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8/16/2019 Tumor Wills

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263Diagnóstico molecular de trastornos mendelianos y complejos

© E

l s e v i e r . F o t o c o p i a r s i n a u t o r i z a

c i ó n e s u n d e l i t o .

DIAGNÓSTICO MOLECULARDE TRASTORNOS MENDELIANOSY COMPLEJOS

En la última década, son pocas las disciplinas en el estudiode la patología que hayan visto una oleada tan rápida tanto de«aportes» como de «demandas» comparable a la observada enel diagnóstico molecular. En la era anterior a la disponibilidadinmediata de los métodos de diagnóstico molecular, que hacíanque el diagnóstico de un trastorno genético dependiera de laidentificación de productos génicos anómalos (p. ej., hemoglo-bina mutante o metabolitos anómalos) o sus efectos clínicos,como el retraso mental (p. ej., en la FCU). El campo floreciente

del diagnóstico molecular nació en la segunda mitad del sigloXX

con la aplicación de procedimientos de bajo rendimiento, como larealización del cariotipo convencional para el reconocimiento delos trastornos citogenéticos (p. ej., síndrome de Down), y méto-dos basados en el ADN, como la inmunotransferencia Southernpara el diagnóstico de la enfermedad de Huntington. Desdeentonces, varios factores han permitido la rápida expansión deestos procedimientos, desde un terreno que rayaba lo esotéricoa una presencia prácticamente universal en los laboratorios deanatomía patológica tanto investigadores como comerciales (secalcula que, actualmente, el «mercado mundial» tiene un tamañode decenas de miles de millones de dólares). Estos factores han

sido: 1) la secuenciación del genoma humano y el depósito delos resultados en bases de datos de acceso público; 2) la dis-ponibilidad de muchas pruebas comerciales estandarizadas dereacción en cadena de la polimerasa (RCP) listas para usar yadaptadas a las necesidades del cliente para identificar trastornosgenéticos específicos; 3) la disponibilidad de micromatrices dealta resolución («microchips de ADN») que permiten analizartanto al ADN como al ARN en una escala pangenómica, utili-zando una plataforma simple, y, por último, 4) la aparición detecnologías de secuenciación automatizadas y de un rendimientoextremadamente alto, de última generación («NextGen»). Losdos últimos avances citados han sido especialmente útiles en elcontexto de nuevas investigaciones para aclarar la base genéticade los trastornos tanto mendelianos como complejos. Aunquequeda fuera del ámbito de esta obra ofrecer una descripción

detallada del diagnóstico molecular, en los párrafos siguientesse resaltan algunos de los abordajes mejor conocidos, con lasalvedad importante de que, sea cual sea la técnica utilizada,la aberración genética que se está investigando puede estaren la línea germinal (es decir, presente en todas y cada una de lascélulas de la persona afectada, como la mutación de CFTR en unpaciente con FQ) o en células somáticas (es decir, se limita a tiposde tejidos o lesiones específicos, como la amplificación NMYC enlas células del neuroblastoma). Esta consideración determinarála naturaleza de la muestra (p. ej., linfocitos de sangre periférica[LSP], saliva o tejido tumoral) necesaria para el procedimiento.

Diagnóstico molecular de las anomalíasdel número de copias

Como ya hemos comentado en este capítulo, hay varias enfermeda-des que pueden aparecer como consecuencia de las anomalías delnúmero de copias, en todo el cromosoma (trisomía 21), en segmen-tos cromosómicos (síndrome de deleción 22q11) o como delecionesintragénicas submicroscópicas (síndrome WAGR). El análisis delcariotipo en los cromosomas mediante las bandas G sigue siendo elprocedimiento clásico para identificar variaciones en el cromosoma.Sin embargo, como cabría esperar, la resolución con esta técnicaes bastante baja. Para identificar alteraciones subcromosómicas seha extendido el uso de otros métodos centrados en el análisis deregiones cromosómicas mediante FISH y en procedimientos pange-nómicos como la hibridación genómica comparativa (HGC).

Figura 6-36 A. Se muestra un tumor de Wilms, con células azules bien compactas compatibles con el componente del blastema y túbulos primitivos entremez-clados, que representan el componente epitelial. Aunque se ven muchos focos de figuras mitóticas, en este campo ninguna de ellas es atípica. B. En este tumorde Wilms se detectaron focos de anaplasia focal en otras áreas, caracterizados por células con núcleos hipercromáticos y pleomorfos con mitosis anómalas.

síndrome con tumor de Wilms, aniridia, anomalías genitalesy retraso mental.

-nitales y retraso mental y el síndrome de Denys-Drash seasocian a la inactivación de WT1, mientras que el síndromede Beckwith-Wiedemann es secundario a anomalías de laimpronta genómica en el locus WT2 que afectan principal-mente al gen IGF2.

-sisten en elementos del blastema (células azules pequeñasy redondas), así como epiteliales y estromales.

de Wilms.



CAP Í TU LO 6264 Enfermedades genéticas y pediátricas

Hibridación in situ fuorescente (FISH)

La técnica de FISH utiliza sondas de ADN que reconocen se-cuencias específicas de regiones cromosómicas de un tamañosuperior a 100 kilobases (kb), lo que define el límite de reso-lución de esta técnica para identificar cambios cromosómicos.Estas sondas se marcan con colorantes fluorescentes y se aplican

a extensiones en metafase o núcleos en interfase. La sonda seune a su secuencia complementaria en el cromosoma y, de estamanera, marca la región cromosómica específica que puede servisualizada mediante microscopia de fluorescencia. La capaci-dad de la FISH de sortear la necesidad de células en divisiónes de gran valía cuando se requiere un diagnóstico rápido(p. ej., en un bebé gravemente enfermo en el que se sospecha untrastorno genético subyacente). Este análisis puede realizarse enmuestras prenatales (p. ej., células obtenidas por amniocentesis,biopsia de vellosidades coriónicas o sangre de cordón umbilical),con LSP e incluso con cortes de tejido de archivo. La FISH se haempleado para la detección de una serie de anomalías cromo-sómicas (aneuploidías) (fig. 6-37, A); para la demostración demicrodeleciones sutiles (fig. 6-37, B) o para translocaciones com-plejas no detectables por las técnicas habituales de realizacióndel cariotipo; para el análisis de amplificación génica (p. ej., am-

plificación NMYC en neuroblastomas), y para el cartografiadode genes de interés por su localización cromosómica.

Hibridación genómica basada en matrices

A partir de lo descrito antes, parece claro que la FISH precisa unconocimiento previo de una o de algunas regiones cromosómicasespecíficas de las que se sospecha que están alteradas en la mues-tra-problema. Sin embargo, las anomalías cromosómicas tambiénpueden detectarse sin que previamente se sepa qué aberraciónpuede haber mediante el uso de una estrategia global conocidacomo HGC basada en matrices. En la HGC, el ADN problema yun ADN de referencia (normal) son marcados con dos coloran-tes fluorescentes diferentes (con mayor frecuencia, Cy5 y Cy3,con fluorescencia roja y verde, respectivamente). A continuación,

las muestras que se han marcado de forma diferenciada se hi-bridan con una serie de segmentos de ADN genómico «moteado»sobre una matriz sólida, normalmente un portaobjetos de vidrio(fig. 6-38, A). Esos segmentos de ADN son representaciones delgenoma humano a intervalos regulares, y en ellas están incluidoslos 22 autosomas y los cromosomas sexuales (v. fig. 6-38, A). Las

amplificaciones y deleciones que haya en la muestra en estudioproducen un aumento o una disminución de la señal en relacióncon el ADN normal que se puede detectar hasta una resoluciónde 10 kb (fig. 6-38, B). Las generaciones más modernas de micro-matrices que utilizan SNP (v. a continuación) proporcionan unaresolución aún mayor (con más de 1 millón de SNP del genomahumano en una sola micromatriz). Actualmente, se utilizanpara identificar anomalías del número de copias en diversasenfermedades, desde el cáncer al autismo.

Detección directa de las mutacionesdel ADN mediante análisis de la reacciónen cadena de la polimerasa (RCP)

En la actualidad, la RCP, que implica la amplificación expo-

nencial del ADN, se emplea ampliamente para el diagnósticomolecular. Si se utiliza como sustrato el ARN, primero se realizauna transcripción inversa (RT, del inglés reverse transcription)para obtener ADNc y, posteriormente, amplificarlo por RCP.Este método que implica la RT con frecuencia se abrevia comoRT-RCP. Un requisito previo para la detección directa es que sedebe conocer la secuencia de un gen normal. Para identificar elgen mutado, se designan dos cebadores (primers) que se unena los extremos 3’ y 5’ de la secuencia normal. Utilizando poli-merasas adecuadas de ADN y termociclado, el ADN diana seamplifica en gran cantidad y produce millones de copias de lasecuencia de ADN entre las dos localizaciones de los cebadores.La identificación ulterior de una secuencia anómala puede rea-lizarse por diversas vías:

Figura 6-37 Hibridación in situ fluores-cente (FISH). A. Núcleo en interfase deun varón con sospecha de trisomía 18.Se han utilizado tres sondas fluorescen-tes distintas en el «cóctel de FISH»; lasonda verde híbrida con el centrómerodel cromosoma X (una copia), la sondaroja con el centrómero del cromosoma Y(una copia) y la sonda agua (azul) con elcentrómero del cromosoma 18 (trescopias). B. Extensión de una metafase enla que se ha utilizado dos sondas fluores-

centes, una con hibridación con la regióncromosómica 22q13 (verde) y la otra conhibridación con la región cromosómica22q11.2 (rojo). Hay dos señales 22q13.Uno de los dos cromosomas no se tiñecon la sonda para la región 22q11.2, loque indica una microdeleción en estaregión. Esta anomalía origina el síndromede eliminación 22q11.2 (síndrome deDiGeorge).(Por cortesía de la Dra. Nancy R. Schneider y JeffDoolittle, Cytogenetics Laboratory, University of TexasSouthwestern Medical Center, Dallas, Texas.)

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