SPOTTEN MET BLOED

Ir. Mariëtte T. Ackermans, PhDAnalytisch Chemica

Laboratorium voor EndocrinologieAcademisch Medisch Centrum

Amsterdam

DISCLOSURE

Burgers’ Zoo – 17-11-2015

(Potentiële) Belangenverstrengeling Geen

Laboratory of Endocrinology

Monster dilemma

Laboratory of Endocrinology

Dried Blood Spot

Voordelen:

• Patiënt kan eenvoudig thuis zelf bloed afnemen

• Monster kan via reguliere post naar lab gestuurd

• Klein monstervolume (belangrijk voor o.a. neonaten)

Nadelen:

• Gevoeligere meetmethoden nodig vanwege kleine

monstervolumina

• Validatie DBS ten opzichte van conventionele bloedafname

(effecten matrix zoals HT en bloedvolume)

Laboratory of Endocrinology

Adrenogenitaal syndroom (AGS)

Sinds 2000 onderdeel van het Nederlandse neonatale

screeningsprogramma

Laboratory of Endocrinology

AGS screening: Hielprik

Interpretatie afhankelijk van zwangerschapduur

Actie:

• 17-hydroxyprogesteron afwijkend: verwijzing naar kinderarts

• 17-hydroxyprogesteron dubieus: 2e hielprik aanvragen

Laboratory of Endocrinology

AGS screening in AMC (2012)

Neonaten

n=35087

Negatief

n=35057

Dubieus

n=29Positief

n=1

Dubieus

n=0Positief

n=2

Negatief

n=21

1ste Hielprik

2de Hielprik (n=23)

Verwezen

n=3

Geen aktie

n=35078

Verwezen

n=6

Laboratory of Endocrinology

Diagnostiek

Synacthen test:

Bepaling van cortisol na synacthen

In eerste monster ook:

17-OHP, testosteron, androsteendion,

ACTH en PRA

Monster volume: 1 mL bloed

O

O

HO

H

H

H

17-OHP

O

O

H

H

H

Androsteendion

Laboratory of Endocrinology

Nadelen immunoassays

• Kruisreactiviteit ten gevolge van non-specifieke binding

• Aparte immunoassays nodig voor 17-OHP en androsteendion

O

O

OHHO

HO

H

H

H

O

O

HO

H

H

H

O

O

HO

H

H

H

OH

17-OHP

Cortisol

11-Deoxycortisol

Laboratory of Endocrinology

Nadelen immunoassays

• Kruisreactiviteit ten gevolge van non-specifieke binding

• Aparte immunoassays nodig voor 17-OHP en androsteendion

O

O

OHHO

HO

H

H

H

O

O

HO

H

H

H

O

O

HO

H

H

H

OH

17-OHP

Cortisol

11-Deoxycortisol

Laboratory of Endocrinology

LC-MSMS versus immunoassays

Voordelen:

• Kruisreactiviteit is geen issue

• Meerdere componenten kunnen in één run gemeten worden

• Lineaire bereik is groter

• Kan worden gezien als gouden standaard

Nadelen:

• Er is meer monstervoorbereiding nodig (matrix effect)

• Apparatuur is duurder en complexer

• Analist moet meer geschoold worden/zijn

Laboratory of Endocrinology

2nd Tier test eerste hielprik

Voordelen:

• Geen tweede hielprik nodig (voordeel voor de neonaat en

sneller)

• Minder vals positieven

• Minder ongerustheid ouders

Voordat we dit in gebruik kunnen nemen is een analytische en

klinische validatie nodig.

Laboratory of Endocrinology

LC-MSMS methode

Monstervoorbewerking:

DBS: extractie met acetonitril/H2O

Interne Standaarden: deuterium gelabelde steroïden

LC-MSMS

Kolom: Acquity HSS T3 (50x2.1mm, 1.7 µm)

Mobiele fase:

A: 2 mM Ammonium acetaat/H2O + 0.1% mierenzuur

B: 2 mM Ammonium acetaat/methanol + 0.1% mierenzuur

0.6 mL/min, gradiënt: 40 tot 64% B

Detectie: MS/MS Waters Xevo TQ-S

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram standaard

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

Laboratory of Endocrinology

Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

11-deoxycorticosteron

Laboratory of Endocrinology

Extractie recovery

Component Extractie recovery

d3-testosteron 86% 72%

d8-17-hydroxyrogesteron 78% 68%

d7-androsteendion 72% 62%

d4-cortisol 88% 76%

d8-corticosteron 80% 69%

Laboratory of Endocrinology

Matrix effect

Component Matrix effect

testosteron -6%

17-hydroxyrogesteron 5%

androsteendion 6%

11-deoxycortisol 8%

cortisol 10%

cortison 18%

corticosteron 2%

21-deoxycortisol 9%

11-deoxycorticosteron -7%

Laboratory of Endocrinology

Analytische validatie

Lineariteit

COR : 1-1000 nmol/L

DAND, TST, CCN : 1-100 nmol/L

11-DOCL, 21-DOCL, OHP, CN: 1-500 nmol/L

Stabiliteit

DBS: Tenminste 3 weken op KT, 4°C of -20 °C

Ge-extraheerde spots: 2 dagen bij 10 °C

Precisie

Intra-assay CV <8%;

Total-assay CV <8%

LLOQ

<1 nmol/L voor alle

componenten

COR:cortisol, DAND:D4-androstenedion; TST:testosteron; CCN:corticosteron, 11-DOCL:11-deoxycortisol

21-DOCL:21-deoxycortisol, OHP:17-hydroxyprogesteron, CN:cortison

Laboratory of Endocrinology

Vergelijking met OHP Immunoassay van

de screening

Referentie

populatie

Neonaten

met bewezen

21-

hydroxylase

deficiëntie

Laboratory of Endocrinology

Klinische validatie: referentiewaarden

Laboratory of Endocrinology

Steroidprofiel kinderen met afwijkende

AGS screening

♦ Referentie populatie ■ Neonaten met bewezen AGS

Laboratory of Endocrinology

Steroidprofiel kinderen met afwijkende

AGS screening

♦ Neonaten met afwijkende 1ste hielprik ■ Neonaten met bewezen 21-hydroxylase deficiëntie

Laboratory of Endocrinology

Biosynthese 21-deoxycortisol

Laboratory of Endocrinology

Conclusie

De LC-MSMS methode kan worden gebruikt als 2nd tier test voor AGS

21-Desoxycortisol is een goede marker voor AGS. De 8 neonaten die

bewezen 21-hydroxylase deficiëntie hebben konden op basis van de 21-

desoxycortisol geïdentificeerd worden uit de groep met 94 dubieuze of

afwijkende eerste hielprik

Door de 2nd tier test voor dubieuze en afwijkende eerste hielprik screening

van AGS te gebruiken:

• Is er geen tweede hielprik nodig (voordeel voor de neonaat en sneller)

• Zijn er minder vals positieve uitslagen

• Is er minder ongerustheid ouders

Laboratory of Endocrinology

Acknowledgements

An RuiterErik Endert

Anita Boelen

Hedi Claahsen

Nationale screeningslabs:

Marja van Veen (AMC)

Marella Bouva (RIVM)

Johan Timmers (Elisabeth Ziekenhuis Tilburg)

Carolien van Rijswijk (IJsselland Ziekenhuis,

Capelle a/d IJssel)

Gerda Beltman (Isala Klinieken, Zwolle)