 2-methyl-THF. De reactie bleek

volledig door te gaan bij een temperatuur vanaf 100 °C. In het algemeen waren de enamineanalogen

van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 met aminoëthers beter oplosbaar in verschillende

solventen dan deze met aminoalcoholen. Dit is de reden waarom de reactie voor de vorming van

analogen 64a en b doorging in 2-methyl-THF, terwijl dit voor analogen 56a en b niet het geval was. In

reactie 6 (Tabel 8) werd ethanol gebruikt als solvent. Dit solvent liet toe de reactie uit te voeren bij

mildere omstandigheden. Het enamineanaloog 64a werd zuiver bekomen door middel van

kolomchromatogafie over silica (EtOAc/PE 4/1) in een mooi rendement van 40 procent. Dit relatief

hoog rendement is wederom te wijten aan het feit dat geen herkristalliatie nodig was tijdens de

zuivering. Tevens is door de betere oplosbaarheid van enamineanalogen 64a en b in verschillende

solventen geen methanol vereist in het eluens gebruikt bij de kolomchromatografie.


32

In reactie 7 tot en met 10 (Tabel 8) werd 3-methoxypropylamine gebruikt voor de iminering van

curcumine 1. De reactie werd eerst uitgevoerd in ethanol. Door oplosbaarheidproblemen tijdens de

opwerking, bleek ethanol echter geen geschikt solvent voor de synthese van derivaat 64b. Daarom

werd overgeschakeld naar dimethylformamide (DMF) als solvent om problemen tijdens de

opwerking van het reactiemengsel te omzeilen. Wanneer gekeken wordt naar reactie 7 en 8 (Tabel 8)

waar dezelfde reactieomstandigheden toegepast werden, behalve het solvent, valt het op dat de

verhoudingen 64/65 verschillend zijn. In reactie 7, waar ethanol gebruikt wordt, wordt veel meer

nevenproduct gevormd dan in reactie 8, waar DMF gebruikt wordt. Dus ethanol heeft

hoogstwaarschijnlijk een stimulerend effect op vorming van het cyclisch nevenproduct 65b. Dit werd

hiervoor (in sectie 3.1.1.1) reeds als reden aangehaald waarom in vorige Masterproef minder

nevenproduct werd gevormd, gezien de reacties daar uitgevoerd werden in chloroform en 2-methyl-

THF en niet in ethanol. De sterkere nevenproductvorming in ethanol zou kunnen verklaard worden

door waterstofbrugvorming. In het algemeen zijn enamineanalogen gestabiliseerd door een

intramoleculaire waterstofbinding tussen de aminogroep en de carbonylgroep, weergegeven als een

stippenlijn in het eerste intermediair in onderstaande figuur. Wanneer het enamineanaloog echter in

ethanol opgelost wordt kan ethanol intermoleculaire waterstofbindingen gaan vormen met het

enamineanaloog waardoor de tweede intermediaire toestand gestabiliseerd zal worden en bijgevolg

de vorming van het cyclisch nevenproduct gemakkelijker zal gebeuren. In solventen die geen

waterstofbindingen kunnen vormen, zoals DMF, kan deze tweede intermediaire toestand niet

gestabiliseerd worden waardoor cyclische nevenproducten minder gemakkelijk zullen gevormd

worden.

Vervolgens wordt in onderstaand schema de iminering van het curcuminoïde

bisdemethoxycurcumine 3 met aminoëthers, ter vorming van enamineanalogen 66a en b en

cyclische nevenproducten 67a en b, afgebeeld. In Tabel 9 worden de verschillende pogingen in detail

weergegeven.


33



Temp. (°C)


MK10 (massa-equiv.)

Omzet-ting (%)

a

Verhou-ding

66/67

Rende-ment 66

(%)

1 1 10 100 1h 2-Me-THF 2,4 1,9 100 -c

-d

2 1 10 90 1h EtOH 2.4 1,9 100 71/29 32 3 1 10 70 1h EtOH 2,4 1,9 100 50/50 -

e

4 2 10 90 1h EtOH 2,4 1,9 100 67/33 -d

5 2 10 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 63/37 (67 = 2)

6 2 5 80 1h EtOH 2,4 1,9 100 53/47 22

(67 = 3)


1H-NMR


1H-NMR

c verhouding moeilijk te bepalen



Reactie 1, Tabel 9 vond plaats in 2-methyl-THF en gaf een omzetting van 100 procent. De zuivering

door middel van kolomchromatografie over silica (EtOAc) mislukte echter. Wederom vond afbraak

van het product plaats door de algemene gevoeligheid van bisdemethoxycurcuminederivaten op

silica. Bij reactie 2 in ethanol werd het bekomen product gezuiverd via 'reversed phase'

kolomchromatografie met als initieel eluens methanol/water 40/60 die gradueel steeg in de tijd tot

honderd procent methanol. Via deze methode werd verbinding 66a zuiver bekomen in een

rendement van 32 procent. Opnieuw een relatief hoog rendement gezien herkristallisatie niet nodig

was, dit in tegenstelling tot de rendementen waarbij wel een extra zuivering met behulp van

herkristallisatie nodig was.

In reacties 4, 5 en 6 (Tabel 9) werden imineringsreacties uitgevoerd op bisdemethoxycurcumine 3

met 3-methoxypropylamine. In reactie 4 kon het enamineanaloog 66b niet zuiver bekomen worden

na kolomchromatografie over silica (EtOAc/MeOH 99/1) en herkristallisatie. In reactie 5 en 6 werd


34

het methanolpercentage in het eluensmengsel voor kolomchromatografie opgedreven tot

respectievelijk 2 en 10 procent. In reactie 5 werd enkel nevenproduct 67b zuiver verkregen na

herkristallisatie in methanol en in reactie 6 werden enamineanaloog 66b en nevenproduct 67b zuiver

bekomen na herkristallisatie in methanol, in rendementen van 22 en 3 procent respectievelijk.

3.1.2.1 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 65 en 67

Bij de imineringsreacties uitgevoerd met aminoëthers kon aan de hand van de LC-MS- en 1H-NMR-

spectra (d6-DMSO) geconcludeerd worden dat ook hier de cyclische nevenproducten met een 2,3-

dihydropyridinonstructuur prominent aanwezig waren. De verhoudingen enamineanaloog/2,3-

hydropyridin-4-on, bepaald aan de hand van 1H-NMR-spectra (d6-DMSO), zijn terug te vinden in

Tabellen 8 en 9. In reactie 5 en 6 (Tabel 9) werd het 2,3-dihydropyridin-4-on 67b zuiver verkregen als

nevenproduct van de imineringsreactie in rendementen van 2 en 3 procent. Verbinding 67b (Rf-

waarde = 0,18) elueerde opnieuw na het hoofdproduct (Rf-waarde = 0,44) tijdens de

kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH 9/9/2) en vertoonde dus de grootste affiniteit voor de

polaire silicakolom.

3.2 Oplosbaarheid en biologische testing Met succes werden acht nieuwe enamineanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3,

met een polaire aminogroep, gesynthetiseerd. Er werd tevens in geslaagd, door een onverwachte

wending in dit onderzoek, drie cyclische nevenproducten met een 2,3-dihydropyridinonstructuur

zuiver te bekomen. Deze samen vormen een mooie bibliotheek van elf nieuwe curcumineanalogen,

hieronder weergegeven in Figuur 2, die in een volgende stap getest kunnen worden op hun

bioactiviteit en wateroplosbaarheid.

Zoals reeds aangegeven in 1.2 Doel, was de intentie van deze Masterproef de synthese van

enamineanalogen met een verhoogde oplosbaarheid in water, en een daarmee gepaard gaande

verlaagde partitiecoëfficiënt, in vergelijking met reeds gesynthetiseerde enamineanalogen in vorig

onderzoek.9, 10 De partitiecoëfficiënt is de verhouding van de concentraties van een bepaalde stof in

oplossing in respectievelijk 1-octanol en water, bij gelijke temperatuur. Hoe lager de verhouding, hoe

meer hydrofiel de stof is. Aan de hand van het computerprogramma ‘ChemDraw’ kan de (logaritme

https://nl.wikipedia.org/wiki/Concentratie_(oplossing)

https://nl.wikipedia.org/wiki/1-octanol

https://nl.wikipedia.org/wiki/Water


35

van) de partitiecoëfficiënt van stoffen benaderd worden. De theoretische logaritme van de

partitiecoëffiënt (LogP) werd op deze manier bepaald voor curcumine 1, bisdemethoxycurcumine 3,

de acht nieuwe enamineanalogen (56a,b, 58a,b, 64a,b en 66a,b), de drie 2,3-dihydropyridinanalogen

(57b, 59a en 67b), en de enamineanalogen (9a-g en 10a-c), gesynthetiseerd in voorgaand

onderzoek.9, 10 Deze waarden zijn weergegeven in Tabel 10.

Tabel 10. Theoretische partitiecoëfficiënten van curcumine, bisdemethoxycurcumine, enamineanalogen en 2,3-dihydropyridinanalogen

Verb. LogP Verb. LogP Verb. LogP

1 2,56 9g 3,85 64a 2,04 3 2,81 10a 3,78 64b 2,15

9a 3,13 10b 3,70 66a 2,40 9b 2,96 10c 4,11 66b 2,51 9c 3,14 56a 1,79 57b 1,61 9d 3,55 56b 1,89 59a 1,76 9e 3,53 58a 2,15 67b 2,23 9f 3,45 58b 2,26

Uit Tabel 10 kan geconcludeerd worden dat de nieuw-gesynthetiseerde enamine- en 2,3-

dihydropyridinonanalogen in deze Masterproef een lagere theoretische partitiecoëfficiënt bezitten

dan curcumine 1, bisdemethoxycurcumine 3 en enaminanalogen (9 en 10) gesynthetiseerd in

voorgaand onderzoek.9, 10 Dit betekent dat de oplosbaarheid in water van de nieuwe analogen van

curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 beter zou moeten zijn.

Om hiervan een bevestiging te bekomen werd de wateroplosbaarheid van de acht nieuwe

enamineanalogen en drie nieuwe 2,3-dihydropyridinanalogen vervolgens ook experimenteel

onderzocht. Hiervoor werd gebruikt gemaakt van eenvoudig experiment waarin 1 mg analoog in een

vial met 1,5 ml water werd gebracht. Vervolgens werd dit mengsel gedurende 1 minuut verwarmd

met een haardroger. Daarna werd de oplosbaarheid van het analoog in water geanalyseerd aan de

hand van de kleur van het mengsel, aangezien curumineanalogen doorgaans een sterkere

geel/oranje verkleuring van het solvent vertonen bij hogere oplosbaarheid. De waarnemingen zijn

weergegeven in Tabel 11, waarin voor iedere verbinding de kleur van de verbinding en de kleur van

het mengsel (verbinding/water) te vinden is.


36

Tabel 11. Waarneming van de oplosbaarheid van curcumine, bisdemethoxycurcumine, enamineanalogen en 2,3-dihydropyridinonanalogen

Verb. Kleur Verb. Kleur Opl. Verb. Kleur Verb. Kleur Opl.

1 oranje geen verkleuring 64b oranje geen verkleuring 3 oranje geen verkleuring 66a oranje zeer lichtgeel

56a oranje lichtgeel 66b oranje lichtgeel 56b oranje donkergeel 57b geel donkergeel 58a oranje licht - donkergeel 59a geel lichtgeel 58b oranje donkergeel 67b geel geen verkleuring 64a oranje zeer lichtgeel

Zoals verwacht loste geen enkele verbinding volledig op in water, maar de oplosbaarheid was wel

duidelijk verschillend voor de verschillende verbindingen. Uit Tabel 11 valt het op dat enamine- en

2,3-dihydropyridinonanalogen gevormd met een hydroxylgroep (56a,b, 58a,b, 57b en 59a) een

betere oplosbaarheid in water vertonen dan curcumine 1, bisdemethoxycurcumine 3 en enamine- en

2,3-dihydropyridinonanalogen met een methoxygroep (64a,b en 66a,b en 67b), daar verbindingen

56a,b, 58a,b, 57b en 59a een sterkere verkleuring (lichtgeel tot donkergeel) van water vertoonden in

vergelijking met de andere verbindingen (geen verkleuring tot lichtgeel). Wanneer teruggekeken

wordt naar Tabel 10 zijn het ook deze verbindingen die de laagste theoretische partitiecoëfficiënt

hebben en dus het meest hydrofiel zijn. In de nabije toekomst zal de oplosbaarheid van de elf nieuwe

verbindingen nog verder onderzocht worden met een gespecialiseerde test, maar aan de hand van

dit experiment kunnen verbindingen 56a en b, 58a en b, 57b en 59a met een hydroxylgroep, op basis

van hun wateroplosbaarheid, beschouwd worden als meest belovende nieuwe analogen van

curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3.

Naast de oplosbaarheid, zal ook de biologische activiteit van de elf nieuwe verbindingen getest

worden op verschillende kankercellijnen. Dit zal vervolgens inzicht geven in het effect van analogen

met enerzijds een alcoholgroep (56a,b en 58a,b) versus een methoxygroep (64a,b en 66a,b) en

anderzijds een gesubstitueerde 2-ethylaminogroep (56a, 58a, 64a en 66a) versus een

gesubstitueerde 3-propylaminogroep (56b, 58b, 64b en 66b). Daarenboven zal voor iedere

enamineanaloog het verschil curcumine (56 en 64) versus bisdemethoxycurcumine (58 en 66)

kunnen bestudeerd worden. Als laatste zullen de bekomen cyclische nevenproducten 57b, 59a en

67b kunnen vergeleken worden met hun niet cyclische enaminepartner 56b, 58a en 66b.


37

Figuur 2. Analogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3 gesynthetiseerd in deze Masterproef

Samenvatting en besluit

38

4 Samenvatting en besluit Curcumine is het actieve bestanddeel in het kruid kurkuma, het populairste kruid in de Indische

keuken en het hoofdbestanddeel in kerriepoeder. Curcumine bezit een waaier aan biologische

activiteiten, met als belangrijkste de anti-oxidant-, anti-inflammatoire- en antikankeractiviteit. Eén

groot nadeel echter is de lage biobeschikbaarheid van de stof. Daarom is het onderzoek naar de

synthese van curcumineanalogen, met als doel de verbetering van de biobeschikbaarheid, een ‘hot

issue’ in de medicinale chemie. Met bijna 4000 pre-klinische testen daaromtrent is curcumine één

van de meest onderzochte verbindingen in de medicinale chemie.51 Deze Masterproef knoopte aan

bij het onderzoek naar curcumineanalogen en spitste zich toe op de synthese van enamineanalogen

van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3. In preliminair onderzoek aan de “SynBioC Research

Group” van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) werden reeds verschillende

enamineanalogen van curcumine 1 en bisdemethoxycurcumine 3, met gebruik van alkylaminen,

gesynthetiseerd en getest op hun bioactiviteit en oplosbaarheid in water. Deze analogen vertoonden

een verhoogde activiteit in vergelijking met curcumine 1, waarbij de

bisdemethoxycurcumineanalogen het best scoorden. De wateroplosbaarheid van de

enamineanalogen was echter niet verbeterd. Daarom had deze Masterproef als doel het onderzoek

naar de synthese van meer polaire enamineanalogen 11 en 12 van curcumine 1 en

bisdemethoxycurcumine 3 door gebruik te maken van polaire aminen zoals aminoalcoholen,

aminoëthers, aminozuren en aminoësters om de oplosbaarheid in water te verhogen en zo mogelijk

het farmacologisch profiel te verbeteren.

4.1 Samenvatting In voorgaande Masterproeven werden reeds de eerste fundamentele bouwstenen gelegd voor de

synthese van enamineanalogen, waardoor in deze Masterproef kon vertrokken worden vanuit deze

eerder bekomen methode, die gebruik maakte van microgolfbestraling.9, 10 Na enkele veranderingen

aan de methode werd een geschikte procedure gevonden voor de synthese van enamineanalogen

met het gebruik van polaire aminen. Voor de polaire aminen werd gebruik gemaakt van twee types,

namelijk aminoalcoholen en aminoëthers. Onder microgolfbestraling voerde het polair amine een

nucleofiele additie uit op curcumine 1 (of bisdemethoxycurcumine 3) (1 mmol) in ethanol (5 ml) als


39

solvent en in aanwezigheid van montmorillonietklei en azijnzuur als katalysatoren. Tijdens deze

imineringsreactie werd niet enkel het gewenste enamineanaloog i gevormd maar ook het cyclisch

nevenproduct ii met een 2,3-dihydropyridinonstructuur. Gezien het interessant farmacologisch

profiel van de cyclische nevenproducten ii werden ook getracht deze zuiver te bekomen. Details van

de reactie staan weergegeven in onderstaand reactieschema.

De reacties onder microgolfbestraling verliepen steeds vlot, met meestal een omzetting van 100

procent, maar de opwerking en zuivering van de reactiemengsels waren minder gemakkelijk. Iedere

reactie werd, op enkele uitzonderingen na, gezuiverd via kolomchromatografie over silica met een

daaropvolgende herkristallisatie in een geschikt solvent(mengsel). In de 1H-NMR-spectra van de

bekomen fracties na kolomchromatografie waren meestal nog ongewenste signalen aanwezig

waardoor herkristallisatie noodzakelijk was. Indien toch geen herkristallisatie nodig was, is dit te

merken aan het relatief hoge rendement (ic, if en ig).

De zuivering van de enamineanalogen met aminoëthers ic, d, g en h verliep gemakkelijker dan die

van de enamineanalogen met aminoalcoholen ia, b, e en f. Dit komt doordat verbindingen ic, d, g en

h beter oplossen in organische solventen zoals ethylacetaat, chloroform, dichloormethaan, ethanol

en methanol terwijl verbindingen ia, b, e en f enkel oplossen in methanol en ethanol. Daarenboven

ging de zuivering van curcuminederivaten ia-d beter dan die van de

bisdemethoxycurcuminederivaten ie-h, omdat deze laatste gevoeliger zijn voor afbraak op de

silicakolom.


40

De acht mogelijke enamineanalogen ia-h werden zuiver bekomen in rendementen van 8 tot 40

procent. De vorming van nevenproduct, moeilijke opwerking en dubbele zuivering liggen aan de

basis voor deze lage rendementen.

Daarnaast konden drie nevenproducten (iia, b en c) zuiver worden bekomen in rendementen van 3

tot 12 procent. Gezien dit effectief nevenproducten zijn, was het niet verwonderlijk dat deze

verbindingen in lage rendementen werden bekomen.

Van deze acht nieuwe enamineanalogen i en drie nieuwe 2,3-dihydropyridinonanaolgen ii bezitten

diegenen met een hydroxygesubstitueerd amine (ia, b, e en f, en iia en b) de hoogste oplosbaarheid

in water.

4.2 Besluit Ter uitbreiding van een reeks verbindingen die in preliminair onderzoek aan de “SynBioC Research

Group” van de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen (UGent) werden gesynthetiseerd, werd met

succes geslaagd in de synthese van 11 nieuwe stikstofanalogen van curcumine. Deze elf nieuwe

verbindingen zullen in de nabije toekomt getest worden op hun bioactiviteit en oplosbaarheid. Van

de elf nieuwe stikstofanalogen zijn er acht verbindingen ia-h met een enaminestructuur.

Tijdens de testing op bioactiviteit en oplosbaarheid kan een mooie vergelijkende studie gemaakt

worden door verschillende structurele elementen te vergelijken. Ten eerste kan de activiteit en

oplosbaarheid van derivaten van curcumine (ia-d) versus bisdemethoxycurcumine (ie-h) vergeleken


41

worden. Ten tweede kan het effect van analogen met enerzijds een alcoholgroep (ia, b, e en f) versus

een methoxygroep (ic, d, g en h) bestudeerd worden. Een laatste structureel element dat kan

vergeleken worden bij de analogen is de gesubstitueerde 2-ethylaminogroep (ia, c, e en g) versus

een gesubstitueerde 3-propylaminogroep (ib, d, f en h). Op basis van deze drie vergelijkingen kan

dan een SAR (Structure Activity Relationship) opgesteld worden. Wanneer de enamineanalogen i een

verhoogde activiteit én oplosbaarheid in vergelijking met curcumine 1 en voorgaande

gesynthetiseerde enamineanalogen bezitten kan in de toekomst gezocht worden naar een methode

om deze verbindingen efficiënter te bekomen. Enerzijds zou minder cyclisch nevenproduct moeten

gevormd worden en anderzijds zou de opwerking en zuivering vlotter moeten verlopen. Beide zaken

zouden misschien al kunnen verbeterd worden door gebruik te maken van een ander solvent waarin

de reacties kunnen in plaats vinden. De reacties zouden ook moeten opgeschaald worden om meer

product te bekomen om nog meer testen op biologische activiteit te kunnen uitvoeren. Daarenboven

kunnen ook nog tal van andere enamineanalogen aangemaakt worden door gebruik te maken van

andere polaire aminen zoals aminozuren of aminoësters.

Naast bovenstaande acht enamineanalogen i werden tevens drie 2,3-dihydropyridinonanalogen ii

gesynthetiseerd en geïsoleerd in hoge zuiverheid.

Deze drie verbindingen zullen in de nabije toekomst ook getest worden op hun bioactiviteit en

oplosbaarheid, en kunnen daarbij vergeleken worden met hun enaminepartner (ib, ie, ih). Uit de

theoretische partitiecoëfficiënt en een eerste experimentele test blijkt reeds een verhoogde

wateroplosbaarheid van deze verbindingen. Tevens bleek uit vroegere literatuurstudies, en ook

weergegeven in hoofdstuk 2 Literatuurstudie, dat de aanwezigheid van heterocyclische ringen

aanleiding kan geven tot een verhoogde bioactiviteit van verbindingen. Deze twee bevindingen doen


42

hoopvolle verwachtingen rijzen en indien uit biologische testing blijkt dat 2,3-

dihydropyridinonanalogen ii effectief een betere wateroplosbaarheid en bioactiviteit bezitten dan de

overeenkomstige enamineanalogen i kan dan in de toekomst een optimale syntheseroute gezocht

worden om de 2,3-dihydropyridinonanalogen ii als hoofdproducten te verkrijgen. Daarenboven

kunnen ook nog andere 2,3-dihydropyridinonanalogen gesynthetiseerd worden door gebruik te

maken van andere polaire aminen zoals aminozuren en aminoësters.

Experimenteel deel

43

5 Experimenteel deel

5.1 Methodologie

5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC)

Dunnelaagchromatografie werd gebruikt voor het bepalen van het geschikte eluens voor

kolomchromatografie. Daarenboven werden de fracties die verkregen werden bij

kolomchromatografie ook met behulp van dunnelaagchromatografie geanalyseerd. Hiervoor werd

gebruik gemaakt van silicaplaatjes (Merck Silicagel 60F254; dikte 0,25 mm). Voor de detectie van de

verschillende ‘spots’ werden UV-licht en/of kaliumpermanganaat (KMnO4) aangewend.

5.1.2 Kolomchromatografie

Voor de preparatieve zuivering van een reactiemengsel werd silica (korreldiameter 0,035-0,070 mm;

poriëndiameter ca. 6 nm) als stationaire fase gebruikt. Bij de elutie van het te zuiveren

reactiemengsel bedroeg de loopsnelheid ongeveer 3 cm/min.

5.1.3 Vloeistofchromatografie

Vloeistofchromatografie werd uitgevoerd met een Agilent 1200 series toestel, uitgerust met een

Supelco Ascentic Express C18 kolom (L 3cm × I.D. 4,6 mm) met 2,7 µm fused-core partikels met 90 Å

poriëngrootte. De mobiele fase die standaard wordt toegepast, is een mengsel van water en

acetonitril, maar ook andere combinaties zijn mogelijk zoals bijvoorbeeld de combinatie water en

methanol. Voor de analyse van de LC-stalen in deze Masterproef werd deze laatste toegepast.

Detectie van de verbindingen gebeurt via een UV-DAD-detector. Het toestel is gekoppeld aan een

massaspectrometer met elektrospray ionisatie geometrie (ESI 70 eV) en een quadrupool detector.

5.1.4 Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR)

Voor de 1H-NMR-spectra werd gebruik gemaakt van een Bruker Avance Nanobay III (400 MHz) NMR

spectrometer. De 13C-NMR-spectra werden eveneens met dit toestel opgenomen en dit bij 100,6

MHz. De te analyseren verbindingen werden opgelost in een gedeutereerd solvent (CDCl3, d6-DMSO

of d4-methanol) met tetramethylsilaan als interne standaard. De chemische verschuiving werd

gerapporteerd als een -waarde in ppm.

5.1.5 Massaspectrometrie (MS)

Massaspectra werden opgenomen met een Agilent 1100 MSD SL series massaspectrometer met

electrospray ionisatie geometrie (ESI 70 eV) en een quadrupool detector.

5.1.6 Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS)

Hoge resolutie ‘electrospray (ES)’ massaspectra (HRMS) werden opgenomen met een Agilent

Technologies 6210 Series Time-of-flight massaspectrometer.

Experimenteel deel

44

5.1.7 Smeltpuntbepaling

Het smeltpunt van een vaste stof werd bepaald met een Kofler WME smeltbank van Wager & Munz.

De vaste stof werd aangebracht op het verwarmingselement (bij 50°C) en vervolgens met een spatel

richting hogere temperaturen verplaatst (max 260°C) totdat de verbinding smolt.

5.1.8 Microgolfreactor

De microgolfreacties werden uitgevoerd in een CEM Focused MicrowaveTM Synthesis System, Model

Discover, met een maximaal vermogen van 300 W, die toelaat de temperatuur en tijd van de reactie

in te stellen. Als recipiënt werd gebruik gemaakt van speciale dikwandige glazen flacons, voorzien

van een aangepast septum met kliksysteem. De temperatuur werd gecontroleerd door middel van

een infraroodsensor en een magnetische, roterende plaat aan de onderkant van de reactor zorgde

voor menging van het reactiemengsel. Finale koeling gebeurde door middel van aangezogen lucht.

5.2 Veiligheid

5.2.1 Algemene veiligheidsmaatregelen in het chemisch labo

Bij het aanvatten van het onderzoek voor deze Masterproef werden drie documenten omtrent de

veiligheid gelezen en ondertekend: Interne richtlijnen van de SynBioC Research Group,

Veiligheidsinstructies, waarin algemene veiligheidsvoorschriften voor het hanteren van verschillende

(klassen van) chemische verbindingen geschreven staan, en de Ugent Welzijns- en Milieugids.

Daarenboven werd een rondleiding gegeven in het labo waarbij toegelicht werd hoe men efficiënt

moet handelen in noodsituaties. Bij het betreden van het chemisch labo zijn het dragen van een

labojas en labobril elementair. Tevens moeten veiligheidshandschoenen gedragen worden wanneer

gewerkt wordt met schadelijke stoffen, maar bij het hanteren van apparatuur en bij het verlaten van

het labo moeten deze handschoenen afgedaan worden. Verder is het ook essentieel om de MSDS-

fiches te hebben gelezen bij het aanvatten van een nieuwe reactie met nieuwe reagentia, stoffen en

solventen.

5.2.2 Risico’s verbonden aan gebruikte reagentia en solventen

In deze sectie wordt een overzicht gegeven van de risico’s verbonden aan reagentia, solventen, en

andere chemische stoffen die veel gebruikt werden tijdens het onderzoek voor deze Masterproef. De

informatie werd gehaald uit MSDS-fiches.

2-Amino-1-ethanol, 3-amino-1-propanol, 2-methoxyethylamine en 3-methoxypropylamine zijn licht

ontvlambare vloeistoffen waarvan de dampen ook licht ontvlambaar zijn. De stoffen zijn schadelijk

bij inslikken, contact met de huid en bij inademing. Ze kunnen ernstige brandwonden en oogletsels

veroorzaken. Bij gebruik worden ze dus best weggehouden van warmte, vuur, of hete oppervlakken

Experimenteel deel

45

en moet inademing vermeden worden. Bovendien zijn ze schadelijk voor in water levende

organismen, met langdurige gevolgen.

Azijnzuur is een schadelijke ontvlambare vloeistof en damp. Bij contact met de huid kan het ernstige

brandwonden veroorzaken. Maar ook bij inhalatie heeft het een corrosief effect op de longen. Wat

de chronische schade betreft, kan het mutaties veroorzaken in somatische cellen, voornamelijk in

volgende lichaamsdelen: nieren, huid, slijmvliezen en tanden.

Silica komt voor als witte kristallen en is zeer schadelijk voor de longen bij inademing. Silica heeft

verschillende negatieve effecten op de gezondheid. Bij inhalatie van zeer grote concentraties op een

korte tijd (enkele maanden) kan silica silicose veroorzaken, die fataal kan zijn. Veder kan het ook

kanker, auto-immuunziekten, tuberculose en nefrotoxiciteit veroorzaken.

Celiet of diatomeeënaarde komt voor onder de vorm van een fijn grijs poeder en is een amorfe vorm

van silica. Het kan irritatie van luchtwegen veroorzaken en is schadelijk voor de longen. Het is minder

schadelijk dan kristallijne silica maar moet toch met de nodige voorzichtigheid gehanteerd worden

door te werken in de trekkast of door een stofmasker te dragen.

Montmorillonietklei (K10) is wederom een fijn grijs poeder, waarvan de inademing moet vermeden

worden. Maar verder worden geen ernstige effecten gerapporteerd voor deze stof.

Ethanol is een vloeistof waarvan de vloeibare- en dampvorm ontvlambaar zijn. Bij contact met de

huid heeft het een matig schadelijk effect, maar bij inademing werkt het in op het centrale

zenuwstelsel wat zich uit in duizeligheid, hoofdpijn, misselijkheid, en het kan zelfs leiden een tot een

comateuze toestand. Verstikking is ook een mogelijk effect bij inademing van ethanoldamp.

Methanol is een vloeistof waarvan de vloeibare- en dampvorm ontvlambaar zijn en matige irritatie

geven bij contact met de huid. Bij inname en inhalatie zijn de effecten wel zeer schadelijk. Bij inname

wordt het gastrointestinaal stelsel beschadigd wat misselijkheid, overgeven en diarree veroorzaakt.

Het zenuwstelsel wordt ook beschadigd en dit leidt tot hoofdpijn, duizeligheid, slaperigheid. Daarna

kan dit leiden tot bewusteloosheid en zelfs tot het belanden in een comateuze toestand, met sterfte

tot gevolg. Inname kan ook blindheid veroorzaken. Bij inademing kunnen volgende symptomen

voorkomen: duizeligheid, hoofdpijn, misselijkheid en mogelijk comateuze toestand, blindheid en

aantasting van de slijmvliezen.

Dimethylsulfoxide (DMSO) is een kleurloze vloeistof waarvoor in het algemeen een lage toxiciteit

gerapporteerd staat.

Experimenteel deel

46

Gehalogeneerde solventen zoals chloroform en dichloormethaan worden zoveel mogelijk vermeden

omwille van effect op het milieu. Ze zorgen namelijk voor de afbraak van de ozonlaag. Bovendien zijn

deze stoffen carcinogeen voor de mens. Wanneer deze solventen toch dienen gebruikt te worden in

het labo, wordt de exacte hoeveelheid van gebruik genoteerd in een schrift en worden deze na

gebruik gedeponeerd in aparte vaten.

5.3 Beschrijving van de experimenten

5.3.1 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,4,6-

heptatriëen-3-onen 56 en 64

De synthese van (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-

heptatriëen-3-on 56a wordt hieronder beschreven als representatief voorbeeld voor de synthese van

(1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-onen 56 en 64.

Curcumine 1 (1 mmol, 368 mg) werd opgelost in 5 ml ethanol in een microgolfovenflacon van 10 ml.

Vervolgens werden 1,6 massa-equivalenten montmorillonietklei (600 mg) toegevoegd als katalysator

en droogmiddel. Daarna werden 10 equivalenten 2-amino-1-ethanol (10 mmol, 0,60 ml) en 2,4

equivalenten azijnzuur (2,4 mmol, 0,14 ml) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende één uur

geroerd bij 70 °C onder invloed van microgolfbestraling. In een volgende stap werd het

reactiemengsel gefiltreerd over celiet en werd de filterkoek grondig nagespoeld met ethanol (300

ml). Hierna werd de ethanol uit het filtraat ingedampt aan de rotavapor tot nog ongeveer 50 ml

overbleef. Vervolgens werd 500 ml ethylacetaat toegevoegd en werd dit mengsel gewassen met een

verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat (50 ml) en pekel (50 ml). Daarna werd het mengsel

gedroogd over magnesiumsulfaat, gefiltreerd en ingedampt aan de rotavapor. Na

kolomchromatografie over silica (EtOAc/MeOH (100/1)) en een daaropvolgende herkristallisatie

(EtOH/hexaan 15/1) resulteerde dit in 38 mg (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-

hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 56a (9 %).

Voor de synthese van verbinding 64a werd gebruik gemaakt van 2-methyltetrahydrofuran als

solvent, 90 minuten als reactietijd en 100 °C als reactietemperatuur. Verbindingen 56b en 64b

werden bekomen bij een reactietemperatuur van respectievelijk 80 en 90 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on

56a

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 3,48 - 3,52 (2H,

m, NHCH2CH2O); 3,56 - 3,59 (2H, m, NHCH2CH2O);

3,82 en 3,83 (2 × 3H, 2 × s, 2 × CH3O); 4,93 (1H, s

Experimenteel deel

47

(br), CH2OH); 5,60 (1H, s, COCHCN); 6,73 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,80

(1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,94 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,00 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 7,11 (1H, d, J =

8,2 Hz, CHarom); 7,21 (1H, s, CHarom); 7,24 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,27 - 7,31 (2 × 1H, m, 1 × CHarom en 1

× CH); 9,39 (2 × 1H, s (br), 2 × OH); 11,46 (1H, t, J = 5,8 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 45,7

(HNCH2CH2);56,0 en 56,2 (2 × CH3O);60,9 (CH2OH);92,8 (COCHCN);110,8, 111,6, 116,0 en 116,1 (4 ×

HCarom);117,9 (HC);122,4 en 122,5 (2 × HCarom);127,3 (HC);127,6 en 127,7 (2 × Cquat,arom);136,5 en

137,8 (2 x HC);148,3, 148,4 en 148,8 (4 x Cquat,arom);162,6 (CquatN);184,6 (C=O). MS (70 eV): m/z (%):

412 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C23H26NO6: 412,1755 [M+H]+, gevonden: 412,1772.

Oranje kristallen. Rendement na kolomchromatografie (EtOAc/MeOH (100/1); Rf(SiO2) = 0,10) en

herkristallisatie in ethanol/hexaan (15/1): 9%. Tm = 194 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(3-hydroxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on

56b

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,72 (2H, quint, J =

6,0 Hz, CH2CH2CH2); 3,48 - 3,52 (2 × 2H, m,

NHCH2CH2CH2O); 3,82 en 3,83 (2 x 3H, 2 x s, 2 x

CH3O); 4,64 (1H, s (br), CH2OH); 5,61 (1H, s,

COCHCN); 6,73 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,80 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom);

6,96 (1H, d, J = 16,1 Hz, CH); 7,00 (1H, d × d, J = 8,2, 1,5 Hz, CHarom); 7,11 (1H, d × d, J = 8,2, 1,5 Hz,

CHarom); 7,21 (1H, d, J = 1,5 Hz, CHarom); 7,25 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,29 (1H, d, J = 1,5 Hz, CHarom);

7,32 (1H, d, J = 16,1 Hz, CH); 9,40 (2 x 1H, s (br), 2 x OH); 11,49 (1H, t, J = 6,0 Hz, NH). 13C-NMR (100

MHz, d6-DMSO): 33,6 (CH2CH2CH2);39,8 (NHCH2CH2); 56,0 en 56,2 (2 × CH3O); 58,2 (CH2CH2O); 92,7

(COCHCN);110,8, 111,5, 116,0 en 116,1 (4 × HCarom);117,6 (HC);122,4 (2 × HCarom);127,2 (HC);127,6

en 127,7 (2 × Cquat,arom);136,6 en 137,9 (2 × HC);148,3, 148,4, 148,5 en 148,9 (4 × Cquat,arom);162,7

(CquatN);184,6 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 426 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C24H28NO6:

426,1911 [M+H]+, gevonden: 426,1902. Oranje kristallen. Rendement na kolomchromatografie

(PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,23) en herkristallisatie in methanol: 8%. Tm = 112 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(2-methoxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on

64a

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 3,43 (3H, s, CH2OCH3);

3,60 (4H, s, NH(CH2)2O); 3,93 en 3,95 (2 × 3H, 2 × s,

2 × CH3O); 5,54 (1H, s, COCHCN); 5,77 en 5,83 (2 ×

1H, 2 × s, 2 × OH); 6,63 (1H, d, J = 15,6 Hz, CH); 6,74

(1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 6,90 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,93 (1H, d, J = 8,2 Hz, CHarom); 6,99 – 7,09 (4H,

Experimenteel deel

48

m, 4 × CHarom); 7,19 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,47 (1H, d, J = 15,6 Hz, CH); 11,51 (1H, s (br), NH). 13C-

NMR (100 MHz, ref = CDCl3): 43,7 (HNCH2CH2);56,1 en 56,2 (2 × CH3O);59,4 (CH2OCH3);71,9

(CH2CH2O);93,9 (COCHCN);109,3, 109,4, 114,8 en 115,0 (4 × HCarom);118,6 (HC);121,9 en 122,5 (2 ×

HCarom);127,0 (HC);128,4 en 128,9 (2 × Cquat,arom);137,4 en 137,6 (2 × HC);146,8, 146,9, 147,0 en

147,4 (4 × Cquat,arom);163,0 (CquatN);186,0 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 426 (M++1, 100). HRMS (ESI):

berekend voor C24H28NO6: 426,1911 [M+H]+, gevonden: 426,1905. Oranje kristallen. Rendement na

kolomchromatografie (PE/EtOAc (1/4); Rf(SiO2) = 0,10) en herkristallisatie in ethanol/hexaan (15/1):

9%. Tm = 174 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-5-(3-methoxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on

64b


6,0 Hz, CH2CH2CH2); 3,25 (3H, s, CH2OCH3); 3,42 (2H,

t, J = 6,0 Hz, CH2CH2O); 3,50 (2H, q, J = 6,0 Hz,

NHCH2CH2); 3,82 en 3,83 (2 x 3H, 2 x s, 2 x CH3O);

5,61 (1H, s, COCHCN); 6,73 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHarom); 6,81 (1H, d, J = 8,1

Hz, CHarom); 6,93 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,01 (1H, d × d, J = 8,1, 1,6 Hz, CHarom); 7,12 (1H, d × d, J =

8,1, 1,6 Hz, CHarom); 7,22 - 7,28 (3 × 1H, m, 2 × CHarom en 1 × CH); 7,32 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 9,40 (2 x

1H, s (br), 2 x OH); 11,46 (1H, t, J = 6,0 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 30,5

(CH2CH2CH2);39,8 (NHCH2CH2); 56,0 en 56,1 (2 × CH3O); 58,5 (CH2OCH3); 69,4 (CH2CH2O); 92,8

(COCHCN);110,9, 111,6, 116,0 en 116,1 (4 × HCarom);117,4 (HC);122,4 en 122,5 (2 × HCarom);127,2

(HC);127,6 en 127,7 (2 × Cquat,arom);136,7 en 138,0 (2 × HC); 148,3, 148,4 en 148,8 (4 ×

Cquat,arom);162,6 (CquatN);184,7 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 440 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend

voor C25H30NO6: 440,2068 [M+H]+, gevonden: 440,2073. Oranje kristallen. Rendement na

kolomchromatografie (PE/EtOAc en MeOH (1/5 en 2%); Rf(SiO2) = 0,24) en herkristallisatie in

methanol/hexaan (15/1): 11%. Tm = 141 °C.

5.3.2 Synthese van (1E,4Z,6E)-5-amino-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-

onen 58 en 66

De synthese van (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on

58a wordt hieronder beschreven als representatief voorbeeld voor de synthese van (1E,4Z,6E)-5-

amino-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-1,4,6-heptatriëen-3-onen 58 en 66.

Bisdemethoxycurcumine 3 (1 mmol, 308mg) werd opgelost in 5 ml ethanol in een

microgolfovenflacon van 10 ml. Vervolgens werden 1,9 massa-equivalenten montmorillonietklei (600

mg) toegevoegd als katalysator en droogmiddel. Daarna werden 5 equivalenten 2-amino-1-ethanol

Experimenteel deel

49

(5 mmol, 0,3 ml) en 2,4 equivalenten azijnzuur (2,4 mmol, 0,14 ml) toegevoegd. Het mengsel werd

gedurende één uur geroerd bij 90 °C onder invloed van microgolfbestraling. In een volgende stap

werd het reactiemengsel gefiltreerd over celiet en werd de filterkoek grondig nagespoeld met

ethanol (300 ml). Hierna werd de ethanol uit het filtraat ingedampt aan de rotavapor tot ongeveer 50

ml overbleef. Vervolgens werd 500 ml ethylacetaat toegevoegd en werd dit mengsel gewassen met

een verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat (50 ml) en pekel (50 ml). Daarna werd het mengsel


kolomchromatografie over silica (PE/EtOAc/MeOH 9/9/2) en een daaropvolgende herkristallisatie in

methanol resulteerde dit in 28 mg (1E,4Z,6E)-1,7-bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-

heptatriëen-3-on 58a (8 %).

Voor de synthese van verbinding 58b werd gebruik gemaakt van 10 equivalenten 3-amino-1-

propanol en een reactietemperatuur van 80 °C. Voor het bekomen van verbinding 66a werden 10

equivalenten 2-methoxyethylamine gebruikt en verbinding 66b werd bekomen bij een

reactietemperatuur van 80 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-hydroxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 58a

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 3,48 (2H, ~t, J = 5,1

Hz, NHCH2CH2O); 3,56 (2H, q, J = 5,1 Hz, NHCH2CH2O);

4,92 (1H, t, J = 5,1 Hz, CH2OH); 5,59 (1H, s, COCHCN);

6,67 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,6 Hz,

CHarom); 6,80 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,91 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,25 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,30

(1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,43 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 7,53 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 9,80 (2 × 1H, s

(br), 2 × OH); 11,47 (1H, t, J = 5,1 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 45,7 (HNCH2CH2);60,9

(CH2CH2O); 92,9 (COCHCN);116,2 (4 × HCarom); 117,6 (HC); 127,0 (HC);127,1 en 127,2 (2 ×

Cquat,arom);129,7 en 129,9 (4 × HCarom);136,2 en 137,4 (2 × HC);159,0 en 159,3 (2 × Cquat,arom);162,8

(CquatN);184,8 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 352 (M++1, 100). Oranje kristallen. Rendement na

kolomchromatografgie (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,19) en herkristallisatie in methanol: 8%.

Tm = 132 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(3-hydroxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 58b


6,3 Hz, CH2CH2CH2); 3,48 (2H, q, J = 6,3 Hz, NHCH2CH2);

3,50 (2H, q, J = 6,3 Hz, CH2CH2O); 4,61 (1H, t, J = 6,3

Hz, CH2OH); 5,60 (1H, s, COCHCN); 6,66 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 6,80

Experimenteel deel

50

(2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 6,91 (1H, d, J = 16,1 Hz, CH); 7,25 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,32 (1H, d, J =

16,1 Hz, CH); 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 7,54 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 9,76 en 9,87 (2 × 1H, 2 × s,

2 × OH); 11,50 (1H, t, J = 6,3 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 33,6 (CH2CH2CH2);39,8

(NHCH2CH2); 58,2 (CH2OH);92,6 (COCHCN);116,2 (4 × HCarom); 117,2 (HC); 126,9 (HC);127,1 en

127,2 (2 × Cquat,arom);129,7 en 130,0 (4 × HCarom);136,3 en 137,6 (2 × HC);159,0 en 159,4 (2 ×

Cquat,arom);162,7 (CquatN);184,6 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 366 (M++1, 100). Oranje kristallen.

Rendement na kolomchromatografie (EtOAc/MeOH (100/2); Rf(SiO2) = 0,29): 18%. Tm = 144 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(2-methoxyethyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 66a

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 3,31 (3H, s,

CH2OCH3); 3,50 (2H, t, J = 5,4 Hz, NHCH2CH2O); 3,60

(2H, q, J = 5,4 Hz, NHCH2CH2O); 5,60 (1H, s, COCHCN);

6,67 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,6 Hz,

CHarom); 6,80 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,90 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,26 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,31

(1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,44 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 7,53 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 9,76 (2 × 1H, s

(br), 2 x OH); 11,47 (1H, t, J = 5,4 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 42,9 (HNCH2CH2);58,7

(CH2OCH3); 71,6 (CH2CH2O); 92,8 (COCHCN);116,2 (4 × HCarom); 117,4 (HC); 126,9 (HC);127,1 en

127,2 (2 × Cquat,arom);129,7 en 130,0 (4 × HCarom);136,4 en 137,6 (2 × HC);159,0 en 159,4 (2 ×

Cquat,arom);162,5 (CquatN);184,7 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 366 (M++1, 100). HRMS (ESI): berekend

voor C22H24NO4: 366,1700 [M+H]+, gevonden: 366,1705. Oranje kristallen. Rendement na ‘reversed

phase’ kolomchromatografie (MeOH/H2O 40/60 naar 100/0): 32%. Tm = 196 °C.

(1E, 4Z, 6E)-1,7-Bis-(4-hydroxyfenyl)-5-(3-methoxypropyl)amino-1,4,6-heptatriëen-3-on 66b


6,2 Hz, CH2CH2CH2); 3,25 (3H, s, CH2OCH3); 3,41 (2H, t,

J = 6,2 Hz, CH2CH2O); 3,48 (2H, q, J = 6,2 Hz,

NHCH2CH2); 5,60 (1H, s, COCHCN); 6,67 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 6,77 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,80

(2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 6,89 (1H, d, J = 16,0 Hz, CH); 7,26 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,32 (1H, d, J =

16,0 Hz, CH); 7,44 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 7,53 (2H, d, J = 8,6 Hz, CHarom); 9,77 en 9,87 (2 × 1H, 2 × s,

2 × OH); 11,48 (1H, t, J = 6,2 Hz, NH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 30,5 (CH2CH2CH2);39,7

(NHCH2CH2); 58,5 (CH2OCH3); 69,3 (CH2CH2O); 92,7 (COCHCN);116,1 en 116,2 (4 × HCarom); 117,2

(HC); 126,9 (HC);127,1 en 127,2 (2 × Cquat,arom);129,7 en 130,0 (4 × HCarom);136,4 en 137,6 (2 ×

HC);159,0 en 159,4 (2 × Cquat,arom);162,6 (CquatN);184,7 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 380 (M++1, 100).

Oranje kristallen. Rendement na kolomchromotografie (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,44) en

herkristallisatie in methanol: 22%. Tm = 161 °C.

Experimenteel deel

51

5.3.3 Synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57b, 59a en 67b

De synthese van E-2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-6-(4-hydroxy-3-methoxystyryl)-1-(3-

hydroxypropyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 57b wordt hieronder beschreven als representatief

voorbeeld voor de synthese van 2,3-dihydropyridin-4-onen 57b, 59a en 67b.

Curcumine 1 (1 mmol, 368mg) werd opgelost in 5 ml ethanol in een microgolfovenflacon van 10 ml.

Vervolgens werden 1,6 massa-equivalenten montmorillonietklei (600 mg) toegevoegd als katalysator

en droogmiddel. Daarna werden 10 equivalenten 3-amino-1-propanol (10 mmol, 0,76 ml) en 2,4

equivalenten azijnzuur (2,4 mmol, 0,14 ml) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende één uur

geroerd bij 80 °C onder invloed van microgolfbestraling. In een volgende stap werd het

reactiemengsel gefiltreerd over celiet en werd de filterkoek grondig nagespoeld met ethanol (300

ml). Hierna werd de ethanol uit het filtraat ingedampt aan de rotavapor tot ongeveer 50 ml

overbleef. Vervolgens werd 500 ml ethylacetaat toegevoegd en werd dit mengsel gewassen met een

verzadigde oplossing van natriumbicarbonaat (50 ml) en pekel (50 ml). Daarna werd het mengsel


kolomchromatografie over silica (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2)) en een daaropvolgende herkristallisatie in

methanol resulteerde dit in 50 mg E-2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-6-(4-hydroxy-3-methoxystyryl)-1-

(3-hydroxypropyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 57b (12 %).

Voor de synthese van verbindingen 59a en 67b werd gebruik gemaakt van bisdemethoxycurcumine 3

en van 5 equivalenten 2-amino-1-ethanol en 3-methoxypropylamine. Daarenboven werd voor de

synthese van 59a een reactieduur van 4 uur en een reactietemperatuur van 90 °C toegepast en werd

één equivalent azijnzuur gebruikt.

E-2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-6-(4-hydroxy-3-methoxystyryl)-1-(3-hydroxypropyl)-2,3-

dihydropyridin-4-onen 57b

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,63 - 1,73 (2H, m,

CH2CH2CH2); 2,41 (1H, d × d, J = 16,2, 5,0 Hz, 3-Ha); 2,86

(1H, d × d, J = 16,2, 5,0 Hz, 3-Hb); 3,09 - 3,16 (1H, m,

N(HCH)); 3,42 - 3,43 (2H, m, CH2CH2O); 3,74 en 3,81 (2 ×

3H, 2 × s, 2 × OCH3); 3,81 - 3,85 (1H, m, N(HCH)); 4,63

(1H, s (br), CH2OH); 4,72 - 4,74 (1H, m, 2-H); 5,08 (1H, s, 5-H); 6,66 (1H, d × d, J = 8,1, 1,5 Hz, CHarom);

6,71 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHarom); 6,78 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHarom); 6,84 (1H, d, J = 1,5 Hz, CHarom); 7,05 (1H,

d, J = 15,8 Hz, CH); 7,07 (1H, d × d, J = 8,1, 1,6 Hz, CHarom); 7,18 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,28 (1H, d, J =

1,6 Hz, CHarom); 8,93 en 9,38 (2 × 1H, 2 × s (br), 2 × OH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 32,8

(CH2CH2CH2);43,4 (3-CH2); 47,6 (NCH2CH2); 56,2 (2 × OCH3); 58,1 (CH2CH2O); 61,2 (2-CH); 96,0 (5-

Experimenteel deel

52

CH);111,3, 111,4, 115,7, 116,0 en 119,1 (5 × HCarom); 119,5 (HC); 122,3 (HCarom);127,8 en 130,9 (2 ×

Cquat,arom); 137,6 (HC); 146,3, 148,1, 148,3 en 148,6 (4 × Cquat,arom); 161,0 (6-CH);188,3 (C=O). MS (70

eV): m/z (%): 426 (M++1, 100). Gele kristallen. Rendement na kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH

(9/9/2); Rf(SiO2) = 0,08) en herkristallisatie in methanol: 12%. Tm = 146 °C.

E-2-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-hydroxystyryl)-1-(2-hydroxyethyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 59a

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 2,33 (1H, d × d, J = 15,9, 4,4

Hz, 3-Ha); 2,92 (1H, d × d, J = 15,9, 4,4 Hz, 3-Hb); 3,03 - 3,10

(1H, m, N(HCH)); 3,49 - 3,54 (2H, m, CH2OH); 3,83 - 3,89 (1H,

m, N(HCH)); 4,77 - 4,80 (1H, m, 2-H); 4,89 (1H, s (br),

CH2OH); 5,07 (1H, s, 5-H); 6,71 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom);

6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 6,99 (1H, d, J = 15,8 Hz, CH); 7,07 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 7,16 (1H,

d, J = 15,8 Hz, CH); 7,50 (2H, d, J = 8,5 Hz, CHarom); 9,35 en 9,80 (2 × 1H, 2 × s, 2 × OH). 13C-NMR (100

MHz, d6-DMSO): 43,0 (3-CH2); 52,9 (NCH2CH2); 60,3 (CH2CH2O); 61,1 (2-CH);96,3 (5-CH);115,6 en

116,1 (4 × HCarom); 119,5 (HC);127,3 (Cquat,arom);127,9 en 129,8 (4 × HCarom); 130,0 (Cquat,arom);137,2

(HC);157,0, 159,1 en 160,9 (2 × Cquat,arom en 1 × 6-CH);188,5 (C=O). MS (70 eV): m/z (%): 352 (M++1,

100). Gele kristallen. Rendement na kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH (9/9/2); Rf(SiO2) = 0,18)

en herkristallisatie in methanol: 9%. Tm = 149 °C.

E-2-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-hydroxystyryl)-1-(3-methoxypropyl)-2,3-dihydropyridin-4-on 67b

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): 1,74 - 1,76 (2H, m,

CH2CH2CH2); 2,34 (1H, ~d, J = 15,7 Hz, 3-Ha); 2,89 (1H, d × d,

J = 15,7; 6,1 Hz, 3-Hb); 3,04 - 3,07 (1H, m, N(HCH)); 3,18 (3H,

s, CH2OCH3); 3,29 - 3,34 (2H, m, CH2OCH3); 3,81 - 3,84 (1H,

m, N(HCH)); 4,70 - 4,72 (1H, m, 2-H); 5,08 (1H, s, 5-H); 6,71

(2H, d, J = 7,5 Hz, CHarom); 6,79 (2H, d, J = 7,5 Hz, CHarom);

6,94 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,07 (2H, d, J = 7,5 Hz, CHarom); 7,19 (1H, d, J = 15,7 Hz, CH); 7,50 (2H, d, J

= 7,5 Hz, CHarom); 9,37 en 9,80 (2 × 1H, 2 × s, 2 × OH). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 29,6

(CH2CH2CH2);43,3 (3-CH2); 47,6 (NCH2CH2); 58,3 (CH2OCH3); 60,7 (2-CH); 69,2 (CH2CH2O); 96,1 (5-

CH);115,7 en 116,1 (4 × HCarom); 119,1 (HC);127,3 (Cquat,arom);128,0 en 129,8 (4 × HCarom); 130,1

(Cquat,arom);137,4 (HC);157,1 en 159,1 en 160,8 (2 × Cquat,arom en 1 × 6-CH);188,3 (C=O). MS (70 eV):

m/z (%): 380 (M++1, 100). Gele kristallen. Rendement na kolomchromatografie (PE/EtOAc/MeOH

(9/9/2); Rf(SiO2) = 0,18) en herkristallisatie in methanol: 3%. Tm = 252 °C.

Bronnen

53

Bronnen 1. Prasad, S.; Gupta, S.C.; Tyagi, A.K.; Aggarwal, B.B. Biotech. Adv. 2014, 32, 1053.

2. Goel, A.; Kunnumakkara, A.B.; Aggarwal B.B. Biochem. Pharmacol. 2008, 75, 787.

3. Strimpakos, A.S.; Sharma, R.A.; Antioxid. Redox. Signal. 2008, 10, 511.

4. Tønnesen, H.H.; Karlsen, J.; Z Lebensm. Unters. Forsch. 1985, 180, 132.

5. Aggarwal, B.B.; Kumar, A.; Bharti, A.C. Anticancer Res. 2003, 23, 363.

6. Wang, Y.J.; Pan, M.H.; Cheng, A.L.; Lin, L.I.; Ho, Y.S.; Hsieh, C.Y. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 1997,

15, 1867.

7. Anand, P.; Kunnumakkara, A.B.; Newman, R.A.; Aggarwal, B.B. Mol. Pharmaceut. 2007, 4, 807.

8. Shoba, G.; Joy, D.; Joseph, T.; Majeed, M.; Rajendran, R.; Srinivas, P. S. Planta. Med. 1998, 64, 353.

9. Van Bogaert, M. Ingenieurstesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2013.

10. Van Damme, S. Ingenieurstesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2014.

11. D’Hoore, S. Ingenieurstesis, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, 2015.

12. Wang, Y.J.; Pan, M.H.; Cheng, A.L.; Lin, L.I.; Ho, Y.S.; Hsieh, C.Y.; Lin, J.K. J. Pharm. Biomed. Anal.

1997, 15, 1867.

13. Tomren, M.A.; Masson, M.; Loftsson, T.; Hjorth Tønnesen, H. Int. J. Pharm. 2007, 338, 27.

14. Straganz, G.D.; Glieder, A.; Brecker, L.; Ribbons, D.W.; Steiner, W. Biochem. J. 2003, 369, 573.

15. Rosemonda, M.J.C.; St. John-Williams, L.; Yamaguchi, T.; Fujishita, T.; Walsh, S.J. Chem. Biol.

Interact. 2004, 147, 129.

16. Muthenna, P.; Suryanarayana, P.; Gunda, S.K.; Petrash, J.M.; Reddy, G.B. FEBS Letters. 2009, 583,

3637.

17. Sardjiman, S. S.; Reksohadiprodjo, M. S.; Hakim, L.; Goot, H.; Timmerman, H. Eur. J. Med. Chem.

1997, 32, 625.

18. Du, Z. Y.; Liu, R. R.; Shao, W. Y.; Mao, X. P.; Ma, L.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S.; Chan, A. S. Eur. J. Med.

Chem. 2006, 41, 213.

19. Zhou, D.Y.; Zhang, K.; Conney, A.H.; Ding, N.; Cui, X.-X.; Wang, H.; Verano, M.; Zhao, S.Q.; Fan,

Y.X.; Zheng, X.; Du, Z.Y. Chem. Pharm. Bull. 2013, 61, 1149.

20. Fuchs, J.R.; Pandit, B.; Bhasin, D.; Etter, J.P.; Regan, N.; Abdelhamid, D.; Li, C.; Lin, J.; Li, P.K.

Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 2065.

21. Wei, X.; Du, Z.Y.; Zheng, X.; Cui, X.X.; Conney, A.H.; Zhang, K. Eur. J. Med. Chem. 2012, 53, 235.

Bronnen

54

22. Suarez, J.A.Q.; Rando, D.G.; Santos, R.P.; Gonçalves, C.P.; Ferreira, E.; Ernesto de Carvalho, J.;

Kohn, L.; Maria, D.A.; Faião-Flores, F.; Michalik, D.; Marcucci, M.C.; Vogel, C. Bioorg. Med. Chem.

2010, 8, 6275.

23. Adams, B.K.; Ferstl, E.M.; Davis, M.C.; Herold, M.; Kurtkaya, S.; Camalier, R.F.; Hollingshead, M.G.;

Kaur, G.; Sausville, E.A.; Rickles, F.R.; Snyder, J.P.; Liotta, D.C.; Shoji, M. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12,

3871.

24. Nali, H. Ingenieurstesis, Faculteit Ingenieurswetenschappen en Architectuur, Universiteit Gent.

2014

25. Rumpel, W. Austrian Pat. Appl., 1954, 180, 258, AT 180258.

26. Dinkova-Kostova, A. T.; Abeygunawardana, C.; Talalay, P. J. Med. Chem. 1998, 41, 5287.

27. Lee, K.; Aziz, F.H.A.; Syahida, A.; Abas, F.; Shaari, K.; Israf, D.A.; Lajis, N.H. Eur. J. Med. Chem. 2009,

44, 3195.

28. Liang, G.; Shao, L.; Wang, Y.; Zhao, C.; Chu, Y.; Xiao, J.; Zhao, Y.; Li, X.; Yang, S. Bioorg. Med.

Chem. 2009, 17, 2623.

29. Samaan, N.; Zhong, Q.; Fernandez, J.; Chen, G.; Hussain, A.M.; Zheng, S.; Wang, G.; Chen, Q.H.

Eur. J. Med. Chem, 2014, 75, 123.

30. Yadav, B.; Taurin, S.; Rosengren, R.J.; Schumacher, M.; Diederich, M.; Somers-Edgar, T.J.; Larsen,

L. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 6701.

31. Lin, L.; Qian Shi, Q.; Nyarko, A.K.; Bastow, K.F.; Wu, C.C.; Su, C.Y.; Shih,C.C.Y.; Lee, K.H. J. Med.

Chem. 2006, 49, 3963.

32. Karthikeyan, N.S.; Sathiyanarayanan, K.I.; Aravindan, P.G.; Giridharan, P. Med. Chem. Res. 2011,

20, 81.

33. Liang, G.; Li, X.; Chen, L.; Yang, S.; Wu, X.; Studer, E. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 1525.

34. Liang, G.; Yang, S.; Xiao, J. Eur. J. Med. Chem. 2008. doi:10.1016/j.ejmech.2008.01.031.

35. Wang, R.; Chen, C.; Zhang, X.; Zhang, C.; Zhong, Q.; Chen, G.; Zhang, Q.; Zheng, S.; Wang, G.;

Chen, Q.H. J. Med. Chem. 2015, 58, 4713.

36. Borsche, W.; Geyer, A. Ann. 1912, 393, 29.

37. Yin, S.; Zheng, X.; Yao, X.; Wang, Y.; Liao, D. J. Cancer Ther. 2013, 4.

38. Sehnal, P.; Taghzouti, H.; Fairlamb, I.J. S.; Jutand, A.; Lee, A.F.; Whitwood, A.C. Organometallics

2009, 28, 82.

39. Larsen, R.O.; Aksnes, G. Phosphorus Sulfur 1983, 15, 218.

40. Lefèbvre, G.; Seyden-Penne, J. J. Chem. Soc .1970, 1308.

Bronnen

55

41. Weber, W.M.; Hunsaker, L.A.; Roybal, C.N.; Bobrovnikova-Marjon, E.V.; Abcouwer, S.F.; Royer,

R.E.; Deck, L.M.; Vander Jagt, D.L. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 2450.

42. Shetty, D.; Kim, Y.J.; Shim, H.; Snyder, J.P. Molecules. 2015, 20, 249.

43. Lu, Y.; Wang, Y.; Zhu, W. Phys. Chem. Chem. Phys. 2010, 12, 4543.

44. Xu, Z.; Yang, Z.; Liu, Y.; Lu, Y.; Chen, K.; Zhu, W. J. Chem. Inf. Model. 2014, 54, 69.

45. Ohori, H.; Yamakoshi, H.; Tomizawa, M.; Shibuya, M.; Kakudo, Y.; Takahashi, A.; Takahashi, S.;

Kato, S.; Suzuki, T.; Ishioka, C.; Iwabuchi, Y.; Shibata H. Mol. Cancer Ther. 2006, 5, 2563.

46. Li, Y.; Zhang, L.P.;Dai, F.; Yan, W.J.; Wang, H.B.; Tu, Z.S.; Zhou, B. J. Agric. Food Chem. 2015, 63,

7731.

47. Andrew Brown, A.; Shi, Q.; Moore, T.W.; Yoon, Y.; Prussia, A.; Maddox, C. Liotta, D.C.; Shim, H.;

Snyder, J.P. J. Med. Chem. 2013, 56, 3456.

48. Roth, B. L.; Sheffler, D. J.; Kroeze, W. K. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 353.

49. Elias, R.S.; Saeed, B.A.; Saour, K.Y.; Al-Masoudi, N.A. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3049.

50. Amr, A.G.E; Mohamed, A.M.; Mohamed, S.F.; Abdel-Hafez, N.A.; Hammam, A.E.F.G. Bioorg.

Med. Chem. 2006, 16, 5481.

51. Jurenka, S.J. Altern. Med. Rev. 2009, 14, 141.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968089606003452




Synthese van 5-hydroxyalkylamino- en 5-methoxyalkylamino...

Documents

Transcript of Synthese van 5-hydroxyalkylamino- en 5-methoxyalkylamino...