UJET DE LA THESE - univ-oran1.dz · 2019-01-21 · dans le processus de cancérisation autres que...

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MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D'ORAN ES-SENIA

FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

LABORATOIRE DE BIOLOGIE DU DEVELOPPEMENT

Thèse présentée en vue de l'obtention du diplôme de Doctorat

Option: Embryogenèse & Oncogenèse

Présentée par

ABERKANE Meriem Samia

SUJET DE LA THESE:

Etude de l’implication des gènes du métabolisme des xénobiotiques :

GST, MDR1, CYP3A5, UGT1A1 et TS dans la survenue du cancer

colorectal dans la population de l’Ouest Algérien

Devant le jury composé de :

- Président : Pr Saidi D. Faculté des Sciences, Université d’Oran.

- Directrice de thèse : Pr El Kebir F.Z. Faculté des Sciences, Université d’Oran.

- Examinateur : Pr Colonna P. Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris.

- Examinateur : Pr Mehtar N. Université des Sciences et Technologies d’Oran.

- Examinateur : Pr Djellali L. Faculté de Médecine. Université d’Oran.

- Examinateur : Pr Benlatreche C. Faculté de Médecine. Université de Constantine.

- Invité : Dr Boudjema A. Université des Sciences et Technologies d’Oran.

Année 2009

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A mes parents,

A mes enfants Mokhtar et Karim

A mon mari Abdelkader

A ma sœur Kenza

A mon frère Abou Khalil et son épouse Lamia

A mes neveux

A Mme Zahia Chentouf-Mentouri

A Melle Martine Muffat-Joly

A ma belle famille

A tous mes amis

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REMERCIEMENTS

Madame le professeur FZ El Kebir, vous qui m’avez accueillie dans votre

laboratoire, encouragée et conseillée, tout au long de ce travail, soyez assurée

de ma sincère gratitude.

Monsieur le Professeur D SAIDI, votre compétence reconnue de tous n’a d’égal

que votre disponibilité et votre gentillesse. Vous avez accepté de présider ce

jury, croyez à ma profonde reconnaissance.

Madame le Professeur N MEHTAR, vous m’avez permis d’accéder à votre

laboratoire pour la réalisation d’une partie de ce travail et me faites aujourd’hui

l’honneur de l’évaluer. Je vous en remercie et tiens à vous exprimer ma gratitude.

Madame le Professeur C BENLATRECHE, vous avez accepté de juger ce travail,

j’en suis honorée et vous prie de croire en ma sincère reconnaissance.

Monsieur le Professeur P COLONNA, après m’avoir encadrée pour la réalisation

de mon premier mémoire aujourd’hui vous me faites l’honneur d’examiner mon

travail avec la disponibilité et la modestie qui vous caractérisent. Je vous en

remercie du fond du cœur.

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Monsieur le professeur L DJELLALI, je vous suis infiniment reconnaissante de

m’avoir ouvert votre service clinique et vous remercie d’accepter de juger mon

travail.

Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr A BOUDJEMA pour son amitié,

sa disponibilité, ses encouragements et sa précieuse aide.

Je remercie Madame le Professeur MA LORIOT ainsi que Madame AM

HOULLIET du laboratoire de toxicologie moléculaire de la Faculté de Médecine

du Centre Universitaire Paris-Descartes (INSERM U-775) pour leur

collaboration scientifique et leur amitié.

Je remercie également mes collègues et amis pour leur contribution à la

réalisation de ce travail, en particulier le Dr B LARBAOUI, Le Dr F

CHENNTOUF, le Dr T SAHRAOUI, Mr M FODIL, et Melle F ZEMMANI.

Enfin, je remercie les organismes et institutions qui ont permis de mener à

terme ce travail :

- Le Laboratoire de toxicologie moléculaire de la Faculté de Médecine du

Centre Universitaire Paris-Descartes (INSERM U-775)

- Le Laboratoire de Biologie du Développement de l’Université d’Oran.

- Le service d’Oncologie du CHU d’Oran.

- L’Agence Nationale pour le Développement de la Recherche en Santé

(ANDRS).

- La Faculté de Médecine de l’Université d’Oran.

- Le Laboratoire de Génétique Moléculaire et Cellulaire de l’USTO.

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Résumé

En Algérie, les cancers colorectaux (CCR) sont en troisième position après ceux du poumon et de la vessie chez

l’homme et ceux du sein et du col utérin chez la femme. Les gènes considérés comme ayant une implication

significative dans la mise en place du processus de cancérisation sont les oncogènes, les anti-oncogènes, les

gènes de réparation de l’ADN et les gènes du métabolisme des xénobiotiques. Les xénobiotiques sont des

molécules étrangères à l’organisme dont font partie les médicaments, les polluants de l’eau ou de

l’atmosphère, les additifs alimentaires et certains composés naturels des aliments. De nombreux

xénobiotiques sont potentiellement carcinogènes et font l’objet d’une métabolisation dans l’organisme au

cours de laquelle interviennent de nombreuses enzymes.

L’objectif de ce travail est de rechercher d’éventuelles associations entre les polymorphismes des gènes du

métabolisme et du transport des xénobiotiques : GSTM1, GSTT1, GSTP1 (313A>G et 341C>T), CYP3A5

6986A>G, MDR1, UGT1A1((TA)6>(TA)7 et -3156 G>A), TS (2R>3R et délétion/insertion de 6pb)

et la survenue du CCR sur une population constituée de 99 malades et 101 contrôles, tous originaires de

l’Ouest Algérien.

Aucune relation d’association entre les polymorphismes des gènes GST, CYP3A5, MDR1, UGT1A1 et la

survenue du CCR n’a été retrouvée dans notre population suggérant ainsi l’intervention d’autres mécanismes

dans le processus de cancérisation autres que ces gènes. En revanche, une association entre le polymorphisme

délétion/insertion de 6pb du gène de la thymidylate synthétase (TS) et la survenue du CCR a été retrouvée

dans notre population. En effet, les individus porteurs de l’insertion 6pb (allèle 6pb) dans le gène de la TS

avaient plus de risque de développer un CCR que les individus présentant la délétion de 6pb (allèle 0pb)

(OR=1.92, p=0.018). De plus, une différence statistiquement significative a aussi été retrouvée entre les cas et

les contrôles concernant les génotypes, suggérant que les deux génotypes 0pb/6pb et 6pb/6pb sont associés à

un plus haut risque de CCR.

La TS est une enzyme capitale dans la biosynthèse de la thymidine requise pour la synthèse et la réparation

de l’ADN. Elle intervient aussi dans le métabolisme des folates, connus pour leur rôle protecteur vis-à-vis du

CCR. Ce polymorphisme délétion/insertion de 6pb, bien que siégeant dans la région 3’UTR non codante du

gène de la TS pourrait affecter la stabilité ou la structure secondaire de l’ARNm de la TS régulant de ce fait le

taux d’expression de cette enzyme. Nos résultats suggèrent que l’insertion de 6pb serait corrélée à une plus

faible activité de la TS augmentant de ce fait la susceptibilité à développer le CCR via une déficience dans le

métabolisme des folates. De plus, un manque de reserve en thymidine du à la diminution du taux de TS

entrainerait probablement la cellule sur une voie de cancérisation à cause de l’incorporation d’uracile au lieu

de la thymine dans la chaine d’ADN.

Par ailleurs, les enzymes codées par ces gènes peuvent moduler la réponse et/ou la toxicité à des molécules utilisées dans la chimiothérapie du CCR comme le 5Fluorouracile, l’Irinotécan ou l’Oxaliplatine.

Ce premier travail nous ouvre donc des perspectives intéressantes dans la recherche de corrélations entre certains polymorphismes et la survenue d’autres pathologies mais aussi la réponse individuelle à la chimiothérapie du CCR.

Mots clés : Cancer colorectal, CCR, Xénobiotiques, GST, CYP3A5, MDR1, UGT1A1, TS.

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SOMMAIRE

I/ Introduction ............................................................................................................................................8

II/ Aspect clinique................................................................................................................................... 10

1 Description ....................................................................................................................................................... 10

2 Traitement ....................................................................................................................................................... 10

2.1 Chirurgie ............................................................................................................................................................................................. 10 2.2 Radiothérapie................................................................................................................................................................................... 11 2.3 Chimiothérapie ................................................................................................................................................................................ 11

III Aspect génétique ................................................................................................................................ 13

1 Cancer du colon héréditaire ..................................................................................................................... 13

1.1 La polypose adénomateuse familiale (PAF) ..................................................................................................................... 13 1.2 Le syndrome de Lynch (HNPCC) ............................................................................................................................................. 14

2 Mécanismes moléculaires dans la cancérogenèse colorectale ................................................... 14

2.1 L’instabilité des microsatellites............................................................................................................................................... 15 2.2 L’instabilité chromosomique .................................................................................................................................................... 15

IV Pharmacogénétique des agents anticancéreux utilisés dans la chimiothérapie du CCR

...................................................................................................................................................................... 28

1 Mécanismes d’action des agents anticancéreux cytotoxiques .................................................... 29

2 Pharmacogénétique du 5-Fluorouracile ............................................................................................. 29

3 Pharmacogénétique de l’Irinotécan ...................................................................................................... 33

4 Pharmacogénétique de l’Oxaliplatine .................................................................................................. 36

But de l’étude ........................................................................................................................................... 37

V Population et méthodes..................................................................................................................... 40

1 Population d’étude........................................................................................................................................ 40

2 Gènes explorés ................................................................................................................................................ 40

2.1 Gène CYP3A5: SNP 6986A>G .................................................................................................................................................... 40 2.2 Gènes GST : délétion de GSTM1, délétion de GSTT1 et SNPs : GSTP1 313A>G et GSTP1 341C>T ......... 41 2.3 Gène UGT1A1: Le VNTR UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 et le SNP -3156 G>A ............................................................ 41 2.4 Gène MDR : SNP 3435C>T .......................................................................................................................................................... 42 2.5 Gène TS: Répétition 2R>3R dans la région 5’UTR du gène TS et délétion/insertion de 6pb dans sa

région 3’UTR ............................................................................................................................................................................................. 42

3 Méthodes d’exploration génétique ......................................................................................................... 43

3.1 Extraction et dosage de l’ADN ................................................................................................................................................. 43 3.2 Exploration de la délétion des gènes GSTT1, GSTM1 et du SNP GSTP1 313A>G par PCR multiplex,

digestion enzymatique et analyse des RFLP. .......................................................................................................................... 44 3.3 Analyse des SNPs : GSTP1 341C>T, MDR1 3435C>T, CYP3A5 6986A>G et UGT1A1 -3156 G>A par

PCR quantitative en temps réel....................................................................................................................................................... 45 3.4 Exploration des polymorphismes UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7, TS5’ « 2R>3R » et TS3’

« délétion/insertion de 6pb » par analyse de fragments ................................................................................................... 49

7

4 Analyse statistique ....................................................................................................................................... 52

VI Résultats et discussion ........................................................................................................................ 53

1 Résultats et discussion du génotypage des sujets pour les gènes GSTM1, GSTT1, et GSTP1

exons 5 et 6 ............................................................................................................................................................ 53

2 Résultats et discussion du génotypage des sujets pour le gène MDR1 .............................................. 64

3 Résultats et discussion du génotypage des sujets pour le gène CYP3A5........................................... 67

4 Résultats et discussion du génotypage des sujets pour le gène UGT1A1 ............................... 71

5 Résultats et discussion du génotypage des sujets pour le gène TS ........................................... 77

Conclusion et perspectives....................................................................................................................... 86

Réferences Bibliographiques .............................................................................................................. 88

ANNEXES .................................................................................................................................................... 97

Revue bibliographique

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I/ INTRODUCTION

Le cancer colorectal est un cancer siégeant dans la région du côlon et du rectum (partie

terminale du colon). Il est caractérisé par une prolifération anormale de cellules dans le gros

intestin et par la formation de carcinomes glandulaires ou adénocarcinomes. Les cancers du

côlon et du rectum étant assez semblables, ils sont regroupés sous le terme de cancer

colorectal (CCR).

Le cancer colorectal constitue un principal problème de santé dans le monde. En effet, il

représente la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde, avec 400.000 décès

environ annuellement (European Journal of Cancer, 2005).

Il est 10 fois plus fréquent aux états unis d’Amérique qu’en Afrique. En 2006, on lui

incombait plus de 55 000 décès aux états unis (Jemal et al, 2006). Ces différences sont la

conséquence du rôle essentiel de l’alimentation dans sa survenue (Irigaray et al, 2007). En

Europe, il représente le second cancer, en termes de fréquence, chez la femme, après le cancer

du sein et le troisième chez l'homme après le cancer du poumon et celui de la prostate (Boyle

et al, 2005).

En Algérie et particulièrement à Oran les cancers colorectaux sont en troisième position après

ceux du poumon et de la vessie chez l’homme et ceux du sein et du col utérin chez la femme

avec une augmentation de plus de 50% des cas entre 1986 et 2000 (Registre du cancer d’Oran,

2006).

A l’échelon moléculaire, le développement d’un adénome puis d’un cancer colorectal est le

résultat d’une accumulation d’évènements génétiques complexes altérant le fonctionnement

normal d’un certain nombre de gènes impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la

division cellulaire. Les gènes considérés comme ayant une implication significative dans la

mise en place du processus tumoral sont les oncogènes, les anti-oncogènes, les gènes de

réparation de l’ADN et les gènes du métabolisme des xénobiotiques (Vogelstein et al, 1988).

L’organisme vivant est constamment exposé aux composés exogènes carcinogènes tels que la

dioxine, les nitrosoamines et les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). Pour


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neutraliser leurs effets toxiques, l'organisme possède un système multienzymatique complexe

permettant l'élimination de ces substances hydrophobes par les urines ou la bile. Toute

variation dans l'activité de ces enzymes pourra potentiellement avoir des répercussions

significatives sur le devenir des composés médicamenteux et carcinogènes et sur les quantités

des métabolites produits. Actuellement, il est clairement établi que les polymorphismes

génétiques des enzymes du métabolisme des médicaments (EMX) influencent la susceptibilité

individuelle vis-à-vis de certaines pathologies comme les cancers. Ces analyses se regroupent

sous le terme de pharmacogénétique (Cross et al, 2004). Un autre volet de cette discipline

consiste à œuvrer pour une meilleure connaissance des cibles moléculaires des

chimiothérapies afin de permettre l’identification de facteurs génétiques prédictifs de la

réponse et/ou de la toxicité aux médicaments utilisés dans la chimiothérapie de différents

cancers, dont les cancers colorectaux (Loriot et al, 2004).

L’objectif de la présente étude est la recherche d’éventuelles associations entre les

polymorphismes des gènes impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques et la survenue

du cancer colorectal sur une population de l’Ouest Algérien. Ce premier travail nous ouvre

des perspectives intéressantes dans la recherche de corrélations entre certains polymorphismes

et la réponse individuelle à la chimiothérapie du CCR.


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II/ ASPECT CLINIQUE

1 DESCRIPTION

Le gros intestin appelé aussi colon, se situe dans la cavité abdominale où il prend la forme

d’un « U » renversé. Il fait suite à l’intestin grêle dans la fosse iliaque droite puis remonte le

long de l’abdomen, qu’il traverse dans sa partie supérieure, pour redescendre ensuite jusque

dans la fosse iliaque gauche où il forme une boucle en S (colon sigmoïde). Il se continue

ensuite avec le rectum puis, 15 cm plus bas, avec le canal anal pour se terminer par l’anus.

Les tumeurs malignes du colon se développent dans 70 pour cent des cas dans le sigmoïde ou

le rectum, et sont issues de la muqueuse (couche interne) ou plus souvent d'un polype (tumeur

bénigne qui s'est cancérisée).

Les polypes adénomateux naissent de l'épithélium glandulaire, les cellules se développant

sans restriction et sans se différencier. Ils peuvent être sessiles ou pédiculés, composés

d'abord de cellules de type tubulaire ou de type villeux. Au niveau des cryptes, là où se

renouvelle l'épithélium, on peut observer des zones de cancer colique bien différencié. Il

existe en outre des polypes hyperplasiques, mais dont l'évolution vers le cancer n'est pas

fréquente. Le polype adénomateux semble être la maladie pré cancéreuse à partir de laquelle

se développe le cancer. Les polypes sont au moins 10 fois plus fréquents que les cancers.

2 TRAITEMENT

2.1 CHIRURGIE

La chirurgie est le traitement de référence des cancers colorectaux. Pour traiter un cancer

colorectal potentiellement curable, la première démarche est le traitement de la tumeur

primitive par exérèse chirurgicale. L’évaluation préopératoire et l’examen


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anatomopathologique de la tumeur primitive permettent de poser l’indication d’un traitement

complémentaire.

L’examen anatomopathologique précise le grade de la tumeur (extension en profondeur de la

tumeur, présence de ganglions envahis, présence de métastases à distance).

2.2 RADIOTHERAPIE

Pour les tumeurs colorectales localement avancées, la radiothérapie est un traitement

complémentaire à la chirurgie qui permet non seulement de diminuer les risques de récidive

locorégionale, mais aussi d’augmenter la survie globale des patients. La radiothérapie n’a en

aucun cas une visée curative dans le traitement des cancers colorectaux.

2.3 CHIMIOTHERAPIE

Les résultats souvent décevants de la chirurgie exclusive dans les formes évoluées conduisent

à lui associer une chimiothérapie adjuvante. Les molécules communément utilisées dans la

chimiothérapie du cancer colorectal sont les suivantes :

2.3.1 Le 5-Fluorouracile

De tous les médicaments anticancéreux, le 5-fluorouracile figure parmi les plus anciens et les

moins onéreux (Aparicio et al, 2002).

Synthétisé en 1957 par Heidelberger à l’Université du Wisconsin (USA), le 5-fluorouracile est

l’anticancéreux le plus utilisé en chimiothérapie du CCR. Il a été développé à partir de

l’uracile, base azotée qui entre dans la composition de l’ARN. Un atome de fluor remplace un

atome d’hydrogène en position 5, d’où le nom de 5-fluorouracile ou encore 5FU. Le

fluorouracile est un antimétabolite qui « mime » l’uracile, précurseur de la thymine, base


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nécessaire à la synthèse d’ADN (De Chaisemartin et al, 2005). Il inhibe la thymidylate

synthétase empêchant la méthylation de l’uracile en thymine et ses métabolites sont

incorporés dans l’ADN et l’ARN bloquant ainsi leur synthèse. Comme la plupart des

antimétabolites, le fluorouracile agit sur les cellules en phase S du cycle cellulaire (phase de

synthèse d’ADN). Le fluorouracile se fixe aux protéines du sang et diffuse rapidement dans

l’organisme. Il franchit la barrière hémato-encéphalique où sa concentration est faible mais

persistante. Il est métabolisé dans le foie. Seule une petite fraction est éliminée par le rein. La

prévention des complications toxiques du fluorouracile passe par une étude pharmacologique.

Ainsi une toxicité sévère est à redouter pour les patients présentant un déficit congénital en

une enzyme, la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) qui intervient à la première étape

du catabolisme du fluorouracile et dégrade plus de 80% de cette molécule.

2.3.2 Oxaliplatine

L'oxaliplatine associée au 5-fluorouracile a démontré son efficacité dans les cancers du côlon

de stade III et IV. Cette association est régulièrement prescrite dans ces deux indications. Ce

composé bloque la réplication de l'ADN et les enzymes responsables de son métabolisme,

comme les glutathion S-transférases (GST), jouent un rôle dans l'efficacité de cette thérapie

(Stoehlmacher et al, 2002).

2.3.3 Irinotécan ou CPT-11

L'Irinotécan (Campto) utilisé dans le traitement du cancer du côlon est une pro-drogue dont le

métabolite actif, le SN-38, inhibiteur de la topo-isomérase I, est 100 à 1000 fois plus actif que

la molécule mère. Ce métabolite est produit par des estérases notamment la carboxylestérase

puis normalement glucurono-conjugué (SN-38G) par une uridinediphosphate-

glucuronosyltransférase de type 1 (UGT1) qui le rend inactif et atoxique avant d'être éliminé

par la bile et les urines. Il peut subir un cycle entérohépatique en cas de déconjugaison par les

glucuronidases bactériennes intestinales et redevenir actif et toxique au niveau intestinal sur

les cellules à renouvellement rapide comme les cellules du colon (De Jong et al, 2006).


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III ASPECT GENETIQUE

1 CANCER DU COLON HEREDITAIRE

Bien que nécessairement réducteurs et schématiques, au regard de nos connaissances encore

fragmentaires, quelques aspects prédominants émergent dans la compréhension des

mécanismes de la cancérogenèse. S’agissant du cancer colorectal, ces mécanismes

moléculaires ont été tout d’abord mis en évidence sur deux variantes héréditaires principales :

la polypose adénomateuse familiale (PAF) et le syndrome de Lynch ou HNPCC (Hereditary

Non Polyposis Colorectal Cancer) qui constituent environ 5% de tous les CCR. Les

recherches sur ces deux syndromes ont permis de mieux comprendre les bases moléculaires

du cancer colorectal intervenant dans un cadre sporadique c'est-à-dire en dehors d'un contexte

héréditaire prédisposant au cancer du côlon (Aaltonen et al, 1993).

1.1 LA POLYPOSE ADENOMATEUSE FAMILIALE (PAF)

La polypose adénomateuse familiale (PAF) est un syndrome autosomique dominant en

rapport avec des altérations du gène APC (Adenomatous Polyposis Coli). Cette maladie

représente 1 % des cancers colorectaux et affecte environ un individu sur 10 000 (Bjork et al,

1999). Des centaines voire des milliers de polypes sont observés tout le long du colon vers

l'âge de 30-40 ans. Vers 40 ans, un ou plusieurs de ces polypes dégénèrent, entraînant un

cancer colique évolutif.

Le gène APC est situé sur le bras long du chromosome 5 et code pour une protéine de 2843

acides aminés. Cette dernière contient une variété de domaines fonctionnels impliqués dans la

transcription, la régulation du cycle cellulaire, la différentiation, et l'apoptose. Des mutations

dans le gène APC ont été démontrées en 1991 (Kinzler et al 1991) et à ce jour, plus de 800

mutations ont été identifiées. Les mutations de phase prédominent et des mutations non-sens

sont retrouvées dans un tiers des cas, tandis que les grandes délétions et mutations faux sens

représentent des causes plus rares de PAF (Nilbert et al 2008).


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1.2 LE SYNDROME DE LYNCH (HNPCC)

Le syndrome HNPCC (hereditary non polyposis colon cancer) représente environ 5 % des

CCR. Il constitue une prédisposition héréditaire au cancer, dont les critères de reconnaissance

reposent sur des informations individuelles et généalogiques. En effet, des critères dits

d’Amsterdam ont été définis pour ce syndrome : 3 sujets atteints de cancer appartenant au

spectre (cancer colorectal, endomètre, intestin grêle, voies urinaires), l’un étant lié au premier

degré aux 2 autres, 2 générations étant atteintes, et un des cancers au moins s’étant révélé

avant l’âge de 50 ans (Lynch et al, 1996). Le syndrome HNPCC est lié, dans environ 70 %

des cas, à une altération constitutionnelle d'un gène de réparation des mésappariements de

l’ADN, les gènes MMR (MisMatch Repair). Les cellules tumorales présentent alors un

phénotype particulier appelé MSI (Microsatellite Instability). L'instabilité des microsatellites

(MSI) se caractérise par la variation anormale du nombre de séquences répétées dans l'ADN

tumoral comparé à l'ADN du même patient provenant de tissu sain. Celle-ci est présente dans

95 % des cas de HNPCC mais également dans environ 15 % des cancers du côlon non

héréditaires (ou sporadiques) (Lamoril et al 2006).

2 MECANISMES MOLECULAIRES DANS LA CANCEROGENESE COLORECTALE

Il existe deux principales voies de cancérogenèse colorectale et toutes deux résultent d’une

instabilité génétique, l’une, la plus fréquente, à l’échelon chromosomique (instabilité

chromosomique nucléaire « CIN »), l’autre à l’échelon des nucléotides (instabilité des

microsatellites « MSI »). Ces deux voies différentes à l’échelle moléculaire donnent des

lésions semblables au plan morphologique (les adénomes), mais dont le génie évolutif vers le

cancer est différent et plus important dans la voie de l’instabilité des microsatellites (Hamilton

et al, 2006).


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2.1 L’INSTABILITE DES MICROSATELLITES

Ce mécanisme concerne 15 % des cancers colorectaux sporadiques et est observé de façon

plus claire dans le cadre du syndrome de Lynch. Ces cancers sont appelés MSI ou RER+

(Replication Error). Les cellules cancéreuses ont un contenu en ADN normal (diploïdie),

n’ont pas de pertes chromosomiques et ont des anomalies des gènes MMR (Mitchell et al,

2002). Ces gènes codent pour des protéines dont le rôle est de détecter et de réparer les erreurs

de réplication de l’ADN survenues au cours de la mitose. La mutation ou la méthylation de la

région promotrice des gènes MMR induit une déficience de ce système de réparation et les

mutations vont s’accumuler, préférentiellement au niveau des microsatellites, régions du

génome particulièrement sujettes aux erreurs de réplication (Won-Suk Lee et al, 2008).

2.2 L’INSTABILITE CHROMOSOMIQUE

Celle-ci représente le mécanisme moléculaire de cancérogenèse le plus fréquent dans le

cancer colorectal et concerne 80 à 85 % des cancers colorectaux sporadiques. Ces cancers

sont appelés LOH+ (Loss of Heterozygoty) et sont caractérisés par la survenue de pertes

allèliques (pertes de fragments chromosomiques ou pertes d’hétérozygotie). Les cellules

cancéreuses ont un contenu anormalement élevé en ADN (hyperploïdie), des pertes

chromosomiques fréquentes et des mutations fréquentes (Lièvre et al, 2005). Ces altérations

touchent trois principales catégories de gènes : les oncogènes, les anti-oncogènes et les gènes

du métabolisme des xénobiotiques.

2.2.1 Oncogènes

Physiologiquement, les proto-oncogènes ont une action stimulatrice sur la division cellulaire

mais leur expression est soumise à une régulation fine durant le cycle cellulaire. Ils sont

susceptibles d'être activés en oncogènes lorsqu'ils subissent des altérations somatiques


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(mutation ponctuelle, translocation ou amplification) ou plus rarement constitutionnelles.

Dans cette catégorie, les plus documentés sont les suivants:

Gène ras

En analysant les tumeurs du côlon d'un point de vue moléculaire, plusieurs gènes impliqués

dans la cancérogenèse ont déjà pu être mis en évidence. Parmi ceux qui sont le plus souvent

incriminés, l’oncogène « ras », en particulier K-ras et N-ras (Gosse-Brun et al, 1998).

Au nombre de trois (K-ras, H-ras et N-ras), les protéines « ras » sont au cœur de nombreuses

voies de signalisation. Elles intègrent et interprètent divers signaux venus de l'extérieur pour

les véhiculer à l'intérieur de la cellule. Pour cela, elles oscillent entre deux états : actif et

inactif. Pour être actives, les protéines « ras » doivent être ancrées à la face interne de la

membrane plasmique. Sous cette forme, elles déclenchent notamment la prolifération des

cellules. Lorsqu'une mutation intervient dans l’un des gènes ras, les protéines sont alors

produites sous une forme continuellement active et les cellules ne cessent de se diviser en

multipliant les erreurs. Le gène ras (K-ras et N-ras) est l'objet de mutations somatiques dans

plus de 50% des tumeurs coliques, et dans environ 50% des adénomes de plus de 1 cm de

diamètre. En revanche, il est peu muté dans les petits adénomes (moins de 10%). Les

mutations retrouvées dans le CCR ne portent pas sur le gène H-ras, mais sur les codons 12 et

13 du K-ras et 12, 13, 61 du N-ras (Soh et al, 1993). Le rôle exact de ces mutations n'est pas

connu. Elles pourraient transformer un petit adénome en grand adénome dysplasique, ou bien

être présentes d'emblée dans les cellules très proliférantes.

Gène c-src

Le src cellulaire « c-src » est un homologue humain de l'oncogène viral du sarcome de Rous,

« v-src ». Le gène c-src a été impliqué dans le développement et la progression de nombreux

cancers humains (Warmuth et al, 2003), y compris le cancer colorectal, et semble nettement

activé dans ce dernier (Iravani et al, 1998). La première étude ayant étayé cette hypothèse est


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celle qui a rapporté une mutation ponctuelle du gène src au codon 531 à l’origine d’une

activation de c-src (Irby et al 1999).

Gène c-myc

A l’origine, la première implication de ce gène dans les cancers humains a été mise en

évidence dans les lymphomes de Burkitt chez lesquels la translocation t (8-14) (q24;q32)

conduit à la juxtaposition du gène c-myc devant l'élément enhancer du gène codant pour les

chaînes lourdes des immunoglobulines. Cette hyper expression tissu-spécifique de c-myc est

l'élément clé dans l'établissement du processus néoplasique de ces lymphomes (Soussi, 2001).

Depuis, c-myc a été incriminé dans différents cancers dont le cancer colorectal. En effet,

l’amplification de la région 8q24 a été récemment retrouvée associée à un risque augmenté de

CCR (Gruber et al, 2007).

2.2.2 Gènes suppresseurs de tumeurs ou anti-oncogènes

Les gènes suppresseurs de tumeurs ou anti-oncogènes, identifiés grâce aux formes

héréditaires de cancer (ex : gène APC) se comportent dans leur état normal comme des

inhibiteurs de la division cellulaire. Leur mode de fonctionnement est récessif au niveau

cellulaire, c'est-à-dire que, pour que le cancer apparaisse, les deux allèles d'un même anti-

oncogène doivent être inactivés (par mutations ponctuelles, délétions ou une combinaison des

deux), selon la théorie du double événement mutationnel décrit par Knudson dans le cas du

rétinoblastome (Knudson et al, 1971).

Gène APC

Des mutations qui inactivent l’anti-oncogène APC sur le chromosome 5q sont responsables

des tous premiers dérèglements observés lors de la constitution des adénomes de petite taille.

Au niveau du chromosome 5q, on observe une perte de l'hétérozygotie (LOH), c'est-à-dire que

seul un des deux chromosomes parait affecté. Cependant, en général, l'autre copie est


18

inactivée (d'après la théorie de Knudson) ; on évoque alors la présence d'une nouvelle protéine

dominante synthétisée par l'allèle muté. La mutation sur le gène APC est très précoce dans le

développement tumoral et il semblerait qu’il soit muté dans 80 % des cancers du côlon

(Powell et al 1992).

Gène MCC

Le gène MCC (Mutated in Colorectal Cancer) se situe très près du gène APC sur le

chromosome 5q21, et a été retrouvé muté dans environ 10 à 15% des cancers colorectaux. Il

semble avoir un rôle suppresseur probable en association avec le gène APC (Kohonen-Corish

et al, 2007).

Gène DCC

Une perte de l'hétérozygotie est retrouvée sur le chromosome 18q, dans 70% des cancers

colorectaux évolués, mais dans seulement 10% des adénomes débutants. A ce niveau a été

identifié un gène appelé DCC (Deleted in Colon Carcinoma) contenant plus de 29 exons, et

codant pour une protéine transmembranaire. Le gène DCC est exprimé dans toutes les cellules

muqueuses normales et semble être responsable des interactions cellulaires de l'épithélium

normal. Son inactivation serait responsable des troubles de l'adhésion cellulaire, de l'invasion

et des métastases dans le CCR (Beggs et al, 2008)

Gène p53

Le gène p53 code pour un facteur transcriptionnel capable de réguler le cycle cellulaire,

l'apoptose et la réparation de l'ADN (Olivier et al 2003). Ce gène localisé sur le chromosome

17p13 est le plus communément muté dans tous les types de cancers (Levine et al, 1994).

Concernant le CCR, les mutations du domaine central du gène p53 sont les plus souvent

incriminées et les polymorphismes qui lui sont le plus souvent associés sont situés dans le

codon 72 de l’exon 4 (Schneider-Stock et al, 2004; Mammano et al, 2008).


19

2.2.3 Gènes du métabolisme et du transport des carcinogènes

Les xénobiotiques, dont les carcinogènes, sont des molécules de faible masse moléculaire

étrangères à l’organisme. Il s’agit par exemple des médicaments, des polluants de l’eau ou de

l’atmosphère, des additifs alimentaires mais également de certains composés naturels des

aliments. Les substances les plus souvent impliqués dans les processus cancérigènes (cancers

respiratoires, de la vessie, de la peau, des voies aérodigestives supérieures, des systèmes

lymphatique et hématopoïétique et des voies digestives) sont les hydrocarbures aromatiques

polycycliques (HAP) et les amines hétérocycliques (AH). Parmi les expositions

environnementales aux HAP les plus fréquentes, des produits naturels, des médicaments, et

des polluants de l’environnement, toxines végétales et animales, dérivés des combustibles

domestiques et industriels, solvants, colorants, additifs alimentaires, pesticides, herbicides,

etc….

Généralement hydrophobes, les xénobiotiques ont pour tendance naturelle de s’accumuler

dans les phases lipidiques des membranes cellulaires. Elles entraînent ainsi une mort

inéluctable des organismes si ceux-ci ne s’étaient dotés, au cours de l’évolution, de systèmes

enzymatiques permettant leur détoxication et leur élimination.

Le processus de détoxication se déroule selon trois phases regroupant différentes enzymes de

biotransformation (phase I et II), et des transporteurs (phase III) (Figure 1).

Les réactions de phase I, dites de fonctionnalisation, permettent l’introduction d’une fonction

chimique nouvelle (-OH, NH2, COOH) rendant la molécule plus polaire. Les xénobiotiques

pénètrent facilement dans la cellule s’ils sont hydrophobes. Ils sont alors pris en charge par

ces enzymes, dont les plus importantes sont les cytochromes P450 (CYP450) qui catalysent

une réaction de mono oxygénation et peuvent transformer ces carcinogènes en métabolites

très électrophiles, voire génotoxiques.

Les réactions de phases II, dites de conjugaisons, permettent l’ajout d’un radical hydrophile et

sont réalisées soit directement sur le xénobiotique inchangé, soit sur les métabolites

« fonctionnalisés » générés par la phase I. Ces réactions de conjugaison avec un groupement

(glutathion, acide glucuronique, méthyl, acétyl…), augmentent l’hydrophilie de la molécule,

facilitent son transport et activent son élimination par voies rénale et biliaire. Les enzymes de


20

la phase II sont, entre autres, les glutathion S-transférases (GST), uridine diphosphate

glucorono-transférase (UGT1A1), la glutathion peroxydase, la sulfotransférase etc… (Allorge

et al, 2004).

Les enzymes de phase III permettent l’élimination des conjugués hydrophiles. Ce sont

essentiellement des glycoprotéines membranaires comme la P-glycoporotéine P-gp, produit

du gène MDR1 « Multi Drug Resistance » (Schinkel et al, 1997) permettant le transport actif

des xénobiotiques et des conjugués de la phase II hors de la cellule (Silverman JA, 1999).

Elles participent à l’excrétion hors de ces cellules par la voie biliaire (Stieger B et al 1998) et

sont à l’origine de résistances multiples car elles diminuent la quantité de médicament

présente dans la cellule (Silverman et al 1999). Toutefois, le métabolisme des xénobiotiques

ne conduit pas toujours à la détoxication de ces composés. Dans certains cas, le produit oxydé

ou réduit peut manifester une très forte réactivité par attaque électrophile ou nucléophile des

macromolécules environnantes (protéines, acides nucléiques). Ainsi, la formation d’adduits

sur l’ADN peut entraîner l’apparition de mutations ponctuelles et initier des processus de

cancérogenèse, tandis que la formation d’adduits aux protéines peut entraîner une nécrose

tissulaire et des phénomènes d’allergie (Dansette et al, 1998). Toutes ces enzymes sont donc

considérées aujourd’hui comme étant potentiellement impliquées dans la survenue de certains

cancers via leur rôle de détoxication et d’élimination des substances carcinogènes auxquelles

est souvent exposé l’organisme.


21

Figure 1: Représentation schématique du métabolisme des xénobiotiques.

Les xénobiotiques (X) sont généralement des molécules hydrophobes, qui pénètrent facilement dans la cellule.

Ils peuvent en être expulsés par des protéines comme la P-gp ou être métabolisés par fonctionnalisation (Phase

I, exemple : les CYP 450) puis/ou par conjugaison (Phase II, exemple : les GST), en produits plus hydrophiles

(XOH et XOR), ce qui facilite leur élimination hors de la cellule. L’élimination est directe ou effectuée par

l’intermédiaire de protéines dites de Phase III, comme les MRP « Multidrug Resistance Proteins » dont la P-gp

(Beaune et al, 2000).

Gène CYP450

Les cytochromes P450 (CYP450) forment une super famille multi génique codant pour des

enzymes de la phase I, impliquées dans le métabolisme oxydatif de diverses molécules aussi

bien des xénobiotiques (médicaments, pesticides, polluants, cancérigènes…) que des

substances endogènes (hormones stéroïdiennes, vitamines, acides gras…) (Perera et al, 1997).

Chez l’homme, les formes prépondérantes de cytochromes P450 sont représentées par

plusieurs familles et sous familles présentant de fortes homologies dans leurs séquences en

acides aminés (Nebert et al, 1987).

Actuellement, plus de 57 cytochromes P450s sont connus, la plupart d’entre eux possèdent

une expression type cellulaire et tissu-spécifique (Ding et al, 2003). Les réactions de


22

transformations catalysées par ces enzymes s’inscrivent dans un processus de détoxication

évitant l’accumulation de molécules potentiellement toxiques dans l’organisme.

Les cytochromes P450 ont un rôle majeur dans le développement tumoral de par leur fonction

dans le métabolisme de nombreuses substances carcinogènes (Murray et al, 2000). En effet,

ces enzymes peuvent parfois catalyser l’activation chimique de certains composés et produire

des métabolites toxiques voire cancérigènes (Bethke et al, 2007).

Les enzymes CYP450 participent également au métabolisme de nombreuses hormones

stéroïdes et d’acides gras connus pour leur implication dans le développement de certains

cancers (Li et al, 2005; Rodriguez-Antona et al, 2006).

Parmi les composés impliqués dans l’étiologie des cancers colorectaux, les hydrocarbures

aromatiques polycycliques (HAP). Ces derniers sont générés essentiellement au cours de la

cuisson de la viande à haute température et requièrent une activation métabolique par les

CYP450 par hydroxylation avant d’exercer leur effet génotoxique (Windmill et al, 1997).

Les enzymes CYP3A comme les 3A4, 3A5, 3A7 et 3A43, représentent la sous famille la plus

importante des CYP450 dans le métabolisme des xénobiotiques parce qu’ils constituent plus

de 30% de la totalité des protéines CYP450 dans le foie et métabolisent plus de 50% des

médicaments (Shimada et al 1994; Westlind et al, 2001). La plupart de ces protéines sont très

polymorphes et des mutations dans leurs gènes respectifs abolissent, réduisent ou altèrent

leurs fonctions enzymatiques respectives. A ce jour, plusieurs études se sont focalisées sur le

rôle des polymorphismes des gènes CYP1A1 (Ye et al, 2002) de CYP1A2 (Chen et al, 2005)

de CYP1B1 (Gibson et al, 2003) et de CYP2E1 (Park et al, 2003) dans les cancers du colon

ou de l’estomac.

Concernant le gène CYP3A5, localisé sur le chromosome 7q22.1, il existe plus de 34 variants

allèliques (Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee :

http://www.cypalleles.ki.se, mise à jour du 09/09/2008). Le plus connu est le SNP (single

nucleotide polymorphism) CYP3A5*3C qui consiste en une transistion 6986A>G dans

l’intron 3 qui crée un site d’épissage alternatif et code pour un ARNm tronqué avec un codon

stop prématuré aboutissant à une absence d’activité de la protéine (Kuehl et al, 2001). Ce

SNP est retrouvé chez les afro-américains, les caucasiens et les japonais à une fréquence de


23

50 à 80% (Kuehl et al, 2001; Garsa et al, 2005 ; Quaranta et al, 2006) et une étude récente a

retrouvé une association de ce SNP avec la diminution du risque de cancer de l’œsophage

(Dandara et al, 2005). Cependant, à ce jour l’impact des polymorphismes génétiques de

CYP3A5 sur le cancer colorectal n’a pas été clairement établi.

Gènes GST

Parmi les enzymes du métabolisme de phase II, les glutathion S-transférases (GST) ; Les GST

sont des enzymes polymorphes impliquées dans la conjugaison du glutathion réduit à des

composés électrophiles nocifs. Ces enzymes occupent une place très importante dans le

système de défense cellulaire (Hayes et al, 1999). Ce sont des enzymes solubles avec une

masse moléculaire d'environ 25 kDa, dimériques et largement répandues dans la faune et la

flore. Chaque sous-unité GST porte deux sites de fixation : le premier est spécifique du

glutathion réduit (GSH), site « G », alors que le second l'est pour le substrat « S »

médicamenteux ou un autre xénobiotique endogène ou exogène, site « H » (Alexandrie et al,

2002).

Les fonctions biologiques remplies par les GST sont diverses. Les plus importantes sont la

détoxication des xénobiotiques et l’activation de certains substrats. En effet, les GST

catalysent la conjugaison du GSH à différents substrats de la phase I nocifs pour la cellule.

Par conséquent, elles constituent une importante ligne de défense protégeant les composants

cellulaires (ADN, lipides et protéines) des effets délétères induits par ces composés (Giachelia

et al, 2007). Les GST jouent aussi un rôle important dans le transport de composés endogènes

comme les hormones, les stéroïdes, l’acide urique et la bilirubine (Hayes et al, 2000 ;

Cavalieri et al, 2000).

Bien que la grande majorité des xénobiotiques soit neutralisée par les GST, il existe plusieurs

cas pour lesquels la catalyse impliquant ces enzymes ne conduit pas à une détoxication

complète. Ainsi, certains conjugués néoformés sont instables et peuvent être clivés donnant

des métabolites souvent très toxiques ce qui expose la cellule à la menace chimique de ces

derniers (Lo et al, 2007).


24

Les GST représentent une importante famille d'isoenzymes réparties en huit classes : mu

(GSTM), alpha (GSTA), pi (GSTP), thêta (GSTT), zêta (GSTZ), sigma (GST), kappa (GSTK)

et oméga (GSTO) (Hayes et al, 1999).

Les cinq classes de GST, GSTA, GSTM, GSTP, GSTT et GSTZ, présentent des

polymorphismes génétiques et les plus étudiés et documentés d’entre eux sont ceux relatifs

aux sous-classes GSTM1, T1 et P1 car elles sont à l’origine de changements au niveau de

l’activité enzymatique de ces protéines (Hayes et al, 2005) (tableau 1).

Les différentes enzymes de la classe GSTM sont codées par les gènes localisés sur le

chromosome 1p13 (Ross et al, 1993). Les GSTP sont codées par un unique gène situé sur le

chromosome 11q13 (Board et al, 1989) et enfin, la classe des GSTT qui est composée de deux

sous unités : GSTT1, et GSTT2 toutes les deux codées par des gènes localisés sur le

chromosome 22q11 (Sherratt et al, 1997).

Tableau 1 : Principaux polymorphismes caractérisés pour les classes GST les plus étudiées (Habdous et al,

2004).

Classe GST Gène Variants allèliques Conséquences

Theta hGSTT1 hGSTT1*A Thr104

hGSTT1*B Thr104Pro

hGSTT1*0 Absence de l’enzyme

Mu hGSTM1 hGSTM1*A Lys173

hGSTM1*B Lys173Asn

hGSTM1*0 Absence de l’enzyme

Pi hGSTP1 hGSTP1*A Ile105/Ala114

hGSTP1*B Ile105Val/Ala114

hGSTP1*C Ile105Val/Ala114Val

hGSTP1*D Ile105/Ala114Val


25

Trois allèles sont décrits pour GSTT1: GSTT1*A, GSTT1*B et GSTT1*0 correspondant

respectivement à l’allèle sauvage, à une variation nucléotidique au niveau du codon 310

(310A>C) qui transforme le résidu thréonine 104 en proline et à une délétion du gène

GSTT1. Pour GSTM1, la variation nucléotidique (2619G>C) et une délétion complète du

gène GSTM1 sont responsables de la présence de trois allèles nommés : GSTM1*A,

GSTM1*B et GSTM1*0. GSTP1 présente quatre variants allèliques nommés GSTP1*A,

GSTP1*B, GSTP1*C et GSTP1*D. Ces variants résultent de la présence de deux variations

nucléotidiques 313A>G et 341C>T au niveau de la séquence codante. Ces transitions

nucléotidiques transforment le codon ATC (isoleucine) en position 105 dans les GSTP1*A et

GSTP1*D en GTC (valine) dans les GSTP1*B et GSTP1*C. Quant au codon GCG (alanine)

en position 114, initialement présent dans les GSTP1*A et 1*B, il est transformé en GTG

(valine) dans les GSTP1*C et GSTP1*D (Habdous et al, 2004).

La délétion à l’état homozygote des gènes GSTT1 (allèle hGSTT1*0) ou GSTM1 (allèle

hGSTM1*0) a pour conséquence une totale absence d’activité de ces deux enzymes. Tandis

que les substitutions sur le gène GSTP1 aboutissent à des changements d’acides aminés qui

s’opèrent dans le site actif de GSTP1 et conduisent à une plus faible activité de cette enzyme

due à une diminution de son affinité pour le substrat (Zimniak et al, 1994 ; Ali-Osman et al,

1997;Van der Logt et al 2004).

Etant donné le rôle que jouent les GST dans la détoxication des composés carcinogènes,

plusieurs études épidémiologiques ont examiné l'incidence de leurs polymorphismes

génétiques sur le risque de survenue et/ou d'aggravation de nombreuses pathologies comme

les cancers et les maladies cardiovasculaires.

Dans une méta-analyse, Benhamou et al concluent à une augmentation du risque de cancer du

poumon chez les sujets ayant l'allèle nul GSTM1*0 (Benhamou et al, 2002) ; tandis que

d’autres travaux ont associé ce génotype à une augmentation du risque du cancer de la

vessie (Kempkes et al, 1996 ; Engel et al, 2002) mais également à celui du cancer du larynx

(D’Errico et al, 1999). GSTM1 a également été largement étudié dans la relation avec le CCR

à cause de son taux d’expression important dans le tractus gastro-intestinal et son rôle dans la

détoxification des dérivés carcinogènes dans l’alimentation (Lin et al, 1995). La plupart de ces


26

études semblent aboutir à une association entre l’allèle nul GSTM1 et le risque accru au CCR

(Zhong et al, 1993 ; Moore et al, 2005).

Concernant le gène GSTT1, un risque relativement élevé de survenue d'astrocytomes et de

méningiomes chez les sujets porteurs de l'allèle nul GSTT1*0 a été rapporté (Elexpuru-

Camiruaga et al, 1995). De plus, une augmentation du risque de survenue du cancer de la

vessie a également été associée à cet allèle dans différentes études cas/témoins (Ma et al,

2002 ; Lee et al, 2002) mais à l’inverse du génotype GSTM1 nul, la délétion homozygote de

GSTT1 semble n’avoir aucune incidence sur le risque de survenue du cancer du poumon

(D’Errico et al, 1999).

Par ailleurs, la corrélation entre le gène GSTT1 et la survenue du CCR a fait l’objet de

nombreuses études aussi (Chenevix-Trench et al 1995 ; Deakin et al, 1996) dont quelques

unes qui ont retrouvé une association significative entre le génotype nul GSTT1 et une

augmentation du risque de survenue de ce cancer (Deakin et al, 1996) ; cependant cette

association est contestée dans d’autres travaux (De Jong et al, 2002 ; Van der Logt et al,

2004).

Concernant le gène GSTP1, de nombreuses études ont incriminé le polymorphisme dans le

codon 105 du gène GSTP1 dans le risque de CCR (Harris et al, 1998 ; Sachse et al, 2002)

mais les données des différentes méta-analyses ne vont pas toutes dans le même sens et le

risque probable d’une association de ce SNP avec la survenue du CCR reste encore à

déterminer (Houlston et al, 2001).

Ces différentes associations demeurent difficiles à établir vu les différences ethniques

importantes qui existent pour les polymorphismes de ces gènes (Longuemaux et al, 1999;

Park et al, 1999 ; Wormhoudt et al, 1999). En effet, certains polymorphismes SNPs qui ont

été associés avec le CCR dans une population pourrait être sans effet sur le risque de la

survenue de ce cancer dans d’autres populations.


27

Gène MDR1

La P-glycoprotéine (P-gp) est une protéine de la membrane cellulaire de 170 kDa codée chez

l’homme par le gène MDR1 « Multidrug Resistance » localisé en 7q21.1. Ce gène s’étend sur

200kb et comprend 28 exons (Gottesman et al ; 1995).

La P-gp est exprimée de manière constitutive au niveau de certains organes notamment au

niveau de l’intestin et des cellules endothéliales des capillaires sanguins de la barrière hémato-

encéphalique. C’est un transporteur membranaire qui participe à la protection du milieu

intracellulaire en rejetant à l’extérieur de la cellule des molécules présentes dans le milieu

intracellulaire entre autres des substances potentiellement carcinogènes, des métabolites

cellulaires toxiques mais aussi des molécules médicamenteuses. Dans ce dernier cas, ceci peut

constituer une barrière importante dans la réponse thérapeutique (Gottesman et al, 1996).

Différentes études ont montré que ce gène était très polymorphe avec plus de 50 SNPs

différents (Cascorbi et al, 2001). Etant donné le rôle physiologique de la P-gp , de nombreuses

études ont pu mettre en évidence une association entre des SNPs altérant sa fonction et

certains cancers comme la leucémie myéloide chronique (Urayama et al, 2007), le cancer du

sein (Turgut et al, 2007) et le cancer rénal (Siegsmund et al, 2002).Une attention particulière

s’est portée sur un SNP particulier, MDR 3435C>T localisé dans l’exon 26. Bien que ce SNP

soit une mutation silencieuse codant pour l'isoleucine, ce polymorphisme semble affecter

l'expression et la fonction de la P-gp de façon importante (Hoffmeyer et al, 2000).

Concernant le cancer colorectal certaines études ont retrouvé une augmentation du risque de

sa survenue avec l’allèle 3435T de ce SNP mais également l’allèle 2677G du SNP du SNP

MDR1 2677G > T/A situé dans l’exon 21 (Osswald et al, 2007). Cependant cette corrélation

reste controversée (Petrova et al, 2008).

Par ailleurs, il existe d’importantes différences ethniques concernant les polymorphismes de

ce gène, ce qui contribue à rendre plus difficile la recherche d’associations entre la plupart de

ces SNPs et la survenue de cancers (Ozawa et al, 2004).


28

IV PHARMACOGENETIQUE DES AGENTS ANTICANCEREUX UTILISES

DANS LA CHIMIOTHERAPIE DU CCR

Les médicaments sont souvent une cause importante de morbidité et de mortalité même

lorsque leur prescription est faite correctement. Une étude française a montré que ces

accidents étaient à l’origine d’environ 10 à 20% des admissions dans un service d’urgence

(Queneau et al, 2003). Une autre étude attribue aux médicaments 44.000 à 98.000 décès par

an aux Etats-Unis (Kohn et al, 2000).

A l’inverse, des médicaments très utilisés sont inactifs chez certains patients. Une telle

variabilité de la réponse aux médicaments dépend de facteurs environnementaux

(alimentation, interaction médicamenteuse, tabagisme), de l’état du malade (sévérité de la

maladie, pathologies associées, âge), d’erreurs thérapeutiques, mais aussi de déterminants

génétiques.

La pharmacogénétique est l’étude des relations entre la variabilité du génome et la réponse

thérapeutique. Elle étudie les mécanismes d’origine génétique intervenant dans la réponse

aux médicaments dans le but d’optimiser les traitements médicamenteux, tant en termes

d’efficacité que de sécurité d’emploi. Cette branche de la pharmacologie s’est imposée il y a

plus de 50 ans lorsqu’on a constaté que les hémolyses aiguës après la prise d’un anti-

paludéen, la primaquine, survenaient chez les malades présentant un déficit héréditaire en

glucose-6-phosphate déshydrogénase (Beutler et al, 1993).

En cancérologie, la prédiction de la toxicité des agents anticancéreux devient un problème

crucial compte tenu de la fenêtre thérapeutique étroite de ces médicaments et des alternatives

possibles entre différents protocoles de chimiothérapie. L’évaluation du risque de toxicité

grave avant la mise en route du traitement et la sélection du protocole thérapeutique

(molécule, posologie, schéma d’administration) en fonction de critères spécifiques au malade,

sont des objectifs majeurs pour l’amélioration de la réponse à la chimiothérapie.

Le médicament est aussi un xénobiotique, son introduction dans l’organisme est suivie de

deux temps, un de transformation, souvent hépatique, et un deuxième d’effet sur la cible, dans


29

un ordre variable. Ces deux temps sont précédés par une phase d’absorption intestinale pour

les médicaments administrés par voie orale. Toutes ces étapes sont assurées par des

transporteurs et des enzymes dont l’expression peut varier en fonction du polymorphisme du

gène concerné.

1 MECANISMES D’ACTION DES AGENTS ANTICANCEREUX CYTOTOXIQUES

L’objectif de la chimiothérapie cytotoxique anticancéreuse est de détruire la totalité des

cellules cancéreuses. La plupart des agents cytotoxiques utilisés en chimiothérapie

anticancéreuse interagissent avec l’ADN ou ses précurseurs : ils inhibent la synthèse de

l’ADN ou induisent des lésions irréparables de l’ADN. Certains agents agissent après la phase

de transcription : ils interagissent avec des protéines et des enzymes impliquées dans la

prolifération/division cellulaire : par exemple, les taxanes se fixent sur la tubuline et

empêchent la division cellulaire. Les drogues cytotoxiques ne sont pas spécifiques des cellules

cancéreuses, elles agissent aussi sur les cellules normales à prolifération rapide telles que les

cellules de la moelle osseuse, les cellules de la muqueuse digestive, les gonades, la peau, les

phanères. C’est de cette non-spécificité que découle leur toxicité.

Après avoir passé en revue les différentes molécules administrées en chimiothérapie du CCR

dans le chapitre précèdent, nous allons examiner dans celui-ci les principales enzymes

intervenant dans le métabolisme de ces molécules, ensuite les incidences des mutations

somatiques sur leurs gènes respectifs en essayant de prévoir quelles sont les perspectives de

prescription personnalisée qu’ouvrent ces travaux récents.

2 PHARMACOGENETIQUE DU 5-FLUOROURACILE

Une méta-analyse réalisée sur des malades atteints d’un cancer colorectal et recevant du 5-FU

a montré que des toxicités sévères surviennent dans environ 1/3 des cas et une toxicité létale

pour 0,5 % des patients (Meta-analysis Group In Cancer, 1998).


30

Les polymorphismes des gènes codants pour des enzymes intervenant dans le métabolisme du

5-FU sont en partie responsables de la survenue de ces effets indésirables (Ulrich et al, 2003).

Deux enzymes capitales entrent en jeux dans le métabolisme du 5FU ; la dihydropyrimidine

déshydrogénase (DPD) qui métabolise plus de 80% du 5-FU dans le foie et la thymidylate

synthétase (TS) qui est inhibée par un des métabolites du 5FU, le 5-fluorouridine

monophosphate (FUMP) (Figure 2).

Figure 2: Métabolisme du 5-fluorouracile (5FU).

Le 5-FU est détoxifié à 80 % par la dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) en 5-fluoro-dihydro-uracile, qui

sera converti en fluorobêta-alanine. Les 20% restants sont transformés soit en 5-fluroro-uridine monophosphate

(FUMP) par l’orotate phosphoribosyl transférase (OPRT) ou bien l’uridine phosphorylase (UP) puis l’uridine

kinase (UK), soit en 5-fluoro-désoxyuridine monophosphate (FdUMP) par la thymidine kinase (TK) puis la

thymidine phosphorylase (TP). Le 5-FUMP est ensuite phosphorylé en 5-fluoro-uridine triphosphate (5FUTP)

qui va être incorporé à l’ARN et inhiber son métabolisme. Le 5-FdUMP exerce un effet inhibiteur puissant sur la

thymidylate synthase, enzyme du métabolisme des pyrimidines, qui convertit l’uridine monophosphate (UMP) en

thymidine monophosphate (TMP) nécessaire à la synthèse d’ADN. Mais il peut également être phosphorylé en 5-

fluorodésoxyuridine triphosphate (5-FdUTP) et être intégré à l’ADN dont il va perturber la réplication et la

réparation.


31

Gène DYPD

La DPD (Dihydropyrimidine dehydrogenase) produit du gène DPYD localisé sur le

chromosome 1p21.3 est l’intervenant enzymatique principal dans l’inactivation de plus de

80% du 5FU au niveau hépatique. Cette enzyme semble avoir une activité exclusivement

cytosolique et une expression ubiquitaire (Van Kuilenbourg et al, 2002 (a)).

L’activité de la DPD est très variable selon les individus, et les malades à faible activité ne

peuvent pas métaboliser le 5-FU, d’où la survenue de phénomènes toxiques graves atteignant

le système nerveux, la moelle osseuse et le tractus gastro-intestinal, et pouvant conduire au

décès (Milano et al, 1999).

Le gène codant pour la DPD comprend 23 exons et plus de 39 mutations sur ce gène,

inactivant l’enzyme, ont été répertoriées (Van Kuilenbourg 2004). La plus fréquente est une

substitution intronique au niveau d’un site d’épissage, qui aboutit à l’excision totale de l’exon

14 (allèle DPYD*2A) et correspondant environ à 40–50 % de l’ensemble des variants (Van

Kuilenbourg et al, 2002 (b); De Chaisemartin et al 2005).

Plus de la moitié de ces SNPs ont un effet délétère connu sur l’activité enzymatique de la

DPD (Mc Leod et al, 1998; Van Kuilenbourg et al, 2000) mais l’impact clinique de

nombreux autres SNPs modifiant la séquence protéique de la DPD restent à explorer.

Gène TS

La thymidine synthétase (TS) codée par le gène TS situé sur le chromosome 18p11.32, est une

enzyme capitale dans la biosynthèse des nucléotides. En effet, la TS est une enzyme à deux

substrats qui forme avec le déoxyuridine monophosphate (dUMP) et le coenzyme méthylène

tétrahydrofolate un complexe ternaire où le méthylène tétrahydrofolate cède un groupement

méthyl au dUMP pour le convertir en désoxythymidine monophosphate (dTMP). Ce dernier

est ensuite phosphorylé en désoxythymidine triphosphate (dTTP). Cette conversion est

essentielle pour la disponibilité de la thymidine requise pour la synthèse et la réparation de

l’ADN. La TS est aussi un intervenant essentiel dans le métabolisme des folates étant donné

que la forme circulante des folates dans le sang est surtout le méthyl tétrahydrofolate


32

(Carreras et al, 1995). Mais le rôle le plus étudié de la TS est celui qu’elle joue dans la

réponse à certaines molécules utilisées en chimiothérapie dont le 5FU. En effet, dans la

cascade métabolique du 5-FU, un des métabolites actifs, le 5-FdUMP se fixe à la TS et inhibe

son activité ce qui diminue voire abolit la synthèse de l’ADN des cellules tumorales entre

autres et freine ainsi la progression du cancer (Santi et al, 1974) (Figure 2). Plusieurs études

ont montré une relation inverse entre le taux d’ARNm ou protéique de la TS et la réponse

anti-tumorale au 5-FU (Johnston et al, 1995). Ces travaux ont mis en évidence plusieurs

polymorphismes du gène TS aboutissant à une variation du taux d’expression de cette

enzyme. Parmi ces polymorphismes, le plus documenté est celui se trouvant dans la région

enhancer 5’UTR (untranslated region) du gène TS. En effet, le promoteur de TS comprend

une séquence de 28pb (paires de bases) qui peut être répétée plusieurs fois, les nombres de

copies les plus fréquents dans la population normale étant 2 et 3 répétitions (allèles 2R ou

3R). La présence de trois répétitions se traduit par une augmentation de la transcription et de

l’expression de la thymidylate synthétase (Horie et al, 1995) ; cette augmentation a été

corrélée à une plus faible inhibition de la thymidylate synthase par le 5-FU et une réponse

inefficace voire toxique à cet anticancéreux (Pullarkat et al, 2001).

Par ailleurs, un nouveau polymorphisme G > C touchant le 12ème nucléotide de la 2ème

répétition de 28pb du promoteur de TS entraîne une altération du site de fixation du facteur de

transcription USF-1 (upstream stimulating factor) et modifie l'expression de la thymidylate

synthétase ce qui interfère avec l’expression du gène (Marcuello et al, 2004).

Une autre variation importante a été également mise en évidence. Il s'agit d'une délétion ou

insertion de 6pb dans la région 3'UTR du gène TS (Ulrich et al, 2000). L’effet de ce

polymorphisme sur l’expression de la TS est encore sujet à controverse (Mandola et al, 2004 ;

Dotor et al, 2006). Néanmoins ce dernier polymorphisme a récemment été corrélé à un risque

accru de survenue de certains cancers comme le cancer du poumon ou celui de l’œsophage

(Zhang et al, 2004; Shi et al, 2005).

Globalement, une expression élevée de la thymidylate synthétase est désormais largement

reconnue comme étant une des causes déterminantes de la résistance au 5-FU. Cette donnée

valable pour le cancer colorectal devrait être prise en compte dans le traitement et le

pronostic. L’ensemble de ces données suggèrent que l’étude des polymorphismes du gène de


33

la TS pourrait être utile dans la sélection des patients pour lesquels le 5-FU est efficace et bien

toléré.

3 PHARMACOGENETIQUE DE L’IRINOTECAN

L’Irinotécan ou le CPT-11 (carbonyloxycamptothécine) est une autre molécule utilisée dans la

chimiothérapie du CCR qui abolit la division anarchique des cellules cancéreuses en inhibant

la topo-isomérase I. Les topo-isomérases sont des enzymes assurant la spiralisation et

déspiralisation de l’ADN après avoir crée des coupures transitoires de l’un (topo-isomérase I)

ou des deux (topo-isomérase II) brins d’ADN puis elles assurent la réparation de ses coupures.

Elles permettent une relaxation des forces de torsion générées au moment de la réplication.

Les inhibiteurs des topo-isomérase I ou II stabilisent le complexe de clivage et empêchent

l’étape de réparation et provoquent une coupure définitive des brins d’ADN ce qui induit

l’apoptose des cellules.

L’action de l’Irinotécan sur la topo-isomérase I passe par sa conversion en son métabolite

actif, le SN 38 qui est 100 à 1000 fois plus actif sur la topo-isomérase I que la molécule mère.

Ce métabolite est produit par des estérases notamment la carboxylestérase (CES). Le SN-38

est alors détoxifié par glucorono-conjugaison (SN-38 G) par une glucuronyl-transférase de

type 1 (UGT1) qui le rend inactif et atoxique avant d'être éliminé par la bile et les urines (De

Chaisemartin et al, 2005).

L’Irinotécan peut engendrer une toxicité importante aussi bien hématologique (leucopénies)

que digestive (diarrhées aiguës). Par ailleurs, La réponse au traitement à l’Irinotécan pour un

cancer du côlon de même grade varie énormément d’un patient à l’autre (Yu et al. 2005).

Outre les facteurs environnementaux, les facteurs génétiques comme les insertions, les

délétions, les réarrangements chromosomiques et les polymorphismes peuvent altérer la

composition en acides aminés, l’épissage et l’expression de gènes et ainsi modifier la

pharmacocinétique et la pharmacodynamique de ce médicament (Figure 3).


34

Gène CES

Les gènes codant pour les CES (carboxylestérases) sont localisés en 16q13-q22 et présentent

une forte homologie, faisant évoquer un gène ancestral commun. Il existe trois

isoenzymes humaines connues: la CES 1, CES 2 et CES 3. CES2 a une action catalytique sur

l’Irinotécan 100 et 2000 fois plus importante que CES 1 et CES 3 respectivement (Sanghani et

al, 2004). Il a été mis en évidence plus de onze polymorphismes sur la CES 2 avec des

distributions variables en fonction de l'ethnie (Charasson, 2005; Ceppa, 2005). Cependant, si

des variations dans l'expression de l'ARNm de cette enzyme ont été corrélées avec certains

polymorphismes, les études pharmacogénétiques n’ont pas encore aboutit à un consensus sur

l’association des SNPs de ce gène avec le taux de métabolisme de l'Irinotécan (Wu et al,

2003; Kubo et al, 2005). En revanche, un épissage alternatif affectant l’exon 10 de ce gène

aboutissant à une protéine tronquée de 16 acides aminés dans le site actif de CES 2 a

récemment été corrélé à une baisse d’activité importante de plus de 80% de cette enzyme

(Schiel et al, 2007).

Figure 3 : Métabolisme de l’Irinotécan

L’Irinotécan est converti par la carboxylestérase (CES) en son métabolite actif, le SN 38.

Ce métabolite est détoxifié au niveau hépatique par l’uridine diphosphate glucuronosyl-

transférase 1A1 (UGT1A1) en glucurono-SN38 « SN38G» (De Chaisemartin et al, 2005).


35

Gène UGT1A1

L’UGT1A1 (Uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1) codée

par le gène UGT1A1 sur le chromosome 2q37.1 est un membre de la famille des UGT,

enzymes du métabolisme de phase II, responsables de la détoxification de nombreux

xénobiotiques, mais également de certaines substances endogènes. Le processus de

glucurono-conjugaison consiste en l’ajout d’acide glucuronique à des composés liposolubles

(Kaderlik et al, 1994). Cela permet d’augmenter leur solubilité et leur poids moléculaire, ce

qui empêche leur réabsorption dans les tissus et favorise l’élimination de ces composés dans

la bile ou l’urine. Les UGT sont situées dans la membrane cellulaire au niveau du réticulum

endoplasmique. Ces protéines sont exprimées dans à peu près tous les tissus, mais le sont

majoritairement dans le système hépatique, rénal, gastro-intestinal et cérébral.

L’UGT1A1 est physiologiquement responsable de la glucurono-conjugaison de la bilirubine

mais aussi de nombreux autres xénobiotiques dont l’Irinotécan. Son intervention dans le

métabolisme de ce dernier consiste à catalyser la réaction de glucurono-conjugaison du SN-38

le rendant ainsi inactif et atoxique avant d'être éliminé par la bile et les urines.

Il existe au niveau de la séquence TATA box du gène UGT1A1 un VNTR (variable number

of tandem repeat) UGT1A1*28(TA) 6>(TA)7 à la position -53, consistant en une répétition

d’un dinucléotide (TA) qui influence l’activité transcriptionnelle du promoteur, l’allèle

sauvage UGT1A1*1 correspondant à 6 répétitions. L’allèle comprenant sept répétitions du

dinucléotide suite à une micro-insertion (allèle TA7 ou UGT1A1*28) est associé à plus de

70% de réduction de son expression. Le génotype homozygote UGT1A1*28/*28 est d’ailleurs

une des causes de la maladie de Gilbert, hyper bilirubinémie modérée chronique assez

fréquente (10 à 15 % de la population européenne) (Bosma et al, 1995). Plusieurs études ont

démontré que le génotype UGT1A1*28/*28 est associé à une toxicité accrue de l’Irinotécan,

aussi bien pour sa toxicité hématologique que digestive (Kweekel et al, 2008). En effet, les

patients UGT1A1*28/*28 auraient un risque 9,3 fois plus important de développer une

neutropénie de grade IV que les autres génotypes (Innocenti et al, 2004). Il existe d’autres

polymorphismes candidats présents au niveau du promoteur de ce gène; il s’agit de

UGT1A1-3279G>T et UGT1A1-3156G>A (Innocenti et al, 2002; Zhou Q et al, 2005) et il a

été suggéré par l’équipe d’Innocenti que le SNP UGT1A1-3156G>A serait plus prédictif du


36

statut fonctionnel de l’enzyme UGT1A1 que le VNTR UGT1A1*28(TA) 6>(TA)7 (Innocenti

et al, 2004).

4 PHARMACOGENETIQUE DE L’OXALIPLATINE

L'oxaliplatine est un médicament anti-cancéreux de synthèse du groupe des agents dérivés de

platine. Son action passe par l’inhibition de la synthèse et de la réplication de l’ADN par

formation de ponts intrabrins entre 2 guanines adjacentes par leur site N7 (Kenji Inagaki et al,

1984). La première étape du métabolisme de l'oxaliplatine consiste en la libération d'oxalate

qui est remplacé par 2 ions chlore aboutissant ainsi à la formation du dichlorodachplatine

(dichloro-diaminocyclohexane platinum) (Hagler et al. 1973) et une intoxication aiguë par de

l'oxalate se traduit par des paresthésies des extrémités, des dysesthésies exacerbées par

l'exposition au froid et des myoclonies, pouvant aller jusqu'à des convulsions en cas

d'intoxication massive (Argyriou et al, 2008).

Gène GSTP1

En plus de son rôle potentiel évoqué précédemment dans la survenue du CCR (Sachse et al,

2002; Harris et al, 1998), l’isoenzyme GSTP1 participe à la détoxication des dérivés platine

de l’oxaliplatine dans le système nerveux périphérique et les tumeurs résistantes à

l'oxaliplatine présenteraient une augmentation de l'expression de cette enzyme (Stoehlmacher,

2002). Le polymorphisme de GSTP1 correspondant à la transition 313A>G (Ileu105Val) sur

l'exon 5 (voir tableau 1) provoque une baisse de l'activité de l'enzyme et par conséquent

devrait permettre une meilleure efficacité de la thérapie. Cette hypothèse est confirmée par

l'étude de l’équipe de Stoehlmacher chez 107 patients atteints de cancer colorectal métastasé

traités par oxaliplatine et 5-FU (Stoehlmacher et al, 2002). Paradoxalement, une étude récente

a retrouvé une association entre le variant 105Ile et le risque de neuropathie chez des patients

atteints de cancer gastro-intestinal suggérant de ce fait un effet protecteur de l’allèle variant

105Val par rapport à la toxicité de l’oxaliplatine (Lecomte et al, 2006). Le rôle des

polymorphismes du gène GSTP1 sur le métabolisme de l’oxaliplatine reste donc à déterminer.

Population et méthodes

37

BUT DE L’ETUDE

Les xénobiotiques sont des molécules à faible poids moléculaire, étrangères à l’organisme

dont font partie les médicaments, les polluants de l’eau ou de l’atmosphère, les additifs

alimentaires mais également certains composés naturels des aliments. Beaucoup de ces

molécules sont potentiellement carcinogènes et font l’objet d’une métabolisation lorsqu’elles

arrivent dans l’organisme. Ces processus de biotransformation surviennent essentiellement au

niveau du foie, mais d’autres tissus comme le colon ou le tube digestif sont également

susceptibles de métaboliser ces xénobiotiques. Les processus mis en route sont généralement

multi étapes et font appel à des réactions préliminaires d’oxydation pour rendre les molécules

plus polaires (réaction de phase I), à des réactions de conjugaison avec un ligand comme les

sulfates, l’acide glucuronique, l’acétate ou le glutathion (réactions de phase II) et enfin au

transport de ces molécules (phase III) qui permet l’élimination de ces conjugués hydrophiles

grâce à des glycoprotéines membranaires.

Lors de la phase I, une fonctionnalisation des xénobiotiques est catalysée par certaines

enzymes dont font partie les cytochromes P450 qui catalysent une réaction de mono

oxygénation et peuvent transformer ces xénobiotiques en métabolites très électrophiles, voire

génotoxiques. Parmi ces enzymes, CYP3A5 est exprimée en grande quantité dans le tractus

digestif et son activité enzymatique est impliquée dans l’activation de plusieurs

procarcinogènes comme les nitrosamines, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, et les

amines hétérocycliques. Le SNP CYP3A5 6986A>G aboutit à des changements fonctionnels

de cette enzyme et pourrait avoir un impact sur la survenue du CCR. Nous avons donc choisit

de l’explorer afin de rechercher une éventuelle association avec le risque du développement

du CCR d’une part et d’autre part pour déterminer la distribution de sa fréquence dans notre

population.

Pour les enzymes de la phase II du métabolisme des xénobiotiques, notre choix s’est porté sur

les gènes codant pour la famille des enzymes GST. Ces enzymes occupent une place très

importante dans le système de défense cellulaire de part leur rôle de conjugaison du glutathion

réduit à des composés électrophiles nocifs permettant la détoxication des xénobiotiques et


38

l’activation de certains substrats. Celles ci pourraient être également impliquées dans la

toxicité à certains agents anticancéreux comme l’oxaliplatine Etant donné ce rôle capital,

plusieurs études épidémiologiques ont examiné l'incidence de leurs polymorphismes

génétiques sur le risque de survenue et/ou d'aggravation de nombreuses pathologies comme le

CCR et les conclusions de ces études ne convergent pas toujours. Nous avons voulu examiner

cette relation d’association avec le risque d’émergence du CCR dans notre population. Pour

cela, nous avons choisit d’analyser 4 polymorphismes génétiques différents et de comparer la

distribution de leurs fréquences respectives entre les cas et les contrôles à la recherche d’une

éventuelle association avec un risque majoré de CCR ; il s’agit d’une part, de la délétion totale

des gènes GSTM1 et GSTT1 qui, à l'état homozygote, est associée à une absence complète

d'activité enzymatique et d’autre part, des deux SNPs 313A>G et 341C>T sur GSTP1

impliqués dans la diminution de l’activité enzymatique de GSTP1. De nombreux autres

cancers ont été associés à des polymorphismes des GST, l’évaluation des fréquences de ces

derniers dans la population Algérienne pourrait donc être utilisée dans d’autres études

cas/témoins concernant ces pathologies.

Un autre exemple de polymorphisme portant sur une transférase de la phase II est celui de

UGT1A1 (UDP-glucuronosyltransférase) dont le rôle est de catalyser une réaction de

glucorono-conjugaison des xénobiotiques afin de les rendre plus hydrophiles et faciliter leur

élimination. Concernant ce gène, nous avons recherché une éventuelle association entre les

polymorphismes UGT1A1-3156G >A et le VNTR UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7 à la position

-53 et la survenue du CCR sur notre population car ces SNPs induisent une baisse de

transcription de cette enzyme et de ce fait une plus faible activité enzymatique. Par

conséquent, elles peuvent modifier le métabolisme de certains composés carcinogènes. De

plus, plusieurs études ont retrouvé une association de ces polymorphismes avec la toxicité à

l’Irinotécan. Cet anticancéreux étant largement utilisé dans la chimiothérapie du CCR en

Algérie, la connaissance des fréquences de ces SNPs dans notre population serait intéressante

pour évaluer d’une manière globale l’éventuel effet toxique de cette molécule dans notre

contexte. La phase III d’excrétion des xénobiotiques hors de la cellule est assurée par la

protéine P-gp codée par le gène MDR1 « Multidrug Resistance ». Cette protéine, en modulant

les concentrations plasmatiques et intracellulaires des xénobiotiques, dont certaines molécules

carcinogènes, pourrait influencer la susceptibilité au CCR mais aussi la réponse au traitement.


39

Dans cette étude nous avons exploré le SNP MDR1 3435C>T de ce gène car il est

responsable d’une baisse significative de l’expression de la protéine P-gp et serait également

un facteur de risque important dans la survenue de certains cancers dont le CCR.

L’exploration du polymorphisme du gène MDR1 a été entreprise également à cause du rôle

primordial de cette protéine dans le phénomène de résistance thérapeutique.

Pour finir, nous nous sommes intéressés à deux polymorphismes du gène codant pour la

thymidylate synthétase à cause du rôle incontournable de cette enzyme dans le métabolisme

des pyrimidines. En effet celle-ci catalyse la réaction de conversion du désoxyuridine

monophosphate en désoxythymidine monophosphate et les deux polymorphismes explorés

dans notre étude ont été incriminés dans la modulation du taux d’expression de cette enzyme.

Il s’agit du polymorphisme de répétition 2R>3R dans la région 5’UTR d’une séquence de

28pb et la délétion/insertion de 6bp en position 1494 dans sa région 3'UTR.

Notre choix de mener une étude cas/témoins sur ces deux polymorphismes de la TS a été

guidé par l’hypothèse qu’une plus faible expression de la TS due à un de ces deux

polymorphismes réduisant le taux de thymidine, pourrait augmenter le risque d’incorporation

de l’uracile au lieu de la thymine dans l’ADN, ce qui pourrait accroitre le risque de cassure de

l’ADN double brin dans les cellules à prolifération rapide comme les cellules du colon.

Par ailleurs, la principale cible du 5-FU, un anticancéreux largement utilisé dans la

chimiothérapie du CCR étant la thymidylate synthétase, de nombreuses études ont été

réalisées pour évaluer l’utilité de l’expression de cette enzyme en tant que marqueur

biologique de réponse et/ou de toxicité au traitement à base de 5-FU. L’exploration de ces

deux polymorphismes sur notre population est de ce fait d’une grande importance pour

retrouver les patients capables d’une réponse optimale à cet anticancéreux en Algérie.

Au delà du but initial de cette première étude en Algérie consistant à rechercher une

éventuelle association entre les polymorphismes des gènes codant pour les enzymes du

métabolisme des xénobiotiques et la survenue du CCR, l’évaluation de la distribution des

fréquences de ces variants dans notre population pourrait servir à envisager d’autres études

cas/contrôles concernant d’autres pathologies dans lesquelles les fonctions de ces enzymes

sont impliquées.


40

V POPULATION ET METHODES

1 POPULATION D’ETUDE

Notre travail a été réalisé sur une population de 200 individus dont 101 sujets sains non

apparentés et ne présentant aucune maladie chronique et 99 malades atteints de cancer

colorectal admis au service d’oncologie du CHU d’Oran et âgés entre 20 et 75ans. Tous les

individus recrutés dans cette étude sont originaires de l’Ouest Algérien.

2 GENES EXPLORES

2.1 GENE CYP3A5: SNP 6986A>G

L’hypothèse qui justifie la présente étude est basée sur le fait que l’enzyme CYP3A5 est

exprimée en grande quantité dans le tractus digestif et que son activité enzymatique est

impliquée dans l’activation de plusieurs procarcinogènes dont certaines mycotoxines comme

l’aflatoxine B1 mais aussi les nitrosamines, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, et

les amines hétérocycliques produits au cours de la cuisson des aliments (Parke, 1994;

Windmill et al, 1997).

Le SNP CYP3A5 6986A>G (dbSNP Id : rs776746) fait partie des polymorphismes

récemment découverts qui aboutissent à des changements fonctionnels de cette enzyme (Van

Schaik et al, 2002). Ce SNP donne naissance à une protéine tronquée, et nous l’avons exploré

afin de définir la distribution de sa fréquence dans notre population d’une part et d’autre part

pour rechercher une éventuelle association avec le risque du développement du CCR.


41

2.2 GENES GST : DELETION DE GSTM1, DELETION DE GSTT1 ET SNPS : GSTP1 313A>G

ET GSTP1 341C>T

Pour cette classe de gène nous avons choisis d’analyser 4 polymorphismes génétiques

différents : d’une part, les délétions totales des gènes GSTM1 et GSTT1 qui, à l'état

homozygote, sont corrélées à une absence complète d'activité enzymatique et d’autre part,

deux SNPs sur GSTP1 : une substitution 313A>G (Ileu105Val) sur l’exon 5 pour le premier

(dbSNP Id : rs1695) et une substitution 341C>T (Ala114Val) sur l’exon 6 pour le second

(dbSNP Id : rs1138272) aboutissant toutes deux à une diminution de l’activité enzymatique

de GSTP1.

Les polymorphismes de ces trois gènes sont largement étudiés par rapport à leur fonction dans

la détoxification des xénobiotiques dont certaines molécules carcinogènes présentes dans

l’alimentation ou dans la fumée de tabac et leurs implications possibles dans la susceptibilité

génétique à développer plusieurs cancers dont le CCR (Chenevix-Trench et 1995; Deakin et

al, 1996; Harris et al, 1998; Sachse et al, 2002). Enfin, ces gènes sont explorés pour leur rôle

dans la détermination génétique individuelle de la réponse aux molécules anticancéreuses

comme l’oxaliplatine utilisée dans la chimiothérapie du CCR (Stoehlmacher et al, 2002;

Lecomte et al, 2006).

2.3 GENE UGT1A1: LE VNTR UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 ET LE SNP -3156 G>A

Dans cette étude nous avons recherché une éventuelle association entre les polymorphismes

UGT1A1-3156G >A (dbSNP Id : rs10929302) et le VNTR UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7

(dbSNP Id : rs8175347) à la position -53 et la survenue du CCR sur notre population car ces

SNPs ont pour conséquence une baisse de transcription de cette enzyme et de ce fait une plus

faible activité enzymatique. Par conséquent, elles peuvent modifier le métabolisme de certains

composés carcinogènes présents dans l’alimentation. De plus, plusieurs études ont retrouvé

une association des polymorphismes UGT1A1-3156G >A et UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7

avec la toxicité à l’Irinotécan (Innocenti et al, 2004; Kweekel et al, 2008). Cet anticancéreux

étant largement utilisé dans la chimiothérapie du CCR en Algérie, la connaissance des


42

fréquences de ces SNPs dans notre population serait intéressante pour évaluer d’une manière

globale l’éventuel effet toxique de cette molécule dans notre contexte.

2.4 GENE MDR : SNP 3435C>T

Un seul SNP de ce gène, le SNP MDR1 3435C>T (dbSNP Id : rs1045642) a été exploré dans

cette étude car il est responsable d’une baisse significative de l’expression de la protéine P-gp.

Cette dernière, de part son rôle dans le transport des xénobiotiques dont les médicaments

anticancéreux mais aussi les substances carcinogènes, est en première ligne dans le

phénomène de résistance thérapeutique (Sekine et al, 2001; Nagasubriamanian et al, 2003).

Ce SNP serait également un facteur de risque important dans la survenue de certains cancers

dont le CCR (Osswald et al, 2007). De plus la fréquence de ce SNP diffère selon les ethnies,

et l’évaluation de sa fréquence sur la population Algérienne est encore inconnue.

2.5 GENE TS: REPETITION 2R>3R DANS LA REGION 5’UTR DU GENE TS ET

DELETION/INSERTION DE 6PB DANS SA REGION 3’UTR

Pour ce gène nous avons exploré deux polymorphismes : Le polymorphisme de répétition

2R>3R dans la région 5’UTR d’une séquence de 28pb (dbSNP Id : rs34743033) et la

délétion/insertion de 6bp dans la région 3'UTR (dbSNP Id : rs34489327).

Concernant le polymorphisme de répétition 2R>3R en 5’UTR, le génotype 3R/3R a été

associé à une augmentation du taux d’expression de la TS et à une activité enzymatique plus

importante (Kawakami et al, 1999). De plus, l’allèle 3R confère une efficacité de traduction

de la TS plus élevée que l’allèle 2R (Horie et al, 1995) et une étude a montré que le taux

d’ARNm de TS dans les tissus tumoraux était 3 fois plus bas chez les sujets homozygotes

2R/2R que chez les sujets homozygotes 3R/3R (Pullarkat et al, 2001). Par ailleurs, la délétion

de 6pb dans la région 3’UTR de la TS a été corrélée également à un taux d’expression plus

faible d’ARNm dans les tumeurs colorectales due une à augmentation du taux d’instabilité de

celui-ci (Mandola et al, 2004).


43

Notre choix de mener une étude cas/témoins sur ces deux polymorphismes de la TS a été

guidé par l’hypothèse qu’une plus faible expression de la TS due à un de ces deux

polymorphismes réduisant la conversion du dUMP en dTMP pourrait augmenter le risque

d’incorporation de l’uracile au lieu de la thymine dans l’ADN, ce qui pourrait accroitre le

risque de cassure de l’ADN double brin dans les cellules à prolifération rapide comme les

cellules du colon.

Par ailleurs, la principale cible du 5-FU étant la thymidylate synthétase, de nombreuses études

ont été réalisées pour évaluer l’utilité de l’expression de la TS en tant que marqueur

biologique de réponse au traitement à base de 5-FU. L’exploration de ces deux

polymorphismes sur notre population est de ce fait d’une grande importance pour retrouver

les patients capable d’une réponse optimale à cet anticancéreux largement utilisé dans la

chimiothérapie du CCR en Algérie.

3 METHODES D’EXPLORATION GENETIQUE

3.1 EXTRACTION ET DOSAGE DE L’ADN

L’ADN a été extrait à partir de 10 à 20 ml de sang total par la technique aux sels (salting out).

Elle est basée sur le traitement des lysats de cellules blanches par une solution saline associée

à la protéinase K (enzyme protéolytique) (Miller et al, 1988).

L’estimation de la concentration de l’ADN se fait par la mesure de l’absorbance à 260nm.

Sachant qu’une unité de DO à 260nm est équivalente à 50 µg /ml d’ADN, il est possible

d’évaluer la quantité d’ADN d’un échantillon par la formule: facteur de dilution x 50 x DO260.

Un ADN de bonne qualité (sans contamination par les protéines) présente un rapport

DO260/DO280 compris entre 1,5 et 2.


44

3.2 EXPLORATION DE LA DELETION DES GENES GSTT1, GSTM1 ET DU SNP GSTP1

313A>G PAR PCR MULTIPLEX, DIGESTION ENZYMATIQUE ET ANALYSE DES RFLP.

Nous avons procédé à un génotypage simultané des sujets pour les trois gènes GST dans un

même tube en réalisant une PCR multiplex (polymerase chain reaction) (Lecomte et al, 2006)

avec des paires d’amorces spécifiques à chacun des gènes (Nedelcheva Kristensen et al, 1998)

(tableau 2).

La PCR a été réalisée dans un volume final de 25µl avec un programme PCR de 30 cycles en

tout avec un « Touch Down » de 68° à 48° consistant à diminuer la température de 1° par

cycle sur 20cycles. Programme de la PCR : 1 cycle de 5min à 94°C suivi de 30sec à 94°C,

30sec de 68°C à 48°C et 30sec à 72°C pendant 20 cycles; 30sec à 94°C, 30sec à 51°C et

30sec à 72°C pendant 10 cycles et enfin 10 min à 72°C.

20µl des produits PCR ont été soumis à une digestion enzymatique par BsmA1 (New England

Biolabs, Saint Quentin en Yvelines, France) suivie d’une analyse des RFLP (restriction

fragment lenght polymorphism) (Lecomte et al, 2006).

Les résultats étaient validés en utilisant le fragment PCR de GSTP1 comme témoin

d’amplification.

Tableau 2 : Séquences des amorces utilisées pour la PCR multiplex des gènes GSTT1, GSTM1, et GSTP1

313A>G (Nedelcheva Kristensen et al, 1998).

Gènes GST Séquences des amorces

GSTT1 Amorce F : TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC

Amorce R : TCACCGGATCATGGCCAGCA

GSTM1 Amorce F : GGACTCCCTGAAAAGCTAAAGC

Amorce R : GTTGGGCTCAAATATACGGTGG

GSTP1 313A>G

rs1695

Amorce F : ACCCCAGGGCTCTATGGGAA

Amorce R : TGAGGGCACAAGAAGCCCCT


45

Seul le fragment de 176pb de GSTP1 est digéré en deux fragments de 91pb et 85pb lorsqu’on

est en présence de GSTP1 105Val et non digéré en présence de l’allèle 105Ile. La taille des

fragments générés des produits PCR étaient de 450pb pour GSTT1, 250pb pour GSTM1 et

176pb pour GSTP1. La présence du gène GSTM1 ou du gène GSTT1 donne un signal PCR

positif tandis que la délétion ne donne aucun signal. Les produits de digestion sont alors

révélés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 8%.

3.3 ANALYSE DES SNPS : GSTP1 341C>T, MDR1 3435C>T, CYP3A5 6986A>G ET

UGT1A1 -3156 G>A PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL.

Les SNPs GSTP1 341C>T, MDR1 3435C>T, UGT1A1-3156 G>A et CYP3A5 6986A>G ont

été détectés au moyen d’une analyse par discrimination allèlique par PCR quantitative en

temps réel (Taqman, ABI PRISM® 7900 Sequence Detection System Applied Biosystems,

Foster City, CA) (Livak et al, 1995) en adaptant la chimie et les conditions recommandées par

la biotechnologie Applied Biosystems (http://snp500cancer.nci.nih.gov/taqman_assays, mise

à jour du 03/12/2008) pour le génotypage de chacun de ces SNPs (Tableau3).

Tableau 3 : Séquences des amorces et des sondes Taqman utilisées pour l’analyse des SNPs : GSTP1 341C>T,

MDR1 3435C>T, CYP3A5 6986A>G et UGT1A1 -3156 G>A

SNP Séquences des amorces Sonde VIC Sonde FAM

GSTP1 341C>T

rs1138272

Amorce F: AGTAGGATGATACATGGTGGTGTCT

Amorce R: GGCAGTGCCTTCACATAGTCAT

CTTGCCCGCCTCCT CTTGCCCACCTCCT

MDR1 3435C>T

rs1045642

Amorce F: CTGTTTGACTGCAGCATTGCT

Amorce R: ATGTATGTTGGCCTCCTTTGCT

CCCTCACGATCTCTT CCCTCACAATCTCTT

UGT1A1-3156G>A

rs10929302

Amorce F: TCCAGAATGGCTAGAGGGTAAGAG

Amorce R: CTTGCTCTCAAAACTCTGGGATAGA

CCTGTCCAAGCTCA CCTGTCTAAGCTCA

CYP3A5 6986A>G

rs776746

Amorce F: CGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCA

Amorce R: TGAAGGGTAATGTGGTCCAAACAG

AGAGAGACTGAAAG AGAGAGATTGAAAG


46

La PCR quantitative en temps réel est basée sur une réaction enzymologique, la PCR, et sur la

mesure en continu de son produit. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou

d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. L’obtention de la cinétique

complète de la réaction de polymérisation permet d’obtenir une quantification absolue de la

quantité initiale d’ADN cible (Tse et al, 2003).

Les sondes d’hydrolyse « Taqman » sont les sondes les plus fréquement utilisées pour la

détection de mutations ponctuelles. Elles sont marquées par deux fluorophores : un à leur

extrêmité 5’ (fluorophore donneur ou émetteur) et l’autre à leur extrêmité 3’ (fluorophore

extincteur ou « Quencher »). Le Quencher à proximité du donneur inhibe l’émission de

fluorescence par ce dernier. Ces sondes sont dessinées de manière à s’hybrider spécifiquement

à leur cible (Figure 4).

Figure 4: Principe de la technique Taqman

P1 et P2 sont les amorces utilisées pour la PCR. La sonde est marquée à son extrêmité 5’ par un fluorophore (F)

par exemple le fluorophore FAM et à son exrêmité 3’ par le Quencher (Q), par exemple le Quencher TAMRA.

Pendant la réaction de PCR, la sonde se fixe à la cible. La Taq polymérase, par son activité nucléasique 5’clive

la sonde et libère la molécule de fluorescence FAM. Schéma tiré du livre : Principes de biologie moléculaire en

biologie clinique (Ameziane et al 2006).


47

Pour notre étude, les sondes spécifiques utilisées ont été marquées à leur extrémité 5’ par les

fluorophores FAM et VIC (Absolute Blue QPCR ROX Mix – Abgene ref AB- 4138/B)

respectivement pour l’allèle 1 et l’allèle 2 de chacun des SNPs explorés.

Pour chacun des SNPs explorés, l’analyse a été réalisée en utilisant 1,5µl d’ADN à 25ng dans

un volume réactionnel Taqman final de 5µl (5’nuclease Assay), composé de 2.5 ul du tampon

« Taqman Genotyping Master Mix » (Applied Biosystems, Foster City, CA) à 2X et du

mélange « sonde assay-specific » contenant les amorces spécifiques à chaque SNP et les

sondes VIC et FAM à des concentrations définies par le biosystème d’analyse « Applied

Biosystems » . Ces réactifs sont commandés en fonction de la référence NCBI « rs » (National

Center for Biotechnology Information Reference) de chacun des SNPs et les conditions

« Taqman » appliquées sont celles recommandées par le fabricant (Applied Biosystems)

(http://snp500cancer.nci.nih.gov/taqman_assays, mise à jour du 03/12/2008)

Les réactions ont été faites sur une plaque de 384 puits. Et des contrôles homozygotes

sauvages, homozygotes mutés et hétérozygotes correspondant à chacun des SNPs ont été

ajoutés à la plaque. On obtient donc deux fluorescences pour un hétérozygote et une seule

(VIC ou FAM) pour un homozygote. La figure 5 montre un exemple de SNP où l’allèle

sauvage est C et l’allèle muté est T.


48

La détection de la fluorescence émise par chacune des sondes VIC ou FAM hybridée chacune

à l’allèle qui lui est complémentaire permet alors de classer les individus par génotype et

attribue un nuage de points correspondant à chaque génotype du SNP (Figure 6).

A B C

Figure 5 : Graphes représentant la fluorescence émise par chacun des génotypes

Le graphe A est un exemple d’un génotype CC normal et est représenté par la seule sonde VIC qui émet une

fluorescence verte. Le graphe B est un exemple du génotype hétérozygote CT et est représenté par les deux

sondes VIC (en vert) et FAM (en rouge) et enfin le graphe C, un individu de génotype TT représenté par la

fluorescence rouge exclusive de la sonde FAM. La fluorescence bleue est émise par le fluorophore ROX et sert

comme contrôle interne de la réaction

Figure 6: Détection des SNPs et constitution d’un nuage de point de fluorescence différent correspondant aux

différents génotypes en fonction de l’hybridation des sondes VIC ou FAM à chacun des allèles du polymorphisme

recherché (schéma tiré de la présentation Power Point présentée au cours de l’Atelier de Génotypage par PCR en

temps réel pour le laboratoire de Biotechnologie d’ORAN Mercredi 9 Avril – Jeudi 10 Avril 2008)


49

Les allèles pour GSTP1 sont définis en tenant compte des deux SNPs de GSTP1 (exon 5 et

exon6) (Tableau 3).

3.4 EXPLORATION DES POLYMORPHISMES UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7, TS5’ « 2R>3R » ET

TS3’ « DELETION/INSERTION DE 6PB » PAR ANALYSE DE FRAGMENTS

Ces trois SNPs ont été recherchés par une analyse de fragments qui consiste en une PCR avec

des amorces fluoromarquées suivie par une lecture de la taille des fragments amplifiés au

niveau du séquenceur. Enfin une analyse des fragments est réalisée en utilisant un logiciel

adapté grâce aux pics de fluorescence émise par une molécule fluorescente.

• Gène TS : TS5’ « 2R>3R » et TS3’ « délétion/insertion de 6pb »

Pour l’amplification du gène TS, une PCR avec une des amorces couplée à une molécule

fluorescente (FAM) été réalisée dans 15µl contenant 2µl d’ADN à 25ng/µl, du tampon PCR

10x (GeneAmp, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) chacune des amorces R et F à

20µM , des dNTP à 1.25mM, Mgcl2 à 25mM (GeneAmp, Applied Biosystems), et de la Taq

Tableau 3: Définition des différentes allèles de GSTP1 en fonction des deux SNPs GSTP1 313A>G et GSTP1

341C>T

Allèles de GSTP1 Génotype Effet sur la protéine

Allèle GSTP1*A Ex5 AA / Ex6 CC Ileu105/Ala114

Allèle GSTP1*B Ex5 GG/ Ex 6 CC Ileu105Val/Ala114

Allèle GSTP1*C Ex 5 GG/ Ex6 TT Ileu105Val/Ala114Val

Allèle GSTP1*D Ex 5 AA/ Ex6 TT Ileu105/Ala114Val


50

Quiagen à U/µl en suivant un programme constitué de 15min à 95°, 30 cycles de 30sec à

94°C, 30sec à 55°C ou 62°C pour TS 5’ et TS 3’ respectivement 30sec à 72°C et enfin 6min

à 72°C.

• UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7

Pour l’amplification de UGT1A1, une PCR avec une des amorces couplée à une molécule

fluorescente « FAM » a été réalisée dans 19µl contenant 2µl d’ADN à 25ng/µl, du tampon

PCR 10x (GeneAmp, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France), chacune des amorces R et F

à 20µM, des dNTPs à 1.25mM, Mgcl2 à 25mM (GeneAmp, Applied Biosystems), et de la

Taq Gold polymérase à 5U/µl (Applied - N808-0243 ); le programme de la PCR était

constitué de 10min à 94°, 10 cycles de 30sec à 94°C, 45sec à 60°C et 1min à 72° ; 24 cycles

de 30sec à 94°, 45sec à 58°, 1min à 72° et enfin 7min à 72°C.

Un marqueur de taille « Genescan 400HD ROX » (Applied 402985) et un agent dénaturant :

Hi-Di Formamide (Applied 4311320) sont ajoutés aux produits PCR obtenus (tableau 4).

Tableau 4 : Séquences des amorces utilisées pour l’analyse des polymorphismes UGT1A1*28

(TA)6>(TA)7, TS5’ « 2R>3R » et TS3’ « délétion/insertion de 6pb ».

Gène Amorces

TS5’ « 2R>3R »

rs34743033

Amorce F : 5’(FAM) GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC 3’

Amorce R: 5’ GCTCCGAGCCGGCCACAGGCAT 3’

TS3’ « délétion/insertion de 6pb »

rs34489327

Amorce F : 5’GACGAATGCAGAACACTTCT 3’

Amorce R : 5’(FAM) AATCTGAGGGAGCTGAGTAAC 3’

UGT1A1*28 (TA)6 >(TA)7

rs8175347

Amorce F : 5’ GCTCCACCTTCTTTATCTCTG 3’

Amorce R : 5’(FAM) CAGCATGGGACACCACTG 3’


51

Les produits PCR fluorescents ont été distribués en colonne sur une plaque « MicroAmp

Optical » (Applied N801-0560) pour être séparés par électrophorèse capillaire sur séquenceur

(ABI PRISM 3700 DNA Analyser - Applied Biosystems) et analysés grâce aux logiciel

« GENEMAPPER ».

Pour TS 5’, on attend une bande à 214 pb pour les homozygotes sauvages « 2R/2R » et une

autre à 248 s’il ya répétition de la séquence de 28pb pour les hétérozygotes « 2R/ 3R ». Les

homozygotes « 3R/3R » ont une seule bande à 248pb.

Pour TS 3’, on attend un fragment de 107pb pour les homozygotes sauvages pour la délétion

de 6pb et un autre à 107+ 6 bases s’il ya insertion de 6pb.

Pour le SNP UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7 à la position -53, on attend un fragment à 249pb

pour les homozygotes sauvages « UGT1A1*1/*1 », un autre à 251pb pour les homozygotes

mutés « UGT1A1*28/*28 » et deux fragments à 249pb et 251pb pour les hétérozygotes

« UGT1A1*1/*28 ».


52

4 ANALYSE STATISTIQUE

Les analyses des résultats obtenus dans cette étude ont été réalisées en utilisant les outils

statistiques classiques de recherche d’association marqueur génétique/maladie : Khi2 Odds

ratio et la signification statistique (p).

La signification statistique d’une association entre un marqueur et une maladie, est testée par

le calcul du Khi2. Le Khi2 de conformité permet d’apprécier la signification ou non d’une

différence de distribution, pour un marqueur donné, entre les populations de malades et de

témoins.

(p) représente le degré de signification qui correspond à la probabilité que l’écart global soit

imputable seulement aux fluctuations du hasard. Lorsque la probabilité ‘p’ est égale ou

inférieure à 0.05 (5%), il y a moins de 5 chances sur 100 que la distribution résulte du hasard.

Ainsi, la différence de distribution entre les populations de malades et de témoins, pour un

marqueur donné, est donc statistiquement significative et le marqueur peut être considéré

comme associé à la maladie. L’Odds Ratio ‘OR’ est utilisé dans les enquêtes de cohorte et de

type cas/témoins, il permet d’apprécier l’intensité d’une association entre un marqueur et une

maladie. L’évaluation du Khi2, de ‘p’ et de OR dans cette étude a été réalisée par l’utilisation

du logiciel Epi info 6.

Résultats et discussion

53

VI RESULTATS ET DISCUSSION

1 RESULTATS ET DISCUSSION DU GENOTYPAGE DES SUJETS POUR LES GENES

GSTM1, GSTT1, ET GSTP1 EXONS 5 ET 6

Les résultats des génotypage des sujets pour les gènes GSTM1 et GSTT1 ont concerné 71

patients atteints de CCR et 49 contrôles tandis que ceux révélant les polymorphismes de

GSTP1 exon 5 ont été obtenus pour 97 CCR et 99 contrôles et ceux de GSTP1 exon 6 ont été

analysés pour 93 CCR et 99 contrôles.

La figure 7 montre le profil d’amplification des gènes GSTM1, GSTT1 mais aussi le profil de

digestion enzymatique par BsmA1 du gène GSTP1 exon 5. Au cours de cette réaction sont

amplifiés simultanément les gènes GSTM1 dont la taille est de 250pb et le gène GSTT1 dont

la taille est de 450pb. Les délétions homozygotes GSTM1 et GSTT1 sont caractérisées par

une absence totale de bande correspondant à l’amplification. Les délétions hétérozygotes ne

sont pas mises en évidence. La distribution des fréquences de ces deux délétions dans notre

population est reportée sur le tableau 5.

Figure 7: Profils d’amplification des gènes GSTM1, GSTT1 et

de digestion enzymatique par BsmA1 du gène GSTP1 exon 5


54

La digestion du gène GSTP1 313A>G nous a donné un fragment de 176pb lorsqu’on était en

présence d’un homozygote sauvage AA (105Ile/105Ileu), de deux fragments de 91pb et 85pb

en présence d’un homozygote muté GG (105Val/105Val) et de trois fragments de 176pb,

91pb et 85pb pour un hétérozygote muté AG (105Ile /105Val).

L’exploration du polymorphisme de l’exon 6 du gène GSTP1 a été réalisée par PCR

quantitative. Cette technique nous a permis de retrouver les fréquences de l’allèle sauvage

GSTP1 341C (114Ala), de l’allèle muté GSTP1 341T (114Val) et des différents génotypes

homozygotes sauvages CC, homozygotes mutés TT et hétérozygotes CT de ce gène parmi la

population de patients CCR et celle des contrôles (Tableau 5).

L’analyse du génotypage par Taqman (nuages de points) nous a permis de distinguer les

homozygotes des hétérozygotes pour chacun des SNPs explorés. La figure 8 montre un

exemple de résultat de génotypage concernant le SNP GSTP1 341C>T.

Figure 8: Nuages de points représentant les individus de différents génotypes

Les individus homozygotes CC sont représentés par un nuage de points de couleur rouge ; les individus

hétérozygotes CT par un (nuage de couleur verte. Les homozygotes TT n’ayant pas été retrouvés dans

notre échantillon, le nuage de couleur bleue correspondant n’apparait pas sur la figure. Les individus

dont le génotype n’est pas correctement déterminé sont représentés par un nuage de couleur noire.


55

Les tableaux 5 et 6 résument ces résultats pour la population de malades et celle des contrôles.

Tableau 5 : Distribution des fréquences génotypiques de GSTM1 et GSTT1 dans la

population de l’Ouest Algérien.

Génotypes

GSTM1

Délétion homozygote

Délétion non homozygote

GSTT1

Délétion homozygote

Délétion non homozygote

CCR Contrôles

p

n=72

36/72 (50%)

36/72 (50%)

23/72 (32%)

49/72 (68%)

n=49

25/49 (51%)

24/49 (48,9%)

12/49 (24,4%)

37/49 (75.5%)

ns

ns

ns

ns

*ns : non significatif ; p : Signification statistique.


56

Tableau 6 : Distribution des fréquences allèliques et haplotypiques de GSTP1 dans la population de


GSTP1 313A>G

Allèle 313A (105Ile)

Allèle 313G (105Val)

Génotypes

AA (Ile/Ile)

AG (Ile/Val)

GG (Val/Val)

GSTP1 341C>T

Allèle 341C (114Ala)

Allèle 341T (114Val)

CC (Ala/Ala)

CT (Ala/Val)

TT (Val/Val)

GSTP1 haplotypes

GSTP1*A/GSTP1*A

GSTP1*A/GSTP1*B

GSTP1*B/GSTP1*B

GSTP1*B/GSTP1*C

CCR

n=97

124/194 (63,9%)

70/194 (36 %)

41/97 (42,2%)

42/97 (43,2%)

14/97 (14,4%)

n=93

177/186 (95,2%)

9/168 (4,9%)

84/93 (90,3%)

9/93 (9,6%)

0/93 (0%)

n=86

39/86 (45,3%)

33/86 (38,3%)

12/86 (13,9%)

2/86 (2,3%)

Contrôles

n=99

130/198 (65,6%)

68/198 (34,4%)

44/99 (44,4%)

42/99 (42,4%)

13/99 (13,1%)

n=99

189/198 (95,4%)

9/198 (4.5%)

90/99 (90,9%)

9/99 (9%)

0/99 (0%)

n=94

44/94 (44,4%)

37/94 (39,3%)

9/94 (9,5%)

4/94 (4,2%)

p

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns



57

Délétion des gènes GSTM1 et GSTT1

Pour la délétion du gène GSTM1 nous n’avons retrouvé aucune différence dans la distribution

de l’allèle nul (délétion homozygote) chez les individus sains comparés aux patients CCR. En

effet, 50% des cas et 51% des contrôles possédaient l’allèle nul (p=0.91) (Figure 9).

Par ailleurs, la fréquence de la délétion homozygote de GSTM1 de 51 % trouvée dans notre

population contrôle est identique à celle observée dans la population Caucasienne (50 %) (Lee

et al, 2004). La seule comparaison avec la population maghrébine qui ait pu être établie est

celle relative à la population Tunisienne qui rapporte une fréquence de 33 % (Chelbi et al,

2007) (Figure 10).

Figure 9: Distribution de la délétion homozygote de GSTM1 entre les

patients CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien.

Figure 10: Distribution de la fréquence de la délétion homozygote du

gène GSTM1 de la population de l’Ouest Algérien comparée à celle

d’autres populations.


58

Pour la délétion du gène GSTT1 notre analyse ne retrouve aucune différence statistiquement

significative entre CCR et contrôles puisque l’allèle nul a été retrouvé chez 31,9% des cas et

24,4% des contrôles (p=0.37) (Figure 11).

Par ailleurs, la fréquence de la délétion homozygote GSTT1 de 24,4 % dans notre population

contrôle se rapproche autant de celles observée dans la population Caucasienne (20 %) (Lee et

al, 2004) que de celle retrouvée chez nos voisins Tunisiens (29,50%) (Chelbi et al, 2007)

(Figure 12).

Figure 11: Distribution de la délétion homozygote de GSTT1 entre les


Figure 12: Distribution de la fréquence de la délétion homozygote du

gène GSTT1 de la population de l’Ouest Algérien comparée à celle



59

L’absence d’association entre la délétion homozygote de GSTM1 et la délétion homozygote

de GSTT1 et la survenue du CCR que nous avons retrouvée dans cette étude suggère que les

individus porteurs de ces délétions à l’état homozygote qui abolissent complètement l’activité

de ces deux enzymes, n’ont pas plus de risque de développer un CCR dans notre population

que les sujets non homozygotes.

La relation entre le risque de CCR et le polymorphisme GSTM1 a été largement analysée et

des études portant sur une large cohorte (Houlston et al, 2001 ; Little et al, 2006) n’ont

conclut à aucune association du polymorphisme GSTM1 avec le CCR. Nos résultats sont

conformes à ces observations. En revanche, l’équipe de Sachse et celle de Martínez décrivent

un risque accru au CCR pour les porteurs nuls de la délétion de GSTM1 (Sachse et al, 2002 ;

Martínez et al, 2006).

Concernant, GSTT1, nos résultats sont en accord avec la méta-analyse de Houlston mais en

contradiction avec celle de De Jong qui rapporte des résultats opposés (Houlston et al, 2001)

(De Jong et al, 2002).

Les délétions des gènes GSTM1 et GSTT1 annihilent complètement l’activité enzymatique

des enzymes correspondantes or il a été démontré que ces enzymes sont responsables de la

détoxication de nombreuses molécules électrophiles mutagènes présentes dans la fumée de

tabac ou encore dans l’alimentation. En effet la fumée de tabac est une source riche en

molécules carcinogènes comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques, et les amines

aromatiques, et d'autres carcinogènes et ces molécules font parties des nombreux substrats des

GST (Giovannucci et al, 1996 ; Potter et al, 1999). Le colon est également exposé aux HAP et

aux amines hétérocycliques par la consommation d’aliments cuits à températures élevées, ce

qui représente un autre facteur de risque potentiel pour le CCR (Sinha et al, 1999 ; Sinha et al,

2001). Les HAP activés sont des substrats pour les enzymes GSTM1 et GSTT1 qui,

lorsqu’elles sont actives, les conjuguent au glutathion leur faisant perdre ainsi leur potentiel

cancérigène (Prochaska et al, 1998). Cette conjugaison est également induite par la

consommation diététique des isothiocyanates trouvés dans les légumes crucifères (Whitty et

al, 1987). De plus, la formation des adduits d’ADN et le taux de mutations somatiques ont été

rapportés comme étant augmentés chez les individus porteurs de délétions homozygotes pour

GSTM1 et GSTT1 (Smith et al, 1995). Il n’est donc pas surprenant que certains auteurs aient


60

retrouvé une association entre la perte d’activité de ces deux enzymes et la survenue du CCR

(De Jong et al, 2002 ; Sachse et al, 2002 ; Martínez et al, 2006).

Dans ce travail, notre population d’étude n’a pas été stratifiée en fonction des habitudes

alimentaires, cela pourrait constituer un biais dans l’interprétation des résultats. Par ailleurs,

les différences ethniques concernant les gènes GSTM1 et GSTT1 sont telles que leurs

délétions pourraient avoir un impact différent selon les populations (Longuemaux et al, 1999 ;

Park et al, 1999 ; Wormhoudt et al, 1999).

GSTP1313A>G et GSTP1 341C>T

• GSTP1 313A>G

Pour le gène GSTP1 exon 5, la fréquence de l’allèle GSTP1 313A était de 0.639 chez les cas

et de 0.656 chez les contrôles ; la fréquence de l’allèle GSTP1 313G était de 0.360 chez les

cas et 0.344 pour les contrôles. Chez les contrôles, 42,4% des individus étaient hétérozygotes,

44,4% homozygotes pour GSTP1 313A et 13,1% étaient homozygotes pour GSTP1 313G ;

chez les cas, ces pourcentages étaient respectivement de 43,3%, 42,2% et 14,4%. Aucune

différence statistiquement significative n’a été retrouvée entre les cas et les contrôles pour le

SNP GSTP1 313A>G (p=0.71) (Figure 13).

Figure13: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 313A>G entre les



61

Par ailleurs, dans notre population contrôle, la fréquence de l’allèle GSTP1 313A était de

65,6% et celle de GSTP1 313G de 34,4% ; ces valeurs sont très proches de celles retrouvées

dans la population Caucasienne ou ces fréquences sont de 68% pour GSTP1 313A et 32%

pour GSTP1 313G (Schneider et al, 2004). En revanche ces fréquences s’éloignent quelque

peu de celles retrouvées chez nos voisins Tunisiens qui ont rapporté dans une étude récente

une fréquence de 56,2% pour GSTP1 313A et 43,8% pour GSTP1 313G (Chelbi Hanene et

al, 2007) (Figure 14).

• GSTP1 341C>T

Pour GSTP1 exon 6, la fréquence de l’allèle GSTP1 341C était de 0.951 chez les malades

contre 0.954 chez les contrôles ; celle de l’allèle GSTP1 341T était de 0.49 chez les malades

contre 0.46 chez les contrôles ; les malades hétérozygotes avaient une fréquence de 9,6%

contre 9% chez les contrôles ; les homozygotes pour GSTP1 341C étaient de 90,3% parmi les

cas contre 90,9% parmi les contrôles ; et enfin aucun individu homozygote pour GSTP1 341T

n’a été retrouvé ni parmi les cas ni parmi les contrôles ; concernant cet autre SNP de GSTP1,

aucune différence statistiquement significative n’a été retrouvée (p=0.89) (Figure 15).

Figure 14: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 313A>G de la

population de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations.


62

La fréquence de l’allèle GSTP1 341C dans notre population contrôle était de 95,4%, et celle

de l’allèle GSTP1 341T de 4,5% ; aucune donnée sur la population Tunisienne ni Maghrébine

en général concernant ce SNP n’est disponible mais nos fréquences semblent être les mêmes

que celles retrouvées sur la population Caucasienne (91,5% pour l’allèle GSTP1 341C et

8,5% pour l’allèle GSTP1 341T) (Moore, et al, 2005) (Figure 16).

Figure 15: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 341C>T entre les


Figure 16: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 341C>T de la

population de l’Ouest Algérien comparée à celle de la population

Caucasienne.


63

Nous avons également analysé la fréquence des haplotypes sur ce gène et aucune différence

statistiquement significative n’a été retrouvée entre la population de patients CCR et la

population contrôle.

De par son taux d’expression plus important au niveau du colon et de par son intervention

dans la désactivation des aminés hétérocycliques mutagènes formés dans les aliments cuits,

GSTP1 semble être parmi les GST, le meilleur gène candidat pour la susceptibilité au CCR

(Lin et al, 1994 ; Nijhoff et al, 1995).

Les deux SNPs sur GSTP1, GSTP1 313A>G sur l’exon 5 et GSTP1 341C>T dans l’exon 6

ont une incidence sur la structure tridimensionnelle de l’enzyme et sur la stéréospécificité du

site catalytique (Ali-Osman et al, 1997). En effet, en altérant le site actif de GSTP1, ils

diminuent son affinité pour le substrat aboutissant de ce fait à une plus faible activité de cette

enzyme (Zimniak P et al, 1994 ; Van der Logt et al, 2004). In vitro, l’activité enzymatique de

la GSTP1 est quatre fois plus faible pour les variants allèliques GSTP1*B et GSTP1*C

comparés à l’allèle de référence GSTP1*A et l’allèle GSTP1*D semble très rare (Alexandrie

et al, 2002).

Seules de rares études ont conforté l’hypothèse selon laquelle ces polymorphismes sur le gène

GSTP1 sont associés à la survenue du CCR (Katoh et al, 1996 ; Harris et al, 1998). En

revanche, de nombreux travaux ne retrouvent pas cette association (Welfare et al, 1999 ;

Moore, et al, 2005 ; Ateş et al, 2005). Nous avons recherché cette relation d’association et les

résultats de notre étude sont en accord avec ces derniers puisqu’aucune association

statistiquement significative na été retrouvée entre les variants 313G ou 341T de GSTP1 et

l’augmentation du risque de CCR dans notre population. De même que pour GSTM1 et

GSTT1, cette non association suggère que d’autres facteurs comme l’alimentation pourraient

intervenir dans ce processus de cancérisation et que la modification de l’activité de GSTP1

seule n’aurait aucun impact sur la survenue du CCR.

Les gènes GST ont été largement explorés et les résultats restent à ce jour contradictoire quant

à leur association avec la survenue du CCR mais il reste important de connaitre les

distributions de leurs différents allèles dans notre population notamment dans le domaine de

la pharmacogénétique. En effet, le polymorphisme 313A>G du gène codant pour GSTP1 a pu

être corrélé avec une augmentation significative de la survie dans une série de patients atteints


64

d’un cancer colorectal métastasé traité par une chimiothérapie à base d’oxaliplatine (médiane

de survie à 25 mois pour le génotype Val/Val, 13 mois pour Ile/Val, et 8 mois pour Ile/Ile)

(Stoelmacher et al, 2002). De plus, une étude récente a associé ce SNP à un risque diminué

de neuropathie périphérique cumulative chez des patients atteints de cancer gastro-intestinal

(Lecomte et al, 2006).

Cependant, les conclusions relatives à l’implication de ce polymorphisme dans la survenue

de la toxicité à l’oxaliplatine restent contradictoires et de plus amples études sont nécessaires

afin de déterminer le rôle exact de ce SNP dans la réponse à l’oxaliplatine. Cet anticancéreux

est également prescrit dans la chimiothérapie du CCR en Algérie et une recherche de la

corrélation entre la réponse à cette molécule et les génotypes de GSTP1 sur notre population

de patients est en cours d’analyse. En attendant que ce travail soit réalisé, la distribution des

fréquences génotypiques de ces gènes dans notre population pourrait servir à rechercher des

associations avec d’autres pathologies.

2 RESULTATS ET DISCUSSION DU GENOTYPAGE DES SUJETS POUR LE GENE MDR1

Les résultats génotypiques pour le SNP MDR1 3435 C>T ont été retrouvé pour 94 patients

atteints de CCR et 98 contrôles.

Les fréquences allèliques et génotypiques du SNP MDR1 3435C>T ont été comparées entre

les cas et les contrôles. La fréquence de l’allèle C était de 0,643 chez les cas contre 0,658 chez

les contrôles. Celle de l’allèle T était de 0,356 chez les malades contre 0,341 chez les sujets

sains. Le génotype CC a été retrouvé à une fréquence de 0,414, le génotype CT à 0,457 et TT

à 0,127 dans le groupe des malades. Dans le groupe des sujets sains, la fréquence du génotype

CC était de 0,448 celle de CT de 0,418 et celle de TT de 0,132 (Tableau 7).


65

Aucune différence significative n’a été observée dans la distribution des fréquences des

allèles C et T chez les cas par rapport aux contrôles (p=0.76) (Figure 17).

Tableau 7: Distribution des fréquences allèliques et génotypiques du SNP MDR1

3435C>T, chez des patients atteints de CCR et une population contrôle de l’Ouest

Algérien

MDR1 3435C>T

Allèle 3435C

Allèle 3435T

CC

CT

TT

CCR

n=94

121/188 (64,3%)

67/188 (35,6 %)

39/94 (41,4%)

43/94 (45,7%)

12/94 (12,7%)

Contrôles

n=98

129/196 (65,8%)

67/196 (34,1%)

44/98 (44,8%)

41/98 (41,8%)

13/98 (13,2%)

p

ns

ns

ns

ns

ns


Figure 17: Distribution de la fréquence du SNP MDR1 3435C>T entre les

patients CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien


66

Il est à noter que la fréquence de l’allèle MDR1 3435C est largement supérieure à la

fréquence de l’allèle MDR1 3435T dans notre échantillon témoin. Cette même observation est

également retrouvée dans les populations Japonaise et Iranienne (Komoto et al, 2006 ;

Farnood et al, 2007) ce qui n’est pas le cas pour les populations Caucasiennes Espagnole et

Américaine (Bernal et al, 2003 ; Vicente et al, 2007). Par ailleurs, la fréquence de ce SNP

observée dans notre population se rapproche beaucoup de celle trouvée dans la population

Iranienne (Figure 18).

Les génotypes CC, CT et TT de ce SNP, sont associés à des variations d'expression de la P-

gp. Les individus portant le génotype CC présentent une expression de la P-gp duodénale

65 fois plus importante que les individus homozygotes TT (Hoffmeyer et al, 2000). Cette

surexpression de la protéine P-gp s’accompagne d’une résistance des sujets CC à l’entrée des

xénobiotiques réduisant probablement ainsi le risque d’un CCR (Gottesman et al, 2006). Dans

notre étude, nous retrouvons une fréquence des génotypes CC plus importante que celle des

génotypes TT aussi bien chez les cas que chez les contrôles. Ainsi, il apparait que le génotype

CC n’est pas corrélé à la survenue du CCR dans notre population. Cette absence d’association

est également retrouvée dans d’autres études cas/témoins (Petrova et al, 2008).

Figure 18: Distribution de la fréquence du SNP MDR1 3435C>T dans la



67

L’analyse de la distribution des fréquences allèliques du SNP 3435C>T du gène MDR1

semble montrer que notre population est très proche de la population Iranienne. De plus,

contrairement à certaines populations, l’allèle MDR1 3435C est prédominant dans la

population Algérienne mais ne semble conférer aucune protection ni susceptibilité particulière

vis-à-vis de la survenue du CCR. Néanmoins, il serait intéressant d’explorer d’autres SNPs du

gène MDR1 en particulier les SNPs se trouvant dans la région promotrice de MDR1 comme

2410T>C, 1910T>C et 692T>C dont l’effet sur l’expression de la P-gp dans la muqueuse

colorectale a été clairement mis en évidence (Taniguchi et al, 2003).

L’importance de l’influence du polymorphisme du gène MDR1 sur la réponse aux

médicaments utilisés dans la chimiothérapie du CCR est telle, qu’il est très intéressant de

compléter cette étude par la recherche des corrélations entre les génotypes de ce SNP vis-à-vis

des molécules anti-cancers et ceci pour une meilleure prise en charge des malades ; ce travail

nécessite du temps pour une bonne évaluation à long terme de cette réponse thérapeutique et

est en cours d’analyse sur la population de l’Ouest Algérien.

3 RESULTATS ET DISCUSSION DU GENOTYPAGE DES SUJETS POUR LE GENE

CYP3A5

Les résultats génotypiques pour le SNP 6986A>G dans l’intron 3 du gène CYP3A5 ont été

retrouvés pour 96 patients atteints de CCR et 99 contrôles.

L’allèle sauvage 6986A de ce polymorphisme est noté CYP3A5*1 tandis que l’allèle muté

6986G s’écrit CYP3A5*3.

La fréquence de l’allèle CYP3A5*1 était de 0,161 chez les cas contre 0,204 chez les

contrôles. Celle de l’allèle CYP3A5*3 était de 0,838 chez les malades contre 0,806 chez les

sujets sains. Concernant la distribution des génotypes, dans notre population d’étude, le

génotype CYP3A5*1/*1 est très rare autant chez les cas (1%) que chez les contrôles (6.1%).

Par ailleurs, le génotype CYP3A5*3/*3 a été retrouvé à une fréquence de 68.7% chez les

CCR et 66.3% chez les contrôles (Tableau 8).


68

Après comparaison des fréquences allèliques et génotypiques du SNP 6986A>G du gène

CYP3A5 entre les cas et les contrôles, il ressort qu’il n’existe aucune différence significative

dans la distribution des fréquences des allèles CYP3A5*1 et CYP3A5*3 entre les deux

catégories d’individus (p=29) (Figure 19).

Tableau 8: Distribution des fréquences allèliques et génotypiques du SNP 6986>G du

gène CYP3A5 chez des patients atteints de CCR et une population contrôle de l’Ouest

Algérien.

CYP3A5 6986A>G

Allèle A (CYP3A5*1)

Allèle G (CYP3A5*3)

AA (CYP3A5*1/*1)

GA (CYP3A5*1/*3)

GG (CYP3A5*3/*3)

CCR

n=96

31/192 (16.1 %)

161/192 (83.8%)

1/96 (1%)

29/96 (30.2%)

66/96 (68.7%)

Contrôles

n=98

40/196 (20.4%)

158/196 (80.6%)

6/98 (6.1%)

28/98 (28.5%)

65/98 (66.3%)

p

ns

ns

ns

ns

ns

Figure 19: Distribution de la fréquence du SNP 6986A>G du

gène CYP3A5 entre les patients CCR et les contrôles sur une



69

La fréquence de 80.6% de l’allèle CYP3A5*3 dans notre population contrôle est proche de

celle retrouvée sur la population Caucasienne Française (81,3%) et de celle retrouvée sur la

population Tunisienne (83%) (Figure 20).

Les HAP comme le benzo[a]pyrène font l’objet de réactions d’oxydation de phase I qui

peuvent conduire à des composés oxygénés mutagènes et cancérogènes selon le niveau

d’attaque sur la molécule. L’enzyme CYP3A5 fait partie des enzymes de la phase I, c’est une

mono oxygénase impliquée dans une voie NADPH-dépendante de transport d’électron. Elle

oxyde une variété de composés structurellement indépendants dont les stréroides, des acides

gras et divers xénobiotiques potentiellement carcinogènes présents dans l’alimentation. Cette

fonction d’oxygénation permet à ces substances d’être plus hydrophiles facilitant ainsi leur

excrétion (Hustert et al, 2001).

Le SNP 6986A>G est de découverte relativement récente (Kuehl et al, 2001). L’équipe de

Kuehl a analysé l’ADNc du gène CYP3A5 et a corrélé l’allèle CYP3A5*1 à l’expression du

taux le plus élevé d’ARNm et à une expression maximale de l’enzyme CYP3A5. En

revanche, les individus présentant l’allèle CYP3A5*3 ont une variabilité de séquence dans

l’intron 3 qui crée un site d’épissage cryptique aboutissant à un exon supplémentaire « 3B »

Figure 20: Distribution de la fréquence du SNP 6986A>G du gène

CYP3A5 dans la population de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres

populations.


70

dérivé de séquences de l’intron 3. Cet allèle code pour un ARNm avec un codon stop

prématuré et la traduction de ce transcrit anormal génère une protéine prématurément

tronquée au niveau de l’acide aminé 102. Cet épissage alternatif serait responsable d’une

importante réduction voire absence de l’enzyme CYP3A5 (Kuehl et al, 2001).

Sachant que l’allèle CYP3A5*3 est synonyme d’une expression plus faible voire nulle de

l’enzyme CYP3A5, il semblerait que dans notre population, l’expression de CYP3A5 serait

plus faible et donc que la perte de l’expression de cette enzyme due au SNP 6986A>G n’ait

pas de lien avec une susceptibilité accrue au CCR. Ceci est en accord avec les conclusions

d’autres études récentes (Petrova et al, 2007 ; Gervasini et al, 2007). Cette absence

d’association, malgré la fréquence élevée de ce SNP dans notre population, pourrait

s’expliquer par le mode d’alimentation différent et donc une exposition à des substances

cancérigènes potentielles différentes dans nos régions qui ne nécessiteraient pas la fonction

enzymatique de CYP3A5 pour être désactivées. De plus, il se pourrait que l’expression de

CYP3A5 ne soit pas exclusivement régulée au niveau transcriptionnel, et que les mécanismes

de régulation de celle-ci pourraient être différents entre les sujets souffrant de CCR et les

individus sains (Bergheim et al, 2005). Cette hypothèse signifierait que le polymorphisme

modifiant la transcription du gène CYP3A5 pourrait être contrebalancé par un autre

mécanisme de régulation qui aboutirait à une expression normale de cette enzyme chez les

sujets malades. Par ailleurs, il se pourrait que ce SNP ait des conséquences différentes en

fonction de l’alimentation et donc de la localisation géographique. Cette hypothèse est étayée

par d’autres travaux ou l’effet de l’allèle CYP3A5*3 semble plutôt protecteur vis-à-vis du

cancer dans d’autres populations. En effet dans ces études ce SNP est associé à une

diminution du risque de cancer de l’œsophage mais aussi du cancer de la prostate (Dandara et

al, 2005 ; Plummer et al, 2003).

Néanmoins, il reste important de connaitre la distribution des fréquences allèliques et

génotypiques de ce SNP dans notre population car cela pourrait servir à établir d’autres

comparaisons dans le cadre d’études cas/témoins à la recherche d’une éventuelle association

avec d’autres pathologies cancéreuses en Algérie.


71

4 RESULTATS ET DISCUSSION DU GENOTYPAGE DES SUJETS POUR LE GENE UGT1A1

• VNTR UGT1A1*28(TA) 6>(TA)7

Concernant le VNTR UGT1A1*28(TA) 6>(TA)7, l’étude a porté sur 72 CCR et 45 individus

sains.

La fréquence de l’allèle UGT1A1*1 correspondant à 6 répétitions de la séquence TA était de

0,68 chez les CCR contre 0,60 chez les contrôles ; la fréquence de l’allèle UGT1A1*28

correspondant à 7 répétitions de TA était de 0,32 chez les CCR contre 0,40 chez les contrôles.

Concernant les génotypes, 47% des CCR et 40% des contrôles étaient homozygotes pour

l’allèle UGT1A1*1, tandis que 11% des CCR et 20% des contrôles étaient homozygotes pour

l’allèle UGT1A1*28. Les hétérozygotes UGT1A1*1/*28 étaient de 42% chez les CCR contre

40% chez les contrôles (Tableau 9).


72

Tableau 9: Distribution des fréquences allèliques, génotypiques et haplotypiques du SNP -3156

G>A et du VNTR UGT1A1*28(TA)6> (TA)7 du gène UGT1A1 chez des patients atteints de CCR

et une population contrôle de l’Ouest Algérien.

SNP UGT1A1*28(TA)6>(TA)7

Allèle UGT1A1*1

Allèle UGT1A1*28

UGT1A1*1/*1

UGT1A1*1/*28

UGT1A1*28/*28

SNP UGT1A1 -3156 G>A

Allèle G

Allèle A

GG

GA

AA

Haplotypes

GG/UGT1A1*1/*1

GG/UGT1A1*1/*28

GG/UGT1A1*28/*28

GA/UGT1A1*1/*1

GA/UGT1A1*1/*28

GA/UGT1A1*28/*28

AA/UGT1A1*28/28

CCR

n=72

98/144 (68%)

46/144 (32%)

34/72 (47%)

30/72 (42%)

8/72 (11%)

n=96

141/192 (73,4%)

51/192 (26,5%)

52/96 (54.1%)

37/96 (38,5%)

7/96 (7,3%)

n=70

29/70 (41%)

10/70 (14.3%)

1/70 (1,4%)

4/70 (5,7%)

19/70 (27.1%)

1/70 (1,4%)

6/70 (8,5%)

Contrôles

n=45

54/90 (60%)

36/90 (40%)

18 /45 (40%)

18/45 (40%)

9/45 (20%)

n=99

146/198 (73,7%)

52/198 (26,2%)

55 /99 (55,5%)

36 /99 (36,4%)

8/99 (8%)

n=45

18/45 (40%)

4/45 (8.9%)

0/45 (0%)

0/45 (0%)

15/45 (33.3%)

1/45 (2.2%)

7/45 (15.5%)

p

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

*ns : non significatif ; p : Signification statistique .


73

Aucune différence statistiquement significative n’a été retrouvée entre les cas et les contrôles

concernant ce SNP (p=0.20) (Figure 21).

La fréquence de l’allèle UGT1A1*28 est de 40% dans notre population contrôle ; Cette

évaluation n’ayant été faite sur aucune des populations Maghrébines voisines nous n’avons

donc pas pu établir de comparaison avec celles-ci. En revanche nous pouvons dire que cette

fréquence est similaire à celle caractérisant la population Caucasienne (38%) et la population

afro-américaine (42%) (Beutler et al, 1998) (Figure 22).

Figure 21: Distribution de la fréquence du VNTR UGT1A1*28(TA)6>(TA)7du

gène UGT1A1 entre les patients CCR et les contrôles sur une population de


Figure 22: Distribution de la fréquence du VNTR UGT1A1*28(TA)6>(TA)7

dans la population de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations.


74

• UGT1A1 -3156G>A

Les résultats pour le SNP-3156G>A du gène UGT1A1 concernent 96 CCR et 99 contrôles.

La fréquence de l’allèle UGT1A1-3156G était de 0.734 chez les cas et de 0,737 chez les

contrôles ; la fréquence de l’allèle UGT1A1-3156A était de 0.265 chez les cas et 0.262 pour

les contrôles ; chez les cas, 38,5% des individus étaient hétérozygotes, 54.1% homozygotes

pour UGT1A1-3156 G et 7,3% étaient homozygotes pour UGT1A1-3156 A ; chez les

contrôles, ces pourcentages étaient respectivement de 55,5%, 36,4% et 8% (tableau 9).

Aucune différence statistiquement significative n’a été retrouvée entre les cas et les contrôles

pour le SNP UGT1A1-3156 (p=94) (Figure 23).

Le pourcentage de l’allèle UGT1A1-3156 A dans notre population contrôle était de 26,2% ;

celui-ci est très proche de ceux caractérisant la population Caucasienne (29,5%) et la

population Afro-Américaine (28,5%) (Beutler et al 1998) (Figure 24).

Figure 23: Distribution de la fréquence du SNP -3156 G>A du gène

UGT1A1 entre les patients CCR et les contrôles sur une population de



75

Après avoir comparé les fréquences de chaque SNP seul entre les cas et les malades nous

nous sommes intéressé à établir les différents haplotypes constitués par ces deux SNPs. Nous

n’avons retrouvé, la non plus, aucune différence statistiquement significative entre les cas et

les contrôles (Tableau 9).

Le CCR est en grande partie associé au mode de vie, mais il peut être aussi modulé par des

facteurs génétiques à faible pénétrance. De nombreuses études ont clairement démontré le rôle

du gène UGT1A1 dans le métabolisme des molécules potentiellement carcinogènes produites

par la cuisson des aliments à hautes températures dont les amines hétérocycliques et les

hydrocarbures aromatiques polycycliques issus de la cuisson de la viande (Kaderlik et al,

1994). En effet, la réaction de glucuronidation assurée par cette enzyme est une des premières

voies de détoxification de ces molécules dont les métabolites toxiques se fixent au niveau de

l’ADN cellulaire conduisant à des mutations. (Turesky, 2002). Le tractus gastro-intestinal

étant exposé directement à ces substances toxiques ou pré-cancérigènes, la muqueuse

intestinale représente donc la première barrière à risque. Par ailleurs, certaines études ont

retrouvé une association entre des SNPs d’autres enzymes de la même famille que UGT1A1,

l’enzyme UGT1A7 et la survenue de CCR (Van der Logt et al, 2004 ;Tang et al, 2005 ; Chen

Figure 24: Distribution de la fréquence du SNP UGT1A1-3156G>A dans la



76

et al, 2006). Il est donc concevable de supposer que des polymorphismes du gène UGT1A1

réduisant la transcription de cette enzyme comme les SNPs UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 sur le

promoteur ou UGT1A1-3156 en amont du promoteur puissent avoir une conséquence sur

l’augmentation du risque de CCR.

Dans notre étude nous n’avons retrouvé aucune différence de distribution de l’allèle

UGT1A1*28 entre les cas et les contrôles. Cela signifie que les individus présentant une plus

faible expression de l’enzyme UGT1A1 due à l’allèle UGT1A1*28 ne présentent pas plus de

risque de développer le CCR par rapport aux patients ne présentant pas cet allèle. Ces

résultats sont en accord avec d’autres études qui aboutissent à la même conclusion (Van der

Logt et al, 2004 ; Tang, et al, 2005).

De même que le VNTR UGT1A1*28(TA)6>(TA)7, le variant UGT1A1 -3156G>A situé dans

une région enhancer en amont du promoteur de ce gène a été corrélé avec une baisse du taux

de transcription du gène UGT1A1 (Innocenti et al, 2002). En se basant sur la possibilité qu’il

puisse de ce fait avoir une influence sur le risque de survenue du CCR, nous l’avons analysé

sur notre population et n’avons retrouvé aucune différence statistiquement significative entre

les cas et les contrôles.

L’importance du génotypage des sujets pour ces deux polymorphismes du gène UGT1A1

réside surtout dans le fait qu’ils soient impliqués dans la toxicité à l’Irinotécan, une molécule

couramment utilisée dans la chimiothérapie du CCR. En effet, plusieurs études ont montré

une association entre ces deux SNPs et une sévère neutropénie après administration

d’Irinotécan (Innocenti et al, 2004).

La réponse au médicament implique deux aspects importants, la quantité de médicament actif

qui atteint la tumeur dans le tissu cible, c’est-à-dire le côlon et également la quantité de

médicament actif qui agit dans la cellule tumorale. Des polymorphismes de UGT1A1 dans

l’ADN constitutif qui affectent toutes les cellules du corps vont moduler la quantité de

médicament actif (SN-38) qui atteint le tissu cible. Le foie est l’organe de prédilection pour le

métabolisme de l’Irinotécan. Les polymorphismes comme UGT1A1*28 affectent la quantité

de SN-38 actif circulant donc par conséquent, la quantité qui se rend au tissu cible. Ceci

pourrait avoir un impact sur la réponse à l’Irinotécan mais aucune étude à ce jour n’a permis


77

de démontrer de façon précise l’impact d’UGT1A1 sur la réponse à la thérapie à base

d’Irinotécan.

Le travail que nous avons réalisé sur ce gène constitue la première étape dans la recherche en

cours de cette corrélation sur notre échantillon d’individus malades soumis a une

chimiothérapie à base d’Irinotécan afin d’optimiser le dosage de cette molécule.

Les fréquences de ces polymorphismes SNPs sur notre population contrôle pourraient aussi

servir dans d’autres études cas /témoins en particulier pour l’hyper bilirubinémie du syndrome

de Gilbert (Bosma et al, 1995). En effet cette pathologie a pour principal facteur causal une

baisse de transcription du gène UGT1A1 due en particulier au polymorphisme

UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 et a pour conséquence une diminution de la réaction de

glucoronidation du SN-38 de la bilirubine d’où une accumulation toxique de celle-ci dans le

foie. Aujourd’hui, dans les pays développé, un dépistage systématique pré thérapeutique est

réalisé afin d'adapter les doses d’Irinotécan aux capacités de glucuronidation de l'enzyme

UGT1A1 avant la mise en place d'un traitement à base de cette molécule.

5 RESULTATS ET DISCUSSION DU GENOTYPAGE DES SUJETS POUR LE GENE TS

Pour ce gène, deux polymorphismes ont été explorés : la répétition de la séquence de 28pb

« 2R >3R » en 5’ au niveau du promoteur, et la délétion/insertion de 6pb dans la région 3’ en

aval du codon stop à la position 1494. Pour le premier polymorphisme, les résultats rapportés

dans notre étude concernent 70 CCR et 48 contrôles tandis que pour le second, les résultats

concernent 71 CCR et 48 patients.

• TS répétition 2R>3R

La fréquence de l’allèle 2R correspondant à 2 répétitions de la séquence de 28pb était de 0,52

chez les CCR contre 0,53 chez les contrôles ; celle de l’allèle 3R correspondant à 3 répétitions

de la séquence de 28pb était de 0,48 chez les CCR contre 0,47 chez les contrôles. 31,4% des

CCR et 29% des contrôles étaient homozygotes 2R/2R ; 27,1% des CCR et 23% des contrôles


78

étaient homozygotes 3R/3R et 41,4% des CCR et 48% des contrôles étaient hétérozygotes

(Tableau 10).

Tableau 10: Distribution des fréquences allèliques, génotypiques et haplotypiques des

polymorphismes TS « 2R>3R » et TS « del/ins6pb » chez des patients atteints de CCR et une

population contrôle de l’Ouest Algérien.

Gène TS

TS répétition de 28pb

Allèle 2R

Allèle 3R

2R/2R

2R/3R

3R/3R

TS del/ins 6pb

Allèle 0pb

Allèle 6pb

0pb/0pb

0pb/6pb

6pb/6pb

Haplotypes

6pb/6pb//2R/2R

0pb/6pb//2R/2R

0pb/'0pb//2R/2R

6pb/6pb//3R/3R

0pb/6pb//3R/3R

0pb/'0pb//3R/3R

6pb/'6pb//2R/3R

0pb/6pb//2R/3R

0pb/0pb//2R/3R

CCR

n=70

73/140 (52%)

67/140 (48%)

22/70 (31,4%)

29/70 (41,4%)

19/70 (27,1%)

n=71

41/142 (28,8%)

101/142 (71,1%)

5/71 (7%)

31/71 (44%)

35/71 (49%)

n=68

12 (68%)

8 (11.8%)

2 (3%)

9 (13.2%)

6 (8.8%)

3 (4,4%)

14 (20.5%)

1 4 (20.5%)

0 (0%)

Contrôles

n=48

51/96 (53%)

45/96 (47%)

14/48 (29%)

23/48 (48%)

11/48 (23%)

n=48

42/96 (43,8%)

54/96 (56,2%)

10/48 (21%)

22/48 (46%)

16/48 (33%)

n=47

6 (12.8%)

6 (12.8%)

2 (4,2%)

4 (8.5%)

4 (8.5%)

3 (6.3%)

6 (12.7%)

12 (25,5%)

4 (8.5%)

p

ns

ns

ns

ns

ns

0.018

0.018

0.026

ns

0.08

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

OR

0.52

1.92

0.29

1.94

*ns : non significatif ; p : Signification statistique ; OR : Odds ratio.


79

Dans notre étude, nous n’avons retrouvé aucune association entre la répétition de 28pb « 2R>

3R » du promoteur de TS et la survenue du CCR (p=0.88) (Figure 25).

Pour ce VNTR, la fréquence de l’allèle 2R dans notre population était de 53% contre 47%

pour l’allèle 3R ; en comparant nos fréquences à celles caractérisant d’autres populations,

nous avons pu noter que nos fréquences sont proches de celles de la population Caucasienne

qui se caractérise par une fréquence de 45% pour l’allèle 2R et de 55% pour l’allèle 3R (Jia

Chen et al, 2003). En revanche celles-ci semblent très éloignées de celles retrouvées sur la

population Chinoise (18% pour 2R et 82% pour 3R) (Marsh et al, 1999) (Figure 26).

Figure 26: Distribution de la fréquence du polymorphisme TS

« 2R>3R » dans la population de l’Ouest Algérien comparée à celle


Figure 25: Distribution de la fréquence du polymorphisme TS « 2R>3R »

entre les patients CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest

Algérien.


80

• TS délétion/insertion de 6pb « del/ins 6pb »

Concernant la délétion/insertion de 6pb, la fréquence de l’allèle 0pb (délétion de 6pb) était de

0,288 chez les CCR contre 0,438 chez les contrôles. La fréquence de l’allèle 6pb (insertion de

6pb) était de 0,712 chez les CCR contre 0,562 chez les contrôles. Une association

statistiquement significative a été retrouvée concernant l’allèle 6pb et le CCR (OR=1.92,

p=0.018) (Figure 27).

Les individus homozygotes porteurs de la délétion (0pb/0pb) représentent seulement 7% des

CCR contre 21% des contrôles. Pour le reste des génotypes, 49% des CCR sont homozygotes

6pb/6pb contre 33% des contrôles; le reste des CCR (44%) et des contrôles (46%) sont

hétérozygotes (Tableau 10). Une différence statistiquement significative est là aussi retrouvée

entre les cas et les contrôles, pour les génotypes 0pb/6pb et 6pb/6pb suggérant que ces deux

génotypes 0pb/6pb et 6pb/6pb sont associés à une plus haut risque de CCR.

Figure 27: Distribution de la fréquence du polymorphisme TS

« del/ins6pb » entre les patients CCR et les contrôles sur une population

de l’Ouest Algérien.


81

Dans notre population contrôles nous retrouvons une fréquence de l’allèle 0pb de 43,8%

contre 56,2% pour l’allèle 6pb. Celle-ci semble s’éloigner quelque peu des fréquences

retrouvées dans la population Caucasienne (32,2% pour l’allèle 0pb contre 68,8% pour l’allèle

6pb) (Shi et al, 2005). Dans la population Chinoise, ces fréquences sont estimées à 68% pour

l’allèle 0pb et 32% pour l’allèle 6pb ( Zhang et al, 2004) (Figure 28).

Notre choix de rechercher une possible association des polymorphismes de TS et le CCR dans

notre population a été guidé par les conclusions de nombreuses études. D’une part celles qui

ont largement démontré que la TS participait au métabolisme des folates présents dans

l’alimentation (Rustum et al 1997 ; Radparvar et al, 1988) et d’autre part celles qui ont

démontré qu’une plus importante consommation de folates dans l’alimentation ou sous forme

de compléments diététiques, est associée à un risque plus faible de CCR (Giovannucci et al

1995 ; Duthie, 1999 ; Kato et al, 1999 ; Fenech, 2001).

La thymidylate synthase est l'enzyme responsable de la transformation par méthylation de la

déoxyuridine monophosphate, dUMP, en désoxythymidine monophosphate (dTMP), qui est

ensuite phosphorylé en thymidine triphosphate, TTP, laquelle est incorporée dans l’ADN

(Carreras et al, 1995). C'est une enzyme à deux substrats qui forme avec le dUMP et le

Figure 28 : Distribution de la fréquence du polymorphisme TS

« del/ins6pb » dans la population de l’Ouest Algérien comparée à

celle d’autres populations.


82

méthylène tétrahydrofolate un complexe où le méthylène tétrahydrofolate cède un groupe

méthyl au dUMP. De plus, la TS est une enzyme clé dans le métabolisme des folates en

catalysant la conversion du 5,10-methylenetetrahydrofolate en dihydrofolate (Radparvar et al,

1988). Il n’est donc pas surprenant qu’une diminution de l’activité de la TS puisse avoir un

impact sur le métabolisme des folates et de ce fait augmenter le risque de cancer colorectal.

Par ailleurs, les cellules du colon ont une division cellulaire rapide et sont ainsi le siège d’une

synthèse d'ADN importante, la réparation de l'ADN est de ce fait essentielle dans ces cellules,

et des mécanismes de réparation d'ADN peuvent être irréversiblement affectés par un manque

de thymidine (Mattano et al, 1990 ; James et al, 1994). En effet, il a été prouvé que la baisse

de dTMP pourrrait aboutir à une incorporation de l’uracile au lieu de la thymine dans l’ADN,

erreur qui ne pourrait être réparée par l’uracile-ADN-glycosylase par manque de thymine et

qui provoquerait alors des cassures de la double chaine d’ADN (Duthi, 1999 ; Fenech ,2001).

C’est d’ailleurs ce mécanisme, entre autres, qui est mis à profit en chimiothérapie à base de

5FU pour agir sur les cellules tumorales. Rappelons que le 5FU est un analogue de l’uracile

qui agit selon plusieurs mécanismes. Il peut être intégré soit à l’ARN sous forme de FUTP,

altérant profondément son métabolisme et sa stabilité, soit à l’ADN sous forme de FdUTP,

provoquant une inhibition de la réplication et une fragmentation de l’ADN. Toutefois, son

activité antitumorale s’exerce principalement sous la forme de FdUMP, métabolite capable

d’inhiber la thymidylate synthétase. Cette inhibition est suivie d’un déficit en thymidine et

d’une incorporation de dUTP dans l’ADN, ce qui provoque l’apoptose cellulaire (Longley et

al, 2003).

Par ailleurs, sachant que de nombreuses analyses fonctionnelles ont depuis longtemps prouvé

que la répétition 3R dans le promoteur de TS contribuait à une plus grande efficacité de

l’expression du gène de la TS (Horie et al, 1995 ; Kai-Huan Yu et al, 2008) et partant de

l’hypothèse qu’une plus grande expression de la TS aboutissait à un plus important

métabolisme des folates, nous avons supposé que l’allèle 3R pouvait par conséquent avoir un

effet protecteur par rapport à la survenue du CCR. Nous n’avons retrouvé aucun résultat

allant dans ce sens. Pourtant l’équipe de Ulrich a envisagé cette possibilité et a aboutit à la

conclusion que les polymorphismes du gène TS et la consommation de folates, sous forme de

compléments diététiques avaient un effet interactif sur le risque de cancer. En effet dans cette

étude cas/contrôles de 510 patients souffrant d’un CCR et 604 individus sains, les auteurs de


83

cette étude ont montré que les individus de génotype 3R/3R et ayant une consommation

importante de folates étaient associés à un risque de CCR plus faible ; tandis que les individus

de génotype 2R/2R ayant une consommation aussi importante de folates étaient associés à un

risque plus élevé de CCR (Ulrich et al, 2002).

Cependant d’autres études qui ont recherché l’impact de ce polymorphisme sur la survenue du

CCR ont trouvé des résultats contradictoires. Entre autres, cette étude prospective cas/témoins

portant sur 270 cas de CCR et 454 contrôles dans laquelle les individus de génotype 2R/2R

présentaient un risque plus faible de CCR (Chen et al, 2003). Dans cette étude, les individus

de génotype 2R/2R avaient un taux de folates plasmatiques inférieur à ceux avec le génotype

3R/3R et ces résultats suggeraient donc que ce risque diminué n’était pas influencé par ce

polymorphisme.

Du point de vue pharmacogénétique, étant donné que la TS est une des cibles du 5FU utilisé

dans la chimiothérapie du CCR, plusieurs équipes se sont penchées sur l’analyse de l’impact

du polymorphisme du promoteur de TS sur la réponse à cette molécule (Lacopetta et al,

2001). Plusieurs études ont alors prouvé qu’il existait une relation inverse entre le taux

d’ARNm ou protéique de TS et la réponse anti-tumorale au 5-FU (Lenz et al, 1998 ; Etienne

et al, 2002). Ces travaux ont montré que les malades homozygotes 2R/2R avaient un taux de

réponse au 5-FU supérieur à celui des malades homozygotes 3R/3R et que la présence de

l’allèle 3R est donc associée à une augmentation de l’activité transcriptionnelle (Horie et al,

1995) et par conséquent une diminution de la réponse au 5-FU, mais aussi à une diminution

de la survie (Pullarkat et al, 2001).

Parallèlement à la réponse au 5-FU, une étude récente a montré que ce polymorphisme de TS

était également prédictif de la toxicité au 5-FU avec des taux de toxicité de 43 %, 18 % et 3 %

respectivement pour les génotypes 2R/2R, 2R/3R et 3R/3R (Lecomte et al, 2004). Les sujets

porteurs d au moins un allèle comportant 2 répétitions sont exposés à un risque plus élevé de

toxicité. Ceci s’expliquant par le fait qu’une diminution du taux d’ARNm de la TS dans les

tissus sains des patients CCR de génotype 2R/2R recevant du 5FU ne confère aucune

protection des cellules normales contre les dommages provoqués par cet antimétabolite à

cause d’une trop grande efficacité dans l’inhibition de la TS.


84

Le plus grand nombre de malades de notre population d’étude étaient de génotype 2R/2R ;

ceux-ci sont plus importants en nombre que les autres génotypes et d’après toutes ces

données, cela signifie que ces patients seraient de meilleurs candidats pour une réponse

optimale au 5FU, mais pourraient aussi être sujets à une toxicité plus importante que les

individus présentant les autres génotypes ; il serait donc intéressant de poursuivre cette étude

par l’analyse de la réponse à la chimiothérapie à base de 5FU de ces malades afin d’une part

de confirmer les résultats de ces différentes conclusions sur notre population, et d’autre part

afin de prévoir la réponse à cet anticancéreux et de prévenir les réactions de toxicité à cette

molécule.

Le second polymorphisme du gène TS exploré dans ce travail est celui relatif à la

délétion/insertion de 6pb dans la région 3’UTR de ce gène. Malgré le faible nombre

d’individus enrôlés dans cette étude pour l’exploration de ce polymorphisme, nos résultats

suggèrent qu’il existe un risque plus grand de CCR associé à l’insertion de 6pb « allèle 6pb »

(p=0.018). La même analyse a montré que les deux échantillons cas et témoins sont en

équilibre de Hardy-Weinberg.

Ce polymorphisme a été découvert lors d’une étude faite par (Ulrich et al, 2000). Dans cette

étude, il est suggéré que ce polymorphisme bien que siégeant dans la région 3’UTR non

codante du gène pourrait affecter la stabilité ou la structure secondaire de l’ARNm de la TS

régulant de ce fait le taux d’expression de cette enzyme. Dans notre étude, nous avons trouvé

que les individus porteurs de l’insertion 6pb avaient plus de risque de développer un CCR.

Etant donné les différentes preuves confortant l’hypothèse que la diminution de l’activité de la

TS aurait un impact sur le métabolismes des folates et par conséquent sur la réparation de

l’ADN, ce résultat suggère que l’insertion de 6pb serait corrélée à une plus faible expression

d’ARNm de la TS et que cette plus faible activité de la TS pourrait avoir un effet augmenté

sur la susceptibilité à développer le CCR via une déficience dans le métabolisme des folates.

Une autre explication serait qu’un manque de reserve en thymidine dû à la diminution du taux

de TS entrainerait la cellule sur une voie de cancérisation à cause de l’incorporation d’uracile

au lieu de la thymine dans la chaine d’ADN. Notre résultat est en accord avec d’autres études

qui ont retrouvé une association entre les génotypes 0pb/6pb et 6pb/6pb et le cancer de

l’œsophage d’une part mais aussi du poumon (Zhang et al, 2004 ; Shi et al, 2005).


85

Cependant , les conclusions de ces travaux et les notres sont en contradiction avec une analyse

de fonction sur la signification biologique de la délétion de 6pb dans la région 3’UTR de TS ;

en effet cette étude a montré que la délétion de 6pb se traduisait par une diminution d’environ

50% du taux d’ARNm de la TS par rapport à l’insertion de 6pb et que donc l’activité

enzymatique était tout aussi diminuée (Mandola et al, 2004).

D’autres études ont exploré cette éventuelle association avec le CCR mais n’ont aboutit à

aucun résultat probant (Ulrich et al, 2000 ; Ulrich et al, 2002 ; Chen et al, 2003). Ceci

signifirait que d’autres mécanismes sont impliqués dans cette voie oncogénique et que ceux-ci

restent encore à élucider.

Concernant ce polymorphisme délétion/insertion de 6pb, l’équipe de Lecomte retrouve aussi

une association entre un taux de survie plus important des individus CCR recevant du 5F en

chimiothérapie et l’insertion de 6pb, ce qui suggère selon les conclusions tirées de l’étude du

polymorphisme 2R>3R que cette insertion de 6pb diminuerait le taux d’expression de la

thymidine synthétase. Ceci serait en accord avec nos résultats concernant l’association de ce

polymorphisme et le CCR et contredit les conclusions de l’équipe de Lenz (Lenz et al, 1998).

Paradoxalement, un travail récent (Dotor et al, 2006) a démontré que la délétion de 6pb était

un facteur prédictif d’une meilleure réponse au 5FU et d’un taux de survie plus important

dans le CCR. Les individus porteurs de l’allèle 6pb dans notre échantillon de malades sont en

revanche plus importants que ceux porteurs de l’allèle insertion6pb ; en se basant sur ce

polymorphisme seul et selon cette étude nos patients auraient un taux de réponse au 5FU

moins élevé.

Ce travail que nous avons réalisé sur ce gène nous a permis d’évaluer les fréquences des deux

polymorphismes de la TS, les plus documentés, sur la population CCR Algérienne d’une part,

ce qui pourrait servir à définir les patients susceptibles de bénéficier correctement d’une

chimiothérapie à base de 5FU ; d’autre part sur la population contrôle ce qui nous a permis de

rapporter les fréquences de ces deux variants de la TS caractérisant la population Algérienne

et de les comparer à d’autres populations. Ces données pourraient servir pour d’autres études

cas/témoins sur d’autres pathologies cancéreuses.

Conclusion et perspectives

86

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La recherche de corrélations entre les polymorphismes des gènes du métabolisme et du

transport des xénobiotiques : GSTM1, GSTT1, GSTP1 « 313A>G » et « 341C>T », CYP3A5

6986A>G, MDR1 3435C>T, UGT1A1 « (TA)6>(TA)7 » et « -3156 G>A », TS « 2R>3R »

et TS « délétion/insertion de 6pb » et la survenue du CCR est un travail réalisé pour la

première fois sur la population Algérienne.

Ce travail nous a permis de montrer qu’il n’existait aucune relation d’association entre la

plupart de ces gènes et la survenue du CCR dans notre population en dehors du

polymorphisme « délétion/ insertion de 6pb » du gène TS.

En effet, dans notre population, les individus porteurs de l’insertion de 6pb « allèle 6pb »,

avaient un plus grand risque de développer un CCR que ceux porteurs de la délétion de 6pb

« allèle 0pb ».

Les résultats obtenus dans cette étude semblent exclure donc toute implication des autres

gènes du métabolisme des xénobiotiques explorés au cours de cette étude dans le

développement du CCR dans notre population. Cependant, afin de confirmer ces

observations, il est nécessaire d’élargir l’échantillon étudié pour certains de ces

polymorphismes comme les délétions des gènes GSTM1 et GSTT1, le polymorphisme de

répétition UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 et celui du gène TS « 2R>3R ».

La comparaison de la distribution des fréquences des différents polymorphismes étudiés avec

celle de populations d’origine ethniques différentes, nous a permis, d’une part de confronter

nos résultats car les associations peuvent varier suivant les populations et d’autre part de

contribuer à mettre à jour de nouveaux gènes de susceptibilité au CCR comme celui du gène

TS dans notre population.

Les différents gènes explorés au cours de ce travail codent pour des enzymes ayant une

fonction dans le métabolisme des xénobiotiques dont les substances carcinogènes présentes

dans l’alimentation, entre autres, mais aussi les molécules utilisées dans la chimiothérapie du

CCR comme le gène TS dans la réponse au 5FU, le gène UGT1A1 dans la toxicité à

Conclusion et perspectives

87

l’Irinotécan et le gène GSTP1 dans celle à l’Oxaliplatine. Pour cette raison, il serait

intéressant de compléter ce travail par différents volets importants :

Le premier que nous envisageons est une stratification des résultats en fonction du mode

d’alimentation et de l’exposition à d’autres facteurs favorisant le cancer comme le tabagisme.

En effet, les polymorphismes étudiés dans ce travail présentent de grandes variabilités

ethniques, et une corrélation avec ces variantes importantes dans le mode de vie serait plus

concluante pour la recherche de leurs éventuelles associations avec le risque du CCR

caractérisant notre population.

Le second volet que nous avons amorcé et que nous envisageons de poursuivre est le suivi de

la réponse à la chimiothérapie à base de 5FU, d’Irinotécan et d’Oxaliplatine des patients CCR

génotypés pour les gènes codant pour la TS, ou UGT1A1 ou encore les GST impliqués dans

la réponse et/ou la toxicité de ces molécules afin d’optimiser les dosages de ces différents

traitements et de prédire leurs éventuels effets toxiques.

Enfin, toutes les données obtenues dans cette étude sur la distribution des différents allèles de

chacun des gènes explorés dans notre population témoin, pourraient être mises à profit afin de

rechercher d’autres associations avec d’autres pathologies dans lesquelles ces gènes

interviennent.

Références bibliographiques

88

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ANNEXES

97

ANNEXES

LISTE DES FIGURES

- Figure 1: Représentation schématique du métabolisme des xénobiotiques.

- Figure 2: Métabolisme du 5-fluorouracile (5FU).

- Figure 3 : Métabolisme de l’Irinotécan

- Figure 4: Principe de la technique Taqman

- Figure 5 : Graphes représentant la fluorescence émise par chacun des génotypes

- Figure 6: Détection des SNPs et constitution d’un nuage de point de fluorescence

différent correspondant aux différents génotypes en fonction de l’hybridation des

sondes VIC ou FAM à chacun des allèles du polymorphisme recherché

- Figure 7: Profils d’amplification des gènes GSTM1, GSTT1 et de digestion

enzymatique par BsmA1 du gène GSTP1 exon 5

- Figure 8: Nuages de points représentant les individus de différents génotypes

- Figure 9: Distribution de la délétion homozygote de GSTM1 entre les patients CCR et

les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien

- Figure 10: Distribution de la fréquence de la délétion homozygote du gène GSTM1 de

la population de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations.

- Figure 11: Distribution de la délétion homozygote de GSTT1 entre les patients CCR et

les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien.

- Figure 12: Distribution de la fréquence de la délétion homozygote du gène GSTT1 de

la population de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations.

- Figure13: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 313A>G entre les patients

CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien.

- Figure 14: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 313A>G de la population de

l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations.

- Figure 15: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 341C>T entre les patients

CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien.

ANNEXES

98

- Figure 16: Distribution de la fréquence du SNP GSTP1 341C>T de la population de

l’Ouest Algérien comparée à celle de la population Caucasienne.

- Figure 17: Distribution de la fréquence du SNP MDR1 3435C>T entre les patients

CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien

- Figure 18: Distribution de la fréquence du SNP MDR1 3435C>T dans la population

de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations.

- Figure 19: Distribution de la fréquence du SNP 6986A>G du gène CYP3A5 entre les


- Figure 20: Distribution de la fréquence du SNP 6986A>G du gène CYP3A5 dans la


- Figure 21: Distribution de la fréquence du VNTR UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 entre les


- Figure 22: Distribution de la fréquence du SNP UGT1A1*28(TA)6>(TA)7 dans la

population de l’Ouest Algérien comparée à celle d’autres populations

- Figure 23: Distribution de la fréquence du SNP -3156 G>A du gène UGT1A1 entre

les patients CCR et les contrôles sur une population de l’Ouest Algérien.

- Figure 24: Distribution de la fréquence du SNP UGT1A1-3156G>A dans la


- Figure 25: Distribution de la fréquence du polymorphisme TS « 2R>3R » entre les


- Figure 26: Distribution de la fréquence du polymorphisme TS « 2R>3R » dans la


- Figure 27: Distribution de la fréquence du polymorphisme TS « del/ins6pb » entre les


- Figure 28 : Distribution de la fréquence du polymorphisme TS « del/ins 6pb » dans la


ANNEXES

99

LISTE DES TABLEAUX

- Tableau 1 : Principaux polymorphismes caractérisés pour les classes GST les plus

étudiées

- Tableau 2 : Séquences des amorces utilisées pour la PCR multiplex des gènes GSTT1,

GSTM1, et GSTP1 313A>G

- Tableau 3 : Séquences des amorces et des sondes Taqman utilisées pour l’analyse des

SNPs : GSTP1 341C>T, MDR1 3435C>T, CYP3A5 6986A>G et UGT1A1 -3156 G>A

- Tableau 3: Définition des différentes allèles de GSTP1 en fonction des deux SNPs

GSTP1 313A>G et GSTP1 341C>T

- Tableau 4 : Séquences des amorces utilisées pour l’analyse des polymorphismes

UGT1A1*28 (TA)6>(TA)7, TS5’ « 2R>3R » et TS3’ « délétion/insertion de 6pb »

- Tableau 5 : Distribution des fréquences génotypiques de GSTM1 et GSTT1 dans la


- Tableau 6 : Distribution des fréquences allèliques et haplotypiques de GSTP1 dans la


- Tableau 7: Distribution des fréquences allèliques et génotypiques du SNP MDR1

3435C>T, chez des patients atteints de CCR et une population contrôle de l’Ouest

Algérien

- Tableau 8: Distribution des fréquences allèliques et génotypiques du SNP 6986>G du

gène CYP3A5 chez des patients atteints de CCR et une population contrôle de l’Ouest

Algérien.

- Tableau 9: Distribution des fréquences allèliques, génotypiques et haplotypiques du

SNP -3156 G>A et du VNTR UGT1A1*28(TA)6> (TA)7 du gène UGT1A1 chez des

patients atteints de CCR et une population contrôle de l’Ouest Algérien.

- Tableau 10: Distribution des fréquences allèliques, génotypiques et haplotypiques des

polymorphismes TS « 2R>3R » et TS « del/ins6pb » chez des patients atteints de

CCR et une population contrôle de l’Ouest Algérien.

UJET DE LA THESE - univ-oran1.dz · 2019-01-21 · dans le processus de cancérisation autres que...

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