BIOCHEMIE A - BIOMOLECULEN

MOLECULARIE BASIS VAN HET LEVEN

Basiseenheid van alle levende wezens = celAlles in het leven is gericht op overleving en voortplanting

prokaryote cel eukaryote celcytoplasmacelmembraan met pompen en kanalencelwandcirkelvormig chromosoomribosomencytosol met moleculen voor stofwisseling

cytoplasmasubcellulaire organellenkern met chromosomenribosomenendoplasmatisch reticulumGolgi-apparaatlysosomensecretiegranulaemitochondriën

Cellen zijn microscopisch klein, maar 1 middelgrote dierlijke cel bevat 1,3 x 1013 watermoleculen die door hun polariteit en vermogen tot vorming van waterstofbruggen bijdragen tot 3D structuur van vrijwel alle biomoleculen

1 Å = 10-10 m = 0,1 nm

Afmetingen van biomoleculen- 7 µm: kleinste menselijke cellen zoals erytrocyten- 65 Å: eiwit zoals hemoglobine- 6 Å: glucose- 1,5 Å: lengte van een covalente C-C binding

Resoluties:- lichtmicroscoop: 2000 Å- elektronenmicroscoop: 10 Å- röntgendiffractie: 1 Å

Snelheid van biochemische reacties- 10-12 s: verplaatsing van een elektronenpaar binnen een molecuul als rhodopsine (pigment netvlies,

fotoreceptor)- 10-9 s: vorming of verbreking van een covalente verbinding en de conformatieverandering van een

proteïne- 10-6 s: katalytische reacties van snelle enzymen en conformatieveranderingen van grote

macromoleculen zoals DNA- 10-3 s: trage enzymen- 1014 s geleden: gemeenschappelijke voorouder mens en chimpansee- 1017 s geleden: eerste biomoleculen

1kcal = 4,2 kJ

Energetische aspecten van biochemische reacties- <4 kJ/mol: trillingsenergie van moleculen bij lichaamstemperatuur- 4-40 kJ/mol: zwakke niet-covalente bindingen- 400 kJ/mol: bindingsenergieën van de meeste covalente bindingen verbroken met behulp van

enzymen en inbreng van chemische energie- 30 kJ/mol: energie die vrijkomt bij hydrolyse van de terminale fosfaatgroep van ATP (intermediair

tussen verbreken van een covalente C-C binding en een niet-covalente interactie

- 9000 kJ energie per dag: onderhoud van basale en specifieke levensfuncties bij gemiddelde actieve volwassen mens

- 3600 kJ: 40% van de energie die wordt omgezet tot ATP (120 mol)- 3-10 kJ/mol: energie betrokken bij een dipool-dipool interactie- 12-25 kJ/mol: bindingsenergie van een H-brug

Wet van Coulomb: afstotend wanneer beide ladingen hetzelfde teken dragen en aantrekkend

bij ladingen van tegengesteld tekenvb: negatieve lading van fosfaatgroepen op DNA-molecuul met positeive lysine- en arginineresidu’s van DNA-bindende eiwitten (vb histonen)

Permanente dipolen kunnen elektrostatische reacties aangaan met ionen en andere permanente dipolen zwakker dan ion-ion interacties

London-dispersiekracht: de ene geïnduceerde dipool van molecuul 1 gaat een dipool van omgekeerde fase induceren in molecuul 2 (= Van der Waalskrachten) zwakste van alle niet covalente krachten, maar ook talrijkste interacties tussen biomoleculen

Van der Waals-contactafstand: bij een zekere dichte toenadering bestaat er een maximale aantrekking tussen de atomen (= som van van der Waals-contactradii)

Waterstofbruggen: gemeenschappelijk delen van een waterstofatoom door 2 naburige atomen stabilisatie van secundaire eiwitstructuur (- helix en -vouwblad) en vorming van basenparen in de dubbelstrengige DNA-keten hoek van de H-brug belangrijk voor zijn sterkte: co-lineariteit

Water maakt steeds 70% of meer uit van de massa van organismen en 95% van alle lichaamsmoleculen

Water heeft een abnormaal hoog smelt- en kookpunt zeer sterke intermoleculaire interacties (H-bruggen en dipool-dipool interacties)

De valentie-elektronen van het zuurstofatoom in ater zijn via sp3-hybridisatie verdeeld over 4 orbitalen met bij benadering een tetraëdrische configuratie

De beide vrije elektronenparen van O zijn uitstekende acceptors voor het aangaan van waterstofbruggen; de beide H-atomen zijn uitstekende donors elk watermolecuul kan 4 H-bruggen aangaan met 4 andere watermoleculen ijs

Wanneer ijs smelt, verbreken er ongeveer 15% van de H-bruggen open structuur van water iets gecondenseerd dichtheid van water groter dan van ijs ijs drijft op water

Solvatie = oplossend vermogen van water

Water gaat zeer goed interacties aan met polaire moleculen en groepen polaire moleculen goed wateroplosbaar (hydrofiel): dipolen van water schermen de ladingen van de ionen als het ware af en beletten dat deze ionen elektrostatische interacties aangaan hoge diëlektrische constante van water als medium

Apolaire structuren kunnen geen H-bruggen of dipool-dipool interacties met water aangaan, alleen in staat tot zwakke induced-dipool interacties onder elkaar (hydrofoob) watermoleculen zullen dergelijke apolaire stoffen proberen te omgeven met een kooi (clathraat) waarin een maximum aantal H-bruggen

tussen de watermoleculen onderling aanwezig zijn thermodynamisch onwaarschijnlijk apolaire stoffen worden bijeengedreven weg van de waterfase

Een molecuul die zowel apolaire als polaire groepen bevat, noemt men amfifatisch

Water is tegelijkertijd een zwak zuur en een zwakke geconjugeerde base

Een buffer bestaat uit een waterige oplossing van een zwak zuur met zijn geconjugeerde base vermogen om de pH van een oplossing relatief constant te houden ondanks toevoeging van een (beperkte) hoeveelheid zuur of base (principe van Le Châtelier-van’t Hof)

Normale pH-waarde van bloed: 7,35-7,45- te lage bloed pH: acidose- te hoge bloed pH: alkalose

De bufferende werking is het grootst in de nabijheid van de pKz-waarde van de buffer Henderson-

Hasselbalch: pKz-waarde = de pH-waarde waarbij er evenveel

moleculen geconjugeerde base zijn als moleculen zwak zuur (indien 50% van de zuurmoleculen zijn gedissocieerd in geconjugeerde base en protonen)

Wanneer we de pH 1 eenheid laten stijgen boven de pKz-waarde, dan is de verhouding

ongeveer 91% van het zuur is gedissocieerd

Wanneer we de pH 1 eenheid laten dalen onder de pKz-waarde, dan is de verhouding

ongeveer 9% van het zuur is gedissocieerd

Buffers in het menselijk bloed- HCO3

-/H2CO3 chemische vorm waarin het meeste koolzuurgas van de weefsels naar de longen wordt vervoerd

- HPO42-/H2PO4

- bestanddeel van botmineraal en bestanddeel van vele biomoleculen- albumine transporteiwit, osmotische zuigkracht waardoor water in de bloedbaan blijft- hemoglobine in de rode bloedcellen RBC noodzakelijk om CO2 om te zetten in HCO3

-

Niet-covalente wisselwerkingen in water zijn belangrijk voor het totstandkomen van moleculaire structuur en voor het aangaan van intermoleculaire interacties (juise complementaire vorm tussen 2 groepen) denaturatie: hoge concentraties NaCl of ureum aan water toevoegen renaturatie: wanneer de denaturerende agentia worde nweggenomen, nemen de moleculen vaak weer spontaan hun natuurlijke vorm aan

4 grote families macromoleculen vertegenwoordigt in alle cellen:- proteïnen- nucleïnezuren- lipiden- koolhydraten bouw: polymerisatie van een beperkt aantal bouwstenen

Proteïnen- opgebouwd uit onvertakte aminozuurketens van uiteenlopende lengte- bouwstenen: 20 verschillende aminozuren

Nucleïnezuren

- informatiedragende moleculen (RNA, DNA)- lange onvertakte ketens van nucleotiden- bouwstenen: 4 verschillende nucleotiden

Koolhydraten (sachariden of suikers)- monomeren metabolisme- oligomeren vaak covalent gebonden aan eiwitten en lipiden rol in herkenning en binding van

macromoleculen onderling- polymeren brandstofreserve (glycogeen, zetmeel), vormen van structuur (cellulose, chitine)

Lipiden- kleinere afmetingen- vertakte moleculen- bestaan meestal uit vetzuren en een alcohol waarop 1 of meerdere kleine (polaire) moleculen gehecht

kunnen zitten- belangrijke structurele rol en als cellulaire brandstoffen

Er bestaan covalente bindingen tussen suikters en eiwitten of lipiden hybride moleculen (glycoproteïnen, glycolipiden)

Primaire structuur = volgorde waarin schakels aan elkaar vast zittenSecundaire structuur = ruimtelijke vorm van het polymeer over korte afstandTertiaire structuur = ruimtelijke vorm voor het gehele polymeer

in-vivo-experimenten: proefopstelling waar men gebruik maakt van intacta organismen eerste: op Escherichia coli (darmbacterie) of Saccharomyces cerevisiae (gist) daarna op primitieve dieren vb: drosophila melanogaster (vlieg) en caenorhabditis elegans (worm) nu: op kleine zoogdieren (muis, rat)

in-vitro-experimenten: isoleren van een bepaald bestanddeel uit het organisme (geïsoleerde cellen uit een orgaan, gezuiverde celorganellen, celvrij extract …)

Ultracentrifugatie: cellen op een weinig beschadigdende wijze openbreken en diverse celbestanddelen te fractioneren

Biomoleculen scheiden:- naar grootte: gelchromatografie of polyacrylamide gelelektroforese- naar lading: ion-uitwisselingschromatografie en iso-elektrische focussing- naar specifieke groepen: affiniteitschromatografie

Radioisotopen: ontrafelen van een aantal biochemische processen: natuurlijk voorkomende elementen (14C, 3H, 32P, 35S) als precursor ingebouwd of gezuiverde eiwitten in vitro merken met 125I (radio-immuno-assay)

Structuuranalyse van eiwitten en nucleïnezuren:- ontcijferen van de sequentie of volgorde van hun bouwstenen- analyse van hogere graden van moleculaire structuur (3D conformatie röntgendiffractie of NMR-

spectroscopie)

Antilichamen (immunoglobulines):- zeer hoog discriminatief vermogen- diverse biomoleculen opsporen, zuiveren of doseren (vb: RIA, Western Blot en

affiniteitschromatografie)

Met specifieke enzymen kan men heel gericht bepaalde reacties in vitro uitvoeren:

vb reproduceerbaar knippen va een lang DNA-molecuul in fragmenten met behulp van restrictie-enzymen vb Taq-DNA polymerase kan in vitro vele kopieën maken van een stukje DNA dat de onderzoeker interesseert

Ultracentrifuge- doorbraak: biochemische processen lokaliseren in subcellulaire compartimenten van eukaryote

weefsels of cellen- kleinere subcellulaire deeltjes of zelfs grote geïsoleerde moleculen scheiden ten zuiveren- preparatieve scheidingstechniek- principe berust op een beweging van een deeltje of molecuul in een snel ronddraaiende buis, zodat op

dit deeltje een netto fysische kracht werkt = resultante van de centrifugale kracht die op elk deeltje met een massa groter dan nu werkt en de tegenwerkende wrijvingskracht die ontstaat van zodra het deeltje begint te bewegen

- de centrifugale kracht hangt af vano kwadraat van de hoeksnelheido de straal van het zwaartepunt van het deeltje tot de as van de centrifugeo de massa van het deeltjeo dimensieloze coëfficiënt gebaseerd op het verschil in dichtheid tussen het deeltje en de

vloeistof waarin het deeltje zich beweegtFc= m (1 - ) ² r

- de centrifugebuis bevindt zich in een rotor met vaste hoek of beweeglijke hoek ten opzichte van de rotatieas

Isopycnische centrifugatie:- dichtheid van de vloeistof in de centrifugebuis overal gelijk- wrijvingskracht zal evenredig met de snelheid van het partikel en de wrijvingscoëfficiënt van de

vloeistof toenemen, er komt een moment dat de snelheid zo groot is dat Fw=Fc: Steady state het deeltje beweegt zich met constante snelheid voort: sedimentatiecoëfficiënt die de steady state snelheid per centrifugatieversnelling:

S = v / ² r = m (1 - ) / f met v: sedimentatiesnelheid en ² r = hoekversnelling eenheid: Svedberg (S) = 10-3 s afhankelijk van massa en densiteit van het deeltje en van dichtheid en viscositeit van de centrifugatievloeistof grote biomoleculen: S = 2-20 S

Dichtheidsgradiëntcentrifugatie- dichtheid van de vloeistof is variabel afhankelijk van de plaats in de centrifugebuis (1 - ) zal naar

nul naderen naargelang het deeltje meer naar beneden de centrifugebuis beweegt- deeltje komt tot stilstand wanneer de dichtheden van het deeltje en omgeving even groot zijn- veel gebruikte vloeistoffen: waterige sucrosegradiënten en waterige gradiënt van het zout

cesiumchloride (CsCl) ( RNA en DNA uit cellen isoleren)

Isotopen van een bepaald element bezitten hetzelfde aantal protonen in de kern en hetzelfde aantal elektronen in de orbitalen; zij verschillen echter in het aantal neutronen in de kern quasi-identieke scheikundige eigenschappen

Stabiele (niet-radioactieve) isotopen - inbouwen daarvan in biomoleculen kunnen verschillen in de dichtheid van de stof teweeg brengen:

(Meselson en Stahl) 14N-DNA en 15N-DNA via ultracentrifugatie scheiden bewijs voor wijze waarop DNA zich repliceert

- verschil in nucleaire magnetische resonantie (NMR) NMR-spectroscopie om glucosemetabolisme bij de mens in vivo te bestuderen na injectie van 13C-gemerkt glucose in de bloedbaan

Radio-actieve (niet stabiele) isotopen: atoomkernen vervallen in de tijd naar nieuwe structuren met grotere bindingskrachten tussen de protonen en neutronen in de kern ontvangst of uitzending van energierijke elementaire deeltjeElk type radio-isotoop bezit zijn eigen karakteristiek patroon van verval dat gekenmerkt wordt door een karakteristieke emissie en een karakteristieke tijdsconstante waarin een fractie van de kern vervallen isDe snelheid van verval is de daling door desintegratie van het aantal radio-actieve kernen per tijdseenheid

evenredig met het aantal kernen op dat moment aanwezig: aantal overgebleven

radioactieve kernen als functie van de tijd: Met de desintegratieconstante, nauw verwant aan de halveringstijd t1/2: t1/2 = 0,693/

Zelfs als de fractie klein is, kunnen er door het doorgaans grote aantal atomen in een biosysteem, toch veel desintegraties per seconde optreden heel kleine hoeveelheden radioactief gemerkte stof gemeten (= tracer)Vb: tritium 3H: - desintegreert tot helium waarbij een neutron uiteenvalt in een proton en een energierijk elektron- -straler- energie per elektron: 2 x 104 eV = 0,02 MeV- halveringstijd: 12,1 jaar- Specifieke activiteit = verhouding van het aantal 3H-atomen op het aantal glucosemoleculen (Curie/mol)

met 1 Ci = 3,7 x 1010 dps (Bq)

14C isotoop:- -straler- energie van het gemiddelde elektron per desintegratie 0,16 MeV- halveringstijd 5 x 103 jaar max. speciefieke activiteit ongeveer 3 groottes lager dan van 3H-gemerkte

biomoleculen

32P-isotoop- radioactieve labeling van nucleïnezuren en andere fosfaatbevattende biomoleculen- hoge energie van -stralen (1,4 MeV)- kortere halveringstijd: 14 dagen- specifieke activiteit tot 104 Ci/mmol- toep: DNA of RNA blot die het mogelijk maakt een bepaalde nucleotidensequentie uit een

verzamelingvan duizenden verschillende sequenties te detecteren met een gemerkte radiactieve proob

35S-isotoop- radioactieve labeling van eiwitten, middels het inbouwen van een radioactieve methionine tracer- -straler- energie van emissie-elektronen vergelijkbaar met 14C (0,16 MeV)- halfwaardetijd 87 dagen- specifieke activiteit tot 103 Ci/mmol

Radio-isotopen van jood (125I en 131I)- -stralers uitzenden van hoogenergetisch foton- 125I:

o eiwitten labelen door jodinatie vantyrosine zijketenso zeer hoge specifieke activiteit detectie van zeer kleine hoeveelheden molec

Geiger-Muller-teller: klassieke detector voor radioactiviteit

Nauwkeurige meting van radioactieve monsters via vloeibare scintillatietelling, gamma-foton-telling en autoradiografie

Vloeibare scintillatietelling: - energierijke emissi-elektronen van de radioactieve desintegraties exciteren een soort ‘remspoor’ in de

-elektronen van het organische oplosmiddel (aromatische ringen) waarmee het radioactieve monster is verdund

- elke excitatie geeft een lichtfoton door het terugkeren van het geëxciteerde -elektron naar zijn oorspronkelijke orbitaal

- lichtflits wordt opgevangen en elektronisch versterkt door een fotomultiplier - energie van het emissie-elektron bepaalt de intensiteit van het gemeten lichtflitsje- telling van 2 soorten emissie-elektronen mogelijk (dubbellabeling)- aantal lichtflitsen per seconde is evenredig met de hoeveelheid radioactieve desintegraties per seconde- de hoeveelheid getelde desintegraties = de werkelijke hoeveelheid desintegraties vermenigvuldigd met

de counting efficiency (meestal ongeveer 0,5): cpm = dpm x CE

Autoradiografie: detectie van desintegraties gebaseerd op de excitatie van elektronen in een fotogevoelige laag (emulsie)- in combinatie met LM of EM waarbij men in weefsel- of celsneden onderzoekt waar een bepaalde

radioactieve tracer gelokaliseerd is (vb lokalisatie van een bepaalde mRNA in een bepaald celtype) eerder kwalitatieve techniek

- in combinatie met gelelektroforese waarbij radioactieve biomoleculen eerst op grootte of lading van elkaar worden gescheiden en vervolgens met een radiografische emulsie worden gedetecteerd (plaatsen aar radioactieve biomoleculen geconcentreerd zwarte vlek optische dichtheid meten) semi-kwantitatieve techniek

DE PRIMAIRE EIWITSTRUCTUUR

De functionele en morfologische eigenschappen van de verscheidenheid aan cellen waaruit het menselijk lichaam is opgebouwd, worden in grote mate bepaald door de aard van de proteïnen die in deze cellen aanwezig zijn eiwitfuncties:- katalyse: bijna alle enzymen zijn proteïnen (uits: sommige RNA-moleculen)- structuur: vorm en stevigheid van weefsels en organen via proteïnen van cytoskelet en via collageen,

elastine en andere bindweefselproteïnen tussen de cellen- beweging: intracellulaire contractiele proteïnen (filamenten van actine, myosine en geassocieerde

proteïnen- transport en opslag: transporteiwitten

o transferrine: vervoert ijzero albumine: transport van apolaire moleculen zoals bilirubineo celmembraan bevat specifieke transporteiwitten en –kanalen die opname van polaire

moleculen zoals ionen, suikers en aminozuren toelateno in cel bestaan er speciale eiwitten met opslagfunctie (vb: ferritine voor ijzer)o myoglobine draagt zuurstof in cytoplasma van spiercelo hemoglobine transporteert zuurstof in de rode bloedcel

- intercellulaire communicatie: hormonen en neurotransmitters binden op zeer specifieke wijze op hun doelwitcellen via receptoren die een signaal van buiten doorgeven naar het binnenste van de cel

- intracellulaire communicatie: doorgeven van informatie van receptorbezetting aan structuren die dieper in de cel liggen (signaaltransductie)

o transducereiwitten: tijdelijke associatie met nucleotide GTPo transcriptiefactoren: eiwitten die de expressie van het erfelijk materiaal op het niveau van

mRNA-aanmaak zeer selectief regelen- Groei en differentiatie: differentiatie als gevolg van weefselspecifieke genexpressie geregeld door

extracellulaire signalen, groeifactoren

- immunologische afweer: immunoglobulines functioneren als moleculaire antistoffen die vreemde moleculen op een specifieke wijze herkennen en binden

o complement systeem: eiwit-eiwit interacties dat leidt tot het doorboren van de celmembraan van een lichaamsvreemde cel en het aantrekken van fagocyten

o histocompatibiliteits systeem en T-cel-receptoren: in plasmamembranen cellulaire immuniteit

Chromatine = associatie van DNA met DNA-bindende eiwitten (vb histonen)

Specifieke wijze waarop proteïnen interacties aangaan met hun doelwit 3D complementariteit tussen het specifieke proteïne en het bijbehorende ligand 2 modellen om de specifieke eiwit-ligand interacties te verklaren:- instructieve theorie: 1 zeer veelzijdige flexibele proteïneketen vouwt zich netjes om het ligand heen

voor N verschillende liganden bestaan er dus N verschillend specifieke conformaties van hetzelfde proteïne

- matrijs theorie: voor elk ligand bestaat er een specifiek afzonderlijk proteïne dat vanaf de eiwitsynthese reeds de complementaire conformatie bezit

meestal 2de theorie juist, maar ook in zekere mate sprake van een kleine of grotere aanpassing van de vorm van het eiwit aan die van het ligand, dit nadat de binding tot stand is gekomen = induced fit

Alle proteïnen zijn opgebouwd als onvertakte ketens van 20 soorten bouwstenen die onveranderd gebleven zijn gedurende miljarden jaren van evolutie = aminozuren

Aminozuur < aminogroep, carboxylgroep, waterstofatoom en variabele zijketen gebonden op een centraal koolstofatoom (chiraal centrum enantiomeren L en D)- carboxylgroep: zwak zuur met pKz = 2 bij fysiologische pH volledig geïoniseerd tot COO-

- aminogroep: base met pKz = 10 bij pH = 7 bijna volledig geïoniseerd tot NH3+

Aminozuren dragen bij pH 7 minstens 2 geïoniseerde gropen = zwitterionen

Hydrofobe aminozuren: geen sterke interacties met water, in diepte van 3D-eiwitstructuur zijketens met weinig of geen elektronegatieve groepen, maar vooral koolstof- en waterstofatomen- glycine

o zeer klein wanneer er weinig plaats in een bepaalde positie in het eiwit beschikbaar iso enige symmetrische aminozuur (geen entantiomeren)

- prolineo bezit een secundaire aminogroep omdat de zijketen ‘teruggevouwen’ is om het constante

gedeelteo ringstructuur beperkte rotatievrijheid kan ruimtelijke structuur sterk beïnvloeden

- alifatische apolaire aminozuren :o alanineo valine : zeer hydrofoobo isoleucine : zeer hydrofoobo leucine : zeer hydrofoob

- zwavelatoom in zijketen beperkte polariteit, maar apolaire karakter CH-groepen overheersto cysteïne: SH-groep aan uiteinde cysteïne zwavelbrug: stabilisatie ruimtelijke eiwitstructuuro methionine: van alle nieuw aangemaakte eiwitten het eerste aminozuur

- aromatische zijketens UV-absorptie max bij golflengtes van 280 nm (Trp en Tyr) en 260 nm (Phe)o fenylalanineo tyrosine: bezit polaire hydroxylgroep zodat het minder hydrofoob is (kan meedoen in H-

bruggen)o tryptofaan

Hydrofiele aminozuren : wel interacties met water, aan oppervlakte van een eiwit

- aminozuren met alifatische alcoholgroep: vrij reactieve hydroxylgroepen soms vervangen door andere groepen (post-translationele modificaties)

o serine: serine-O-groep vaak een belangrijk onderdeel van de actieve site van enzymen (vb serine proteasen)

o threonine- positieve lading bij pH 7,4: vormen ionbindingen met anionen of gaan elektrostatische interacties aan

met watero lysine: hoge pKz (10,8)o arginine : hoge pKz (12,5)o histidine imidazolgroep heeft pKz van 6-7: bij neutrale pH evenwicht waarbij ongeveer de

helft van de histidines neutraal en de helft positief geladen zijn verschuivingen evenwicht belangrijk voor veranderingen in eiwitstructuur of eiwitfunctie vaak onderdeel van actieve site van enzymen

- netto negatief geladen zijketens bij pH 7 : komen bij neutrale pH voor al anionen intramoleculaire ionbindingen of sterke interacties met waterige omgeving

o aspartaato glutamaat

- zeer polair maar niet geladen : directe afgeleiden van aspartaat en glutamaato asparagine amidogroep wordt in sommige eiwitten geglycosyleer = N-gebonden

glycosyleringo glutamine

Post-translationele modificaties : sommige aminozuurzijketens worden na inbouw van het aminozuur in een eiwit nog chemisch gewijzigd belangrijk voor het bepalen van de uiteindelijke eiwitstructuur of voor de regulatie van de eiwitfunctie- onomkeerbare modificaties herkenning van eiwitten door andere eiwitten (chemische communicatie

tussen celleno hydroxylatie van sommige prolines en lysines in het structuureiwit collageeno sommige asparagine, serine en threoninezijketens in eiwitten worden geglycosylerd (= covalent

vasthechten van korte vertakte suikerketens die het eiwit extra polariteit geven)- omkeerbare modificaties:

o fosforylatie (proteïne kinasen) /defosforylatie (proteïne fosfatasen) van sommige serine, threonine of tyrosineresidu’s in eiwitten actief of inactie maken meest gebruikte chemische vorm van regulatie van eiwitfunctie

Modificaties van vrije aminozuren zijn belangrijk voor de werking van het zenuwstelsel: zenuwcellen communiceren met andere zenuwcellen of met doelwitcellen via chemische boodschapperstoffen (neurotransmitters, vaak directe afgeleiden van aminozuren) en worden door de zenuwcel in de buitenwereld gebracht via een proces van secretie

Binding van een neurotransmitter ionenstromen door de plasmamembraan of aanmaak van kleine intracellulaire signalen- neurotransmitters afgeleid van tyrosine: dopamine, adrenaline en noradrenaline- neurotransmitter afgeleid van tryptofaan: serotonine- neurotransmitter afgeleid van glutamaat: GABA- ongewijzigde aminozuren als neurotransmitters: glycine en glutamaat (belangrijkste stimulerende

boodschapperstof in de hersenen, onontbeerlijk voor geheugen en redenering)

Een peptidebinding ontstaat wanneer de -carboxylgroep van het ene aminozuur condenseert met de -aminogroep van het andere aminozuur, waarbij een watermolecuul vrijkomt evenwicht naar links, omdat peptidebinding een hogere energie-inhoud bezit aanzienlijke inbreng van energie (ATP)

Vorming van peptidebindingen vindt plaats in een levende cel via ribosomen, afbraak (proteolyse) gebeurt op vele plaatsen en verloopt via een serie specifieke katalysatorenvb: bloedstolling wordt via beperkte proteolyse geregeld- oligopeptiden: minder dan 20 AZ- polypeptiden: 20 tot 100 AZ- proteïnen: grote tot zeer grote polypeptiden die uit 1 of meerdere ketens van honderden aminozuren

kunnen bestaan (vb IgG: 2 lichte en 2 zware ketens, gezamenlijk 1500 aminozuurbouwstenen)Aminoterminaal deel is volgens afspraak het begin van de peptideketen, het is ook de zijde die het eerst ontstaat tijdens het proces van proteïnesynthese

Primaire structuur: aminozuursequentie en de juiste posities van S-S-bruggen verantwoordelijk voor de eigenschappen van het eiwit en bevat de informatie die bepaalt hoe het eiwitmolecuul zich driedimensionaal gaat oprollen tot een min of meer compacte structuur

De sequentiebepaling van de aminozuurvolgorde van insuline uit runderen door Fred Sanger leverde het experimenteel bewijs dat een welbepaald proteïne gekarakteriseerd wordt door een welbepaalde unieke aminozuurvolgorde

insuline: - peptidehormoon dat bij hogere diersoorten het bloedsuikergehalte verlaagt- vrij klein eiwit, bestaat uit 2 ketens die onderling covalent verbonden zijn door 2 zwavelbruggen- er bestaat binnen de A-keten ook een interne S-S brug- runderpacreas insuline en menselijk insuline zijn voor meer dan 90% gelijk zeer grote

sequentiehomologie en meeste wijzigingen conservatief (gewijzigde aminozuren bezitten vrijwel identieke zijketens) (hetzelfde eiwit in 2 levensvormen = orthologen)

- verschillen tussen mens en rund voor insuline op DNA-niveau zijn groter dan de verschillen die werden opgemerkt op eiwitniveau

Primaire structuur van zuurstoftransporteiwit myoglobine: 1 enkele polypeptide met 153 residu’s primaire structuur in verschillende diersoorten vrij sterk vergelijkbaar (walvis en mens: 84% identiek)

Moleculaire evolutieleer: duidelijke relatie tussen de volutionaire afstand tussen twee levensvormen en de graad van identiteit van 2 primaire sequenties van een bepaald type eiwit dat aanwezig is in deze levenvormen (aantal aminozuursubstituties per miljoen jaren evolutie is echter zeer verschillend van eiwit tot eiwit

Cytochroom c - van mens en rhesusaap verschilt slechts 1 van de 104 aminozuurresidu’s- voor mens en hond: 11 residu’s- voor mens en saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) tot 45 residu’s elke mutatie van een dergelijk geconserveerd aminozuur is fataal voor het individu en blijft dus niet behouden voor de volgende generatie

Histonen:- histon H4 verschilt slecht 2 op 102 residu’s tussen erwt en rund (evolutionaire afstand: 1 miljard jaar)- aminozuursequentie van histon H4 bevat relatief veel aminozuren met positief geladen zijketens (Lys

en Arg) van groot belang voor de binding van deze eiwitten op het negatief geladen DNA

Fibrine: - sterke verschillen in primaire structuur in nauw verwante diersoorten- maar weinig of geen functieverlies

Sterk geconserveerde residu’s zijn belangrijk voor de functie van het eiwit elke mutatie van een dergelijk geconserveerd aminozuur is nadelig voor het individu en blijft dus niet behouden voor de volgende generatie

IGF1 en IGF2 (insulinlike growth factoren)- lijken op insuline sequentiehomologie- groeistimulatoren de meeste eiwitten zijn leden van een of andere eiwitfamilie, 2 eiwitfamilieleden in dezelfde levensvorm zijn paralogen of isovormen van elkaar

De biochemische studie van de eiwitfunctie start meestal met de zuivering van het studieobject uit het startmateriaal

Elektroforese is een techniek die geladen moleculen van elkaar scheidt door differentiële mobiliteit in een ruimte waarin een elektrisch veld aanwezig is

Elektroforese wordt uitgevoerd in een gel - die bestaat uit een macromoleculair netwerk waarin water, zouten en biomoleculen zich kunnen

bewegen- voordeel: stabiliseert de waterfase enorm geen turbulenties in het scheidingsveld ten gevolge van

warmteontwikkeling- polyacrylamide-gel: eiwitelektroforese, bestaat uit chemisch inert steunmateriaal (polyacrylamide)- agarose: elektroforese van nucleïnezuren- eiwitmengsels volgens 2 principes scheiden (eiwitgrootte en netto eiwitlading) gecombineerd tot 2D

eiwitelektroforese

Polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-PAGE)- eiwitten in het te scheiden mengsel worden eerst voorbehandels met SDS (sodiumdodecylsulfaat):

negatief geladen detergens dat de eiwitten gedeeltelijk denatureerd en dat in grote hoeveelheden gaat binden op het eiwit (natuurlijke nettolading van het eiwit speelt dus geen rol)

- door eiwitten vooraf te reduceren met -mercapto-ethanol of dithiotreitol, verbreekt men ook de eventueel aanwezige S-S-bruggen

- alle eiwitten bewegen dus naar de positieve elektrode (anode)o kleinste eiwitten, die een kleine wrijving ondergaan in het netwerk zullen het snelst migrereno grootste eiwitten zullen langzamer migreren praktijk: eiwitten in een bepaalde tijdsperiode laten migreren over een afstand die omgekeerd evenredig is met de logaritme van hun moleculair gewicht

- door in parallel met het onbekende eiwit(mengsel) een aantal standaardeiwitten met bekende moleculaire gewichten te laten migreren, kan men de molecuulmassa van het onbekende eiwit bepalen

- meestal zijn eiwitten kleurloos kleuren of visualiseren:o coomassie blauw of zilverkleuringo autoradiografie (bij radioactief gemerkte eiwitten)o blotting: eiwitten uit de gel kwantitatief overdragen op een membraan (Western blotting) wat

toelaat om de eiwitbandjes te onderzoeken met specifieke antisera

Iso-elektrische focussing (IEF): eiwitten gescheiden naargelang de natuurlijke nettolading eiwitten bevatten naast de vrije amino- en carboxyterminus ook ioniseerbare aminozuurzijketens (lading hangt af van pH)- elk eiwit kan door het aantal en type ioniseerbare groepen worden gekarakteriseerd door een

grootheid: pI of iso-elektrisch punt = pH-waarde waarbij de som van alle ladingen van het eiwitmolecuul 0 is en waarin een eiwit niet meer beweegt in een elektrisch veld omdat de voortstuwende kracht dan gelijk is aan nul

- belangrijkste ioniseerbare groepen:

o carboxylgroep Asparaginezuur of glutaminezuuro histidineo lysine aminogroepo arginine aminogroep

- gel waarin zich een pH-gradiënt bevindt komt tot stand door een gradiënt van zogeheten amfolines (kleine polymeren die ioniseerbare groepen dragen) te gebruiken

- ieder eiwit zal volgens zijn eigen ‘natuurlijke’ nettolading gaan bewegen totdat het terechtkomt in een gebied dat een pH-waarde bezit die gelijk is aan de pI van het eiwit

In de chromatografie wordt een mechainsche kracht uitgeoefend op een zogenoemde mobiele fase die langs een vaste fase stroomt- vaste fase: grote aantallen zeer kleine bolletjes in de kolom met een relatief klein volume mobiele

fase kan met een enorme oppervlakte vaste drager bereiken efficiënte scheiding- gebaseerd op molecuul specifieke verschillen in de relatieve interacties (adsorptie, diffusie, binding)

tussen moleculen, de vaste fase en de vloeibare fase- moleculen met de zwakste interacties komen het eerst de kolom weer uit, moleculen met sterkere

interacties volgen later- verschillende soorten: gelfiltratie, ion-exchange chromatography, affiniteitschromatografie en high

performance liquid chromatografie (HPLC)

Gelfiltratie: de vaste drager werkt als een moleculaire zeer omdat de kleine bolletjes (sephadex, sepharose …) heel poreus zijn en van binnen bestaan uit een doolhof van mazen en spleten waarin kleine moleculen kunnen doordringen en dus sterk vertraagd worden. De keuze van de poriegrootte van de bolletjes bepaalt het gebied van moleculaire gewichten waar de scheiding het meest efficiënt is.

Ionenuitwisselingschromatografie: de vaste drager draagt geladen groepen- drager negatief: carboxymetylcellulose (CM-cellulose) netto positief geladen eiwitten worden door

elektrostatische aantrekkingskrachten tegengehouden en dus vertraagt tov loopbuffer- door pH van de loopbuffer geleidelijk te verhogen, zullen alle eiwitten meer en meer netto negatief

geladen worden o de volgorde van loslaten van eiwitten van de kolom geeft een beeld van de pI-waarden van

deze eiwitteno tijdens elutie worden de oorspronkelijk positief geladen eiwitten dus van de drager losgemaakt

door de pH te verhogen- door de concentratie NaCl of een ander zout van de loopbuffer gradueel te verhogen, gaan de positief

geladen natriumionen competeren met de positief geladen eiwitgroepen voor binding op de negatief geladen dragergroepen op de kolom

Gelfiltratie lijkt op SDS-PAGE terwijl ionenuitwisselingschromatografie wat lijkt op IEF

Affiniteitschromatografie: drager met een covalent gebonden groep die een affiniteit bezit voor het eiwit dat men wil zuiveren- grote specificiteit- vb: lectine concanavaline A bindt aan glycoproteïnen die glucoseresidu’s bevatten

o weerhoudt op een specifieke wijze de glucose bevattende glycoproteïnen uit een zeer complex eiwitmengsel

o na de kolom te hebben gewassen, blijven gezuiverde glucose bevattende glycoproteïnen overo deze worden uit de kolom geëlueerd door een overmaat glucose aan de nieuwe loopbuffer toe

te voegen competitie voor binding aan Con A glycoproteïne wordt verdrongen en wordt als zuivere fractie onderaan de kolom opgevangen

- krachtiger als scheidingstechniek naarmate men een specifieker en sterker bindende groep als lokaas op de drager hecht

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)- scheidingen bij hoge vloeistofdruk vloeistofstroom door de gehele kolom sneller en

scheidingsprocedure vlotter- hoge druk laat toe om relatief lange kolommen te gebruiken met een zeer kleine diameter en toch een

zeer groot oppervlak voor uitwisseling met de te scheiden moleculen scheiding mogelijk op relatief kleine hoeveelheden monsters en scheidingsvermogen van mengsels beter

- volautomatisch en computergestuurd analyses en verwerking van de resultaten kunnen continu doorgaan

Reverse-phase HPLC: eiwitten worden vooral op basis van hun hydrofobiciteit gescheiden door gebruik te maken van een apolaire vaste drager en een min of meer polaire vloeibare fase (vb water, trifluorazijnzuur TFA en acetonitril)- polariteit van de vloeibare fase kan in de tijd worden veranderd: gradiënt- mogelijk om in een complex mengsel vele soorten peptiden van elkaar te scheiden- door UV-absorptie metingen wordt de eiwitconcentratie in het eluans gemeten- de volgorde waarmee de peptiden als functie van de tijd uit de kolom elueren en de piekhoogtes

worden weergegeven door het chromatogram- door te werken met radioactief gemerkte eiwitten, kan met de fracties ook kwantificeren via -

scintillatietelling

Aminozuursamenstelling van een zuiver eiwit bepalen: analyse van de primaire structuur:- zure hydrolyse van alle peptidebindingen- de 20 verschillende soorten aminozuren in het hydrolysaat worden door een speciale

ionenuitwisselingschromatografie van elkaar gescheiden- de hoeveelheden van elk aminozuurfractie worden bepaald door een kwantitatieve kleurreactie met

ninhydrine of een andere kleurstof

Bepaling van de aminoterminus- Fred Sanger- gebruik van stoffen die een stabiele covalente binding aangaan met de vrije aminoterminus- zure hydrolyse levert een veranderend NH2-terminaal residu op dat door

ionenuitwisselingschromatografie kan worden geïdentificeerd- Sangerreagens: fluorodinitrobenzeen

Bepaling van de aminozuurvolgorde Edman-degradatie- verbinding gevormd tussen de aminoterminus van het eiwit en de stof fenylisothiocyanaat- in licht zure omstandigheden splitst alleen het NH2-terminale aminozuurderivaat af, waarbij een

fenylthiohydantoïne-ring (FTH) ontstaat- nieuwe aminoterminus kan in een volgende ronde met fenylisothiocyanaat reageren- verschil met Sanger: geen agressieve zure hydrolyse, maar lichte hydrolyse waarbij alleen het

hydantoïnederivaat ontstaat- de sequentiebepaling vindt plaats op een zuivere eiwitfractie- alle eiwitmoleculen behouden tijdens de sequentiebepaling synchroon dezelfde opeenvolgende

aminotermini- met moderne geautomatiseerde apparaten = sequenators: van zeer kleine hoeveelheden zuiver eiwit

sequentie van enkele 10tallen opeenvolgende aminozuren te achterhalen

Selectieve proteolyse- bij elke volgende ronde van Edman-degradatie neemt de ruis een beetje toe en het signaal een beetje

af (synchrone status van de afzonderlijke eiwitmoleculen is niet perfect)- eiwit eerst in kleinere fragmenten splitsen en dan van elk fragment wordt de aminozuursequentie

bepaald

- cyanogeenbromide (CNBr): verbreekt alleen peptidebindingen aan de carboxyterminale zijde van methionineresidu’s (methionine is vrij zeldzaam in eiwitten)

- trypsine: spijsverteringsenzym, knipt peptideketen uitsluitend aan de carboxyterminale zijde van arginine- of lysine-residu’s

- de verkregen eiwitfragmenten worden via HPLC van elkaar gescheiden en daarna wordt via Edman-degradatie de aminozuursequentie van elk fragment bepaald

- om volgorde van fragmenten te kennen overlappende eiwitfragmenten die met andere knipmethode werden gemaakt (vb eerst CNBr en dan trypsine)

Families van eiwitten:- haem-dragende zuurstoftransporteiwitten: globines- serine proteasen: trypsine, chymotrypsine, thrombine en plasmine- secretie-eiwitten bevatten aan aminoterminale kant een signaalsequentie die bestaat uit een 20-tal

hydrofobe residu’s- transmembranaire eiwitten bevatten 1 of meerdere hydrofobe stukken van 20-tal residu’s

Bekende aminozuursequenties maken van antilichamen tegen het eiwit, vertalen van aminozuursequentie in waarschijnlijke nucleotidensequentie om een synthetisch oligonucleotide te vervaardigen dat gebruikt kan worden als probe in moleculair biologisch onderzoek

Synthetische oligopeptiden- omgekeerde weg van machinale polypeptideafbraak van sequencing = solid phase methode van

Merrifield - via organisch-chemische synthese specifieke oligopeptiden met een maximale lengte van ongeveer 40

aminozuren kan synthetiseren- principe: groeiende peptideketen tijdens de synthese geïmmobiliseerd zodat alle reacties zich afspelen

in een kleine kamer die tussen de ahtereenvolgende koppelingscycli grondig gewassen wordt- telkens wordt 1 specifieke peptidebinding gevormd doordat de gewenste COO—groep van het aan te

koppelen aminozuur is geactiveerd met DCC (dicyclohexylcarbodiimide) terwijl alle overige groepen chemisch zijn afgeschermd met t-Boc (tertbutyloxycarbonyl)

- door zachte hydrolyse komt het uiteindelijke polypeptide los van de vaste drager en kan het met HPLC van onzuiverheden worden gescheiden

- belang in het medisch-biologisch onderzoek en in de geneeskunde:o met deze peptiden specifieke antilichamen maken (peptide wel gekoppeld aan drager)o als synthetisch hormoono synthetische peptide-analogen als geneesmiddelen met een betere werking

Een verandering in de gezondheidstoestand gaat vaak gepaard met veranderingen in de biochemische samenstelling van het extracellulair vocht bloedafname is daarom een belangrijk middel om biologische en biochemische criteria van gezondheid of ziekte bij de mens vast te stellen

Extracellulaire vochten:- bloed(plasma)- lymfe- interstitieel vocht- cerebrospinaal vocht (bijzondere vorm van interstitieel vocht in het centraal zenuwstelsel)

Bloed bestaat uit een cellulaire component en een vloeistofcomponent die van elkaar gescheiden worden dankzij sedimentatie en centrifugatie- beiden nemen normaal 50% van het totale bloedvolume in- bepalen van het celvolume-aandeel in het bloed (hematocriet) is een belangrijk routinebloedonderzoek

Plasma is de vloeistoffase die overblijft wanneer men de bloedcellen verwijderd via centrifugatie uit onstolbaar gemaakt bloed

Als men vers bloed laat stollen:- klonter opgebouwd als een netwerk van onoplosbaar fibrine waarin de bloedcellen gevangen zitten- de lichtgele bovenstaande vloeistof = serum lichtgele kleur is afkomstig aan het opgelost bilirubine

(afbraakproduct van haem)

Lymfe en interstitieel vocht zijn relatief arm aan grotere eiwitten en bevatten normaal geen rode bloedcellen

Bij bloedafname moet men er rekening mee houden dat de cellulaire component een invloed kan hebben op de biochemische eigenschappen van de niet-cellulaire fase, vb: Hemolyse (artefact waarbij rode bloedcellen openbarsten) hemoglobine en kalium in plasmafase kunnen door glucoseopname en –metabolisme de plasmaglucosespiegel doen dalen

Plasma-eiwitten zorgen voor een groot aandeel van biomoleculen in het bloed- verschil tussen plasma en serum: in plasma is er nog fibrinogeen aanwezig- plasma- of serumeiwitten worden van elkaar gescheiden mbv elektroforese

Serumeiwitten:- albumine (54-58%)- 1-globulinen (6-7%)- 2-globulinen (8-9%)- -globulinen (13-14%) : verzameling van plasmaeiwitten met een elektroforetische mobiliteit van de -

globulinegroep- -globulinen (11-12%)

Albumine- 66kDa- opgebouwd uit 1 enkele polypeptideketen (580 AZ-residu’s)- meest vertegenwoordigde eiwit in serum en een van de kleinste serumeiwitten draagt bij tot de

osmotische druk van het plasma- in mindere mate aanwezig in interstitieel vocht oncotische druk (microcirculatie)- afgeronde elliptische vorm geeft relatief kleine viscositeit aan bloed (gunstig omdat dit van het hart

een relatief geringe inspanning vraagt- fysiologische rol in het transport van sommige apolaire biomoleculen door de bloedbaan (vb vrije

vetzuren en bilirubine, steroidhormonen, tryptofaan)o vrij vetzuurtransport: belangrijk tijdens periode van vasten waarbij vetcellen hun triglyceriden

afbreken tot glycerol en vetzuren vetzuuren naar lever waar via endocytose opgenomen in parenchymcellen

- analbuminemie: hoeveelheden cholesterol, triglyceriden en fosfolipiden in het bloed zijn gestegen (erfelijke ziekte)

- bindt ook geneesmiddelen (penicilline, coumarinederivaten, aspirine …) farmacokinetiek van geneesmiddelen

- aangemaakt en gesecreteerd door de parenchymcellen van de lever plasmaconcentratie van dit eiwit daalt bij ernstige leverziekten (levercirrhose)

- hypoalbuminemie: verlies van albumine in de urine (albuminurie) met als gevolg oedemen (verlaagde oncotische druk in capillairen leidt tot verhoogde vloeistofstroom vanuit de bloedvaatjes naar de interstitiële ruimte vochtopstapeling)

o vb bij ontstekingsreactie van de glomerulus waarbij de membraan gaat lekken (= nefrotisch syndroom)

o vb bij chronische eiwitmalnutritie (ontwikkelingslanden)

-globulinen:- uiteenlopende functies- retinol binding proteïn (vormt een complex met transthyretine vermijden van verdwijnen in urine),

TBG (thyroxine binding globuline) en transcortine: 1-globulines die functioneren als specifieke transporteiwitten (retinol=vitamine A, thyroxine en cortisol)

- ceruloplasmine en haptoglobulinen: 2-globulines, specifieke transporteiwitten o ceruloplasmine: glycoproteïne dat koperionen vervoerd, rol in regulatie van ijzertransporto haptoglobulinen: specifiek vrij hemoglobine binden dat ontstaat door intravasculaire hemolyse

niet gebonden circulerend hemoglobine wordt door glomeruli in nier doorgelaten wat leidt tot nierschade en verlies van ijzer (heterogeniteit quaternaire structuur van lichte - en zware -ketens)

- serine protease inhibitors (antithrombine III en 2-antiplasmine)o 2-macroglobuline dat allerlei ongewenste proteolytische activiteit in het bloed remto 1-antitrypsine remt elastase dat vrijkomt wanneer fagocyterende witte bloedcellen hun

secretiegranulae exocyteren (gaat overdreven werking van elastase tegen)

-globulinen:- transferrine: transporteiwit voor Fe3+-ionen in de bloedbaan (2-3 gram/liter), gehalte stijgt bij patiënten

met ijzertekort (normaal 30% van bindingsplaatsen bezet, bij ijzertekort neemt dit percentage af)- hemopexine: bindt specifiek vrije haemgroepen , vooral belangrijk bij overdreven intravasculaire

hemolyseo complex haem-hemopexine wordt opgenomen in Kupfercellen van de lever waar het ijzer

wordt gerecupereerd- 2-microglobuline: in zeer lage gehaltes in serum, vormen invariabele lichte-keten-component van

klasse I-HLA (Human Leucocyte Antigen, polymorfe groep membraaneiwitten)- C-reactive proteïn (CRP): normaal in kleine hoeveelheden, gehalte stijgt sterk in acute fase van

infectieziekten (acute fase eiwit)

Enzymen komen bij veel lagere concentraties in het bloed voor, in sommige pathologische omstandigheden gepaard met weefselschade intracellulaire enzymen in bloed

Hormonen zijn ook vaak serumeiwitten, vaak in zeer lage concentraties: vb insuline

RUIMTELIJKE EIWITSTRUCTUUR

röntgendiffractie en 2D NMR spectroscopie

De ruimtelijke eiwitstructuur over korte afstand = secundaire structuur

Röngendiffractie-analyse van oligopeptiden door Pauling en Corey info over manieren waarop een lineaire polypeptideketen zich over korte afstand kan oprollen- peptidebinding is vrij stijve 2D-structuur waarbij carbonyl-zuurstof en amino-waterstof in transpositie

tegenover elkaar liggen- beide centrale koolstofatomen hebben el een zekere rotatievrijheid

-helix- rechtsdraaiende spiraal van de peptideketen- CO-groep van aminozuur 1 vormt een H-brug met de NH-groep van een aminozuur 4 plaatsen meer

naar het carboxyterminaal

- per winding zijn er gemiddeld 3,6 aminozuurresidu’s overspannen 1 AZ roteert ong 100° tov zijn buren

- zijketens van de aminozuurresidu’s liggen loodrecht op lengteas van de helix en wijzen naar buiten toe- in een aantal proteïnen betrokken bij vormgeving of verdeling van trek- en drukkrachtveld in of tussen

cellen: -helix gedeelten zeer uitgestrekt en vormen meerdere naast elkaar gelegen moleculen als het ware gevlochten kabels die heel wat kracht kunnen opvangen (vb: myosine, keratine in huid en haar, fibrine in bloedklonters)

-vouwblad- vlakke structuur waar de polypeptideketen bijna volledig uitgerekt is- talrijke H-bruggen tussen CO- en NH-groepen van aminozuren die ver van elkaar liggen, vaak zelfs op

verschillende polypeptideketens- parallel -vouwblad: verschillende peptideketens lopen in dezelfde richting- anti-parallel -vouwblad: in tegengestelde richting- aminozuurzijketens steken naar boven en onder het vlak van het vouwblad uit- vb: zijde-fibroïne geeft stevigheid en elasticiteit aan zijde (verschillende uitgestrekte vouwbladen op

elkaar gestapeld)- -draai: richting van polypeptide draait plots 180° waarna er een stukje anti-parallelle -structuur

ontstaat (dikwijls door prolineresidu)

Collageenhelix = triple helix- uniek voor collageen (bindweefseleiwit)- zeer hoog gehalte aan glycine, proline en post-translationeel gewijzigd hydroxyproline (motief Gly-Pro-

X met X vaak hydroxyproline)- linksdraaiende helix met precies 3 residu’s per winding- 3 polypeptideketens kunnen zeer dicht bij elkaar komen doordat de glycines met hun zeer kleine

zijketen naar de gemeenschappelijke lengte-as uitsteken en de (hydroxy)prolines radiaal uitsteken

Supersecundaire structuur = typische motieven van ruimtelijke conformaties in iets uitgebreidere gebieden (vb bundels van -helix of raamwerken van parallele of anti-parallele -vouwbladen) vormen soms domein in het eiwit

Volledige ruimtelijke structuur van de polypeptideketen = tertiaire structuur

Gebieden in de polypeptideketen met minder regelmatige conformatie = random coil

Aminozuurresidu’s in onregelmatige bochten aan de oppervlakte van het eiwit zijn evolutionair minder geconserveerd

Binnen een bepaalde eiwitfamilie is de homologie in tertiaire structuur doorgaans groter dan de homologie in de primaire structuur

De ruimtelijke structuur van eiwitten met verschillende subeenheden = quaternaire structuurElk afzonderlijk polypeptide wordt subeenheid genoemd

Hemoglobine:- eiwit dat zuurstof transporteert in de rode bloedcellen- heterotetrameer: structuur met 4 subeenheden waaronder tenminste 2 verschillende soorten

subeenheid- de 2 soorten subeenheden behoren tot de globinefamilie (zoals myoglobine zuurstofdragend eiwit

in spierweefsel)

Fibreuze eiwitten- grote supramoleculaire netwerken

- vezelachtige structuren- belangrijke mechanische rol

o collageen bindweefselo elastine wand bloedvateno keratine huid en haar

Fibroïne- eiwit dat de zijderups gebruikt om zijde te spinnen voor een cocon- rijk aan glycine (45%), alanine (29%) en serine (12%) uitgestrekte regio’s van anti-parallele -

vouwbladen (alternerend gly-X) verschillende bladen mooi dicht opeen stapelen (heel wat niet-covalente interacties op korte afstand

Keratines- -keratines structurele rol in haar- velee polypeptideketens liggen evenwijdig gerangschikt in een vezel- elke afzonderlijke polypeptideketen vormt een langgerekte -helix- 3 -helixen draaien om elkaar heen = protofibril- bundels protofibrillen interageren parallel tot een microfibril en vele microfibrillen vormen

macrofibrillen- talrijke stabiliserende H-bruggen- afzonderlijke polypeptideketens covalent aan elkaar gebonden via een netwerk van S-S-bruggen =

cross-links

Collageen:- meest voorkomende eiwit in het lichaam van hogere dieren- vormt wateronoplosbare eiwitkabels die weerstand bieden aan mechanische trekkrachten

mechanische stevigheid- extracellulair bindweefseleiwit, in praktisch alle weefsels- meer dan 10 verschillende collageensoorten beschreven met een weefselspecifiek distributiepatroon,

elk type collageen bezit een gelijkwaardige ruimtelijke structuur- primaire structuur: repetitieve sequentie met glycine en proline secundaire structuur: collageenhelix- 3 collageenhelixen vormen samen de triple helix procollageen (voorlopereiwit van collageen) door

weefselvormende cellen zoals fibroblasten aangemaakt en buiten de cellen gebracht via secretie- in extracellulaire ruimte zullen de ‘losse staartjes’ aan de carboxy- en aminoterminale uiteinden van

procollageen worden afgeknipt tropocollageen- vele H-bruggen tussen de ketens van de triple helix en de dichte toenadering van de ketens waardoor

er van der Waals interacties zijn, veroorzaken een vrij stijve, staafvormige molecuul (totale lengte 300 nm)

- vele tropocollageen moleculen liggen parallel gerangschikt in een collageenvezel, waarbij koppen en staarten van naburige moleculen ongeveer 67 nm tov elkaar verschoven zijn

- de gaten tussen de tropocollageen bouwstenen (40 nm) zijn waarschijnlijk nucleatieplaatsen voor de afzetting van calciumzouten (hydroxyapatiet) in bot-collageen

- cross-links: tussen lysines en hydroxylysineso lysines worden eerst door het enzym lysyl-oxydase omgezet tot lysine-aldehyde (allysine)o 2 allysineresidu’s of een lysine- en een allysineresidu condenseren tot een cross-linko verschillende lysine- en allysineresidu’s aan de carboxy- en aminoterminale uiteinden van

tropocollagen condenseren tot een complexe cross-link die een brug vormt tussen 2 afzonderlijke tropocollageen moleculen collageenvezel verstevigd

o vb: in collageen type I van menselijke achillespees veel meer cross-linking dan in huid- enzymatische afbraak door collagenasen die peptidebindingen in het tropocollageen openknippen

o pathologische collagenase: bacterie clostridium histolyticum (verwekker van gangreen, een zeer invasieve weefselinfectie) in onderzoekslabo’s gebruikt om weefselstukken te verteren tot losse cellen of celklompjes

o fysiologisch type collagenase: door fibroblasten gebruikt tijdens perioden van weefselmodellering (embryogenese of wondheling) knipt tropocollageen slechts op enkele specifieke plaatsen door

Globulaire eiwitten- compacte, wateroplosbare bolvormige eiwitten- diverse functies: katalyse, transport, signaaloverdracht, genexpressie, verdediging- de meeste polaire aminozuurzijketens steken naar de buitenkanten van het eiwit uit terwijl de apolaire

residu’s in de diepte van het eiwit liggen begraven en via van der Waals-interacties kunnen interageren- ook regelmatige secundaire structuren (-helix, -vouwblad) vooral in de diepte omdat de polaire

backbone-groepen verbonden zijn door H-bruggen en dus geen interactie meer kunnen aangaan met water

- hydrofobe effect is een van de grootste drijfveren voor het spontaan oprollen van globulaire eiwitten in een waterige omgeving

- andere stabiliserende krachten: ionbindingen, S-S bruggen, H-bruggen

Cytochroom c:- hydrofobe effect: hydrofobe en hydrofiele aminozuurresidu’s liggen door elkaar heen in de primaire

eiwitstructuur, in de tertiaire structuur liggen de hydrofobe aminozuurresidu’s echter in de diepte van het eiwit begraven en de hydrofiele aminozuurresidu’s aan de oppervlakte van het eiwit

- bevat relatief veel stukjes -helix zowel aan oppervlak als in de diepte- centraal in het eiwit ligt een hydrofobe niet-eiwitstructuur: haemgroep haem = platte ringvormige

structuur, waarmee cytochroom c zijn functie uitoefent, centraal in de ringstructuur zit een ijzeratoom (geïoniseerd en covalent verbonden met 2 aminozuurzijketens van de polypeptideketen (his-18 en met-80)

- tertiaire structuur is evolutionair zeer goed geconserveerd- het ijzerion wordt gereduceerd en geoxideerd tijdens een redoxreactie die als doel heeft om elektronen

door e geven in de mitochondriale ademhalingsketen. Door deze elektronenstroom is de mens in staat om biochemische brandstoffen aëroob te verbranden

Immunoglobulinen- antilichamen herkennen en opruimen van lichaamsvreemde structuren (herkenningsmechanisme:

dichte wederzijdse toenadering)- basisstructuur: Y-vormig molecuul dat is opgebouwd uit 2 paren polypeptideketens die aaneenhangen

dankzij S-S-bruggen en niet-covalente interactieso zware ketens en lichte ketens met moleculair gewicht van 50 en 25 kDao centrale as: carboxyterminale helft van de beide zware ketenso lichte keten gaat interacties aan met telkens de aminoterminale helft van 1 zware keten

- er bestaan 5 verschillende immunoglobuline klassen (IgA, IgG, IgD, IgE en IgM) met telkens 1 bepaald type zware keten (, , , of )

- er bestaan 2 soorten lichte ketens ( of )- IgM:

o circulerend antilichaam o vroege fase van immuunresponso herkennen van antigenen met een zich herhalende structuur

- IgGo grootste fractie van de circulerende immunoglobulineso veel grotere specificiteit van de antigeen herkenningo kan door complexvorming gevaarlijke stoffen neutraliseren (vb neutralisatie van het

tetanostoxine van de bacil Clostridium tetani en neutralisatie van het poliovirus)o het constant gedeelte van IgG kan verschillende effectormechanismen in gang zetten

opsonisatie: het door IgG gebonden virus of bacterie wordt gemakkelijker gefagocyteerd door macrofagen of monocyten

activatie van het complementsysteem: cascade van proteolytische eiwitreacties die leiden tot het vrijkomen van ontstekingsbevorderende factoren en tot het doorboren van de met IgG beklede celmembraan

- IgAo antilichaam van de secretievloeistoffeno relatief resistent tegen proteaseno dimeer, naast zware en lichte ketens een aparte secretory componento verdediging tegen infectieziekten thv de slijmvliezen o via de moedermelk aan de zuigeling gegeven

- IgD: integraal eiwit in de membraan van lymfocyten- IgE

o in zeer lage concentraties in het serumo gehalte is gestegen bij allergische patiënteno bindt om mastocyten en veroorzaakt secretie van vasoactieve stoffen zoals histamine (wanneer

in sterk overdreven mate in bloed anafylactische shock)- mbv proteolytische enzymen zoals papaïne kan een immunoglobuline gesplitst worden in een constant

gedeelte (Fc) dat bestaat uit een doormidden gebroken zware-ketenpaar en 2 variabele fragmenten (Fab) die bestaan uit de andere helft van 1 zware keten samen met 1 lichte keten antigeen bindt in groeve (antigeen-bindende sites) aan het uiteinde van de Fab fragmenten

- variaties aan de carboxyterminale helft van de lichte en zware ketens komen veel minder voor, maar de aminoterminale gedeelten van zowel lichte als zware ketens vertonen kleine regio’s van enorme variabiliteit

o in primaire structuur = hypervariabele regio’so ruimtelijke eiwitstructuur = complementariteit-determinerende regio’s (CDR’s)

- antigeen-bindende sites: o afgegrensd door de aminozuurzijketens die zich bevinden in de bochten van 6 CDR’s (3 van

lichte en 3 van zware keten)o vooral apolair verhindert het binnendringen van watero plaatsspecifieke groepen die via de niet-covalente interacties bijdragen tot bindingsstrekte met

het antigeen- globale ruimtelijke structuur: elk van de 4 ketens is opgerold in een klein aantal compacte domeinen =

immunoglobuline vouw 2 anti-parallelle -vouwbladen die interacties met elkaar aangaan door talrijke hydrofobe interacties en S-S-bruggen

- geconserveerde domeinstructuur wordt bepaald door regelmatige secundaire structuur, terwijl variatie ontstaat door veranderde aminozuurzijketens in onregelmatige lussen

Het bewijs dat de primaire structuur van een polypeptideketen alle informatie bevat voor de vorming van de correcte 3D eiwitstructuur en eiwitfunctie: Anfinsen die het enzym Rnase bestudeerde- denaturatie van ribonuclease mbv hoge concentraties ureum dat de niet-covalente interacties binnen

de peptideketen verbreekt- verdere denaturatie door toevoegen van -mercaptoethanol dat de covalente S-S-bruggen verbreekt

door reductie van de zwavelgroepen polypeptideketen in radom coil conformatie (geen 3D organisatie meer, maar zeer flexibele en variabele conformatie

- gedenatureerd Rnase geen enkele biologische activiteit- denaturatie is reversibel en enzymatische activiteit van het gedenatureerde preparaat kan herwonnen

worden door de denaturerende agentia via dialyse te verwijderen en her-oxidatie van de cysteïnes- oprollen tot de juiste rumtelijke structuur = renaturatie

De sequentie van zijketens op een eiwit of nucleïnezuur bevat informatie voor de 3D structuur en dus voor de functie. Basisprincipes:

- hydrofobe en hydrofiele aminozuurresidu’s door elkaar in primaire eiwitstructuur, maar in tertiaire structuur liggen de hydrofobe aminozuren vooral in de diepte van het eiwit begraven en de hydrofiele aminozuren aan de oppervlakte

- polaire of geladen aminozuurzijketens kunnen paarsgewijs of in netwerkverband sterkere bindingen in de diepte van het eiwit maken

- S-S-brugen stabiliseren deze interacties (gevormd nadat het eiwit zich ruimtelijk goed heeft opgerold)

Het oprollen van kleine eiwitten gebeurt spontaan, wordt op vele plaatsen tegelijk geïnitieerd waarbij het systeem trapsgewijs van een hoge energietoestand naar een lage toestand vervalt ontstaan van lokale secundaire structuren

Ribonuclease T1 - klein eiwit met enkele S-S-bruggen in de primaire structuur- Stabiliserende krachten: 4 S-S-bruggen, 90 intramoleculaire H-bruggen en ongeveer 85% van de

hydrofobe aminozuurzijketens begraven in het binnenste van het eiwit- -helix aan het ene oppervlak van het eiwit en een anti-parallel -vouwblad aan de andere zijde- val in vrije energie tijdens het oprollen van het eiwit in waterig midden is vrij laag (verbreken van 1

covalente C-C-binding vraagt 16x meer energie)- invloed van pH op conformationele stabiliteit is klein rol van elektrostatische krachten tussen

geladen aminozuurzijketens als verwaarloosbaar- grootste stabiliteit bij iso-elektrisch punt

Grotere eiwitten hebben hulp nodig van begeleidermoleculen op te kunnen opvouwen: moleculaire chaperons:- evolutionair sterk geconserveerde eiwitten- hsp70 familie: herkennen in een juist aangemaakt eiwit de lokale hydrofobe raakvlakken in secundaire

structuren, door op deze structuren te binden, verhinderen deze chaperones dat het eiwit zich voortijdig slecht opvouwt

- hsp60 familie: helpt het eiwit ten koste van ATP-hydrolyse verder opvouwen- hsp heat shock proteïn: komen veel voor in door verhitting beschadigde cellen

Proteïnen functioneren meestal dankzij hun binding aan 1 of meerdere voor hen specifieke moleculen. De gebonden stof noemt men ligand.

Na binding van het ligand kunnen er kleine lokale verplaatsingen van eiwitgroepen optreden die secundair tot gevolg hebben dat de algehele eiwitstructuur verandert. Wanneer deze structuurverandering een extra goede ruimtelijke complementariteit tussen eiwit en ligand tot gevolg heeft, spreekt men van induced fit

De werking van het eiwit vergt soms een belangrijke ruimtelijke structuurverandering die optreedt nadat het ligand is gebonden: vb: receptoren voor peptidehormonen in de plasmamembraan wanneer ligand specifiek op de receptor gebonden is, ondergaat de receptor een structuurverandering die zich uitbreidt tot de zijde van de receptor die in contact is met het cytoplasma

Veel eiwitten bevatten ook speciale bindingsplaatsen voor regelende liganden die een conformatieverandering en dus een gewijzigde functie veroorzaken

De alternatieve ruimtelijke toestanden van het eiwit = allosterie

Myoglobine en hemoglobine:- zuurstof opslag en transport in spieren en zuurstoftransport in rode bloedcellen- zuurstof bindt aan haem (platte ringvormige apolaire niet-eiwitstructuur) = prosthetische groep- in centrum van ring: Fe2+-ion dat een zuurstofmolecuul kan binden - haemgroep is covalent gebonden met het eiwitgedeelte via his-F8, een tweede histidine bepaalt de

hoek waarmee zuurstof aan haem kan binden

- ijzer in vrije haemgroep wordt onmiddellijk door O2 geoxideerd tot Fe3+ kan niet langer zuurstof binden polypeptideketen belet oxidatie

- geometrie (his-E7) zorgt voor een sterische belemmering voor het binden van CO op de haemgroep

Myoglobine:- eerste eiwit waarvan de ruimtelijke structuur met Angstrom resolutie werd bepaald- zuurstof opslaan in spieren- 75% uit -helix die in het eiwit loopt als 8 korte staafjes- in 4 gevallen wordt een stuk helix onderbroken door een proline knik- erg compact eiwit, in diepte vooral hydrofobe aminozuren (Leu, Val, Met, Phe) binden van apolaire

haemgroep- 2 uitzonderlijke polaire residu’s in de diepte: his E7 en F8 binding van haem en vorming van de

bindingsholte voor zuurstof- zuurstof bindt in hydrofobe spleet van myoglobine op het centrale ijzerion van de haemgroep

Hemoglobine- fysiologische zuurstofdrager van de rode bloedcellen- quaternaire eiwitstructuur: 4 globineketens met elk een zeer gelijkwaardige 3D structuur als

myoglobine- elk van de ketens bezit de compacte ruimtelijke vorm met vooral -helix en een haemring die

gebonden is tussen his E7 en F8 in een centrale apolaire ruimte- hemoglobine A (HbA): structuur ()2 interacties tussen de 4 ketens in hemoglobine zorgen voor

allosterie-

o oxygenatietoestand van myoglobine is op hyperbole wijze afhankelijk van de partiële zuurstofdruk, partiële zuurstofdruk waarbij 50% van de myoglobine verzadigd is met zuustof is ongeveer 1 mm Hg (lager dan zuurstofspanning in bloedvaten van spieren)

o hemoglobine in de rode bloedcellen vertoont een sigmoïdale verzadigingskromme met een veel lagere affiniteit van Hb voor zuurstof (p50 HbA is ongeveer 30 mm Hg hoger dan partiële zuurstofspanning in capillairen in spieren zuurstof laat Hb los minder dan 50% van Hb verzadigd)

o vrijgekomen O2 zal naar spiercellen diffunderen en daar binden op Mb- 2 belangrijke kenmerken van allosterie in de hemoglobine-zuurstof interactie: coöperativiteit en

regelbaarheid van de binding o in totaal kunnen 4 moleculen O2 binden op 1 molecuul Hb binding van eerste molecuul O2 op

Hb is het moeilijkst coöperativiteit: interactie tussen de 4 subeenheden vooral thv de raakvlakken tussen 12 en 21 subeenheden: H-bruggen verbroken en nieuwe H-bruggen gevormd

binding O2 op haemring F8-his-zijketen naar haemring getrokken F-helix wijzigt in structuur via raakvlakken wordt conformatie doorgegeven aan andere subeenheden F-helixen

in andere 3 ketens ook verplaatsen = homo-allosterieo regelbaar door fysiologische moleculen: heteroallosterie kleine organische zuur 2,3-

difosfoglyceraat (DPG) dat in rode bloedcellen wordt geproduceerd DPG is sterk negatief geladen bindt krachtig in nis die gevormd wordt door de 2 -subeenheden van Hb

(elektrostatische bindingen met pos. geladen aminotermini van ketens en zijketens Lys-82 en His-143

stabiliseert de deoxy-Hb conformatie

binding zuurstof op haem allosterische vormverandering in Hb spleet tussen -ketens nauwer

DPG moet bindingsplaats verlaten, verdringen kost energie ( affiniteit van HbA voor zuurstof is laag)

Foetaal hemoglobine (HbF):- bevat 2 -ketens- heeft minder krachtige bindingsplaats voor DPG his-143 is vervangen door serine- zuurstofaffiniteit van HbF is groter dan die van HbA zuurstof kan door de placenta heen worden

overgedragen van moederlijk naar foetaal bloed

Hemoglobine bindt zuurstof liever in arterieel bloed dan in veneus bloed veneus bloed bevat relatief hoge CO2 en H+ concentraties en dit zijn allosterische liganden die de desoxy-conformatie van Hb bevorderen ten koste van de oxy-conformatie = Bohr-effect HbO2 laat zuurstof los in capillairen waar CO2

en H+ vrijkomen, omgekeerd in longen (Haldane effect)

Elastine- elasticiteit van de bloedvatwanden- ontstaan als fibreuze (wateronoplosbare) structuren doordat afzonderlijke elastinemonomeren (pro-

elastine) intensief zijn verbonden via cross-links- typische brug in elastine: desmosine

o condensatie van 4 lysineresidu’so secundaire structuur tussen desmosinebruggen: vooral -spiraal, maar ook random coil

- bij uitrekken van elastine worden de polypeptideketens vooral thv de -spiraal meer lineair- afgebroken via elastasen (vb uit witte bloedcellen die circuleren in capillairen) = enzymen die de

peptidebindingen in de elastineketen doorknippen- grootste deel van elastase wordt onmiddellijk geremd door een eiwit-inhibitor of 1-antitrypsine- rokers: grotere hoeveelheden witte bloedcellen in longweefsel meer elastase wanneer aanmaak

van nieuwe elastase de afbraaksnelheid niet kan volgen, daalt de elasticiteit van de long en kan een pathologische toestand (emfyseem) ontstaan

Koolstofmonoxidevergiftiging- CO is een kleurloos, reukloos en niet-irriterend gas dat vrijkomt door de onvolledige verbranding van

kolen, hout of andere brandstoffen- CO is een van nature in de mens voorkomende stof, die in zeer kleine hoeveelheden ontstaat bij de

afbraak van haem tot bilirubine (vermoeden: bij zeer lage concentraties in hersenen een natuurlijke functie als neurotransmitter)

- toxische eigenschappen CO: zeer sterke binding van het gas aan Hb en in mindere mate door binding op het myoglobine in spieren (carboxyhemoglobine) defect in het zuurstoftransport met weefsel hypoxie als gevolg

- CO remt afgifte van zuurstof door oxyhemoglobine- affiniteit van CO voor Hb is ongeveer 200 maal groter dan die voor O2

- symptomen: o bij lucht waarin 0,01 – 0,03% CO: geleidelijk opkomende kloppende hoofdpijn, misselijkheid en

brakeno meer dan 0,1% CO: slachtoffer volkomen verrast, ‘slaapt’ inmiddelijk ino kersrode kleur van de huid en slijmvliezen keur van carboxyHb

- behandeling: onmiddelijke beluchting met verse lucht, patiënt moet stil blijven liggen, eventueel inademen van zuivere zuurstof

- bij ernstige gevallen zullen neurologische stoornissen blijven bestaan (sequelen)

Sikkelcel bloedarmoede- puntmutatie in het -globine gen op chromosoon 11: glutamaatresidu vervangen door apolaire valine- sickle cell trait: heterozygoot, niet of nauwelijks ziek omdat ongeveer 50% HbA in rode bloedcellen- sikkelcel bloedarmoede verkorte levensduur van rode bloedcellen, chronische bloedarmoede en

acute aanvallen met infarcten in diverse organen (milt, bot)- praktisch al het hemoglobine in de rode bloedcellen is opgebouwd uit 2 normale -ketens en 2

abnormale -ketens (HbS), daarnaast is er een variabele hoeveelheid HbF- aminozuursubstitutie van de -keten manifesteerd zich aan het oppervlak van het eiwit waarbij de

polaire glutamaat-zijketen vervangen is door het apolaire valine- in desoxyHb bestaat er voor dit apolaire uitsteeksel een complementaire apolaire bindingsgroeve

polymeren- HbS-polymeren groeien aan tot dikke kabels met mechanische stijfheid rode bloedcellen vervormen

tot kenmerkende sikkelvormige toestand gaan sneller stuk in bochtige en nauwe capillairen chronische bloedarmoede

- in een acute crisis ontstaan er in een korte tijd grote aantallen sikkelcellen die de haarvaten verstoppen vicieuze cirkel met stijgend zuurstoftekort in de weefsels en verdere sikkelcelvorming infarct van het weefsel met sterte van de stikkende cellen

- diagnose: door de aminozuursubstitutie is de nettolading van het eiwit afgenomen met 2 negatieve eenheden iso-elektrisch punt van het eiwit toegenomen van ong 6,8 naar 7 (vaststellen via iso-elektrische focussing of kolomchromatografie) (nu via vruchtwaterpunctie of chorionvlokkenbiopt genotype onderzoeken)

- Behandeling: vooral symptomatisch: acute aanvallen worden bestreden met pijnstillers en transfusies

Immuno-assay: de specifieke binding van immunoglobulines aan welbepaalde antigenen wort gebruikt in een aantal technieken om 1 bepaald eiwit op te sporen en de concentratie ervan te meten vaak zeer specifiek en zeer gevoelig- afhankelijk van de beschikbaarheid van een specifiek antilichaam- antigeen:

o biochemisch gezuiverd of moleculair biologisch verkregen eiwito oligopeptide-onderdeel van het eiwit synthetiseren en dit koppelen aan een immunogeen

standaardeiwit na paar weken in bloed van geïmmuniseerde proefdier een mengsel van verschillende antilichamen die onderdelen van het eiwit herkennen = polyklonaal antilichaam

- specifieke antilichamen kunnen uit het serum gezuiverd worden door een immuno-affiniteitschromatografie met geïmmobiliseerd antigeen in de kolom

- Milstein en Köhler: in vitro via celculturen van tumorale immunoglobuline-secreterende cellen een kloon cellen selecteren die het gewenste antilichaam produceert = monoklonaal antilichaam

- scheiden van antiserum en eiwit: antilichaam-antigen complexen precipiteren of adsorberen aan een oppervlak

- antilichaam-antigen complexen detecteren en kwantificeren: o western blot en radio-immuno)assay radio-isotopeno enzyme-linked-immuno-sorbent-assay enzym dat een kleurreactie katalyseerd

Western blot: scheidingsvermogen van gelelektroforese + specifieke herkenningsvermogen van antilichamen- na de SDS-PAGE worden de op molecuulmassa gescheiden eiwitten vanuit de gel kwantitatief

overgebracht (via capillaire vloeistofstroom of door elektrisch veld) op de oppervlakte van een nylon of nitrocellulose membraan (op oppervlakte talrijke polaire en apolaire groepen die niet-covalente bindingen toelaten met eiwit)

- membraan met geblotte eiwitten wordt behandeld, zodat niet specifieke adsorptie van het antiserum wordt vermeden overmaat standaardeiwit

- de antilichamen zullen in principe slechts specifiek binden op plaatsen waar antigeen geconcentreerd is- incubatie van sterk verdunde antiserum met de membranen: in waterige oplossing bij fysiologische pH- na incubatie worden niet gebonden antilichamen grondig weggewassen

- gebonden antilichaam op de membraan detecteren: 2de antilichaam (gemerkt) dat gericht is tegen het eerste

o radioactieve methoden autoradiografie: fotografische film zwarting evenredig met de hoeveelheid vrijgekomen radioactiviteit en dus met de hoeveelheid gebonden antigeen

o Niet-radioactieve detectie: 2de antilichaam koppelen aan een enzym dat een bepaalde reactie katalyseert, vb: peroxydase dat een chemoluminiserend reactieproduct produceert

nagaan of een bepaald eiwit aanwezig is in een biologisch monster en ruwe kwantificatie door meting van de intensiteit van het fotografische of autoradiografische signaal en als kwaliteitscriterium om na te gaan of men over een specifiek antilichaam tegen een bepaald eiwit-antigeen beschikt

Radio-immuno-assay- ontwikkeld door Yalow en Berson meting van zeer lage concentraties insuline in menselijk

bloedplasma- principe: competitie tussen radioactief gemerkt en ongemerkt antigeen voor binding op hetzelfde

antilichaam (gemerkte antigeen bindt evengoed op antilichaam)- men dient te beschikken over een antilichaam dat een beperkte en specifieke bindingscapaciteit bezit

voor het antigeen dat mens wenst te doseren: vb hormoon insuline in bloed van patiënten meten via RIA-dosering:

o componenten die nodig zijn: specifiek anti-hormoon antilichaam = Ab radioactief gemerkt hormoon (meestal 125I) = *H verdunningsreeks van bekende hoeveelheden ongemerkt hormoon = H scheidingsmethode voor (niet)gebonden hormoon en detectiestap

o na mengen *H en H ontstaat na verloop van tijd een evenwichto wanneer constante hoeveelheden antilichaam en radioactief hormoon beschikbaar zijn, dan

ziet men dat de hoeveelheid *H.Ab bij evenwicht afhankelijk is van de bijgevoegde hoeveelheid koud hormoon onderlinge competitie voor de binding op dezelfde voorraad bindingsplaatsen op de antilichamen

o competitie kwantificeren: op antilichaam gebonden radioactiviteit scheiden van vrije radioactiviteit (vb door precipitatie van de antilichamen door polyethyleenglycol)

o men verkrijgt de standaardcurve door bij een reeks bekende standaardconcentraties van koud hormoon te meten hoeveel radioactiviteit op het antilichaam gebonden blijft

- in RIA meet men altijd eerst een reeks bekende standaards zodat men de standaardcurve kan tekenen of berekenen, de hoeveelheid hormoon in onbekende monsters wordt daarna via de standaardcurve berekend uit de gemeten radioactiviteit

- RIA is een veel gebruikte techniek voor het meten van lage concentraties van hormonen in bloedplasma en voor de dosering van andere biomoleculen

- combineert hoge gevoeligheid met grote specificiteit (hoge specifieke activiteit van 125I) en het scherpe moleculaire herkenningsvermogen van antilichamen

ENZYMEN

Onder fysiologische omstandigheden verlopen de meeste biochemische reacties tussen zuivere stoffen bijzonder traag

Splitsing van een peptidebinding door een molecuul water = hydrolyse

Beginstoffen = substraten, gevormde stoffen = reactieproducten

Peptidebindingen zijn in waterige oplossing onder fysiologische omstandigheden vrij stabiel eiwitten van huid en haar zullen niet zomaar in aminozuren splitsen door contact met water

Pancreatische spijsverteringsenzymen trypsine en chymotrypsine knippen peptidebindingen in een tijdsbestek van milliseconden versnelling = katalyse

Een katalysator wordt niet stoichiometrisch tijdens een reactie verbruikt en blijft dus beschikbaar om nieuwe reacties te katalyseren

Elke chemische reactie verloopt energetisch over een soort barrière: toestand waarbij de bestaande elektronenconfiguratie van het substraat reeds gedeeltelijk verdwenen is ten koste van het begin van de nieuwe elektronenconfiguratie van het reactieproductThermodynamisch: - hoogst energetische toestand van het energiediagram van de reactie = transition state- energieverschil tussen begintoestand en transition state = activeringsenergie hoe groter, hoe trager

de reactie

Het katalytisch vermogen van enzymen activeringsenergie verlagen: chemische omgeving creëren die optimaal is aangepast aan de structuur van de transition state (= enzymen stabiliseren de chemische toestand van de transition state) door stabilisatie is het ook gemakkelijker om van de eindtoestand via de transition state naar de begintoestand te gaan (veel biochemische reacties zijn reversibel) enzymen hebben geen invloed op de ligging van het reactie-evenwicht

Actieve site- waar substraten en reactieproducten tijdelijk gebonden worden en chemische reactie versneld door

stabilisatie van de transition state- paar procent van de totale enzymstructuur- meestal kleine holte binnen in het eiwit die wordt afgegrensd door specifieke aminozuurzijketens en

door niet specifieke groepen van de peptidebackbone

Enzymen- substraatspecifiteit- hoge mate van regelbaarheid werkelijke snelheid van de chemische reactie is niet afhankelijk van de

massawet, maar van de activiteitstoestand van het enzym

De enzymatische katalyse van een biochemische reactie begint met de binding van substraat op de actieve site waarbij een enzymsubstraatcomplex (ES) gevormd wordt. Algemene kenmerken van enzymsubstraat interacties:- de actieve site bestrijkt slechts klein deel van het totale enzym (meestal een in de diepte van het eiwit

gelegen kleine ruimte met wanden die worden gegenereerd door de zijketens van enkele residu’s van de peptideketen). Soms actieve site op grensvlak tussen de subeenheden van het enzym met quaternaire structuur vaak goed afgegrensd waardoor de enzymatische reactie in een optimale fysisch-chemische omgeving kan optreden

- specificiteit van de enzymatische reactie berust grotendeels op een nauwkeurig aan het substraat aangepaste vorm van de ruimte van de actieve site verschillende atomen van substraat en enzym dicht naderen om talrijke niet-covalente interacties met elkaar aan te gaan

Chymotrypsine en trypsine- serine proteasen: hydrolyseren peptidebindingen dankzij de katalytische werking van een belangrijk

serineresidu dicht bij de actieve site- overwegend -vouwblad als secundaire structuur, 2 domeinen- door de exocriene pancreas aangemaakt als inactieve pro-enzymen (zymogenen) die in de darmholte

proteolytisch moeten worden geactiveerd voorkomt ongewenste proteolytische activiteit van nieuw aangemaakte pro-enzymen in pancreascellen

- actieve site: raakvlak beide domeinen, in centrum eiwit

- substraatspecificiteit: holte die ontstaat tussen de polypeptidelussen die -vouwblad3-4 en 5-6 verbinden

- chymotrypsine: serine, glycine en glycine vrij grote holte voor aromatische zijketen van substraat (tryptofaan, fenylalanine, tyrosine) knipt peptidebindingen naast deze aromatische zijketens

- trypsine: negatief geladen aspartaat op de bodem van de substraatbindende site positief geladen arginine- of lysineresidu’s hydrolyseert naast lysine of arginine

Elastase:- serine protease- ondiepe actieve site met een apolaire bodem bekleed met valine zijketen- knipt naast de kleine glycine of alanineresidu’s

De meeste enzymen vertonen tijdens hun katalyse enige vorm van induced fit, vb: hexokinase- zet glucose om tot glucose-6-fosfaat- na binding substraten (glucose en ATP) beweegt er een heel eiwitdomein over grote afstand tov het

andere eiwitdomein- de actieve site wordt ahw van de buitenwereld afgesloten

Kunstmatig zeer discrete veranderingen aanbrengen in 1 bepaalde aminozuurketen rond de actieve site = site-directed mutagenesis

Elk enzym heeft zijn eigen specifiek mechanisme voor katalyse, maar toch overeenkomsten:- katalyse wordt voorafgegaan door de binding van het substraat in de actieve site, doorgaans induced

fit, indien meerdere substraten dicht genoeg bij elkaar brengen in een geschikte ruimtelijke oriëntatie tov elkaar

- vrijgekomen energie van de enzym-substraat binding ruimtelijke conformatie gedwongen tot transition state

- kritische aminozuurzijketens of hulpfactoren leveren elektronen of protonen die nodig zijn voor de chemische reactie, soms tijdelijk covalente binding met het substraat

- na reactie meestal 2de transition state alvorens reactieproduct- reactieproduct laat los van enzym dat door 2de vormverandering zijn oorspronkelijke toestand weer

bereikt enzymen maken een bepaald proces mogelijk door de meest ongunstige toestand in de reactie thermodynamisch een stuk waarschijnlijker te maken

Co-factor:- hulpstof voor katalytische werking- in de buurt van de actieve site, of maken er deel van uit- co-enzymen: vaak afgeleid van stoffen uit de vitamine B groep, vormen samen met het eiwitgedeelte

(apo-enzym) het functioneel intact enzym (holo-enzym), binden vaak alleen via niet-covalente bindingen aan de peptideketen van het enzym

- metaalionen: meestal covalent gebonden- prosthetische groep: indien het co-enzym zeer vast zit aan het enzym

Serine proteasen: het substraat bindt eerst aan het enzym- serine doet een nucleofiele aanval op de carbonyl-C van de te splitsen peptidebinding, geholpen door

histidine dat een proton overneemt- positief geladen histidine wordt gestabiliseerd door negatief geladen aspartaat transition state,

waarbij carbonylgroep van de te klieven peptidebinding in een tetraëdische configuratie, carbonyl-O heeft 1 elektronenpaar extra voor zichzelf neg. gestabiliseerd door binding in speciale site van het enzym (oxanion-gat) verlaagt activeringsenergie

- peptidebinding breekt doordat histidine proton afstaat aan nieuwe aminoterminus, carboxyterminaal gedeelte van polypeptide verlaat actieve site ontstaan van acyl-enzym complex

- water neemt plaats in van verdwenen reactieproduct, histidine maakt van water een zeer nucleofiele hydroxylgroep door een proton op te nemen extra proton wordt gestabiliseerd door histidine/aspartaat, het hydroxyl-anion valt de carbonyl-C van het acyl-enzym complex aan

- er ontstaat een tetraëdische transition state, toestand wordt gestabiliseerd door binding van O—groep in oxanoin-gat

- aminoterminaal gedeelte van geknipte peptidebinding komt vrij wanneer serine proton van histidine overneemt, actieve site weer in begintoestand

Dehydrogenasen:- katalyseren redoxreacties waarbij een elektronenpaar wordt overgedragen van het ene substraat naar

het andere- in elk type is 1 van de 2 substraten enzymspecifiek, terwijl de andere vrijwel onveranderlijk is en als co-

enzym meespeelt in de actieve site 2 soorten co-enzymen:o nicotinamide adenine dinucleotide NAD+ of zijn fosfaat NADP+

o flavine adenine dinucleotide FAD elektronenpaar dat overgedragen wordt tijdens redoxreactie wordt gebonden op reactieve nicotinamide ring of isoalloxazine ring (moeten als vitaminen uit het voedsel worden opgenomen)

Lactaat dehydrogenase:- NAD-gekoppeld dehydrogenase- NADH wordt gebruikt als substraat om reducerende elektronen te leveren en als co-enzym om

transition state te stabiliseren- binding van pyruvaat (sterke elektrostatische kracht tussen carboxylgroep en positief geladen zijketen

van arginine) in een kloof van de actieve site van het enzym beweging van een lus van LDH actieve site volledig van de buitenwereld afgesloten (induced fit)

- uitsluitend L-lactaat als substraat- tijdens transition-state wordt C=O-binding van pyruvaat maximaal gepolariseerd waardoor een positief

geladen koolstofatoom en een negatief geladen zuurstofatoom ontstaat gestabiliseerd door arginine en histidine (stabiliseren negatief geladen O) en aspartaat (stabiliseert positief geladen histidine)

- tijdens reactie levert histidine een H+-ion aan de O-groep van pyruvaat terwijl NADH een hydride-ion levert aan het centrale C-atoom

- nicotinamidering van NADH ligt op correcte wijze georiënteerd dankzij hydrofobe interacties met onder andere isoleucine

- na H+/H- overdracht, ontstaan de producten L-lactaat en NAD+

- stoffen verlaten actieve site en nieuw proton zal op histidine binden

Fundamentele concepten van de enzymatische werking:- slechts enkele aminozuren in het enzym zijn kritisch voor de katalyse- substraatspecificiteit wordt veroorzaakt door bindingssites in de actieve site- de reactie wordt versneld doordat het enzym de transition state stabiliseert

Veel enzymatische reacties vertonen een hyperbolisch verband tussen de initiële reactiesnelheid en de substraatconcentratie

Steady state: geen wijziging in de hoeveelheid enzymsubstraat complex als functie van de tijd snelheid waarmee ES gevormd wordt = snelheid waarmee ES verdwijnt

Michaelis-Menten vergelijking:

- bij zeer lage substraatconcentraties is de reactiesnelheid recht evenredig met [S]- bij zeer hoge substraatconcentraties is de reactiesnelheid niet langer afhankelijk van [S], maar heeft ze

haar maximale waarde bereikt

Lineweaver-Burk grafiek: dubbel reciproke variant van Michaelis-Menten vergelijking:

bepaling van KM en Vmax: de meetpunten komen op rechte lijn te liggen

Eadie-Hofstee vergelijking: V wodt uitgezet teven V/[S]

KM stelt de substraatconcentratie voor waar de helft van het totale aantal enzymmoleculen bestaat als ES-complexen, zodat de reactiesnelheid op 50% van de maximale waarde verloopt affiniteit van het substraat tov het enzym

Turnover getal k3= maat voor de snelheid waarmee het enzym reactieproducten vormt uit het ES-complex

Irreversibele enzyminhibitoren: moleculen die meestal een covalente binding met het doelwitenzym aangaan, waardoor de katalytische eigenschappen van het enzym definitief uitgeschakeld worden (vb acetylcholinesteraseremmers insecticiden)

Reversibele inhibitoren- competitieve inhibitoren: lijken sterk op substraat , bezetten in onderlinge competitie met het

substraat de actieve sites op het enzym minder actieve sites beschikbaar (stijging van helling en verschuiving van –1/KM naar het nulpunt op de x-as op de Lineweaver-Bork grafiek)

- niet-competitieve inhibitoren: inhibitor bindt op ander gedeelte van het enzym katalytische efficiëntie van het enzym wordt verminderd (wijziging van intercept met y-as, Vmax daalt)

Enzymclassificatie:- EC1: oxidoreductasen: katalyseert oxidatie- en reductiereacties, afhankelijk van elektronenacceptor:

o dehydrogenasen (NAD+, NADP+, FAD of cytochromen als elektronenacceptor)o oxygenasen geven elektronen af aan zuurstof (mono- en di-oxygenasen)

- EC2: transferasen: overdracht van een bepaalde groep van het ene molecuul naar het andere, donor treedt vaak als co-factor van het enzym op

- EC3: hydrolasen: ook transferasen, dragen bepaalde groepen over aan een watermolecuul, splitsen ester-, glycoside-, peptide- of andere covalente bindingen waarbij de –OH en –H groepen van water aan beide uiteinden van het gesplitste molecuul komen te liggen afbraak van grotere macromoleculen tot hun bouwstenen

o peptidasen of proteasen: hydrolyseren peptidebindingen (serine proteasen, metalloproteasen metaalion als co-factor)

o lipasen: hydrolyse van esterbindingen in vetteno sacharidasen: verbreken glycosidebindingen tusen suikerpolymereno ribonucleasen en desoxyribonucleasen: splitsing van RNA en DNA tot vrije nucleotiden

fosfaatesters verbroken- EC4: lyasen: klieven of veranderen C-C, C-N en C-O-bindingen via:

o eliminatie van groepen waardoor er dubbele bindingen ontstaano toevoegen van groepen waardoor dubbele bindingen verdwijnen

- EC5: isomerasen: sterische veranderingen binnen het substraatmolecuul (racemasen, epimerasen, cis-trans-isomerasen, mutasen)

- EC6: ligasen (= synthetasen): plakken uiteinden van 2 moleculen aan elkaar waarbij water vrijkomt

Iso-enzymen van LDN: heterotetrameer eiwit met 2 mogelijke soorten subeenheden:- M-type subeenheid- H-type subeenheid verschillen in affiniteit voor substraat en in regelbaarheid door externe factoren

Myocard infarct:- creatine fosfokinase: hoge piek, daalt snel

- LDN: komt trager tot stand, maar kan tot 10 dagen na het infarct aanwezig blijven

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)- detecteren van biomoleculen, virussen of geneesmiddelen- specifiek antilichaam tegen het op te sporen antigeen- met een tweede antilichaam wordt de aanwezigheid van gebonden eerste antilichaam gedetecteerd

detectie: enzymatische kleurreactie (biotine uiterst hoge bindingsaffiniteit voor streptavidine dat covalent gekoppeld is aan een ezym zoals peroxidase)

- vb: aanwezigheid van HIV via de virale antigenen in menselijk bloed opsporen

REGELING ENZYMATISCHE ACTIVITEIT

Enzymregulatie: de enzymatische activiteit kan worden geregeld naargelang de behoeft van de cel- 1ste niveau: substraatniveau regulatie: sommige enzymen worden competitief geremd door hun

reactieproduct- snelheid van meeste metabole wegen wordt bepaald door bottleneck, het snelheidsbeperkend enzym

(mate van opstopping thv het moeilijkste punt in het traject) op kritische snelheidsbeperkende enzymen zitten regelknoppen die de enzymatische activiteit drastisch kunnen veranderen:

o liganden gaan op bindingssites van het enzym binden en zullen een ruimtelijke structuurverandering in het enzym veroorzaken = allosterie

- covalente verandering van de enzymstructuur: bij enzym-fosforylatie worden er covalente fosfaatesters gevormd met OH-groepen van serine, threonine of tyrosine sterk verandernde enzymatische activiteit

- irreversibele vorm van enzymregulatie: covalente verandering van de primaire enzymstructuur bij proteasen die alleen op welbepaalde plaats en tijd actief mogen zijn (vb trypsine en chymotrypsine enkel in dunnen darmholte)

- thv productie of afbraak van het enzym bepaalt aantal enzymmoleculen, thv genexpressie

Reacties verlopen spontaan in 1 bepaalde richting indien de vrije energie van Gibbs een negatief getal is = exergonisch (verlaging potentiële energie of verhoging van de wanorde in de richting van de reactie)Reacties met positieve vrije energie van Gibbs of een waarde gelijk aan nul kunnen dus niet spontaan verlopen = endergonisch

Een thermodynamisch ongunstige reactie kan dus verlopen door ze te koppelen aan een thermodynamisch gunstige reactie (als exergonische stap vaak hydrolyse)

Bij allosterie zullen regelstoffen via niet-covalente krachten op het enzym binden en daardoor de katalytische eigenschappen van het enzym wijzigen. Ze doen dit door na de binding een ruimtelijke structuurverandering in het enzym te induceren die zich uitbreidt tot in de actieve site substraat bindt met gewijzigde affiniteit op de actieve site of de transition state wordt moeilijker of gemakkelijker bereiktDe overgang van de ene in de andere toestand = allosterische transitie- allosterische toestand waarin het enzym hoge katalytische activiteit vertoont: R- inactieve vorm: TPrincipe: positieve coöperativiteit tav de binding van substraat en regelbaarheid van de allosterische toestand door activatoren en inhibitoren- positieve coöperativiteit: bij alle allosterische enzymen is de V-[S]-kromme sigmoïdaal, bij lage

substraatconcentraties is er een kleinere toename van V, bij verdere toename van [S] gaat V ineens sterk stijgen

- zonder substraat bevindt het enzym zich in T configuratie alle actieve sites hebben lage affiniteit voor substraat, dus binding van eerste substraatmolecuul met vorming van een ES-complex is het moeilijkst

Naast katalytische subeenheden bezitten sommige allosterische enzymen ook regulatorische subeenheden die via vele niet-covalente interacties deel uitmaken van het holo-enzym bevatten doorgaans hetero-allosterische regelknoppenAspartaat transcarbamoylase (ATCase)- katalyseert de snelheidsbeperkende stap in de pyrimidinebiosynthese die nodig is voor de aanmaak van

DNA en RNA- fusie tussen 2 substraten (aspartaat en carbamoylfosfaat) tot carbamoylaspartaat- kinetiek is sigmoïdaal coöperativiteit- allosterisch geremd door CTP, een eindproducti van de pyrimidinesynthese = feedback inhibitie- het snelheidsbeperkend enzym voor de keten wordt uitgeschakeld wanneer er zich genoeg eindproduct

opstapeld, de allosterisch rem wordt tegengewerkt door de activator ATP- homo-allosterisch gedrag en regelbaarheid van het enzym door CTP en ATP uit te schakelen door te

behandelen met kwikzuiten ATCase valt uiteen in verschillende subeenheden (katalytische subeenheden en regulator subeenheden bindingsplaatsen voor de allosterische liganden ATP en CTP)

- quaternaire structuur: o 6 katalytische subeenheden georganiseerd als 2 trimereno 6 regulator subeenheden in 3 dimereno ruimtelijke structuur van T-configuratie is compacter omdat paren van katalytische

subeenheden elkaar loslaten tijdens de allosterischte TR-transitieo binnen een katalytische subeenheid wordt de tertiaire structuur juist compacter en wordt de

actieve site scherper afgegrensd beide substraten kunnen met hoge affiniteit binden

Fosfofructokinase- in glucolyse: zet fructose-6-fosfaat om tot fructose-1,6-bifosfaat- tetrameer van identieke subeenheden waarbij de 4 katalytische sites aan 1 zijde afgegrensd worden

door de raakvlakken tussen 2 subeenheden- binding van allosterische liganden veroorzaakt rotatie van 2 dimeren tov elkaar thv actieve site:

uitwisseling van arginine voor glutamaat, het arginine bindt elektrostatisch met de fosfaatgroep van fructose-6-fosfaat, terwijl Glutamaat dit juist verhindert

- geremd door ATP en citroenzuur, allosterisch geactiveerd door AMP en fructose-2,6-bisfosfaat

Fosfaatesters worden gevormd door proteïne kinasen, enzymen die de fosfaat overdragen van ATP op welbepaalde aminozuurzijketens die door herkenningspunten in de primaire eiwitstructuur afgebakend worden. Fosfaatesters worden gesplitst door hydrolyse via proteïne fosfatasen. Zowel de activiteit van proteïne kinasen als die van proteïne fosfatasen wordt geregeld door chemische stimuli, die de cel van buiten bereieken en die in de cel worden omgezet tot intracellulaire chemische signalen.

Glycogeen fosforylase- katalyseert de snelheidsbeperkende stap van de afbraak van glycogeen in lever en spieren- homodimeer: in elke subeenheid is de actieve site in een diepe groeve van het enzym gelegen water

moet uit de actieve site geweerd worden (hydrolyse)- door hetero-allosterie geregeld glycogeen fosforylase wordt actief als er energietekort ontstaat in de

celo ATP: sterke inhibitoro AMP: allosterische activator

- een tweede regelknop is gevoelig voor allosterisch inhibitor glucose-6-fosfaat vermeden dat de brandstofvoorraad wordt aangesproken als er een alternatieve energiebron in de spiercel aanwezig is

- de niet-gefosforyleerde vorm = fosforylase b

- fosforylatie van serine vorming fosforylase a veranderng in tertiaire structuur: het aminoterminaal domein van de gefosforyleerde subeenheid krijgt een stijve structuur die overeenkomt met deze van de R-conformatie hogere affiniteit voor substraat en niet meer gevoelig voor de allosterische inhibitie van ATP en glucose-6-fosfaat

- proteïne fosfatase 1 splitst fosfaat af van serine fosforylase b

De enzymen die de voedingseiwitten verteren, worden door de pancreas als zymogenen aangemaakt- enzym enteropeptidase knipt de 6 aminoterminale aminozuren van trypsinogeen weg trypsine- zal zelf vele ander tripsinogeen moleculen omzetten in trypsine- katalyseert omzetting van chymotrypsinogeen in -chymotrypsine, pro-elastase in elastase en pro-

carboxypeptidase A in carboxypeptidase A- bij gebrek aan substraat zullen de spijsverteringsenzymen zichzelf uitschakelen- in pancreas: pancreatische trypsine inhibitor

Pancreatitis- gemeenschappelijk afvoerkanaal van pancreas en galafvoerkanaal verstopt door galsteenvorming- afvloei van pancreassap belemmeren en zelfs galsap retrograad in de ductus pancreaticus doen vloeien- activatie van trypsine in pancreas sneeuwbaleffect van autokatalyse massale vertering van het

weefsel en lek van geactiveerde enzymen in omringende weefsel, bloedingen en vochtopstapeling in het orgaan

- kan ook door overmatig alcoholgebruik, bepaalde virale infecties en inname van bepaalde geneesmiddelen

Bloedstolling- bij defect in vaatwand bloed van hoge naar lage hydrostatische druk bloedverlies- cascade van zymogeen-activaties wateroplosbaar fibrinogeen wordt omgezet tot wateronoplosbaar

fibrinenetwerk (klonter of thrombus) waarin bloedcellen vastgehouden worden- 2 verschillende initiatiewegen convergeren naar 1 gemeenschappelijke amplificatie- en effectorweg

stollingsfactor thrombine knipt enkele oligopeptiden uit fibrinogeen- na proteolytische werking thrombine (knipt 4 peptidebindingen van fibrinogeen) splitsen

fibrinopeptiden A en B af en ontstaat de ()2-structuur van fibrine bezit complementaire hydrofobe holten en knobbels aan de oppervlakte spontane polymerisatie in water

- fibrinopeptiden A en b netto negatief bijdrage tot wateroplosbaarheid van fibrinogeen en elektrostatisch afstoten van individuele moleculen fibrinogeen

- fibrinepolymeer wordt door crosslinks (covalente glutaminebruggen tussen 2 fibrinemoleculen, aangebracht door enzym trans-glutaminase) verder verstevigd

- Activatie van thrombine: 2 initiatiewegeno intrinsieke weg: herkent contactoppervlak dat veranderd iso extrinsieke weg: weefselfactor die vrijkomt uit door trauma beschadigde cellen

- thrombine wordt proteolytisch gevormd uit pro-thrombine- hemofilie A en B:

o X-gebonden recessief overgeërfdo veroorzaakt door deleties of puntmutaties van het reusachtige factor VIII-gen waardeoor er te

weinig of een defect factor VIII wordt aangemaakto therapie: frequente bloedtransfusies of toediening van donor-plasmaconcentraten

- Fibrinolyseo fibrinedraden via proteolyse afbreken tot fibrine degradatieproducteno enzym: plasmineo plasmine dat vrij circuleert in menselijk plasma wordt vrijwel onmiddellijk uitgeschakeld door

een fysiologische inhibitor 2-antiplasmine voorkomt algemene intravasculaire afbraak van fibrinogeen

o 2 enzymen die plasminogeen kunnen activeren tot plasmine: tissue-type Plasminogen Activator: bindt via aminoterminaal gedeelte met hoge

affiniteit aan fibrine verhoogt katalytische werking enzym efficiënter geactiveerd aan het oppervlak van een fibrineklonter (werking tegengegaan door inhibitoreiwit)

urokinase hoge activiteit in menselijke urine

- kunstmatige antistolling en thrombolyseo bloedafname: verlagen van vrije calciumionen door toevoeging van calciumchelators of

toevoegen van overmaat heparine dat via antithrombine III de actieve stollingsfactoren onmiddellijk neutraliseert

o chronische antistollingstherapie: remmers van de werking van vitamine K vermindering van de -carboxylering van glutamaat in stollingseiwitten

Serineprotease-inhibitors = serpins

Het complementsysteem- doden van micro-organismen die in het lichaam zijn doorgedrongen + produceren van alarmsignalen

die immuunsysteem aantrekken of fagocytose vergemakkelijke- klassieke weg: herkenning van een antigeen-antilichaam complex door het complement eiwit C1q- alternatieve weg: lichaamsvreemde moleculaire oppervlak herkend door complement eiwit C3 en

bijkomende hulpeiwitten- mannaan-herkenningsweg: specifieke receptor voor bacteriële suiker mannaan- amplificatie: activatie van C3 convertase (splitst pro-enzym C3 in C3a en C3b) C3b activeert pro-

enzym C5 convertase splitst C5 in C5a en C5b C5b complexeert reeks andere complementfactoren

- effectorfase: ontstaan ringvormige poriecomplex dat de plasmamembraan van de indringer doorboort

NUCLEINZUREN

Het betrouwbaar kopiëren van DNA voor de volgende generatie = replicatieRetrovirussen gebruiken de omgekeerde transcriptie waarin RNA wordt afgeschreven tot cDNA

Bewijs voor de rol van DNA:- Grifith- Avery- studies van de bacteriofaag T2 (klein virus dat parasiteert op de colibacil)

o hecht zich met zijn staart op de gastheercel en injecteert het zijn genetisch materiaal door de bacteriewand, DNA gaat zich vermenigvuldigen, gastheercel barst open en nieuwe virussen komen vrij in de buitenwereld

o Hershey en Chase: T2-DNA werd gemerkt met 32P terwijl de virale eiwitten werden gemerkt met 35S na korte incubatie van radioactief gemerkt virus met de colibacillen werd het mengsel

onderworpen aan een mechanische agitatie, waardoor de vastgehechte virussen van hun gastheercellen werden afgebroken

mengsel werd gecentrifugeerd zodat de bacteriën pellet en vrije virussen in vloeistof daarboven (supernatans)

pellet en supernatans werden geanalyseerd op hoeveelheden 32P en 35S radioactiviteit virus injecteert zijn DNA en niet zijn eiwitten in de gastheercel aanzienlijke fractie van 32P in dochtervirussen, 35S niet

Bouwstenen van DNA:- purines: adenine en guanine- pyrimidines: cytosine en thymine- desoxyribose- fosfaat- 3’-5’-fosfodiësterbindingen- oriëntatie: nucleotide met vrije 5’-fosfaatgroep laagste nummer en links DNA ketens worden

gemaakt van 5’ 3’

Chemische analyse van de bouwstenen van DNA: Chargaff in alle soorten DNA evenveel adenine als thymine en evenveel guanine als cytosine

Franklin en Wilkins- DNA gezuiverd uit cellen en laten polymeriseren als vezels, röntgendiffractie geen kristal met een

perfecte ruimtelijke herhaling van structuur- werk overgenomen door Watson en Crick: dubbele helix: gemiddelde structuur van de DNA-vezels

Essentiële karakteristieken van Watson en Crick dubbele helix:- 2 DNA-ketens spiraalsgewijs rond een gemeenschappelijke as gewonden, 1 complete winding = 10

nucleotiden per keten, lengte 34 Å, diameter 20 Å, oriëntatie: antiparallel- suikerfosfaat ruggengraten liggen aan buitenzijde, basen naar binnen waar zij hydrofobe interacties

met elkaar aangaan, basen staan ongeveer loodrecht op lengteas en liggen als schoteltjes opgestapeld (basepair stacking). Tussen beide backbones bevinden zicht 2 spleten (brede en smalle groeve) waar de basenparen contact hebben met de omgeving

- basenparen interageren door middel van H-bruggen: A-T en G-C- basensequentie in DNA = drager van de genetische informatie, dubbelstrenging DNA bestaat uit 2

ketens met complementaire sequenties

Replicatie van DNA is semi-conservatief bewijs door Meselson en Stahl:- merkten nieuw aangemaakt en oud DNA tegelijkertijd door zware (15N) of lichte (14N) stikstofatomen in

de basen in te bouwen- het zware DNA kon gescheiden worden van het lichte via dichtheidsgradiënt-evenwichts-sedimentatie

(concentratie-gradiënt van een cesiumchloride-oplossing)- eerst werden bacteriën gekweekt op een voedingsbodem met uitsluitend 15N alle nieuw

aangemaakte DNA een hoger soortelijk gewicht dan het DNA dat verkregen zou worden met 14N-voedingsbodem

- door plotseling over te schekelen op licht stikstof in de voedingsbron, bleken alle dochtercellen van de eerste generatie DNA te bevatten met ‘intermediaire’ dichtheid

Lengte van DNA-moleculen:- chromosoom van E. coli: 4600 kb (kilobasen) of 4,6 mb (megabasen)- totale lengte van het DNA in 1 menselijke zaadcel: 1 meter dubbele helix (~3000 mb)

DNA-moleculen vertonen superwindingen (supercoils). Supercoiled DNA is compacter dan lineair DNA en draagt bij tot het gemakkelijker ontrollen van de complementaire ketens

Bouwstenen van RNA:- ribose- uracil in plaats van thymine- meestal enkelvoudige strengen, maar kunnen stam-lus structuren vormen waarbij de stammen als

korte stukjes dubbele helix voorkomen

Ribosomaal RNA (rRNA)

- grootste aandeel van het totaal RNA in de cel (80%)- 2/3 van het gewicht van de ribosomen- 4 soorten rRNA met sedimentatiecoëfficiënten van 5S, 5,8S, 18S en 28S in 1 ribosoom telkens een

molecuul van elk van deze 4- rol in de translatie- bij bacteriën: 3 soorten rRNA (23S, 16S en 5S)

Transport RNA (tRNA)- 10-15% van het totale RNA- fysische drager van geactiveerde aminozuren naar de ribosomen- tijdens de eiwitsynthese als adaptormolecuul om de juiste aminozuren aaneen te koppelen- voor elk van de 20 aminozuren bestaat er minstens 1 specifiek tRNA- klein: 75 nucleotiden- karakteristieke secundaire (klaverblad) en tertiaire (L-vorm) structuur

Messenger RNA (mRNA)- minder dan 5% van het totale cellulair RNA- zeer heterogeen, ontstaat door transcriptie- bij bacteriën heeft mRNA een kort leven en zijn transcriptie en translatie gekoppeld in tijd en ruimte- bij eukaryoten is mRNA veel stabieler en ontstaat het pas na een reeks modificaties (splicing, capping,

poly-A staart)

Bij eukaryoten bestaat er ook nog een verzamelijk kleine RNA’s die vaak geassocieerd voorkomen met eiwitten- in de kern zijn er de small nuclear ribonucleoproteïns (snRNP) enzymatische bewerking (splicing) van

juist afgeschreven RNA’s- in het cytoplasma bestaan er small cytoplasmic ribonucleoproteins (scRNP) transport van bepaalde

eiwitten door de membraan van het endoplasmatisch reticulum

RNA dient ook als primer voor de DNA-replicatie

KOOLHYDRATEN

vereenvoudigde kenmerkende stoichiometrie (CH2O)n

Belangrijke functies van koolhydraten:- metabolisme: tussenproducten in de stofwiseling van de meeste organismen (prototype: glucose)- structureel: skelet van planten, insecten en schaaldieren, structuurelementen van RNA, DNA en

nucleotiden- Cel-cel interacties: vertakte koolhydraten met relatief ingewikkelde structuur vertonen covalente

bruggen met eiwitten of vetten die zich aan de oppervlakte van dierlijke cellen bevinden (glycoproteïnen en glycolipiden)

- diverse functies: bepalen van de levensduur van een in het bloed circulerend eiwit, eiwitadressering en moleculair smeren van gewrichten

Grote koolhydraten bestaan door covalente brugvorming tussen kleine bouwstenen (monosachariden)

Monosachariden:- ketosen of aldosen- 3-8 C-atomen (vb: triosen, pentosen, hexosen)

Triose D-glyceraldehyde- kleinste aldose- als fosfaatester door cellen gebruikt als metaboliet- thv de 3 C-atomen geoxideerd: C1 is aldehyde, C2 en C3 dragen alcoholgroepen- zeer polair en goed wateroplosbaar gemeenschappelijk kenmerk voor alle suikers- middelste C-atoom chiraal centrum 2 enantiomeren: D- en L-glyceraldehyden alleen D-

glyceraldehyde in cellen gebruikt als metaboliet (bijna alle monosachariden D-configuratie) (per C-atoom komt er 1 nieuw chiraal centrum bij)

ketotriose dihydroxyaceton: C2-ketogroep tautomeer van glyceraldehyde- als fosfaatester belangrijk stofwisselingsproduct- symmetrisch molecuul geen stereo-isomeren (grotere ketosen wel chirale centra)

ketotriosefosfaat en aldotriosefosfaat worden tijdens de stofwisseling in elkaar omgezet dankzij het enzym triosefosfaat isomerase

Koolstofketens van pentosen en hexosen zijn in waterige oplossing zeer flexibel (rotaties rond de C-C bindingen). Door herschikking van elektronen rond de aldehydegroep en het voorlaatste C-atoom ringvormige structuren: pyranosen (6-ring) of furanosen (5-ring) die in een waterige oplossing veel stabieler zijn

Tijdens de ringsluiting van D-glucose tot een D-glycopyranose interageert de aldehydegroep van C1 met de OH-groep van C5, door herschikking van elektronenparen ontstaat een hemi-acetaalbinding (door ringsluiten ontstaat 1 extra asymmetrisch C-atoom -anomeer waarbij de anomerische OH-groep onder het vlak van de ring ligt en de -anomeer waarbij de OH-groep boven de ring ligtOpenen en sluiten van ring is reversibel, in water evenwicht naar ringen2 x meer -D-glucose strandstoelconformatie (zijgroepen telkens equatoriale positie want minder sterische hinder) en alle volumineuze zijgroepen van de ring equatoriaal

Fructose 4 mogelijke ringstructuren: -D en -D-fructopyranose en -D en -D-fructofuranose

Glucose en fructose: zoet smakende suikers, belangrijk als brandstoffen, via enzymen afgebroken tot kleinere suikers zoals triosefosfaten (glycolyse)

Stereo-isomeren die niet elkaars ruimtelijk spiegelbeeld zijn = diastereomeren2 diastereomeren die slechts verschillen op 1 assymetrisch C-atoom = epimeren

Galactose eveneens een brandstof voor bepaalde cellen die de suiker kunnen opnemen

Er bestaan een hele reeks chemisch gewijzigde monosachariden die een rol spelen als metabolieten of bouwstenen van complexe suikerpolymeren- fosfaatesters van hexosen en triosen in glycolyse (glucose-6-fosfaat, glyceraldehyde-3-fosfaat)- C6-OH-groep van glucose kan verder geoxideerd worden tot –COOH ontstaan van zure suiker

glucuronzuur (afbraak en eliminatie van sommige geneesmiddelen door de menselijke lever)- C2-OH-groepen van hexosen worden soms vervangen door een aminogroep (glucosamine,

galactosamine) verder veranderd door N-acetylering tot bv N-acetylglucosamine (samen met N-acetylmuraminezuur een belangrijke bouwsteen van peptidoglycaan, structurele polysacharide van de bacteriële celwand)

De glycosidebinding ontstaat wanneer de anomerische OH-groep condenseert met een andere suiker-OH-groep (O-glycosidebinding polymerisatie van monosachariden tot polymeren) of met een purine- of pyrimidinebase (N-glycosidebinding in ribonucleotide of desoxyribonucleotide, positie base altijd boven de ring)

In cellobiose (disacharide, afbraakproduct van cellulose) is de -anomerische OH-groep van een glucoseresidu verbonden met de C4-OH-groep van een tweede glucoseresidu

Adenosine is een adenine bevattend ribonucleoside- komt voor als metabole tussenstap in de afbraak van ribonucleotiden ATP, ADP en AMP- door sommige cellen gebruikt als extracellulair signaal in de intercellulaire communicatie

Bij disachariden worden 2 monosachariden verbonden tot een dimeer via 1 O-glycosidebinding- sucrose: tafelsuiker, anomerisch C-atoom van glucose is via een -1,2-glycosidebinding gehecht aan het

anomerisch C2-atoom van fructose- maltose: bestaat uit D-glucose via -1,4-glycosidebinding aan elkaar gebonden, ontstaat bij mens in

dunne darm door spijsvertering van polysachariden zoals zetmeel- lactose: galactose dat via een -1,4-binding vastzit aan glucose, in zoogdierenmelk, door een speciaal

enzym aangemaakt in de borstklier tijdens de periode van lactatie door specifieke enzymen (sucrase, maltase en lactase, die zich als integrale membraaneiwitten in de microvilli van de mucosacellen bevinden) verteerd in dunne darm

Bij een groot aantal volwassen mensen bestaat er lactose-intolerantie waarbij de lactase-activiteit in de dunne darm zo sterk daalt, dat lactose niet langer verteerd wordt en er na het drinken van melk diarree optreedt

De meeste polysachariden zijn vertakte ketens, de bouwstenen en onderlinge bindingen zijn meer variabel en de synthese van polysachariden is niet matrijsafhankelijk

De belangrijke polysachariden - structurele rol:

o peptidoglycaan celwanden bacteriëno chitine exoskelet schaaldieren en insecteno cellulose hout van planteno proteoglycanen bij zoogdieren grondstof van intercellulaire ruimten (vooral bindweefsel)

- metabole rol: glucose energiereserveo dextraan eencelligeno zetmeel planteno glycogeen zoogdieren, in lever en spieren

- oligosachariden: onderdeel van glycoproteïnen en glycolipiden in de extracellulair gerichte laag van celmembraan

Cellulose:- lange lineaire ketens van cellulose worden stijf door zeer regelmatige H-bruggen tussen de C3-OH en de

ring-O-groep in 2 naburige glucoseresidu’s- ook veel H-bruggen tussen afzonderlijke, parallel verlopende ketens- meest voorkomende biomolecuul op aarde met een biomassa van vele triljoenen tonnen en een

jaarlijkse productie/afbraak van meer dan 1015 kg- celwand van plantaardige cellen- vezels van het polysacharide worden stevig bijeengehouden door hemi-cellulose (mengsel van andere

structuurpolysachariden- papier is een vrij zuivere vorm van cellulose

Chitine- bouwstof van exoskelet van insecten en schaaldieren

- op bepaalde posities sterk gemineraliseerd- talrijke H-bruggen tussen C3-OH en ring-O van naburige residu’s

Levende wezens gebruiken homo-polymeren van D-glucose als opslagplaats voor energie- bacteriën dextranen, planten zetmeel, dieren glycogeen- dextranen bestanddeel van tandplaque, mineralisatie van plak tandsteen tandvlees trekt terug

en metabolisme van bacteriën levert lokaal organische zuren die de mineralen van het tandglazuur oplossen cariës (gaatjes)

- zetmeel:o grote korrels in cytoplasma van plantaardige celleno bevat moleculair 2 componenten:

vertakte amylopectine: -1,4-glycosidebindingen met hierop vertakkingen dankzij -1,6-glycosidebindingen, helicale structuur bolvormige structuur

onvertakte amylose: lineair polymeer met uitsluitend -1,4-bindingen tussen glucoseresidu’s, ruimtelijk amylose-helix

o mens: spijsverteringsenzymen (vb pancreatisch amylase) om -1,4-glycosidebindingen van zetmeel te hydrolyseren ontstaan van oa maltose dat verder afgebroken wordt tot D-glucose

o mens bezit geen enzymen om de -1,4-bindingen van cellulose te hydrolyseren een voldoende hoeveelheid onverteerbare vezels in het voedsel vergemakkelijkt de passage van de inhoud van de dikke darm

- dierlijke glycogeeno lijkt sterk op amylopectineo treedt op als opslagpolymeer van D-glucose in de lever en in de skeletspieren rol in

menselijk metabolisme

Proteoglycanen- rol als grondstof voor intercellulaire ruimtes vooral in bindweefsel- 95% suikers en 5% eiwit, sterk negatief geladen binden veel water en kationen, basis van

extracellulaire matrix- suikergedeelte = glycosaminoglycaan:

o polysachariden die bestaan uit repeterende eenheden van telkens 2 hexosen waaronder doorgaans een aminosuiker

o negatief geladen door een carboxylgroep of door sulfatie van amino- of alcoholgroep binding van watermantels en interactie met positieve ladingen van andere macromoleculen

o vb: hyaluronzuur (polymeer van glucuronzuur en N-acetylglucosamine, als vrij polysacharide in synoviale vloeistof en in glasachtig lichaam van oog verhoogt viscositeit en smeert gewrichten), heparine, heparaansulfaat, chondroïtinesulfaat en kerataansulfaat

o bindt via niet covalente krachten aan ongeveer 140 moleculen core protein, aan elk core protein zitten op regelmatige afstand de polysacharidenchondroïtinesulfaat en kerataansulfaat covalent gebonden op serinezijketens

Heparine- bindt sterk aan anti-thrombine III in bloedbaan voorkomt bloedstolling- in geneeskunde vaakt gebruikt als anti-stollingsmiddel- komt normaal niet voor in de bloedbaan- mutaties in het gen dat codeert voor sulfaterend enzym voor heparinesynthese in muizen heparine

regelt intracellulair de werking van mastocyten op het niveau van eiwitglycosylering

Vertakte oligosachariden die covalent verbonden zijn met eiwitten (glycoproteïnen) en vetten (glycolipiden) spelen rol in herkenningsmechanismen: de speciefieke structuur van de suikers wordt door specifieke eiwitten herkend, deze lectines bevinden zich in de membraan van een andere cel ontstaan niet-covalente bindingen tussen cellen rol in celadhesie (beweeglijke cel hecht zich vast aan een andere)

O-gebonden oligosachariden:- vast aan serine- of threonineresidu’s van het eiwit- vrijwel identiek aan suikers op glycolipiden- glycoforine A: eiwit in rode bloedcelmembraan met veel O-gebonden oligosachariden

N-gebonden oligosachariden- vast op asparagineresidu- vertakte structuren van ongeveer 10 suikerresidu’s: in hun centrum een kern of core oligosacharide dat

opgebouwd is uit 2 moleculen N-acetylglucosamine en 3 moleculen mannose waarrond een aantal extra suikers

Het aantal oligosachariden is enorm omdat een groot aantal verschillende bouwstenen op een vrij groot aantal mogelijke manieren aan elkaar kunnen vastzitten

De bacteriële celwanden zijn voor deel verantwoordelijk voor klinische uiting van bacteriële infecties en suikers in deze celwanden leveren vaak de antigenen die zullen leiden tot een immunologische afweer vanwege de gastheer

Penicilline verhindert dat bacteriën hun celwand vormen en lysozyme breekt de polysacharideketen af

Bacteriën hebben hun celwand nodig om te kunnen overleven versterkende laag, bescherming tegen mechanische en osmotische agressie- grampositieve bacteriën: celwand bestaat uit peptidoglycaan en teichoïnezuur- gramnegatieve bacteriën: nog extra laag die bestaat uit complex mengsel van eiwitten, lipiden en

koolhydraten

Polysacharideketens- basis van wandstructuur- bestaan uit herhalende disacharide: N-acetylglucosamine in -1,4-glycosidebinding met N-

acetylmuraminezuur die onderling verbonden zijn via -1,4-glycosidebinding

Peptidebruggen:- aan elk molecuul NAM zit covalent aan lactaatgroep een tetrapeptide vast (keten met van amino- naar

carboxyterminaal: L-alanine, D-glutamaat, L-lysine en D-alanine)- de 2 D-aminozuren worden door racemasen gevormd uit hun natuurlijke voorlopers- glutamaat vormt een isopeptidebinding via -carboxylgroep- pentaglycine zit met carboxyterminus vast aan de -aminogroep van L-lysine in het tetrapeptide

De laatste stap in de biosynthese van nieuw peptidoglycaan vindt plaats buiten de cel, op de basis van reeds aanwezige celwand - vorming van covalente bruggen tussen de afzonderlijke suiker-peptide ketens- enzym glycopeptide transpeptidase afsplitsing 2de D-alanine deze stap wordt geremd door

penicilline (bezit zelf een reactieve peptidebinding in de -lactaamring die een covalent complex vormt met het glycopeptide transpeptidase irreversibel uitgeschakeld)

Een aantal van de pathogene bacteriën bij de mens zijn resistent geworden egen het natuurlijk voorkomende penicilline dankzij resistentie-enzym penicillinase dat de reactieve peptidebinding van de -lactaamring openknipt waarbij inactief penicillaanzuur gevormd wordt maar derivaten van penicilline

LIPIDEN EN BIOLOGISCCH MEMBRAAN

overheersende hydrofobe eigenschappen door de koolwaterstofstructuur die overheerst, toch is in een aantal belangrijke lipiden een beperkt deel polair of zelfs geladen (amfifatisch) geschit om apolaire fase af te schermen van waterige fase (vormen van micellen (spijsvertering van vetten) of moleculaire dubbellagen (lipidenmembranen, compartimentalisatie van weefsels in cellen grote snelheid van biochemische reacties laat een beperkte diffusieafstand van substraten en producten toe, juiste moleculen binnen het beperkte volume van een cel concentreren)

De beperkte diameter van cellen door afbakening door een lipidenmembraan minimaliseert de diffusie-afstanden en zorgt ervoor dat eiwitten en andere grote moleculen in de cel ‘geconcentreerd’ blijvenMaar probleem van splendid isolation: niet alle voor de cel belangrijke moleculen diffunderen even goed als zuurstof door een lipidenmembraan, vooral polaire of geladen stoffen diffunderen niet of nauwelijks biologische membraan is dus semi-permeabel speciale transportkanalen (doorlaatbaarheid geregeld in functie van de fysiologische omstandigheden)

Rollen van lipiden:- structurele rol in membranen- belangrijke brandstof voor het metabolisme- isoleert veel warmbloedige dieren tegen koudere buitenwereld- beperken soms verlies van of contact met water

Basisstructuur:- 1 of enkele vetzuren via esterbinding covalent gebonden aan een alcohol- vetzuren = organische zuren met een ioniseerbare carboxylgroep en een koolwaterstofstaart- carboxylgroep reageert in water als zwak zuur, is sterk polair, de koolwaterstofstaart is sterk hydrofoob- echte vetzuren lengte van koolwaterstofstaart minstens 10 C-atomen, in biologische structuren 10 tot

26 C-atomen, aantal C-atomen bijna altijd even getal, keten doorgaans niet vertakt

Stearaat: 18 C-atomen (17 in vetzuurstaart, 1 van carboxylgroep), bestanddeel van kaarsvetPalmitaat: 16 C-atomen, zeer talrijk in allerlei lipiden, als vetzuur grote rol in het metabolisme

Belangrijke onverzadigde vetzuren voor de mens: oleaat, linoleaat en linolenaat (3 vetzuur, beschermt tegen hart- en vaatziekten) (C18) cisconfiguratie knik invloed op 3D-structuur van vetzuur

Micellen: de enigszinds kegelvormige ruimtelijke structuur van een geïoniseerd vetzuur leidt tot bolvormige aggregaten van vetzuren met een polair oppervlak en een apolaire kern in kernen kunnen andere apolaire lipiden opgelost worden soortgelijke functie vervullen de amfifatische galzouten in de spijsvertering van vetten in de dunne darm

Vetzuren kunnen via een esterbinding met hun carboxylgroep covalent gebonden worden met een alcoholgroep. Wanneer 3 vetzuren veresterd zijn met glycerol triacyglycerol (= triglyceride, niet amfifatisch, vormen geen micellen) belangrijk bestanddeel van vetcellen (adipocyten)

Gemiddelde gezonde volwassen mens draagt ongeveer 10 kg triglyceriden mee, vooral in laag onderhuids vet brandstof voor vele weefsels en waterstofisolator

Lipiden van biologische membranen ontstaan doordat 1 of meerdere vetzuren via esterbindingen covalent gebonden worden aan glycerol (glycerolipiden) of sfingosine (sfingolipiden), daarnaast bevatten dierlijke membranen het neutraal lipide cholesterol (groot, apolair alcohol)

Schematische structuren van glycerolipide en sfingolipide:- aan de ene zijde 2 apolaire koolwaterstofstaarten- aan de andere zijde ene polaire of zelfs geladen kop

uitgesproken amfifatisch

fosforylcholine: - 3de alcoholgroep van glycerol is veresterd met fosfaat dat op zijn beurt covalent gebonden is aan

choline = fosfatidylcholine - kan als kop dienen in een sfingolipide = sfingomyeline

Behalve choline kan fosfaat van glycerolipiden nog 3 andere polaire stoffen dragen:- serine fosfatidylserine- ethanolamine fosfatidylethanolamine- inositol fosfatidylinositol

o kan nog verder veresterd worden met 2 bijkomende fosfaatgroepen op de inositolring voorloper van de intracellulaire signaalmoleculen diacyglycerol en inositol-1,4,5-trifosfaat

o kan door een fosfo-inositide-3-OH kinase thv de 3-OH groep worden veresterd cruciale stap van de signaaltransductie van een aantal hormonen en groeifactoren

Glycolipiden: - sommige sfingolipiden dragen een suikergroep als polaire kop- komen uitsluitend in de buitenste laag van de celmembran voor, waarbij de suikers in de extracellulaire

ruimte steken- rol in weefselherkenning en cel-cel interacties- cerebrosiden: bevatten glucose of galactose als monosacharide- gangliosiden: dragen op sfingosine vertakte oligosachariden die bestaan uit tot 7 suikers van diverse

soorten zoals N-acetylgalactosamine, galactose, siaalzuur en fucose, worden samen met andere componenten van verouderde stukken celmembraan in de cel opgenomen en verteerd tot vrije suikers, vetzuren en sfingosine (lysosomen) gangliosidosen: stapelingsziekten waarbij in lysosomen 1 specifiek enzym ontbreekt dat de gangliosiden in de lysosomen moet afbreken

- ABO-bloedgroepen systeem op rode bloedcelleno 3 verschillende suikerstructuren: A-, B- en O-antigeeno elk van deze oligosachariden zit onveranderlijk covalent vast op een ceramide (sfingosine +

vetzuur)o O-antigeen: sfingosine-gebonden oligosacharide bestaande uit N-acetyl galactosamine,

galactose, siaalzuur en fucoseo A-antigeen: extra N-acetylgalatosamine op galactose gebondeno B-antigeen: extra suiker galactose

Cholesterol- compact molecuul met 4 stijve ringen die alle in stoelconfiguratie verkeren = sterolkern

o meest linkse ring draagt een OH-groepo de vijfring rechts draagt een vertakte koolwaterstofketen

- alleen in dierenrijk, in grote hoeveelheden in de plasmamembranen ingebouwd- wanneer de vrije alcoholgroep covalent gebonden wordt aan een vetzuur = cholesterolesters in

lipidendruppels binnen of buiten de cellen- biochemische voorloper van steroïdhormonen (vb cortisol, aldosteron, oestrogenen, progesteron en

testosteron) rol in regulatie van genexpressie- komt niet voor in de membranen van prokaryoten en planten, bij dieren minder aanwezig in de

membranen van celorganellen dan in de plasmamembraan

Sfingo- en glycerolipiden:- amfifatisch en bijna perfect cilindervormig- in waterige omgeving spontaan lipidendubbellagen vormen, elke halflaag ong 3 nm dik- bij planten en bacteriën wordt de membraan omgeven door een celwand van polysachariden

- in dierlijke cellen wordt de membraan verstevigd door een proteïneskelet in de cel en een proteoglycaanmatrix tussen de cellen die door integrines in de membraan gebonden worden

Asymmetrische verdeling van lipiden over de buitenste en binnenste halflaag, vb: rode bloedcellen: buitenste halflaag: 80% van het totale fosfatidylcholine, 15% van het membraan fosfatidylethanolamine, 5% van het fosfatidylserine en 90% van het sfingomyeline- verschillende verdeling van lading aan de binnen- en buitenzijde van de cel- verschillende fysische beweeglijkheid van lipiden in een halflaag = fluïditeit (bijna uitsluitend een

laterale diffusie van de lipiden ten opzichte van elkaar)o bij afkoeling onder een bepaalde kritische temperatuur (transitietemperatuur) zal de

trillingsenergie van de vetzuurstaarten lager zijn dan de bindingsenergie tussen de parallele staarten geen laterale diffusie meer mogelijk

o aanwezigheid van onverzadigde vetzuren verlaagt de van der Waals krachten (grote verschil in smeltpunten tussen verzadigde en onverzadigde vetzuren met gelijke ketenlengte)

o cholesterol (stijve ringen met regelmatige kristalstructuur) minder sterk effect van de temperatuur op de membraanfluïditeit

Membraanfuncties die fluïditeit vereisen:- exocytose: versmelten van de plasmamembraan met de membraan van een secretiegranule- endocytose: een deel van de plasmamembraan stulpt zich in en knijpt zich af van het cytoplasma- celbeweging waarbij een cel membraanuitstulpsels doet vormen die zich aan een zijde aan de bodem

vastgrijpen- celvervorming: extreem bij rode bloedcellen bij elke passage door het lichaam 2 x door zeer nauwe

capillairen worden geperst- communicatie tussen cellen waarbij een extracellulair signaal door de membraan wordt opgevangen en

wordt doorgegeven aan enzymen in de plasmamembraan

Membraaneiwitten:- selectieve transport van polaire moleculen (kanalen)- specifieke binding van hormonen of neurotransmitters (receptoren)- katalyse van bepaalde biochemische reacties (enzymen)- 20-75% van de massa van een biologische membraan

Myelineschede van zenuwvezels erg arm aan eiwit zo weinig mogelijk ionen doorlaten (elektrische isolatie), binnenste mitochondriale membraan erg eiwitrijk (oa cytochromen oxidatieve fosforylatie)

Integrale membraaneiwitten: - zitten stevig in de lipidenlaag verankerd doordat een hydrofoob gedeelte van het eiwit direct in contact

is met de vetzuurstaarten- bevatten meestal een transmembranair gedeelte dat bestaat uit minstens 1 transmembranaire -helix

o uitgesproken overwicht van apolaire aminozuren (Val, Leu, Phe) interageren via hun zijketens met de hydrofobe vetzuurstaarten

o 20 aminozuurresidu’s lang, dus ongeveer 6 helicale windingeno vb: G-proteïnen: sterk geconserveerde ruimtelijke structuur met telkens 7 transmembranaire

-helixen (serpentinereceptoren) (vb: adrenerge-receptoren, glucagonreceptor, geurstofreceptoren, fotoreceptoren)

- kunnen ook via covalente vasthechting aan een apolaire stof verankerd zijn, vb: proto-oncogenen regulatie van de celproliferatie (overdreven expressie = kanker)

o p21ras: covalent gebonden aan een farnesylgroep (C1 isopropeen structuur)o p60src: via aminoterminaal glycine verbonden aan C14 vetzuur myristaat

Perifere membraaneiwitten: zijn losser aan de membraan gebonden, meestal door niet-covalente interacties met een integraal eiwit

Laterale diffusie goed mogelijk, voor sommige membraaneiwitten zelfs noodzakelijk signaaltransductie van een hormonale prikkel buiten de cel naar een tweede prikken binnen de celTransversale beweging (flip-flop) zeer moeilijk tot onmogelijk omdat polaire of geladen eiwitgedeelten hiervoor door het apolaire centrum van de dubbellaag heen moeten dompelen (thermodynamisch onwaarschijnlijk)

Samenstelling van de buitenste en binnenste zijde van de celmembraan verschillen van elkaar- qua lipidensamenstelling- wat betreft oriëntatie van de integrale membraaneiwitten- aard van de perifere eiwitten membranen bestaan uit 2 asymmetrische dubbellagen oorsprong: op asymmetrische wijze gesynthetiseerd (vb suikergroepen van glycolipiden en van membraanglycoproteïnen altijd gebonden aan het extracellulair eiwitgedeelte)

Glycoforine A:- talrijke suikergroepen zijn covalent gebonden op de peptideketen van glycoforine (vooral op serines en

threonines) thv het extracellulair domein- suikergroepen alleen gebonden aan serines/threonines die zich bevinden in het extracellulaire domein

van het eiwit- 1 transmembranaire -helix van 20 overwegend apolaire residu’s- carboxyterminale cytoplasmatische domein bevat een aantal geladen aminozuurzijketens

Flippasen = enzymen die de flip-flop-beweging van bepaalde membraanbestanddelen kunnen versnellen dankzij ATP-hydrolyse asymmetrische inplanting/verdeling van een membraanmolecuul over de 2 lipidenhalflagen onderhouden of inducerenVb: P-glycoproteïne resistentie van kenkercellen tegen een serie cytostatica: flip-flopt vetoplosbare cytostatica van de binnenste naar de buitenste lipidenhalflaag

Anionenkanaal in de rode bloedcel en de glucosetransporters:- verankerd in membraan dankzij een aantal transmembranaire helixen met hydrofobe zijketens- vaak amfifatisch met polaire zijketens die afgewisseld zijn met apolaire zijketens- vormen samen een watergevuld kanaaltje waarbij polaire of geladen zijketens in de holte van het

kanaal wijzen, terwijl de hydrofobe zijketens verantwoordelijk zijn voor de helix-helix contacten en de interactie met de lipiden

- anionenkanaalo homodimeer: elke subeenheid boort zesmaal door de lipidenmembraano uitwisseling van HCO3

-/Cl- ionen door de celmembraan heen rol in transport van CO2 en O2

(ademhaling)o werkt samen met koolzuuranhydrase (enzym dat CO2 en water omzet in HCO3

- en H+ en omgekeerd)

o draagt ook bij tot stevigheid van de rode bloedcel aminoterminaal domein bevindt zich in het cytoplasma en interageert daar met het cytoskelet (spectrine, actine en ankyrine) van de rode bloedcel

- glucosetransporters:o opname van glucose door cellen stofwisseling van die celo bij zoogdieren: minstens 5 verschillende leden die structureel en functioneel op elkaar lijken

met elk een weefselspecifiek patroon van expressie GLUT2: leverspecifieke glucosetransporter GLUT4: spierspecifieke isovorm regelbaar door het hormoon insuline dat

glucoseopname in deze weefsels bevorderto doorkruisen de lipidenmembraan 12 x, telkens via een transmembranaire -helix van 20

residu’s vormen samen een watergevulde porie waardoor het polaire glucose kan diffunderen

Een van de meest intense moleculaire contacten tussen mens en bacterie: oppervlaktestructuren van gramnegatieve bacillen en het immuunsysteem van de gast

Het meest primitieve immuunsysteem mucosabarrière met lipopolysacharide (LPS)- complex vertakte suiker die covalent gebonden is met een lipide van de buitenste celmembraan- buitenste deel: repeat oligosacharide (herhaling van een lineair of vertakt oligosacharide)- binnenste deel: bijna onderveranderlijk, omvat een core-oligosacharide dat covalent vast zit aan lipide

A (gefosforyleerd glucosamine-disacharide waaraan 5 vetzuurstaarten verankerd zitten, negatief geladen)

- ook endotoxine genoemd: lipide A gedeelte is na intraveneuze inspuiting extreem toxisch bij alle zoogdieren

- komt in het bloed vrij tijdens de septische shock levensgevaarlijke bloeddrukdaling en uitvallen van verschillende orgaanfuncties ten gevolge van de aanwezigheid van bacteriën in de bloedbaan (sepsis)

Toxische effecten niet rechtstreeks door LPS zelf veroorzaakt:- bij lysis van enkele gramnegatieve bacteriën door macrofagen kleine hoeveelheden LPS vrij die

worden gekliefd in het suikergedeelte en het lipide A- lipide A stimuleert de macrofagen tot de aanmaak en secretie van een reeks polypeptiden (cytokines)

waaronder tumor necrosis facter-alfa - TNF, zeer actief cytokine dat de werking van het immuunsysteem op vele manieren tegelijk activeer

o werking op thermoregulatoir systeem met ontwikkeling van koortso induceert het verschijnen van acute-fase eiwitten in bloedbaano verhoogt werking van B- en T-lymfocyteno doet via immuunactivatie afweer tegen sommige tumoren toenemen met eventueel

tumorregressie als gevolg- het cytokine activeert de adhesie van granulocyten aan de wanden van de capillairen en de productie

van toxische zuurstofradialen door granulocyten