Vectoren voor hogere organismen : dierlijke cellen en planten

Vectoren : dierlijke cellen deels in T.A. Brown : hoofdstuk 7

deels in Primrose et al. : hoofdstuk 12

Simian virus 40 (SV40)

Geïsoleerd uit de Rhesus aap

Papovaviridae (Papilloma, polyoma, vaculating agent)

Groei op niercellen van aap (AGMK, CV1, …)

Structuur :

5243 bp, circulair DNA

chromatinestructuur (nucleosomen)

viruspartikel : icosahedraal, VP1, VP2, VP3

Genetische opbouw : "early" & "late" gebied, OR (replicatiefunctie)

Lytische ontwikkeling versus cellulaire transformatie

Vectoren voor dierlijke cellen, gebaseerd op SV40

Transcriptiekaart van SV40.

ORI ligt op positie 5243/0

Vroege transcriptie in tegenwijzerzin. 2 mRNAs door verschillende splicing (large-T + small-t)

Late transcriptie in wijzerzin.2 mRNAs, één voor VP1, andere voor VP2 + VP3

Gestippelde zones zijn de introns.

SV40 ori-gebied (details op volgende slide)

De origin voor SV40 DNA replicatie wordt voorgesteld door de ellips met erin een ruit

(tussen posities 5207 en 31). De belangrijkste elementen zijn een 27 bp palindroom

en de aansluitende 17 bp AT ("AT-block").

Als nulpunt (G) is de centrale positie genomen van het 27 bp palindroom

(positie 1 ligt dus het volgende bp.)

Het ligt aan de rechterzijde van een unieke BglI herkenningsplaats.

cagaggccgaggcGgcctcggcctctg

BglI GCCnnnnnGGC

........0123456789 nummering

Transcriptie van zowel vroeg als laat gebied wordt geregeld door een

bidirectionele promoter die de AT-block, 21 bp herhalingen, en de sequentie

van de identische 72 bp gebieden omvat.

Het kleinste vroeg mRNA codeert voor groot-T antigen. Het grootste vroeg mRNA voor

klein-T antigen, hoewel het gehele vertaalde gebied (dus ook het stoptriplet) voor de positie

van het intron ligt. Er is een (gemeenschappelijk) polyadenylatiesignaal, maar er is geen

specifieke afstand vereist (m.a.w. bij deletiemutanten verschuift de positie naar links of rechts).

Een groot intron zorgt voor het VP1 late mRNA. De andere VP-eiwitten worden op grotere

mRNAs gecodeerd (kleinere introns, diverse groottes).

Verloop van een SV40 infectie in permissive en in niet-permissieve cellen.

Tot ongeveer 14 uur na infectie (vroege fase) is de de ontwikkeling gelijklopend. In permissieve cellen volgt dan DNA replicatie, late eiwitsynthese, virusvorming en celdood. In niet-permissieve cellen integreert het virale DNA in het cellulair DNA en kan celtransformatieoptreden als expressie van groot-T antigen aanhoudt.

Belangrijkste karakteristieken

Basisgegevens :

replicatie : ORI : minimaal 70 bp

bi-directionele replicatie

bij elke replicatieronde is T-antigen nodig

ORI : sluit promotoractiviteit in op beide strengen (tegengestelde richtingen)

- vroege mRNA’s : 19S (T en t)

- late mRNA’s : 16S (VP1) en 19S (VP2 en VP3)

Beperkte inpakmogelijkheid : tot 110% van het genoom

(30% deleties mogelijk)

=> limiteert vectorconstructie

Bij pendelvectoren (zie verder) moet rekening gehouden worden met

zogenaamde “toxische” sequenties van pBR322 : dit zijn sequenties die

de efficientie van transformatie van dierlijke cellen verminderen. Zij zijn

gesitueerd in het gebied rond de nic/bom plaats.

Infectieproces

ontmanteling : 8 u

vroege fase: vroege mRNA's, vroege eiwitten : 4 u

start replicatie + late fase : late mRNA's en eiwitten : vanaf +/- 24 u

maturatie : inpakking, cellyse

Aanmaak COS cellen : SV40 lineair met BglI

afsplitsingen uitstekende uiteinden en ligeren

=> enkele bp in ORI verloren : ORI inactief

transformatie cellen : detectie T-antigen (fluorescentie)

COS cellen : constitutieve expressie van T-antigen door het celgenoom

=> T-antigen wordt in trans voorzien

Types SV40 vectoren

- transducerende vectoren (met helper virus) : inpakbaar, replicerendlate replacement vectors : 2 soorten virions

early replacement vectors : 2 soorten virions

in COS cellen : zuivere virions

- plasmide vectoren : niet-inpakbaar, replicerendgevolg van de vaststelling dat in COS cellen het viraal DNA repliceert,

ook als het late gebied verwijderd is. Er worden dan uiteraard geen

virions meer gevormd, dus geen plaques : er is een selectiemerker nodig.

- passieve vectoren : niet-inpakbaar, niet-replicerendhet DNA kan niet repliceren, maar alleen behouden worden door

integratie. Werd mogelijk zodra selectiemerkers voor dierlijke

cellen beschikbaar waren.

- pendelvectoren met E.coli plasmide : "toxisch" gebied te vermijden een SV40 replicon samengevoegd met een E. coli replicon.

twee selectiemerkers vereist ; één voor elk van beide waardcellen.

Belangrijkste karakteristieken

nb. in deze en verdere figuren :

vroegere nummering van het

SV40 DNA vanaf de EcoRI

knipplaats (in het VP1 gen) met

het late gebied in wijzerzin.

Complementatie van SV40

transducerende vectoren met

defectieve helpers (ts-mutanten).Hetzij het "laat-DNA" (bovenaan)

hetzij het "vroeg-DNA" (onderaan)

is vervangen.

Een temperatuur-gevoelige

tsA mutatie geeft een mutant T,

een tsB mutatie een mutant VP1.

Complementatie door COS cellen,

van een SV40 tranducerende

vector zonder groot-T gen.

Het "laat-DNA" is vervangen door

nieuwe insertsequenties. Na

transfectie zijn alle eiwitten voor

replicatie en verpakking aanwezig :

T-antigen vanuit de COS cellen,

VP1, 2 en 3 vanop de vector.

Belangrijkste karakteristieken

SV40 plasmidevectoren.

Meestal pendelvectoren : bevattenongeveer 2,3 kb pBR322 sequentiesmet de ori en het bla gen, voor klonering in E. coli. Het SV40 segment in de vector is hetgebied van 5171 tot 270 (in wijzerzin)waarin de ORI ligt en ook de promoter-activiteit voor vroege transcriptie. Hierachter is een selectiemerker voorzien, waarachter de SV40 sequenties voor polyadenylering (rond positie 2500) liggen, zodat een actief mRNA gevormd wordt.

pSV2 repliceert in COS cellen, maarniet in gewone apencellen waarin geengroot-T antigen aanwezig is. pSV3 repliceert wel in gewone apencellen, aangezien het groot-T gen ingebouwd is in de BamHI plaats van pSV2.

pSV2 en pSV3 kunnen ook insereren in het celgenoom en permanentetransformatie veroorzaken. Aldus groeit 1 cel op 104-105 tot een koloniein aanwezigheid van mycofenolzuur.

"Klonering”

- principe van ‘co-transformatie’

- transiënt versus permanent (‘stabiele transformatie’)

=> ‘amplificatie’ met methotrexaat

- merkers en selectie

- uit nucleotidemetabolisme (TK, HPRT, APRT, ...)

- exogene, dominante (neo, nptII, (aphII) : geneticine; ...)

- "amplificatie" : methotrexaat : competitieve inhibitie DHFR

resistentie door - mutaties in DHFR

- verhindering opname

- verhoogde doelwitdosis

- reporters (Primrose & Twyman (7nd edition) pp.229-230 en 310-311) :

CAT : radiochemisch, chromatografie, ELISA (intracellulair)

Alkalische fosfatase : kleur, fluorografie. (secretie)

LacZ : kleurvorming, ...

GusA : kleurvorming, ...

luciferase (luciferine, ATP, Mg2+) : flash

GFP (UV/blauw => groen fluorescent) en varianten

(vereist geen substraat ; vooral nuttig voor localisatie-experimenten)

Ter illustratie

N

Vectoren voor hogere organismen : dierlijke cellen en planten

Vectoren : planten deels in T.A. Brown : hoofdstuk 7

deels in Primrose et al. : hoofdstuk 14

Belangrijke facetten

Wat hebben (hadden) we voorhanden?

N

Functionele kaart van het Ti plasmide pTIC58

noc : catabolisme van nopaline

nos : biosynthese van nopaline

tra : genen voor conjugatieve transfer

(tussen bacteriën !)

T-DNA : tumor DNA (of onc-gebied)

D is het vir gebied (virulentie) : het

operon met de functies nodig voor

transfer van het T-DNA naar de plant.

N

Voorbeelden van opines :

A) octopines

B) nopalines

C) agropine

N

Herkenning / selectie van transformatie :

=> weefselkweek van plantencellen vereist fytohormonen voor groei (auxine, cytokinine)

=> transformanten groeien onafhankelijk van toegevoegde fytohormonen

(noemt men autotrofie)

Dit is een natuurlijk selectiemiddel voor transformanten. Echter : deze kankercellen zijn niet of zeer moeilijk te regenereren tot intacte planten.

De gevormde tumoren hebben dus 2 basiskarakteristieken :

=> wildgroei karakter

=> synthese van een opine (aminozuurderivaat)

Uiteraard is het niet interessant een transgene plant te hebben met tumoren. Dit moet dus uitgeschakeld worden.

N

Ti plasmiden (natuurlijke DNA overdracht van bacterie Agrobacterium tumefaciens naar plant)

Structuur plasmide: kenmerken ori, tra, vir, onc, opine synthese/afbraak

Kenmerken (van de “natuurlijk getransformeerde” plant):- tumorvorming (crown-gall) : groei onafhankelijk van fytohormonen

- aanmaak nieuw metaboliet : opine

=> het opine wordt gesecreteerd en kan gebruik worden door de bacterie

Infectie verwonde plant : interactie bacterie-plant- verwonding => fenolen e.a. => attractie bacteriën

=> contact plant-bacterie : chromosomaal gecodeerde genproducten

=> inductie van vir regio op Ti-plasmide : contact met VirA proteïne

Overdracht tumor-DNA : LB en RB consensus sequenties (25 bp direct repeats)

- membraaneiwit VirA : autofosforylatie

- => fosforylatie VirG proteïne (bindt op regulator van vir-gebied)

=> expressie-activatie : VirD1, VirD2, VirE

- VirD1, VirD2 : plaats-specifieke endonucleasen=> nicks in zelfde streng aan linker- en rechterzijde van het T-DNA=> enkelstreng DNA : verpakt in VirE

- VirD2 (pilooteiwit) covalent gebonden aan uiteinde- transfer naar plantnucleus en covalente integratie in “willekeurige” plaatsen in het

genoom

N

De RB en LB consensus sequenties :

De gebieden met hoogste homologie is (zwart) ingekaderd. Tussenin zijn er 2 bp zonder

specifieke gelijkenissen.

Nopaline L en R plasmiden : in de Ti plasmiden pTiC58 en pTi37.

In de octopine plasmiden is het tumorgebied in twee segmenten verdeeld : vandaar 4

‘border’ gebieden. In de Ti plasmiden pTiAch5 en pTiA5955.

N

Schematische weergave van Agrobacterium-gemedieerde gentransfer van de bacterie naar de plant.

De verwonde plant scheidt fenolische componenten af als onderdeel van een defensie- en

wondhelingsstrategie. verdere beschrijving op volgende slide

N

Schematische weergave van Agrobacterium-gemedieerde gentransfer van de bacterie naar de plant.

De verwonde plant scheidt fenolische componenten af als onderdeel van een defensie- en

wondhelingsstrategie.

(1) deze fenolische componenten leiden tot attractie van Agrobacterium tumefaciens

(positieve chemotaxis)

(2) de bacterie hecht zich celwand van de plant

(3) de fenolen worden herkend door het VirA eiwit van het Ti-plasmide (autofosforylatie) en

(4) en (5) leidt tot fosforylatie van VirG (DNA bindend eiwit) dat het vir gebied activeert.

(6) VirD eiwitten (plaats-specifieke ss-endonucleasen) knippen (nick) de onderste streng van het

T-DNA (bij de LB en RB plaatsen)

(7) De T-streng wordt verpakt in VirE eiwit en gepiloteerd door VirD naar de plant nucleus.

OV (overdrive) stimuleert deze stap. (Octopine stammen.)

(8) Het T-DNA wordt covalent geïntegreerd in het plantengenoom en tot expressie gebracht.

Dit omvat genen die auxine en cytokine laten aanmaken en tot permanente groei leiden

(tumorvorming)

(9) Het ocs of nos gen komt tot expressie en het opine wordt gesecreteerd ten voordele van de

bacteriën die het als C, N en energiebron kunnen gebruiken in deze parasitaire interactie. Het vir-gebied wordt niet zelf overgedragen. Bij nopaline tumoren is het overgedragen gebied (T-DNA) ongeveer 22 kb ; bij octopine tumoren ongeveer 12, of, in sommige gevallen, 2 segmenten : 13 kb + 7 kb.

N

Ontwapening van het Ti-plasmide : pGV3850- RB en LB zijn voldoende als cis-element voor excisie en transfer

(“overdrive” bij RB (in sommige Ti-plasmiden) intensifieert dit proces)

- de genen die het tumoraal karakter bepalen spelen hierbij geen rol

=> vervanging van het (grootste deel van het) T-DNA door pBR322

Klonering in Ti-derivaten- transfer door co-integraat strategie

- pBR322 sequenties in pGV3850 zijn doelwit voor homologe recombinatie in

Agrobacterium tumefaciens

- het vir gebied blijft op hetzelfde plasmide

Binaire benadering voor transfer- splitsing van de “functionele” gebieden : => 2 plasmiden

- één zonder T-gebied (noch LB, RB), met andere Ti-elementen

- één met het te tranfereren gebied, geflankeerd door LB & RB nb. nos of ocs kunnen als herkenningsmerker aanwezig blijven

Gebruik van Ti-plasmiden als vectoren N

Structuur van het Ti plasmide, dat “ontwapend’ is, m.a.w. waarin het T-DNA vervangen is door pBR322 (dat een doelwit voor homologe recombinatie is).

N

Vorming van een co-integraatmet pGV3850 door homologerecombinatie.

Het gebied tussen de driehoekjes ( ) wordt naar de plant overgedragen.

N

Basisstructuur vectoren (binaire benadering)- selectiemerkers (E. coli, A. tumefaciens, plant), bacteriële ori’s- expressie-elementen (promotor, terminatiegebied)- eventueel herkenningsmerker of reporter (“scorable”)

N