1

S A M E N V A T T I N G Een cel is de kleinste, georganiseerde levende eenheid binnen een organisme, die met een eigen metabolisme min of meer onafhankelijk kan bestaan en in staat is tot beweging, groei en celdeling. Een cel bestaat uit honderden verschillende onderdelen en 'subsystemen', en in de celkern is het genoom opgeslagen; een molecuul opgebouwd als een dubbele helix met miljarden basenparen, waarin de informatie opgeslagen zit voor alle functies die een cel (afhankelijk van het type) kan uitvoeren. Deze expressie van genen gebeurt met behulp van RNA-polymerase, een eiwitcomplex dat het DNA (staand voor desoxyribonucleic acid) afleest en een RNA-streng maakt, waarna het ribosoom het RNA kan aflezen en er een eiwit uit kan produceren. De stap van DNA naar RNA heet transcriptie, van RNA naar eiwit translatie. Niet alle eiwitten die de cel kan maken met behulp van het DNA zijn tegelijkertijd nodig, afhankelijk van het celtype zijn er een hoop eiwitten overbodig. Het proces dat regelt welke eiwitten wel en niet aanwezig zijn en geproduceerd worden, noemt men genregulatie. Tot op 5 jaar geleden dacht men dat hier voornamelijk eiwitten bij betrokken waren, de zogeheten activators en promoters, die het RNA-polymerase helpen bij transcriptie, of juist blokkeren. Deze eiwitten worden ook wel transcriptiefactoren genoemd. Er zijn meerdere manieren om genexpressie te reguleren, maar ingrijpen bij de transcriptie is de meest voorkomende. Echter, bij de laatste jaren zijn er interessante ontwikkelingen geweest in de moleculaire biologie, men heeft ontdekt dat bij dit proces van genregulatie nog andere transcriptiefactoren actief zijn, de zogeheten microRNA's (kort miRNA's). Het proces waarbij miRNA's invloed uitoefenen op de genregulatie noemt met RNA interference. miRNA's bevinden zich zowel in de intronen als in de exonen van de genen, en worden op een iets andere manier dan RNA verwerkt na transcriptie. Het miRNA kan op een aantal manieren invloed uitoefenen op de genregulatie, o.a. door als repressor te fungeren bij de transcriptie, maar hoofdzakelijk door uitschakeling van het mRNA (post-transcriptief). Welke rollen miRNA nog meer vervult binnen de cel wordt tegenwoordig op grote schaal onderzoek naar gedaan, maar is nog niet heel veel over bekend. Het lijkt erop dat miRNA naast de regulerende functie ook van belang kan zijn bij bestrijden van virussen binnen de cel, en bij transposons (verspringende genen). Wellicht kan miRNA in de toekomst worden ingezet als medicijn tegen virussen zoals HIV, dit is echter nog lang niet bewerkstelligd. Uit onderzoek blijkt dat de expressie (o.a. van miRNA's, maar ook van andere genen) van groot belang kan zijn bij de evolutie van een soort. Mensen en apen hebben bijvoorbeeld voor 98% hetzelfde DNA, maar zijn toch zijn de verschillen significant. Er zijn verscheidene onderzoeken waaruit blijkt dat de snelle evolutie van de mens de

2

afgelopen 5 miljoen jaar toe te dichten is aan genregulatie. Echter nog lang niet alle miRNA’s zijn in kaart gebracht, zowel wat betreft aantal als functies die ze vervullen. Een model voor het ontstaan van miRNA’s in planten is dat miRNA’s wellicht gevormd kunnen worden door geinverteerde transpositie van hun toekomstige doelgenen. In dieren hebben de mRNA’s echter veel meer plekken waar meerdere verschillende miRNA’s op kunnen binden, het ontstaan van de eerste miRNA’s in dieren wordt dan ook toegedicht aan mutaties in de intronen. Ook met behulp van miRNA’s kun je terugkijken in de tijd, naar de evolutie van een soort. Zo blijkt bijvoorbeeld dat vrijwel alle menselijke miRNA’s worden terug-gevonden in o.a. de muis, de rat, de chimpansee, verscheidene vissen en de kikker. Net als genen kunnen miRNA’s ook in clusters thuis-horen, zo zitten in de Hox-clusters (Hox-genen zijn belangrijke sturende genen die hele grote groepen andere genen aansturen) ook hele groepen van miRNA’s. Door mutaties in deze groepen te bekijken kun je een evolutionaire boom opstellen. Op de Universiteit Twente wordt op dit moment nog geen onderzoek gedaan naar miRNA’s, maar dat staat wel op de agenda, vooral met betrekking tot de rol van miRNA’s in de mate van pluripotentie en self-renewal van embryonale stamcellen. Hier zijn onderzoeksvoor-stellen voor geschreven, maar deze zijn nog niet uitgevoerd. Het uiteindelijke doel dat de UT hiermee voor ogen heeft is meer inzicht krijgen in (embryonale) stamcellen, om zo ziektes te genezen of weefsels te repareren die een mens zelf niet repareren kan. Dit is echter nog toekomstmuziek.

T E K S T V E R D E L I N G Gerwin Ruiterkamp Hoofdstuk 2. Evert Schippers Inleiding, Hoofdstuk 4, Conclusie. Roelfina Visser Hoofdstuk 1 (minus paragraaf ‘Genregulatie’) Nienke Vlutters Hoofdstuk 3 Pieter van Wijngaarden Samenvatting, paragraaf ‘Genregulatie’ (H1), Hoofdstuk 5.

3

I N H O U D S O P G A V E 0. INLEIDING ............................................................................................................................................ 4 1. CELBIOLOGIE EN GENREGULATIE ............................................................................................ 5

DE CEL ..................................................................................................................................................... 5 DNA......................................................................................................................................................... 7

DNA in Eukaryoten ............................................................................................................................ 8 DNA in Prokaryoten........................................................................................................................... 8 DNA in Virussen en viroïden.............................................................................................................. 8 RNA..................................................................................................................................................... 9 Verschillen tussen DNA en RNA ........................................................................................................ 9

TRANSCRIPTIE ........................................................................................................................................ 10 TRANSLATIE........................................................................................................................................... 10 GENREGULATIE...................................................................................................................................... 11 CONCLUSIE............................................................................................................................................. 14

2. MICRORNA......................................................................................................................................... 15 INTRODUCTIE ......................................................................................................................................... 15 PRODUCTIE VAN MIRNA ....................................................................................................................... 15

Transcriptie van pri-miRNA............................................................................................................. 15 Via pre-miRNA naar dubbelstreng miRNA [13] ............................................................................. 16 Naar functionele miRNA’s ............................................................................................................... 17 Het belang van Dicer ....................................................................................................................... 17

FUNCTIES VAN MIRNA .......................................................................................................................... 18 Uitschakeling mRNA ........................................................................................................................ 18 Verhindering van translatie ............................................................................................................. 18 Verhindering van transcriptie .......................................................................................................... 19

ROL VAN MIRNA ................................................................................................................................... 20 Regulering ........................................................................................................................................ 20 Bescherming ..................................................................................................................................... 20 Onderzoek [11]................................................................................................................................. 21

3. GENEXPRESSIE EN EVOLUTIE.................................................................................................... 22 De rol van genregulatie.................................................................................................................... 22 Onderzoek naar mensen en apen ..................................................................................................... 23 Evolutie van de moderne mens......................................................................................................... 26

4. OORSPRONG EN EVOLUTIE [25] ................................................................................................. 28 EVOLUTIE AAN DE HAND VAN MIRNA CLUSTERS ................................................................................. 29 EVOLUTIE VAN MIRNA BINNEN HET HOX-CLUSTER [28]...................................................................... 30

Conclusie .......................................................................................................................................... 32 5. RNAI ONDERZOEK AAN DE UT ................................................................................................... 33

ONDERZOEKSFOCUS VAN DE UT ........................................................................................................... 33 ONDERZOEKSMETHODEN....................................................................................................................... 34

Western Blot [] ................................................................................................................................. 34 DOELSTELLINGEN VAN DEZE ONDERZOEKEN ........................................................................................ 35

6. CONCLUSIE........................................................................................................................................ 36

4

0 . I N L E I D I N G “Challenging the dogma” is de titel van een van gelezen artikelen die als bron dienen voor dit verslag. Ook achter dit verslag is een dergelijk thema terug te vinden, daar zogenaamde microRNA’s een nieuw dogma inluiden op het gebied van genetica. Sinds de ont-dekking van de DNA structuur is bekend dat dit desoxyribonucleaire zuur de drager is van erfelijke informatie. Ook was alom erkend dat deze informatie zich uitte doordat DNA codeerde voor de productie van een scala aan eiwitten waaruit een organisme zich kon op-bouwen. Dit ‘dogma’ wordt bondig gevat in het hoofdstuk 1. Er blijkt echter meer te zijn. RNA, met slechts een boodschapper-rol in het oude denken, blijkt meer zoden aan de dijk te zetten. In het dogma draagt RNA de bouwtekening voor een eiwit van het DNA over naar de ribosomen, waar de bouw van het eiwit begint. Ook RNA zelf blijkt nu taken te kunnen vervullen, net als eiwitten. Kleine RNA ketens kunnen zelfs hun boodschappende soortgenoten onderschep-pen en zo verhinderen dat zij hun doel, het doen ontstaan van een eiwit, bereiken. Meer over deze RNA interferentie door deze micro-RNA’s komt aan bod in hoofdstuk 2: wat het zijn, waar ze vandaan komen en hoe ze werken. Aangezien miRNA’s een belangrijke rol lijken te vervullen op het gebied van genexpressie en genregulatie, wordt in hoofdstuk 3 inge-gaan op de invloed van genregulatie in de evolutie. De evolutie van de mate waarin en wanneer genen tot expressie komen in de levensloop van een organisme lijkt minstens even belangrijk te zijn als de evolutie van de genen zelf. Identieke microRNA’s worden teruggevonden in het genoom van vele verschillende organismen. De mate van overeenkomst van miRNA’s in bijvoorbeeld mensen en zebravissen laat zien dat de miRNA’s een belangrijke rol vervullen en evolutionair de tand des tijd kunnen doorstaan. In hoofdstuk 4 wordt gekeken naar de oorsprong van de eerste vormen van miRNA, hun evolutie en hoe verschillen in het miRNA van hedendaagse organismen gebruikt kan worden voor het opstellen van een evolutionaire boom. Ter afsluiting is ook een kort hoofdstuk gewijd aan enig onderzoek dat hier aan de UT gaat plaatsvinden. De invloed die bepaalde miRNA’s hebben op differentiëren (of juist niet differentiëren) van een stamcel zal worden onderzocht.

5

1 . C E L B I O L O G I E E N G E N R E G U L A T I E Het onderwerp van dit verslag is de microRNA’s. Er is een recente ontdekking gedaan in de genetica op het gebied van eiwitsynthese. Om deze nieuwe ontwikkeling in het juiste daglicht te kunnen zien is het van belang om te weten hoe men tot het begin van de 21e eeuw dacht over genetica en eiwitsynthese. Dit dogma, dat al eerder in de inleiding werd genoemd, wordt beschreven in dit hoofdstuk. Het hoofdstuk bestaat uit twee delen. Allereerst een gedeelte over DNA: hoe codeert DNA voor eiwitten en hoe werkt dat? In deel twee wordt verder ingegaan op hoe de uiting van genen wordt gereguleerd, ofwel genregulatie. Over miRNA zal uitgebreid in worden gegaan in hoofdstuk 2 en zal hier verder buiten beschouwing blijven.

D E C E L

De cel is de kleinste eenheid, waaruit alle organismen of levende wezens met een eigen metabolisme zijn opgebouwd. In meercellige organismen zijn verschillende celtypen verenigd in weefsels en organen. Een cel kan worden gedefinieerd als: “de kleinste, georganiseerde levende eenheid binnen een organisme, die dankzij een ingewikkeld metabolisme min of meer onafhankelijk kan bestaan in een fysiologische omgeving en die in staat is tot beweging, groei en deling door mitose”. [1] Verschillende celtypen kunnen samen als bouwstenen van een weefsel fungeren. In het menselijk lichaam bevinden zich meer dan tweehonderd celtypen waarbij sommige cellen een leeftijd behalen van enkele dagen en andere cellen net zolang leven als het organisme. De cellen kunnen vervangen worden en zijn ook voortdurend bezig met het vervangen van hun organellen en opbouwende bestanddelen, de eiwitten, lipiden en koolhydraten en combinaties van deze moleculen. De synthese van eiwitten en enzymen die hiervoor nodig is, wordt bepaald door de informatie afkomstig van het genoom. De verzameling van alle genen van een organisme noemt men het genoom. Het genoom beschrijft de combinatie van alle erfelijke factoren en het legt het genotype voor alle eigenschappen vast. [2] Alle cellen zijn via mutatie en selectie tijdens de evolutie ontstaan uit een primitieve oercel. Eencellige organismen, zoals bacteriën en protozoën, hebben zich aan de meest verschillende omstandigheden aangepast en vormen meer dan de helft van de biomassa op aarde. Bij eencelligen moeten alle functies door één cel worden uitgevoerd. In een meercellig organisme kunnen de cellen zich door de expressie van verschillende delen van hun genoom differentiëren. Meercellige organismen kunnen complexere taken vervullen dan eencellige, door de differentiatie van de cellen. Hierbij wordt een andere biochemische activiteit gestart welke tot differentiatie leidt. Dit kan een

6

evolutionair voordeel hebben, aangezien het organisme zich dan beter aan kan passen op zijn omgeving. Een belangrijke stap in de evolutie is de ontwikkeling van eukaryotische cellen. Hierbij werd het DNA afgescheiden van het plasma en opgeborgen in de kern van de cel welke wordt omgeven door een kernmembraan. De eukaryotische cellen bevatten organellen welke te zien zijn als gespecialiseerde compartimenten van de cel waarbij elk organel een specifieke structuur en werking heeft. In de onderstaande tabel zijn de verschillen tussen prokaryotische en eukaryotische cellen opgenomen.

Eukaryotische cel (protozoa, wieren) Prokaryotische cel (bacteriën, blauwwieren) Unicellulair of multicellulair Uitsluitend unicellulair Diameter 5-100 µm Diameter 0,5-10 µm Kern bevat genetische informatie van complex georganiseerde chromosomen bestaande uit DNA en eiwit

Genetische informatie in circulair DNA dat in de cel is gelegen

RNA-synthese in de kern, eiwitsynthese in cytoplasme, nucleoli in de kern aanwezig

RNA en eiwit gesynthetiseerd in hetzelfde compartiment, geen nucleoli

Cytoplasme met cytoskelet dat bestaat uit eiwitten

Geen cytoskelet, organellen niet of nauwelijks ontwikkeld

Deling door mitose of meiose Deling via doorsnoering In principe aëroob metabolisme Anaëroob of aëroob metabolisme

Figuur 1: Tabel met de verschillen tussen eukaryotische en prokaryotische cellen [1]

Figuur 2: Diagram van een typische eukaryotische (dierlijke) cel [3].

1. Nucleolus (kerntje met o.a. DNA) 2. Nucleus (celkern) 3. Ribosomen 4. Blaasje 5. Ruw endoplasmatisch reticulum (ER) 6. Golgi-apparaat 7. Microtubule 8. Glad ER 9. Mitochondriën 10. Peroxisoom 11. Cytoplasma 12. Lysosoom 13. Centriolen

7

Figuur 3: Doorsnede van en prokaryotische cel [4].

In bovenstaande figuren is duidelijk te zien dat een eukaryotische cel vele malen complexer is dan een prokaryotische cel. Deze complexiteit was onder andere noodzakelijk om organismen te vormen zoals dieren en mensen. Bij de eukaryotische cel bevindt de genetische informatie zich in de celkern. De hoeveelheid genen welke nodig is om een levensvatbare cel te hebben is waarschijnlijk minder dan 400. De mens heeft echter rond de 30,000 genen, wat ook weer de complexiteit van het organisme aangeeft. Een vlieg heeft maar de helft van dit aantal genen en de E. Coli bacterie heeft er rond de 5000.

D N A

Desoxyribonucleïnezuur of DNA, wat een afkorting is van desoxyribonucleic acid, is in levende organismen de drager van erfelijke informatie. Het DNA wordt in levende cellen gelezen en via diverse stappen leidt dit tot de aanmaak van eiwitten in de cel. Bij de voortplanting wordt (een deel van) het DNA doorgegeven aan het nageslacht, door middel van chromosomen. Bij normale celdeling (mitose) wordt het DNA in de oorspronkelijke cel gekopieerd, en elke dochtercel krijgt een kopie van het totale genoom. Bij meiose, een vorm van celdeling waarbij de geslachtscellen (gameten) ontstaan, krijgt elke dochtercel slechts de helft van het DNA in de moedercel. Omdat geslachtscellen als ze ver-smelten ook hun DNA samenvoegen, heeft het nieuwe organisme dat hieruit ontstaat, weer de normale hoeveelheid DNA. De eigenschappen van het nieuwe organisme, zoals vastgelegd in het

Figuur 4: DNA structuur (dubbele

helix)

8

DNA, zijn op deze wijze van beide ouders afkomstig. Het proces van expressie van genen verloopt via transcriptie (uitlezen van DNA naar RNA) en translatie (het vertalen van de RNA moleculen in aminozuren) naar de productie van eiwitten. De eiwitten zijn uiteindelijk bepalend voor de biochemische activiteiten van de cel. Deze bepalen dus eigenlijk wat voor soort cel er gevormd wordt.

DNA in Eukaryoten

"Hogere" organismen (eukaryoten: planten, dieren, schimmels) hebben in elke cel een celkern (nucleus - vandaar ook nucleïnezuur) waarin het DNA zich bevindt. Het DNA is verdeeld in een aantal af-zonderlijke strengen. De strengen vormen in de celkern chromo-somen. Een chromosoom is een complex van DNA en specifieke eiwitten die histonen worden genoemd. Buiten de celkern komt in sommige organellen ook DNA voor. Alle eukaryote cellen hebben mitochondrieën met eigen DNA en bij planten wordt in verschillende soorten plastiden zoals bladgroen-korrels DNA gevonden. Men gaat er van uit dat deze organellen in de loop van de evolutie zijn ontstaan door opname van complete andere cellen in de eukaryote cel. Niet alle organellen hebben eigen DNA. Dit extranucleair DNA wordt bij geslachtelijke voortplanting alleen via de vrouwelijke lijn doorgegeven. Van een mannelijke voortplantings-cel versmelt alleen het DNA uit de celkern met het DNA van de eicel. De zo ontstane zygote gebruikt de celorganellen uit de eicel. [5]

DNA in Prokaryoten

"Lagere" organismen (prokaryoten: bacteriën en archaea) hebben geen celkern, en het DNA zweeft daar los rond in de cel. Ondanks dat de meeste prokaryoten geen histonen hebben, spreekt men ook in deze gevallen van een chromosoom. Prokaryoten hebben meestal een enkel ringvormig chromosoom, vaak vergezeld van één of meerdere plasmiden die aanvullende genetische informatie bevatten. Hierop zijn echter uitzonderingen, sommige bacteriën hebben lineair DNA en ook sommige plasmiden zijn lineair.[5]

DNA in Virussen en viroïden

Virussen bestaan uit een stuk DNA (of RNA) omgeven door een eiwitmantel. Virussen injecteren hun erfelijk materiaal in een levende cel. In de levende cel wordt het erfelijke materiaal gelezen en op basis van die informatie gaat de cel nieuwe virussen maken. Viroïden werken op vergelijkbare wijze, maar hebben geen eiwitmantel. Ze bestaan dus uitsluitend uit DNA of RNA.

9

RNA

RNA staat voor ribonucleïnezuur, in het Engels Ribo Nucleic Acid, en bestaat uit een reeks van nucleotiden [6]. Een nucleotide is vooral bekend als een bouwsteen van het DNA en bestaat uit: een base, een suiker en een fosfaatgroep. Binnen de wetenschap denkt men dat RNA bestond voor er DNA was en dat DNA ontwikkeld is als een opslag voor genetische informatie. Voor het bestaan van DNA zouden organismen volledig uit RNA hebben bestaan, de zogenoemde RNA-wereld [7]. RNA speelt een belangrijke rol in de aan-maak van eiwitten in de cel. Het meeste RNA is enkelstrengs, zie de figuur hier-naast. RNA speelt ook een rol in de cellulaire afweer, welke vooral actief is in planten. Er bestaan verschillende soorten RNA. In het essay zullen een aantal verschillende soorten RNA naar voren komen waarbij specifiek op de functie van miRNA wordt ingegaan in hoofdstuk 2.

Verschillen tussen DNA en RNA

RNA gebruikt een andere suiker in zijn keten: ribose in plaats van desoxyribose.

De nucleotide uracil (U) wordt gebruikt in plaats van thymine (T) in DNA.

RNA wordt in eukaryoten single-stranded (enkelstrengs) gebruikt. Dubbelstrengs RNA komt wel voor in het genetisch materiaal van sommige RNA-virussen, en speelt in planten een rol bij cellulaire immuniteit.

Aan het 3' eind van het mRNA wordt in een eukaryoot een poly-Adenosine staart geplakt. Polyadenylatie is het beëindigen van de transcriptie, en is belangrijk voor transport uit de celkern en translatie.

Figuur 5: Structuur van RNA ten opzichte van DNA

10

T R A N S C R I P T I E

Transcriptie is in de genetica het proces waarbij een specifiek stuk van een DNA keten wordt afgelezen en in "gespiegelde" vorm wordt vastgelegd in een RNA keten, het mRNA. Dit is de eerste stap in de activering van dit deel van de DNA code. De tweede stap is de translatie van het RNA. De spiegeling is functioneel perfect, er is een één op één relatie tussen elke schakel in de RNA keten en een schakel in de DNA keten, maar chemisch vertonen beide ketens verschillen. Hoewel DNA en RNA beide uit gelijksoortige chemische componenten zijn opgebouwd, men spreekt van basen of nucleotiden, zijn deze enigszins verschillend in samenstelling (ware dit niet zo geweest dat zou de gespiegelde kopie allicht zelf weer gekopieerd worden, en dit tot in het oneindige). De DNA code is nu in de vorm van een RNA "afdruk" toegankelijk gemaakt voor opbouwprocessen in de cel. De synthese van eiwitten begint altijd met transcriptie van één of meerdere DNA segmenten. Verdere uitleg over transcriptie volgt in de paragraaf over genregulatie. [5,8]

T R A N S L A T I E

Om daadwerkelijk ook iets met de informatie uit het RNA te kunnen doen binnen de eiwitsynthese is er een translatie nodig van het RNA. Bij de translatie bindt het tRNA (Transfer RNA) zich aan een aminozuur, om deze vervolgens "af te leveren" bij het ribosoom. In het ribosoom komt het mRNA en het passende tRNA bij elkaar. Het rRNA (Ribosomaal-RNA) molecuul van het ribosoom maakt de reactie mogelijk die de eiwitketen verlengt. Het feit dat rRNA een enzymatische activiteit heeft, maakt het tot een ribozym. tRNA brengt een bepaald aminozuur naar een groeiende polypeptide keten. Hier vindt de overdracht plaats met behulp van triplets van nucleotiden. Doordat elk van deze triplets is gebonden aan een aminozuur. Een mRNA triplet wordt een codon genoemd en de complementaire tRNA triplet een anti-codon.

Figuur 6: Translatie in het cytoplasma; tRNA’s dragen aminozuren naar de in het ribosoom

groeiende peptideketen.

11

Nadat aan het eerste triplet van het mRNA een passend tRNA gekoppeld is, bindt een tweede passend tRNA zich aan het mRNA. Vervolgens worden de twee aan de tRNA hangende aminozuren met een peptidebinding aan elkaar gekoppeld en verlaat het eerste tRNA nu zonder een aminozuur het ribosoom. Vervolgens gaat een derde passend tRNA aan het mRNA zitten en herhaalt zich het proces. Het ribosoom wandelt tijdens dit proces met een stapgrootte van een codon over het mRNA. Aan het eind van het mRNA zit een stopcodon, waaraan zich geen tRNA kan aanhechten en stopt de aanmaak van het eiwit. Bij de binding aan het ribosoom bindt het tRNA in de zogenaamde A-plek van het mRNA, maar alleen wanneer het anticodon van het tRNA overeenkomt met het codon van het mRNA in de A-plek. Zo bindt AAG op het tRNA als anticodon dus met UUC op het codon in de A-plek van het ribosoom. Het anticodon en de bindingsplaats voor het aminozuur bevinden zich ten opzichte van elkaar aan de andere kant van het tRNA. tRNA wordt afgelezen door RNA-polymerase III. [9]

G E N R E G U L A T I E

Een van de belangrijkste aspecten van deze vertaling van DNA, naar RNA, naar eiwit, is de controle die de cel op dit proces heeft. Het menselijke genoom bevat informatie voor tienduizenden eiwitten, maar als een cel zich gespecialiseerd in een van de ongeveer 200 celtypen, is maar een fractie van die eiwitten op een bepaald moment nodig. Alle andere zijn overbodig, of misschien zelfs schadelijk voor het (specifieke) functioneren van de cel. De cel moet dus een mechanisme hebben om sommige genen wel tot expressie te laten komen en anderen niet. Dit wordt genregulatie genoemd. In het volgende hoofdstuk zal worden behandeld hoe microRNA bij dit proces betrokken lijkt te zijn, maar voordat dat duidelijk beschreven kan worden, moeten we eerst de ‘klassieke’ manier van genregulatie toelichten, d.w.z. hoe men tot op 5 jaar geleden dacht dat genregulatie in elkaar zat.

Figuur 7 – De mogelijke momenten waar de vertaling van DNA naar eiwit onderbroken kan

worden.

12

Er zijn verschillende manieren waarop de cel in kan grijpen op de expressie van genen, in verschillende fasen. De belangrijkste en meest voorkomende manier van genregulatie is echter de eerste (zie Figuur 7), beïnvloeding van de mate van transcriptie. Hierbij gaat RNA-polymerase over het DNA om een pRNA streng te maken. Bij de transcriptie zijn, zowel in eu- als in prokaryoten, zogeheten tran-scriptiefactoren actief, eiwitten die de transcriptie beïnvloeden. Er kan onderscheid gemaakt worden tussen repressors (factoren met een blokkerende werking) en activators (factoren met een stimulerende werking). Een activator zorgt ervoor dat het RNA-polymerase makkelijker de initiation site kan vinden, de plek waar transcriptie kan beginnen. Activators binden aan het DNA op promoter regions, bijvoorbeeld TATA-box. In prokaryote cellen, zoals de bacterie E.coli, wordt de transcriptie op bepaalde plaatsen in het DNA als het ware aan- en uitgezet door de promotor, de TATA-box, een zogenaamde consensussequentie. Deze heet zo omdat de sequentie "TATA" er vaak in voorkomt (elke letter staat voor een nucleotide). Transcriptie in eukaryote cellen, zoals die van de mens, is een stuk ingewikkelder. Er zijn zogenaamde enhancers, zoals de GC-box, en silencers aanwezig op het DNA die de frequentie van het aanvangen van transcriptie en zo de mate van expressie van het gen bepalen. Ook omvat het transcriptie complex naast RNA polymerase nog veel meer eiwitten: de activatoren, co-activatoren, een TATA-bindend eiwit en vijf andere basale factoren. Ook komen er in het pre-mRNA nog introns voor, die niet betrokken zijn bij de codering van een eiwit en door splicing uit het pre-mRNA geknipt worden. De repressor zorgt juist dat het RNA-polymerase niet kan binden. Bij de meeste genen zijn zowel activators als repressors betrokken, zoals bij het lac operon (zie Figuur 8). Het lac operon is een set eiwitten die in prokaryoten het lactosegehalte beïnvloedt. [5]

13

Figuur 8 – De Iac operon wordt door twee signalen bestuurd.

Bij eukaryoten is het proces meestal een stuk complexer, hier is een heel transcriptiecomplex bij nodig, bestaande uit een aantal algemene transcriptiefactoren (TFIIA, TFIIB t/m TFIIH) en een aantal specifieke eiwitten. Hier kan in sommige gevallen ook een activator eiwit een stukje verder stroomopwaarts (transcriptie vindt stroomafwaarts plaats) ten opzichte van de promoter bij betrokken zijn. Het DNA wat tussen de promoter en de plek zit waar de activator zich aan het DNA bindt, wordt spacer DNA genoemd.

Figuur 9 – Transcriptie in eukaryotische cellen begint op een afstand.

14

Het is niet zo dat elk gen zijn eigen activators en repressors heeft, een hoop van die eiwitten kunnen bij regulatie van meerdere eiwitten actief zijn. Tevens kan genregulatie plaatsvinden door veranderingen in de structuur van het chromatine. Een hoop van deze regulatiemechanismen zijn nog steeds in grote lijnen correct, echter vormen de microRNA’s wel een belangrijke toevoeging aan dit hele verhaal. Hoe dit precies zit, wordt beschreven in de loop van het volgende hoofdstuk.

C O N C L U S I E

In dit hoofdstuk is uiteengezet hoe men dacht op het gebied van celbiologie en genregulatie in de vorige eeuw. Dit dogma is wat wij willen vergelijken met nieuwe ontdekkingen op het gebied van microRNA in de komende hoofdstukken. Tot niet lang geleden werd gedacht dat een groot gedeelte van het DNA en RNA junk was en dat dit alleen ontstond door kopiëren en niet daadwerkelijk een functie had. In tegenstelling tot het “gewone” RNA, dat van DNA wordt gekopieerd om proteïnen te bouwen, wordt niet-coderend RNA niet vertaald in proteïnen. Soms worden deze gecategoriseerd als "junk", en er zijn vele duizenden van deze niet-coderende RNA’s binnen menselijke cellen. In de komende hoofdstukken zal een stukje van deze “junk”-RNA worden beschreven. Tevens zal de rol die deze “junk”-RNA heeft bij onder andere gen-regulatie en –expressie worden uitgediept.

15

2 . M I C R O R N A

I N T R O D U C T I E

In het voorgaande hoofdstuk is beschreven hoe RNA wordt gepro-duceerd uit DNA en in het cytosol wordt omgezet naar eiwitten. Tot enkele jaren geleden werd aangenomen dat eiwitten alle functies en expressies van een cel veroorzaakten. Dit was voordat door Fire en Mello in 1998 korte RNA-ketens met speciale eigenschappen werden ontdekt [10]. De functionele ketens zijn 20 tot 25 nucleotiden lang en konden bepaalde genexpressies verminderen of zelfs helemaal uit-schakelen. Het effect dat de introductie van korte RNA-ketens bepaalde genexpressies kon uitschakelen was op dat moment al eerder waargenomen. Begin jaren 90 werd een experiment uitgevoerd met paarse petunia’s. In deze petunia’s werden stukjes gen toegevoegd die voor de paarse kleur coderen. Verwacht werd dat de petunia’s een nog paarsere kleur zouden ontwikkelen. Men was dan ook verbaasd toen de petunia’s juist wit of gevlekt bleken te zijn. Indertijd was dit effect een raadsel, maar met de kennis die Fire en Mello hadden opgedaan, was dit effect te verklaren. De introductie van specifiek RNA-materiaal, kan leiden tot de stillegging (silencing) van een genexpressie. Hierdoor wordt in de petunia’s juist het paarse gen uitgeschakeld en zullen de bloemen een witte kleur krijgen. Het hele proces waarbij korte RNA-ketens invloed uitoefenen op een cel wordt RNA interference of RNAi genoemd. Er zijn een aantal manieren waarop de korte RNA-ketens in de vorm van short interfering RNA (siRNA) of microRNA (miRNA) een rol spelen bij genexpressie. In dit hoofdstuk wordt beschreven hoe siRNA en miRNA in een cel wordt geproduceerd en welke functies het binnen een cel vervult. De nadruk zal hierbij vooral liggen op miRNA.

P R O D U C T I E V A N M I R N A

Transcriptie van pri-miRNA

Voor de transcriptie van RNA uit DNA is een complex van eiwitten, polymerase, nodig. Er zijn verschillende soorten poly-merase bekend. Voor de transcriptie van miRNA is het RNA polymerase II complex verantwoordelijk. Dit complex vertaalt DNA naar een primary-miRNA transcript (pri-miRNA). Het pri-miRNA is veel langer dan het uiteindelijke miRNA en kan in lengte variëren tussen honderden en dui-zenden nucleotiden. De meeste miRNA’s

Figuur 10: Transcriptie van pri-miRNA met behulp van RNA

polymerase IIError! Bookmark not defined.

16

komen uit de stukken genoom waar geen eitwit-codering plaatsvindt, dit wijst erop dat deze miRNA’s hun eigen transcriptie units hebben. Ongeveer de helft van de nu bekende miRNA’s bevinden zich op in-tronen van eiwit-coderende genen of op de intronen of exonen van niet-coderend RNA, in plaats van in de zojuist genoemde transcriptie units [13]. Het miRNA op de intronen heeft dezelfde oriëntatie als het mRNA en wordt dus tegelijkertijd omgezet. De transcriptie van pri-miRNA vindt in de kern van zowel dieren, planten als schimmels plaats. Bij de vervolgstap treden echter wel verschillen op.

Via pre-miRNA naar dubbelstreng miRNA [13]

Bij dieren wordt de lange pri-miRNA keten tot functionele stukken gemaakt door het RNase III genaamd Drosha. Hierdoor blijft een keten van ongeveer 70 nucleotiden over, die deels is dubbelgevouwen en de structuur van een haarspeld heeft, zoals hiernaast te zien is in Figuur 11. Deze keten wordt de pre-miRNA genoemd en heeft door het knipwerk van Drosha een 5’ einde met een fosfaat en een 3’ einde met een hydroxy groep. Deze specifieke uiteinden worden herkend door Exportin5, een eiwit dat het pre-miRNA naar het cytoplasma vervoerd. In het cytoplasma wordt het pre-miRNA verder verwerkt door het complex Dicer. Dicer snijdt de bocht uit het pre-miRNA, waardoor een dubbele keten van 21 nucleotiden lengte overblijft. Deze zogeheten miRNA-miRNA* duplex bestaat uit twee gespiegelde ketens miRNA. Net als dit het geval is bij DNA, zijn de twee strengen elkaars inverse. Een speciale eigenschap van

miRNA is dat de twee strengen, de ‘sense’ miRNA en de ‘anti-sense’ miRNA* geen exacte spiegelbeelden zijn; er zitten kinken in de kabel. Deze imperfectie zorgt ervoor dat het miRNA beter verwerkt kan worden in het vervolgproces. In planten is de weg van pri-miRNA naar miRNA iets anders, planten hebben namelijk geen Drosha om de pre-miRNA ketens te verkrijgen. In plaats daarvan hebben ze een RNase III enzym DICER-

Figuur 11: Conversie van pri-miRNA naar miRNA in dierenError! Bookmark not defined.

Figuur 12: Conversie van pri-miRNA naar miRNA in planten [?]

17

LIKE 1 (DCL1), dat een soortgelijke functie verricht. Er wordt een pre-miRNA gevormd dat qua structuur gelijk is aan dat van een dier. In dierlijke cellen wordt dit complex naar het cytoplasma gebracht, maar in planten vindt de volgende bewerkingsstap al plaats in de cel met hetzelfde DCL1 enzym. De losse eindjes worden van het dubbelstrengs miRNA afgeknipt, het miRNA-miRNA* duplex dat zo overblijft wordt door een HST-eiwit naar het cytoplasma vervoerd.

Naar functionele miRNA’s

De laatste stap voordat het miRNA kan worden ingezet is de omzetting van het dubbelstreng miRNA-miRNA* duplex naar twee enkele strengen. Dit gebeurt met behulp van het eiwit Helicase. Hierdoor ontstaan de miRNA en miRNA* strengen, die nu hun regulerende functie kunnen gaan uitvoeren. Deze functie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, dit wordt verder toegelicht in de volgende paragraaf.

Het belang van Dicer

De rol van Dicer is hierboven al kort toegelicht, maar toch willen we dit eiwit specifieker onder de loep nemen. De oorspronkelijke functie van Dicer was waarschijnlijk niet het maken van miRNA, maar het beschermen van het genoom tegen virussen en transposons11. Naast de pre-miRNA haarspeld structuren, zoals te zien in Figuur 11, kan Dicer ook dubbelstreng RNA ketens herkennen en verwerken. Hieruit ontstaan de al eerder genoemde short interfering RNA ketens. Net als bij miRNA worden de siRNA’s verwerkt tot dubbelstreng ketens van ongeveer 21 nucleotiden. Het verschil met miRNA is dat de siRNA’s wel een perfecte aansluiting hebben, de twee strengen zijn elkaars exacte spiegelbeeld12. Daarnaast is het siRNA ook een exacte kopie van het DNA waar het vanaf komt, dit betekend dat een van de twee strengen weer het exacte spiegelbeeld is van een mRNA dat wordt gevormd op het desbetreffende DNA. Dit is informatie die we even in ons achterhoofd moeten houden, als we de werking van miRNA en siRNA gaan bekijken. [13], [14], [15], [16]

Figuur 13

18

F U N C T I E S V A N M I R N A

Zoals gezegd heeft microRNA een regulerende functie binnen een cel. In deze paragraaf worden drie manieren van regulering toegelicht. Het miRNA kan een mRNA uitschakelen, de translatie van eiwitten verhinderen of de transcriptie van mRNA verhinderen.

Uitschakeling mRNA

Voor de eerste twee functies van miRNA is het RNA-induced Silencing Complex (RISC) van belang. Dit is een eiwit-complex waarin miRNA (en ook siRNA) kan worden opgenomen. Eenmaal ‘geladen’ zal het RISC op zoek gaan naar een mRNA dat precies of grotendeels past bij het opgenomen miRNA. Wat hierna gebeurt is afhankelijk van de mate van overlap die het miRNA en mRNA vertonen. Bij een kleine overlap van 8 tot 10 nucleotiden wordt de translatie van eiwit vanaf het mRNA verhinderd. Bij een grote overlap vindt splitsing van het mRNA plaats, deze splitsing gebeurt precies in het midden van het bijbehorende miRNA. Door deze splitsing is het mRNA niet meer functioneel en zal het binnen de cel worden afgebroken. Het miRNA blijft intact in het RISC en kan zo doorgaan om een ander mRNA te herkennen en uit te schakelen. Met deze methode kan de expressie van genen worden onderdrukt; de transcriptie van het DNA naar mRNA vindt nog wel plaats, maar het mRNA is niet in staat om eiwitten te vormen.

Verhindering van translatie

Als er sprake is van geringe overlap tussen het miRNA en het mRNA, zal het RISC wel hechten aan het mRNA, maar is het niet in staat om deze te splitsen. De translatie van mRNA naar eiwitten wordt hierdoor verhinderd, maar er zijn een aantal belangrijke verschillen met de hierboven beschreven totale uitschakeling van mRNA. Vaak bindt het miRNA-RISC complex met een RNA-sequentie in de 3’ UTR, het uiteinde van een mRNA dat niet wordt vertaald naar eiwit. Het RISC complex verhindert hierdoor de translatie van eiwit, maar hoeft deze niet helemaal uit te schakelen. Er hoeft slechts een beperkte overlap van 7 tot 9 nucleotiden te zijn, om de translatie te verhinderen. Hierdoor kan één miRNA verschillende mRNA’s verhinderen, waarop soortgelijke sequenties van nucleotiden voorkomen.

19

Verhindering van transcriptie

De vorige twee methoden zijn gebaseerd op interactie met mRNA door middel van RISC om zo de productie van eiwitten te verstoren. Een andere methode waarmee miRNA invloed kan uitoefenen op genexpressie is door de structuur van DNA te beïnvloeden. De structuur van DNA wordt bepaald door de combinatie van histonen en DNA, deze structuur wordt chromatin genoemd. Met behulp van enzymen, chromatin remodelling complexen en DNA methylation kan de structuur van chromatin worden bepaald en wordt het genoom opgedeeld in discrete domeinen. Voor de werking van miRNA moet gekeken worden naar de eigenschappen van heterochromatin. Dit is een geordende staat van DNA die moeilijker toegankelijk is voor transcriptie. Gebieden op het DNA met een hoge mate van herhalingen zijn de meestvoorkomende doelwitten voor de vorming van heterochromatin. Een speciale eigenschap van heterochromatin is dat het zich binnen een domein kan verspreiden en zo bepaalde gen-sequenties kan afschermen. Dit is een proces waarbij mij de invloed van miRNA verwacht. In Figuur 14 wordt beschreven hoe men denkt dat deze interactie plaatsvindt.

Figuur 14: Mechanisme voor de initiatie van heterochromatin vorming [16]

De rode vlaggetjes zijn histone H3 eiwitten die gemethyleerd zijn op lysine 9. Aan dit histone bindt zich het heterochromatin protein (HP1) eiwit. De enzymen HMT en HDAC zetten het HP1-eiwit om in de heterochromatin structuur. Om deze omzetting te starten moeten specifieke DNA-sequenties worden herkend. Dit kan gebeuren door bepaalde transcriptie factoren (TF) of door siRNA ketens die zich richten op de herhalende, specifieke DNA-sequenties. Het groene blokje in Figuur 14 staat voor deze, nog onbekende, siRNA interactie [16].

20

R O L V A N M I R N A

We weten nu hoe microRNA in een cel wordt gemaakt en op welke manier het invloed kan uitoefenen binnen een cel. Nu rest de vraag welke functie deze korte RNA-ketens en de bijbehorende machinerie hebben. Dit is een gebied waar momenteel erg veel onderzoek naar wordt gedaan. Algemeen wordt aangenomen dat miRNA een rol speelt bij de regulering en ontwikkeling van een cel, maar de RNAi biedt ook een goede bescherming tegen virussen en transposons.

Regulering

De eerste miRNA’s die zijn ontdekt, lin-4 en let-7, bepalen de overgangen in de verschillende stadia van een larve. Ook in planten worden overgangen in de ontwikkeling bepaald door miRNA en in vliegen zorgen ze voor celdeling en het afsterven ervan. [12] In [?]

wordt een model voorgesteld om de ontwikkeling van planten te kunnen beschrijven. Hierin wordt aangenomen dat veel miRNA in planten werkt door bij de differentiatie van cellen belangrijke regulerende gen transcripties in specifieke dochtercellen te verhinderen. Bij de ontwikkeling van een plant moeten soms bepaalde minder gedifferentieerde genen worden uitgeschakeld. Dit kan door het verhinderen van transcripties (zoals hierboven beschreven), maar dit is een langzaam proces. Door op dat moment miRNA in te schakelen wordt de mRNA die hoort bij het betreffende gen uitgeschakeld. Op deze manier kan een genexpressie sneller worden gestopt en kunnen dochtercellen zich sneller differentiëren.

Bescherming

Naast een regulerende taak heeft miRNA, of eigenlijk RNAi, ook een beschermende functie. Zo worden virussen aangepakt die RNA gebruiken om hun eigen eiwitten in een cel te maken [17]. Ook hier komt Dicer in actie, verwerkt de dubbelstreng RNA tot kleine siRNA’s, welke weer door RISC kunnen worden gebruikt om de eiwitproductie van het virus te kunnen uitschakelen. Op eenzelfde manier kunnen transposons, verspringende genen, door hetzelfde mechanisme worden onderdrukt.

21

Onderzoek [11]

Met behulp van dubbelstreng RNA kan op een snellere en efficiëntere manier onderzoek worden gedaan naar de functie van een specifiek gen. Hoe dit in zijn werk gaat is ontdekt door de groep van Thomas Tuschl. Als een menselijke cel wordt geïnfecteerd door een virus dat lange dubbelstreng RNA maakt, gaat de cel in een beschermende modus: het enzym PKR blokkeert alle translaties van mRNA, zowel van het lichaam als van het virus, en het enzym RNAse L vernietigt alle mRNA’s. Dit afweermechanisme is een onderdeel van de interferon reactie. Deze interferon reactie is een probleem voor onderzoekers, omdat zij genetisch materiaal willen inbrengen via dubbelstreng RNA. Nu bleek dat dubbelstreng RNA ketens korter dan 30 nucleotiden niet werden opgemerkt door het afweersysteem. Deze gesynthetiseerde ketens werden door Dicer en RISC verwerkt om selectief genen uit te schakelen. Deze ontdekking was een doorbraak voor genetisch onderzoek. Het was wel mogelijk om specifiek genen uit te schakelen met behulp van virussen, maar met die methode duurde het maanden om een gen uit te schakelen en het effect te onderzoeken. Met de siRNA’s is het mogelijk om binnen enkele uren een gen naar keuze uit te schakelen. RNAi is een krachtig hulpmiddel in de zoektocht naar nieuwe medicijnen. Er wordt onderzoek gedaan naar het uitschakelen van virussen zoals HIV, hepatitis en polio met behulp van siRNA’s. In het lab is het al gelukt om deze virussen tijdelijk uit te schakelen, het zal echter nog wel een tijd duren voordat siRNA’s voor menselijk gebruik beschikbaar zijn.

22

3 . G E N E X P R E S S I E E N E V O L U T I E In dit hoofdstuk zal worden gekeken naar de genexpressie. Het blijkt namelijk dat dicht bij elkaar staande soorten zoals de aap en de mens nauwelijks verschillen in het DNA. De mens en de aap hebben bijvoorbeeld voor 98% dezelfde genen. Ondanks dat er grote gelijkenis is in het DNA bestaan er grote verschillen tussen de mens en de aap. Deze verschillen ontstaan omdat de genregulatie bij beiden anders is, waardoor dezelfde genen op een andere manier tot expressie komen. Al in 1975 schreven Mary-Claire King en Allan Wilson of Berkeley in een paper dat de overeenkomst in de genen tussen de mens en de chimpansee 99 procent was. Zij suggereerden dat genregulatie misschien een verklaring zou kunnen zijn voor het feit dat zo weinig genetische verschillen toch zulke wijdverbreide verschillen in anatomie en gedrag tot gevolg kan hebben. Hieronder zal duidelijk worden dat zij al 40 jaar het juiste vermoeden hadden.

De rol van genregulatie

Door de vooruitgang die is geboekt op het gebied van het bijhouden van genen, is duidelijk geworden dat de genomen van zoogdieren een opvallende consistentie in hun set genen bevatten. Er van uitgaande dat er in elk zoogdier een vergelijkbare set van genen aanwezig is, is voorgesteld dat verschillen in regulatie een belangrijke rol kunnen spelen in het verklaren van de verschillen tussen soorten. Bij zoogdieren vallen de genregulerende mechanismen op dit moment in drie categorieën te onderscheiden. De eerste categorie is de regu-latie van de transcriptie in cis, waarbij promotors en enhancers bemiddelen. De tweede is de regulatie in trans, waarbij transcriptiefactoren bemiddelen bij de binding aan cis, RNA interference en microRNA’s. Het derde mechanisme is regulatie op basis van de veranderlijkheid van DNA en hoe DNA is opgerold. Daarnaast wordt de genactiviteit ook geregeld door splicing, de sta-biliteit van het RNA, efficiëntie van de translatie en de stabiliteit en activiteit van proteïne. Deze regelsystemen zijn in hoofdstuk 1 beschreven en zullen op dit moment buiten beschouwing worden gelaten. In een vergelijkend onderzoek van Mark Adams benoemt hij een aantal studies waarin wordt gekeken naar de genexpressie als een variabele van de evolutie. Een goed voorbeeld vindt hij de studie naar de impact die een veranderde genregulatie heeft op in zoet- en zoutwater levende stekelbaarsjes. Een gereduceerde expressie van het transcriptiefactor gen Pitx1, bij zowel de zoet- als zoutwater stekelbaars, bleken ervoor te zorgen dat het bekkenskelet niet meer aanwezig was in de visjes. Dit voorbeeld geeft goed aan dat veranderingen in de regulering van de genexpressie een directe en snelle evolutionaire impact kunnen hebben.

23

Een voorbeeld waarin duidelijk wordt dat zelfs het sociale gedrag door genexpressie wordt bepaald is een onderzoek bij de “Killifish Fundulus Heteroclitus”. Verschillen in de expressie van de vasopressin-1a-receptor leidde tot verandering in sociaal gedrag, waaronder de voorkeur voor partner [18].

Onderzoek naar mensen en apen

In maart 2006 hebben onderzoekers uit Amerika, verbonden aan Yale en onderzoekers uit Australië, verbonden aan het Hall Institute, een nieuwe techniek gebruikt om de genexpressie in duizenden genen tegelijk te meten. Uit deze studie kwam naar voren dat mensen in de laatste vijf miljoen jaar meer en meer begonnen te verschillen van hun aapachtige voorouders. In deze periode zijn de genen die de transcriptiefactoren bepalen vier keer zo vaak veranderd en hebben ze hun eigen expressie patronen veranderd alsmede de genen die zij reguleren. Omdat deze regulerende genen veel invloed hebben op de activiteit van vele genetische doelen, kunnen kleine veranderingen in de expressie van de regulerende genen een enorme impact hebben. De hierboven benoemde transcriptiefactoren zijn erg belangrijk. De genregulatie bepaalt wanneer, hoeveel en in welke cel een gen wordt afgelezen. Hiervoor heeft de cel een systeem van enzymen en DNA-bindende eiwitten die transcriptiefactoren worden genoemd. Er zijn meer dan 2000 verschillende transcriptiefactoren in het menselijke genoom [19]. Wanneer werd gekeken naar de genexpressie bij de Makaak, de Orang-oetang en de Chimpansee werden er maar kleine veranderingen in de genexpressie gevonden over een periode van 65 miljoen jaar. Bij de mens echter is er sprake geweest van een snelle evolutie in transcriptiefactoren, zoals hierboven is aangegeven. Om de verschillen in de genexpressie van verschillende soorten te kunnen meten hebben White en Gilad de eerste "multi-species gene array" ontwikkeld. Hiermee konden ze het expressieniveau van meer dan duizend genen tussen mensen, Chimpansees, Orang-oetangs en Rhesus Makaken met elkaar vergelijken. Om een goede vergelijking te kunnen maken hebben de onderzoekers gekeken naar de genen in de lever van vijf volwassen mannen van elke van de vier soorten. Er werd gekeken naar het expressieniveau van twee sets genen. De eerste set waren de genen waar voor alle vier de soorten het minst aan was veranderd. Dit was voor 60 procent van de 1.056 genen van de vier soorten het geval. Dit geeft aan dat deze genen bijna hetzelfde zijn gebleven voor een periode ongeveer 70 miljoen jaar wat kan suggereren dat de regulatie van deze genen onder evolutionaire dwang is. De meeste van deze bijna onveranderde genen zijn betrokken bij de primaire cellulaire processen. De onderzoekers suggereren dat het veranderen van de regulatie van deze fundamentele en oude genen schadelijk kan zijn omdat deze

24

betrokken zijn bij de primaire cellulaire processen. Veranderingen in deze genen en processen kunnen grote gevolgen hebben. De tweede set is een set met genen die drastisch zijn veranderd. Dit kan een indicatie zijn van een sterke prikkel om aan te passen aan een veranderende omgeving. De onderzoekers hebben in deze set ook gekeken naar menselijke genen met een significant hoger of lager expressieniveau. Ze vonden 14 genen met een verhoogde expressie en vijf genen met een verlaagde expressie. Dit is opmerkelijk omdat slechts 10 procent van de genen in de totale reeks transcriptiefactoren waren. Van deze 10 procent had 42 procent een verhoogde expressie van de menselijke genen. Geen enkel gen met een lagere expressie bevatte transcriptie-factoren. Deze bevindingen geven de mogelijkheid dat de functie en regulering van transcriptiefactoren wezenlijk zijn veranderd in de evolutie van de mens. Deze veranderingen zijn een zeer efficiënte manier om met een kleine moeite grote veranderingen te krijgen, zegt Gilad. Door het veranderen van transcriptiefactoren kan het gehele regulerende netwerk veranderen met slechts een klein aantal mutaties, die een grote impact hebben. De vraag waarom mensen zo anders zijn dan andere levensvormen blijft wel bestaan. Wat voor veranderingen in de omgeving of levenswijze hebben er voor gezorgd dat er zo´n snelle verandering in de expressie van de genen in de lever van de mensen heeft plaatsgevonden en niet bij andere primaten? Een deel van het antwoord is volgens Gilad te vinden in het feit dat er snelle veranderingen hebben plaatsgevonden in ons dieet. Doordat we vuur zijn gaan gebruiken is er een voorkeur ontstaan voor gekookt eten, dit terwijl er geen andere levensvormen zijn die afhankelijk zijn van gekookt eten. Misschien heeft iets in het kookproces de biochemische benodigdheden voor de maximale opname van nutrieten en het proces dat nodig is om de natuurlijke toxinen die in plantaardig- en dierlijk eten voorkomen af te breken veranderd [20]. In het onderzoek dat Gilad heeft uitgevoerd werd gekeken naar de genen in de lever. Een ander onderzoek, uitgevoerd door Enard et.al. werd gekeken naar de transcriptie in zowel bloedleukocyten als in de lever en de hersenen van de mens, de chimpansee, de orang-oetang en de makaak. Dit is gedaan door gebruik te maken van microarrays en door te kijken naar patronen in de eiwitexpressie. Hiermee hebben de onderzoekers soortspecifieke genexpressie patronen ontdekt. Deze patronen indiceren dat veranderingen in proteïne en genexpressie zich voornamelijk in de hersenen van de mens uiten. In de studie werd duidelijk dat het aantal van intraspecifieke variatie in de genexpressie in de variatie tussen individuen van dezelfde soort hoog was in vergelijking met het aantal tussen de chimpansee en de mens [21]. Wanneer de interspecifieke verschillen in de transcriptie in het

25

bloed en de lever werden vergeleken tussen de mens, de chimpansee en de rhesus makaak, werd duidelijk dat de transcriptie van de mens meer op de transcriptie van de chimpansee leek dan op de transcriptie van de rhesus makaak. Dit verschil was echter te verwachten vanwege de relatie tussen de mens en de chimpansee. Er was echter wel een verschil in genexpressie in de hersenen gevonden waarbij de chimpansee nu een grotere overeenkomst heeft met de makaak dan met de mens. Bij het menselijke brein bleek dat de ratio in verandering van het niveau van genexpressie 5,5 keer sneller was vergeleken met de ratio voor verandering van het niveau van genexpressie in het bloed en de lever. Dit wordt weergegeven in Figuur 15.

Figuur 15 – De afstand van de takken representeren de relatieve omvang van veranderingen in

expressie bij drie primaten en drie weefsels. De nummers verwijzen naar de ratio van verschillen die bekend zijn tussen mens en chimpansee.

Om te kijken of dit patroon uniek is voor primaten en om te kijken of de verandering in het niveau van de genexpressie uniek was voor het menselijke brein werd onderzoek gedaan bij drie soorten muizen. Bij elke soort muizen zijn drie individuen onderzocht. De drie soorten waren de M. Musculus, de M. Caroli en de M. Spretus. Het werd duidelijk dat individuen van de soorten M. Musculus en M. Spretus patronen in genexpressie gemeen hebben die hen onderscheiden van de andere soorten. Net zo als dit ook het geval is bij de mens en de chimpansee. Deze uitkomst bevestigt dat zoogdieren die dicht bij elkaar staan erg verschillende genexpressies kunnen hebben. De onderzoekers denken dat de evolutie in de hersenen van de mens te maken hebben met evolutionaire veranderingen in het niveau van genexpressie en met veranderingen in het niveau van mRNA en de proteïne levels. Uit het bovenstaande wordt duidelijk dat soorten die dicht bij elkaar staan, zoals verschillende soorten muizen en bijvoorbeeld de mens en de aap, in bepaalde weefsels zeer weinig verschillen in DNA. Echter, er bestaan wel degelijk zeer grote verschillen die worden veroorzaakt door verschillen in genregulatie. Er bestaat het vermoeden dat dit waarschijnlijk wordt geregeld door microRNA’s, maar hier is nog niet veel duidelijkheid over. In de vele artikelen die zijn gelezen voor het samenstellen van dit hoofdstuk is gebleken dat microRNA’s waarschijnlijk een belangrijke rol vervullen bij het verduidelijken van het verschil tussen cellen die zijn gedifferentieerd. Daarnaast komt

26

uit een onderzoek van Ronald Plasterk naar voren dat microRNA’s blijkbaar worden gevormd nadat veel cellen zijn gedifferentieerd en weefsels zijn gevormd [22]. Wat wel duidelijk is, is dat microRNA’s korte niet-coderende RNA’s zijn die post-transcriptief de genexpressie onderdrukken door het blokkeren van de translatie of door het teweegbrengen van de degradatie van de doelgerichte mRNA’s. Vele honderden microRNA’s en tienduizenden van potentiële doelwitten zijn geïdentificeerd of voorspeld, maar nog steeds zijn er twee basisvragen niet beantwoord: hoe veel microRNA’s zijn er en welke van de voorspelde doelwitten zijn functioneel? [23] Dit geeft aan dat er nog steeds onduidelijkheid bestaat over microRNA’s. Ook is er op dit moment nog niet veel meer informatie beschikbaar over de functie van microRNA’s. Het is daarom ook lastig om meer zeggen over microRNA’s dan dat zij op een bepaalde manier belangrijk zijn bij de genregulatie.

Evolutie van de moderne mens

Uit het voorgaande is duidelijk geworden dat de mens zich in de laatste 5 miljoen jaar zeer snel heeft geëvolueerd en dat deze snelle evolutie waarschijnlijk heeft te maken met genregulatie en genexpressie. Ook wordt veel variatie bereikt door verschillen in genexpressie. Hieronder volgt een duidelijk voorbeeld van een verschil in genen en genexpressie bij de mens. Het wordt duidelijk dat bepaalde mensen door een verandering in genexpressie wel tegen melk kunnen, terwijl het gen zelf onveranderd aanwezig is. Ook zal door dit voorbeeld duidelijk worden dat de mens nog steeds aan het evolueren is. In een artikel van Newton en Bailey (2006) wordt geprobeerd een antwoord te geven op deze vraag. Tot een paar honderd jaar geleden gold ook voor de mens nog het principe van “survival of the fittest”. Alleen degenen die het beste in staat waren zich aan te passen overleefden en konden voor nageslacht zorgen. Echter, vandaag de dag is het in grote delen van de wereld, dankzij verbeterde hygiëne, gezondheidszorg en voldoende en goed voedsel, veilig. De gevaren in het leven van de mens zijn geminimaliseerd. Je zou verwachten dat de evolutie voorbij is, dit is echter niet het geval omdat natuurlijke selectie ook op genetisch niveau plaats vind. Hiermee is natuurlijke selectie nog betrokken bij de fundamentele invloeden op het leven: eten, reproductie en infecties. Deze varianten zijn slechts enkele kenmerken waarop natuurlijke selectie nog van invloed is. Er bestaat het International HamMap Project waarin miljoenen varianten van genen van Yoruba Nigerianen, Utah Europeanen, Han Chinezen en Japanners zijn opgenomen. Hiermee proberen onderzoekers bewijs voor natuurlijke selectie te vinden. Er is recent bewijs gevonden voor natuurlijke positieve selectie. Dr. Jonathan Pritchard vond genen die betrokken waren bij geur, reproductie, metabolisme van koolhydraten

27

en de ontwikkeling van de hersenen. Ze vonden ook vijf genen die betrokken zijn bij pigment in de huid wat als bewijs wordt gezien voor positieve selectie bij Europeanen. Het is echter nog steeds lastig om uit te vinden waarom bepaalde varianten zijn geselecteerd. Het is namelijk onmogelijk om terug te gaan in de tijd en daar de fitheid van individuen met die variant te meten. Het enige dat onderzoekers kunnen doen is zeggen dat ze denken dat er selectie heeft plaatsgevonden. Een zeer duidelijk en leuk voorbeeld van natuurlijke selectie heeft te maken met melk. In de meeste delen van de wereld kunnen volwassen geen melk drinken. Na de periode dat een kind wordt gevoed met moedermelk, wordt het lactose gen meestal uitgeschakeld. Dit lactose gen produceert een enzym dat de lactosesuiker in de melk afbreekt. Toch is voor meer dan 70 procent van de volwassenen in Europa mogelijk om melk te drinken omdat zij een variatie van het lactose gen hebben waardoor de productie van het enzym wordt voortgezet. Deze genetische verandering heeft waarschijnlijk tussen de 5000 en 10000 jaar geleden plaats gevonden, op het moment dat de melkfabrieken zich begonnen te ontwikkelen. Vanuit de natuurlijke selectie gezien kan worden gespeculeerd dat het in West-Europa belangrijk was om melk te kunnen drinken als volwassene om te overleven. Dit zorgde voor een selectieve druk ten gunste van de mutatie van het gen. De mutatie van het gen is op dit moment zelfs zo gewoon geworden dat het onvermogen van een volwassene om lactose te verteren wordt gezien als een ziekte, namelijk lactose intolerantie. Als de selectieve druk op deze mutatie hetzelfde blijft zal iedereen over een duizend jaar over deze mutatie beschikken [24].

28

4 . O O R S P R O N G E N E V O L U T I E [ 2 5 ] In alle meercellige organismen worden miRNA’s aangetroffen. Voor het grootste deel zijn de miRNA-genen geconserveerd in het dierenrijk of in het plantenrijk, maar er zijn nog geen gelijke miRNA’s gevonden in dieren én planten. Dit wijst erop dat de gevonden microRNA’s in beide takken apart zijn ontstaan en ook dat dit pas is gebeurd na de splitsing van planten en dieren. Over het ontstaan van de eerste miRNA’s is weinig bekend, maar in [25] wordt gesuggereerd, met een zekere mate van onzekerheid, dat miRNA-genen kunnen ontstaan door geinverteerde duplicatie van hun toekomstige doel-genen. Tijdens een celdeling wordt het DNA van de cel gedupliceerd. Tijdens dit kopieerproces komt het wel eens voor dat genen per ongeluk twee maal achter elkaar gekopieerd worden (“gene duplication”, [5]). Het is dan net zo goed mogelijk dat deze kopie achterstevoren vlak achter het originele gen komt te zitten. Om een geheel geinverteerde duplicatie te krijgen, komt deze kopie ook nog eens ‘op zijn kop’ te zitten. Op deze manier komt het complement van het gen op dezelfde DNA-streng te zitten (Figuur 16, zwart is het complement van rood). De geinverteerde kopie vormt, na transscriptie, een teruggevouwen RNA-molecuul (Figuur 16) waaruit zogenaamde small-RNA’s geknipt worden. Dit knippen gebeurt wanneer de grote, nog nutteloze RNA wordt afgebroken. Deze kleine RNA’s hebben de potentie om, wanneer ze goed geknipt worden, een regulerend miRNA te worden. Nutteloze geinverteerde kopieën zullen verder muteren (in de loop van evolutie) totdat ze een nuttig miRNA vormen (en blijft geconserveerd in de evolutie) of een schakelijk RNA vormen (en verdwijnt dus in de evolutie).

Figuur 16 – Model voor het ontstaan van de eerste pre-miRNA’s in planten. Nadat een gen

geïnverteerd is gekopieerd in een volgend DNA, zal er een dubbelgevouwen RNA van gebouwd kunnen worden (complementaire basenparen plakken automatisch aan elkaar na transscriptie).

Basenpaar sequenties zijn willekeurig en slechts ter illustratie.

29

Dit model wordt ondersteund door de vinding van verschillende ‘small RNA’s’ op plaatsen waar ze te verwachten zijn, wanneer ge-inverteerde duplicatie van hun doel-gen plaats zou hebben gevonden. Dit model is echter alleen van toepassing op plant-miRNA’s. In dieren hebben de messengerRNA’s meerdere plaatsen waar verschillende miRNA’s op kunnen binden. Dit zorgt ervoor dat in dieren de regulatie preciezer kan plaatsvinden, in tegenstelling tot de “aan/uit” regeling in planten. Het verschil in oorsprong van miRNA’s bij planten en dieren verklaart nog eens het feit dat veelvoorkomende miRNA’s in dieren niet worden teruggevonden in planten en vice versa. In dieren is het waarschijnlijk dat mutaties in de onvertaalde delen van genen (intronen) ervoor zorgen dat een intron een functie krijgt en evolueert tot miRNA.

E V O L U T I E A A N D E H A N D V A N M I R N A C L U S T E R S

Terugkijken in de evolutie is te doen aan de hand van microRNA’s. In [26] bijvoorbeeld, wordt de evolutionaire geschiedenis gereconstrueerd van het mir17 microRNA cluster. Een cluster is een verzameling genen die afkomstig is van een enkele transscriptie. Uit zo’n enkele transscriptie kunnen meerdere miRNA’s gemaakt worden. In Figuur 17 staat het mir17 miRNA cluster afgebeeld.

Figuur 17 – Menselijke mir17 miRNA cluster. Op chromosoom 13 bevinden zich de ‘blokken’ die

de precursor miRNA’s voorstellen, met de namen van de pre-miRNA’s eronder. Uit deze pre-miRNA’s worden één of twee miRNA’s geknipt: de donkere gebieden in de blokken, met de

namen cursief erboven. Op twee andere chromosomen zijn homologen aan de pre-miRNA’s uit het cluster te vinden.

Homologen van de pre-miRNA’s in het menselijk mir17 cluster zijn te vinden op andere chromosomen van de mens, maar ook in vele andere organismen. Deze homologen zijn, op enkele mutaties na, gelijk aan de menselijke. Ze bevatten dezelfde miRNA-sequenties zoals die in mensen wordt aangetroffen. Wat de functie is van de miRNA’s in het mir17 cluster is onbekend. Bijna alle menselijke miRNA’s worden teruggevonden in andere zoogdieren als de muis, de rat, de chimpansee, vissen en de kikker. In

30

ongewervelden worden echter miRNA-17 en miRNA-19 niet gevonden en lijken dus alleen ontstaan te zijn in gewervelden. In gewervelden worden ook meer homologen gevonden (op verschil-lende chromosomen) dan in ongewervelden. Er wordt daarom ge-speculeerd dat deze uitbreiding van het mir17 cluster te maken heeft met het ontstaan van de gewervelden en samenging met de duplicatie van het hele genoom. Deze genoom duplicatie zorgde voor viervoudige hox-clusters in gewervelden, Figuur 18.

Figuur 18 – Hox-genen zijn hier voorgesteld als gekleurde blokken. In gewervelden zijn de hox

genen op vier chromosomen terug te vinden, in ongewervelden slechts op één. Hoewel de plaats en frequentie van de genen verandert per soort, zijn de genen zelf vrijwel identiek en komen dus van

een gemeenschappelijke voorouder. De genen werken als hoofdschakelaars voor een grote verzameling andere genen. Expressie van een enkel hox-gen kan in de embryonale fase de start

geven voor bijvoorbeeld een complete staart of een been. [27]

E V O L U T I E V A N M I R N A B I N N E N H E T H O X - C L U S T E R [ 2 8 ]

Zoals eerder besproken resulteert één transscriptie niet persé in één gen, maar kan ook meerdere genen voortbrengen. Deze genen behoren dan tot een cluster. Dit geldt zowel voor miRNA-genen als de hox-genen, besproken in Figuur 18. In de gebieden binnen de hox-clusters tussen de hox-genen zit ook genetisch materiaal voor de bouw van miRNA’s. In de hox-clusters zitten ten minste drie groepen van miRNA’s gecodeerd. In [28] wordt van 3 miRNA’s (mir-10, mir-196 en iab-4) de geschiedenis onderzocht, door mutaties in de miRNA-sequenties te bekijken. Deze miRNA’s hebben een regulerende werking op de in de buurt gelegen hox-genen. In Figuur 19 wordt aan de hand van het miRNA mir-10 een voorbeeld gegeven hoe met de miRNA sequenties

31

in verschillende organismen een evolutionaire boom kan worden gebouwd. Begonnen wordt met de sequentie van mir-10 in geleedpotigen (arthropods). In alle andere dieren wordt een mutatie op plaats 23 waargenomen (T G). Diep in het verleden zijn deze dus afgesplitst van een gemeenschappelijke voorouder (ten tijde van de eerste gewer-velden). Vergeleken met deze nieuwe sequenties wordt wederom een mutatie in een groep ontdekt, en wel op plaats 12 (T A). Dit duidt weer op een splitsing. Al deze mutaties staan ook genoteerd in de stamboom die met deze informatie is opgebouwd.

Figuur 19 – Reconstructie van de evolutionaire geschiedenis van het mir-10 miRNA. Dieren

waarin dezelfde mutatie voorkomt horen tot één tak.

Op een grotere schaal kan gekeken worden naar de aan- of afwezigheid van miRNA’s in zijn geheel. Mir-196 wordt bijvoorbeeld alleen in gewervelden gevonden. Dit kan erop duiden dat dieren zonder dit miRNA tot een andere tak behoren. Het kan natuurlijk het geval zijn dat het miRNA weer verloren raakt in een tak van gewervelden. In de stamboom in Figuur 20 is echter ook gekeken naar de hox-genen zelf. De ontwikkeling en verplaatsing van de hox-genen volgt dezelfde patronen als van de verschijning en verplaatsing van de geassocieerde miRNA’s. Doordat miRNA’s goed geconserveerd zijn gebleven in de loop van de evolutie, zijn ze bijzonder geschikt om een stamboom mee op te bou-wen, ondanks hun korte basenpaarsequentie. Het mir-10 miRNA is evolutionair gezien oeroud en was waarschijn-lijk al aanwezig in de gemeenschappelijke voorouder van de protos-tomen en deuterostomen, de eerste dieren met symmetrische opbouw. De afwezigheid ervan binnen rondwormen en manteldieren (tuni-cates) wordt verklaard door de desintegratie van de hox-clusters in die soorten. Mir-196 miRNA wordt alleen aangetroffen in gewervelden. Iab-4 heeft wellicht een analoge regelende werking binnen geleedpotigen, maar vertoont geen homologie met het mir-196 miRNA. Het feit dat

32

mir-196 nog wel in zeeprikken wordt aangetroffen, maar verder niet meer in simpelere deuterostomen (zee-egels en lancetvisjes) sug-gereert dat het zijn oorsprong vindt in een van de allereerste gewervelden.

Figuur 20 –Hox-gen regulerende miRNA’s in een evolutionaire stamboom: mir-10, mir-196 en iab-

4. De oorspronkelijke in het Latijn vermelde namen zijn vertaald aan de hand van wikipedia, voor zover verantwoord.

De figuren op een lijn stellen de aanwezigheid voor van een bepaald miRNA-gen binnen een hox-cluster. Losstaande figuren stellen homologen voor van een miRNA, deze zijn dus wel aanwezig in

het organisme, maar niet gevonden binnen een hox-cluster. De aanwezigheid van mir-196 luidt de tak naar de eerste gewervelden in. Vanaf de eerste

beenvissen zijn de hox-clusters verdubbeld en daarmee ook de miRNA’s. Van de zeeprik is slechts een kort stukje genoom beschikbaar, vandaar de gestippelde lijnen.

Conclusie

Mutaties in intronen zijn wellicht de oorsprong van de eerste miRNA’s in het dierenrijk. Binnen het plantenrijk, waar miRNA’s ook, maar onafhankelijk zijn ontstaan, zijn geïnverteerde kopieën van de toekomstige doel-genen waarschijnlijk de bron. Door de sequenties van miRNA’s op te sporen in het DNA van allerlei hedendaagse diersoorten en daarin de onderlinge mutaties te vergelijken, is het te doen een evolutionaire boom op te bouwen. MiRNA’s zijn goed geconserveerd gebleven sinds hun eerste ver-schijning na de splitsing van dieren en planten. Een slechts op één hand telbare hoeveelheid mutaties heeft plaatsgevonden op sommige miRNA’s sinds hun ontstaan ten tijde van de allereerste gewervelden. Dit kan betekenen dat die miRNA’s een zeer belangrijke rol spelen in de ‘fitheid’ van deze organismen.

33

5 . R N A I O N D E R Z O E K A A N D E U T De precieze werking van genregulatie door RNAi is, zoals duidelijk is geworden, nog lang niet in zijn geheel bekend, en is daarom de afgelopen jaren overduidelijk een hot issue geweest voor wetenschappers, en zal dit de komende jaren ook blijven. Ons laatste punt van aandacht is dan ook het onderzoek dat de Universiteit Twente uitvoert of uit wil gaan voeren met betrekking tot RNAi.

O N D E R Z O E K S F O C U S V A N D E U T

Er zijn verschillende vormen van onderzoek die gedaan kunnen worden naar miRNA, voor een deel zijn deze ook al beschreven in hoofdstuk 2. Uitzoeken welke miRNA’s er allemaal zijn en welk gen ze reguleren, is hier natuurlijk de belangrijkste, omdat dit nog niet volledig in kaart is gebracht. De Universiteit Twente focust zich bij het (aanstaande) onderzoek naar miRNA op de ontwikkelingsbiologie, en dan in het bijzonder de embryonale fase hiervan. De leerstoel Moleculaire Celbiologie, aangesloten bij de faculteit TNW, is de vakgroep die zich bezighoudt met gentranscriptie, –translatie en –regulatie, en probeert in kaart te brengen hoe embryonale stamcellen zich differentieren. Stamcellen zijn cellen die het vermogen bezitten zich te differentieren tot elke type somatische cel of voortplantingscel die in het lichaam te vinden is (dit noemt men ook wel pluripotentie). Er bestaan trouwens ook adulte stamcellen, bijvoorbeeld in het menselijke beenmerg zitten stamcellen waar nieuwe bloedcellen uit gemaakt kunnen worden. Een andere bijzondere eigenschap van stamcellen, naast pluripotentie, is self renewal: dit is een speciale (asymmetrische) celdeling die de stamcel uitvoert, waarbij er een nieuwe stamcel ontstaat en een meer gespecialiseerde cel.29 Begrijpen hoe deze stamcellen zich differentieren en onder welke voorwaarden, heeft een grote potentiele waarde voor de medische wetenschap, omdat met stamcellen bijzonder veel ziekten en aandoeningen behandeld kunnen worden. Het onderzoek moet dus uitwijzen of microRNA’s spelen een grote rol spelen in de regulatie van deze cellen en in het instandhouden van de pluripotentie. De verwachting is dat dit wel het geval is, er zijn namelijk nogal wat genen die uitgeschakeld moeten blijven voor een cel om een stamcel te blijven. Daarom zijn er transcriptiefactoren actief die hiervoor zorgen, dit zijn eiwitten die op de promoter- of enhancer-regionen van een gen gaan zitten om zo de transcriptie van dit gen naar RNA te blokkeren of juist te versnellen. Tevens zijn er andere transcriptiefactoren die juist zorgen voor differentiatie, maar beide groepen zijn (zo is uit onderzoek gebleken) targets voor verschillende miRNA’s. Hier dient dus onderzoek naar gedaan te worden, welke miRNA’s blokkeren de genen die verantwoordelijk zijn voor differentiatie van de cel, of welke

34

miRNA’s blokkeren de genen die verantwoordelijk zijn voor het instandhouden van de pluripotentie?

O N D E R Z O E K S M E T H O D E N

Om te onderzoeken welke genen getarget worden door een bepaald miRNA, maakt men gebruik van genoomdatabases waarin het (menselijke) genoom is opgeslagen, en zoekt men naar (expressieve) genen die een sequentie hebben die gelijk is aan de sequentie van het miRNA. Bij de transcriptie van het miRNA wordt het relevante deel ‘ingevoegd’ in het RISC (RNA-induced silencing complex, zie ook hoofstuk 2), als dit deel gelijk is aan een bepaald gen zal het mRNA (dat door transcriptie van dit gen gevormd wordt) gebonden worden aan het RISC, wat translatie van het mRNA in eiwit tegenhoudt. Afhankelijk van de mate van overeenkomt tussen het miRNA en het gen kan het RISC het mRNA wellicht ook ‘in stukjes hakken’ (mRNA degradation). Bij een van de onderzoeksvoorstel die geschreven is de onderzoeksvraag als volgt gedefinieerd: Does mir-137 play a role in maintaining the pluripotency of ES (Embryonal

Stem) cells by regulating the ZIC3-gene?30

ZIC3 is een van de genen die ‘transcriptionally active’ is, wat wil zeggen dat er veel en vaak transcriptie plaatsvindt op dit gen, en het eiwit dat dit gen codeert is een eiwit dat de andere eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het instandhouden van de pluripotentie kan silencen. Om een onderzoeksvraag als deze met bij behorende hypothese te testen zijn er verschillende methoden beschikbaar, hiervan zullen we er eentje onder de loep nemen.

Western Blot [31]

Bij de WB methode scheidt men verschillende gedenatureerde eiwitten op basis van de massa van het eiwit. In het geval van ZIC3 probeert men dus de hoeveelheid van het gedenatureerde ZIC3-eiwit (het resultaat van expressie van het ZIC3-gen) te bepalen in verschillende groepen stamcellen. Een gedenatureerd eiwit is zijn natuurlijke conformatie (en daarmee zijn functie) kwijtgeraakt. Eerst gebruikt men gel-electroforese om de eiwitten die in de stamcellen zijn gevormd naar massa te scheiden (hierbij breken de stamcellen open en sterven af), en dan wordt het geheel op een membraan aangebracht door het membraan tegen de gel aan te plakken en er electriciteit doorheen te geleiden. Hierdoor komt er een dun laagje van de eiwitten op het membraan terecht waarbij men met antilichamen verschillende eiwitten kan identificeren. Met nog een aantal tussenstappen veroorzaken de antilichamen een kleur-verandering van het eiwit.

35

Figuur 21 – Voorbeeld van een Western Blot.

Om correct aan te tonen dat ZIC3 daadwerkelijk het gen is dat gesilenced wordt door mir-137, zijn er zijn drie verschillende groepen stamcellen, eentje met een normale hoeveelheid van het miRNA, eentje met extra mir-137, en eentje met het mir-137_AS (anti-strand) toegevoegd. Als de hypothese blijkt te kloppen, zal in de eerste groep stamcellen de differentiatie van de stamcellen zijn zoals normaal het geval is, bij de tweede groep zal het toegevoegde mir-137 ervoor zorgen dat er geen ZIC3 wordt gemaakt en zullen de cellen een hogere mate van pluripotentie behouden, en in de derde groep zal het mir-137_AS binden aan het mir-137 (omdat ze elkaars complement zijn) en zal de expressie van ZIC3 dus hoger zijn dan normaal, en zullen de cellen verder differentiëren dan normaal.

D O E L S T E L L I N G E N V A N D E Z E O N D E R Z O E K E N

Op de Universiteit Twente op dit moment nog geen daadwerkelijk onderzoek gedaan naar miRNA’s. Het staat al wel op de agenda, er zijn al onderzoeksvoorstellen geschreven maar die onderzoeken zijn nog niet gestart. Het doel van dergelijk onderzoek voor de universiteit ligt in het betere begrip van de pluripotentie van stamcellen, om precies te weten welke factoren nou verantwoordelijk zijn voor het differentiëren van deze cellen. Als dit proces volledig in kaart is gebracht, kunnen hier allerlei interessante medische toepassingen uit voortvloeien, zoals het gericht kunnen herstellen van bepaalde weefsels bij mensen, waarbij die weefsels zo beschadigd zijn dat het menselijke lichaam het zelf niet meer kan repareren. Nog meer tot de verbeelding sprekende voorbeelden zijn het maken van een nieuw orgaan voor een donor uit zijn eigen DNA. Dit is echter nog verre van bewerkstelligd, er zal nog een hele lange weg afgelegd worden voordat er zoveel inzicht is verkregen in het proces dat dergelijke medische toepassingen mogelijk zullen zijn.

36

6 . C O N C L U S I E Het dogma Hoewel de ontdekkingen van de vorige eeuw veel hebben verklaard op het gebied van genetica en evolutie, was men er nog niet helemaal. De bestaande theorieën zijn niet zozeer onjuist, maar wel incompleet. Niet-coderende, functionele RNA’s waren over het hoofd gezien en voegen veel toe aan het dogma, dat alle functies binnen een orga-nisme op eiwitten afschoof. mircoRNA De recentste ontdekking onder de niet-coderende RNA’s zijn de microRNA’s. We zijn er achter gekomen wat het zijn, wat ze doen en hoe ze werken. Het zijn kleine RNA moleculen die zich binden aan hun doel-messengerRNA en ze op deze manier markeren om ver-nietigd te worden. Op deze manier onderdrukken ze het gen waar dit messengerRNA vandaan kwam, nog na transscriptie. Genregulatie en celdifferentiatie We kunnen concluderen dat de mate van en het tijdstip waarop genen tot expressie komen even zo bepalend is voor een organisme als de genen zelf. Hoewel het lastig is het uiterlijke verschil tussen een chimpansee en een mens uit te drukken in procenten, lijkt het niet op een verschil van “1%”. Dit is namelijk het verschil in (eiwitcoderende) genen. Het is dus zeker niet ondenkbaar dat niet-coderende RNA’s, zoals miRNA’s, actief zijn bij het regelen van genen en bij het differentiëren. Evolutie Samen met belangrijke, alomtegenwoordige genen als de Hox-genen worden miRNA’s teruggevonden in vele organismen. Na vergelijking van genomen en door te kijken naar mutaties kan bepaald worden wanneer welke miRNA’s zijn onstaan. Bijvoorbeeld werd duidelijk dat de allereeste miRNA’s afzonderlijk van elkaar zijn ontstaan in planten en dieren. Ook kan geconcludeerd worden dat miRNA’s de tand des tijds kunnen doorstaan sinds hun ontstaan, honderden mil-joenen jaren geleden en dus van groot belang zijn voor de organismen waarin ze voorkomen. De UT Op de UT zijn nog slechts onderzoeksvoorstellen geschreven. Het uiteindelijke doel dat de UT met deze onderzoeken voor ogen heeft is meer inzicht krijgen in (embryonale) stamcellen, om zo ziektes te genezen of weefsels te repareren die een mens zelf niet repareren kan. Dit is echter nog toekomstmuziek.

37

R E F E R E N T I E S . 1 L.C. Junqueira en J. Carneiro; Functionele histolgie; 10e druk, 2003; Elsevier Gezondheidszorg, Maarssen; Hoofdstuk 3 2 Wikipedia (NL): zoekterm Genoom (14-01-2007) 3 Wikipedia (NL): zoekterm Cel (biologie) (15-01-2007); http://nl.wikipedia.org/wiki/Cel_%28biologie%29 4 Wikipedia (EN): zoekterm Prokaryoot (15-01-2007); http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Prokaryote_cell_diagram.svg 5 Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter; Essential Cell Biology; 2nd Editions, 2004; Garland Scinece New York; Chapters 1,5, 6, 7, 8 en 9. 6 Wikipedia (NL): zoekterm RNA (15-01-2007) 7 C. Zimmer; Evolution; 2003, Arrow Books London; Chapter 4 8 Wikipedia (NL): zoekterm transcripte (17-01-2006) 9 Wikipedia (NL): zoekterm translatie (17-01-2006) 10 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006, RNA interference – gene silencing by double-stranded RNA, http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/ 11 Nelson Lau and David Bartel, Censors of the Genome, Scientific American, Augustus 2003, p 34-41 12 Carl Novina and Phillip Sharp, The RNAi Revolution, Nature, Vol. 430, p 161-164 13 Tingting Du and Philip Zamore, microPrimer: the biogenesis and function of microRNA, Development Vol. 132, p 4645-4652 14 John Mattick, Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-coding RNAs in complex organisms, Bioessays, Vol. 25, p 930-939 15 John Mattick, Hidden Genetic Program of Complex Organims, Scientific American, Oktober 2004, p 60-67 16 Shiv Greval and Songtao Jia, Heterochormatin revisited, Nature Reviews Genetics, January 2007, p 35-46 17 Gary Stix, Hitting the Genetic Off Switch, Scientific American, Oktober 2004, p 98-101 18 Adams, M.D. (2005). Conserved sequences and the evolution of gene regulatory signals. Elsevier,2005. 19 Nutrigene (June, 2002). Over genen en genieten. Retrieved Janaury 13, 2007 from http://nutrigene.4t.com/oratie.pdf 20 Science Daily (March, 2006). Most human-chimp differences due to gene regulation – not genes. Retrieved January 13, 2007, from http://www.sciencedaily.com/releases/2006/03/060309190112.htm

38

21 Enard, W. , Khaitovich, P., Klose, J., Zöllner, S., et.al (2002). Intra- and Interspecific variation in primate gene expression patterns. Science, vol. 296, April 2002 22 Plasterk, R.H.A. (2006). Micro RNAs in Animal Development. Elsevier, maart 2006 23 J.M. Perkel, (2007). MicroRNA evolution put to the test. The Scientist, January 2007 24 Bailey, P. & Newton, G. (2006). Are humans still evolving? The Human Genome. 25 Olivier Voinnet – “Shaping small RNAs in plants by gene duplication” – Nature 36-12, p. 1245-1246, december 2004. 26 Andrea Tanzer, Peter F. Stadler – “Molecular Evolution of a MicroRNA Cluster” – Mol. Biol. (2004), 339, 327-335. 27 Carl Zimmer – Evolutie – Het Spectrum, Utrect, vertaald 2002. 28 Andrea Tanzer, Chris Amemiya, Chang-Bae Kim, Peter F. Stadler – “Evolution of MicroRNAs Located Within Hox Gene Clusters” – Journal of Experimental Zoology (Mol. Dev. Evol) 304B:75-85, 2005 29 W. Kruijer – Sneller herstellen met stamcellen, 2004. Inaugurele rede Universiteit Twente 30 The regulatory role of mir-137 in maintaining pluripotency in embryonal stem cells (zoek uit) 31 http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/method/Westernblot.html