Technische aspecten van Niet-Invasieve Prenatale Testen (NIPT)

Dr Brigitte Faas

Laboratorium specialist Klinische Genetica

SPN, bijscholing counseling NIPT

Circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) afkomstig van apoptotische cytotrophoblast cellen Fragmenteerd Aanwezig vanaf week 5 van zwangerschap 5-15% van het ccfDNA in het maternale plasma is

van foetale origine

1997: Lo et al.: Free fetal DNA in the maternal plasma/serum (Lancet 1997;350:485-487)

Introductie

Trisomie 21

sample % foetaal DNA chr 21 (%) chr 21 (-voud)

vlok 100% 50% 1.5

maternale plasma ~10% 5% 1.05

maternale plasma 4% 2% 1.02

Lo LYM, Chiu RWK. Nat Rev Genet, 2007;8:71-77.

Introductie

een techniek om subtiele verschillen aan te tonen en / of een techniek om de regio van interesse te verrijken

Miljoenen tot biljoenen baseparen sequencen per run Door gebruik te maken van patient-specifieke barcodes is parallel sequencen

van meerdere patiënten simultaan in 1 run mogelijk

Massively Parallel Sequencing (MPS)

Next Generation Sequencing (NGS)

Introductie

PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63.

PNAS, 2008 Oct 21;105(42):16266-71.

Introductie

Chiu et al., PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63

Introductie

Targeted approach Whole genome approach

http://www.illinoisgenetics.org/web/wp-content/uploads/2013/02/Grobman-Non-invasive-prenatal-testing-update.pdf

Verschil aantonen tussen ~1.32% en~1.27%

Sequence reads = X Sequence reads = 10X Sequence reads = 100X

Introductie

Bepalen of er van een chromosoom meer (of minder) materiaal aanwezig is, ten opzichte van een referentie set van normale individuen / plasma’s

Z-score (Chiu et al., 2008) Normalized Chromosome Value (Sehnert et al., 2011) student’s t -test-based (Jiang et al., 2012) WISECONDOR (Straver et al., 2013) .....

triploidie en gebalanceerde rearrangements worden niet gedetecteerd!

WIthin-SamplE COpy Number aberration DetectOR

Trisomie 21

T21 T18 T13 anders normaal 28 3x11+ 5x 12+ 7x13+ 1x14+ 4x15+ 1x18+ 1x20+ 1x21+ 1x22+ 4 onbekend

7 2x12+ 2x13+ 1x20+ 2x21+

4 +1 1x11+ 1x12+ 2x19+

12 307

Totaal

359

Alleen afwijkingen >20 Mb: geen vals-positieven / negatieven

Nijmegen

N N T21 Sensitivity Specificity

Chiu 2011 232 86 100% 97,9%

Ehrich 2011 449 39 100% 99,8%

Palomaki 2011 1683 212 98,6% 99,8%

Sehnert 2011 47 13 100% 100%

Ashoor 2012 397 50 100% 100%

Bianchi 2012 493 89 100% 100%

Lau 2012 108 11 100% 100%

Norton 2012 3080 81 100% 99,97%

Sparks 2012 167 36 100% 100%

Jiang 2012 903 16 100% 100%

Liang 2013 412 40 100% 100%

Nicolaides 2013 242 25 100% 100%

High risk population

T13, T18 en geslachtschromosomen: lager dan T21, afhankelijk van techniek, maar wel zeer hoog

Sensitiviteit: T13: 92% T18: 97% T21: 99%

Binnenkomst materiaal

Afdraaien plasma scheiden van buffy coat

DNA isolatie

Library prep

ePCR en starten NGS machine (5500xl)

Runnen NGS machine

Data analyse en interpretatie

Week 1, ma / di:

Week 1, di / woe:

Week 1, do / vrij

Week 2, ma /di

t/m week 3, woe

Week 3, do / vrij

uitslag Uiterlijk week 4, ma

Flow Nijmegen

Tip van Flip! 10 ml EDTA buis, vol, let op positie sticker!!

X X X X

Binnenkomst materiaal

Afdraaien plasma scheiden van buffy coat

DNA isolatie

Library prep

ePCR en starten NGS machine (5500xl)

Runnen NGS machine

Data analyse en interpretatie

Week 1, ma / di:

Week 1, di / woe:

Week 1, do / vrij

Week 2, ma /di

t/m week 3, woe

Week 3, do / vrij

uitslag Uiterlijk week 4, ma

Flow Nijmegen

3 wkn

Foetale fractie

Literatuur: 4% Zeer lage concentraties DNA “homeopathische bepaling”? Betrouwbaarheid?? Op welk moment in het proces meten?? Test??

•Methylatie? •SRY? •Sequentie data (SNP?)

>22.000 zwangerschappen eenling minimaal 10 wkn zw schapsduur

“The vast majority of clinical maternal plasma samples greater than 10 weeks gestational age contain an adequate fetal cfDNA proportion to allow for useful clinical results.”

Prenatal Diagnosis 2013, 33, 569–574

Totaal: 6123 Gemiddelde TAT: 5.1 werkdagen Geen uitslag voor 1 chromosoom: 2.8% Onduidelijk discordant (FPR): 0.2% Fout negatief: 0.08%

Gecanceled: 149 Technische redenen: 43 (0.7%) Administratieve redenen: 106 (1.7%)

Mogelijke oorzaken voor discrepanties: Technisch (waaronder lage foetale fractie) Confined Placental Mosaicism Maternale deletie of duplicatie Maternaal of foetaal mozaiek Vanishing twin Maternale maligniteit Maternale geslachtschromosomale afwijking

Discrepante bevindingen

Technisch

NIPT 16.4 wkn verhoogd risico op T13 (84%) 18 wkn: Geen echo-afwijkingen Invasieve procedure

Vruchtwater normaal in 50 metafasen

Herhaalde NIPT in eigen lab (bloed afgenomen bij 18 wkn) Geen aanwijzing voor T13

Kindje is geboren: placenta laat geen tekenen van T13 zien

Discrepante bevindingen

Choi et al., Prenat Diagn 2013,33,198-200 NIPT (NIFTY) trisomy 22 (duplicate measurement at two gestational ages) Normal fetus and child placental trisomy 22 disomy 22 in umbilical cord blood

Mennuti et al., AJOG 2013 Case 7: NIPT trisomy 13 CVS sampling FISH T13 termination of pregnancy culture 46,XY SNP array normal male profile Case 8: NIPT trisomy 13 CVS sampling direct preparation 46,XX,+13,der(13;13)(q10;q10) long term culture 46,XX Amniocentesis 46,XX No US anomalies (child not yet born)

Placenta mozaicisme

Lau et al., Prenat Diagn 2013, 33, 1–7 49,XXX, +7, +21 Trisomy 16 Pan et al., Prenat Diagn 2013 Jun;33(6):598-601 47,XX,+21 and UPD21 in fetus

Discrepante bevindingen

Maternale maligniteit

Osborne et al., Prenat Diagn 2013,33(6),609–611 NIPT (duplo metingen) trisomie 13 (NCV 10.9) monosomie 18? (NCV -10.7)

vruchtwater 46,XY en normaal array profiel Postnatale analyse van placenta biopten normaal

Maternale tumor met cytogenetisch numerieke afwijkingen van zowel #13 als #18

Discrepante bevindingen

Maternale geslachtschromosomale afwijkingen

Yao et al., Pren Diagn 2012,32(11),1114–1116 Maternale 47,XXX

Lau et al., Prenat Diagn 2013, 33,1–7 Maternale 45,X /46,XX Searle et al., Prenat Diagn 2013,33(6),612–613 Maternale deletie op X en maternale SRY

Discrepante bevindingen

Alle academische centra Whole genome approach Verschillende platforms en analyse methoden in Nederland Geen bepaling foetale fractie Uitslagtermijn Nijmegen 3 wkn (mits op maandag of dinsdag aangeleverd) Rapportage over chromosomen 13, 18 en 21, evt “toevalsbevindingen” op andere chromosomen zullen gemeld worden Geen rapportage over geslacht of geslachtschromosomale afwijkingen Uitslag: SMS indien normaal en indien afwijkend: via gynaecoloog > BMI is geen exclusie criterium, wel onderdeel van de studie, dus BMI gegevens zijn noodzakelijk Bevestiging: vruchtwater

Concluderend….