Technische aspecten van Niet-Invasieve Prenatale Testen (NIPT)
Dr Brigitte Faas
Laboratorium specialist Klinische Genetica
SPN, bijscholing counseling NIPT
Circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) afkomstig van apoptotische cytotrophoblast cellen Fragmenteerd Aanwezig vanaf week 5 van zwangerschap 5-15% van het ccfDNA in het maternale plasma is
van foetale origine
1997: Lo et al.: Free fetal DNA in the maternal plasma/serum (Lancet 1997;350:485-487)
Introductie
Trisomie 21
sample % foetaal DNA chr 21 (%) chr 21 (-voud)
vlok 100% 50% 1.5
maternale plasma ~10% 5% 1.05
maternale plasma 4% 2% 1.02
Lo LYM, Chiu RWK. Nat Rev Genet, 2007;8:71-77.
Introductie
een techniek om subtiele verschillen aan te tonen en / of een techniek om de regio van interesse te verrijken
Miljoenen tot biljoenen baseparen sequencen per run Door gebruik te maken van patient-specifieke barcodes is parallel sequencen
van meerdere patiënten simultaan in 1 run mogelijk
Massively Parallel Sequencing (MPS)
Next Generation Sequencing (NGS)
Introductie
PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63.
PNAS, 2008 Oct 21;105(42):16266-71.
Introductie
Chiu et al., PNAS, 2008 Dec 23;105(51):20458-63
Introductie
Targeted approach Whole genome approach
http://www.illinoisgenetics.org/web/wp-content/uploads/2013/02/Grobman-Non-invasive-prenatal-testing-update.pdf
Verschil aantonen tussen ~1.32% en~1.27%
Sequence reads = X Sequence reads = 10X Sequence reads = 100X
Introductie
Bepalen of er van een chromosoom meer (of minder) materiaal aanwezig is, ten opzichte van een referentie set van normale individuen / plasma’s
Z-score (Chiu et al., 2008) Normalized Chromosome Value (Sehnert et al., 2011) student’s t -test-based (Jiang et al., 2012) WISECONDOR (Straver et al., 2013) .....
triploidie en gebalanceerde rearrangements worden niet gedetecteerd!
WIthin-SamplE COpy Number aberration DetectOR
Trisomie 21
T21 T18 T13 anders normaal 28 3x11+ 5x 12+ 7x13+ 1x14+ 4x15+ 1x18+ 1x20+ 1x21+ 1x22+ 4 onbekend
7 2x12+ 2x13+ 1x20+ 2x21+
4 +1 1x11+ 1x12+ 2x19+
12 307
Totaal
359
Alleen afwijkingen >20 Mb: geen vals-positieven / negatieven
Nijmegen
N N T21 Sensitivity Specificity
Chiu 2011 232 86 100% 97,9%
Ehrich 2011 449 39 100% 99,8%
Palomaki 2011 1683 212 98,6% 99,8%
Sehnert 2011 47 13 100% 100%
Ashoor 2012 397 50 100% 100%
Bianchi 2012 493 89 100% 100%
Lau 2012 108 11 100% 100%
Norton 2012 3080 81 100% 99,97%
Sparks 2012 167 36 100% 100%
Jiang 2012 903 16 100% 100%
Liang 2013 412 40 100% 100%
Nicolaides 2013 242 25 100% 100%
High risk population
T13, T18 en geslachtschromosomen: lager dan T21, afhankelijk van techniek, maar wel zeer hoog
Sensitiviteit: T13: 92% T18: 97% T21: 99%
Binnenkomst materiaal
Afdraaien plasma scheiden van buffy coat
DNA isolatie
Library prep
ePCR en starten NGS machine (5500xl)
Runnen NGS machine
Data analyse en interpretatie
Week 1, ma / di:
Week 1, di / woe:
Week 1, do / vrij
Week 2, ma /di
t/m week 3, woe
Week 3, do / vrij
uitslag Uiterlijk week 4, ma
Flow Nijmegen
Tip van Flip! 10 ml EDTA buis, vol, let op positie sticker!!
X X X X
Binnenkomst materiaal
Afdraaien plasma scheiden van buffy coat
DNA isolatie
Library prep
ePCR en starten NGS machine (5500xl)
Runnen NGS machine
Data analyse en interpretatie
Week 1, ma / di:
Week 1, di / woe:
Week 1, do / vrij
Week 2, ma /di
t/m week 3, woe
Week 3, do / vrij
uitslag Uiterlijk week 4, ma
Flow Nijmegen
3 wkn
Foetale fractie
Literatuur: 4% Zeer lage concentraties DNA “homeopathische bepaling”? Betrouwbaarheid?? Op welk moment in het proces meten?? Test??
•Methylatie? •SRY? •Sequentie data (SNP?)
>22.000 zwangerschappen eenling minimaal 10 wkn zw schapsduur
“The vast majority of clinical maternal plasma samples greater than 10 weeks gestational age contain an adequate fetal cfDNA proportion to allow for useful clinical results.”
Prenatal Diagnosis 2013, 33, 569–574
Totaal: 6123 Gemiddelde TAT: 5.1 werkdagen Geen uitslag voor 1 chromosoom: 2.8% Onduidelijk discordant (FPR): 0.2% Fout negatief: 0.08%
Gecanceled: 149 Technische redenen: 43 (0.7%) Administratieve redenen: 106 (1.7%)
Mogelijke oorzaken voor discrepanties: Technisch (waaronder lage foetale fractie) Confined Placental Mosaicism Maternale deletie of duplicatie Maternaal of foetaal mozaiek Vanishing twin Maternale maligniteit Maternale geslachtschromosomale afwijking
Discrepante bevindingen
Technisch
NIPT 16.4 wkn verhoogd risico op T13 (84%) 18 wkn: Geen echo-afwijkingen Invasieve procedure
Vruchtwater normaal in 50 metafasen
Herhaalde NIPT in eigen lab (bloed afgenomen bij 18 wkn) Geen aanwijzing voor T13
Kindje is geboren: placenta laat geen tekenen van T13 zien
Discrepante bevindingen
Choi et al., Prenat Diagn 2013,33,198-200 NIPT (NIFTY) trisomy 22 (duplicate measurement at two gestational ages) Normal fetus and child placental trisomy 22 disomy 22 in umbilical cord blood
Mennuti et al., AJOG 2013 Case 7: NIPT trisomy 13 CVS sampling FISH T13 termination of pregnancy culture 46,XY SNP array normal male profile Case 8: NIPT trisomy 13 CVS sampling direct preparation 46,XX,+13,der(13;13)(q10;q10) long term culture 46,XX Amniocentesis 46,XX No US anomalies (child not yet born)
Placenta mozaicisme
Lau et al., Prenat Diagn 2013, 33, 1–7 49,XXX, +7, +21 Trisomy 16 Pan et al., Prenat Diagn 2013 Jun;33(6):598-601 47,XX,+21 and UPD21 in fetus
Discrepante bevindingen
Maternale maligniteit
Osborne et al., Prenat Diagn 2013,33(6),609–611 NIPT (duplo metingen) trisomie 13 (NCV 10.9) monosomie 18? (NCV -10.7)
vruchtwater 46,XY en normaal array profiel Postnatale analyse van placenta biopten normaal
Maternale tumor met cytogenetisch numerieke afwijkingen van zowel #13 als #18
Discrepante bevindingen
Maternale geslachtschromosomale afwijkingen
Yao et al., Pren Diagn 2012,32(11),1114–1116 Maternale 47,XXX
Lau et al., Prenat Diagn 2013, 33,1–7 Maternale 45,X /46,XX Searle et al., Prenat Diagn 2013,33(6),612–613 Maternale deletie op X en maternale SRY
Discrepante bevindingen
Alle academische centra Whole genome approach Verschillende platforms en analyse methoden in Nederland Geen bepaling foetale fractie Uitslagtermijn Nijmegen 3 wkn (mits op maandag of dinsdag aangeleverd) Rapportage over chromosomen 13, 18 en 21, evt “toevalsbevindingen” op andere chromosomen zullen gemeld worden Geen rapportage over geslacht of geslachtschromosomale afwijkingen Uitslag: SMS indien normaal en indien afwijkend: via gynaecoloog > BMI is geen exclusie criterium, wel onderdeel van de studie, dus BMI gegevens zijn noodzakelijk Bevestiging: vruchtwater
Concluderend….
Top Related