Optimalisatie van diepe hersenstimulatie als behandeling voor … · 2013. 12. 21. · Lien,...

Optimalisatie van diepe hersenstimulatie

als behandeling voor epilepsie:

evaluatie van het aanvalsonderdrukkend

effect van unilaterale versus bilaterale

stimulatie

Justien MAES

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Robrecht Raedt

Begeleider: Bregt Van Nieuwenhuyse

Vakgroep: Inwendige ziekten

Academiejaar 2012-2013

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef

voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren

voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking

tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het

aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

Justien Maes Prof. Dr. Robrecht Raedt

Voorwoord

Via deze weg zou ik graag iedereen bedanken die de voorbije twee jaar heeft bijgedragen tot

het realiseren van deze masterproef.

Eerst en vooral zou ik graag Prof. Paul Boon, Prof. Robrecht Raedt en Prof. Kristl Vonck

bedanken. Jullie maakten het mogelijk dat ik mijn masterproef in het LKEN3 kon uitvoeren.

Nog een extra woord van dank voor Prof. Raedt en Prof. Vonck om mij 2 jaar lang op te

volgen en te ondersteunen.

Een welgemeend dankjewel gaat uit naar mijn begeleider Bregt. Zonder zijn begeleiding en

raadgeving was deze masterproef nooit gelukt. Bedankt om mij kennis te laten maken met de

boeiende wereld van EEG lezen, elektroden maken en omgaan met proefdieren. Ook Lore wil

ik bedanken, om er altijd samen de sfeer in te houden met de vele babbeltjes en mij op te

peppen als het mijn dag niet was. Met twee was het zoveel leuker dan alleen!

De bende van in Gent wil ik natuurlijk ook bedanken. Laura, Tessa, Lisa, Tessa, Yana,

Sherly, Jelle en Giel, we hebben de thesis-stress samen doorstaan! Daarnaast beleefden we al

vijf fantastische jaren. Bedankt voor de vele leuke momenten en toffe herinneringen, er zullen

er ongetwijfeld nog veel volgen eenmaal deze masterproef binnen is!

Een zeer speciaal dankjewel gaat uit naar degenen die me bijstonden met raad en daad tijdens

‘de koffiepauze’. Tante Regine en Feline, echt bedankt om mij af en toe gewoon te laten

uitrazen en steeds opnieuw al mijn verhalen te willen aanhoren. Idem voor nonkel Johan en

Lien, bedankt voor de interesse, het nauwkeurige leeswerk en de handige excel of wordtips!

Hetzelfde kan gezegd worden voor de vriendinnen van in Aalter! Telkens wanneer de

frustraties zich opstapelden en de emmer (nog maar eens) overliep stonden jullie steeds klaar

met een slimme opmerking, grappige tussendoortjes of gewoon deugddoende woorden van

begrip en steun. Ik heb mij enorm opgetrokken aan jullie! Charlot, Nele, Fien en Ilse, ik kan

mij echt geen betere best friends inbeelden!

Mijn allerlaatste en belangrijkste woorden van dank gaan uit naar mijn ouders en broer.

Mama, papa en Fiel, bedankt om mij gedurende deze periode te blijven steunen, ondanks mijn

wisselvallig humeur. Jullie hebben mij de kans gegeven om dit te realiseren en ik ben jullie

daar meer dan dankbaar voor. Ik besef dat ik nooit zou staan waar ik nu sta, zonder jullie.

Dikke merci!

Inhoudstafel

Inhoudstafel

Samenvatting 1

1. Inleiding 2

1.1. Epilepsie 2

1.1.1. Algemeen 2 1.1.2. Classificatie 2 1.1.3. Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) 3 1.1.4. Diagnose 6

1.2. Behandeling 6

1.2.1. Anti-epileptische drugs (AED’s) 6 1.2.2. Resectieve chirurgie 6 1.2.3. Elektrische neurostimulatie 7 1.2.4. Andere 8

1.3. Diepe hersenstimulatie (DBS) 9

1.3.1. Algemeen 9 1.3.2. Klinische studies 9 1.3.3. Dierexperimentele studies 11 1.3.4. Werkingsmechanisme 12

1.4. Proefdiermodel 12

1.4.1. Algemeen 12 1.4.2. Het kindling model 12 1.4.3. De status epilepticus (SE) modellen 13

1.5. Rationale masterproef 15

2. Materialen en methoden 16

2.1. Test experiment NPI-stimulator 16

2.1.1. Algemeen 16 2.1.2. Operatie 17

Nieuwe operatiemethode 17

Klassieke operatiemethode 18

Elektroden 18

2.1.3. EEG opname, stimulatie opstelling en EEG analyse 19 2.1.4. Tresholdbepaling 20 2.1.5. Experimenteel protocol 21 2.1.6. Histologie 23

2.2. Test experiment Diego-stimulator 23

2.2.1. Algemeen 23 2.2.2. Operatie 23 2.2.3. Diego-stimulator 23 2.2.4. Experimenteel protocol 24

2.3. Unilaterale vs. bilaterale stimulatie 24

2.3.1. Algemeen 24 2.3.2. Kainaat injecties 24 2.3.3. Selectie d.m.v. observatie 24 2.3.4. Operatie 25 2.3.5. Tresholdbepaling 25 2.3.6. Experimenteel protocol 26 2.3.7. Statistische methode 26

2.4. Dorsale vs. ventrale stimulatie 27

2.4.1. Algemeen 27 2.4.2. Operatie 27 2.4.3. Tresholdbepaling 27 2.4.4. Experimenteel protocol 28

3. Resultaten 29

3.1. Test experimenten 29

3.1.1. Gebruikte operatiemethode & NPI-stimulator 29 3.1.2. Diego-stimulator 32

3.2. Correlatie observaties met selectie & baseline in het KA-model 32

3.2.1. Observaties KA-model 32 3.2.2. Dorsale vs. ventrale stimulatie 35


3.3.1. Aanvalsfrequentie 37 3.3.2. Aanvalsduur 40

4. Bespreking 43

4.1. Test experimenten 43

4.2. Observaties 44


5. Algemeen besluit 48

6. Referentielijst 49

1

Samenvatting

Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) is de meest refractaire vorm van epilepsie. TLE

wordt gekarakteriseerd door complexe partiële aanvallen met of zonder secundaire

generalisatie vanuit de temporale kwab regio’s. Diepe hersenstimulatie (DBS) kan bij deze

patiënten een potentieel voordeel bieden. Hippocampale DBS, zowel uni als bilateraal, werd

al succesvol toegepast bij patiënten met refractaire epilepsie. Tot nu toe werd het effect van

bilaterale hippocampale DBS nog nooit getest in een diermodel voor epilepsie. In deze studie

werd getracht het potentieel voordeel van bilaterale t.o.v. unilaterale DBS aan te tonen.

Hiervoor werd eerst het gebruik van bilaterale DBS in het LKEN3 geoptimaliseerd. De

werking van twee stimulatoren werd vergeleken, nl. een commercieel beschikbare NPI-

stimulator en een custom made ‘Diego’-stimulator. Verder werden ook twee verschillende

operatiemethoden geëvalueerd. Dit experiment werd gecombineerd met het experiment met

de NPI-stimulator. Negen ratten werden volgens twee verschillende methoden geopereerd, 2

stierven na de operatie. Zeven ratten werden bilateraal of unilateraal gestimuleerd. Gedurende

de baseline werden geen aanvallen te wijten aan een gebruikte operatiemethode geobserveerd.

Tijdens stimulatie met de NPI-stimulator kregen 3/7 ratten aanvallen. Voor de test met de

Diego-stimulator werden vier ratten gebruikt en deze werden zowel bilateraal als unilateraal

gestimuleerd. De ratten die de stimulatie kregen zoals bedoeld was, kregen geen aanvallen.

Voor de uni vs. bilaterale proef werden eerst observaties uitgevoerd over verschillende weken

om de correlatie na te gaan tussen de aanvalsfrequentie tijdens observatie en tijdens EEG-

registratie. Acht ratten werden geselecteerd, geopereerd en bilateraal of unilateraal

gestimuleerd. De selectie werd niet gewijzigd na observatie over verschillende weken. De

dieren met de hoogste aanvalsfrequentie tijdens de observatie hadden ook de hoogste

aanvalsfrequentie gedurende de baseline. De bilaterale groep had een significantie reductie (p-

waarde = 0,004 < 0,025) in aanvalsfrequentie van 0,568 ± 0,063 aanvallen per uur tijdens

baseline naar 0,502 ± 0,076 aanvallen per uur tijdens bilaterale DBS. Twee ratten werden

aanvalsvrij tijdens bilaterale DBS.

Uit deze studie kan besloten worden dat de NPI-stimulator niet compatibel is met de

registratie opstelling. De operatiemethoden zijn wel veilig en de Diego-stimulator lijkt veilig.

Herhaling bij 6 dieren dient dit te bevestigen. De observatie lijkt een eerste betrouwbare maat

voor de aanvalsfrequentie te zijn. Bilaterale stimulatie lijkt te werken, over unilaterale

stimulatie kon geen besluit gevormd worden. Bij herhaling van deze proef met meer dieren

zou het wel mogelijk moeten zijn om te bevestigen en significantie aan te tonen.

2

1. Inleiding

1.1. Epilepsie

1.1.1. Algemeen

Epilepsie is een chronische ziekte van de hersenen die gekarakteriseerd wordt door herhaalde

aanvallen. Deze aanvallen zijn het gevolg van een abnormale buitensporige elektrische

ontlading in een groep van hersencellen. De ontlading kan in verschillende delen van de

hersenen voorkomen (1). Eén enkele aanval duidt niet op epilepsie, tot 10% van de mensen

wereldwijd hebben één aanval tijdens hun leven. Epilepsie wordt pas gediagnosticeerd bij

herhaalde (twee of meer) spontane aanvallen (1, 2).

Wereldwijd lijden ongeveer 50 miljoen mensen aan epilepsie. Bijna 80% van deze mensen

met epilepsie komen uit ontwikkelingsgebieden (1, 3). De gemiddelde jaarlijkse incidentie

varieert aanzienlijk volgens de leeftijd, zijnde 70 per 100 000 bij kinderen en adolescenten, 30

per 100 000 bij volwassenen en 100 per 100 000 bij ouderen (4). Als aanvallen niet kunnen

gecontroleerd worden, kan de patiënt aanzienlijke hinder ondervinden tijdens familiale,

sociale, educationele, en beroepsactiviteiten. Dit kan een diepe impact hebben op de

levenskwaliteit van de patiënt (3).

1.1.2. Classificatie

Epileptische aanvallen worden doorgaans geclassificeerd als focale (partiële) aanvallen en

gegeneraliseerde aanvallen (5). Bij een partiële of focale aanval blijft de verandering van

elektrische activiteit beperkt tot een bepaalde lokalisatie in één hemisfeer van de hersenen (6,

7). De klinische manifestatie van focale aanvallen varieert afhankelijk van de oorsprong van

Figuur 1 Aanduiding locatie temporale lob. Vanuit deze lob ontstaan de epileptische aanvallen voorkomend bij mediale temporale kwab epilepsie (MTLE) (8).

3

de epileptische ontladingen (de epileptische focus), en omvat motorische, sensorische,

autonome en/of psychische symptomen (5). Epileptische aanvallen worden gedefinieerd als

enkelvoudig partieel als er geen verlies is van het bewustzijn, en als complex partieel als er

wel verlies is van het bewustzijn. Deze complex partiële aanvallen worden vaak

psychomotorische of temporaalkwab epileptische aanvallen genoemd omdat ze gepaard gaan

met automatische bewegingen en ze meestal hun oorsprong vinden in één van de temporale

lobben (5, 9, Fig. 1).

Indien de epileptische ontlading zich voldoende snel uitbreidt of generaliseert, en er een

sterke participatie is van het motorisch systeem, resulteert dit in een convulsieve reactie die

typisch zowel tonische (aanhoudende contractie) als clonische (oscillerende contracties en

relaxaties) componenten bevat. Deze primair gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen

worden bij sommigen voorafgegaan door prodromen zoals verhoogde prikkelbaarheid, onrust

of hoofdpijn. De eigenlijke aanval treedt meestal plotseling op, waarbij de patiënt

bewusteloos neervalt. De tonische fase duurt 10 tot 30 seconden en de clonische fase duurt 30

tot 60 seconden (5, 9).

Absences zijn primair gegeneraliseerde aanvallen waarbij er geen sterke recrutering van het

motorisch systeem voorkomt. Deze aanvallen lijken bijna onmiddellijk gegeneraliseerd te

zijn. Ook focale aanvallen kunnen generaliseren, deze worden dan secundair gegeneraliseerde

aanvallen genoemd (5).

Op basis van de oorzaak of etiologie kan epilepsie nog verder ingedeeld worden in

symptomatische, idiopathische en cryptogene epilepsie (5). De focale epilepsieën worden dan

verder geclassificeerd als idiopathische focale epilepsie, waarbij geen onderliggende oorzaak

wordt gevonden anders dan een mogelijke erfelijke voorbeschiktheid, of als symptomatische

focale epilepsie (6, 10). De symptomatische focale epilepsieën worden verder onderverdeeld

volgens de locatie van de epileptogene zone (10). In het meest recente International League

Against Epilepsy (ILAE) Classification Commission verslag wordt gesuggereerd dat de

termen idiopathisch, symptomatisch en cryptogeen beter vervangen worden door

respectievelijk genetisch, structureel/metabool en onbekend (6).

1.1.3. Mediale temporale kwab epilepsie (TLE)

Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) is het meest voorkomende type van symptomatische

focale epilepsie en wordt gekarakteriseerd door complexe partiële aanvallen met of zonder

secundaire generalisatie vanuit de temporale kwab regio’s (11). De aanvallen worden typisch

4

vergezeld van bewegingsloos staren en orofaciale automatismen, dit zijn repetitieve acties

zoals kauwen, met de lippen smakken of slikken (5, 12). In de meeste gevallen bestaat de

ontwikkeling van TLE uit drie fasen. Een eerste fase is een initieel precipiterend trauma van

de hersenen zoals koortsstuipen, hoofdtrauma, status epilepticus (SE), infectie of een beroerte

die primaire structurele veranderingen initiëren. De tweede fase is een periode van 5-10 jaar

waarin moleculaire en/of structurele wijzigingen plaatsvinden en de patiënten vrij zijn van

symptomen of complicaties. Deze latente periode, geassocieerd met epileptogenese, gaat over

in een derde fase eenmaal bij de patiënt spontane aanvallen optreden (11, 13). De latente

periode definieert de duur van epileptogenese niet. De epileptogenese is een continue of

progressieve functie van de tijd (14, Fig. 2).

Figuur 2 Grafische weergave van het tijdsverloop van epileptogenese. De aanvalsprobabiliteit of frequentie neemt continu toe. Dit wordt voorgesteld als een sigmoïde curve in functie van de tijd. Na het hersentrauma start een graduele toename in aanvalsfrequentie, gevolgd door een periode met een exponentiële toename. Ten slotte volgt een graduele ontwikkeling van een steady state of plateaufase (14).

Er is aanzienlijk bewijs dat de hippocampale formatie betrokken is in de initiatie van de

epileptische aanval bij TLE-patiënten (15). Epileptische activiteit bij TLE omvat een netwerk

van de temporale lobben en het limbisch systeem. In dit netwerk zijn volgende structuren

opgenomen: de hippocampus, de amygdala, de entorhinale cortex, de laterale temporale

neocortex, de mediale thalamus en de inferieure frontale lobben (16).

De hippocampus is een structuur gelegen langs de dorsomediale zijde van de twee temporale

lobben, posterieur van de amygdala. De hippocampale formatie kan onderverdeeld worden in

drie regio’s: de gyrus dentatus, hoorn van Ammon (cornu Ammonis, (CA)) en het subiculum.

De hoorn van Ammon wordt verder onderverdeeld in subregio’s: CA1, CA2, CA3 en CA4

(Fig. 3). Deze regio’s worden gedifferentieerd door variaties in de grootte van de pyramidale

cellen, dit zijn de primaire neuronen in de hoorn van Ammon. De hippocampus ontvangt

5

neocorticale, subcorticale, limbische en hersenstam afferenten die via de tractus perforans

van de entorhinale cortex naar de gyrus dentatus lopen. Van hieruit projecteren de axonen van

de gyrus dentatus cellen (mossy fibers) naar de pyramidale neuronen in de CA3 regio (17).

Figuur 3 Afbeelding van de hippocampus van een rat met aanduiding van de CA regio’s (CA1, CA2 en CA3), het subiculum en de gyrus dentatus (18).

De meest voorkomende histopathologische bevinding bij TLE is atrofie van de hippocampus

geassocieerd met neuronaal verlies in alle regio’s van de hippocampus (11). De combinatie

van neuronaal verlies en verdikking van gliaweefsel (gliose), wordt hippocampale sclerose

(HS) genoemd (11, 19). De hippocampus wordt aangeduid als de voornaamste bron van de

oorsprong van de epileptische aanval en van het onderhouden van de aanval (20). Bovenop

deze degeneratieve veranderingen toont de epileptogene hippocampus neuronale

reorganisatie. Dit is bewezen door metingen van axonal sprouting en vorming van nieuwe

synapsen (synaptogenese) (5, Fig. 4).

Figuur 4 Schematische voorstelling van factoren die leiden tot epileptogenese. Na het primaire trauma volgt een periode waarin structurele en moleculaire veranderingen optreden zoals gliose, neuronale celdood en mossy fiber sprouting. Ook de fysiologische veranderingen met infammatoire cytokines, adenosine homeostase en ionkanaal regulatie spelen een belangrijke rol in het ontstaan van epileptische activiteit (13).

6

1.1.4. Diagnose

Een epileptische aanval wordt gedefinieerd als een overmatige losbarsting van abnormale

synchrone neuronale activiteit. Dit resulteert in klinische manifestaties die plots opkomen en

doorgaans van korte duur zijn. Complex partiële aanvallen, zoals deze die voorkomen bij

TLE, hebben een karakteristieke klinische presentatie. Op basis van deze klinische

symptomen kan reeds een eerste diagnose gesteld worden. Om verder te bepalen welke zone

in de hersenen verantwoordelijk is voor de generatie van de aanvallen wordt een elektro-

encefalografie (EEG) meting uitgevoerd. Hierbij worden verschillende scalp elektroden op het

hoofd geplaatst en wordt de hersenactiviteit gemeten. Dit wordt vaak gevolgd door een

magnetic resonance imaging (MRI) opname om structurele defecten te onderzoeken (21).

1.2. Behandeling

1.2.1. Anti-epileptische drugs (AED’s)

Na het stellen van een correcte diagnose wordt bij patiënten met epilepsie een chronische

therapie met anti-epileptische drugs (AEDs) gestart (9). AEDs zijn structureel en functioneel

divers (22). De keuze van het anti-epilepticum is afhankelijk van de aard van de aanvallen en

van de eventuele bijwerkingen bij de patiënt (9).

Chronische therapie met AEDs is gebaseerd op de modulatie van de corticale

inhibitie/excitatie balans om epileptische aanvallen te voorkomen (3). Anti-epileptica werken

op basis van membraanstabilisatie, gereduceerde neurotransmittervrijstelling of verhoogde

gamma-aminoboterzuur (GABA)-gemedieerde inhibitie.

Membraanstabilisatoren reduceren de exciteerbaarheid door Na2+-kanalen te blokkeren (bv.

carbamazepine) of door K+-kanalen te activeren (bv. Retigabine) (22, 23). De inhibitoren van

neurotransmittervrijstelling werken door Ca2+-kanalen te blokkeren (bv. Gabapentine) en de

GABAmimetica werken in op het GABA metabolisme (bv. Valproaat) of werken direct in op

de GABA-receptoren (bv. benzodiazepines) (22). Bij een primair gegeneraliseerde epilepsie

wordt meestal natriumvalproaat (Depakine) gegeven. Bij focale epilepsie en symptomatische

tonisch-clonische aanvallen is carbamazepine (Tegretol) de eerste keus (9).

1.2.2. Resectieve chirurgie

Ondanks chronische therapie met AEDs zal tot 30% van de patiënten met epilepsie blijvend

last hebben van aanvallen. Deze patiënten hebben refractaire epilepsie (3, 24, 25). TLE is de

meest refractaire vorm van epilepsie (15).

7

Een deel van deze patiënten zal kandidaat zijn voor resectieve chirurgie. Dit is mogelijk als de

ictale zone waar de aanval begint (ictal onset zone) kan geïdentificeerd worden. Deze zone is

verantwoordelijk voor de generatie van de aanvallen (25). Dit gebeurt tijdens de preoperatieve

evaluatie. Deze evaluatie maakt gebruik van klinische, neuropsychologische,

elektrofysiologische, en radiologische gegevens om te bepalen of aanvallen hun oorsprong

vinden in een focale zone. Bepaling van de epileptogene zone gebeurt bij ongeveer 85% van

de patiënten op een niet-invasieve manier. De overige 15% van de patiënten vereisen

intracraniële elektroden voor deze bepaling. Interictale EEG opname toont vaak epileptische

activiteit aan bij patiënten met refractaire epilepsie. Specifieke interictale EEG patronen

kunnen aanwijzingen geven omtrent de pathologie. Een MRI opname kan structurele defecten

aan het licht brengen en eventueel een duidelijke unilaterale focus aantonen. Het uitvoeren

van een langdurige ictale video EEG opname speelt een essentiële rol in de preoperatieve

evaluatie. Een optimale sessie zou verschillende typische aanvallen van de patiënt moeten

vastleggen. Op deze manier laat de video-opname betere karakterisatie toe van de

aanvalssemiologie en wordt correlatie met het ictaal EEG vergemakkelijkt (21).

Als de aanvallen multifocaal (meerdere foci), bilateraal (foci in beide hersenhelften) of

gegeneraliseerd zijn, zijn de patiënten geen geschikte kandidaten voor resectieve chirurgie

aangezien de ‘ictal onset zone’ niet kan gedefinieerd worden. Als de aanvallen hun oorsprong

hebben in de eloquente cortex, dit is de cortex die instaat voor taalkennis en de verwerking

van sensorische stimuli, zijn dit ook geen geschikte kandidaten (3, 25). Bij patiënten met

epilepsie die resistent zijn voor behandeling met AEDs en niet geschikt voor resectieve

chirurgie kan elektrische neurostimulatie een potentieel voordeel hebben (3).

1.2.3. Elektrische neurostimulatie

Neurostimulatie wordt gedefinieerd als directe toediening van elektrische pulsen aan

zenuwweefsel om zo een pathologisch substraat te moduleren en een therapeutisch effect te

bereiken (24). Enkele belangrijke factoren hebben geleid tot de ontwikkeling van

neurostimulatie. Ten eerste is resectieve chirurgie irreversibel en kan het nadelige effecten

zoals geheugenverlies en problemen met benaming veroorzaken. Ten tweede is een

aanzienlijk deel van patiënten niet vrij van epileptische aanvallen na het ondergaan van

resectieve chirurgie (26). Het doel van deze behandeling is de kans op het voorkomen en

verspreiden van aanvallen te reduceren (3). Twee grote stimulatie strategieën kunnen

nagestreefd worden. De ene aanpak is om zich te richten tot cruciale structuren van het

centraal zenuwstelsel waarvan wordt verondersteld dat ze een pacemaker, trigger of gating rol

8

in het epileptogene netwerk hebben. De andere aanpak is om potentiële interferentie met de

‘ictal onset zone’ te evalueren (24).

Elektrische stimulatie kan dus op verschillende locaties in het zenuwstelsel toegediend

worden. De nervus vagus stimulator stimuleert de Xe craniale zenuw in de hals. De

responsieve neurostimulator (RNS) dient stimulatie toe in de regio van de aanvalsfocus, met

de bedoeling de verspreiding van de gesynchroniseerde ictale ontlading te proberen te

verbreken. Diepe hersenstimulatie (DBS) richt zich op specifieke diepe grijze stof structuren

of vezelbanen. Open-loop methoden zoals nervus vagus stimulatie (VNS) en DBS geven

chronische stimulatie. RNS is een closed-loop systeem dat enkel stimuleert als er een

werkelijke aanval gedetecteerd wordt door het systeem. Op het huidige ogenblik, wordt enkel

VNS toegepast voor de behandeling van refractaire partiële epilepsie. Alhoewel DBS

goedgekeurd is voor de behandeling van Parkinson, is het nog niet goedgekeurd voor gebruik

bij epilepsie. RNS is tot nu toe ook nog niet goedgekeurd. Tenslotte, repetitieve transcraniële

magnetische stimulatie (rTMS) wordt ook nog onderzocht voor de behandeling van epilepsie

(27).

1.2.4. Andere

Een alternatieve behandeling voor refractaire epilepsie is het ketogeen dieet. Dit is een

neuroprotectief dieet dat een hoge hoeveelheid vetten, voldoende proteïnen en weinig

koolhydraten bevat. Het bootst de metabole effecten van vasten of uithongering na. Als de

voorraad aan glucose niet voldoende is, worden ketonlichaampjes geproduceerd vanuit het

vetzuurmetabolisme en gebruikt als hoofdenergiebron in de hersenen. Deze ketonlichaampjes

hebben een anticonvulsief effect. Traditioneel wordt het dieet gebruikt bij kinderen, alhoewel

er ook bewijs is van effectiviteit bij volwassenen. Tot 50% van de kinderen zal ten minste

50% reductie ondervinden in aanvallen. Eén derde kan 90% aanvalsreductie bereiken en 10%

zal uiteindelijk aanvalsvrij en zelfs medicatievrij worden. De voorbije jaren zijn er meerdere

alternatieve ketogene diëten ontwikkeld. Dit met het oog op het gemakkelijker en smakelijker

maken van de behandeling, de bijwerkingen te verminderen en eventueel de behandeling aan

een bredere groep van refractaire epilepsie-patiënten te kunnen aanbieden. Inclusief tieners en

volwassenen voor wie het klassieke ketogeen dieet moeilijk te volgen is. Voor deze groepen

wordt het Modified Atkins Diet (MAD) of het Low Glycaemic Index Treatment (LGIT) dieet

aanbevolen, deze kunnen individueel aangepast worden aan de noden van de patiënt (28).

9

1.3. Diepe hersenstimulatie (DBS)

1.3.1. Algemeen

‘Deep brain stimulation’, DBS is directe stimulatie van specifieke hersenregio’s. Het gaat om

intracraniële implantatie van één of meer elektroden in een specifieke hersenregio (25). Bij de

mens worden via een geïmplanteerde pulsgenerator en een subcutane geleider elektrische

pulsen verzonden naar specifieke delen van de hersenen om de neuronale activiteit van de

doelwitregio te moduleren (29).

Er is aanzienlijk bewijs dat de hippocampale formatie betrokken is in de initiatie van een

epileptische aanval bij TLE-patiënten. DBS van het limbisch systeem is dan ook al met succes

toegepast om refractaire TLE te behandelen. Meer specifiek werd hippocampale DBS reeds

succesvol toegepast in de behandeling van refractaire TLE (15).

1.3.2. Klinische studies

Velasco en collega’s waren de eersten om te ontdekken dat unilaterale DBS, geleverd via

diepte-elektroden in de temporale regio aan één zijde, interictale en ictale epileptische

activiteit verminderde bij refractaire TLE patiënten (30).

Vonck en collega’s voerden een studie uit bij 3 patiënten met een normaal MRI, maar met

elektroklinische bevindingen die overeenkwamen met TLE. Alle patiënten ondergingen

unilaterale stimulatie (in linker of rechterhersenhelft) en hadden een reductie in

aanvalsfrequentie van ten minste 50%. Deze studie toont de mogelijkheid aan van continue

EEG-meting en DBS in mesiale temporale lob structuren (MTL) gebruik makend van DBS

elektroden (25, 26).

Dezelfde groep bestudeerde 12 patiënten met refractaire TLE waarbij intracraniële EEG-

meting vereist was door normaal MRI of niet overeenstemmende resultaten tijdens de niet-

invasieve preoperatieve evaluatie. Patiënten met een bilaterale focus werden bilateraal

gestimuleerd (in beide hersenhelften) en patiënten met een unilaterale focus werden

unilateraal gestimuleerd. Twee van de 12 patiënten met de minste respons ondergingen

vervolgens een resectie van de ictale zone. Na een gemiddelde opvolgtijd van 31 maanden

werd één patiënt volledig aanvalsvrij, één patiënt had een aanvalsreductie van meer dan 90%,

5 patiënten een aanvalsreductie van meer dan 50%, twee patiënten een aanvalsreductie van

30-49% en één patiënt reageerde niet op de stimulatie. Deze studie toont de mogelijke

efficiëntie van langdurige DBS in MTL structuren, bij zowel patiënten met schade als

patiënten zonder schade aan de hippocampus (24, 26).

10

Velasco en collega’s voerden een tweede studie uit bij 9 patiënten om de veiligheid en

efficiëntie van hippocampale stimulatie te evalueren. Patiënten met een bilaterale focus

werden net zoals in de studie van Boon en collega’s bilateraal gestimuleerd en patiënten met

een unilaterale focus werden unilateraal gestimuleerd. Er werd geobserveerd dat

hippocampale stimulatie minder efficiënt was bij patiënten met hippocampale sclerose. De 4

patiënten met zichtbare hippocampale sclerose op MRI hadden slechts een aanvalsreductie

van 50% tot 70% t.o.v. een 95% aanvalsreductie bij patiënten met een normaal MRI. Er werd

besloten dat hippocampale stimulatie een alternatieve therapie is voor patiënten met TLE met

een normaal MRI en die geen kandidaat zijn voor resectieve chirurgie (26, 31).

Het effect van continue bilaterale elektrische stimulatie van de hippocampus op aanvallen en

geheugen werd nagegaan door McLachlan en collega’s. Er werden bij twee patiënten twee

elektroden met vier contacten elk geïmplanteerd in de hippocampus. Simultane stimulatie van

alle elektrode contacten stond aan of uit gedurende elk interval van 3 maanden. De

aanvalsfrequentie tijdens stimulatie reduceerde bij beide patiënten met 33%. Drie maanden

nadat de stimulatie werd afgezet bleef de aanvalsfrequentie lager dan 25% vooraleer terug te

keren naar het baseline niveau. Er werden geen veranderingen in de objectieve of subjectieve

metingen van het geheugen gedetecteerd. In deze studie is de algemene impact niet zo robuust

zoals gerapporteerd werd in vorige studies (32).

Een recente klinische studie van Boëx en collega’s evalueerde de efficiëntie en de effecten

van wijzigingen in parameters van chronische amygdala-hippocampale DBS (AH-DBS) bij

patiënten met TLE. Acht patiënten ontvingen chronische AH-DBS: twee patiënten met HS en

6 patiënten met een normaal MRI. In deze studie werd bij alle patiënten unilaterale stimulatie

toegepast. De twee patiënten met HS verkregen een reductie van 65-75% in

aanvalsfrequentie. Twee van de zes patiënten met normaal MRI werden aanvalsvrij, één

hiervan zonder stimulatie, wat een microlesioneel effect suggereert. Twee patiënten hadden

een reductie in aanvalsfrequentie van 65-70% en de overige twee toonden geen significante

aanvalsreductie. Het merendeel van de TLE patiënten ondervindt dus op lange termijn een

doeltreffende invloed van AH-DBS. Er werd geconcludeerd dat het een waardevolle

behandelingsoptie is voor patiënten met refractaire epilepsie die geen kandidaat zijn voor

resectieve chirurgie (33).

Tenslotte volgden Vonck en collega’s hun 11 patiënten die uni- of bilaterale MTL DBS

ondergingen op gedurende een gemiddelde periode van 8,5 jaar. Dit demonstreerde bij de

meerderheid van de patiënten het voordelige effect van MTL DBS. Drie patiënten zijn

11

aanvalsvrij voor reeds meer dan drie jaar, drie patiënten hebben een aanvalsreductie van meer

dan 90% en drie andere hebben een gemiddelde respons met een aanvalsreductie van 40% -

70%. Twee patiënten hadden slechts een aanvalsreductie van 30%. Bij 3 van de 5 patiënten

was het overschakelen van unilaterale naar bilaterale MTL DBS succesvol. Dit kan wijzen op

een grotere effectiviteit van bilaterale MTL DBS bij de behandeling van unilaterale MTL

epilepsie. Er werd ook besloten dat het overschakelen op stimulatie volgens een dag-nacht

cyclus geen invloed heeft op de controle van de aanvallen. Dit kan dus gebruikt worden om de

levensduur van de batterij te verlengen (34).

1.3.3. Dierexperimentele studies

De eerste dierexperimentele studies vonden dat low frequency stimulation (LFS) in de

hippocampus resulteerde in aanvalsinhibitie zowel op korte als lange termijn bij volledig

gekindlede ratten. De meer recente studies over LFS in de hippocampus en amygdala zijn

allemaal beperkt tot het kindling model. De eerste studie die gebruik maakt van een spontaan

model is deze van Bragin en collega’s. Het effect van 200 Hz HFS op de snelheid van

interictale pieken en spontane aanvallen werd onderzocht bij kainaat (KA)-behandelde dieren.

Er werd geen significante onderdrukking gevonden van de interictale ‘events’ en spontane

aanvallen (35, 36).

Wyckhuys en collega’s onderzochten het effect van HFS (130 Hz) bij het kindling model. Er

werd geconcludeerd dat continue HFS in de hippocampus van epileptische ratten de

eigenschappen van de uitgelokte afterdischarge (AD) moduleert op een zodanige manier dat

dit zich uit in een reductie van de exciteerbaarheid van de doeltwitregio (37). Dezelfde groep

onderzocht het mechanisme en stimulatieprotocol van hippocampale DBS verder. Een

vergelijking werd gemaakt van HFS DBS en LFS op AD bij gekindlede ratten. Er werd

besloten dat HFS meer effectief is dan LFS in het beïnvloeden van de exciteerbaarheid van

epileptische ratten. Dit werd gereflecteerd in een hogere AD drempelwaarde en langere AD

latentie tijdens toediening van de stimulatie. Hieruit werd de hypothese opgesteld dat DBS

waarschijnlijk de intrinsieke exciteerbaarheid van de gestimuleerde regio beïnvloedt door te

interfereren met de intrinsieke homeostatische regulatie van de exciteerbaarheid. Een andere

mogelijkheid is dat DBS interfereert met de generatie en propagatie van synchrone activiteit.

Volgens deze hypothese zou interferentie met Poisson distributed stimulation (PDS) meer

effectief zijn dan deze met HFS. HFS heeft een vast tijdsinterval tussen twee pulsen, PDS

heeft dit niet (Fig. 5). Bij PDS worden de pulsen gegeven met een tijdsinterval volgens een

Poissonverdeling, hierdoor ontstaat een niet-gesynchroniseerde stimulatie. Er werd

12

aangetoond dat bij PDS eenzelfde aantal pulsen met een significant lagere intensiteit tot een

lichtjes grotere groep van responders leidt (38).

Figuur 5 High frequency stimulation (HFS) met een vast tijdsinterval tussen twee pulsen en Poisson distributed stimulation (PDS) met een tijdsinterval volgens een Poissonverdeling (15).

1.3.4. Werkingsmechanisme

Als mogelijk werkingsmechanisme van DBS wordt gesuggereerd dat er een rol is voor

homeostatische schaling van membraanexciteerbaarheid en/of synaptische kracht (15). Dit is

een mechanisme van homeostatische plasticiteit waarbij neuronen selectief de grootte van hun

functionele intrinsieke stromen (exciteerbaarheid) aanpassen als reactie op veranderingen in

synaptische activiteit. Dit gebeurt op een relatieve korte termijn tijdsschaal (39). Neuronen

gaan ook hun synaptische sterkte regelen als respons op het algemene niveau van synaptische

activiteit. Hoge synaptische activiteit, zoals geïnduceerd bij toepassing van DBS zal dan

leiden tot downregulatie van neuronale activiteit (15).

1.4. Proefdiermodel

1.4.1. Algemeen

Een optimaal diermodel voor epilepsie heeft als kenmerken dat er een laag sterftecijfer is en

een hoog percentage van de dieren terugkerende spontane aanvallen vertoont. Het diermodel

moet ook de gedrags-, elektrografische en anatomische karakteristieke eigenschappen van

humane TLE vertonen (40). Bij knaagdieren worden de spontane aanvallen uitgelokt door

herseninfarct, traumatische hersenschade, koortsstuipen, kindling en status epilepticus (SE)

(11). De twee meest gebruikte diermodellen voor TLE zijn het kindling model en het SE-

model (5).

1.4.2. Het kindling model

In het kindling model triggert herhaalde stimulatie in de amygdala of hippocampus

progressief sterkere epileptische aanvallen. De voordelen van het kindling model zijn

13

duidelijk. Nauwkeurige focale activatie van de doelwit hersenregio is mogelijk, ontwikkeling

van chronische epileptogenese wordt betrouwbaar geobserveerd, het patroon van verspreiding

en generalisatie van de aanval kan gemakkelijk gemonitord worden, en interictale, ictale en

postictale perioden zijn gemakkelijk te manipuleren. Niettemin heeft het kindling model ook

nadelen. De spontane aanvallen ontwikkelen niet tenzij een zeer groot aantal van kindling

stimulaties wordt toegediend (overkindling) (5)

1.4.3. De status epilepticus (SE) modellen

SE is het precipiterende trauma dat histopathologische veranderingen in temporale kwab

regio’s en epileptogenese initieert, resulterend in het optreden van spontane epileptische

aanvallen. SE kan geïnduceerd worden door elektrische of chemische (kainaat (KA),

pilocarpine) stimulatie van de verschillende hersenregio’s. Pilocarpine (PILO) is een

muscarine agonist en stimuleert net zoals acetylcholine de muscarine receptoren (41). KA is

een structuuranaloog van glutamaat en wordt geïsoleerd van het zeewier Digenea simplex. Het

wordt systemisch (i.p. of i.v.) of intracerebraal geïnjecteerd, dit is ook het geval bij

pilocarpine (11).

Multipele injecties van een lage dosis KA leiden tot de ontwikkeling van een chronische

epileptische toestand. Deze wordt gekarakteriseerd door een latente periode voor het optreden

van de chronisch motorische aanvallen en een hoge maar variabele aanvalsfrequentie. Deze

neemt initieel toe met de tijd na de eerste chronische aanval en bereikt later een plateaufase.

De aanvallen komen in het begin geclusterd voor. Eenmaal de aanvalsfrequentie toeneemt en

de plateaufase bereikt wordt verdwijnt de clustering omdat de clusters niet meer kunnen

onderscheiden worden (14, 40). Tenslotte zullen de ratten spontane, gegeneraliseerde tonisch-

clonische aanvallen vertonen die sterk gelijken op deze geobserveerd bij patiënten met

refractaire TLE (38).

In tegenstelling tot kindling zijn deze SE-modellen gemakkelijker te produceren, maar meer

variabel in hun expressie. Gebruikmakend van deze modellen, is het mogelijk om een echte

epileptische rat te creëren. Daarnaast zijn de morfologische veranderingen die voorkomen in

de hippocampus volgend op SE vaak zeer vergelijkbaar met deze gezien in humane mesiale

TLE, alhoewel de schade in het diermodel ernstiger en meer verspreid kan zijn. De nadelen

van SE-modellen zijn dat de status moeilijk kan te controleren zijn (15% van de dieren sterft

tijdens de status fase met het protocol van Hellier), de expressie van de spontane aanvallen

kan onvoorspelbaar zijn, en de neurale schade kan uitgebreid zijn (5, 40).

14

Figuur 6 De ontwikkeling van epileptogenese en het voorkomen van herhaalde spontane aanvallen in het kindling en status epilepticus (SE) model. Pijlen wijzen op elektrische stimulatie in het kindling model of de toediening van chemische agentia zoals kainaat en pilocarpine in het SE model. In het kindling model triggert herhaalde stimulatie progressief sterkere responsen. Als stimulatie stopt als het dier het standaard stage 5 criteria bereikt zullen spontane aanvallen niet ontwikkelen. Als kindling stimulaties verdergaan zullen spontane aanvallen typisch voorkomen na de inductie van honderden uitgelokte aanvallen (over-kindling). In het SE model is er typisch een SE die eindigt binnen enkele uren. Spontane aanvallen treden op na een latente periode die weken of maanden kan duren (5).

15

1.5. Rationale masterproef

Ondanks de veelbelovende resultaten van hippocampale DBS op suppressie van epileptische

activiteit in zowel experimentele diermodellen als TLE patiënten, zijn de optimale

stimulatieparameters nog niet bepaald. Dit belemmert het therapeutisch potentieel van

hippocampale DBS. Ook het potentieel voordeel van bilaterale DBS t.o.v. unilaterale DBS is

nog niet duidelijk aangetoond. Om meer duidelijkheid te krijgen rond deze bovenstaande

zaken werden verschillende experimenten uitgevoerd.

Deze masterproef bestaat uit drie verschillende luiken. Enerzijds wordt een test-proef

uitgevoerd. Dit om het gebruik van DBS te optimaliseren binnen het LKEN3. Hierin wordt

nagegaan welke invloed een gebruikte operatiemethode heeft op de fysiologische outcome,

m.a.w. kunnen DBS elektroden geïmplanteerd worden, zonder fysiologische veranderingen

teweeg te brengen in de hersenen van gezonde proefdieren? Gezonde ratten worden hiervoor

via twee verschillende methoden geopereerd. Verder wordt nog de veiligheid van bilaterale

ongecorreleerde Poisson verdeelde stimulatie met een commercieel beschikbare NPI-

stimulator en custom made “Diego-stimulator” geëvalueerd. Hier wordt nagegaan of

stimulatie met de stimulator in kwestie geen epileptische processen teweegbrengt in de

hersenen van gezonde proefdieren.

In een tweede luik wordt de correlatie nagegaan van de uitgevoerde observaties met de

uiteindelijke selectie van de ratten in het KA-model. Hiervoor worden observaties uitgevoerd

verspreid over verschillende weken. Wordt de selectie van de KA-ratten aangepast na het

uitvoeren van deze observaties? Of is observatie op verschillende dagen in één week, m.a.w. 2

of 3 opeenvolgende dagen, voldoende voor deze selectie? Na de selectie wordt het EEG

opgenomen van deze geselecteerde ratten. Op deze manier is het mogelijk om na te gaan of de

aanvalsfrequentie van de ratten in het KA-model effectief nog toeneemt in de tijd. Verder

wordt a.d.h.v. deze observaties en de daaropvolgende baseline nog nagegaan of de ratten die

tijdens de observatie de hoogste aanvalsfrequentie hadden ook effectief de meeste aanvallen

vertonen op het EEG.

In het derde luik wordt het aanvalsonderdrukkend effect van unilaterale t.o.v. bilaterale

stimulatie geëvalueerd. Dit om de eerder bekomen positieve resultaten van unilaterale

stimulatie in het LKEN3 te bevestigen en een eventueel potentieel voordeel van bilaterale

stimulatie zoals beschreven door Vonck en collega’s aan te tonen in een diermodel (15, 34,

38).

16

2. Materialen en methoden

2.1. Test experiment NPI-stimulator

2.1.1. Algemeen

In dit onderzoek wordt nagegaan welke invloed de gebruikte operatiemethode heeft op de

fysiologische outcome; m.a.w. kunnen DBS elektroden geïmplanteerd worden, zonder nefaste

fysiologische veranderingen teweeg te brengen in de hersenen van gezonde proefdieren?

Twee verschillende operatiemethoden worden uitgevoerd. Vier ratten worden geopereerd via

een nieuwe operatiemethode en vier ratten volgens de klassieke operatiemethode, gebruikt in

LKEN3. Tijdens de nieuwe operatiemethode worden quadripolaire elektroden gebruikt

waarvan de draden gedraaid zijn, dit is niet het geval bij de klassieke operatie. Een tweede

verschil tussen beide methoden is dat bij de nieuwe methode UV-hardend tandheelkundig

cement gebruikt wordt, dit warmt niet op t.o.v. het tandheelkundig acrylcement gebruikt bij de

klassieke operatiemethode. Er wordt gekeken of de ratten aanvallen hebben tijdens de

baseline.

Figuur 7 Positie boorgaten en quadripolaire diepte-elektroden. Er worden in totaal 10 kleine ingangsplaatsen geboord; zes hiervan zijn bedoeld voor de positionering van ankerschroeven, één voor de epidurale elektrode, één voor de referentie elektrode, en twee voor diepte-elektroden. De diepte-elektroden worden stereotactisch geïmplanteerd in de hippocampus (AP -5.8, DV -7.4, ML 5.1 mm t.o.v. Bregma).

Verder wordt nog de veiligheid van bilaterale ongecorreleerde Poisson verdeelde stimulatie

met een commercieel beschikbare NPI-stimulator geëvalueerd. Hier wordt nagegaan of

stimulatie met de stimulator in kwestie geen epileptische processen teweegbrengt in de

hersenen van gezonde proefdieren.

In het onderzoek worden 6 Sprague-Dawley ratten (operatiegewicht 450-550 g) gebruikt en 1

Wistar rat (580 g; Taconic, Denemarken). De dieren worden verzorgd volgens de richtlijnen

17

goedgekeurd door het Europees Ethisch Comité (decreet 86/609/EEC). De dieren worden

gehouden in omgevingsgecontroleerde condities (12 u normale licht/donker cycli; 20-23°C en

50% relatieve vochtigheid) met voedsel en water ad libitum.

2.1.2. Operatie

Nieuwe operatiemethode

De ratten worden verdoofd met een mix van isoflurane (5% voor inductie, 2% tijdens

implantatie) en medisch O2. Na blootstelling van de schedel worden 10 kleine ingangsplaatsen

geboord; zes hiervan zijn bedoeld voor de positionering van ankerschroeven, één voor de

epidurale elektrode, één voor de referentie elektrode, en twee voor diepte-elektroden (Fig. 7,

8A). Een zelfgemaakte epidurale elektrode wordt aan de rechterzijde van de schedel ter

hoogte van de frontale cortex geplaatst. Een gelijkaardig gemaakte referentie elektrode wordt

geplaatst aan de rechterzijde van de schedel, posterieur van de sutura lambdoidea (Fig. 8B).

De diepte-elektroden worden stereotactisch geïmplanteerd in de hippocampus (AP -5.8, DV -

7.4, ML 5.1 mm t.o.v. Bregma) (42, Fig. 8C, D). De elektroden worden naar een connector

geleid die gefixeerd wordt aan de schroeven en de schedel met een UV-hardend

tandheelkundig cement. Op deze manier wordt een hoedje gemaakt (Fig. 8E, F).

Figuur 8 Nieuwe operatiemethode. Boorplaatsen en lokalisatie Bregma (A), plaatsing ankerschroeven en scalpelektroden (B), plaatsing rechter diepte elektrode (C), fixatie met UV-hardend tandheelkundig cement (D) en hoedje (E,F).

A B C

D E F

18

Klassieke operatiemethode

De ratten worden verdoofd met een mix van isoflurane (5% voor inductie, 2% tijdens

implantatie) en medisch O2. Na blootstelling van de schedel (Fig. 9A) worden 10 kleine

ingangsplaatsen geboord; zes hiervan zijn bedoeld voor de positionering van ankerschroeven,

één voor de epidurale elektrode, één voor de referentie elektrode, en twee voor diepte-

elektroden. Een zelfgemaakte epidurale elektrode wordt aan de rechterzijde van de schedel ter

hoogte van de frontale cortex geplaatst. Een gelijkaardig gemaakte referentie elektrode wordt

geplaatst aan de rechterzijde van de schedel posterieur van de sutura lambdoidea.

De diepte-elektroden worden stereotactisch geïmplanteerd in de hippocampus (AP -5.8, DV -

7.4, ML 5.1 mm t.o.v. Bregma) (42, Fig. 9B). De elektroden worden naar een connector

geleid die gefixeerd wordt aan de schroeven en de schedel met tandheelkundig acrylcement

(Fig. 9C).

Figuur 9 Klassieke operatie. Lokalisatie Bregma (A), Plaatsing linker diepte elektrode (B), hoedje (C).

Na de operaties krijgen alle ratten ten minste negen dagen rust in het animalarium. Waarna ze

verplaatst worden naar de EEG-registratie/stimulatie kooien.

Elektroden

Tijdens de operaties worden twee soorten elektroden geplaatst, nl. diepte-elektroden en

scalpelektroden.

De diepte-elektroden worden zelfgemaakt. Bij de nieuwe operatiemethode is dit door vier

polyimide-gecoate roestvrije stalen draden te draaien op de vortex (Fig. 10B). De diepte-

elektroden gebruikt tijdens de klassieke operatiemethode worden zelfgemaakt door vier

polyimide-gecoate roestvrije stalen draden samen te lijmen (Fig. 10A).

De diepte-elektroden bestaan uit twee elektroden van 125 µm diameter (Bilaney, Düsseldorf,

Duitsland) en twee binnenste elektroden van 70 µm diameter (CFW).

A B C

19

Figuur 10 Elektroden. Klassieke diepte elektrode, gemaakt door vier polyimide-gecoate roestvrije draden samen te lijmen (A). Getwiste diepte elektrode, gemaakt door vier polyimide-gecoate roestvrije stalen draden te draaien op de vortex (B). Scalpelektrode, gemaakt door het solderen van een schroef en een connectiepinnetje aan een geïsoleerde metalen draad (C).

Elk van de draden wordt bij beide methoden recht afgesneden, wat resulteert in een

quadripolaire elektrode: de binnenste twee contactpunten zullen gebruikt worden voor

intracraniële EEG (iEEG) meting. De afstand tussen de registratiepunten is 500 µm. De

buitenste twee contactpunten zullen gebruikt worden voor DBS, de afstand tussen de

stimulatiepunten is 3 mm.

De epidurale elektrode en referentie elektrode zijn scalpelektroden die ook zelfgemaakt

worden (Fig. 10C). Dit gebeurt door het solderen van een schroef (Bilaney, 1.57 mm,

Düsseldorf, Duitsland) en een connectiepinnetje aan een geïsoleerde metalen draad.

2.1.3. EEG opname, stimulatie opstelling en EEG analyse

De ratten worden vastgemaakt aan de swivels (Fig. 12A) en krijgen 4 dagen de tijd om te

wennen aan de nieuwe omgeving, voor continue EEG-monitoring wordt gestart. Het hoedje

wordt verbonden via zelfgemaakte voorversterkers (Fig. 11) en versterkers (versterking van

510x) met een NI-DAQ6259 data acquisitie kaart (National Instruments, Austin, TX, U.S.A.)

en de computer.

Figuur 11 Voorversterker, zelfgemaakt door twee stukjes met een capaciteit van 10 µF te solderen aan een PCB plaatje (rechts) en aan de andere kant een IC Op Amp chip TL074 en TL082 (links) te solderen. De connectiestukjes worden boven en onderaan vastgesoldeerd aan het PCB plaatje.

A B C A

20

De voorversterkers worden zelfgemaakt door op een PCB plaatje (Eurocircuits n.v., België)

twee elektrolytische capaciteiten van 10 µF (16V dc, Sigma-Aldrich, België) te solderen. Aan

de andere kant van het plaatje wordt een Operational Amplifier chip TL074 en TL082 (RS,

U.K.) gesoldeerd. De connectiestukjes worden gemaakt door twee rijen van pinnen samen te

lijmen. Deze worden bovenaan en onderaan vast gesoldeerd aan het plaatje.

Het EEG wordt opgenomen met een frequentie van 2000 Hz. Deze hoge EEG-

opnamefrequentie is nodig om de stimulus artefacten te bepalen, die dan verwijderd worden

via interpolatie. In theorie zou een sampling rate van 260 Hz (2 x 130 Hz) reeds voldoende

moeten zijn.

Figuur 12 Verbinding van de rat met voorversterker en met swivel(A), verbinding swivel met stimulator (B).

De analyse van het opgenomen EEG gebeurt met behulp van software. Aanvallen op het EEG

worden onderscheiden van achtergrondruis doordat ze een grotere amplitude (minstens 3x

groter), hoogfrequente activiteit van minimum 5 Hz en een duur van minimum 10 seconden

hebben. De parameters zijn het aantal aanvallen en de duur van de aanvallen.

2.1.4. Tresholdbepaling

Tijdens de laatste drie dagen van deze herstelperiode worden de stimulatie drempelwaarden

(treshold) bepaald voor alle dieren. Op de eerste dag wordt de unilaterale drempelwaarde in

de rechterhippocampus bepaald. Op de tweede dag wordt de unilaterale drempelwaarde in de

linkerhippocampus bepaald. De derde dag wordt de bilaterale hippocampale stimulatie

drempelwaarde bepaald. Gebaseerd op deze drempelwaarden wordt de stimulatie intensiteit

ingesteld voor elk dier individueel, voor unilaterale (in de rechter hippocampus) en bilaterale

hippocampale therapeutische stimulatie.

De tresholdbepaling wordt telkens uitgevoerd op hetzelfde tijdstip van de dag bij een

enkelvoudig experiment of een groep van experimenten (9u – 11u). De stimulatie intensiteit

voor continue therapeutische hippocampale DBS wordt bepaald door het geven van een 10s

A B

21

pulstrein. Deze pulstrein is identiek aan de stimulatie die zal gebruikt worden tijdens de

continue therapeutische stimulatie, m.a.w. 130 Hz, PDS en een pulsbreedte van 100 µs. Deze

10s worden gevolgd door een 1 minuut durende OFF periode gedurende dewelke het EEG

geëvalueerd kan worden op het voorkomen van stimulatie geïnduceerde after discharge (Fig.

13).

De eerste 10s pulstrein bestaat uit stimulatie pulsen met een amplitude van 25 µA, en de

stimulatie intensiteit wordt met elke puls stapsgewijs opgedreven met 25µA, totdat een after

discharge geobserveerd wordt. Stimulatie intensiteit voor de therapeutische stimulatie wordt

dan ingesteld op de AD-uitlokkende intensiteit – 50 µA. De maximaal gebruikte stimulatie

intensiteit is 500 µA.

Figuur 13 Grafiek met uitzetting van de pulsen (µA) gegeven tijdens de tresholdbepaling. De eerste 10s pulstrein bestaat uit stimulatie pulsen met een amplitude van 25 µA, en de stimulatie intensiteit wordt met elke puls stapsgewijs opgedreven met 25 µA, totdat een after discharge geobserveerd wordt. De 10s worden gevolgd door een 1 minuut durende OFF periode gedurende dewelke het EEG geëvalueerd kan worden op het voorkomen van stimulatie geïnduceerde after discharge.

Indien geen drempelwaarde kan bepaald worden met stimulatie in de rechterhippocampus,

worden de ratten geëxcludeerd uit het volledige experiment. Als er geen drempelwaarde

bepaald kan worden met stimulatie in de linkerhippocampus of tijdens bilaterale

hippocampale stimulatie, wordt de rat geëxcludeerd voor het bilaterale hippocampale DBS

deel van het cross-over design.

2.1.5. Experimenteel protocol

Na bepaling van de drempelwaarde start continue video-EEG meting (24u/24u) met 10 dagen

van continue baseline EEG meting, gebruikt om te bepalen of implantatie van de elektroden

via één van bovenstaande operatiemethoden bij de ratten spontane aanvallen veroorzaakt. Na

de baseline worden twee ratten van de nieuwe operatie groep en twee van de klassieke

operatie groep onderworpen aan continue bilaterale hippocampale DBS. De andere vier ratten

worden onderworpen aan continue unilaterale hippocampale DBS om te bepalen of zowel het

22

unilaterale als het bilaterale DBS protocol veilig is om uitgevoerd te worden met de NPI-

stimulator (Fig. 14). Deze stimulatieperiode van 10 dagen wordt dan gevolgd door een 10

dagen durende wash-out periode, nodig om mogelijke langdurige effecten te detecteren.

Elke dag van continue video-EEG meting wordt het correct functioneren van de opstelling

gecontroleerd.

Figuur 14 NPI-stimulator

Om te starten met de therapeutische stimulatie, wordt de stimulatie intensiteit stapsgewijs

opgevoerd tot de eerder bepaalde stimulatie intensiteit (gebaseerd op de drempelwaarde

bepaling) bij elk dier individueel. Bij het stapsgewijs opvoeren start de stimulatie intensiteit

op 50% van de gewenste stimulatie intensiteit. De stimulatie intensiteit wordt dan elke minuut

met 10% opgevoerd totdat de gewenste stimulatie intensiteit bereikt wordt.

Als stimulatie geïnduceerde aanvalsactiviteit geobserveerd wordt tijdens het stapsgewijs

opvoeren, wordt het opvoeren gestopt, en de stimulatie intensiteit wordt dan gehouden op de

laatste stimulatie intensiteit tijdens dewelke geen stimulatie geïnduceerde aanvalsactiviteit

werd geobserveerd, voor de duur van de volgende stimulatieperiode.

Tijdens de stimulatieperioden wordt de elektrode impedantie dagelijks gemeten (9u-9u30)

met de IMP-2 metalen elektrode impedantie tester. De impedantie wordt telkens van beide

elektroden getest, ook als een rat enkel unilaterale stimulatie ondergaat. Op deze manier weet

men dat als de impedantie slechts bij één van beide elektroden verandert, er mogelijks een

probleem is met deze elektrode.

Om de impedantie te testen geeft de IMP-2 metalen elektrode impedantie tester een sinusgolf

stimulus met een frequentie van 1 kHz, en een teststroom van minder dan 40 nA. Deze lage

teststroom laat het gebruik van deze impedantie tester in vivo toe.

23

2.1.6. Histologie

Na uitvoeren van het experiment worden de ratten diep verdoofd met pentobarbital (100

mg/kg, i.p.) en transcardiaal geperfuseerd met ‘phosphate buffered saline’ (PBS) gevolgd

door formol. Vooraleer de perfusie start wordt heparine (0.1 mg) ingespoten rechtstreeks in

het hart om stolling van het bloed tegen te gaan. De hersenen worden verwijderd en in een

formol oplossing geplaatst gedurende tenminste 24u. De hersenen worden getransfereerd naar

een oplossing die 30% sucrose bevat en dan bevroren. Coronale slices (70 µm) die de

hippocampus en de elektrode kanalen bevatten worden gesneden en op draagglaasjes gelegd.

Er wordt een Nissl kleuring uitgevoerd op de slices en deze worden afgedekt. De locatie van

de elektroden wordt geïdentificeerd via lichtmicroscopie.

2.2. Test experiment Diego-stimulator

2.2.1. Algemeen

In dit onderzoek wordt de veiligheid van de custom made “Diego-stimulatoren” geëvalueerd.

Er worden 4 Wistar ratten gebruikt (operatiegewicht 380-450 g; Taconic, Denemarken).

2.2.2. Operatie

Deze ratten worden geopereerd volgens de nieuwe operatiemethode met het verschil dat voor

het maken van het hoedje tandheelkundig acrylcement gebruikt wordt, en enkel voor de

plaatsing van de elektroden het UV-hardend cement.

Operaties, tresholdbepalingen, impedantie-metingen, stimulatie, EEG-analyse, verzorging en

histologie worden uitgevoerd zoals hoger beschreven.

2.2.3. Diego-stimulator

Figuur 15 Diego-stimulator (A, B, C) en overzicht opstelling (D).

A B

C D

24


De 4 Wistar ratten worden 5 dagen gestimuleerd met bilaterale DBS, gevolgd door 5 dagen

van unilaterale DBS.

2.3. Unilaterale vs. bilaterale stimulatie

2.3.1. Algemeen

In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van het intraperitoneaal KA rat model. Hierbij wordt

KA intraperitoneaal geïnjecteerd. Als gevolg hiervan ontwikkelen de proefdieren een status

epilepticus die op zijn beurt aanleiding geeft tot spontane epileptische aanvallen.

In het onderzoek worden 8 Sprague-Dawley ratten (operatiegewicht 400-565 g; Taconic,

Denemarken) gebruikt.

2.3.2. Kainaat injecties

In dit experiment wordt het KA-model gebruikt. Dit omdat het labo hier reeds veel ervaring

mee heeft en er in vergelijking met het PILO-model meer spontane aanvallen optreden.

De ratten worden intraperitoneaal geïnjecteerd met KA (KA; Tocris Bioscience, U.S.A.) met

een concentratie van 5 mg/kg om het uur (38). Na behandeling met KA sterft ongeveer 15%

van de ratten. Er worden in totaal 35 ratten geïnjecteerd met KA, uit vorige studies in het labo

blijkt dat dit aantal voldoende is om uiteindelijk 16 ratten te kunnen selecteren met voldoende

spontane aanvallen. Eenmaal een rat extreme inactiviteit of activiteit vertoont worden de

volgende injecties uitgesteld of gereduceerd tot 2,5 mg/kg per 30 minuten. De injecties

worden aangepast omdat werd geobserveerd dat dit gedrag frequent vooraf gaat aan sterfte als

de behandeling voortgaat aan dezelfde snelheid. Extreme inactiviteit wordt gedefinieerd als

wanneer de rat amper nog beweegt en op één locatie in de kooi ligt. Het dier ligt niet te

slapen, de ogen zijn open. Extreme activiteit wordt gedefinieerd als wanneer de rat continu in

rondjes loopt, springt en/of in de hoek van de kooi staat en overmatig snuift (40). De

behandeling wordt voortgezet totdat de dieren in SE zijn. Dit wordt gedefinieerd als het

krijgen van 5 stage III-V aanvallen volgens de schaal van Racine in het voorbije uur.

2.3.3. Selectie d.m.v. observatie

Elf tot twaalf weken na de injectie met KA worden de ratten geselecteerd op basis van het

aantal aanvallen die ze doen in een bepaalde periode, de 8 ratten met het hoogste aantal stage

III-V aanvallen worden gebruikt voor de studie en dus geopereerd.

25

Om de aanvallen te scoren wordt gebruik gemaakt van de schaal van Racine. Deze verdeelt de

aanvallen in 5 klassen. Bij een aanval van klasse I zijn de gedragskenmerken: immobiliteit,

gesloten ogen, trekkingen van de neusharen, faciale clonus en wet dog shakes. Bij klasse II

zijn dit knikken met hun hoofd, kauwen, ernstige faciale clonus en wet dog shakes (43-45).

Bij een aanval van klasse III vertonen de dieren een clonus van één van de voorste ledematen

met een lordotische houding. Bij klasse IV staan ze op hun achterpoten en hebben ze een

clonus van beide voorste ledematen en bij klasse V hebben ze een aanval volgens klasse IV en

vallen ze omver door een verlies aan evenwicht (40, 43-45).

Enkel de motorische aanvallen (klasse III-V) worden gescoord, dus klassen I en II worden

niet gescoord. Het krijgen van minstens 2 stage III-V aanvallen in een periode van 6 uur

wordt gebruikt als selectiecriterium.

Er wordt geobserveerd over verschillende weken om na te gaan of dezelfde ratten zouden

geselecteerd worden onafhankelijk van het tijdstip van de observatie. Ook willen we nagaan

of er bij de ratten over de verschillende weken effectief meer aanvallen worden geobserveerd.

Verder wordt ook nagegaan of het aantal geobserveerde klinische aanvallen gecorreleerd kan

worden met het aantal geobserveerde elektrografische aanvallen tijdens de baselineperiode

waarin continu EEG geregistreerd wordt. Hiervoor zal ook de data uit de baselineperiode van

het uni vs. bilaterale experiment gebruikt worden.

2.3.4. Operatie

De ratten worden geopereerd volgens de operatiemethode beschreven bij het test experiment

met de Diego-stimulator.

Na de operatie krijgen de ratten 3 dagen rust om te herstellen van de operatie in het

animalarium. Daarna worden ze verplaatst naar de EEG-meting/stimulatie kooien voor nog 5

dagen rust.


De ratten worden vastgemaakt aan de swivels en krijgen 4 dagen de tijd om te wennen aan de

nieuwe omgeving voor continue EEG-monitoring wordt gestart. Tijdens deze rustdagen wordt

de dagelijkse verzorging uitgevoerd identiek aan de verzorging die gegeven zal worden

tijdens het experiment, m.a.w. wekelijks kuisen van de kooien, dagelijkse controle van de

vochtigheid en temperatuur, en dagelijkse controle van de fysische conditie.

26

Tijdens de laatste drie dagen van de herstelperiode worden de stimulatie drempelwaarden

bepaald voor alle dieren zoals hoger beschreven. Indien geen drempelwaarde kan bepaald

worden met stimulatie in de rechter of linkerhippocampus, worden de ratten geëxcludeerd uit

het volledige experiment.


Na bepaling van de drempelwaarde start continue video-EEG registratie (24u/24u) met 10

dagen van continue baseline EEG registratie gebruikt om de baseline aanvalsfrequentie te

bepalen in alle ratten. Na de baselineperiode worden de ratten ingedeeld in 2 groepen zodat

een gelijke verdeling in dagelijkse aanvalsfrequentie bekomen wordt. De ene groep wordt dan

onderworpen aan unilaterale hippocampale DBS in de rechterhippocampus, en de andere

groep wordt onderworpen aan bilaterale hippocampale DBS (Fig. 16). Elke dag van continue

video-EEG opname wordt het correct functioneren van de opstelling gecontroleerd.

Het stapsgewijs opvoeren van de stimulatie, het meten van de impedantie en de EEG-analyse

worden uitgevoerd zoals hoger beschreven.

Figuur 16 Tijdsschema van het onderzoek. De KA-injecties worden uitgevoerd in oktober. Selectie gebeurt d.m.v. observatie 11 tot 12 weken na injectie. Vervolgens worden de ratten in maart geopereerd en krijgen ze 8 dagen rust. Hierna wordt gestart met 10 dagen EEG opname (baseline) gevolgd door 10 dagen stimulatie en 10 dagen wash-out.

2.3.7. Statistische methode

De verkregen data uit de gemeten iEEGs zijn het aantal aanvallen en de duur van de

aanvallen. De data worden uitgedrukt als gemiddelde (mean) en standard error of the mean

(SEM). Statistische evaluatie van de aanvalsfrequentie en aanvalsduur wordt uitgevoerd door

gebruik te maken van de Wilcoxon signed ranks test indien de data niet normaal verdeeld is

en een t-test indien de data normaal verdeeld is.

P-waarde < 0,025 wordt aangenomen om een significant verschil aan te tonen. Er wordt een

Bonferroni correctie van 2 toegepast aangezien telkens twee groepen met elkaar vergeleken

worden.

KA-injectie

Oktober

Selectie

na 11-12 w

Operatie

Maart

Rust

(8 d)

Baseline EEG

(10 d)

Stimulatie

(10 d)

27

2.4. Dorsale vs. ventrale stimulatie

2.4.1. Algemeen

In dit experiment worden 5 Sprague-Dawley ratten geopereerd, 243 dagen na injectie met KA

(operatiegewicht 430-530 g; Taconic, Denemarken). Er wordt geen observatie uitgevoerd

omdat de ratten reeds lange tijd (243 dagen) geïnjecteerd werden en er dus van wordt uit

gegaan dat ze allemaal spontane aanvallen vertonen.

2.4.2. Operatie

In dit experiment wordt de klassieke operatiemethode gebruikt zoals hoger beschreven. Er

worden in totaal 12 ingangsplaatsen geboord, 5 ingangsplaatsen voor de elektroden en 7 voor

de ankerschroeven (1,57 mm diameter; Bilaney, Düsseldorf, Duitsland).

Er wordt gebruik gemaakt van bipolaire diepte-elektroden. Deze worden zelfgemaakt door

twee polyimide-gecoate roestvrije stalen draden samen te lijmen. De diepte elektrode bestaat

uit twee elektroden van 125 µm diameter (Bilaney, Düsseldorf, Duitsland; afstand tussen de

punten: 500 µm).

Er worden 2 bipolaire DBS-diepte-elektroden stereotactisch geplaatst, één in de dorsale

rechterhippocampus (AP -3,8; ML +2,2; DV -4,0 t.o.v. Bregma ) en één in de ventrale

rechterhippocampus (AP -5,1; ML +4,2; DV -8,4 t.o.v. Bregma). Verder worden er 2

bipolaire diepte-elektroden stereotactisch geplaatst voor de intracraniële EEG-opname

(iEEG), één in de rechterhippocampus en één in de linkerhippocampus (AP -5,6; ML +/- 5,10;

DV -6,4 t.o.v. Bregma) (42). De zelfgemaakte epidurale referentie-elektrode wordt aan de

linkerachterzijde van de schedel geïmplanteerd t.h.v. de sutura lambdoidea.


Tijdens de laatste drie dagen van de herstelperiode worden de stimulatie drempelwaarden

bepaald voor alle dieren zoals hoger beschreven. Op de eerste dag wordt de drempelwaarde in

de dorsale rechterhippocampus bepaald. Op de tweede dag wordt de drempelwaarde in de

ventrale rechterhippocampus bepaald. De derde dag wordt de gecombineerde dorsale en

ventrale stimulatie drempelwaarde bepaald in de rechterhippocampus. Gebaseerd op deze

drempelwaarden wordt de stimulatie intensiteit ingesteld voor elk dier individueel, voor

dorsale, ventrale en gecombineerde (allen in de rechter hippocampus) therapeutische

stimulatie.

28

Indien geen drempelwaarde kan bepaald worden met stimulatie in de dorsale of ventrale

rechterhippocampus, worden de ratten geëxcludeerd uit het volledige experiment.


Na de operatie krijgen de ratten 1 tot 2 weken rust om te herstellen van de operatie voor

continue EEG-monitoring wordt gestart. Dezelfde opstelling werd gebruikt zoals hoger

beschreven.

Het experiment start met 10 dagen van continue EEG-monitoring, gebruikt om de baseline

aanvalsfrequentie te bepalen en alle andere parameters van de ratten. Na het baseline EEG

worden de ratten gedurende 10 dagen continu (24h/24h) gestimuleerd met dorsale

hippocampale DBS. De stimulatie gebeurt zoals hoger beschreven volgens een

Poissonverdeling met gemiddelde en variantie 1/130 s, hierdoor is de gemiddelde frequentie

130 Hz. Na 10 dagen van continue stimulatie volgt een 10 dagen durende wash-out periode.

Deze periode wordt gebruikt om de langer durende effecten te bepalen. Hierna volgt 10 dagen

ventrale stimulatie, opnieuw gevolgd door 10 dagen wash-out. Uiteindelijk wordt dan

afgesloten met een 10 dagen durende periode van gecombineerde dorsale en ventrale

stimulatie gevolgd door nog een laatste wash-out periode van 10 dagen (Fig. 17).

Het stapsgewijs opvoeren van de stimulatie, het meten van de impedantie, de EEG-analyse en

de histologie worden uitgevoerd zoals hoger beschreven.

Figuur 17 Tijdsschema van het onderzoek. Na de operatie krijgen de ratten rust voordat 20 dagen van continue EEG opname gestart wordt. Dit wordt gevolgd door 10 dagen dorsale stimulatie en 10 dagen wash-out. Vervolgens start 10 dagen van ventrale stimulatie gevolgd door 10 dagen wash-out. Hierna volgt nog 10 dagen van gecombineerde dorsale en ventrale stimulatie gevolgd door een laatste wash-out periode van 10 dagen.

operatie

+

rust

baseline

(20d)

dorsale

stimulatie

(10d)

wash-out

(10d)

ventrale

stimulatie

(10d)

wash-out

(10d)

D & V

stimulatie

(10d)

wash-out

(10d)

29

3. Resultaten

3.1. Test experimenten

3.1.1. Gebruikte operatiemethode & NPI-stimulator

In totaal werden uiteindelijk 9 ratten geopereerd. Zes volgens de klassieke operatiemethode en

drie volgens de nieuwe operatiemethode. Twee ratten stierven na de operatie, Wistar BVN 2

en C7 (Tabel 1).

Tabel 1 Overzicht operaties test-experiment.

ID gewicht (g) ras operatie-methode

datum overlijden

C1 490 SD "klassiek"

Wistar BVN 1 580 Wistar "klassiek"

Wistar BVN 2 685 Wistar "klassiek" 22/02/2013

C3 476 SD "nieuw"

C4 537 SD "nieuw"


C6 528 SD "nieuw"

C7 466 SD "klassiek" 23/02/2013


SD: Sprague-Dawley

Na bepaling van de drempelwaarden werden de ratten onderverdeeld in twee groepen,

respectievelijk een groep die unilaterale stimulatie onderging en een groep die bilaterale

stimulatie onderging met de NPI-stimulator (Tabel 2).

Tabel 2 Overzicht onderverdeling in unilaterale of bilaterale stimulatie en gebruikte elektroden.

ID Stimulatie Elektroden

C1 unilateraal gekleefd

Wistar BVN1 unilateraal gekleefd

C8 unilateraal gekleefd

C3 unilateraal twisted

C5 bilateraal gekleefd

C4 bilateraal twisted

C6 bilateraal twisted

30

Tijdens de baselineperiode werd een aardingslus gecreëerd tijdens het proberen oplossen van

storing op het EEG. C3 kreeg hierna aanvallen en ging in status (Fig. 18). Geen enkele andere

rat kreeg aanvallen. Verder werd ook geobserveerd dat het loskomen van een rat ook te zien

was op het EEG van alle andere ratten, en dat deze op dit moment allemaal een stroompuls

kregen (Fig. 19).

Figuur 18 Grafiek met gemiddelde aanvallen per dag per rat tijdens de baselineperiode. De aanvallen en daaropvolgende status van C3 zijn te verklaren door het creëren van een aardingslus tijdens het proberen oplossen van storing.

Figuur 19 EEG tijdens stimulatie. Als er een rat loskomt (op figuur de bovenste) valt het signaal ook weg op de andere kanalen en krijgen alle dieren een puls toegediend. De breedte van de figuur stelt 40 seconden voor.

Tijdens de stimulatieperiode ontwikkelden 3 ratten aanvallen; C4, C8 en WBVN1 (Fig. 20).

Om deze reden werd de stimulatie gestopt na 3 dagen. Er hadden twee ratten (C8 en WBVN1)

aanvallen die geopereerd werden volgens de klassieke operatiemethode en één rat (C4)

aanvallen die geopereerd werd volgens de nieuwe operatiemethode. C4 en C8 werden

bilateraal gestimuleerd, WBNV1 unilateraal.

0

5

10

15

20

25

30

day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 day 6 day 7 day 8 day 9 day 10

Aan

tal a

anva

llen/

dag

Baseline

C1

C3

C4

C5

C6

C8

WBVN1

31

Figuur 20 Grafiek met gemiddelde aanvallen per dag per rat tijdens de stimulatieperiode. C4, C8 en WBVN1 ontwikkelden aanvallen, om deze reden werd de stimulatie gestopt na 3 dagen.

Op dag 4 van de wash-out periode is het hoedje van C4 losgekomen, deze rat werd dezelfde

dag nog geperfuseerd. Tijdens deze wash-out kreeg C3 terug aanvallen (Fig. 21).

Figuur 21 Grafiek met gemiddelde aanvallen per dag per rat tijdens wash-out periode. C3 vertoont opnieuw aanvallen.

De locatie van de elektroden werd geïdentificeerd via lichtmicroscopie. De positie van de

elektroden was bij alle ratten goed, nl. zowel links als rechts in de hippocampus.

Er is geen direct oorzakelijk verband zichtbaar tussen de aanvallen en schade of bloeding rond

de elektroden of in de hippocampus, veroorzaakt door de stimulatie. C3 had aanvallen tijdens

de baseline en wash-out t.g.v. het creëren van een aardingslus met een DC offset. Deze rat had

aan beide elektroden een bloeding en een verbrede elektrodegang. C4 had aanvallen tijdens de

stimulatie en aan beide elektroden een minimale hoeveelheid bloed. Bij C8 en WBVN1, die

ook aanvallen hadden tijdens de stimulatie, was er geen schade of bloeding zichtbaar rond de

elektroden. Verder had C1 schade en bloeding rond de rechterelektrode en links een minieme

0

2

4

6

8

10

12

day 1 day 2 day 3

Aan

tal a

anva

llen/

dag

Stimulatie

C1

C3

C4

C5

C6

C8

WBNN1

0

1

2

3

4

5

6

dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5

Aan

tal a

anva

llen/

dag

Wash-out

C1

C3

C4

C5

C6

C8

WBVN1

32

hoeveelheid bloed rond de elektrode. C5 had een minimale hoeveelheid bloed aan de

rechterelektrode en aan de linkerelektrode een bloeding en een verbrede elektrodegang. Bij

C6 was er geen schade of bloeding zichtbaar rond de elektroden.

3.1.2. Diego-stimulator

Tijdens de bilaterale stimulatieperiode ontwikkelde LJB controle 1 aanvallen op dag 3 en 4.

LJB controle 2 had een aanval op de vijfde stimulatiedag (Fig. 22). Beide dieren kwamen los

van hun swivel tijdens de stimulatie en werden opnieuw verbonden zonder de stimulatie te

stoppen. Hierdoor werd de stimulatie meteen toegediend zonder deze eerst op te bouwen zoals

hoger beschreven.

Figuur 22 Grafiek gemiddelde aanvallen per rat per dag tijdens de bilaterale stimulatieperiode.

Tijdens de unilaterale stimulatieperiode kreeg geen enkele rat een aanval. De locatie van de

elektroden werd geïdentificeerd via lichtmicroscopie. De positie van de elektroden was bij

alle ratten goed, nl. zowel links als rechts in de hippocampus, en er werd geen schade

gedetecteerd.

3.2. Correlatie observaties met selectie & baseline in het KA-model

3.2.1. Observaties KA-model

De ratten werden geïnjecteerd met KA op 31 oktober 2013. De eerste observatie vond plaats

83 dagen na de injecties. Volgende observaties volgden op 84, 92, 113 en 120 dagen na

injectie (Fig. 23). Op deze manier werden de observaties uitgevoerd over een periode van

verschillende weken. De eerste twee observatiedagen werd geobserveerd gedurende 8 uur, nl.

van 8u45 tot 16u45. De volgende observatiedagen werd geobserveerd gedurende 6 uur, nl.

van 9u tot 15u.

0123456789

day 1 day 2 day 3 day 4 day 5

Aan

tal a

anva

llen/

dag

Bilaterale stimulatie

LJB controle 1

LJB controle 2

LJB controle 3

LJB controle 4

33

Het selectiecriterium is minstens 2 aanvallen gedurende de 8 uur durende observatieperiode,

of 6 aanvallen in 24u. Omdat deze selectie niet voldoende ratten opleverde, werd het

selectiecriterium aangepast naar minstens 1 aanval gedurende de 8 uur durende

observatieperiode, of 3 aanvallen in 24u. Op basis van de aanvallen die geobserveerd werden

op deze verschillende tijdstippen werden telkens ongeveer dezelfde ratten geselecteerd. LJB

1, 5, 6, 9, 12, 18, 26 en 30 werden geselecteerd na de eerste 2 observatiedagen. LJB 5 en 6

zijn gestorven gedurende de verdere observatieperiode. LJB 30 is gestorven na de operatie.

Met de data van alle observaties werden uiteindelijk nog LJB 14, 15 en 17 toegevoegd aan de

selectie (Fig. 23). LJB 20 werd niet geselecteerd omdat deze zich enorm verzwakt vertoonde

en gevreesd werd de verdoving en operatie niet te overleven. LJB 28 stierf in de periode

tussen de observatie en de operatie en kon om deze reden ook niet geselecteerd worden. Aan

de vroegere selectie veranderde niets. Het lijkt dus geen extra voordeel te hebben om

verschillende observaties verspreid over verschillende weken uit te voeren.

Figuur 23 Grafiek met aantal aanvallen per observatiedag (24u) per rat (15 ratten). Op basis van het selectiecriterium minimum 1 aanval gedurende de 6 uur durende observatieperiode zouden telkens dezelfde selectie gemaakt worden.

Voor de uni vs. bilaterale proef werden de overige 8 ratten geopereerd. Gedurende de

verschillende observatiedagen is een duidelijke toename zichtbaar in aantal aanvallen bij LJB

9 en 12 (Fig. 24). Bij LJB 18 is een lichte toename zichtbaar. Dit is niet het geval bij de

andere ratten.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

SE + 83d SE + 84d SE + 92 SE + 113 SE + 120

stage 3+4+5

Aan

tal a

anva

llen/

obse

rvat

ieda

g

Aanvallen per observatiedag LJB1LJB5

LJB6

LJB9

LJB12

LJB14

LJB15

LJB17

LJB18

LJB20

LJB24

LJB26

LJB28

LJB30

LJB33

34

Figuur 24 Grafiek met aantal aanvallen per rat per observatiedag (8 geselecteerde ratten voor operatie). Een duidelijke toename in aanvalsfrequentie is zichtbaar bij LJB 9 en 12.

Gedurende de 10 dagen durende baselineperiode van de uni vs. bilaterale proef werd het EEG

opgenomen (Fig. 25). Deze startte 142 dagen na injectie. Hierin is een duidelijke toename in

aanvalsfrequentie zichtbaar over de 10 dagen bij LJB 14, 15, 17 en 18. Bij LJB 1, 9, 12 en 26

is dit niet zichtbaar.

Figuur 25 Grafiek met gemiddeld aantal aanvallen per rat gedurende de baselineperiode (10d). Er is een duidelijke toename in aanvalsfrequentie zichtbaar bij LJB 14. 15. 17 en 18. Bij LJB 1. 9. 12 en 26 is dit niet het geval.

Vergelijking van de dieren met de hoogste aanvalsfrequenties gedurende de observatie met

deze gedurende de baseline, wijst uit dat LJB 1, 9 en 26 in beide perioden deel uitmaken van

de groep met de hoogste aanvalsfrequentie (Tabel 3). Er werd een Spearman’s correlatie

uitgevoerd, deze was 0,565 en bereikte geen significantie (p-waarde = 0,145 > 0,05).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Aan

tal a

anva

llen/

obse

rvat

ieda

g

Aanvallen tijdens observatie

stage 3+4+5 SE + 83d



stage 3+4+5 SE + 113d

stage 3+4+5 SE + 120d

0

20

40

60

80

100

120

140

LJB 1 LJB 9 LJB 12 LJB 14 LJB 15 LJB 17 LJB 18 LJB 26

Aan

tal a

anva

llen/

dag

Aanvallen op het EEG dag 1dag 2

dag 3

dag 4

dag 5

dag 6

dag 7

dag 8

dag 9

dag 10

35

Tabel 3 Vergelijking van de gemiddelde aanvalsfrequentie per dag gedurende de observatie (klinisch geobserveerde aanvallen) en de baseline (elektrografische aanvallen).

Gemiddelde aanvallen per dag ID Observatie Baseline

LJB1 11 36 LJB9 22 18 LJB12 5 11 LJB14 1 10 LJB15 2 3 LJB17 1 24 LJB18 1 3 LJB26 18 41

In beide perioden maken LJB 1, 9 en 26 deel uit van de dieren met de hoogste aanvalsfrequentie.

3.2.2. Dorsale vs. ventrale stimulatie

Dit experiment werd uitgevoerd bij 5 ratten. Tijdens het experiment stierven 4 van de 5 ratten,

enkel VHC 1 overleefde het experiment. Tijdens de baseline vertoonden de ratten niet

voldoende aanvallen en een onstabiele aanvalsfrequentie, ondanks dat ze reeds lange tijd

ervoor (243 dagen) geïnjecteerd werden met KA (Fig. 26). Dit samen met de sterfte van de

ratten maakt het onmogelijk om een besluit te vormen over de werking van dorsale vs.

ventrale stimulatie.

Figuur 26 Grafiek met aantal aanvallen tijdens baseline (20d) per rat.

VHC 31 en 20 stierven tijdens de dorsale DBS periode. VHC 28 stierf tijdens de

daaropvolgende baselineperiode en VHC 9 stierf tijdens de ventrale DBS periode. De

histologie achteraf wees uit dat VHC 9 en 28 waarschijnlijk een infectie hadden aan de

elektroden. Het sterven van VHC 20 en 31 kon niet worden verklaard op basis van de

histologie. Bij VHC 1 is de clustering van de aanvallen nog steeds zeer goed zichtbaar (Fig.

27). Dit typeert het KA-model.

010

2030

405060

7080

dag1

dag2

dag3

dag4

dag5

dag6

dag7

dag8

dag9

dag10

dag11

dag12

dag13

dag14

dag15

dag16

dag17

dag18

dag19

dag20

Aan

tal a

anva

llen/

dag

Baseline

VHC 1

VHC 31

VHC 9

VHC 28

VHC 20

36

Figuur 27 Grafiek met aanvallen van LJB 1 tijdens het experiment. De clustering van de aanvallen is duidelijk zichtbaar.

0

5

10

15

20

25d

ag 1

dag

4

dag

7

dag

10

dag

13

dag

16

dag

19

day

2

day

5

day

8

day

1

day

4

day

7

day

10

day

3

day

6

day

9

day

2

day

5

day

8

day

1

day

4

day

7

day

10

day

3

day

6

day

9

baseline 1 dorsalestimulatie

baseline 2 ventralestimulatie

baseline 3 D & Vstimulatie

baseline 4

Aan

tal a

anva

llen/

dag

VHC 1

37

3.3. Unilaterale vs. bilaterale stimulatie

In totaal werden 9 ratten geopereerd. LJB 30 is gestorven na de operatie. Eén rat, LJB 26,

werd geëxcludeerd uit het experiment doordat het niet mogelijk was een treshold te bepalen

tijdens stimulatie in de rechterhippocampus. Later werd via histologie bevestigd dat de

elektroden zich aan beide zijden naast de hippocampus bevonden. Het experiment werd dus

verder gezet met 7 ratten. De ratten werden ingedeeld in twee groepen zodat er twee groepen

verkregen werden met een gelijke aanvalsfrequentie (Tabel 4).

Tabel 4 Verdeling in unilaterale en bilaterale stimulatie groep.

Rat Operatiegewicht (g) Stimulatie LJB 1 416 Bilateraal LJB 9 400 Unilateraal LJB 12 430 Bilateraal LJB 14 563 Unilateraal LJB 15 430 Bilateraal LJB 17 474 Unilateraal LJB 18 441 Bilateraal LJB 26 439 Geëxcludeerd LJB 30 440 Gestorven

De verdeling werd zodanig gemaakt dat twee groepen met een gelijke aanvalsfrequentie werden bekomen. In de tabel wordt verder nog het operatiegewicht per rat weergegeven.

LJB 14 is gestorven op de derde stimulatiedag en werd om deze reden niet opgenomen in de

statistische analyse van de unilaterale groep. Deze had een open wonde aan de buik en is

waarschijnlijk gestorven t.g.v. een infectie.

3.3.1. Aanvalsfrequentie

Een eerste parameter die bestudeerd werd, is de aanvalsfrequentie. De gemiddelde aanvallen

per rat, gemiddeld voor alle ratten in de unilaterale groep, werden berekend. Deze gingen van

21,3 ± 6,2 aanvallen per dag tijdens baseline naar 23,7 ± 2,9 aanvallen per dag tijdens

unilaterale DBS. Dit bereikte geen significantie met de Wilcoxon signed ranks test (p-waarde

= 0,047 > 0,025, Fig. 28). De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de

unilaterale groep werden tevens ook per uur berekend. Deze gingen van 0,879 ± 0,055

aanvallen per uur tijdens baseline naar 0,911 ± 0,061 aanvallen per uur tijdens unilaterale

DBS. Dit bereikte geen significantie met de t-test (p-waarde = 0,705 > 0,025, Fig 29).

De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de bilaterale groep, ging van

13,4 ± 2,3 aanvallen per dag tijdens baseline naar 11,4 ± 3,0 aanvallen per dag tijdens

unilaterale DBS. Dit bereikte geen significantie met de Wilcoxon signed ranks test (p-waarde

= 0,088 > 0,025, Fig. 30). De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de

38

bilaterale groep, werden eveneens per uur berekend. Deze ging van 0,568 ± 0,063 aanvallen

per uur tijdens baseline naar 0,502 ± 0,076 aanvallen per uur tijdens bilaterale DBS. Dit

bereikte significantie met de Wilcoxon signed ranks test (p-waarde = 0,004 < 0,025, Fig 31).

Figuur 28 Grafiek met effect unilaterale DBS per dag t.o.v. baseline, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep (blauw). De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer. De gemiddelde aanvalsfrequentie per dag, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep, wordt weergegeven door de horizontale volle lijn (zwart). De gestippelde lijnen (paars) geven de bijhorende SEM weer.

Figuur 29 Grafiek met effect unilaterale DBS per uur t.o.v. baseline, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep (blauw). De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer. De gemiddelde aanvalsfrequentie per uur, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep, wordt weergegeven door de horizontale volle lijn (zwart). De gestippelde lijnen (paars) geven de bijhorende SEM weer.

0

20

40

60

80

100

120

140

dag

1

dag

2

dag

3

dag

4

dag

5

dag

6

dag

7

dag

8

dag

9

dag

10

dag

1

dag

2

dag

3

dag

4

Optimalisatie van diepe hersenstimulatie als behandeling voor … · 2013. 12. 21. · Lien,...

Documents

Transcript of Optimalisatie van diepe hersenstimulatie als behandeling voor … · 2013. 12. 21. · Lien,...