Z-lijn : Masterproef Experimenteel Onderzoek: “De rol van ...

Academiejaar 2008 – 2010

Academiejaar 2009 - 2010

Z-lijn : Masterproef Experimenteel Onderzoek:

“De rol van HIV Nef in virale fitness: analyse van onverwachte expressieprofielen na transductie in

T-cellijnen”

Nathalie VAN TITTELBOOM

Promotor: Prof. Dr. Bruno Verhasselt Co-promotor: Dr. Kevin Ariën

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot

MASTER IN DE GENEESKUNDE

“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze scriptie.”

Datum

(handtekening student (en)) (handtekening promotor)

(Naam student) (Naam promotor)

VOORWOORD

Allerliefste en vooral zeer hypothetische lezer (Wat zal er met deze bladzijden gebeuren? Zal ik ze op

een dag overleveren aan iemand anders dan mezelf? Ik zal ze zeker hard nodig hebben om me de

dingen te kunnen herinneren en er kracht uit te putten om de strijd verder te zetten.), kies zelf een

naam voor deze cargo, die nu ook een beetje de jouwe is. Maar ik zou heel gelukkig zijn als je hem

‘LEVEN’ zou noemen.

(…)

Wat staat er me inmiddels nog te doen? Leven, eenvoudigweg leven op deze immense ronde cargo,

blauw en stil, die me steeds meer zal verwonderen, alsof HIV, teder en wreed tegelijk, me deze

groeiende betovering wou schenken alvorens me de Dood aan te bieden.

Daarna, als er voor charmante deugenieten ook een Paradijs is, dan hoop ik er Saint-Genêt te kunnen

groeten en er iedereen die me op aarde heeft ontroerd terug te zien.

Pascal de Duve, Uitvaren.

Pascal de Duve (Edegem, 1964), Franstalig Antwerpenaar en polyglot, studeerde sinologie en

wijsbegeerte. In 1987 trok hij naar Parijs, waar hij filosofie doceerde. Op 16 april 1993 overleed hij in

zijn woning te Parijs, slachtoffer van het aidsvirus.

Graag wil ik hierbij iedereen bedanken die het schrijven van deze masterproef heeft mogelijk gemaakt:

Professor Bruno Verhasselt, Dr. Kevin Ariën, Pieter, Hanne, Evelien, Valerie, Ingrid, mijn ouders,

mijn kotgenoot en broer Frederik en Pieter.

INHOUDSOPGAVE

1. Abstract ........................................................................................................................................... 1

2. Inleiding........................................................................................................................................... 2

2.1 Status van de globale HIV epidemie ............................................................................................ 2

2.2 De ontdekking van het AIDS virus ............................................................................................... 3

2.3 HIV-1 genetische diversiteit .......................................................................................................... 4

2.4 Structuur en genoom van HIV-1 ................................................................................................... 4

2.5 Replicatiemechanisme ................................................................................................................... 7

2.6 Kenmerken van HIV transmissie ................................................................................................... 7

2.7 Pathogenese/Pathofysiologie ......................................................................................................... 8

2.8 Preventie en behandeling ............................................................................................................... 9

2.8.1 Preventie ................................................................................................................................. 9

2.8.2 Antiretrovirale medicatie ........................................................................................................ 9

2.9 De rol van HIV Nef in de pathogenese van HIV ......................................................................... 10

2.10 Retrovirale vectoren .................................................................................................................. 11

2.10.1 Methoden voor gen transfer ................................................................................................ 11

2.10.2 Vectoren ............................................................................................................................. 11

2.10.3 Virale vectoren ................................................................................................................... 12

2.10.4 Oncoretrovirale vectoren .................................................................................................... 13

2.10.5 Packaging cellen ................................................................................................................. 13

2.10.6 LZRS-NEF-IRES-EGFP .................................................................................................... 13

2.10.7 EGFP als reportergen ......................................................................................................... 14

2.11 Doelstellingen ............................................................................................................................ 14

3. Materialen en methoden ................................................................................................................ 16

3.1 Sequencing LZRS-Nef(O8)-IRES-EGFP vector ......................................................................... 16

3.1.1 Primerkeuze .......................................................................................................................... 16

3.1.2 Primaire PCR met primerpaar S1/AS4T7 en opzuivering PCR product .............................. 17

3.1.3 Sequenering .......................................................................................................................... 18

3.2 Het abnormale fenotype van de LZRS-PexNef-IRES-EGFP vector ........................................... 21

3.2.1 Virusproductie, transductie en cel sortering ......................................................................... 21

3.2.2 Western blot ......................................................................................................................... 25

3.2.3 mRNA extractie, DNase I behandeling en reverse transcriptie tot cDNA ........................... 28

3.2.4 DNA extractie ....................................................................................................................... 31

3.2.5 Real Time PCR (qPCR)........................................................................................................ 31

3.2.6 Polymerase Chain Reaction (pcr) ......................................................................................... 33

4. Resultaten ...................................................................................................................................... 35

4.1 Sequencing LZRS-Nef(O8)-IRES-EGFP vector ......................................................................... 35

4.2 Het abnormale fenotype van de LZRS-PEXNEF-IRES-EGFP vector ........................................ 40

4.2.1 Virusproductie, transductie, flowcytometrie en cel sortering ............................................... 40

4.2.2 Western blot ......................................................................................................................... 43

4.2.3 Real Time PCR ..................................................................................................................... 45

4.2.4 PCR ..................................................................................................................................... 48

5 Discussie ........................................................................................................................................ 50

5.1 Het abnormale fenotype van de LZRS-NEF(O8)-IRES-EGFP vector ........................................ 50

5.2 Het abnormale fenotype van de LZRS-PEXNEF-IRES-EGFP vector ........................................ 50

5.3 Mogelijke implicaties van de observatie van dit abnormale fenotype ........................................ 52

6 Referenties ..................................................................................................................................... 53

1

1. ABSTRACT

Bij experimenten rond virale fitness in het lab maakt men o.a. gebruik van de LZRS-NEF-IRES-EGFP

vector. Bepaalde virusproducties (o.a. met het O8 nef allel) werken echter niet zoals verwacht: men

ziet geen CD4 en MHC-I down regulatie na een geslaagde transductie. Ook bij Pex Nef constructen

(LZRS-PexNef-IRES-EGFP) werden er afwijkende resultaten gezien: na transductie van Jurkat cellen

of SupT1 cellen met Pex Nef retrovirus ziet men op flowcytometrie twee populaties cellen met een

verschillend fenotype. Enerzijds is er een celpopulatie met een duidelijke down-regulatie van

membraangebonden CD4 en anderzijds een celpopulatie waarbij dit effect afwezig blijkt.

Het eerste luik van mijn project bestond uit het uitvoeren van een aangepast sequencing protocol met

primers S1 en AS4T7, om de O8 Nef insert in de LZRS-Nef-IRES-EGFP vector te kunnen vergelijken

tussen functionele en niet-functionele clones. Deze sequenties bleken nagenoeg gelijk te zijn.

In het tweede luik hebben we geprobeerd om de oorzaak van het abnormale fenotype, opgemerkt na

transductie met Pex allelen te achterhalen op 3 niveaus: op eiwitniveau d.m.v. Western Blot, op DNA

niveau d.m.v. PCR en/of Real Time PCR (qPCR) en op mRNA niveau d.m.v. reverse transcriptie

gevolgd door PCR en/of qPCR. De qPCR toonde de aanwezigheid van Nef aan op DNA en mRNA

niveau. De resultaten van de PCR reacties waren inconclusief. De western blot toonde een afwijkend

eiwit voor de Pex WT Nef constructen en de afwezigheid van eiwit voor Pex F191R Nef constructen.

Het getrunceerde eiwit bij de Pex WT Nef constructen zou het gevolg kunnen zijn van een nonsense

mutatie of een frameshift mutatie met inbouw van een stop codon. Het afwezige eiwit bij de Pex

F191R Nef constructen zou dan op zijn beurt het gevolg kunnen zijn van de introductie van een

prematuur stopcodon waarbij het epitoop herkend door het antilichaam niet meer aanwezig was. De

afwezigheid van het eiwit kan anderzijds ook verklaard worden door nonsense mediated mRNA

decay.

2

2. INLEIDING

2.1 STATUS VAN DE GLOBALE HIV EPIDEMIE (1)

Wereldwijd blijft HIV vandaag een belangrijk gezondheidsprobleem, dat naar schatting reeds 25

miljoen doden veroorzaakt heeft. Globaal is de HIV epidemie gestabiliseerd, maar er zijn nog steeds

onaanvaardbaar veel nieuwe infecties en AIDS doden.

Wereldwijd waren er in 2007 naar schatting 33 miljoen mensen die leefden met HIV. Het aantal

nieuwe HIV infecties is gedaald van 3 miljoen in 2001 naar 2,7 miljoen in 2007. Globaal zijn er 2

miljoen mensen gestorven aan AIDS in 2007, in vergelijking met 1,7 miljoen in 2001. Op deze cijfers

is een foutmarge van 10 à 30 % mogelijk.

Figuur 1: HIV prevalentie in de wereld (1).

Subsaharisch Afrika blijft de regio die het zwaarst getroffen is door HIV/AIDS en is goed voor 67%

van alle mensen die leven met HIV en 75% van alle AIDS doden in 2007. Toch is er ook een

verontrustende toename aan nieuwe infecties in andere dichtbevolkte landen zoals Indonesië, Rusland

en enkele rijkere landen.

3

Figuur 2: Evolutie van de HIV prevalentie (1).

2.2 DE ONTDEKKING VAN HET AIDS VIRUS

Op 5 juni 1981 rapporteerde men in het Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR) vijf

gevallen van pneumocystis carinii pneumonie bij voordien gezonde jonge mannen in Los Angeles

(CDC. Pneumocystis pneumonia---Los Angeles. MMWR 1981;30:250—2). Deze casussen werden later

erkend als de eerste gerapporteerde gevallen van het Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)

in de VS. Op het einde van 1982 probeerden verschillende labo’s de oorzaak van het AIDS syndroom

te achterhalen. Een aantal kenmerken wezen in de richting van een retrovirale oorsprong: de clusters

van getroffen patiënten, de transmissie via gefilterde bloedproducten en het verlies aan CD4 T

lymfocyten. (2)

In 1983 werd een virus geïsoleerd uit de lymfekliercellen van een man met persisterende

gegeneraliseerde lymfadenopathie (PGL), waarvan men aanvankelijk dacht dat het een Humaan T

lymfotroop Virus (HTLV) was. (3,4) Bij verder onderzoek isoleerden Montagnier et al., Gallo et al. en

Levy et al. elk een virus, dat ze respectievelijk doopten tot het LAV (lymphadenopathy-associated

virus), het HTLV-III en het ARV (AIDS-associated retrovirus). (5-7)

Deze 3 virussen (LAV, HTLV III en ARV) werden dan snel erkend als leden van dezelfde groep van

retrovirussen, en door hun eigenschappen werd aangenomen dat het lentivirussen waren. In 1986

besliste het International Committee on Taxonomy of Viruses om het AIDS virus de naam HIV toe te

kennen. (2,8-11)

4

Het Human Immunodeficiency Virus (HIV) behoort tot het genus Lentivirus, uit de familie van de

Retroviridae. De Retroviridae worden zo genoemd omdat hun RNA genoom met het virale enzym

reverse transcriptase (RT) overgeschreven wordt tot DNA. Dit nieuwgevormde DNA wordt dan

geïncorporeerd in het gastheer DNA in de nucleus van de cel. Lentivirussen veroorzaken traag

progressieve aandoeningen (lentus = traag) en worden verder opgedeeld in verschillende species. HIV-

1, HIV-2 en SIV behoren tot de ‘primate lentivirus groep’. (5,12)

2.3 HIV-1 GENETISCHE DIVERSITEIT

Op basis van fylogenetische analyse van HIV sequenties neemt men aan dat de eerste zoönotische

transmissie van de Pan troglodytes troglodytes chimpansee (SIVcpz) naar de mens ongeveer 80 jaar

geleden in centraal Afrika heeft plaatsgevonden. Rond diezelfde tijd zijn er nog tenminste twee

zoönotische transmissies gebeurd in West-Afrika. En zo zijn er dan bij de mens 3 groepen ontstaan: de

M (main), O (outlier) en N (non-M, non-O) groep. De laatste twee groepen (O en N) zijn voornamelijk

beperkt gebleven tot centraal Afrika, terwijl de M groep verantwoordelijk is voor de globale HIV-1

pandemie. (13)

In de M groep worden 9 subtypes erkend en benoemd met de letters A–D, F–H, J en K. Recombinaties

tussen segmenten van 2 verschillende virale stammen in hetzelfde individu hebben geleid tot het

ontstaan van CRF’s (circulating recombinant forms). Momenteel zijn er ongeveer 43 CRF’s

geïdentificeerd. (14,15)

De continue uitbreiding van de genetische diversiteit van HIV-1 wordt veroorzaakt door de fouten die

het virale reverse transcriptase inbouwt, door de snelle turnover van HIV-1 bij geïnfecteerde

individuen, door recombinaties, door druk van het immuunsysteem van de gastheer en door antivirale

medicatie. (13)

HIV-2 werd naar de mens overgedragen via cross-species transmissie vanuit Sootey Mangabeys rond

1930-1955 in West-Afrika. (16)

2.4 STRUCTUUR EN GENOOM VAN HIV-1

Het HIV-1 virion bestaat uit een nucleocapside en een enveloppe. Het is sferisch en heeft een diameter

van 100 nm. De kern of het nucleocapside is icosahedraal en bestaat uit kernproteïnes gecomplexeerd

met twee virale RNA molecules. De enveloppe bestaat uit een bilayer (dubbele laag) lipiden,

afkomstig van de plasmamebraan van de gastheercel, en ongeveer 14 virale glycoproteïne spikes.

Tussen het nucleocapside en de enveloppe bevinden zich ook matrixproteïnes (p17gag

). (5,17)

5

Figuur 3: De structuur van HIV (19).

Zoals andere replicatie competente retrovirussen, bevat het HIV-1 provirus gag, pol en env genen,

geflankeerd door long terminal repeat sequenties (LTR) aan beide zijden van het genoom. HIV-1 bevat

echter nog 6 andere genen die coderen voor: Tat (Transcriptional transactivator of LTR), Rev

(Regulator of viral protein expression), Nef (Negative factor), Vpr (Viral protein R), Vif (Virion

infectivity factor), Vpu (Viral protein U). Het HIV genoom codeert dus voor 9 open reading frames.

Gag, pol en env worden de structurele genen genoemd, tat en rev de regulatoire genen en nef, vpr, vif

en vpu de accessoire genen. Bij conventie worden de virale proteïnes (p) aangeduid met een nummer

dat overeenkomt met de grootte van het proteïne (x 1000). (5,17)

Gag komt initieel tot expressie als een 55 kDa precursor proteïne. Tijdens de virus maturatie splitst het

virale protease deze precursor in verschillende kleine polypeptiden: matrix (MA) van 17 kDa (p17),

capside (CA) van 24 kDa (p24), p2, nucleocapside (NC) van 7kDa, p1 en p6. De eiwitten p24 en p7

vormen samen de belangrijkste componenten van het nucleocapside (p24 vormt de aflijning en p7

bindt aan RNA). (17)

Pol codeert voor 3 proteïnes die enzymatische activiteit hebben: het protease (PR, p10) dat betrokken

is in posttranslationele processing van virale proteïnes, het reverse transcriptase (RT, p66/51) dat

zowel een RNA-dependente DNA polymerase activiteit als een RNase H activiteit vertoont, en het

integrase (IN, p32) dat het virale cDNA integreert in het gastheer genoom. (5,17)

6

Het env gen codeert voor de glycoproteïnen van de enveloppe. Gp160 wordt gesplitst door een

cellulair enzym in twee mature subunits: gp120 (oppervlakte envelop glycoproteïne) en gp41

(transmembranair envelop glycoproteïne). Deze glycoproteïnen migreren dan naar de

plasmamembraan, waar gp120 instaat voor de binding met de CD4 en de chemokine receptor en gp41

voor de fusie. (5)

Tat (p14) is een transactiverend eiwit dat samen met bepaalde cellulaire proteïnes interageert met een

RNA loop structuur gevormd in het 3’ deel van de LTR (tat responsive element). Tat is zeer belangrijk

in het opreguleren van de HIV replicatie. Rev (p19) is een ander viraal regulatoir proteïne. Het

interageert met de Rev-responsive element (RRE), gelokaliseerd in het enveloppe mRNA. Hierdoor

kan ongesplitst mRNA vanuit de nucleus naar het cytoplasma gaan, om zo virale proteïnes te vormen

die nodig zijn voor de productie van nieuw virus. Vroeg tijdens de virale infectie domineren kleine,

multipel gesplitste mRNA’s die coderen voor Tat, Rev en Nef. Later zijn het vooral de genomische en

enkelvoudig gesplitste mRNA’s. Rev is een cruciale factor bij het controleren van deze transitie. (5,17)

Van het 27 kDa grote Nef proteïne werd aanvankelijk gedacht dat het een negatieve regulator was van

de HIV-1 transcriptie. Studies hebben niet kunnen aantonen dat Nef een repressor zou zijn van de

replicatie of de transcriptie van HIV. Het is inmiddels duidelijk dat Nef niet noodzakelijk is voor de

propagatie van HIV in T-cellijnen onder in vitro condities. Een inactivatie van het nef gen in een SIV

kloon veroorzaakte wel een afname van de virale titer en van de pathogeniciteit bij apen. Een deletie

van het nef gen werd ook gevonden bij Long-Term Non Progressors (LTNP). Deze resultaten, samen

met het feit dat het nef gen goed geconserveerd is in verschillende isolaten van HIV-1, HIV-2 en SIV,

suggereren dat Nef een belangrijke rol heeft voor het virus in vivo. Het heeft geen enzymatische

activiteit, maar fungeert als een adaptor proteïne dat gastheercel proteïnes aanzet tot aberrante functies

die de virale replicatie amplificeren. (17,18)

Het Vpr (p15) proteïne helpt bij virale replicatie en heeft een zwakke transactivatie functie bij

transcriptie. Vif (p23) verhoogt de virale infectiviteit en de cel naar cel transmissie en helpt bij de

provirale DNA synthese en/of bij de virion assemblage. Vpu (p16) is vereist voor efficiënte budding.

(5,19)

7

2.5 REPLICATIEMECHANISME

HIV bindt via gp120 aan de CD4 celoppervlakte

receptor en aan de chemokine co-receptoren

(attachement). Vervolgens treedt het virus binnen

in de cel en wordt het ontmanteld (uncoating). Het

virale RNA-dependente DNA polymerase (reverse

transcriptase) zorgt voor transcriptie van het virale

genoom naar een dubbelstrengig viraal cDNA

(provirus). Dit laatste wordt dan door het virale

integrase geïncorporeerd in het DNA van de

gastheercel. Via transcriptie door het RNA

polymerase van de gastheer worden genomische en

virale mRNA’s gevormd. Het virale mRNA wordt

dan vertaald naar virale proteïnes. In het

cytoplasma volgt dan een assemblage van het

nucleocapside, dat vervolgens door budding

vrijgelaten wordt. (19)

2.6 KENMERKEN VAN HIV TRANSMISSIE

Ondanks het feit dat HIV in talrijke lichaamsvloeistoffen en weefsels teruggevonden kan worden,

gebeuren de meeste transmissies via semen, cervicaal vocht en bloed. Speeksel is geen belangrijke

bron van infectie, omdat het weinig virus bevat en omdat er substanties in voorkomen die HIV

inhiberen. Tranen, urine, zweet en andere lichaamsvloeistoffen zijn geen bron van infectie. (5,20)

Globaal gezien zorgen heteroseksuele betrekkingen voor het grootste deel van de infecties. Personen

die homo- en biseksuele contacten hebben vormen een belangrijke risicopopulatie. Zwangere vrouwen

lopen het risico om HIV tijdens de zwangerschap, de geboorte of de borstvoeding over te dragen op

hun kind. Sinds augustus 1985 worden in Europa en Noord-Amerika alle donoren van bloed en

bloedproducten getest op HIV, waardoor de transmissie via deze weg sterk gereduceerd werd. Het

delen van naalden en spuiten voor intra-veneus (IV) drugsgebruik blijft een belangrijke oorzaak van

HIV infectie, zowel in de welvaartslanden als in delen van Zuidoost Azië, Latijns-Amerika en

Rusland. Gezondheidswerkers hebben 0.3% kans op seroconversie na een prikongeval met besmet

bloed. (20,21)

Figuur 4: Replicatiemechanisme

(19).

8

2.7 PATHOGENESE/PATHOFYSIOLOGIE

Macrofagen, dendritische cellen en CD4+ T-cellen brengen CD4 tot expressie en zijn het doelwit van

HIV, dat CD4 als receptor gebruikt. Het gp120 van HIV bindt aan het humane CD4 en het moet ook

binden met een coreceptor in de celmembraan van de gastheer (voornamelijk CCR5 en CXCR4).

Hierna medieert het gp41 de fusie van de virale enveloppe met de plasmamembraan van de gastheer,

waardoor het virale genoom en de geassocieerde proteïnes kunnen binnendringen in het cytoplasma

van de cel. (22)

Na de HIV infectie is er een acute

viremie en een daling van het aantal

CD4 T-cellen. Door activatie van

een HIV-specifieke immuunrespons,

waarbij anti-HIV antilichamen

gevormd worden en cytotoxische T-

cellen geactiveerd worden om de

geïnfecteerde cellen te doden,

vermindert de virale load en stijgt het

aantal circulerende CD4 T-cellen. Als

een geïnfecteerde persoon een

detecteerbare titer van anti-HIV antilichamen in het serum vertoont, spreekt men van seroconversie.

(22)

Na deze acute fase volgt een asymptomatische fase van ‘klinische latentie’. Tijdens deze fase, die

gemiddeld 2 tot 15 jaar kan duren, is er voortdurend infectie en replicatie van HIV in CD4 T-cellen,

waardoor er een graduele vermindering is van het aantal T-cellen. Uiteindelijk ontstaat hierdoor een

toegenomen immuundeficiëntie en de start van het AIDS stadium. Patiënten met AIDS worden vatbaar

voor een reeks opportunistische infecties en kankers, waaraan ze uiteindelijk zullen sterven. (22)

Een kleine minderheid van de geïnfecteerde personen vertonen wel seroconversie, maar geen of een

zeer trage ziekteprogressie: de ‘long-term nonprogressors’. Deze groep wordt bestudeerd om te

achterhalen hoe ze in staat zijn om de HIV infectie te controleren. Een andere minderheid blijft

seronegatief en ziektevrij ondanks blootstelling aan het virus. Sommigen onder hen hebben een goed

beschreven deficiëntie in de virale coreceptor CCR5 (CCR5-Δ32). (22)

Figuur 5: de immuunrespons op HIV (20).

9

2.8 PREVENTIE EN BEHANDELING

2.8.1 PREVENTIE

Een HIV vaccin of een topische profylaxe zullen in de nabije toekomst niet beschikbaar zijn. De enige

biomedische interventies die tot op heden effectief gebleken zijn in de preventie van HIV zijn: het

condoom voor de man, de circumcisie, en het profylactisch gebruik van antiretrovirale medicatie bij

accidentele blootstelling. Orale en vaginale antiretrovirale medicatie, zowel voor pre-exposure

profylaxis als voor het reduceren van de infectiviteit bij HIV positieve individuen, worden

geëvalueerd. Het effect van de behandeling van Seksueel Overdraagbare Aandoeningen (SOA’s) gaf

wisselende resultaten in verschillende trials. (23)

2.8.2 ANTIRETROVIRALE MEDICATIE

Volgens De Clercq (2009) zijn de belangrijkste doelstellingen van een antiretrovirale behandeling: een

vermindering van de HIV-gerelateerde morbiditeit en een verlenging van de levensduur, een

verbetering van de levenskwaliteit, herstel en behoud van de immunologische functie, een maximale

en duurzame onderdrukking van de virale load en ten slotte de preventie van verticale transmissie. Het

onderdrukken van de virale load is belangrijk om mutaties te vermijden die aanleiding kunnen geven

tot resistentie, voor behoud van het aantal CD4 T cellen en heeft ook een positieve weerslag op de

klinische toestand van de patiënt.

In België bestaan er momenteel 25 goedgekeurde producten in verschillende klassen. De reverse

transcriptase inhibitoren werken in op het virale reverse transcriptase enzym, dat het virale RNA

omzet tot proviraal cDNA. Protease inhibitoren werken in op de splitsing van het precursor proteïne

door het viraal protease, waardoor normaal mature capsideproteïnen en functionele proteïnen (zoals

reverse transcriptase en integrase) worden gevormd die instaan voor de volgende replicatiecyclus van

het virus.

Enfuvirtide (T20) is de enige fusie-inhibitor die momenteel beschikbaar is voor de behandeling van

HIV infecties.

Co-receptor inhibitoren (CRIs) interageren met de CCR5 of de CXCR4 co-receptoren, die een rol

spelen bij het virale entry proces. De CCR5 antagonist maraviroc is momenteel de enige klinisch

beschikbare CRI.

Het HIV integrase heeft twee belangrijke catalytische functies: 3’ processing en strand transfer.

Raltegravir is momenteel de enige klinisch beschikbare integrase inhibitor en is gericht op de strand

transfer functie.

10

Highly active antiretroviral therapy (HAART) is effectief in het verminderen van de virale load en het

uitstellen van de ziekteprogressie. Deze medicatie voorkomt de virusproductie door cellen die reeds

geïnfecteerd waren niet, maar verhindert bij nieuwe infecties de vorming van het provirus. (24)

2.9 DE ROL VAN HIV NEF IN DE PATHOGENESE VAN HIV

Zoals reeds eerder vermeld, kan de periode tussen de initiële HIV-1 infectie en de overgang naar het

AIDS stadium variëren van 1 jaar (fast progressors) tot meer dan 20 jaar (slow progressors of

LTNP’s). Dit variabel interval wordt soms bepaald door de genetica van de gastheer (b.v. een deletie

van 32 basenparen in het humane CCR5 gen: CCR5Δ32). (25)

‘Negative Factor’ of Nef is één van de best gekende virale factoren die geassocieerd wordt met de HIV

pathogenese. De interesse voor Nef is ontstaan door de vaststelling dat een aantal Long term non-

progressors (LTNP) geïnfecteerd waren met deleties in het gen dat codeert voor Nef. Verschillende

casussen zijn beschreven, met als belangrijkste de Sydney Blood Bank Cohort (SBBC). Het gebrek

aan ziekteprogressie bij patiënten met een deletie voor nef definieert Nef als een pathogenetische

factor. Men kan hierbij een onderscheid maken tussen ‘elite’ LTNP en slow progressors (SP). Men

kan dus stellen dat Nef in vivo een belangrijke rol speelt bij HIV-1 replicatie, maar niet absoluut

noodzakelijk is. Hoewel bij deze patiënten weinig of geen virus in het bloed aanwezig was,

vertoonden sommigen toch ziekteprogressie. (18)

Er zijn 4 functies van Nef die mogelijks een rol spelen in de pathogenese: (1) down regulatie van

oppervlakte CD4, (2) down regulatie van surface major histocompatibility complex I (MHC-I), (3)

mediëren van cellulaire signaling en activatie (gemedieerd via cellular Pak 2) en (4) bevorderen van de

infectiviteit van virale partikels via CD4 independente mechanismen. Deze functies hebben telkens

een andere genetische basis en vormen dus elk afzonderlijk een mogelijke target voor inhibitie van

Nef. CD4 down regulatie is de target met het meeste perspectief om HIV-1 aan te vallen via Nef. (18)

Verschillende pogingen om de HIV epidemie in te perken hebben gefaald. De beste resultaten zijn

bereikt met antiretrovirale therapie. De mogelijkheid van het virus om te adapteren en muteren vereist

behandeling met meerdere producten (Multiple Drug Treatment), en deze is beperkt door bijwerkingen

en kosten. Topische microbiciden kunnen preventief gebruikt worden, maar geven problemen met

kosten, toxiciteit en efficiëntie. De ontwikkeling van een effectief vaccin in de toekomst is weinig

reëel. Alle mogelijke nieuwe targets (zoals HIV Nef) voor preventie of behandeling van HIV moeten

daarom verder onderzocht worden. (18)

‘Virale fitness’ wordt gedefinieerd als de mogelijkheid om zich aan te passen aan of om zich voort te

planten in een specifieke omgeving. Bij HIV wordt de fitness zowel bepaald door gastheerfactoren als

door virale factoren.

11

Er is een duidelijke correlatie tussen de LTNP status en (1) een lage ‘replicative fitness’ en (2) een

defectief nef gen, maar studies die het directe bewijs leveren voor een rol van Nef bij virale fitness

ontbreken nog.

Een studie toonde reeds de relatieve volgorde aan van de fitness bij verschillende HIV types en

groepen: HIV-1 groep M > HIV-2 > HIV-1 groep O. Deze volgorde correleert ook nagenoeg perfect

met de rol van deze types en groepen in de epidemiologie.

Men zou vervolgens kunnen gaan kijken in welke mate nef allelen, afkomstig van verschillende HIV

virussen met gekende fitness, bijdragen tot verschillen in de replicatieve fitness. Met Nef+ en Nef-

virussen kan men dan een ‘dual infection/competition’ model in humane cellen uitvoeren. Vervolgens

kan men de fractie van de cellen, die door elk virus geïnfecteerd werd, door middel van

flowcytometrie bepalen (= replicatieve fitness). In een later stadium kan men ook de eigenschappen

van Nef, die verantwoordelijk zijn voor dit verschil in replicatieve fitness, gaan bepalen

(downregulatie van de CD4 expressie, associatie met PAK2).

2.10 RETROVIRALE VECTOREN

2.10.1 METHODEN VOOR GEN TRANSFER

Op dit ogenblik kan men 3 verschillende methoden voor gen transfer onderscheiden:

(1) fysische methoden: directe injectie, ‘gene gun’ methode, electroporatie,…

(2) chemische methoden: vormen van een complex tussen het plasmide en een kation, polymeer of

liposoom, waardoor de interactie met de celmembraan bevorderd wordt. Praktische voorbeelden zijn:

calciumfosfaat co-precipitatie, ‘polyplexen’ (polykationisch polymeer in complex met DNA),

‘lipoplexen’ (kationisch lipide zoals DOTAP in complex met DNA).

(3) biologisch: genetisch gemodificeerde virussen die een transgen/gene of interest bevatten en waaruit

essentiële virale genen verwijderd zijn. (26)

2.10.2 VECTOREN

Vectoren zijn de dragers waarmee men een vreemd DNA-fragment in een bacterie of eukaryote cel

kan inbouwen. Op grond van hun herkomst kunnen ze ingedeeld worden in 3 groepen: plasmiden,

virussen en samengestelde vectoren. Plasmiden zijn kleine extrachromosomale, circulaire, dsDNA

moleculen die zich onafhankelijk van het gastheer genoom repliceren. Volledig natuurlijke plasmiden

worden in de recombinant-DNA-technologie niet meer gebruikt. Men gebruikt steeds vectoren die in

meer of mindere mate zijn aangepast en daardoor voor een deel kunstmatig zijn. Ze kunnen ook

ingedeeld worden op grond van hun functie: kloneringsvectoren dienen om veel kopieën (een kloon)

12

van een bepaald insert te krijgen, terwijl bij de expressievectoren dit insert eenvoudig tot expressie kan

gebracht worden in b.v. eukaryote cellen, omdat ze een promotor en een ribosomale bindingsplaats

bezitten. (27)

2.10.3 VIRALE VECTOREN

Het werkingsmechanisme van virale vectoren berust op de eigenschap van virussen om genetisch

materiaal over te brengen naar de geïnfecteerde cel. Het proces van gentransfer en expressie door

virale vectoren noemt men transductie. Om de transductie te kunnen uitvoeren, moet eerst een

infectieus, maar replicatie-defectief virus geproduceerd worden. Hierbij wordt het originele virus

omgebouwd tot een recombinante vector.

Het retrovirale transfervector construct bevat een promotor-gedreven gene of interest, een packaging

signaal, de virale Long Terminal Repeats (LTRs) en hun verwante structuren, die essentieel zijn voor

reverse transcriptie, integratie en transcriptie. De ontbrekende genen, vereist voor replicatie en

structurele proteïnen, worden in trans voorzien door packaging constructs (figuur 6a). De

transfervector en de packaging constructs worden door transfectie in packaging cellen overgebracht.

De proteïnen voor replicatie en virionproductie, worden door het packaging construct tot expressie

gebracht. Vervolgens worden de gerepliceerde vectorgenomen verpakt, om zo recombinante virale

vectoren te vormen (figuur 6b). (28,29)

Figuur 6: Productie van recombinante virale vectoren (29).

13

2.10.4 ONCORETROVIRALE VECTOREN

Retrovirussen beschikken over een enzym, het reverse transcriptase, dat hun RNA genoom overschrijft

naar DNA, waarna het geïntegreerd wordt in het genoom van de gastheercel. De oncoretrovirinae zijn

een subfamilie van de retroviridae. De meeste oncoretrovirale vectoren zijn afgeleid van het Moloney

murine leukemia virus (MLV), dat codeert voor 3 genen (gag, pol en env) geflankeerd door LTR’s die

de expressie van het virale genoom reguleren en voorafgegaan door een ‘packaging signal’ (psi of ψ).

De vectoren bevatten echter enkel het transgen (gene of interest) en de cis-acting virale regio’s: LTR’s

vereist voor reverse transcriptie, integratie en transcriptie; en de ψ sequentie voor de packaging. De

virale genen env, gag en pol worden voorzien in trans door de packaging cellen. Na transfectie van de

packaging cellijn met het oncoretrovirale transfer plasmide worden infectieuze, maar replicatie-

defectieve virale partikels gevormd die het transgen bevatten. Als targetcellen getransduceerd worden

met deze virale partikels, wordt het virale genoom geïntegreerd in het gastheergenoom, waarbij het

transgen tot expressie komt. (12, 30)

2.10.5 PACKAGING CELLEN

‘Packaging cells’ worden zo genoemd omdat ze de retrovirale vector, die het transgen (‘gene of

interest’) draagt, verpakken in retrovirale partikels. Packaging cellen voorzien in alle virale proteïnen

(verkregen door stabiele of transiënte transfectie) om een hoge titer infectieus virus te produceren. Het

genetisch materiaal dat codeert voor deze functies wordt echter niet mee doorgegeven met de virale

partikels, om op die manier replicatie-defectieve vectoren te maken.

Een voorbeeld van een stabiel getransfecteerde packaging cellijn is de goed transfecteerbare 293T

humane embryonale niercellijn afgeleide Phoenix-Ampho. (31)

Bij de helper virus geïnfecteerde cellijnen, zoals voor het eerst ontwikkeld door Richard Mulligan en

David Baltimore in 1983 (Psi-2 gebaseerd op NIH3T3 cellen geïnfecteerd met een virus met een

deletie van het packaging signaal), kan er mogelijks door recombinatie een wild-type replicatie-

competent virus ontstaan. Hoe meer recombinaties er nodig zijn om een dergelijk replicatie-competent

virus te produceren, hoe lager de kans dat het zal gebeuren. Bij de ontwikkeling van de Phoenix-

Ampho packaging cellen, die we hier verder zullen gebruiken, werden de gag-pol en de env genen op

2 verschillende plasmiden gescheiden. (32,33)

2.10.6 LZRS-NEF-IRES-EGFP

Bij bepaalde experimenten (o.a. rond virale fitness) in het lab maakt men gebruik van de LZRS-NEF-

IRES-EGFP vector. Deze transfer vector is gebaseerd op het MLV genoom. Voor het vervaardigen

van deze vector zal men eerst Nef cloneren met behulp van allel specifieke primers. Er is nood aan een

cloneringsplasmide omdat sequencing van de insert in de LZRS vector niet vlot verloopt. Daarna

14

wordt Nef met de EcoRI en BamHI restrictie-enzymes uit het cloneringsplasmide geknipt en

overgebracht naar de LZRS vector, die ook met dezelfde enzymes geknipt is .

2.10.7 EGFP ALS REPORTERGEN

Expressie van 2 proteïnes vanuit 1 RNA, verzekert een gecoördineerde expressie van beide proteïnen.

Als 1 van de 2 proteïnen een ‘selectable marker’ is, zou selectie de expressie van het andere proteïne

moeten garanderen. Er bestaan verschillende mogelijkheden om retrovirale vectoren te ontwikkelen

die 2 of meer proteïnen tot expressie brengen (in ons geval Nef en EGFP).Wij maakten gebruik van

een Internal Ribosomal Entry Site (IRES), om zo translatie van verschillende coderende regio’s in het

mRNA mogelijk te maken. (12)

2.11 DOELSTELLINGEN

Er zijn bepaalde virusproducties (o.a. met het O8 nef allel) die niet werken zoals verwacht: men ziet

geen CD4 en MHC-I down regulatie na een geslaagde transductie (EGFP positief).

De sequentie van Nef in de pcDNA3 vector was correct en het Nef allel bleek ook functioneel. Een

restrictieanalyse van de LZRS vector met BamHI, EcoRI, Xba en SpeI gaf de te verwachten

fragmenten, dus Nef zit weldegelijk in het construct.

Een mogelijke verklaring kan zijn dat er een fout zit in de sequentie van Nef in de LZRS vector.

Daarom bestaat het eerste luik van mijn project uit het uitvoeren van een aangepast sequencing

protocol om de insert toch te kunnen sequeneren in de LZRS vector met primers S1 en AS4T7.

Pex is een consensus subtype B nef allel, dat veranderingen bevat die typisch zijn voor progressors

(K39R, N157T, S163C, and S169N) (34). Bij Pex Nef constructen (LZRS-PexNef-IRES-EGFP)

werden er ook afwijkende resultaten gezien: na transductie van Jurkat cellen of SupT1 cellen met Pex

Nef retrovirus ziet men op flowcytometrie twee populaties cellen met een verschillend fenotype.

Enerzijds is er een celpopulatie met een duidelijke down regulatie van membraangebonden CD4 en

anderzijds een celpopulatie waarbij dit effect afwezig blijkt.

De oorzaak van dit abnormale fenotype kan onderzocht worden op 3 niveaus:

1. Op eiwitniveau d.m.v. Western Blot. Deze techniek gebruikt specifieke antilichamen om

bepaalde proteïnen te identificeren.

2. Op DNA niveau d.m.v. PCR en/of Real Time PCR (qPCR)

3. Op mRNA niveau d.m.v. reverse transcriptie gevolgd door PCR en/of qPCR.

15

LZRS-NEF-IRES-EGFP

12339 bp

Nef

EGFP

IRES

Bam H I (1940)

Cla I (7242)

Eco R I (2567)

Hin d III (2844)

Apa LI (946)

Apa LI (3097)

Apa LI (5210)

Apa LI (11907)

Pst I (1074)

Pst I (1256)

Pst I (2577)

Pst I (6710)

Nco I (1944)

Nco I (3204)

Nco I (5979)

Nco I (7745)

Nco I (10554)

Nco I (11147)

Sma I (537)

Sma I (1135)

Sma I (1913)

Sma I (4470)

Sma I (5959)

Sma I (6579)

Sma I (7801)

Sma I (8923)

Sma I (8982)

Sma I (10715)

Sma I (11631)

Xma I (535)

Xma I (1133)

Xma I (1911)

Xma I (4468)

Xma I (5957)

Xma I (6577)

Xma I (7799)

Xma I (8921)

Xma I (8980)

Xma I (10713)

Xma I (11629)

Ava I (469)

Ava I (502)

Ava I (535)

Ava I (1133)

Ava I (1911)

Ava I (2046)

Ava I (2529)

Ava I (2581)

Ava I (4402)

Ava I (4435)

Ava I (4468)

Ava I (5926)

Ava I (5957)

Ava I (6577)

Ava I (7332)

Ava I (7799)

Ava I (8921)

Ava I (8980)

Ava I (10713)

Ava I (11629)

In het tweede luik van mijn project, hebben we geprobeerd om de oorzaak van het abnormale

fenotype, opgemerkt na transductie met Pex allelen te achterhalen op deze 3 niveaus.

Figuur 7: De LZRS-Nef-IRES-EGFP vector.

16

3. MATERIALEN EN METHODEN

3.1 SEQUENCING LZRS-NEF(O8)-IRES-EGFP VECTOR

De vectoren, getransformeerd in competente DH5α E. Coli cellen, werden bewaard in glycerolstocks

bij -80°C. Door de aanwezigheid van een ampicilline resistentiegen in de vector enerzijds, en door de

bacteriepopulatie uit te spreiden op een voedingsbodem die ampicilline bevat anderzijds (Lysogeny

broth agar platen met ampicilline), konden we de kolonies selecteren die de vector bevatten. Een

geschikte kolonie werd gepikt met een entoogje, geresuspendeerd in 12 ml LBampicilline medium en

overnacht opgegroeid op de schudtafel aan 225 rpm en bij 37 °C. Het LBampicilline medium werd

vervaardigd door 20 g DifcoTM

LB Broth Lennox poeder (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium)

op te lossen in 1l gezuiverd water en gedurende 15 minuten te autoclaveren bij 121 °C. De ampicilline

werd dan toegevoegd aan een concentratie van 100 µg/ml als het medium afgekoeld was tot 55 °C.

Het DNA voor de sequencing werd dan uiteindelijk bekomen door een purificatie met de QIAprep

Spin, Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Germany) (35). We maakten een pellet van de opgegroeide

kolonies, waarna deze geresuspendeerd werd met 250 µl P1 buffer (waaraan RNase A en LyseBlue

(1/1000) werden toegevoegd). Vervolgens werd 250 µl buffer P2 toegevoegd (NaOH/SDS), waarna

een blauwe verkleuring bekomen werd. SDS lost de fosfolipiden- en de eiwitcomponenten van de

celmembraan op, waardoor na de cel lysis de inhoud vrijkomt. Het alkalische milieu zorgt dan voor

een denaturatie van het chromosomale en het plasmide DNA en van de eiwitten. Het lysaat werd dan

geneutraliseerd door 350 µl buffer N3 toe te voegen. Er moet gemengd worden tot de blauwe

kleuromslag opnieuw verdwijnt. De hoge zoutconcentratie zorgt ervoor dat de gedenatureerde

proteïnes, chromosomaal DNA, de cellulaire debris en de SDS precipiteren, terwijl het kleinere

plasmide DNA in oplossing blijft. Na 10 minuten te centrifugeren aan 13.000 rpm werd het

supernatans op een QIAprep spin kolom gebracht en gecentrifugeerd gedurende 1 minuut. Hierna

werd een extra wasstap met 750 µl buffer PB uitgevoerd. De residuele wasbuffer werd verwijderd

door gedurende 1 minuut te centrifugeren. De kolom werd in een nieuw epje geplaatst en het DNA

werd geëlueerd door 50 µl nuclease-vrij water toe te voegen en na 1 minuut incubatie gedurende 1

minuut te centrifugeren.

3.1.1 PRIMERKEUZE

Ons doel was de sequentie van Nef te vergelijken tussen de functionele en de niet-functionele vector.

Een eerste stap was het zoeken naar correcte primers voor de sequencing van een fragment van de

vector dat nef bevatte. Een primer is een synthetisch oligonucleotide dat hybridiseert met de DNA

sequentie, die het gebied dat we willen sequeneren flankeert. Bij de keuze van een geschikte primer

17

moet men een aantal basiskenmerken in acht nemen: (1) de primerlengte is typisch 20 à 25 nucleotiden

(2) de smelttemperatuur (Tm) moet tussen 55 °C en 65 °C liggen, om de specificiteit van de

hybridisatiestap te verbeteren (3) de G+C inhoud moet ongeveer 50% zijn (4) het 3’ uiteinde van de

primers moet GC bevatten, om dit uiteinde te stabiliseren (5) primers mogen geen complementaire

sequenties met zichzelf of de andere primer bevatten (risico op vorming secundaire structuren of

primerdimeer vorming). Na de nef sequentie bevond zich een GC-rijk gebied. Daarom deden we

voorafgaandelijk aan de sequenering een polymerase chain reaction (PCR) met het primerpaar S1 en

AS4T7. T7 is een sequentie toegevoegd aan het complementaire deel van de primer. Deze sequentie

kan in de sequencing reactie door een specifieke T7 primer herkend worden. Inderdaad, door deze

nested PCR benadering kan in een eerste PCR het GC-rijke gebied overbrugd worden bij een hogere

smelttemperatuur dan deze van de sequencing reactie. De sequenering zelf werd uitgevoerd op het

primaire PCR product met de forward primers S1, 0F9015 en O9148 en de reverse primer T7 (bijlage

1).

3.1.2 PRIMAIRE PCR MET PRIMERPAAR S1/AS4T7 EN OPZUIVERING PCR PRODUCT

Voor het standaard protocol, dat gebruikt werd voor de primaire PCR reactie met primerpaar

S1/AS4T7 op de O8 vector, verwijzen we naar ‘3.2.6 de Polymerase Chain Reaction’.

Voor de gelelektroforese verwijzen we ook naar ‘3.2.6 de Polymerase Chain Reaction’.

De opzuivering van het PCR product gebeurde met het Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System

van Promega:

Het PCR product wordt ½ verdund met de membrane binding solution (MBS).

Na goed te mengen, wordt het product op een kolom gebracht en gedurende 1 minuut

geïncubeerd.

Er wordt gedurende 1 minuut gecentrifugeerd aan 14.000 rpm in een mini-centrifuge,

waarna de vloeistof weggegoten wordt.

Het membraan wordt vervolgens twee keer gewassen met membrane wash solution

(MWS, waaraan voordien 95% ethanol werd toegevoegd). Er wordt eerst 750 µl en

daarna 500 µl MWS aan het membraan toegevoegd, waarna respectievelijk 1 minuut

en 5 minuten aan 14.000 rpm gecentrifugeerd wordt.

Hierna wordt nog 1 minuut gecentrifugeerd aan 14.000 rpm om het residuele ethanol

te verwijderen.

De kolom wordt dan in een nieuw epje geplaatst en geëlueerd met 50 µl nuclease-vrij

water. Na 1 minuut incubatie wordt gedurende 1 minuut gecentrifugeerd aan 14.000

rpm.

18

3.1.3 SEQUENERING

De informatie omtrent sequenering werd, tenzij anders vermeld, bekomen uit de Chemistry Guide van

Applied Biosystems (36,37). Onze techniek berust op de Sanger methode (38). Deze methode berust

op in vitro polymerisatie in aanwezigheid van 2’, 3’-dideoxynucleotiden (ddNTPs), en wordt dan ook

soms dideoxy sequencing genoemd. Deze ddNTPs kunnen herkend en ingebouwd worden door het

DNA polymerase, maar eens ingebouwd beletten ze elke verdere polymerisatie door de afwezigheid

van de essentiële 3’-OH groep. Het extensieproduct groeit immers door de vorming van een

fosfodiësterbinding tussen de 3’-OH groep van het groeiende uiteinde van de keten, en de 5’

fosfaatgroep van het nieuw in te bouwen nucleotide. Om deze reden worden ddNTPs ook chain

terminators genoemd.

De reactiemix voor de

cycle sequencing reactie

bevat een gezuiverd

PCR product dat dient

als template DNA, een

vooraf gekozen primer

op een plaats met

gekende sequentie,

dNTPs, ddNTPs, een

DNA polymerase, een

buffer, water en MgCl2.

Het AmpliTaq DNA polymerase FS (Applied Biosystems) is een gemuteerde vorm van het Thermus

aquaticus (Taq) DNA polymerase gen van E. Coli. Het bevat een puntmutatie in zijn actief centrum

(fenylalanine is vervangen door tyrosine op positie 667: Taq F667Y), waardoor de incorporatie van

ddNTPs tijdens de cycle sequencing vlotter verloopt. Een tweede mutatie in het amino terminale

uiteinde elimineert de 5’ 3’ exonuclease activiteit, waardoor er mooiere data verkregen worden met

minder achtergrond. Het enzym bevat ook een thermostabiel anorganisch pyrofosfatase. Dit laatste

verhindert dat pyrofosfaat, een bijproduct van de extensiereactie, opstapelt en zo aanleiding geeft tot

pyrofosforylyse. Pyrofosforylyse is het omkeren van de polymerisatie reactie, waarbij een nucleoside

monofosfaat verwijderd wordt van het extensieproduct en pyrofosfaat toegevoegd wordt met vorming

van een nucleoside trifosfaat. Deze pyrofosforylyse zou dan aanleiding geven tot zwakke of afwezige

pieken in de sequentie.

Figuur 8: Cycle sequencing reactie (36).

19

Als standaardprotocol voor één reactie met een totaalvolume van 20 µl gebruikten wij:

10 µl NF H2O

3,5 µl 5x buffer volume = 17 µl volume = 20 µl

1 µl Ready Reaction (RR) mix

2.5 µl primer (2pmol/µl)

100 ng DNA aangevuld met NF H2O tot een volume van 3 µl

De eerste stap van de cycle sequencing reactie bestaat uit een initiële denaturatie gedurende 6 minuten

bij 95 °C, waarbij het dubbelstrengig DNA smelt en de 2 strengen uit elkaar gaan. De cycle

sequencing reactie bestaat dan uit 25 herhalingen van denaturatie (10 seconden bij 95 °C), hybridisatie

(5 seconden bij 50 °C) en elongatie (4 minuten bij 60 °C). Tijdens de hybridisatie bindt de primer aan

de complementaire sequentie van het template DNA. Door een verhoging van de temperatuur naar het

optimum voor het thermostabiele DNA Polymerase gebeurt een primerelongatie. Doordat het

reactiemengsel zowel dNTPs als ddNTPs bevat, ontstaan DNA fragmenten van verschillende lengte.

Er werd gebruik gemaakt van de ABI PRISM BigDye Terminator cycle sequencing kit (Applied

Biosystems). Deze Dye Terminator methode berust op het feit dat elk van de 4 mogelijke ddNTPs

gelabeld is met een verschillend fluorochroom. Bij excitatie door licht zullen deze fluorochromen een

verschillende golflengte uitzenden, waardoor het emissiespectrum voor A, C, T en G verschillend is.

Figuur 9: Dye terminator methode (36).

Na de cycle sequencing reactie bekomt men DNA fragmenten van verschillende lengte, die in principe

slechts één nucleotide van elkaar verschillen. Een opzuivering van de producten is dan noodzakelijk en

wij maakten gebruik van volgend protocol:

Er wordt een mix gemaakt van 2 µl natriumacetaat (NaOAc, 3 molair stockoplossing) en 50 µl

ethanol 95 % per staal.

De mix (52 µl) wordt uitverdeeld over de 1,5 ml epjes en 20 µl PCR product wordt

toegevoegd. Hierna wordt het geheel gevortexed en worden de stalen gedurende 10 minuten

op ijs geplaatst.

Er wordt 30 minuten gecentrifugeerd op maximum snelheid.

20

Het supernatans wordt voorzichtig met een tip verwijderd en 250 µl ethanol 70 % wordt aan

de pellet toegevoegd.

Er wordt 10 minuten gecentrifugeerd aan maximum snelheid.

Het supernatans wordt verwijderd en de stalen worden 2 minuten gedroogd in de hitteblok bij

95 °C (dekseltjes open laten).

De stalen worden dan geresuspendeerd in 20 µl formamide en gedurende 2 minuten verhit bij

95 °C. Hierna worden de stalen onmiddellijk terug op ijs geplaatst.

De stalen (20 µl) worden vervolgens overgebracht in een speciale plaat voor capillaire

elektroforese.

De verdere analyse gebeurde door het Aids Referentie Labo (ARL) met de ABI Prism 310 Genetic

Analyser (Applied Biosystems). Door capillaire elektroforese worden de fragmenten gescheiden op

basis van hun lengte. Kleine fragmenten ondervinden minder weerstand, migreren sneller en zullen als

eerste voorbij de argonlaser passeren. De detectie van de fluorescente straling, uitgezonden door de

fluorochromen van de opeenvolgende fragmenten, laat dan toe de nucleotidesequentie van het DNA

fragment te bepalen. Detectie gebeurt met een CCD-camera (charge-coupled device) en wordt als een

digitaal signaal opgeslaan op de computer. De sequentie analyse software interpreteert dan de

resultaten en geeft de basen weer die overeenkomen met de hoogste fluorescentie intensiteit op elk

datapunt. De geanalyseerde gegevens van een staal worden dan weergegeven als een elektroferogram.

Wij maakten hierbij gebruik van BioEdit, een sequentie alignment editor voor Windows.

21

3.2 HET ABNORMALE FENOTYPE VAN DE LZRS-PEXNEF-IRES-EGFP

VECTOR

3.2.1 VIRUSPRODUCTIE, TRANSDUCTIE EN CEL SORTERING

De virusproductie, niet door mezelf uitgevoerd, gebeurde door een transfectie van Phoenix-Ampho

cellen met de LZRS vector die Pex Nef bevat (LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP). Deze transfectie wordt

het meest efficiënt uitgevoerd met behulp van de calciumfosfaat co-precipitatie methode. Hierbij

wordt een CaCl2 oplossing druppelsgewijs aan de fosfaatbuffer (Hepes Buffered Saline(HBS)) met

DNA toegevoegd, terwijl er lucht wordt geblazen in deze laatste. Het DNA-calciumfosfaat precipitaat

zou de Phoenix cellen dan binnenkomen via endocytose. Chloroquine wordt daarom aan de cellen

toegevoegd om verzuring van de lysosomen en bijgevolg afbraak van het DNA tegen te gaan. Calcium

zou een efficiente facilitator van DNA opname zijn omwille van een aantal redenen: het zou de

concentratie van DNA aan het celoppervlak verhogen door precipitatie, het zou het DNA beschermen

tegen digestie door serum en intracellulaire nucleases, en calciumfosfaat zelf zou fagocytosis

induceren. Het calciumfosfaat precipitaat zou ook de negatieve lading van de DNA molecules

neutraliseren en zo repulsie door de negatief geladen celmembraan vermijden. (39-41)

Doordat EGFP gebruikt werd als reportergen, konden we met behulp van een FACS read out een idee

krijgen van de transfectie-efficiëntie. Dag twee en drie na transfectie werd het supernatans geoogst en

ingevroren.

Het retrovirale supernatans werd vervolgens gebruikt voor de transductie van Jurkat cellen en SupT1

cellen met behulp van DOTAP. Bij deze methode wordt een lipoplex gevormd tussen het kationische

lipide N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate (DOTAP) en het

virus.

De cellen werden geteld met behulp van trypaanblauw en een Bürker telkamer:

10 µl van de cellen wordt verdund in 10 µl trypaanblauw (1/2 verdunning).

10 µl van het mengsel wordt dan aangebracht in de telkamer onder een draagglaasje.

Onder de microscoop tellen we dan 16 kleine vierkantjes (Fig. 10, tussen de

driedubbele lijnen). Hierbij mogen de cellen, gelegen op 2 van de 4 zijden met

driedubbele lijn, meegeteld worden.

22

De oppervlakte van een klein vierkantje is 0,04 mm2 (0,2 mm x 0,2 mm) en de diepte

is 0,1 mm. Vijfentwintig kleine vierkantjes hebben dus een volume van 0,1 mm3 of

0,1 µl (25 x 0,04 mm

2 x 0,1 mm). Het aantal cellen per milliliter kunnen we dan als

volgt berekenen:

((Aantal cellen / 16) x 25)

x 2 (verdunningsfactor)

x 10.000 (omrekeningsfactor naar

1000 µl)

Figuur 10: Bürker telkamer.

De cellen werden dan naar een concentratie van 500.000 cellen/ml in IMDM (Iscove’s Modified

Dulbecco’s Medium, Invitrogen) complete gebracht (voor 500 ml: 50 ml Fetal Calf Serum (10%)

(Hyclone Perbio, heat inactivated) en 5 ml L-glutamine (Invitrogen) toevoegen). Honderd µl

retroviraal supernatans en 4 µl DOTAP (Roche, Vilvoorde, Belgium) werden in de welletjes gebracht

(weefselcultuurplaat, 96 welletjes, flat bottom) en tien minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. De

lege welletjes werden gevuld met 200 µl PBS (steriel Phosphate Buffered Saline) om evaporatie te

verminderen. Honderd µl cellen werd aan het welletje toegevoegd (50.000 cellen/welletje). Het geheel

werd gecentrifugeerd gedurende 90 minuten aan 2.500 rpm bij 32 °C en geïncubeerd bij 37 °C en 7%

CO2. (42,43)

Flowcytometrie is een techniek voor het tellen, karakteriseren en sorteren van partikels of cellen. Dit

is mogelijk dankzij het principe van de hydrodynamische focusering, waarbij een trager bewegend

staal in een sneller bewegende dragervloeistof wordt geïnjecteerd, waardoor er onder optimale

omstandigheden een laminaire flow ontstaat. Hierdoor passeren de cellen één voor één door de

lichtbundelfocus.

23

Figuur 11: Schematische weergave facscalibur flowcytometer.

Het optische systeem bestaat uit een excitatie en een detectie systeem. Tot het excitatiesysteem

behoren een blauwe argonion laser (488 nm), een rode diode laser ( ~635 nm), lenzen en filters. Als de

cellen door de laserbundel passeren, verstrooit iedere cel het licht in diverse richtingen en met een

verschillende intensiteit. Lenzen, geplaatst op specifieke posities, verzamelen het verstrooide licht en

leiden het naar detectoren. Deze detectoren zetten het lichtsignaal om in een overeenkomstig

elektronisch signaal, dat wordt verzonden naar de computer. De detectie bij 160° - 170° (10 à 20°

t.o.v. de laserbundel) wordt de forward scatter (FSC) genoemd en correleert met de grootte van de

cellen en de brekingsindex van de inhoud van de cel ten opzichte van de suspensievloeistof. Een dode

cel met een permeabele membraan heeft een kleinere brekingsindex dan een even grote levende cel.

De FSC van een dode cel is dus kleiner dan de FSC van een levende cel. Op deze manier kan de FSC-

waarde gebruikt worden als een parameter om onderscheid te maken tussen dode en levende cellen.

De detectie bij 90° wordt de side scatter (SSC) genoemd en is een maat voor de interne structuur of

granulariteit van de cellen.

Er zijn ook speciale detectoren die fluorescentielicht kunnen opvangen. Fluorochromen bezitten de

eigenschap om licht van een bepaalde golflengte te absorberen en licht met een grotere golflengte uit

te stralen. Het meest gebruikte fluorochroom is het fluorescein isothyocyanate (FITC) en wordt

gedetecteerd in het groene kanaal of FL1. Phycoerythrine (PE) straalt geel-oranje licht uit en wordt

gedetecteerd door FL2. Wanneer deze gebonden zijn aan monoclonale antilichamen gericht tegen

24

specifieke oppervlaktemerkers, kunnen ze gebruikt worden om een bepaald celtype te identificeren.

Het fluorescentielicht gaat eerst door dichroïsche spiegels die stralenbundel splitst en vervolgens door

optische filters die de specificiteit van de detectie verhogen. Voor drie van de vier

fluorescentiedetectoren bevindt zich een bandpass filter, die een specifieke bandbreedte doorlaat. FL1

ontvangt groen licht (515 nm – 545 nm), FL2 ontvangt geel-oranje licht (564 nm – 606 nm) en FL4

ontvangt oranje-rood licht (653 nm – 669 nm). Voor FL3 staat een long pass filter, die rood licht met

een golflengte groter dan 670 nm doorlaat. Ten slotte valt het licht in op een photomultiplier tube

(PMT), die het signaal versterkt en omzet in een elektrische puls, waarvan de voltage evenredig is aan

het aantal fotonen. Een analoog-digitaal-converter (ADC) zet dan het elektrische signaal om in een

digitaal signaal.

De weergave van de geregistreerde kenmerken van de cel kan op verschillende manieren gebeuren.

Eén enkele parameter kan worden uitgezet als een histogram en twee parameters kunnen worden

weergegeven als een dotplot. (44-48)

De kleuring met CD4 PE, de flowcytometrie en de cel sortering werden niet door mezelf uitgevoerd,

maar ik heb deze wel meegevolgd.

We maakten gebruik van de FACScalibur (BD Biosciences) om aan de hand van de EGFP expressie

na te gaan of de transductie geslaagd was. Na kleuring met CD4 PE kon ook het abnormale fenotype

van de Pex allelen aangetoond worden. Als basisregel voor de kleuring geldt: 2 µl CD4 PE/100.000

cellen in 50 µl buffer. Hierbij werden de cellen gevortexed en gedurende 30 minuten in de ijskast

(donker en bij 4°C) geïncubeerd.

Om de oorzaak voor dit verschillende fenotype te achterhalen voerden we eerst een celsort uit met

behulp van het FACS Vantage TM Cell Sorter (BD Biosciences). Dit toestel kan ongeveer 2000 cellen

per seconde sorteren. Het is een stream-in-air flow cytometer. Door vibratie wordt de vloeistofstroom

opgesplitst in afzonderlijke druppels. Een vaste drop delay kan worden ingesteld, waardoor het

sorteren van cellen mogelijk wordt.

De cellen werden hier opnieuw gekleurd met CD4 PE. Er werd een elektrische lading toegekend aan

de druppels met een cel die voldeed aan de sortcriteria en die o.a. groen gekleurd (EGFP positief), en

dus getransduceerd, waren. Naargelang de cellen dan een CD4 + (geen downregulatie) of een CD4 –

(downregulatie) patroon vertoonden, werden ze aangetrokken door respectievelijk de negatieve of de

positieve elektrische plaat.

25

3.2.2 WESTERN BLOT

De praktische informatie omtrent western blotting werd bekomen uit de protocols van Abcam (49) en

invitrogen (50) en uit het artikel van Gallagher et al. (2008) (51).

Lysaat van suspensiecellen

De gesorteerde en Nef-getransduceerde SupT1 cellen werden gelyseerd volgens het protocol voor

suspensiecellen: de cellen werden geoogst (Pex WT CD4-: 2.500.000 cellen, Pex WT CD4+:

1.500.000 cellen, Pex WT ongesorteerd: 12.600.000 cellen, Pex F191R CD4-: 1.400.000 cellen, Pex

F191R CD4+: 1.200.000 cellen, Pex F191R ongesorteerd: 11.200.000 cellen) en overgebracht in een

1,5 ml epje. Via een wasstap met Phosphate Buffered Saline (PBS 1X, 17-516F, Cambrex), werden de

eiwitten van het serum weggewassen.

Vervolgens werd een lysis buffer gemaakt met 50mM Tris-HCL, 1mM EDTA en 150 mM NaCl (pH

7.4). 800 µl lysis buffer, 100 µl Triton 100X (10%) (Sigma, Bornem, Belgium) en 100 µl protease

inhibitor 10X (Roche) werden aan elkaar toegevoegd. Hiervan werd telkens 100 µl op de celpellet

gepipetteerd, en gedurende 20 minuten op ijs geplaatst. Na 5 minuten centrifugeren aan 13.000 rotaties

per minuut (rpm), werd het supernatans bijgehouden (100 µl) en ingevroren bij -20 °C.

Concentratie meten en laadvolume bepalen

Elk laantje van de gel moet een gelijke hoeveelheid proteïnen bevatten, daarom werd de

proteïneconcentratie van het lysaat bepaald. We maakten hierbij gebruik van de Bio-Rad Detergent

Compatible (DC) assay en een spectrofotometer (Beckman DU 640B). Bij deze proteïne assay werd

250 µl reagens A (per ml reagens A (een alkalische kopertartraat oplossing) 20 µl reagens S

toevoegen) en 2 ml reagens B (een gedilueerd foline reagens) toegevoegd aan elk staal, gevortexed en

gedurende 15 minuten geïncubeerd. Hierdoor ontstond een blauwe kleuromslag met een maximum

absorbantie bij 750 nm. Er werd een serie verdunningen gemaakt van BSA om tot een standaardcurve

te komen, waarbij de absorbanties van BSA gemeten bij 750 nm uitgezet werden in functie van de

concentratie. Door middel van interpolatie met behulp van een vergelijking kon dan de

proteïneconcentratie (mg/ml) van onze stalen bepaald worden. We wilden dan komen tot een

laadvolume van 20 µl, dat 20 µg proteïnen bevat, 2 µl reducing agent (Nupage) om te denatureren en 7

µl loading dye (mengsel 1:1 broomphenolblauw/ ß-mercapto-ethanol). De stalen werden dan

gedurende 5 minuten verhit bij 95 °C.

26

Eiwitelektroforese

We gebruikten hierbij een 4-12% Bis-Tris gel (NuPAGE,

Invitrogen, Merelbeke, Belgium) die in de Xcell Sure

Lock Mini-cell geplaatst werd. Door het geheel vast te

klikken ontstonden 2 compartimenten, die beide opgevuld

werden met een 1X MES SDS running buffer (NuPAGE,

Invitrogen). Aangezien we met gedenatureerde producten

werkten, werden anti-oxidantia (NuPAGE, Invitrogen)

toegevoegd aan de buffer (500 µl anti-oxidantia per 200

ml buffer) om reoxidatie van de proteïnen te verhinderen.

De gel werd geladen met 20 µl staal en 10 µl merker en

de elektroforese werd uitgevoerd aan 200 volt en 125 mA

gedurende 50-60 minuten.

Western Blottting

De transferbuffer voor gedenatureerde stalen werd aangemaakt met 849 ml bidi, 50 ml NuPAGE

transferbuffer 20x (Invitrogen), 1 ml NuPAGE anti-oxidantia (Invitrogen) en 100 ml methanol.

Om antilichaam detectie mogelijk te maken, werden de

proteïnes onder invloed van een elektrisch veld overgebracht

van de gel naar een Polyvinylidene Difluoride membraan

(PVDF, 0,2 µm pore size, Invitrogen). Elektroblotting met

behulp van een PVDF membraan heeft meer voordelen ten

opzichte van het gebruik van nitrocellulose membranen. De

PVDF membraan is hydrofoob en moet wel voorbehandeld

worden door het achtereenvolgens te wassen in methanol

gedurende 30 minuten, 2 keer in bidi en 5 minuten in transferbuffer. De gel en het membraan werden

vervolgens beiderzijds tussen Whatmanpapiertjes en sponsjes geplaatst, bevochtigd met transferbuffer.

Het is hierbij belangrijk dat er geen luchtbelletjes gevormd worden tussen de gel en het membraan. Dit

geheel werd vervolgens in de Xcell Blot Module geplaatst, waarbij het membraan het dichtst tegen de

anode (+) gelegen is en de gel het dichtst tegen de cathode (-). De blotmodule werd vervolgens in het

elektroforese toestel geplaatst en vastgeklikt, zodat opnieuw 2 compartimenten onstonden. De

binnenste kamer werd gevuld met transferbuffer en het buitenste compartiment met bidi voor

afkoeling. De elektroforese gebeurde nu dwars in plaats van verticaal en gedurende één uur aan 25 volt

en 150 mA.

Figuur 13: Blotmodule – invitrogen

(50).

Figuur 12: Xcell Sure Lock Mini-cell –

invitrogen (50).

27

Kleuring voor actine

Vooreerst werd een ponceau kleuring (ponceau S solution, Sigma) uitgevoerd. Het membraan werd

hiervoor gedurende 5 minuten geïncubeerd in een badje met ponceau. De bandjes werden zichtbaar

door te wassen met bidi. Deze kleuring is snel en reversibel en daardoor geschikt om op een niet

specifieke wijze de aanwezigheid van eiwitbandjes op het membraan aan te tonen.

Vervolgens voerden we een blocking uit van het membraan, om aspecifieke binding van primaire en

secundaire antilichamen te verhinderen. Het membraan werd gedurende 1 uur geblokkeerd op de

schudtafel in een eiwitrijke TBS-melkoplossing (blocking). Deze oplossing bestond uit 100 ml Tris

buffered Saline (TBS), 5 g melkpoeder (Nestlé, Brussels, Belgium) en 75 µl Tween 20 stockoplossing

(Sigma). TBS bestaat uit 6,05 g trisbase (121,1 g/mol; 50 mM) en 8,76 g NaCl (58,44 g/mol; 150

mM), opgelost in 800 ml MilliQ water, waarna de pH werd aangepast tot 7,5 met HCl, om vervolgens

dit geheel aan te lengen tot 1 l met behulp van MilliQ water. Het membraan werd vervolgens bij 4 °C

overnacht geïncubeerd in een 1/1000 verdunning van het primaire anti-actine-antilichaam (MP

Biomedicals, Illkirch, France). De oplossing bestond uit 12 µl antilichaam, 6 ml TBS en 6 ml

blocking. De daaropvolgende dag werd het membraan gewassen gedurende 1 minuut met TBS-T (100

ml TBS en 100 µl Tween 20 stock), 2 maal gedurende 5 minuten met TBS-T en 2 maal gedurende 5

minuten met buffer (50 % TBS en 50 % blocking).

Het membraan werd dan geïncubeerd in een 1/3000 verdunning van het secundaire anti-muis-

Horseradish Peroxidase (HRP)(Amersham Biosciences, Diegem, Belgium). Het membraan werd na 30

tot 60 minuten incubatie opnieuw gewassen volgens protocol en daarna gebeurde de visualisatie met

behulp van het Enhanced Chemiluminiscence (ECL) systeem (Amersham Biosciences). Hierbij

catalyseert het HRP van het secundaire antilichaam de oxidatie van luminol, waarna de lichtemissie

versterkt wordt door een enhancer. Detectie gebeurde met behulp van een hyperfilm (Amersham

Biosciences), waarna de foto’s ontwikkeld werden na een blootstelling van respectievelijk 20

seconden, 1 minuut, 5 minuten en 2 uur.

Figuur 14: Amersham ECL western blotting

system.

28

Kleuring voor Nef

Het membraan werd gestript door het 5 minuten in een badje met ponceaurood te brengen en 2 maal te

wassen met bidi. Er werd opnieuw blocking buffer aangebracht gedurende 1 uur, waarbij deze om de

20 minuten ververst werd, om hierna nog eens gedurende 1 uur blocking buffer toe te voegen. Hierna

werd EH-1 antilichaam (anti-Nef) in een 1/1000 verdunning aangebracht en overnacht bij 4 °C

geïncubeerd. Het membraan werd de volgende dag gewassen volgens het protocol, waarna het

secundaire Streptavidine-HRP antilichaam in een 1/1000 verdunning werd toegevoegd en gedurende 1

uur geïncubeerd op de schudtafel. Visualisatie gebeurde opnieuw met behulp van het Enhanced

Chemiluminiscence (ECL) systeem en de foto’s werden ontwikkeld na een blootstelling van 15

minuten, 4,5 uur en overnacht.

3.2.3 MRNA EXTRACTIE, DNASE I BEHANDELING EN REVERSE TRANSCRIPTIE TOT CDNA

De cellen werden in een Bürker telkamer geteld met behulp van trypaanblauw (zie protocol sectie

2.2.1). Van de cellen getransduceerd met Pex WT en Pex FR werd telkens de CD4+ fractie, de CD4-

fractie en de niet gesorteerde fractie ingevroren aan een concentratie van 1x106 per ml. De cellen

werden overgebracht naar cryovials, in een oplossing van Fetal Calf Serum (heat inactivated FCS,

Hyclone, Perbio, Erembodegem, Belgium) die 10 % Dimethylsulfoxide (DMSO,Serva, Heidelberg,

Germany) bevat. De cryovials werden overnacht in een container met isopropanol (Sigma) aan -80 °C

bewaard. Isopropanol zorgt voor een graduele afkoeling van -1 °C per minuut. De volgende dag

werden de cellen overgebracht naar vloeibare stikstof.

Het ontdooien van cellen kan via een snelle en een trage methode gebeuren. Wij maakten gebruik van

de trage methode, waarbij 1 ml cellen druppelsgewijs werd toegevoegd aan 1 ml IMDM. Vervolgens

werd het buisje gedurende 1 minuut op ijs geplaatst, waarna 2 ml IMDM werd toegevoegd. Deze

laatste stap werd dan nogmaals herhaald, maar deze keer met 4 ml IMDM. Het geheel werd in de

centrifuge geplaatst gedurende 5 minuten aan 1500 rpm bij 4°C, waarna het supernatans verwijderd

werd. De cel pellet werd geresuspendeerd met 10 ml IMDM en in cultuur gebracht bij 37 °C en 7 %

CO2.

Omdat we de PCR en de qPCR zowel op DNA als op cDNA wilden uitvoeren, gingen we eerst over

tot een mRNA extractie met behulp van de miRNeasy Mini Kit (Qiagen) (52).

29

De cellen werden gecollecteerd in een 15 ml buis en geteld in

een ½ verdunning van de celsuspensie in trypaanblauw met

een Bürker-telkamer. De kleuring met trypaanblauw dient om

de dode cellen te kunnen onderscheiden van de levende.

Levende cellen zijn namelijk in staat om deze kleurstof via

exocytose terug naar buiten te brengen. Voor de RNA

extractie mag men niet meer dan 107 cellen hebben.

Door te centrifugeren gedurende 5 minuten aan 1.800 rpm

werd een cel pellet gevormd. Hierna werd het supernatant

verwijderd. Het onvolledig verwijderen van het celcultuur

medium zou de lysis inhiberen en het lysaat dilueren,

waardoor de opbrengst aan RNA minder groot zou zijn. De

pellet werd geresuspendeerd in 1 ml PBS, waarna opnieuw

een cel pellet werd gemaakt. Het supernatant werd

verwijderd, het geheel werd gevortexed. Ten slotte werd 700

µl QIAzol lysis reagent (Qiagen) toegevoegd. Qiazol is een

monofasische oplossing van fenol en guanidine-thiocyanaat,

die de lysis faciliteert, RNases inhibeert en het grootste deel

van het cellulaire DNA en de proteïnes uit het lysaat

afzondert door organische extractie. De cellen werden

gehomogeniseerd door gedurende 1 minuut te vortexen. Het

homogenaat werd gedurende 5 minuten geïncubeerd bij

kamertemperatuur

Na het toevoegen van 140 µl chloroform, werd het geheel

gemengd door gedurende 20 seconden te vortexen. Door

gedurende 15 minuten bij 4 °C en aan 13.000 rpm te

centrifugeren verschenen 3 fases: een bovenste kleurloze fase

met RNA, een witte interfase met DNA en een onderste rode

organische fase met Qiazol, chloroform en proteïnes. De

waterige fase (450 µl) werd geëxtraheerd. 150% van het

totaal volume aan 100 % ethanol werd toegevoegd en

gevortexed Het staal werd overgebracht in een RNeasy Mini

spin column en gedurende 15 seconden afgedraaid aan 15.000

rpm. Hierna volgden dan een aantal wasstappen:

Figuur 15: mRNA extractie met

miRNeasy Mini Kit (Qiagen) (52).

30

700µl RWT buffer toevoegen en centrifugeren gedurende 15 seconden aan 13.000 rpm. De

flow-through weggieten en epje afdrogen om opnieuw te gebruiken.

500 µl RPE buffer toevoegen en centrifugeren gedurende 15 seconden aan 13.000 rpm. De

flow-through weggieten en epje afdrogen om opnieuw te gebruiken.

500 µl RPE buffer toevoegen en centrifugeren gedurende 2 minuten aan 13.000 rpm.

Kolom in een nieuw 2ml epje brengen en centrifugeren gedurende 1min aan 13.000 rpm.

Het RNA bleef hierbij gebonden aan het membraan, terwijl fenol en andere onzuiverheden

weggewassen werden. De kolom werd overgebracht in een nieuw epje en het RNA werd dan ten slotte

geëlueerd door 30 µl RNase-vrij water toe te voegen en gedurende één minuut aan 13.000 rpm te

centrifugeren. De RNA concentratie werd bepaald door middel van de nanodrop (sample type RNA-

40) en het RNA werd bewaard bij -80 °C.

De DNase I behandeling verwijdert het DNA om amplificatie van genomisch DNA bij de q-PCR

reactie te vermijden. We gebruikten het protocol van Invitrogen (Merelbeke, Belgium):

In een 0,5 ml epje samenvoegen en gedurende 15 minuten incuberen bij kamer temperatuur:

- 1 µg RNA ≤ 8 µl

- 10X DNase I Reaction Buffer 1 µl

- 1µl DNase I 1 µl

- DEPC behandeld water tot 10 µl

Om het DNase I te inactiveren werd 1 µl van 25 mM EDTA oplossing aan het reactiemengsel

toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 65 °C verhit.

Het cDNA werd verkregen door reverse transcriptie van het verkregen RNA m.b.v. het SuperScript III

Reverse Transcriptase (Invitrogen). Dit reverse transcriptase is een gemodificeerde vorm van het

Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (M-MLV), met een gereduceerde RNase H

activiteit en een grotere thermische stabiliteit. Dit enzym zorgt voor de productie van een ‘first strand’

cDNA via niet-specifieke primers (random hexamers).

We maakten eerst een RNA/primer mix:

per reactie (µl)

1 µg RNA x

NF – H2O 11-x

Random Hexamers (1/12: 250 ng/µl) 1

10 mM dNTP mix 1

o Stalen vortexen en centrifugeren (short).

o Gedurende 5 minuten bij 65°C in de hitteblok plaatsen.

o Gedurende 3 minuten in de koelblok (vriezer -20°C) plaatsen.

o Centrifugeren (short).

31

Vervolgens maakten we een RT reaction mix:

Per reactie (µl)

5x First Strand Buffer 4

Rnase OUT inhibitor 1

0.1 M DTT 1

Superscript III RT (200 U/µl) 1

elk epje met RNA/primer mix werd 7 µl reactiemix toegevoegd, gevortexed en afgedraaid

(short).

Het gevormde cDNA werd dan gebruikt als template voor de amplificatie door middel van een PCR

reactie (condities: 15 min. bij 25 °C, 50 min. bij 50 °C, 15 min. bij 70 °C). Het geheel werd gedurende

3 minuten op ijs geplaatst en gecentrifugeerd, waarna 30 µl NF - H2O toegevoegd werd (totaal 50 µl).

Het cDNA werd bewaard bij -20 °C.

3.2.4 DNA EXTRACTIE

De DNA extractie gebeurde met de QIAamp DNA purification kit van QIAGEN (protocol for cultured

cells) (53). De cellen werden geoogst en geresuspendeerd in PBS aan een totaal volume van 200 µl.

Vervolgens werd 200 µl Qiagen protease (proteinase K) en 200 µl buffer AL toegevoegd, waarna het

geheel gedurende 15 seconden gevortexed werd om een efficiënte lysis te bekomen. Na een incubatie

van 10 minuten bij 56 °C, werd 200 µl ethanol (96 -100%) toegevoegd en werd kort gevortexed. Het

geheel werd dan overgebracht op een QIAamp spin kolom (in een 2 ml collectiebuisje), waarbij het

DNA na een korte centrifugatie geadsorbeerd was aan de silicamembraan van de kolom. Het residuele

contaminerende materiaal werd weggewassen door 2 centrifugatiestappen, na toevoeging van 2

wasbuffers (AW1 en AW2). Het gezuiverde DNA werd dan met behulp van buffer AE geëlueerd van

de kolom. De concentraties werden bepaald met de nanodrop.

3.2.5 REAL TIME PCR (QPCR)

Bij een klassieke PCR reactie gebeurt detectie van het geamplificeerde product door middel van

gelelectroforese en kleuring met ethidium bromide. Ethidium bromide bindt aan dsDNA door

intercalatie tussen basenparen en fluoresceert bij UV belichting. Real-Time Polymerase Chain

Reaction (qPCR) combineert DNA amplificatie met de onmiddellijke detectie van het product. In

vergelijking met een klassieke PCR, is er bij qPCR een lager contaminatie risico en geeft het een

kwantitatief resultaat. De detectie van het product is gebaseerd op veranderingen in fluorescentie,

proportioneel aan de hoeveelheid product. De fluorescentie wordt weergegeven tijdens elke PCR

cyclus, waardoor de amplificatiecurve in ‘real time’ kan gevolgd worden. (54)

32

SYBR Green I intercaleert tussen dsDNA en fluoresceert eens het gebonden is. De hoeveelheid SYBR

Green dat geïncorporeerd wordt is in proportie met de hoeveelheid product dat gevormd werd. Een

nadeel is dat deze kleurstof aan elk geamplificeerd dsDNA bindt, waardoor primer dimeren en

onspecifieke producten een bias kunnen vormen. De specificiteit van de reactie kan echter wel

nagegaan worden door een smeltcurve uit te voeren. Hierbij gaat men uit van het principe dat elk

product een verschillende smelttemperatuur (Tm) heeft, afhankelijk van de grootte en de baseninhoud.

De temperatuur wordt hierbij traag opgevoerd van 60 °C naar 95 °C. Het geamplificeerde product zal

op een bepaald moment volledig denatureren, waarbij er een daling is van de fluorescentie omdat

SYBR Green dissocieert. Een specifieke reactie moet dan één mooie dissociatiepiek vertonen. (54)

De reagentia die gebruikt worden voor de qPCR reactie zijn in de juiste verhoudingen samengebracht

in een MasterMix. Deze bevat een reactie buffer, een HotStart Taq polymerase, een dNTP mix, Rox

passive reference dye en MgCl2. ROX is een fluorescente marker die gebruikt wordt als passieve

referentie bij sommige thermocyclers. Het fluorescentiesignaal van ROX wordt niet geamplificeerd

tijdens de PCR reactie. Het fluorescentie signaal van de stalen kan genormaliseerd wordt ten opzichte

van deze referentiewaarde, waarbij gecorrigeerd wordt voor experimentele artefacten. (54)

De primers werden samengesteld op basis van een alignment van Nef sequenties, afkomstig van de

Los Alamos HIV sequence database. Het alignment werd bekeken met BioEdit software en op basis

van dit alignment werd een consensus Nef sequentie voor groep B gemaakt. Deze consensus Nef

sequentie werd dan ingeladen in Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) om primers te

kiezen.

De reactiemix bevatte mastermix 2X van eurogentec (12,5 µl per staal), SYBR Green (7,25 µl per

staal), het primerpaar ConsB_sense (0,75 µl per staal) en ConsB_antisense (0,75 µl per staal) (bijlage

1). Deze reactiemix werd aangevuld met nuclease-vrij water tot een volume van 22 µl per staal. Aan 3

µ staal werd dan telkens 22 µl reactiemix toegevoegd.

We maakten voor ons experiment gebruik van het 7300 Real-Time PCR system van Applied

Biosystems. Het thermaal profiel wordt weergegeven in figuur 16. Er werd telkens een dissociatiestap

toegevoegd om de specificiteit van de reactie na te gaan.

33

Thermal Profile

0

25

50

75

100

Segment 1

1 Cycle

Segment 2

1 Cycle

Segment 3

50 Cycle

02:00

50°

95°10:00

95°00:30

60°

01:00

Tem

pera

ture

21 3 4

Figuur 16: Thermaal profiel qPCR (54).

3.2.6 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

De polymerase ketting reactie of PCR (Polymerase Chain Reaction) is een enzymatische techniek voor

het repetitief aanmaken van specifieke segmenten DNA. Karry Mullis ontwikkelde deze techniek in

1983. (55)

De essentiële componenten van de PCR reactiemix zijn het template DNA, twee goed gekozen

primers, een DNA polymerase en de deoxyribonucleotiden (dNTPs) of de bouwstenen voor het DNA.

MgCl2 is ook essentieel als cofactor voor het DNA polymerase. (27)

Het thermostabiele Taq polymerase zorgt voor een verlenging van korte enkelstrengs synthetische

oligonucleotiden (primers), tijdens herhaalde cycli van hitte denaturatie (90-98°C), primer annealing

(37-65 °C) en primer extensie (72 °C). De primers binden specifiek aan de uiteinden van het DNA

fragment dat moet geamplificeerd worden. Het Taq polymerase gebruikt dan het template DNA als

template voor primer extensie. De reactie is exponentieel, waarbij de hoeveelheid materiaal elke

cyclus verdubbeld wordt, tot één van de reagentia de reactie limiteert en er een plateau bereikt wordt.

De temperaturen in deze alinea zijn louter ter voorbeeld. Voor het exacte protocol van elke PCR

reactie die door ons werd uitgevoerd, verwijzen we naar ‘4.2.4 PCR’. (27)

De specificiteit van de PCR reactie hangt in grote mate af van de specificiteit waarmee de primers op

het target DNA hybridiseren. Twee parameters zijn hierbij van cruciaal belang. Vooreerst de

temperatuur van de hybridisatiestap: hoe lager de temperatuur, hoe stabieler de binding van de primers

op het target DNA, maar ook hoe lager de specificiteit. Bij te hoge temperaturen daarentegen, ziet men

soms helemaal geen hybridisatie. Voor elk primerkoppel moet dus een optimale temperatuur bepaald

worden, waarbij bij hogere GC-inhoud hogere temperaturen nodig zijn. Ten tweede is ook de

34

concentratie aan MgCl2 belangrijk. MgCl2 is een absolute vereiste voor het Taq polymerase, maar te

hoge concentraties geven echter een foutieve hybridisatie. (27)

We maakten ook gebruik van de nested PCR techniek. Hierbij wordt gebruik gemaakt van twee

primerkoppels, gericht tegen dezelfde targetsequentie, maar waarvan het tweede paar intern gelegen is

(‘nested’) ten opzichte van het eerste paar. Het PCR product van de eerste reactie vormt dan de target

voor de tweede reactie. Op deze manier kan de sensitiviteit en de specificiteit van de reactie verhoogd

worden.

Als standaard protocol voor de PCR reacties gebruikten we voor één reactie 34,8 µl NF-H2O, 5 µl 10X

buffer, 3 µl MgCl2, 1 µl dNTP’s (10 mM), 0,5 µl primer 1 (50 nmol/µl), 0,5 µl primer 2 (50 nmol/µl)

en 0,2 µl Taq Polymerase (5U). De reagentia komen uit de kit van Applied Biosystems (Roche):

AmpliTaq DNA polymerase with GeneAmp 10X PCR Buffer II and MgCl2 solution. Voor de

nucleotidesequenties van de primers verwijzen we naar de tabel in bijlage 1.

Per reactie werd 45 µl mix toegevoegd aan 5 µl staal, waarbij telkens 100 ng DNA gebruikt werd

aangelengd met NF-H2O. Voor de negatieve controle werd 45 µl mix toegevoegd aan 5 µl NF-H2O.

Voor het instellen van de duur van de elongatiestap gebruikten we de basisregel: 1 minuut per 1000

basenparen.

Na de amplificatie van het target DNA, werden de fragmenten door middel van gelelektroforese

gescheiden op basis van hun grootte. Bij een neutrale pH zijn DNA molecules negatief geladen,

waardoor ze tijdens de elektroforese naar de positieve elektrode migreren. Kleine molecules bewegen

hierbij sneller, waardoor verschillende bandjes ontstaan op de gel. Wij maakten gebruik van een 2 %

agarosegel, die toelaat molecules van 200 nucleotiden tot 20 kb te scheiden. De gel werd gemaakt door

3g agarose (Roche) aan 150 ml TAE buffer (50 ml 10x TAE (invitrogen) + 450 ml gedestilleerd

water) toe te voegen. De gel werd geladen met een mengsel van 300 ng DNA met loading dye (6X

DNA loading dye, Fermentas: 1/6 van het totale volume toevoegen). Als referentie werd ook telkens

een DNA ladder geladen (Fermentas, Gene Ruler 1kb of 100 bp plus DNA ladder ready-to-use). De

gel werd dan gelopen in een elektroforesetoestel (Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis system en

PowerPac HC power supply van Bio-Rad) bij 150 volt en 0.15 ampère per gel.

Hierna gebeurde een kleuring met ethidium bromide gedurende dertig minuten, waarna visualisatie

van de bandjes mogelijk werd met behulp van een UV lamp.

35

4. RESULTATEN

4.1 SEQUENCING LZRS-NEF(O8)-IRES-EGFP VECTOR

Het abnormale fenotype na een geslaagde transductie zou het gevolg kunnen zijn van een fout in de

sequentie van Nef in de LZRS vector. Een structuuranalyse bestaat uit het samenstellen van een

restrictiemap en de bepaling van de nucleotidesequentie. De restrictieanalyse van de LZRS vector met

BamHI, EcoRI, Xba en SpeI werd eerder uitgevoerd in het lab en gaf de te verwachten fragmenten.

Hieruit konden we dus reeds afleiden dat Nef wel degelijk in het construct zat. Het eerste luik van mijn

project bestond dan uit het uitvoeren van een aangepast sequencing protocol om de insert te kunnen

sequeneren in de LZRS vector met primers S1 en AS4T7. We wilden de sequentie vergelijken tussen

de LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP vector waarbij Nef niet functioneel is en een andere clone waarbij Nef

wel functioneel is. Functionaliteit werd bepaald aan de hand van CD4 en MHC-I down regulatie

vermogen in T-cellijnen.

De concentraties bekomen na de miniprep voor de normaal functionerende 08 vector en de abnormale

08 vecor werden gemeten met de nanodrop en bedroegen respectievelijk 232,4 ng/µl en 517,6 ng/µl.

We voerden dan een primaire PCR reactie uit op de functionele en de niet-functionele vector, met

primerpaar S1/AS4T7. De reactie werd uitgevoerd bij volgende condities:

94 °C 2 minuten

94 °C 30 seconden

50 °C 30 seconden 39 herhalingen

72 °C 1 minuut

72°C 7 minuten

4 °C hold

Het PCR product werd eerst op gel gezet, alvorens het op te zuiveren met de Promega Kit. Het product

had telkens de verwachte grootte (ongeveer 800 bp).

Figuur 17: PCR product op gel. 1: 100 bp ladder. 2: PCR op niet-

functionele O8 vector met S1/AS4T7. 3: PCR op functionele O8 vector met

S1/AS4T7. 4: positieve controle. 5: negatieve controle.

36

Na de opzuivering met de Promega Kit bedroeg de DNA concentratie van het PCR product van de

functionele vector 135,8 ng/µl en van de niet-functionele vector 115,7 ng/µl.

Het standaard protocol voor een sequencing reactie werd dan toegepast op dit gezuiverd PCR product.

We gebruikten de forward primers S1 en 0F9015, en de reverse primer T7. De sequentie verkregen

met de T7 primer bleek niet bruikbaar aangezien deze geen overlap vertoonde met de sequenties

verkregen via de forward primers. De gealigneerde sequentie bekomen met de primers S1 en OF9015

bleek echter lang genoeg om de Nef sequentie te kunnen beoordelen. De sequentie van de functionele

vector was mooi gelukt, maar de sequentie van de niet-functionele vector bevatte mutaties, deleties en

inserties. Daarom werd een vergelijking gemaakt tussen de nieuw bekomen sequentie van de

functionele vector en een sequentie van de niet-functionele vector die het labo reeds vroeger

uitgevoerd had.

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

10 20 30 40

functionele vector TGGaCATCCT CTAGACTGCC GGATCCTTTT TATAAATGGG

niet-functionele vector ---------- ---------- ---------- -----ATGGG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

50 60 70 80

functionele vector AAACGCATTG AGAAAACATA GAAATCAGGG ATGGCCAGCA

niet-functionele vector AAACGCATTG AGAAAACATA GAAATCAGGG ATGGCCAGCA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

90 100 110 120

functionele vector GTAAgAgAAA GAATGAGAAA AGCCCCTGAG CCTGAGCCTG

niet-functionele vector GTAAGAGAAA GAATGAGAAA AGCCCCTGAG CCTGAGCCTG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

130 140 150 160

functionele vector AACCATGTGC ACCTGGAGTA GGACAACTAT CCAGGGAAGT

niet-functionele vector AACCATGTGC ACCTGGAGTA GGACAACTAT CCAGGGAAGT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

170 180 190 200

functionele vector AGCAGCCAGA GGAAGGATAC CAAGTTTCCT TACTCCTCAA

niet-functionele vector AGCAGCCAGA GGAAGGATAC CAAGTTTCCT TACTCCTCAA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

210 220 230 240

functionele vector AACAATGCAG CCCTTGCATT TCTAGAAAGT CACCAAGAAG

niet-functionele vector AACAATGCAG CCCTTGCATT TCTAGAAAGT CACCAAGAAG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

250 260 270 280

functionele vector ATGAAGATGC AGTAAGACCT CAAGTGCCTC TAAGGCCAAT

niet-functionele vector ATGAAGATGC AGTAAGACCT CAAGTGCCTC TAAGGCCAAT

37

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

290 300 310 320

functionele vector GACCTATAAA GGAGCATTTG ACCTCAGCTT CTTTTTAAAA

niet-functionele vector GACCTATAAA GGAGCATTTG ACCTCAGCTT CTTTTTAAAA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

330 340 350 360

functionele vector GAAAAGGGAG GACTGGAAGG GTTAATTTAC TCCCATGAGA

niet-functionele vector GAAAAGGGAG GACTGGAAGG GTTAATTTAC TCCCATGAGA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

370 380 390 400

functionele vector GAGCAGAAAT CCTGGATCTT TGGGTATACA ACACTCAGGG

niet-functionele vector GAGCAGAAAT CCTGGATCTT TGGGTATACA ACACTCAGGG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

410 420 430 440

functionele vector ATTCCtCCCt gaTTGGCAGT GCTACACACC AGGACCAGGA

niet-functionele vector ATTCCTCCCT GATTGGCAGT GCTACACACC AGGACCAGGA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

450 460 470 480

functionele vector ACTAGATTCC CACTGACATT TGGATGGTTA TTTAAGCTAG

niet-functionele vector ACTAGATTCC CACTGACATT TGGATGGTTA TTTAAGCTAG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

490 500 510 520

functionele vector TACCAGTGTC AGAAACTGAG GCAGAAGAAC TGGGAAATAA

niet-functionele vector TACCAGTGTC AGAAACTGAG GCAGAAGAAC TGGGAAATAA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

530 540 550 560

functionele vector GTGTGAAAGG GCTAGACTCC TGCATCCAGC TTGTGCCCAT

niet-functionele vector GTGTGAAAGG GCTAGACTCC TGCATCCAGC TTGTGCCCAT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

570 580 590 600

functionele vector GGCTATGGCG ATCGCCACGG AGAGATACTG AAATGGCAGT

niet-functionele vector GGCTATGGCG ATCGCCACGG AGAGATACTG AAATGGCAGT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

610 620 630 640

functionele vector TTGATAGATC ACTAGGCACC ACCCATGTTG CTAAGATAAC

niet-functionele vector TTGATAGATC ACTAGGCACC ACCCATGTTG CTAAGATAAC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

650 660 670 680

functionele vector TAACCCAGAG CTCTTCTCCA AAGACTAAAC GCGTTTTGAA

niet-functionele vector TAACCCAGAG CTCTTCTCCA AAGACTAA-- ----------

38

....|....| ....|....| ....|....| ....|....

690 700 710

functionele vector TTCCTGCAGG CCTCGAGGGA TTATAATATT ATAATACGA

niet-functionele vector ---------- ---------- ---------- ---------

Figuur 18: Alignering van de aminozuursequentie van de functionele en de niet-functionele

LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP vector. De nucleotiden weergegeven in kleine letters werden manueel

geëdit door analyse van de elektroferogrammen met behulp van het programma BioEdit.

Beide sequenties bevatten het startcodon ATG, het stopcodon TAA en waren identiek.

Ter confirmatie deden we opnieuw een sequenering van de niet-functionele vector met 3 forward

primers (S1, O9015 en 09148), maar deze gaf opnieuw geen duidelijk resultaat. Daarom wilden we de

sequentie bepalen op de gelineariseerde vector omdat dit soms betere resultaten geeft. De vector werd

geknipt met het MluI restrictie enzym, met als knipplaats 5’-A^CGCGT-3’ en 3’-TGCGC^A-5’. Bij

het uitvoeren van de PCR met S1 en AS4T7 primers hadden we echter 6 maal (na verschillende

aanpassingen aan het protocol) geen PCR product.

Er werd vervolgens een restrictie-analyse uitgevoerd met het enzyme KpnΙ. Voor de positieve controle

(LZRS LIE) konden we na restrictie en gelelektroforese fragmenten zien met een correcte grootte:

8406 bp, 1411 bp, 1200 bp en 711 bp (Fig. 19 en 20).

Figuur 19: De LZRS-IRES-EGFP vector (positieve controle) met aanduiding KpnI sites.

Fragmenten van 8406 bp, 1411 bp, 1200 bp en 711 bp.

39

Voor de LRZS-Nef-IRES-EGFP vector, verwacht men na restrictie met KpnI fragmenten van 8406 bp,

1411 bp, 1200 bp, 897 bp en 425 bp (Fig. 20). Bij de restrictieanalyse van de functionele vector (Fig.

21) zagen we echter een afwijkend patroon, dat verklaard kan worden doordat de restrictieplaats op

2168 bp niet bewaard is in deze O8 Nef LZRS vector. We verwachten dan een patroon van 8406 bp,

1411 bp, 1322 bp en 1200 bp. De niet-functionele vector vertoonde echter een afwijkend resultaat

(Fig. 21), dat niet kon verklaard worden door het niet bewaard zijn van een KpnI restrictieplaats.

Figuur 20: De LZRS-NEF-IRES-EGFP vector met aanduiding van de KpnI sites. Fragmenten

van 8406 bp, 1411 bp, 1200 bp, 897 bp en 425 bp.

Figuur 21: Restrictie analyse met Kpn I. laantje 1: 1 kbp ladder, 1000 bp

aangeduid op figuur. laantje 2: controle LZRS LIE ongeknipt. laantje 3:

controle LZRS LIE geknipt (met correcte fragmenten: 8406 bp, 1411 bp,

1200 bp en 711 bp). laantje 4: functionele LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP

vector ongeknipt. laantje 5: functionele LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP

vector geknipt. laantje 6: niet-functionele LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP

vector ongeknipt. laantje 7: niet-functionele LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP

vector geknipt.

40


VECTOR

4.2.1 VIRUSPRODUCTIE, TRANSDUCTIE, FLOWCYTOMETRIE EN CEL SORTERING

De virusproductie gebeurde door een transfectie van Phoenixcellen met de LZRS vector die Pex Nef

bevat (LZRS-Pex Nef-IRES-EGFP). Het retrovirale supernatans werd vervolgens gebruikt voor de

transductie van Jurkat CD4.CCR5 cellen en SupT1 cellen. Na ongeveer 5 dagen konden we met

behulp van de FACS read out EGFP expressie zien, wat wees op een geslaagde transductie. Na

kleuring met CD4 PE-gelabeld mAb kon ook het abnormale fenotype aangetoond worden. Hierbij was

er bij een deel van de populatie geen CD4 downregulatie te zien na transductie met een Pex Nef

retrovirus (figuur 22).

Figuur 22: FACS: transductie SupT1 cellen (links) en jurkat cellen (rechts) met FWR .

Na kleuring met CD4 PE zien we enerzijds CD4 downregulatie en anderzijds een

abnormaal fenotype zonder downregulatie.

41

Na de cell sort met de FACS Vantage verkregen we drie populaties: een niet-getransduceerde SupT1

populatie, een Nef-getransduceerde CD4+ populatie en een Nef-getransduceerde CD4- populatie. We

deden dit telkens voor SupT1 cellen getransduceerd met Pex WT Nef (figuur 23) en voor deze

getransduceerd met Pex F191R Nef (figuur 24).

Figuur 23: Resultaten na cell sort voor SupT1 cellen getransduceerd met PEX WT Nef.

42

Figuur 24: FACS: resultaten na cell sort voor SupT1 cellen getransduceerd met PEX F191R Nef.

43

4.2.2 WESTERN BLOT

De gesorteerde en Nef-getransduceerde SupT1 cellen werden gelyseerd volgens het protocol voor

suspensiecellen, zoals beschreven bij ‘materialen en methoden’. Nadat de proteïneconcentratie van de

lysaten bepaald werd met de spectrofotometer, kon het laadvolume voor de gel bepaald worden:

stalen Proteïne-

concentatie

(µg/ µl)

Laadvolume

(µl)

µl staal µg

proteïne

op gel

Reducing

agent (µl)

Loading

dye (µl)

H2O (µl)

Pex WT

ongesorteerd

8,62 20 2 17,2 2 7 9

Pex WT

CD4+

2,86 20 7 20,0 2 7 4

Pex WT

CD4-

2,43 20 8 19,4 2 7 3

Pex F191R

ongesorteerd

9,16 20 2 18,3 2 7 9

Pex F191R

CD4+

2,95 20 7 20,7 2 7 4

Pex F191R

CD4-

2,83 20 7 19,8 2 7 4

De gelelektroforese en de western blotting met kleuring voor actine en voor Nef gebeurde volgens het

protocol, beschreven bij ‘materialen en methoden’.

De western blot voor actine (figuur 25) toonde

de aanwezigheid van een bandje bij 42 kDa.

Actine is een ‘housekeeping gen’.

‘Housekeeping genes’ zijn genen die

constitutief en stabiel tot expressie komen in

nagenoeg alle weefsels en cellen. Hierdoor

kunnen ze dus gebruikt worden als

ladingscontrole.

Figuur 25: Actine kleuring na 2 uur blootstelling .

44

De western blot met kleuring voor Nef (figuur 24) toonde bij de CD4- fractie van zowel de SupT1

cellen getransduceerd met Pex WT Nef, als deze getransduceerd met Pex F191R Nef, een bandje van

28 kDa, dat overeenstemt met het moleculair gewicht van HIV Nef. Bij de CD4+ fractie van de cellen,

getransduceerd met de LZRS vector die Pex WT Nef bevat, is een kleine hoeveelheid van een bandje

van 28 kDa zichtbaar en daarenboven ook een bandje met een kleiner moleculair gewicht (figuur 26,

laantje 2). Bij de CD4+ fractie van de cellen, getransduceerd met de LZRS vector die Pex F191R Nef

bevat, is er geen enkel bandje te zien (figuur 26, laantje 5).

Figuur 26: Nef kleuring na 4.5 uur blootstelling. 1: Pex WT niet gesorteerd. 2: Pex WT CD4+

fractie. 3: Pex WT CD4- fractie. 4: Pex F191R niet gesorteerd. 5: Pex F191R CD4+ fractie. 6: Pex

F191R CD4- fractie.

Bij de CD4+ fractie van de cellen, getransduceerd met de LZRS vector die Pex WT Nef bevat is er een

afwijkend (getrunceerd) eiwit. Voor Pex F191R constructen is er zelfs een volledige afwezigheid van

eiwit.

45

4.2.3 REAL TIME PCR

We voerden een qPCR uit met het primerpaar ConsB_sense en ConsB_antisense op het DNA,

verkregen na DNA extractie volgens het protocol beschreven bij ‘materialen en methoden’, en het

cDNA, verkregen na mRNA extractie en reverse transcriptie volgens het protocol beschreven bij

‘materialen en methoden’, van 6 stalen: Pex WT niet gesorteerd, Pex WT CD4+ fractie, Pex WT CD4-

fractie, Pex F191R niet gesorteerd, Pex F191R CD4+ fractie en Pex F191R CD4- fractie. Naast de

amplificatiereactie weergegeven op de amplificatieplot (Fig. 27), werd ook een dissocatiestap

toegevoegd om de specificiteit van de PCR reactie na te gaan (Fig. 28).

Figuur 27: Amplificatie plot cDNA en DNA.

cDNA

DNA

46

Figuur 28: Dissociatie curves CDNA en DNA.

Figuur 29: Amplificatie plot RNA na DNase behandeling, cDNA en DNA.

Een qPCR reactie die uitgevoerd werd op het RNA (Figuur hier niet weergegeven), toonde ook een

amplificatie. Nadien voerden we een tweede Real Time PCR reactie uit op het RNA, cDNA en DNA

van dezelfde stalen. Om te verhinderen dat het genomische DNA zou mee amplificeren met het

cDNA, werd nu een DNase behandeling uitgevoerd op het mRNA. Ook hier werd een amplificatie

plot (Fig. 29) en een dissociatie plot (Fig. 30 en 31) verkregen. Het RNA, na DNase behandeling,

toonde hier geen specifieke amplificatie.

+ controle

cDNA

- controle

DNA

RNA WT CD4-

RNA F191R totaal

47

Figuur 30: Dissociatie plot cDNA.

Figuur 31: Dissociatie plot DNA.

De smeltcurves (Fig 28, 30 en 31) vertoonden telkens één mooie dissociatiepiek, hetgeen wijst op een

specifieke amplificatie.

Uit figuur 27 konden we afleiden dat Nef aanwezig is in het cDNA en het DNA. Dit werd bevestigd na

een tweede qPCR (Fig. 29). De mogelijke oorzaak van het abnormale fenotype zal dus verder

kwalitatief moeten opgespoord worden d.m.v. sequenering.

48

4.2.4 PCR

We wilden een PCR uitvoeren op het DNA en cDNA, met het primerpaar S1/AS1 en S1 en een

antisense primer in EGFP. Aan de hand van de lengte van de amplicons zouden we dan de

aanwezigheid van de volledige Nef coderende sequentie (S1/AS1) en de volledige Nef-IRES-EGFP

coderende sequentie (S1/EGFP AS) kunnen nagaan. De PCR reactie resulteerde echter niet in

amplificatie. We probeerden daarom een nested PCR met als tweede primerkoppel Pex Nef sense en

Pex Nef antisense. De PCR werd uitgevoerd aan volgende condities:

94 °C 5 minuten

94 °C 30 seconden


72 °C 2 minuten

72°C 7 minuten

4 °C hold

De positieve controles op de LZRS Nef vector met primerkoppel S1/ AS1 en S1/EGFP AS waren

positief, en de negatieve controles negatief. Het resultaat van deze nested PCR was inconclusief,

waarschijnlijk door aspecifieke amplificatie. (Bijlage 1, Fig. 1)

Omdat de PCR reactie niet de verwachte resultaten gaf, deden we een nieuwe DNA en RNA extractie.

We bestelden ook nieuwe Pex Nef sense en antisense primers voor de nested PCR. De experimenten

werden vervolgens herhaald met de nieuwe reagentia.

Vooreerst deden we een PCR reactie op het cDNA met het primerpaar S1 en EGFP AS op de CD4+ en

CD4- fractie van Pex F191R en Pex WT. De PCR werd uitgevoerd bij volgende condities:

94 °C 5 minuten

94 °C 30 seconden


72 °C 2.30 minuten

72°C 7 minuten

4 °C hold

De positieve controle (LZRS Nef) was positief en de negatieve controle negatief. De PCR op de stalen

toonde na elektroforese en kleuring met ethidium bromide echter geen bandjes (Bijlage 2, Fig. 2). Om

de sensitiviteit en specificiteit te verhogen deden we dan een nested PCR met 2 verschillende

primerkoppels (Bijlage 2, Fig. 3): S1/AS1 en Pex Nef Sense/ Pex Nef antisense. De positieve controles

(LZRS Nef voor S1/AS1 en PBR NL4.3 – IRES – EGFP Pex voor Pex Nef S/Pex Nef AS) waren

49

positief en de negatieve controles negatief. Voor de nested PCR met Pex Nef Sense en Pex Nef

antisense, kleurden na elektroforese bandjes aan van correcte lengte.

De resultaten van deze PCR reacties waren dus niet interpreteerbaar.

50

5 DISCUSSIE

5.1 HET ABNORMALE FENOTYPE VAN DE LZRS-NEF(O8)-IRES-EGFP

VECTOR

Bepaalde LZRS-Nef (O8)-IRES-EGFP constructen waren niet functioneel, daar deze geen CD4 en

MHC-I down regulatie gaven in T-cellijnen. Door gebruik te maken van een aangepast sequencing

protocol met primerpaar S1/AS4T7 wilden we de sequentie vergelijken tussen de O8 Nef insert van de

functionele en de niet functionele vector. Er kon echter geen geslaagde sequenering van de niet-

functionele vector bekomen worden, enkel van de functionele. Een alignering tussen deze nieuw

bekomen sequentie van de functionele vector en een sequentie van de niet-functionele vector die in het

lab reeds vroeger bepaald was, leerde dat zij niet significant van elkaar verschillen: een mutatie van

het insert is hier dus geen waarschijnlijke verklaring.

Na restrictie-analyse van de niet-functionele vector met KpnI was echter duidelijk dat dit construct

niet correct was. Wellicht lag hierin een oorzaak van het niet-functioneel zijn.


VECTOR

Bij het gebruik van Pex Nef constructen (LZRS-PexNef-IRES-EGFP) in het lab werden afwijkende

resultaten gezien: na transductie van Jurkat cellen of SupT1 cellen met Pex Nef retrovirus ziet men op

flowcytometrie twee populaties cellen met een verschillend fenotype. Enerzijds is er een celpopulatie

met een duidelijke down regulatie van membraangebonden CD4 en anderzijds een celpopulatie

waarbij dit effect afwezig blijkt. In aanwezigheid van functioneel Nef proteïne, verwacht men down

regulatie van membraangebonden CD4.

Om de oorzaak te achterhalen deden we een cel sortering op basis van de twee verschillende

fenotypes, namelijk: cellen die CD4 down regulatie vertoonden (CD4-) en cellen die dit niet

deden(CD4+). Verder onderzoek naar de oorzaak van dit abnormale fenotype gebeurde op DNA

niveau (na extractie van genomisch DNA) en mRNA niveau (na RNA extractie en reverse transcriptie

tot cDNA) niveau door middel van PCR en qPCR. De qPCR toonde de aanwezigheid van Nef aan op

DNA en mRNA niveau. De resultaten van de PCR reacties waren inconclusief.

Om fouten op te sporen op proteïneniveau deden we ook een western blot. Deze toonde een afwijkend

eiwit voor de Pex WT Nef constructen en de afwezigheid van eiwit voor Pex F191R constructen.

51

Loss of function mutaties veroorzaken een vermindering in de hoeveelheid of de functionele activiteit

van een eiwit (genproduct is verminderd, afwezig of niet-functioneel). Mogelijke oorzaken van loss of

function zijn: inactiverende mutaties in coderende of regulerende gensequenties of totale gendeleties.

Ook mutaties die leiden tot introductie van een prematuur stopcodon (vb. nonsense mutaties of

frameshift mutaties) resulteren in loss of function. De ernst van het fenotypisch effect wordt bepaald

door de hoeveelheid overblijvend eiwit dat functioneel actief is. (56)

Tabel 1: soorten genmutaties (56)

Om de exacte oorzaak van het abnormale eiwit op te sporen, zou er best een sequencing gebeuren.

Door tijdsgebrek is deze echter niet meer uitgevoerd.

De LZRS-Nef-IRES-EGFP vector is een bicistronische vector, waarbij de aanwezigheid van een

Internal Ribosome Entry Site (IRES) een gecombineerde expressie van twee proteïnes (Nef en EGFP)

onder de controle van één enkele promotor toelaat. Aangezien er na transductie van SupT1 cellen met

Pex Nef retrovirus wel EGFP expressie is, is ‘silencing’ van de retrovirale vector door de novo

cytosine methylatie in de retrovirale LTR een weinig waarschijnlijke oorzaak. (57-59)

Na verder nazicht in het lab werd gevonden dat het plasmide correct zou moeten kunnen functioneren.

Een herschikking of een eerder subtiele mutatie van de vector na transductie van SupT1 cellen, is dus

de meest plausibele verklaring. Het getrunceerde eiwit bij de Pex WT Nef constructen zou het gevolg

kunnen zijn van een nonsense mutatie met een aminozuursubstitutie die een getrunceerd eiwit voor

gevolg heeft. Het afwezige eiwit bij de Pex F191R constructen zou ook het gevolg kunnen zijn van de

introductie van een prematuur stopcodon ten gevolge van een frameshift mutatie, een splicing defect

of een nonsense mutatie. Mogelijks is het epitoop herkend door het antilichaam daarom niet meer

aanwezig. De afwezigheid van het eiwit kan anderzijds ook verklaard worden door nonsense mediated

mRNA decay, een beschermingsmechanisme van de cel dat verhindert dat schadelijke getrunceerde

eiwitten zouden kunnen opstapelen.

1. Puntmutaties

- missense mutatie: aminozuursubstitutie

- nonsense mutatie: (prematuur) stopcodon

- frameshift mutatie: verstoring van het normale leesraam, kan ook leiden tot een prematuur

stopcodon

- splice site mutaties: mutaties in splice donor of acceptor site interfereert met RNA splicing

mutatie in een intron leidt tot introductie van cryptische of

alternatieve splice site

2. Deleties/inserties

3. Triple repeat expansies

52

Talrijke voorbeelden van herschikkingen van vectoren kunnen teruggevonden worden in de literatuur.

Valkova et al. (60) toonden aan dat bij sommige NIH 3T3 cellen, getransduceerd met een retrovirale

vector gebaseerd op het Moloney murine leukemia virus (MLV) met Escherichia coli β-galactosidase

(lacZ) als reporter gen, er soms een afwezigheid was van β-galactosidase activiteit. Deze afwezigheid

zou niet het gevolg zijn van een inactivatie van de transcriptie, maar wel van een frame-shift mutatie

met het inbouwen van een stopcodon.

Parthasarathi et al. (61) bestudeerden het spectrum van genomische herschikkingen tijdens één

replicatiecyclus van een vector gebaseerd op het Moloney murine leukemia virus (MLV) die het

herpes simplex virus thymidine kinase (tk) gen bevat. Het virus werd geproduceerd in packaging

cellen, waarna target cellen getransduceerd werden. Er werd een mutatie-ratio gevonden van 3.3%/kbp

per replicatie cyclus. Er wordt ook gesuggereerd dat deze mutaties hoogst waarschijnlijk ontstaan

tijdens reverse transcriptie door het virale reverse transcriptase, na transductie in de target cellen.

5.3 MOGELIJKE IMPLICATIES VAN DE OBSERVATIE VAN DIT

ABNORMALE FENOTYPE

De therapeutische interventies bij HIV/AIDS zijn momenteel voornamelijk gericht op de twee

retrovirale enzymes: reverse transcriptase en protease. Hun gecombineerd gebruik heeft de mortaliteit

en morbiditeit bij personen geïnfecteerd met HIV aanzienlijk verminderd. Deze medicatie veroorzaakt

echter belangrijke toxiciteit, en haar effectiviteit wordt ondermijnd door het optreden van resistentie.

De hoge kost van deze producten bemoeilijkt ook de verspreiding in de ontwikkelingslanden. Nieuwe

veel belovende producten werden inmiddels ontwikkeld: de entry inhibitoren: de fusie inhibitoren

(FI’s: enfuvirtide) en de co-receptor inhibitoren (CRI’s: maraviroc); en de integrase inhibitoren (INI’s:

raltegravir). Er wordt ook onderzoek gedaan naar de HIV proteïnes Tat, Rev en Nef, die vroeg in het

virale leven tot expressie komen en het intracellulaire milieu van de gastheercel optimaliseren voor

virusreplicatie. (62)

Zoals reeds eerder vermeld heeft Nef vier functies die mogelijks een rol spelen in de pathogenese,

waarvan de CD4 down regulatie de target is met het meeste perspectief om HIV-1 aan te vallen via

Nef. Ook Env en Vpu dragen bij tot daling van oppervlakte CD4 expressie. Zonder de functie van Nef

kan het overblijvende CD4 van de gastheercel tijdens de virion budding binden aan Env en op die

manier interfereren met de productie van volledig infectieuze partikels. Onze observaties kunnen dus

belangrijk zijn, omdat deze cruciale pathogene functie van Nef verstoord blijkt te zijn bij bepaalde

retrovirale vectorproducties. Verder onderzoek is dus zeker aangewezen.

Anderzijds is deze casus ook een voorbeeld van de mogelijke problemen die kunnen optreden bij het

gebruik van retrovirale vectoren bij gentherapie.

53

6 REFERENTIES

1. 2008 Report on the global AIDS epidemic. UNAIDS, Geneva, 2008. Opgehaald op 5

september 2009, van http://www.unaids.org/en/KnowledgeCentre/HIVData/GlobalReport/

2008/2008_Global_report.asp.

2. Andersson J. The discoveries of human papilloma viruses that cause cervical cancer and of

human immunodeficiency virus. The Nobel Assembly at Karolinska Institutet, 2009.

Opgehaald op 5 september 2009, van http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/

2008 /adv.pdf.

3. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J et al. Isolation of

a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome

(AIDS). Science 1983 May 20;220 (4599):868-71.

4. Gallo RC, Sarin PS, Gelmann EP, Robert-Guroff M, Richardson E, Kalyanaraman VS et al.

Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS).

Science 1983 May 20;220(4599):865-7.

5. Levy JA. HIV and the pathogenesis of AIDS. 3rd ed. Washington, ASM Press, 2007.

6. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, Shearer GM, Kaplan M, Haynes BF et al. Frequent

detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at

risk for AIDS. Science 1984 May 4;224(4648):500-3.

7. Levy JA, Hoffman AD, Kramer SM, Landis JA, Shimabukuro JM, Oshiro LS. Isolation of

lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS. Science 1984 Aug

24;225(4664):840-2.

8. Wain-Hobson S, Alizon M, Montagnier L. Relationship of AIDS to other retroviruses. Nature

1985 Feb 28-Mar 6;313(6005):743.

9. Coffin J, Haase A, Levy JA, Montagnier L, Oroszlan S, Teich N et al. What to call the AIDS

virus? Nature 1986 May 1-7;321(6065):10.

10. Ratner L, Gallo RC, Wong-Staal F. HTLV-III, LAV, ARV are variants of same AIDS virus.

Nature 1985 Feb;313 (6004):636-7.

11. Coffin J, Haase A, Levy JA, Montagnier L, Oroszlan S, Teich N et al. Human

immunodeficiency viruses. Science 1986 May 9;232(4751):697.

12. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1997.

13. Perrin L, Kaiser L, Yerly S. Travel and the spread of HIV-1 genetic variants. Lancet Infect Dis

2003 Jan;3(1):22-7.

14. Robertson DL, Anderson JP, Bradac JA, Carr JK, Foley B, Funkhouser RK et al. HIV-1

nomenclature proposal. Science 2000 Apr 7;288(5463):55-6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chermann%20JC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chamaret%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gruest%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sarin%20PS%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gelmann%20EP%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Robert-Guroff%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Richardson%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kalyanaraman%20VS%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Salahuddin%20SZ%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Popovic%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shearer%20GM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kaplan%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Haynes%20BF%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

54

15. The Division of AIDS of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID).

The circulating recombinant forms (CRFs). Opgehaald op 6 februari 2009, van

http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html.

16. Ariën KK, Vanham G, Arts EJ. Is HIV-1 evolving to a less virulent form in humans? Nat Rev

Microbiol. 2007 Feb;5(2):141-51.

17. Wang WK, Chen MY, Chuang CY, Jeang KT, Huang LM. Molecular biology of human

immunodeficiency virus type 1. J Microbiol Immunol Infect 2000 Sep;33(3):131-40.

18. Foster JL, Garcia JV. HIV-1 Nef: at the crossroads. Retrovirology 2008 Sep 22;5:84.

19. Mims CA, Dockrell HM, Goering HV. Medical microbiology. 3rd

ed. Edinburgh, Mosby,

2004.

20. Kumar P, Clark M. Clinical medicine. 6th ed. Edinburgh, Saunders, 2005.

21. Rapid advice: use of antiretroviral drugs for treating pregnant women and preventing HIV

infection in infants. World Health Organization, Nov 2009. Opgehaald op 2 december 2009,

van http://www.who.int/hiv/pub/mtct/advice/en/index.html.

22. Parham P. The immune system. 2nd

ed. New York : Garland Science, 2005.

23. Padian NS, Buvé A, Balkus J, Serwadda D, Cates W Jr. Biomedical interventions to prevent

HIV infection: evidence, challenges, and way forward. Lancet 2008 Aug 16;372(9638):585-

99.

24. De Clercq E. Anti-HIV drugs: 25 compounds approved within 25 years after the discovery of

HIV. Int J Antimicrob Agents 2009 Apr;33(4):307-20.

25. Ariën KK, Verhasselt B. HIV Nef: role in pathogenesis and viral fitness. Curr HIV Res 2008

May;6(3):200-8.

26. Templeton NS, Lasic DD. Gene therapy : therapeutic mechanisms and strategies. New York,

Dekker, 2000.

27. Inleiding tot de recombinant DNA technologie 1ste bachelor geneeskunde, Universiteit Gent.

28. Kootstra NA, Verma IM. Gene therapy with viral vectors. Annu Rev Pharmacol Toxicol

2003;43:413-39.

29. Verma IM, Weitzman MD. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem

2005;74:711-38.

30. Van Bockstaele F. Chronic lympocytic leukemia: prognosis and gene transfer. Sept 2008.

31. Pear W.S., Nolan G.P., Scott M.L., Baltimore D. Production of high-titer helper-free

retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci 1993 Sep 15; 90: 8392–8396.

32. Mann R, Mulligan RC, Baltimore D. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use

to produce helper-free defective retrovirus. Cell 1983 May;33(1):153-9.

33. Stanford university, Nolan lab. Phoenix helper-free retrovirus producer lines. Opgehaald op 2

december 2009, van http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/phx.html.

55

34. Carl S, Greenough TC, Krumbiegel M, Greenberg M, Skowronski J, Sullivan JL et al.

Modulation of different human immunodeficiency virus type 1 Nef functions during

progression to AIDS. J Virol 2001 Apr;75(8):3657-65.

35. QIAGEN. QIAprep Miniprep handbook. 2nd ed. December 2008.

36. Applied Biosystems. Automated DNA Sequencing, Chemistry Guide. 2000.

37. Applied Biosystems. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis, Chemistry Guide. 2nd

ed.

2009.

38. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc

Natl Acad Sci U S A 1977 Dec;74(12):5463-7.

39. Graham FL, van der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus

5 DNA. Virology. 1973 Apr;52(2):456-67.

40. Morling FJ, Russell SJ. Enhanced transduction efficiency of retroviral vectors coprecipitated

with calcium phosphate. Gene Ther. 1995 Sep;2(7):504-8.

41. Invitrogen. Product protocols: Calcium phosphate transfection kit. Opgehaald op 17 Februari

2010, van https://resources.invitrogen.com/content/sfs/manuals/capo4man.pdf.

42. Simberg D, Weisman S, Talmon Y, Barenholz Y. DOTAP (and other cationic lipids):

chemistry, biophysics, and transfection. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 2004;21(4):257-317.

43. Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M et al. Lipofection: a highly

efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987

Nov;84(21):7413-7.

44. Alice Longobardi Givan. Flow cytometry. First principles. 2nd

ed. New York (N.Y.) : Wiley-

Liss; 1992.

45. C.A. Rhodius en A. Thijs. Van Microscopie naar flowcytometrie. Ned Tijdschr Geneeskd

2003 juni;6(2).

46. BD BIO: Introduction to Flow Cytometry. Opgehaald op 16 Februari 2010, van

http://www.bd.com/videos/bdb/training_ITF/home.html.

47. Misha Rhaman. Introduction to Flow Cytometry. Opgehaald op 16 Februari 2010, van

http://www.abdserotec.com/uploads/Flow-Cytometry.pdf.

48. BD Biosciences. Introduction to Flow Cytometry: a learning guide. April 2000. Opgehaald

van http://info.med.yale.edu/immuno/cytometry/docs/pdf/introduction.pdf.

49. Western blotting – a beginner’s guide. Opgehaald op 13 Februari 2010, van

http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf.

50. Invitrogen. All-in-one kits for protein detection using western blot analysis. Opgehaald op 13

Februari 2010, van https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.Unit

SectionTree&treeNodeId=4821022202499C03FC007E8F86091119.

51. Gallagher S, Winston SE, Fuller SA, Hurrell JG. Immunoblotting and immunodetection. Curr

Protoc Immunol. 2008 Nov;Chapter 8:Unit 8.10.

52. QIAGEN. miRNeasy Mini Handbook. 2007.

53. QIAGEN. QIAamp DNA mini and blood mini handbook, second edition. 2007.

54. Eurogentec. qPCR guide.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Graham%20FL%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20der%20Eb%20AJ%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Virology.');

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morling%20FJ%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Russell%20SJ%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Gene%20Ther.');

56

55. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA et al. Enzymatic amplification

of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell

anemia. Science 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.

56. Klinische genetica, 2de master geneeskunde, Universiteit Gent.

57. Swindle CS, Klug CA. Mechanisms that regulate silencing of gene expression from retroviral

vectors. J Hematother Stem Cell Res 2002 Jun;11(3):449-56.

58. Bestor TH. Gene silencing as a threat to the success of gene therapy. J Clin Invest 2000

Feb;105(4):409-11.

59. Pannell D, Osborne CS, Yao S, Sukonnik T, Pasceri P, Karaiskakis A et al. Retrovirus vector

silencing is de novo methylase independent and marked by a repressive histone code. EMBO J

2000 Nov 1;19(21):5884-94.

60. Valkova C, Georgiev O, Karagyozov L, Milchev G. Silencing of retroviral vector transduced

LacZ reporter gene by frameshift mutation. Biotechnol Bioeng 2003 Oct 5;84(1):1-6.

61. Parthasarathi S, Varela-Echavarría A, Ron Y, Preston BD, Dougherty JP. Genetic

rearrangements occurring during a single cycle of murine leukemia virus vector replication:

characterization and implications. J Virol 1995 Dec;69(12):7991-8000.

62. Greene WC. The brightening future of HIV therapeutics. Nat Immunol 2004 Sep;5(9):867-71.

Bijlage 1

Tabel 1: Primer nucleotide sequenties (5’ 3’).

LZRS S1

TCAAAGTAGACGGCATCGCAGCTT

LZRS AS1

CGGCTTCGGCCAGTAACGTTAG

SF2 AS

TCATTGGTCTTAAAGGTACCTG

Pex Nef S

CAAGGGAGCTGTAGATCTTAGCC

Pex Nef AS

GTGGTAGACCCACAAATCAAGC

Cons_Nef_B_AS

CTAGGCGGCTGTCAAACTTC

Cons_Nef_B_S

CTGACCTTTGGATGGTGCTT

EGFP AS

TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC

OF9015

AGTGCCTCTAAGGCCAATGACC

O9148

CAGGGATTCTTCCCTGATTGGC

AS4T7

CCCTATAGTGAGTCGTATTATAATATTATAATCCCTCGAGGCCTGCAG

T7

TAATACGACTCACTATAGGG

Bijlage 2

Figuur 1: PCR en nested PCR 24 juni. 1: positieve controle (LZRS Nef) met S1/AS1. 2: negatieve

controle met S1/AS1. 3: positieve controle (LZRS Nef) met S1/AS EGFP. 4: negatieve controle met S1/AS

EGFP. 5: Pex WT CD4- fractie DNA met S1/AS1. 6: Pex WT CD4- fractie DNA met S1/AS EGFP. 7: Pex FR

CD4- fractie cDNA met S1/AS1. 8: Pex FR CD4- fractie DNA met S1/AS EGFP. 9: nested PCR op Pex WT

ongesorteerd DNA met S1/AS1. 10: nested PCR op Pex WT CD4+ DNA met S1/AS1. 11: nested PCR op Pex

WT CD4- DNA met S1/AS1. 12: nested PCR op Pex FR ongesorteerd DNA met S1/AS1. 13: nested PCR op

Pex FR CD4+ DNA met S1/AS1. 14: nested PCR op Pex FR CD4- DNA met S1/AS1. 15: nested PCR op Pex

WT ongesorteerd DNA met S1/AS EGFP. 16: nested PCR op Pex WT CD4+ DNA met S1/AS EGFP. 17: nested

PCR op Pex WT CD4- DNA met S1/AS EGFP. 18: nested PCR op Pex FR ongesorteerd DNA met S1/AS

EGFP. 19: nested PCR op Pex FR CD4+ DNA met S1/AS EGFP. 20: nested PCR op Pex FR CD4- DNA met

S1/AS EGFP. Rij 2 (cDNA): 1: nested PCR op Pex FR CD4+ cDNA met S1/AS1. 2: nested PCR op Pex FR

CD4-cDNA met S1/AS1. 3: nested PCR op Pex FR ongesorteerd cDNA met S1/AS1. 4: nested PCR op Pex WT

CD4+ cDNA met S1/AS1. 5: nested PCR op Pex WT CD4- cDNA met S1/AS1. 6: nested PCR op Pex WT

ongesorteerd cDNA met S1/AS1. 7: nested PCR op Pex FR CD4+ cDNA met S1/AS EGFP. 8: nested PCR op

Pex FR CD4- cDNA met S1/AS EGFP. 9: nested PCR op Pex FR ongesorteerd cDNA met S1/AS EGFP. 10:

nested PCR op Pex WT CD4+ cDNA met S1/AS EGFP. 11: nested PCR op Pex WT CD4- cDNA met S1/AS

EGFP. 12: nested PCR op Pex WT ongesorteerd cDNA met S1/AS EGFP. 13: positieve controle nested pcr. 14:

negatieve controle nested pcr.

Figuur 2: PCR met primerpaar S1 en EGFP AS. 1: FR CD4+ cDNA. 2: FR CD4- cDNA. 3: WT CD4+

cDNA. 4: WT CD4- cDNA. 5: positieve controle (LZRS Nef). 6: negatieve controle.

Figuur 3: Nested PCR. 1: nested PCR met primerpaar S1/AS1 op PCR product van FR CD4+ cDNA met S1/

AS EGFP. 2: nested PCR met primerpaar S1/AS1 op PCR product van FR CD4- cDNA met S1/ AS EGFP. 3:

nested PCR met primerpaar S1/AS1 op PCR product van WT CD4+ cDNA met S1/ AS EGFP. 4: nested PCR

met primerpaar S1/AS1 op PCR product van WT CD4- cDNA met S1/ AS EGFP. 5: nested PCR met primerpaar

S1/AS1 op PCR product van positieve controle met S1/ AS EGFP. 6: nested PCR met primerpaar S1/AS1 op

PCR product van negatieve controle met S1/ AS EGFP. 7: nested PCR met primerpaar Pex Nef S/ Pex Nef AS

op PCR product van FR CD4+ cDNA met S1/ AS EGFP. 8: nested PCR met primerpaar Pex Nef S/ Pex Nef AS

op PCR product van FR CD4- cDNA met S1/ AS EGFP. 9: nested PCR met primerpaar Pex Nef S/ Pex Nef AS

op PCR product van WT CD4+ cDNA met S1/ AS EGFP. 10: nested PCR met primerpaar Pex Nef S/ Pex Nef

AS op PCR product van FWT CD4- cDNA met S1/ AS EGFP. 11: PCR met Pex Nef S/ Pex Nef antisense op

positieve controle (PBR). 12: PCR met Pex Nef S/ Pex Nef antisense op negatieve controle.

Z-lijn : Masterproef Experimenteel Onderzoek: “De rol van ...

Documents

Transcript of Z-lijn : Masterproef Experimenteel Onderzoek: “De rol van ...