Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel ......Onderzoek naar lymfoïd neogenese in...
Transcript of Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel ......Onderzoek naar lymfoïd neogenese in...
Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een
experimenteel model van Chronisch
Obstructief Bronchiaal Lijden (COPD)
Lisa DUPONT
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Brusselle
Vakgroep Inwendige ziekten
Dienst Longziekten
Universiteit Gent – UZ Gent
Academiejaar 2008 - 2009
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder
de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
Dupont Lisa Prof. Dr. Brusselle
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
Voorwoord
Het is al langer geweten dat roken de belangrijkste risicofactor is voor het ontwikkelen van
COPD. De mechanismen achter deze ziekte zijn echter nog steeds niet opgehelderd. Het leek
mij interessant om een stukje van de puzzel te helpen oplossen.
Ik wil graag mijn promotor professor Brusselle bedanken. Hij kan vol enthousiasme over
COPD vertellen en ik was dan ook meteen gemotiveerd om aan de stage te beginnen. In het
laatste anderhalf jaar heb ik veel bijgeleerd, niet alleen gedurende de stage, maar ook in de
research staffs wanneer onderzoekers hun resultaten voorstelden. Professor Brusselle gaf mij
de gelegenheid om zelf zo‟n research staff mee te presenteren.
Tijdens de stage in het labo van de Dienst Longziekten kreeg ik de kans om een deel van mijn
theoretische bagage in de praktijk om te zetten. Hierbij werd ik bijgestaan door een
enthousiast en ervaren team laboranten. Ik ben hen daar natuurlijk zeer dankbaar voor.
Mijn begeleider Ken heeft mij wegwijs gemaakt in het labo en mij enkele technieken
aangeleerd. Hij was ook altijd bereid om de geschreven stukken van mijn masterproef na te
lezen en te verbeteren.
Ik wil Tine bedanken omdat ik mocht meewerken aan haar doctoraatsonderzoek. Zij heeft mij
begeleid bij het analyseren van de resultaten en mij vol geduld veel bijgeleerd. Hierdoor heb
ik ontdekt dat er achter één grafiekje een heleboel werk schuilgaat.
Vervolgens nog een dankwoord voor Sharen, Nele, Ellen en Tania voor de hulp en de
interesse in mijn onderzoek.
Uiteraard wil ik mijn ouders bedanken voor de jarenlange steun in alle betekenissen van het
woord. Bedankt aan mijn familie en vrienden voor de nodige steun en afleiding.
Het begin van mijn laatste academiejaar was tegelijk het begin van het leven van mijn
metekindje Robbe en het einde van het leven van mijn zus Ine. Graag wil ik deze masterproef
opdragen aan Ine, die mij geleerd heeft altijd nauwgezet te werk te gaan en alles positief te
bekijken. Met deze gedachte heb ik dan ook dit werk geschreven.
Voor Ine.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
Inhoudstafel
Samenvatting .............................................................................................................................. 1
1. Inleiding ................................................................................................................................. 2
1.1 Algemeen: COPD ...................................................................................................... 2
1.2 Het muismodel .......................................................................................................... 6
1.3 Lymfoïd neogenese ................................................................................................... 7
1.4 Chemokines ............................................................................................................. 10
1.5 Chemokine receptor 7 ............................................................................................. 11
1.6 Regulatorische T-cellen ........................................................................................... 15
1.7 Doelstelling ............................................................................................................. 16
2. Materialen en methoden ....................................................................................................... 17
3. Resultaten ............................................................................................................................. 30
3.1 Inflammatie ............................................................................................................. 30
3.2 Emfyseem ................................................................................................................ 38
3.3 Lymfoïd neogenese ................................................................................................. 39
3.4 Chemokine-expressie .............................................................................................. 40
3.5 Immuunkleuring CCL19/ProSP-C .......................................................................... 41
4. Bespreking ............................................................................................................................ 43
5. Algemeen besluit .................................................................................................................. 46
6. Referentielijst ....................................................................................................................... 47
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
1
Samenvatting
Chronic obstructive pulmonary disease (chronisch obstructief longlijden) of kortweg COPD,
is een ziekte die gekenmerkt wordt door een niet volledig reversiebele vernauwing van de
kleine luchtwegen. De grootste risicofactor is het roken van sigaretten. Enerzijds ontstaat er
obstructieve bronchiolitis: de wand van de kleine luchtwegen verdikt en het bindweefsel
neemt toe (fibrose). Anderzijds is er afbraak van het longparenchym of emfyseem. In de long
treedt er een inflammatoire reactie op tegen toxische stoffen of gassen. Bij ernstig COPD
worden er zelfs lymfoïde follikels teruggevonden.
In deze masterproef wordt het verband tussen inflammatie, emfyseem en lymfoïd neogenese
nagegaan. Daarvoor wordt er gebruik gemaakt van een muismodel waarbij het gen voor
chemokine receptor 7 (CCR7) uitgeschakeld is. Chemokine receptor 7 zorgt voor de homing
van dendritische cellen en T-lymfocyten naar de lymfeknopen. De muizen worden subacuut
(4 weken) of chronisch (24 weken) blootgesteld aan sigarettenrook.
Zowel subacute als chronische blootstelling aan sigarettenrook induceert inflammatie in
wildtypes en CCR7 knock-outs (KO). In het bronchoalveolair lavagevocht en in de longen
van CCR7 KO muizen zijn er over het algemeen meer dendritische cellen en T-lymfocyten
aanwezig in vergelijking met de wildtypes. De lymfeknopen van CCR7 KO muizen bevatten
daarentegen minder dendritische cellen en T-lymfocyten dan de WT muizen. Het aantal
lymfoïde follikels rond de kleine luchtwegen neemt toe na chronische rookblootstelling en is
significant hoger in de CCR7 KO groep dan in de wildtypegroep. Emfyseem verergert na
rookblootstelling, maar niet bij de CCR7 knock-outs. CCR7-deficiënte muizen hebben wel
baseline reeds een hogere Lm-waarde, die een maat is voor emfyseem.
De expressie van chemokine ligand 19 (CCL19), één van de liganden van CCR7, verhoogt
zowel op mRNA- als op eiwitniveau na rookblootstelling bij wildtypes. CCR7 KO muizen
hebben baseline al een hoger niveau van CCL19-expressie.
Door het ontbreken van chemokine receptor 7, kunnen de dendritische cellen en T-lymfocyten
niet efficiënt naar de lymfeknopen migreren. Deze cellen vormen lymfoïde follikels in de long.
De CCR7 knock-out muizen vertonen na chronische rookblootstelling meer lymfoïde follikels,
maar in tegenstelling tot de wildtypes gaat dit niet gepaard met meer emfyseem. In contrast
met vroegere bevindingen, is er hier een dissociatie tussen emfyseem en lymfoïde follikels.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
2
1. Inleiding
1.1 Algemeen: COPD
Pathologie
Chronic obstructive pulmonary disease (chronisch obstructief longlijden) of kortweg
COPD, is een ziekte die gekenmerkt wordt door een niet volledig reversiebele vernauwing
van de kleine luchtwegen. Enerzijds ontstaat er obstructieve bronchiolitis: de wand van de
kleine luchtwegen verdikt en het bindweefsel neemt toe (fibrose). Anderzijds is er afbraak van
het longparenchym of emfyseem (Figuur 1) [1]. Inflammatoire cellen laten proteases vrij,
zoals matrix metalloproteinases (MMP‟s) en serine proteases. Door een onevenwicht tussen
proteases en hun inhibitoren, ontstaat er emfyseem [2]. Obstructieve bronchiolitis en
emfyseem kunnen zowel alleen als samen voorkomen, maar ze veroorzaken allebei
progressieve vermindering van de longfunctie.
Emfyseem is de permanente destructieve vergroting van luchtruimtes distaal van de
terminale bronchiolen [3]. Hier zijn drie tot vijf generaties respiratoire bronchioli, ducti
alveolares en sacculi alveolares gelegen [4]. De destructie resulteert in een verlies van de
elastische recoil, wat leidt tot verminderde airflow [3]. Er zijn twee soorten emfyseem,
naargelang de ernst en lokalisatie van de afbraak. Bij centri-acinair emfyseem begint de
destructie centraal in de respiratoire bronchioli. De respiratoire ruimte zet dan ook uit in het
centrum van de acinus. Dit is het geval bij emfyseem ontstaan door het roken van sigaretten.
Daarnaast bestaat er ook panacinair emfyseem, waarbij alle luchtwegen en alveoli van de
acinus betrokken zijn. Er is een uitgebreide afbraak en vergroting van de alveolaire ruimten.
Panacinair emfyseem komt onder andere voor bij alfa1-antitrypsine deficiëntie [4].
De luchtwegvernauwing is meestal progressief en er treedt een inflammatoire reactie
van de long op tegen toxische stoffen of gassen [1]. Bij ernstig en zeer ernstig COPD worden
er zelfs lymfoïde follikels gevormd [5]. De kleinste bronchioli zijn vaak gedeeltelijk
afgesloten door mucus en er is ook metaplasie door slijmbekercellen, die daar normaal niet
aanwezig zijn. In de vroegste stadia van de ziekte is er hypersecretie. Het ophoesten van deze
secreten is dan ook één van de eerste symptomen. Bij toenemende luchtwegenobstructie
treedt er ook kortademigheid op. Ten gevolge van stoornissen in de verhouding tussen
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
3
ventilatie en perfusie, ontstaat geleidelijk aan arteriële hypoxemie. Door emfyseem
vermindert het oppervlak voor gasuitwisseling [4].
Bovendien gaat COPD gepaard met extrapulmonaire effecten, zoals disfunctie van de
skeletspieren, een hoger risico op cardiovasculaire ziekten, gewichtsverlies, osteoporose en
depressie [6].
Figuur 1: De pathologie van obstructieve bronchiolitis en emfyseem [1].
Risicofactoren en epidemiologie
De belangrijkste risicofactor voor COPD is het roken van sigaretten. Meer dan 90%
van de patiënten met COPD roken actief of hebben gerookt. Blootstelling aan stof en
chemicaliën kan eveneens COPD veroorzaken. In landen zoals Azië is ook de luchtpollutie,
die ontstaat door verbranding van hout en andere biomass fuels, een risicofactor voor het
ontwikkelen van COPD.
Niet alle rokers zijn vatbaar voor COPD, wat aangeeft dat naast omgevingsfactoren, ook
genetische factoren een rol kunnen spelen. De best gedocumenteerde genetische factor is de
erfelijke deficiëntie van alfa1-antitrypsine. Alfa1-antitrypsine is een antiprotease. De
afwezigheid van dit enzym zorgt ervoor dat bepaalde proteasen vrij spel hebben en deze
patiënten zelfs zonder roken emfyseem ontwikkelen [4].
COPD komt vaker voor bij mannen dan bij vrouwen. De reden hiervoor is onduidelijk.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
4
Men voorspelt dat COPD in de lijst van belangrijkste doodsoorzaken van de 6e plaats in 1990
naar de 3e plaats zal stijgen tegen 2020 [1].
Longfunctie
De Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) heeft een
classificatie met 4 graden van ernst opgesteld (graad 1 tot graad 4), gebaseerd op metingen
van de luchtwegobstructie tijdens geforceerde expiratie. Het volume lucht dat in 1 seconde
uitgeademd wordt, is de één seconde waarde (ESW) of forced expiratory volume in one
second (FEV1). Ook de verhouding van de ESW tot de geforceerde vitale capaciteit (FVC)
wordt berekend. Hoe lager deze waarden, hoe ernstiger de ziekte en hoe hoger de classificatie.
Sigarettenrokers die gevoelig zijn aan rook hebben een snellere jaarlijkse vermindering van de
longfunctie. Het effect is ook dosisafhankelijk: hoe meer iemand rookt, hoe hoger de kans op
het ontwikkelen van COPD. Bij niet-rokers vermindert de ESW jaarlijks met 25 tot 30 ml,
vanaf de leeftijd van 25 tot 30 jaar. Bij rokers kan dit oplopen tot een verlies van 100 ml per
jaar. Wanneer deze personen stoppen met roken, loopt de jaarlijkse vermindering van de ESW
terug gelijk met die van niet-rokers (Figuur 2).
Het meten van de longfunctie is dus een belangrijke parameter in het evalueren van patiënten
met COPD. Dit gebeurt aan de hand van een spirometer [4, 5].
Figuur 2: Paradigma van Fletcher en Peto dat het natuurlijke verloop van COPD bij mannen aantoont
[7].
Regelmatige rokers die gevoelig zijn aan rook, vertonen een snellere daling in longfunctie. Na
rookstop loopt de jaarlijkse afname in longfunctie gelijk met niet-rokers. FEV1 = forced expiratory
volume in one second.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
5
Immunologie
Er is een accumulatie van inflammatoire cellen van zowel het aangeboren als het
verworven immuunsysteem: macrofagen, neutrofielen, T-lymfocyten (bij de mens vooral
cytotoxische CD8+
T-cellen) en dendritische cellen (DC) [8]. Dendritische cellen presenteren
antigenen aan T-lymfocyten en vormen zo de link tussen het aangeboren en verworven
immuunsysteem. Bij ernstig COPD organiseren de T- en B-lymfocyten zich net als in
secundaire lymfoïde organen (zoals milt en lymfeknopen), wat leidt tot de de novo vorming
van B-cel follikels en T-cel zones. Zo worden tertiaire lymfoïde organen (TLO) gevormd, ook
wel lymfoïd neogenese genoemd. In tegenstelling tot lymfeknopen, zijn TLO‟s niet voorzien
van afferente lymfevaten en een kapsel [9]. De aanwezigheid van lymfoïde follikels met
germinale centra wijst op een adaptieve immuunrespons. Dit kan duiden op een
immuunreactie tegen 1) een bepaalde stof uit de sigarettenrook 2) micro-organismen en
andere vreemde materialen die in de lagere luchtwegen geraken doordat het aangeboren
immuunsysteem het laat afweten 3) autoantigenen die ontwikkelen in repetitief beschadigd
longweefsel [10]. Er zijn al antilichamen tegen het lichaamseigen elastine gevonden [11].
Lymfoïd neogenese kan dus een beschermende rol hebben wanneer er een reactie is tegen
infectieuze micro-organismen, maar het kan ook een negatieve invloed hebben wanneer het
reageert tegen autoantigenen die vrijgelaten worden door de afbraak van het weefsel [9].
Na wegnemen van de schadelijke factor, verdwijnt de inflammatie niet. Waarom de
inflammatie blijft aanhouden, is een nog onopgeloste vraag.
Therapie
De enige behandeling om progressieve achteruitgang van de longfunctie tegen te gaan,
is stoppen met roken. Farmacologische behandelingen zijn alleen symptomatisch, ze halen de
oorzaak dus niet weg. Zowel bronchodilatoren als inhalatiecorticosteroïden maken deel uit
van de huidige behandeling. Het is nodig om de moleculaire en cellulaire mechanismen die
leiden tot de ontwikkeling van COPD op te klaren vooraleer een effectieve behandeling kan
worden opgestart [2].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
6
1.2 Het muismodel
In deze masterproef wordt gebruik gemaakt van een muismodel. Hiervoor zijn er
verschillende redenen. Het genoom van zowel mens als muis is gesequeneerd en blijkt
redelijk goed overeen te stemmen. Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid om de
genetische constitutie van de muis te veranderen door genen toe te voegen, te veranderen, te
verwijderen of de expressie te verhogen. In dit experiment wordt de CCR7 knock-out muis
gebruikt, waardoor de invloed van CCR7 in de pathologie van COPD bestudeerd kan worden.
Bovendien zijn er heel wat muisantilichamen voorhanden wat de kwantificatie en lokalisatie
makkelijk maakt.
Uiteraard zijn er ook nadelen verbonden aan het muismodel. Er zijn enkele anatomische en
fysiologische verschillen tussen de luchtwegen van de mens en die van de muis. Ook het
profiel van de inflammatoire mediatoren is iets anders bij de muis. Tot slot is er geen enkel
muismodel dat alle kenmerken van de COPD pathologie heeft. Bepaalde muisstammen
ontwikkelen vooral emfyseem, anderen zijn meer geschikt om inflammatie te onderzoeken.
Toch is de muis een handig en betrouwbaar model om onderzoek te doen naar COPD [12,
13].
In het labo van de Dienst Longziekten (UZ Gent) werden de kenmerken van het muismodel
na rookblootstelling vastgelegd. Hiervoor werd de stam C57BL/6 gebruikt. Na roken is er een
significante verhoging van het totaal aantal inflammatoire cellen in het bronchoalveolair
lavage (BAL)-vocht. Deze cellen bestaan vooral uit macrofagen, neutrofielen, lymfocyten en
dendritische cellen. Macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen verhogen iets vroeger dan
lymfocyten. Lymfocyten behoren tot het adaptief immuunsysteem, dat later in werking komt
dan cellen van het aangeboren immuunsysteem. In contrast met observaties bij de mens, is er
bij de muis een grotere verhoging van CD4+ T-lymfocyten in vergelijking met CD8
+ T-
lymfocyten.
In de long accumuleren macrofagen, dendritische cellen en lymfocyten. Er is ook neutrofilie,
maar die is minder uitgesproken dan in het BAL-vocht [14].
Rond de bronchiolen worden kleine aantallen lymfocyten teruggevonden. Chronische
rookblootstelling veroorzaakt sterke verhogingen in het aantal en de grootte van aggregaten,
analoog aan de lymfoïde aggregaten die bij ernstig COPD bij de mens aanwezig zijn [15, 16].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
7
Vorig onderzoek bij muizen heeft aangetoond dat zowel de grootte als de afmetingen van de
inflammatoire infiltraten verhogen na langdurige blootstelling aan sigarettenrook. Deze
inflammatoire infiltraten bestaan voornamelijk uit B-cellen, omringd door T-cellen. De B-cel
aggregaten zijn lymfoïde follikels, aangezien er folliculaire dendritische cellen aanwezig zijn.
Zowel CD4+ als CD8
+ T-cellen zijn aanwezig rond de lymfoïde follikels, de meerderheid is
CD4 positief [17].
Na 6 maanden roken is er een significante graad van emfyseem [14] en
luchtwegremodellering [15]. Luchtwegremodellering wordt bepaald aan de hand van de
hoeveelheid collageen, fibronectine en smooth muscle actine in de wand van de kleine
luchtwegen.
1.3 Lymfoïd neogenese
Deze masterproef kadert in een doctoraatsonderzoek naar de rol van lymfoïd
neogenese bij COPD. Lymfoïd neogenese is de nieuwvorming van lymfoïde follikels, die een
gelijkaardige structuur hebben als de secundaire lymfoïde organen.
De primaire lymfoïde organen zijn de thymus en het beenmerg. De T-cellen zijn
afkomstig uit de thymus, B-cellen vinden hun oorsprong in het beenmerg.
Secundaire lymfoïde organen (SLO) zijn onder andere lymfeknopen, de milt en
mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel (Peyerse platen, bronchus-geassocieerd lymfoïd
weefsel, …).
De lymfeknopen zijn sterk georganiseerde lymfoïde organen, omgeven door een kapsel. Ze
bevinden zich op de plaats waar de vaten van het lymfatische systeem samenkomen.
Afferente lymfevaten brengen de lymfe samen met pathogenen en antigendragende cellen van
de geïnfecteerde weefsels naar de lymfeknopen. In de lymfeknopen zijn de B-lymfocyten en
folliculaire dendritische cellen gegroepeerd in follikels, die zich in de buitenste cortex van de
lymfeknoop bevinden. T-cellen zijn meer diffuus verdeeld in de omgevende paracorticale
gebieden, ook T-cel zones genoemd. De lymfocyten bereiken de lymfeknopen door te
migreren door de wanden van gespecialiseerde bloedvaten, namelijk high endothelial venules
(HEV). Zo bereiken ze eerst de paracorticale gebieden. Ook antigenpresenterende
dendritische cellen en macrofagen zijn daar gelokaliseerd. Vrij antigen dat door de
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
8
lymfeknoop stroomt, kan makkelijk gevangen worden door deze dendritische cellen en
macrofagen. Doordat antigen, antigenpresenterende cellen en naïeve T-cellen zo dicht liggen,
kunnen naïeve T-cellen hun antigen binden en geactiveerd worden. De geactiveerde
lymfocyten ondergaan een periode van proliferatie en differentiatie. Vervolgens verlaten ze de
lymfeknopen als effector cellen via de efferente lymfevaten. Zo bereiken ze de bloedbaan en
uiteindelijk de weefsels waar ze hun werking kunnen uitvoeren (Figuur 3) [18].
Figuur 3: Structuur van een lymfeknoop [19]. CXCL = CX–chemokineligand, CCL = CC-
chemokineligand
De activatie van B-cellen vereist niet alleen antigen, maar ook samenwerking met helper T-
cellen. Naïeve B-cellen gaan eerst door de T-cel zones, waar ze zowel hun antigen als hun
helper T-cellen tegenkomen. Daardoor worden ze geactiveerd. Sommige B-cel follikels
bevatten germinale centra, waar geactiveerde B-cellen prolifereren en differentiëren in plasma
cellen [18].
De rekrutering en positionering van lymfocyten en DC‟s in de lymfeknoop wordt bepaald
door de lymfoïde chemokines (ook homeostatische chemokines genoemd). De familie van
lymfoïde chemokines bevat 3 liganden, CCL19, CCL21 en CXCL13, en 2 receptoren, CCR7
en CXCR5 [19].
Cytokines van de tumor necrosis factor (TNF) familie spelen een belangrijke rol in lymfoïd
organogenese. Muizen deficiënt aan lymfotoxine (LT)-α of LT-β vertonen abnormaliteiten in
de organisatie van lymfoïde organen en hebben een verminderde productie van CXCL13,
CCL19 en CCL21. TNF-α en zijn receptor TNF-R1 zijn ook noodzakelijk voor de normale
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
9
ontwikkeling van lymfoïde structuren en de expressie van chemokines nodig voor de
rekrutering van lymfocyten naar de T-cel en B-cel zones [9].
In de eerste stadia van SLO ontwikkeling, bindt membraangebonden lymfotoxine α1β2
(LTα1β2) (geëxpresseerd door CD3-CD4
+CD45
+ haematopoietische inducer cellen) op LTβR
op het oppervlak van stromale organizer cellen. Deze interactie resulteert in de aantrekking
van extra haematopoietische cellen, gevolgd door HEV differentiatie en de accumulatie van
naïeve T-lymfocyten (Figuur 4) [9].
Figuur 4: Vorming van B- en T-cel zones in lymfoïd weefsel [9].
DC = dendritische cel, CXCL = CXC-chemokineligand; FDC = folliculaire dendritische cel, LTβR =
lymfotoxine β receptor, LTα1β2 = lymfotoxine α1β2, CCL = CC-chemokineligand, ICAM =
intercellular adhesion molecule, MADCAM = mucosal vascular addressin cell adhesion molecule,
PNAD = peripheral node adressin, VCAM = vascular cell adhesion molecule.
De inductie en/of stabilisatie van tertiaire lymfoïde organen (TLO‟s) is deels
afhankelijk van de lokale beschikbaarheid van dezelfde moleculen die de fysiologische SLO
vorming mediëren [9].
Tertiaire lymfoïde organen bestaan uit lymfocyten die naar de plaats van inflammatie
aangetrokken worden. Deze structuren werden ook teruggevonden in darm, gewrichten en het
longparenchym van COPD patiënten [20].
Lymfoïd neogenese heeft zowel mogelijke voor- als nadelen. De lymfoïde follikels bieden
bescherming tegen pathogenen wanneer de lymfatische verbindingen tussen SLO en de
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
10
geïnfecteerde weefsels defect zijn. Er is ook een betere immuunrespons tegen zwak
immunogene antigenen omdat de hoeveelheid antigen hoger is op de plaats van inflammatie.
De pathogenen kunnen bovendien lokaal vernietigd worden. Een nadeel van lymfoïd
neogenese is de presentatie van zelfantigenen die vrijkomen door het destructieve
inflammatoire proces. Dit werkt ook het behouden van een chronische inflammatie in de
hand, doordat de immuunrespons onafhankelijk van het inducerende mechanisme ontstaat
[21].
1.4 Chemokines
Cytokines en chemokines zijn betrokken in verschillende processen van COPD, zoals
rekrutering van neutrofielen, macrofagen, T- en B-cellen, luchtwegremodellering, metaplasie
van de goblet cellen, hyperplasie van de epitheelcellen en de inductie van emfyseem [3]. In
deze masterproef wordt een bepaalde groep chemokines onderzocht.
Er bestaan verschillende soorten chemokines, waaronder CC en CXC chemokines. CC
chemokines bevatten 2 cysteïnes dicht bij het N-terminaal deel, bij CXC chemokines zijn de 2
cysteïnes gescheiden door een ander aminozuur. Sommige CC chemokines zorgen voor de
rekrutering van inflammatoire cellen van het bloed naar het longweefsel, anderen trekken de
cellen aan naar de lymfeknopen. Deze chemokines zijn dus een belangrijke factor in de
pathogenese van COPD.
Binnen het labo van de Dienst Longziekten (UZ Gent) werd de rol van CC-chemokine
receptor 5 (CCR5) onderzocht bij CCR5-deficiënte muizen. CCR5 komt tot expressie op
granulocyten, macrofagen, immature dendritische cellen, CD8+
T-lymfocyten en geheugen
CD4+
T-lymfocyten. Deze studie toonde aan dat CCR5 een rol speelt bij
sigarettenrookgeïnduceerde pulmonaire inflammatie, de vorming van peribronchiale lymfoïde
follikels en emfyseem, maar niet bij luchtwegremodellering. Chronische blootstelling aan
sigarettenrook leidt tot een verhoging in het aantal peribronchiale lymfoïde follikels. Dit komt
overeen met humane COPD patiënten. Hogg et al. [5] hebben aangetoond dat de progressie
van COPD geassocieerd is met verhoogde percentages van luchtwegen die lymfoïde follikels
bevatten. CCR5 KO muizen hebben significant minder van deze lymfoïde ophopingen rond
de luchtwegen na blootstelling aan sigarettenrook [16].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
11
CCR6 knock-out (KO) muizen werden door dezelfde onderzoeksgroep onderzocht. CCR6
komt tot expressie op immature dendritische cellen, B-lymfocyten, geheugen T-cellen,
cytokine-geactiveerde neutrofielen en in lage gehaltes op endotheelcellen. Rekrutering van
deze cellen gebeurt door interactie tussen CCR6 en zijn ligand Macrophage inflammatory
protein-3 (MIP-3)/CC-chemokine ligand 20 (CCL20). CCL20 neemt toe na
rookblootstelling. Pulmonaire inflammatie en emfyseem, geïnduceerd door sigarettenrook,
zijn verminderd bij CCR6 KO muizen. Het ontbreken van CCR6 heeft echter geen invloed op
de luchtwegremodellering [15].
1.5 Chemokine receptor 7
In deze masterproef wordt CC-chemokine receptor 7 (CCR7) onder de loep genomen.
Deze receptor werd voor het eerst geïdentificeerd in 1994 door Schweickart et al. [22]. CCR7
is een 7-transmembranaire, G-proteïne gekoppelde receptor.
CCR7 heeft een hoge expressie op naïeve T-cellen, mature dendritische cellen en in mindere
mate op B-cellen. Na activatie is er een verhoogde expressie van de receptor.
De liganden van CCR7 zijn CC-chemokine ligand 19 (CCL19) en CCL21. Deze zijn
constitutief geëxpresseerd door stromale cellen binnen de T-cel zones van secundaire
lymfoïde organen. Dendritische cellen in de T-cel zones expresseren CCL19, endotheelcellen
van high endothelial venules (HEVs) en lymfevaten secreteren CCL21. Er bestaan meerdere
kopijen van CCL21-genen. Deze genen coderen voor 2 proteïnen die maar 1 aminozuur
verschillen. Het CCL21a-gen codeert voor een eiwit met een serine op positie 65, het
CCL21b-gen codeert voor een eiwit met een leucine op positie 65. CCL21a komt
voornamelijk tot expressie in lymfoïde weefsels, CCL21b in niet-lymfoïde weefsels [23].
De belangrijkste functie van CCR7 is de homing van CCR7+
T-cellen en mature
dendritische cellen naar de T-cel zones van secundaire lymfoïde organen [24]. Dendritische
cellen hebben in niet-pathogene situaties een hoge expressie van chemokine receptoren 1 tot
en met 6. De aanraking met pathogenen leidt tot activatie van de Toll-like receptoren (TLR).
De TLR signalisatie zorgt ervoor dat de dendritische cellen beginnen te matureren. Dit houdt
ook de inductie van CCR7 in [18]. De expressie van CCR1 tot en met CCR6 verlaagt
daarentegen. Er is ook een opregulatie van major histocompatibility complex (MHC) en
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
12
costimulatorische moleculen. De mature dendritische cellen komen de lymfeknoop binnen via
afferente lymfevaten [25]. Lymfocyten bereiken de lymfeknoop via de high endothelial
venules (HEVs) (Figuur 5). De mature dendritische cellen activeren de naïeve T-lymfocyten
door interactie van MHC II, CD80, CD86 enerzijds en T-cel receptor en CD28 anderzijds.
Naast de mature en immature DC‟s, zijn er ook “semimature” DC‟s die CCR7 expresseren.
Deze cellen gebruiken de receptor om voortdurend te migreren naar de lymfeknopen, in de
afwezigheid van pathogene signalen. Daar dragen ze bij tot de perifere immuuntolerantie
tegen zelfantigenen [25].
Figuur 5: Homing van T-cellen naar de lymfeknoop [26]. HEV=high endothelial venule, CCL21=CC
chemokine ligand 21, CCR7= CC chemokine receptor 7, N= naïeve T-cel, E= effector T-cel.
De functie van CCR7 werd al onderzocht bij andere ziektes. Chronische reumatoïde
artritis is een auto-immuunziekte. Bij CCR7 KO muizen met antigen geïnduceerde artritis
worden er geen folliculaire structuren met afgelijnde B- en T-cel zones gevormd. Het aantal
en de grootte van de infiltraten is wel verhoogd. De infiltraten bevatten voornamelijk T-
cellen. Deficiëntie van de chemokine receptor CCR7 resulteert in verminderde lymfoïd
neogenese in de gewrichten van dit model van reumatoïde artritis. CCR7 speelt dus een rol in
de vorming van zowel secundaire als tertiaire lymfoïde organen [27].
Een ander onderzoek toonde aan dat CCR7 verantwoordelijk is voor de emigratie van
lymfocyten vanuit perifeer weefsel. CCR7-deficiëntie veroorzaakt de ontwikkeling van
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
13
lymfoïde follikels met high endothelial venule-like venules binnen het mucosaal weefsel van
de gastrointestinale tractus.
Om uit te sluiten dat de lokale omgeving en/of de commensale microflora de vorming van
ectopische lymfoïde follikels beïnvloedt, werden muizen behandeld met antibiotica. Deze
muizen hebben vergelijkbare lymfoïde folliculaire structuren als de andere mutante muizen
[28].
De belangrijkste eigenschap van CCR7-deficiënte muizen is de sterk veranderde
microarchitectuur van hun lymfoïde organen. Toch zijn bepaalde muismodellen in staat om
ectopische, goed georganiseerde lymfoïde structuren te vormen op mucosale plaatsen zoals de
longen, maag en darmen. Deze lymfoïde aggregaten hebben goed afgelijnde T- en B-cel zones
en high endothelial venules. CCR7-deficiënte muizen hebben een verminderde homing en
positionering van naïeve, centrale geheugen en regulatorische T-cellen naar de lymfeknopen.
Er is ook een defectieve migratie van dendritische cellen van de huid, intestinale lamina
propria en longen naar de lymfeknopen. De expressie en functie van CCR7 is ook
noodzakelijk voor de differentiatie en maturatie van thymocyten. CCR7-deficiënte muizen
vertonen een vertraagde inductie van adaptieve immuunresponsen [29].
Er wordt gesteld dat georganiseerde tertiaire lymfoïde structuren kunnen bijdragen tot de
pathogenese van auto-immuunziekten doordat het autoantigen gepresenteerd wordt op de
plaats van inflammatie zelf. Hierbij worden autoreactieve T-lymfocyten gegenereerd en B-
cellen geactiveerd om autoantilichamen te produceren [30]. Men zou dus kunnen denken dat
COPD ook een auto-immuunziekte is.
CCR7 heeft nog verschillende andere functies. CCR7 induceert de activatie van de
PI3K/Akt pathway. PI3K fosforyleert Akt, waarna Akt op zijn beurt NFκB fosforyleert.
NFκB inhibeert p53-gemedieerde apoptose, opreguleert anti-apoptotische moleculen en
caspase-inhibitoren. Zo wordt apoptose tegengegaan en is er meer overleving van de cellen.
Daarnaast kan CCR7 ook chemotaxis reguleren door activatie van moleculen van de Mitogen-
Activated Protein Kinase (MAPK)-familie, namelijk Erk1/2, p38 en JNK. Erk1 en Erk2 zijn
serine-threonine kinases. c-Jun N-terminal kinases (JNK) worden geactiveerd door een
dubbele fosforylatie op threonine (T) en tyrosine (Y). Geactiveerde JNK lokaliseren naar de
nucleus waar ze de activiteit van verschillende transcriptiefactoren reguleren. JNK reguleert
zo ondermeer de chemotactische activiteit van de cellen. De migratiesnelheid wordt ook
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
14
bepaald door CCR7. CCR7 induceert de activatie van GTPase Rho, tyrosine kinase Pyk2 en
de inactivatie van cofiline. Src is een tyrosine kinase en induceert, naast Rho, de activatie van
Pyk2. Pyk2 fosforyleert en inactiveert cofiline. Cofiline is een actine-bindend eiwit dat de
actine-filamenten kan depolymeriseren en speelt dus een grote rol in de motiliteit van de cel.
Hiernaast speelt CCR7 ook een rol in endocytose, cytoarchitectuur (zoals dendrietvorming in
dendritische cellen) en maturatie van de cel. De moleculaire pathways hiervoor zijn nog niet
opgehelderd [25, 31].
De expressie van CCR7 is geïnduceerd door Suppressor of cytokine signaling-1
(SOCS1). Na overexpressie van SOCS1 is er een opregulatie van CCR7 [32]. SOCS1 komt
tot expressie na binding van een cytokine op de receptor. Janus kinase (JAK) dimeriseert, er
treedt autofosforylatie op en de Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) -
proteïnen worden geactiveerd. Deze kunnen op hun beurt de transcriptie van SOCS1
stimuleren. SOCS1 inhibeert de JAK kinase activiteit op een directe manier, waardoor er geen
fosforylatie is van de receptor. Hierdoor kan STAT6 niet binden en geen inhiberende invloed
hebben op de transcriptie van CCR7 [33].
Janus kinase 3 (Jak3)-deficiënte muizen hebben geen perifere lymfeknopen of Peyerse platen.
Jak3-/-
T-cellen hebben een verminderde chemotactische respons tegenover CCL19 en CCL21.
Er is dus een verlaagde migratie naar perifere, mesenterische lymfeknopen en Peyerse platen.
De migratie naar de milt is minder afwijkend. Dit komt overeen met de bevinding dat migratie
naar de milt minder afhankelijk is van chemokines. De homing naar de lymfeknopen is niet
volledig afwezig, wat suggereert dat er nog andere receptoren instaan voor de beweging van
T-lymfocyten naar deze organen.
Thymocyten hebben een hogere CCR7 expressie in Jak3-deficiënte muizen in vergelijking
met wildtypes. Dit toont aan dat de verlaagde chemotactische respons te wijten is aan een
verminderde signalisatie, niet aan een lagere expressie van CCR7 op het oppervlak.
Jak3 wordt gefosforyleerd in respons op CCL19 en CCL21 in cellen van de lymfeknoop. Jak3
is nodig voor een CCR7-gemedieerde migratie [34].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
15
1.6 Regulatorische T-cellen
Regulatorische T-cellen (Treg) hebben als functie het onderdrukken van de
immuunrespons.
CCR7 heeft een hoge expressie op FoxP3+CD4
+CD25
+ regulatorische T-cellen en beïnvloedt
hun lokalisatie in verschillende organen [35]. Forkhead box protein (FOX) P3 is een
transcriptiefactor cruciaal voor de ontwikkeling en functie van de regulatorische T-cellen. Het
wordt beschouwd als de meest specifieke merker voor Treg cellen [20]. CD25 is de α-keten
van de interleukine (IL)-2 receptor [18].
Regulatorische T-cellen spelen een belangrijke rol in het voorkomen van auto-immuniteit en
de controle van inflammatoire reacties. Ze inhiberen geactiveerde lymfocyten door de
vrijstelling van molecules zoals IL-10 en TGF-β, of door celcontactmechanismen [20]. Er
wordt een onderscheid gemaakt tussen 2 subtypes: naïeve Treg cellen (αE negatief = CD103-)
en effector/memory-like Treg cellen (αE positief = CD103+). CD103
is de α-keten van αEβ7-
integrine. De naïeve Treg cellen circuleren door de lymfoïde organen en onderdrukken
voornamelijk de inductieve fase van immuunresponsen op deze plaatsen. Treg cellen met een
effector/memory fenotype migreren naar plaatsen van inflammatie waar ze immuunresponsen
onderdrukken [29, 36]. CD103+ effector-like Treg cellen domineren in CCR7-deficiënte
muizen, wat suggereert dat dit T-cel fenotype kan ontwikkelen in de complete afwezigheid
van CCR7-afhankelijke lymfeknoop homing [29].
CCR7-deficiënte naïeve Treg cellen kunnen niet door de lymfeknopen circuleren en bijgevolg
vermindert hun capaciteit om de expansie en effector differentiatie van CD4+
T-cellen tegen te
gaan sterk. CCR7 zelf is echter niet nodig voor de suppressieve functie van Treg cellen [35].
In de longen van patiënten met COPD zijn er significant minder regulatorische T-cellen
gevonden, met een verminderde expressie van FoxP3. In het bronchoalveolair lavage (BAL) -
vocht daarentegen, is er een verhoogde CD4/CD25 expressie bij rokers en COPD patiënten in
vergelijking met niet-rokers, met een verhoogde FoxP3 expressie in deze cellen. De reden
voor dit verschil tussen longen en BAL- vocht blijft onduidelijk [3].
Een recente studie heeft aangetoond dat het aantal FoxP3-positieve cellen opgereguleerd is in
de grote luchtwegen van rokers met of zonder COPD, maar downgereguleerd is in de kleine
luchtwegen van COPD-patiënten [37].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
16
Plumb et al.[20] bestudeerden specifiek de lymfoïde follikels bij patiënten met matige COPD,
rokers en niet-rokers. Er zijn verhoogde aantallen van Tregs in follikels van COPD-patiënten
in vergelijking met de andere 2 groepen. Men denkt dat het verhoogde aantal Tregs de
interacties tussen dendritische cellen en T-lymfocyten onderdrukken, die leiden tot CD8
proliferatie. De Tregs kunnen ook de B-cel activatie tegengaan.
In de literatuur is er geen eenduidige visie over het aantal Tregs in de long. Dit heeft deels te
maken met een verschillend gebruik in merkers. In deze masterproef worden Tregs
gekarakteriseerd als CD4+CD25
+FoxP3
+ cellen.
1.7 Doelstelling
In deze masterproef worden de moleculaire en cellulaire mechanismen onderzocht die zorgen
voor lymfoïd neogenese in een experimenteel model van COPD. De rol van CCR7 in het
ontstaan van inflammatie in de long en luchtwegen, in het ontstaan van emfyseem en van
lymfoïde follikels wordt nagegaan.
De inflammatie ter hoogte van het BAL-vocht en het longweefsel wordt bestudeerd aan de
hand van FACS-analyse. Emfyseem wordt gekwantificeerd door de gemiddelde grootte van
de longblaasjes te berekenen. Door immuunhistochemische kleuring van de coupes kunnen de
lymfoïde follikels geteld worden.
Zoals reeds vermeld kadert deze masterproef in het doctoraatsonderzoek van Tine Demoor. Er
wordt dan ook een paper over CCR7 gepubliceerd in de Journal of Immunology (submitted).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
17
2. Materialen en methoden
Protocol
Er worden 4 groepen van telkens 8 muizen onderzocht. Groep I en II zijn wildtype muizen.
Groep I wordt aan lucht blootgesteld, groep II aan sigarettenrook. Groep III en IV zijn CCR7
KO muizen. Analoog aan de wildtype muizen, wordt groep III aan lucht blootgesteld en groep
IV aan sigarettenrook (Tabel I).
Na 4 weken kan de inflammatie onderzocht worden in de long en in het broncho-alveolair
lavage (BAL)-vocht bij de 4 groepen.
Na 24 weken is er meer informatie: nu kan niet alleen de inflammatie, maar ook de vorming
van lymfoïde follikels en emfyseem bestudeerd worden. Ook de verbanden tussen deze
parameters onderling worden onderzocht.
Tabel I: Groepsindeling van de muizen.
genotype blootstelling A: 4 weken B: 24 weken
wildtype muizen Lucht I I
Rook II II
CCR7 KO muizen Lucht III III
Rook IV IV
Muizen
Het onderzoek gebeurt op homozygote mannelijke CCR7 knock-out muizen (= C57BL/6
muizen die een deletie hebben van het CCR7 gen) en wildtype C57BL/6 muizen. Alle muizen
(8 weken oud) zijn afkomstig van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA).
Er worden 4 groepen van telkens 8 mannelijke muizen vergeleken: wildtype niet-rokers,
wildtype rokers, CCR7 KO niet-rokers en CCR7 KO rokers.
Aangezien er met proefdieren gewerkt wordt, werd er een aanvraag ingediend bij het Ethisch
Comité Proefdieren van Universiteit Gent. Deze aanvraag werd goedgekeurd, daardoor wordt
er voldaan aan de richtlijnen van Good Laboratory Practice.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
18
Sigarettenrookblootstelling
De muizen (n = 8 per groep) worden 4 keer per dag blootgesteld aan sigarettenrook
(Reference Cigarette 3R4F zonder filter, University of Kentucky, Lexington, KY, USA) met
een 30 minuten rookvrij interval, 5 dagen per week, gedurende 4 weken (subacuut) of 24
weken (chronisch). Elke groep wordt blootgesteld aan de tabaksrook van 5 sigaretten.
Er is een rook:lucht ratio van 1:6.
De controlemuizen worden blootgesteld aan lucht.
Bronchoalveolaire lavage, celtelling in Bürker telkamer en cytospins
De muizen worden 24 uur na de laatste rookblootstelling gewogen en gedood met een
overdosis Nembutal (Sanofi, Libourne, Frankrijk) door middel van intraperitoneale injectie.
Wanneer de muis niet meer op prikkels reageert, wordt het oog verwijderd en het bloed
opgevangen in een proefbuis. Daarna wordt de trachea blootgelegd. Vervolgens wordt er een
canule in de trachea gebracht om de longen te laveren. Dit gebeurt eerst met 3 maal 300 µl
Hank‟s balanced salt solution (HBSS) (Lonza, Basel, Zwitserland) met 1% Bovine Serum
Albumine (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). BSA zorgt ervoor dat de cytokines
niet afgebroken worden en dat de cellen niet plakken. Daarna wordt er gelaveerd met 3 maal 1
ml HBSS met een supplement ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) (Sigma-Aldrich). Door
het EDTA komen de cellen makkelijker los.
Het lavagevocht wordt gecentrifugeerd (1800 toeren per minuut, 4°C, 5‟). De grote fractie
supernatans wordt weggegoten, de kleine BSA-fractie supernatans wordt in een epje
overgebracht en er wordt 5 µl protease inhibitor toegevoegd. De epjes worden ingevroren op -
80 °C. De pellets van elke muis worden gebruikt voor FACS-analyse.
Om de cellen te kunnen tellen worden ze verdund in Türk-oplossing (bevat ijsazijn, 1%
waterig methylviolet of gentiaanvioletoplossing en gedestilleerd water) die de eventueel
resterende rode bloedcellen lyseert.
Vervolgens worden de cellen geteld met een Bürker telkamer (Novolab, Geraardsbergen,
België), in 25 grote vierkanten. Op de rand liggende cellen worden op 2 zijden meegeteld. Er
wordt 3 keer geteld op 3 verschillende plaatsen in de telkamer. Van de bekomen waarden
wordt er een gemiddelde gemaakt (A), deze wordt vermenigvuldigd met factor 10000 (deze
factor is specifiek voor de gebruikte telkamer) en met de gebruikte verdunningsfactor. De
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
19
uitkomst is het aantal cellen per milliliter (B). De cellen werden echter opgelost in 200 µl, dus
moet B gedeeld worden door 5 (C) om het totaal aantal BAL cellen te bekomen.
Daarna worden er cytospins gemaakt. Hiervoor wordt de celoplossing verdund met HBSS
naar een concentratie van 0.5x106
cellen/ml. Niet-gecoate draagglaasjes worden samen met
een cup en filterpapiertje in de houder gemonteerd en in de cytocentrifuge gestoken. Eerst
wordt er 100 µl 2% BSA in PBS (phosphate-buffered saline) (Lonza) in de cups gebracht, om
de glaasjes vochtig te maken (= prewetten). Nadien worden de stalen (met 50000 cellen per
cytospin) in de cups gebracht en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd aan een snelheid van
400 toeren per minuut.
De cytospins drogen overnacht in de trekkast. Ze worden gekleurd met May-Grünwald-
Giemsa (1 minuut May-Grünwald (Sigma-Aldrich), 1 minuut PBS en 10 minuten Giemsa
(VWR, Leuven, België)), gespoeld in aquadest en na een nacht drogen worden ze afgedekt
met Mounting medium (ProSan, Merelbeke, België). Door de kleuring worden macrofagen,
neutrofielen en lymfocyten zichtbaar onder de microscoop. Deze cellen worden geteld.
Spoelen van de longen en longfixatie
Na de longlavage wordt er een knipje gemaakt in het linkeratrium van het hart en een infuus
met fysiologische oplossing (0,9% NaCl) ingebracht, waardoor de longcirculatie gespoeld
wordt. De rechterlong wordt afgeklemd en verwijderd. Een deel van de long (inferior lobe)
wordt gebruikt voor digestie, een tweede deel (middle lobe) voor RNA isolatie en een derde
deel (superior lobe) wordt ingevroren in vloeibare stikstof voor Western blotting. De post-
caval lobe wordt niet gebruikt. De linkerlong wordt gefixeerd door infusie van 2 ml 4%
paraformaldehyde door de tracheale canule. Hiervoor wordt de muis 10 minuten aan de pomp
gelegd die een snelheid heeft van 12 ml/h. De trachea, thymus, het hart en de linkerlong
worden uit de borstkas gesneden. De long wordt van de rest gescheiden, overgebracht in een
tube met fixatief en moet 2h al roterend verder fixeren. Vervolgens worden de weefsels in
PBS gebracht en 2h gespoeld. Dit wordt in verse PBS buffer gestockeerd bij 4 graden. Later
wordt de gefixeerde long ingebed in paraffine. Hiervoor worden de weefsels eerst ontwaterd
door ze in een stijgende reeks alcoholbaden te brengen, daarna worden ze overgebracht in
xyleen die mengbaar is met zowel alcohol als het inbedmiddel (nl. paraffine). Vervolgens
worden de weefsels in kleine coupes gesneden van 3 µm.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
20
Beeldjes van de coupes worden genomen met een Zeiss KS400 image analyser (KS400,
Zeiss, Oberkochen, Duitsland).
Single cell suspensie van de long
De inferior lobe van de rechterlong wordt in een 24-well plaat overgebracht, die gevuld is met
Tissue Culture Medium (TCM). Deze oplossing bevat Roswell Park Memorial Institute
(RPMI) medium, 5% foetaal kalfsserum (FCS), L-glutamine, penicilline/streptomycine en β-
mercaptoethanol. De long wordt fijngeknipt met een schaartje en overgebracht naar een
Falconbuis. Na het centrifugeren wordt het medium van tussen de longstukjes weggezogen.
Er wordt 3 ml digestiemedium (bevat collagenase, DNAse en TCM) toegevoegd en de buisjes
worden gedurende 30 minuten in een 37 °C incubator geplaatst. Daarna worden de
longstukjes fijngemaakt met een spuit. Na toevoegen van 2 ml digestiemedium gaan de
buisjes opnieuw de incubator in voor 15 minuten. De overblijvende longstukjes worden na de
incubatie nog eens fijngemaakt en daarna gecentrifugeerd. Het supernatans wordt geaspireerd.
De overblijvende celpellet wordt geresuspendeerd in 10 mM EDTA (hierdoor stopt de
digestie) en een overmaat FACS buffer. Dit wordt nogmaals gecentrifugeerd en geaspireerd.
Er wordt 1 ml ACK toegevoegd en na 3 minuten geresuspendeerd. Na nog eens 3 minuten
worden de cellen in een overmaat FACS buffer gebracht, gefilterd, gecentrifugeerd en
geaspireerd. De cellen worden geresuspendeerd in 1 ml FACS buffer, hiervan wordt 20 µl in
een cuvet gebracht voor de celtelling, samen met 10 ml Isoton (Beckman Coulter, Gent,
België). De hoeveelheid cellen wordt geteld met een Z2 Beckman Coulter particle counter
(Beckman Coulter).
De rest van de cellen wordt over de flexiplaten verdeeld voor de FACS-analyse.
Lymfeknopen verwijderen
In totaal worden vijf mediastinale lymfeknopen verwijderd: 1 grote paratracheale lymfeknoop
en 2 kleine parathymale lymfeknopen aan beide zijden van de thymus. Deze worden samen in
een buisje met TCM gebracht. Later wordt het medium van tussen de lymfeknopen
weggezogen en 2 ml digestiemedium toegevoegd. Na 30 minuten incubatie bij 37 °C worden
de lymfeknopen fijngemaakt met een spuit en er wordt nog 1 ml digestiemedium toegevoegd.
De buisjes gaan terug in de incubator voor 15 minuten. Daarna worden de lymfeknopen
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
21
nogmaals fijngemaakt met een spuit. Na centrifugatie en aspiratie worden de cellen
geresuspendeerd in 1 ml 10 mM EDTA (om de digestie te stoppen) en een overmaat FACS
buffer. Er wordt opnieuw gecentrifugeerd en geaspireerd. Daarna voegt men 500 µl ACK toe,
dit wordt na 3 minuten geresuspendeerd. Na nog eens 3 minuten wordt er een overmaat FACS
buffer toegevoegd, gefilterd, gecentrifugeerd en geaspireerd. De cellen worden
geresuspendeerd in 1 ml FACS buffer, hiervan wordt 20 µl in een cuvet gebracht voor de
celtelling, samen met 10 ml Isoton (Beckman Coulter). De hoeveelheid cellen wordt geteld
met een Z2 Beckman Coulter particle counter (Beckman Coulter).
De rest van de cellen wordt over de flexiplaten verdeeld voor de FACS-analyse.
FACS-analyse
Flow cytometrie of fluorescence activated cell sorting (FACS) gebeurt met de
FACSCaliburTM
(BD Biosciences, Franklin Lakes, California, USA), de resultaten van de
stalen worden door het softwareprogramma CellQuestTM
Pro 5.2 (BD Biosciences) opgeslaan.
Voor de analyse van de data wordt het softwareprogramma FlowJo (TreeStar Inc., Ashland,
OR, USA) gebruikt.
FACS laat toe om het percentage cellen, dat positief is voor bepaalde antigenen, te
kwantificeren. Antilichamen worden gelabeld met fluorochromen. De cellen passeren langs
een excitatiebron. Positieve cellen absorberen het licht en zenden een fluorescent signaal uit,
dat gemeten wordt door de detector. Een eerste laser detecteert FITC (fluoresceïne-
isothiocyanaat, geelgroen licht), PE (phyco-erytrine, oranje licht) en PerCP (peridinine
chlorophylprotein E, rood licht). De tweede laser detecteert APC (allophycocyanine, blauw
licht). De Forward Scatter bepaalt de grootte van de cel, de Side Scatter de complexiteit van
de cel.
De inferior lobe van de long wordt na digestie gelabeld voor FACS-analyse. De pellets uit het
BAL-vocht van elke muis worden bij elkaar gebracht en aangelengd tot 200 µl met FACS
buffer. De buisjes worden gecentrifugeerd en geaspireerd. Er wordt 500 µl ACK toegevoegd
aan de BAL-stalen. ACK is een kinase en lyseert de rode bloedcellen. Deze worden na 3
minuten geresuspendeerd en na 3 minuten wordt er een overmaat FACS buffer aan
toegevoegd. Het staal wordt gefilterd, gecentrifugeerd en geaspireerd. Per labeling wordt er
200 µl van de BAL-stalen over de flexiplaten verdeeld.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
22
De flexiplaten met cellen uit het BAL-vocht, de long en de lymfeknopen worden
gecentrifugeerd (1500 toeren per minuut, 4°C, 3‟) en geaspireerd. Er wordt overal 40 µl Fc-
Block aan toegevoegd (om aspecifieke bindingen te vermijden). Na resuspenderen volgt er
een incubatieperiode van 15 minuten op ijs. Hierna worden de platen afgedraaid, geaspireerd
en geresuspendeerd (in het donker) met de eerste mix van antilichamen en de singles (38 µl
per well). Bij de blanco en de 7AAD (7-aminoactinomycine D) single wordt er alleen FACS
buffer toegevoegd. Na 30 minuten incubatie op ijs in het donker worden de platen gewassen
met 170 µl FACS buffer, gecentrifugeerd, geaspireerd en geresuspendeerd (in het donker) met
de tweede mix. De stalen incuberen opnieuw gedurende 20 minuten op ijs in het donker. De
platen worden nogmaals gewassen met 170 µl FACS buffer, gecentrifugeerd, geaspireerd en
tenslotte overbracht naar de FACS buisjes in 250 µl FACS buffer. Bij alle stalen die niet met
PerCP gelabeld worden, wordt er 20 µl 7AAD gevoegd. Alleen de single 7AAD krijgt dit
ook. Er wordt geïncubeerd op kamertemperatuur in het donker voor 10 minuten. Daarna
worden de buizen op ijs gezet (om de werking van 7AAD te stoppen) en geanalyseerd.
Macrofagen zijn CD11c-positief, hoog autofluorescent en MHCII-negatief. Dendritische
cellen zijn CD11c-positief, laag autofluorescent en MHCII-positief. Bij het BAL-vocht en de
longen wordt er naast het totale aantal DC‟s ook een subtype van de DC‟s geanalyseerd,
namelijk de CD11b-positieve myeloïde DC‟s. Deze dendritische cellen zijn net zoals de
plasmacytoïde DC‟s onder de basolaterale membraan gelokaliseerd. In tegenstelling tot de
CD11b-negatieve, Langerine-positieve DC‟s, hebben de myeloïde DC‟s geen uitlopers tussen
de epitheelcellen (Figuur 6) [38].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
23
Figuur 6: Subtypes van dendritische cellen in de luchtwegen. De residente DC‟s liggen onder
epitheliale laag. De CD11b-, Langerine
+ DC‟s vormen uitlopers tussen de epitheelcellen. De CD11b
+
residente DC‟s en de plasmacytoïde DC‟s zijn onder de basale membraan gelokaliseerd. In de
alveolaire ruimte zijn er alveolaire DC‟s en macrofagen aanwezig. Bij inflammatoire omstandigheden
worden er geactiveerde CD11b+, Ly6c
+ inflammatoire DC‟s teruggevonden, naast interferon-
producerende killer DC‟s [38].
Bij de lymfeknopen wordt er een onderscheid gemaakt tussen dendritische cellen die van de
luchtweg afkomstig zijn (airway-derived dendritic cells) en dendritische cellen die niet uit de
luchtweg komen (non-airway-derived dendritic cells) (Figuur 7).
Figuur 7: Vermaelen K. et al. hebben aangetoond dat groep 1 de airway-derived DC‟s voorstelt en
groep 2 de non-airway-derived DC‟s. Groep 1 is MHCIIhiCD11c
med-hi , groep 2 is MHCII
medCD11c
hi
[39].
T-lymfocyten zijn CD3-positief . Verder wordt er een onderverdeling gemaakt in CD4
+ en
CD8+ T-lymfocyten. Om actieve lymfocyten te kunnen onderscheiden van niet-actieve, wordt
de activatiemerker CD69 toegevoegd. Regulatorische T-cellen zijn positief voor CD4, CD25
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
24
en FoxP3. Als isotype controle wordt PE-geconjugeerd rat IgG2a gebruikt (eBioscience, San
Diego, CA, USA).
Bij BAL-vocht zijn er te weinig cellen om zowel CD4+
/ CD69+
als CD8+
/ CD69+
cellen te
scheiden. Daarom worden alleen CD4+
en CD8+
T-lymfocyten bekeken, zonder rekening te
houden met de activiteit.
De expressie van CCR7 op de cellen wordt uitgedrukt in MFI, mean fluorescence intensity.
Dit is de gemiddelde fluorescentie per cel. Hoe meer fluorescentie, hoe meer CCR7 expressie.
Als isotype controle wordt PE-geconjugeerd rat IgG2a gebruikt. Alle monoklonale
antilichamen en reagentia zijn van BD Pharmingen (San Diego, CA, USA), behalve anti-
CCR7 PE, FoxP3-PE en de isotype controles (eBioscience).
Overzicht van de stalen
→ BAL:
- Macrofagen/dendritische cellen (CD11c-APC/MHCII-biotine-streptavidine-PerCP/
CCR7-PE)
bij de 1 maand proef: dendritische cellen (CD11c-APC/MHCII-biotine-streptavidine-
PerCP/CD11b-PE)
- T-lymfocyten (CD3-APC/CD4-FITC/CD8-PE/7AAD)
→ Long:
- Dendritische cellen (CD11c-APC/MHCII-biotine-streptavidine-PerCP/
CCR7-PE)
bij de 1 maand proef: dendritische cellen (CD11c-APC/MHCII-biotine-streptavidine-
PerCP/CD11b-PE)
- T-lymfocyten (CD3-APC/CD4-FITC/CD69-PE)
- T-lymfocyten (CD3-APC/CD8-FITC/CD69-PE)
- B-lymfocyten (CD11c-APC/CD19-FITC/CCR7-PE)
- Regulatorische T-cellen (CD3-APC/CD4-PerCP/CD25-FITC/FoxP3-PE)
→ Lymfeknopen:
- Macrofagen/dendritische cellen (CD11c-APC/MHCII-biotine-streptavidine-PerCP/CCR7-
PE)
- Regulatorische T-cellen (CD3-APC/CD4-PerCP/CD25-FITC/FoxP3-PE)
- T-lymfocyten (CD3-APC/CD4-PerCP/CD8-FITC/CCR7-PE)
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
25
Immunohistochemie: CD3/B220 dubbelkleuring
Eerst worden de coupes gedeparaffineerd. Daarvoor worden de coupes 3 keer 5 minuten in
ultraclear (Klinipath, Geel, België) gebracht in de 37°C stoof. Bij kamertemperatuur worden
de coupes eerst 2 maal in een 100% ethanolbad (Klinipath) gebracht, daarna 2 maal in een
96% ethanolbad (Klinipath) en tenslotte in aquadest (telkens gedurende 5 minuten).
Vervolgens worden de coupes in een warme citraatoplossing (Klinipath) gebracht (=antigen
retrievel). Door verhitting worden de crosslinks verbroken, waardoor de antigenische epitopen
vrij komen.
Visualisatie van de lymfoïde follikels gebeurt aan de hand van een immunohistochemische
kleuring. Voor T-lymfocyten wordt een anti-CD3 monoklonaal antilichaam (Dako,
Carpinteria, CA, USA) gebruikt, voor B-lymfocyten een anti-B220 monoklonaal antilichaam
(BD Pharmingen). Eerst worden de coupes geïncubeerd met 3% H2O2 (Merck, Darmstadt,
Duitsland) in PBS (Lonza), Boehringer blocking agent (Roche Diagnostics, Basel,
Zwitserland) (om hydrofobe achtergrondkleuring te verminderen) met triton X100 (Sigma-
Aldrich) en het primaire antilichaam anti-CD3 of isotype konijn Ig (Abcam, Cambridge, UK).
Triton is een detergent en zorgt ervoor dat de celmembranen permeabel worden, waardoor het
antilichaam optimaal kan binden. Daarna wordt het poly-HRP (horse radish peroxidase)
antikonijn (Klinipath) en het substraat DAB (diaminobenzidine) (Dako) toegevoegd. Door de
reactie met H2O2 en HRP, wordt DAB geoxideerd, wat een bruine neerslag geeft.
In een tweede stap worden de coupes geïncubeerd met anti-B220 biotine of isotype rat IgG2a
biotine (BD Pharmingen) na Boehringer blocking met triton X100. Tot slot worden de coupes
geïncubeerd met streptavidine alkalische fosfatase en gekleurd met Vector Blue (Vector
Laboratories Inc., Burlingame, California, USA) [16].
Scoring lymfoïde follikels
Het aantal peribronchiale lymfoïde follikels bij rokers en niet-rokers van wildtype muizen en
CCR7-/-
muizen wordt vergeleken.
Eerst wordt het aantal luchtwegen geteld. Daarna worden de aggregaten en follikels gescoord.
Een follikel wordt gedefinieerd als dens, met minimum 50 cellen. Er moeten zowel B- als T-
cellen aanwezig zijn. Een aggregaat bevat minimum 20 cellen.
Het aantal follikels en aggregaten per aantal luchtwegen wordt berekend en in grafiek gezet.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
26
Immunohistochemie: CCL19/ProSPC
Paraffinecoupes worden gekleurd om de aanwezigheid van CCL19 en ProSP-C aan te tonen.
Na het deparaffineren, de antigen retrievel en na blocking met Boehringer block (Roche
Diagnostics), wordt het antilichaam tegen CCL19 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)
aangebracht. Na toevoegen van geit probe en geit polymeer (Biocare Medical, Concord, CA,
USA), wordt het substraat New Fuchin (Dako) op de coupes gebracht.
Na blocking met Boehringer block wordt het tweede antilichaam tegen proSP-C (Chemicon,
Billerica, MA, USA) toegevoegd. Daarna wordt het powervision anti-rabbit AP (Klinipath) en
het substraat Vector Blue (Vector Laboratories Inc.) toegevoegd.
Er worden ook coupes gemaakt met alleen CCL19 aankleuring om nadien de intensiteit van
de aankleuring te kunnen scoren. Er worden scores van 0 (geen aankleuring) tot 4 (zeer sterke
aankleuring) toegekend.
RNA-extractie
Uit de middelste lob van de rechterlong wordt het RNA geëxtraheerd, om aan de hand van
RT-PCR het mRNA niveau van enkele chemokines te kunnen bepalen. De kits die hiervoor
gebruikt worden zijn RNAlater Stabilisation Set (Qiagen, Hilden, Duitsland), RNeasy Mini
kit (Qiagen), RNase-free DNase Set (Qiagen) en proteïnase K (20 mg/ml) (Qiagen). Vooraf
wordt er per ml RLT buffer 10 µl -mercaptoethanol toegevoegd. Een eerste stap is het
lyseren en homogeniseren van het longweefsel. Hiervoor wordt er 600 µl RLT buffer (met de
reeds toegevoegde -mercaptoethanol) aan een klein longlobje toegevoegd. Het staal wordt
gehomogeniseerd met een automatische stamper. Daarna wordt er 590 µl RNase-vrij H20 en
10 µl proteinase K toegevoegd. Het staal wordt gevortext, 10 minuten geïncubeerd bij 55 °C
en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd aan 14000 toeren per minuut. Het supernatans (900
µl) wordt overgebracht naar een nieuw epje.
Tijdens de tweede stap wordt het RNA op de kolom gebonden. Er wordt 450 µl 100 %
ethanol toegevoegd en goed gemengd met een pipet. Van het lysaat wordt er 700 µl op een
RNeasy kolom gebracht, deze wordt op een 2 ml collection tube geplaatst. Na 15 seconden
centrifugeren (10000 toeren per minuut) wordt de flow-through verwijderd en de rest van het
lysaat op de kolom gebracht. Er wordt opnieuw 15 seconden gecentrifugeerd (10000 toeren
per minuut) en de flow-through wordt verwijderd.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
27
De derde stap is de DNase digestie stap. Er wordt 350 µl RW1 buffer op de RNeasy kolom
gepipetteerd. Na 15 seconden centrifugeren (10000 toeren per minuut) wordt de flow-through
verwijderd. Van de DNase I stock oplossing wordt er 10 µl bij 70 µl RDD buffer gevoegd en
voorzichtig gemengd. Dit mengsel wordt op het RNeasy silica-gel membraan gepipetteerd en
15 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Er wordt 350 µl RW1 buffer op de RNeasy
kolom gebracht en na 15 seconden centrifugeren (10000 toeren per minuut) wordt de flow-
through verwijderd.
In de vierde stap wordt de kolom gewassen. Hiervoor wordt er 500 µl RPE buffer op de
kolom gepipetteerd. Na 15 seconden centrifugeren (10000 toeren per minuut) wordt de flow-
through verwijderd. Er wordt opnieuw 500 µl RPE buffer op de RNeasy kolom gebracht. Na
2 minuten centrifugeren (10000 toeren per minuut) wordt de flow-through en de collection
tube verwijderd. De RNeasy mini kolom wordt op een nieuwe 2 ml collection tube geplaatst.
Om de resten van de RPE buffer te verwijderen, wordt er nog 1 minuut gecentrifugeerd
(13000 toeren per minuut).
In de voorlaatste stap wordt het RNA geëlueerd. De RNeasy kolom wordt op een 1,5 ml
collection tube gebracht. Er wordt 50 µl RNase-vrij H20 op het silica-gel membraan
gepipetteerd. Na 2 tot 3 minuten incubatie bij kamertemperatuur en 1 minuut centrifugeren
(13000 toeren per minuut) wordt de kolom op een nieuwe 1,5 ml collection tube gebracht. Er
wordt opnieuw 50 µl RNase-vrij H20 op het silica-gel membraan gepipetteerd, 2 tot 3 minuten
geïncubeerd bij kamertemperatuur en 1 minuut gecentrifugeerd aan 13000 toeren per minuut.
In de laatste stap tenslotte wordt de concentratie van het RNA bepaald. Hiervoor wordt 7 µl
van de RNA-oplossing in een microcuvet gebracht. Aan de hand van spectrofotometrie kan de
concentratie bepaald worden. Er wordt getracht om de concentratie van de stalen op 100 ng/µl
te brengen. Het RNA wordt opgeslaan bij -80 °C tot verder gebruik.
RT-PCR
Na RNA-extractie uit totaal longweefsel, wordt de expressie van het mRNA van CCL19,
CCL21a en CCL21b vergeleken met een huishoudgen (hypoxanthine
phosphoribosyltransferase = HPRT), dat ongeacht de behandeling overal in dezelfde mate
geëxpresseerd wordt. Voor de standaard wordt een verdunningsreeks van het RNA gemaakt.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
28
Wanneer de concentratie van het RNA 100 ng/µl is, wordt er telkens 100 ng, 50 ng, 10 ng, 5
ng of 2 ng toegevoegd. Voor de andere reacties wordt 10 ng RNA gebruikt.
Eerst wordt de mix gemaakt. Deze bestaat uit de Light Cycler 480 Probe Master mix (Roche
Diagnostics) (die al DNA polymerase, dNTP‟s en buffer bevat), reverse transcriptase, RNAse
inhibitor en water. RNAse inhibitor zorgt ervoor dat het RNA niet afgebroken wordt.
Vervolgens worden de primers en probes aan de mix toegevoegd en wordt deze over de plaat
verdeeld. Als laatste wordt het RNA van het te onderzoeken gen of het huishoudgen
toegevoegd. Bij het huishoudgen en het te onderzoeken gen zijn er 3 blanco wells, zonder
RNA, om contaminatie na te gaan (Figuur 8).
De RT-PCR (= Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) wordt uitgevoerd door de
Light Cycler 480 (Roche Diagnostics). Tijdens de RT-PCR zijn er verschillende stadia: eerst
reverse transcriptie (RNA → cDNA) op 48 °C, daarna kunnen de RNA-DNA heteroduplexen
denatureren bij 95 °C. Het DNA wordt geamplificeerd tijdens cycli bij 95 °C en 60 °C.
Gelabelde probes binden op een specifiek stuk DNA. Wanneer de primer verlengd wordt, zal
de quencher van de probe loskomen en een fluorescent signaal uitsturen. De sterkte van het
signaal is een maat voor de hoeveelheid origineel aanwezig RNA.
HPRT
Te bepalen
chemokine
Figuur 8: Indeling van de wellplaat.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Blanco Standaard 1 Standaard 0.5 Standaard 0.1
B Standaard 0.05 Standaard 0.02 Staal 1 Staal 2
C Staal 3 Staal 4 Staal 5 Staal 6
D Staal 7 Staal 8 Staal 9 Staal 10
E Blanco Standaard 1 Standaard 0.5 Standaard 0.1
F Standaard 0.05 Standaard 0.02 Staal 1 Staal 2
G Staal 3 Staal 4 Staal 5 Staal 6
H Staal 7 Staal 8 Staal 9 Staal 10
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
29
ELISA
Op het bronchoalveolair lavagevocht wordt een ELISA (= Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Assay) uitgevoerd, aan de hand van commercieel beschikbare ELISA kits (R&D Systems).
Deze test maakt eiwitten zichtbaar. Hier wordt CC-chemokine ligand 19 onderzocht.
De microplaat is geprecoat met een polyklonaal antilichaam tegen het antigen CCL19. De
standaarden, controle en stalen worden in de wells overgebracht. Het aanwezige CCL19
wordt gebonden door het antilichaam op de microplaat. De wells worden gewassen om de
ongebonden antigenen weg te spoelen. Hierna wordt een enzymgebonden polyklonaal
antilichaam, specifiek voor het antigen toegevoegd. Het enzym is horseradish peroxidase. Het
ongebonden antilichaam-enzym reagens wordt weggewassen. Tenslotte komt het substraat in
de wells. Het substraat bestaat uit H2O2 en het chromogen tetramethylbenzidine. Door de
enzymreactie worden de wells blauw gekleurd. De reactie wordt gestopt met hydrochloorzuur,
waardoor de blauwe kleur in geel verandert. Daarna wordt de intensiteit van de kleur gemeten
in proportie met de hoeveelheid CCL19 die gebonden was in de eerste stap.
Kwantificering emfyseem
Het emfyseem wordt gekwantificeerd aan de hand van de bepaling van de Mean Linear
Intercept (Lm) op paraffinecoupes (haematoxyline-eosine kleuring). Hiervoor wordt Image
Analysis software gebruikt (Image J 1.33). Per muis zijn er 10 beeldjes van het longweefsel.
Op het beeld wordt een rooster geplaatst met 3 horizontale en 5 verticale lijnen. Elk snijpunt
van het longweefsel met de lijnen wordt aangeduid (=alveolaire intercepts). De lengte van
elke lijn wordt dan gedeeld door het aantal alveolaire intercepts. Hieruit wordt de gemiddelde
afstand tussen de longblaasjes berekend, benoemd als mean linear intercept (Lm). Deze
afstand is groter naarmate er meer emfyseem aanwezig is [16].
Statistische analyse
De bekomen gegevens worden statistisch geanalyseerd met Sigma Stat software (SPSS Inc,
Chicago, USA). De gegevens worden aan niet-parametrische tests onderworpen (Kruskall-
Wallis en Mann-Whitney U). Een p-waarde kleiner dan 0.05 wordt als significant beschouwd.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
30
3. Resultaten
3.1 Inflammatie
Bronchoalveolair lavagevocht
- dendritische cellen
Zowel subacute als chronische blootstelling induceert een verhoging in het aantal DC‟s bij de
WT‟s en CCR7 KO‟s, maar dit is duidelijk minder uitgesproken bij de CCR7 KO‟s. De
meerderheid van de aanwezige DC‟s in het 1 maand experiment zijn CD11b+ (Figuur 9A). Er
is geen opregulatie van CCR7-expressie op DC‟s na rookblootstelling.
- macrofagen
Na 1 maand is er een sigarettenrookgeïnduceerde verhoging in het aantal macrofagen. Dit
aantal ligt significant hoger bij de CCR7 KO‟s in vergelijking met de WT‟s. Na 6 maanden
roken is er een trend naar verhoging bij de WT‟s, in de CCR KO groep is er geen significant
verschil in het aantal macrofagen (Figuur 9B).
- neutrofielen
Zowel na 1 maand als na 6 maanden rookblootstelling is er een significant verhoogde
neutrofilie in het BAL-vocht. Dit is echter minder uitgesproken bij de CCR7 KO‟s (Figuur
9C).
- CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten
Subacute en chronische blootstelling aan sigarettenrook induceert een significant verhoogd
aantal CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten in het BAL-vocht van WT‟s en CCR7 KO‟s. CCR7 KO
muizen hebben baseline reeds een hoger aantal CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten (Figuur 9D-E).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
31
A) BAL DC aantal
0
20000
40000
60000
80000
100000
CD11B+
luchtrook
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
**
**
****
***
B) BAL macro aantal
0
300000
600000
900000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
luchtrook
p = 0,083
*
***
C) BAL neutro aantal
0
100000
200000
300000
400000
500000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
lucht
rook
***
*
**
***
***
p = 0,074
D) BAL CD4 aantal
0
50000
100000
150000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
luchtrook
*
**
***
***
**
**
***
E) BAL CD8 aantal
0
50000
100000
150000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
lucht
rook
**
**
***
***
**
**
*
F) BAL totaal aantal
0
500000
1000000
1.5100 6
2.0100 6
2.5100 6
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
**
***
****
**
*luchtrook
Figuur 9: Effect van sigarettenrook en CCR7-deficiëntie op celdifferentiatie in bronchoalveolair
lavagevocht. Celdifferentiatie in het BAL-vocht van wildtype en CCR7 KO muizen na 1 maand en na 6 maanden
blootstelling aan lucht of sigarettenrook: (A) dendritische cellen, (B) macrofagen, (C) neutrofielen, (D)
CD4+ T-lymfocyten, (E) CD8
+ T-lymfocyten en (F) totaal aantal BAL-cellen. Neutrofielen en totaal
aantal BAL-cellen werden geteld aan de hand van cytospins, de andere cellen met behulp van FACS-
analyse. De resultaten worden getoond als gemiddelde ± SEM (n = 8 dieren per groep; * p<0.05, **
p<0.01, ***p<0.001).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
32
Long
- dendritische cellen
Chronische rookblootstelling induceert een significante verhoging van het aantal DC‟s in de
longen van wildtypes en CCR7 KO‟s. De meerderheid van de aanwezige DC‟s in het 1 maand
experiment zijn CD11b+ (Figuur 10A). Bij de wildtypes verhoogt de CCR7-expressie op DC‟s
na chronisch roken (Figuur 13E).
- CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten
Roken induceert geen verandering in aantal T-lymfocyten bij de WT‟s. Alleen de CD4+ T-
lymfocyten vertonen een trend tot verhoging na 6 maanden roken.
Het aantal CD4+, CD8
+ en geactiveerde CD4
+ en CD8
+ T-lymfocyten is significant hoger bij
CCR7 KO‟s in vergelijking met WT‟s en stijgt verder na chronische rookblootstelling (Figuur
10B-E).
- regulatorische T-cellen
Het aantal regulatorische T-cellen stijgt zowel bij WT‟s als CCR7 KO‟s significant na
rookblootstelling en is hoger bij CCR7 KO‟s in vergelijking met WT‟s (Figuur 10F). De
FoxP3 expressie in Tregs is een klein beetje verhoogd na rookblootstelling (Figuur 12A).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
33
A) LONG DC aantal
0
100000
200000
300000
400000
CD11B+
luchtrook
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
*** **
B) LONG CD4 aantal
0
250000
500000
750000
1000000
1.3100 6
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
luchtrook
**
**
p = 0,083
**
****
C) LONG CD4CD69 aantal
0
200000
400000
600000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
luchtrook
***
***
**
****
D) LONG CD8 aantal
0
200000
400000
600000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
luchtrook
p = 0,064
p = 0,094
**
**
E) LONG CD8CD69 aantal
0
50000
100000
150000
200000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
luchtrook
**
**
****
**
F) LONG Treg aantal
0
50000
100000
150000
200000
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
lucht
rook
**
**
*
***
**
*****
Figuur 10: Effect van sigarettenrook en CCR7-deficiëntie op celdifferentiatie in de longen.
Celdifferentiatie in de longen van wildtype en CCR7 KO muizen na 1 maand en na 6 maanden
blootstelling aan lucht of sigarettenrook: (A) dendritische cellen, (B) CD4+ T-lymfocyten, (C)
CD4+CD69
+ T-lymfocyten, (D) CD8
+ T-lymfocyten, (E) CD8
+CD69
+ T-lymfocyten en (F)
regulatorische T-cellen. De resultaten worden getoond als gemiddelde ± SEM (n = 8 dieren per groep;
* p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
34
Lymfeknopen
- dendritische cellen
Na 6 maanden rookblootstelling is er bij de WT‟s een significante toename van het aantal
airway-derived dendritic cells (AW-DC‟s). Bij de KO‟s zijn er zo goed als geen AW-DC‟s
aanwezig. Er is ook een toename in het aantal non-airway-derived dendritic cells (NAW-DC‟s)
bij de WT‟s. Deze cellen nemen niet toe bij de CCR7 KO‟s en zijn ook minder aanwezig in
vergelijking met de WT‟s.
Er zijn echter meer NAW-DC‟s dan AW-DC‟s aanwezig in de lymfeknopen bij de CCR7
knock-outs (Figuur 11A-B). Er is een trend tot verhoogde CCR7 expressie na chronische
rookblootstelling op AW- en NAW-DC‟s in de lymfeknopen van wildtypes. De expressie is
veel hoger bij AW- dan bij NAW-DC‟s (Figuur 13A-B).
- CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten
Het aantal CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten zijn significant verhoogd in de lymfeknopen na
chronische rookblootstelling bij zowel WT‟s als CCR7 KO‟s. CCR7 KO‟s hebben echter
significant minder CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten in de lymfeknopen (Figuur 11C-D). De
wildtypes hebben een lagere expressie van CCR7 op CD4+ en CD8
+ T-lymfocyten na 6
maanden roken (Figuur 13C-D).
- regulatorische T-cellen
Het aantal regulatorische T-cellen is significant verhoogd na chronische rookblootstelling bij
zowel WT als CCR7 KO muizen. De toename in aantal Tregs is echter significant lager in de
CCR7 KO‟s in vergelijking met de WT‟s (Figuur 11E). Chronische rookblootstelling
verhoogt ook de expressie van FoxP3 in Tregs (Figuur 12B).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
35
A) LN AW-DC aantal
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000 lucht
rook
WT KO
****
**
B) LN NAW-DC aantal
0
15000
30000
45000
WT KO
lucht
rook
****
*
C) LN CD4 aantal
0
500000
1000000
1.5100 6
2.0100 6
2.5100 6
WT KO
lucht
rook
p = 0,054
****
**
D) LN CD8 aantal
0
500000
1000000
1.5100 6
2.0100 6
WT KO
lucht
rook
*
*
****
E) LN Treg aantal
0
100000
200000
300000
WT KO
lucht
rook
****
*
**
Figuur 11: Effect van sigarettenrook en CCR7-deficiëntie op celdifferentiatie in de lymfeknopen. Celdifferentiatie in de lymfeknopen van wildtype en CCR7 KO muizen na 6 maanden blootstelling
aan lucht of sigarettenrook: (A) airway-derived dendritische cellen, (B) non-airway-derived
dendritische cellen, (C) CD4+ T-lymfocyten, (D) CD8
+ T-lymfocyten en (E) regulatorische T-cellen.
De resultaten worden getoond als gemiddelde ± SEM (n = 8 dieren per groep; * p<0.05, ** p<0.01).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
36
A) LONG Treg
WT CCR7 KO
B) LN Treg
WT CCR7 KO
Figuur 12: FoxP3-expressie in regulatorische T-cellen van de long (A) en lymfeknopen (B) na 6
maanden blootstelling aan lucht of aan sigarettenrook.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
37
A) LN AW-DC B) LN NAW-DC
C) LN CD4 D) LN CD8
E) LONG DC
Figuur 13: CCR7-expressie op cellen van de lymfeknopen (A-D) en de long (E) na 6 maanden
blootstelling aan lucht of aan sigarettenrook. (A) airway-derived dendritische cellen, (B) non-airway-
derived dendritische cellen, (C) CD4+ T-lymfocyten, (D) CD8
+ T-lymfocyten en (E) dendritische
cellen.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
38
3.2 Emfyseem
Chronische rookblootstelling veroorzaakt een verhoging in de Lm-waarde bij de WT muizen
(lucht 33.57 ± 2.01 µm versus rook 37.65 ± 2.30 µm; 12.2 % toename, p-waarde = 0.002),
maar niet bij de CCR7 KO muizen (lucht 36.70 ± 3.57 versus rook 39.00 ± 5.82; 6.3%
toename, p-waarde = 0.487). De CCR7 KO muizen die aan lucht blootgesteld zijn, hebben
echter baseline reeds een grotere Lm-waarde dan de wildtype muizen. Er is geen significant
verschil in Lm-waarde tussen aan rook blootgestelde wildtypes en CCR7 KO‟s (Figuur 14,15).
WT air WT smoke KO air KO smoke
30
35
40
45
50
**
*
0
Lm
(µ
m)
Figuur 14: Kwantificering van emfyseem door bepaling van de Lm-waarde. De resultaten worden
getoond als gemiddelde ± SEM (n = 8 dieren per groep; *p<0.05, **p<0.01).
Figuur 15: Pulmonair emfyseem na chronische rookblootstelling. Beelden van longweefsel gekleurd met haematoxyline en eosine. (A) wildtype muizen blootgesteld
aan lucht, (B) wildtype muizen blootgesteld aan rook, (C) CCR7 KO muizen blootgesteld aan lucht en
(D) CCR7 KO muizen blootgesteld aan rook.
A B
C D
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
39
3.3 Lymfoïd neogenese
Het aantal luchtwegen is gelijk in de 4 groepen. In de longen van aan lucht blootgestelde WT
muizen komen er zeer weinig lymfoïde follikels voor, terwijl dat aantal bij de aan lucht
blootgestelde CCR7 KO muizen significant hoger is. Bij beide genotypes neemt het aantal
follikels per luchtweg toe na 6 maanden rook. De CCR7 KO groep heeft na chronische
rookblootstelling significant meer follikels per luchtweg dan de WT groep (Figuur 16).
A) aantal follikels per aantal luchtwegen
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00 lucht
rook
**
**
****
WT KO
Figuur 16: Lymfoïde follikels. (A) Aantal follikels per aantal luchtwegen na 6 maanden blootstelling aan lucht of aan rook. De
resultaten worden getoond als gemiddelde ± SEM (n = 8 dieren per groep; **p<0.01). (B-E) Beelden
van longweefsel gekleurd met CD3 (T-lymfocyten, bruin) /B220 (B-lymfocyten, blauw)
dubbelkleuring. (B) wildtype muizen blootgesteld aan lucht, (C) wildtype muizen blootgesteld aan
rook, (D) CCR7 KO muizen blootgesteld aan lucht en (E) CCR7 KO muizen blootgesteld aan rook.
C
E
B
D E
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
40
3.4 Chemokine-expressie
De mRNA-expressie van CCL19 in totaal longweefsel is verhoogd na zowel 1 maand als 6
maanden roken bij de wildtypes. Bij de chronische proef hebben de CCR7 knock-outs
baseline een hogere CCL19 expressie (Figuur 17A).
In tegenstelling tot CCL19, verlaagt de expressie van CCL21a in beide groepen na 6 maanden
rookblootstelling. Bij het subacute experiment heeft de CCR7 KO groep baseline een lagere
CCL21a expressie, die niet verandert na rookblootstelling (Figuur 17B).
De CCL21b expressie verlaagt na roken bij de wildtypes (Figuur 17C).
Het verhoogde expressieniveau van CCL19 bij de wildtypes na chronische rookblootstelling
en de baseline verhoogde CCL19 expressie bij CCR7 KO‟s wordt bevestigd op eiwitniveau
(Figuur 17D).
A) CCL19
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
lucht
rook
***
**
B) CCL21a
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
lucht
rook
*
*
** **
C) CCL21b
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
WT KO WT KO
1 maand 6 maand
lucht
rook
**
**
D) CCL19 ELISA
0
25
50 luchtrook
WT KO
**
*
Figuur 17: mRNA hoeveelheden van (A) CCL19, (B) CCL21a en (C) CCL21b in totaal longweefsel
na 1 maand of 6 maanden blootstelling aan lucht of aan sigarettenrook, gemeten aan de hand van PCR.
(D) Eiwitniveau van CCL19 in bronchoalveolair lavagevocht na 6 maanden blootstelling aan lucht of
aan sigarettenrook, gemeten aan de hand van ELISA. De resultaten worden getoond als gemiddelde ±
SEM (n = 8 dieren per groep; *p<0.05, **p<0.01).
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
41
3.5 Immuunkleuring CCL19/ProSP-C
Door middel van RT-PCR hebben wij aangetoond dat één van de liganden van CCR7,
namelijk CCL19, opgereguleerd is op RNA-niveau na rookblootstelling bij wildtype muizen.
We hadden een vermoeden dat type 2 pneumocyten in de alveolen CCL19 produceren.
Daarom werd er een dubbelkleuring uitgevoerd voor CCL19 en prosurfactant protein (proSP)
-C, een merker voor type 2 pneumocyten, op weefsel van wildtype en CCR7 KO muizen die
gedurende 6 maanden blootgesteld zijn aan rook. Veel aangekleurde cellen zijn
dubbelpositief. Er zijn zeer weinig cellen te vinden die alleen positief zijn voor CCL19. Er
zijn ook weinig ProSP-C enkel positieve cellen aanwezig die geen CCL19 produceren. Deze
resultaten zijn een sterke indicatie dat type 2 pneumocyten een bron van CCL19 zijn (Figuur
18).
Figuur 18: Immuunkleuring CCL19/ProSP-C. (A) single positieve cellen voor ProSP-C (blauw), (B)
single positieve cellen voor CCL19 (roze-rood), (C) dubbelpositieve cellen voor CCL19 en ProSP-C
(paars).
De scoring van de intensiteit van de CCL19 kleuring (Figuur 19A) komt sterk overeen met de
hoeveelheid CCL19 op mRNA- en op eiwitniveau (Figuur 17A, D). Na rookblootstelling is er
een sterkere aankleuring. De CCR7 KO muizen hebben baseline een hoger gehalte CCL19
(Figuur 19A-E).
A B C
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
42
A) CCL19 kleuring
0
1
2
3
4 luchtrook
WT KO
*** *****
Figuur 19: Intensiteit van de CCL19 aankleuring na immunohistochemische kleuring op
paraffinecoupes.
(A) Scoring van de intensiteit van de CCL19 aankleuring na chronische rookblootstelling. De
resultaten worden getoond als gemiddelde ± SEM (n = 8 dieren per groep; **p<0.01, ***p<0.001).
(B-E) Beelden van longweefsel na CCL19 immuunkleuring (B) wildtype muizen blootgesteld aan
lucht, (C) wildtype muizen blootgesteld aan rook, (D) CCR7 KO muizen blootgesteld aan lucht en (E)
CCR7 KO muizen blootgesteld aan rook.
B C
D E
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
43
4. Bespreking
De grootste risicofactor voor het ontwikkelen van COPD is sigarettenrook. In deze
masterproef wordt er dan ook gebruik gemaakt van een model waarbij muizen blootgesteld
worden aan sigarettenrook. De rol van CCR7 in het ontstaan van inflammatie in de long en
luchtwegen, in het ontstaan van emfyseem en in het vormen van lymfoïde follikels wordt
nagegaan.
Chronische sigarettenrookblootstelling induceert de migratie van DC‟s van de long naar de
lymfeknopen. Bij CCR7 knock-out muizen is die migratie sterk verminderd.
Na 6 maanden roken is er een opmerkelijke stijging in het aantal airway-derived dendritic
cells (AW-DC‟s) en non-airway-derived dendritic cells (NAW-DC‟s) in de lymfeknopen bij
de wildtypes.
In de lymfeknopen van wildtype muizen hebben de DC‟s die afkomstig zijn van de
luchtwegen een veel hogere expressie van CCR7 in vergelijking met DC‟s die niet afkomstig
zijn van de luchtwegen. Er homen ook meer CCR7-deficiënte NAW-DC‟s naar de
lymfeknoop dan AW-DC‟s. Dit suggereert dat NAW-DC‟s naast CCR7 ook nog van andere
receptoren afhankelijk zijn om naar de lymfeknoop te migreren.
In vergelijking met de lymfeknoop hebben de DC‟s in het BAL-vocht en de long een lage
CCR7-expressie. De DC‟s gaan CCR7 opreguleren op weg van de long naar de lymfeknoop.
Lymfeknopen van CCR7-deficiënte dieren hebben significant lagere aantallen van cellen in
vergelijking met lymfeknopen van wildtype dieren. Dit bevestigt de eerdere bevindingen van
Worbs et al. [40] en bewijst dat de meeste cellen CCR7 nodig hebben om naar de lymfeknoop
te homen.
In wildtype en CCR7 knock-out muizen is er een verhoging van het aantal CD4+
en CD8+
T-
lymfocyten na rookblootstelling. CCR7 KO muizen hebben baseline een groter aantal T-
lymfocyten in de long en het BAL-vocht, omdat ze niet naar de lymfeknoop kunnen homen.
Ook in de lymfeknoop is er een verhoging in het aantal T-lymfocyten na chronische
rookblootstelling, maar dit is veel minder uitgesproken bij de CCR7 KO muizen. Bij de
wildtypes gaat dit samen met een verlaagde CCR7 expressie per cel. Er differentiëren wellicht
meer naïeve T-cellen tot effector cellen. Dat gaat gepaard met een downregulatie van CCR7
[41].
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
44
Vorig onderzoek heeft aangetoond dat CCR7 KO muizen sterk gereduceerde aantallen van
Tregs hebben in de drainerende lymfeknopen en dat deze dieren vatbaar zijn voor het
spontaan ontwikkelen van bronchus geassocieerd lymfoïd weefsel (BALT), zelfs zonder
tussenkomst van een antigen. Transfer van wildtype Tregs in CCR7 KO muizen, vermindert
de ontwikkeling van BALT. BALT is aanwezig in de CCR7 KO muis vanaf dag 5. Dit
suggereert dat de vorming van BALT gecontroleerd wordt door Tregs [42].
In ons onderzoek zijn er ook bijna geen Tregs in de drainerende lymfeknopen van CCR7 KO
muizen. CCR7-deficiënte regulatorische T-cellen kunnen efficiënt geïnflammeerde perifere
weefsels bereiken, maar ze kunnen niet naar de lymfeknopen homen [40]. Hierdoor kan de
inductieve fase van de immuunrespons minder goed onderdrukt worden en zijn er meer
inflammatoire cellen in de long aanwezig. Het verhoogde aantal Tregs in de long zelf kan wel
de verdere immuunrespons onder controle houden. Dit pleit tegen de hypothese van COPD als
auto-immuunziekte, want bij andere auto-immuunziektes is er een daling in aantal Tregs op
de plaats van inflammatie [43].
Sigarettenrook induceert een verhoging van het aantal Tregs in de long. Er is baseline een
hoger aantal Tregs bij de CCR7 knock-outs. Ook in de lymfeknopen verhoogt het aantal
Tregs na rookblootstelling, maar dit is minder uitgesproken bij de CCR7 KO muizen.
Sigarettenrook induceert een verhoogde FoxP3 expressie in CD4+CD25
+ T-lymfocyten in de
lymfeknopen.
CCR7 KO muizen vertonen een grotere Lm-waarde (mean linear intercept) dan wildtypes,
maar in tegenstelling tot de wildtypes neemt de Lm-waarde niet verder toe na roken. Het is
mogelijk dat de CCR7 knock-outs al van bij de geboorte een zekere graad van alveolaire
grootte hebben, die niet meer vergroot na rookblootstelling.
Door de sigarettenrook is er meer inflammatie en zijn er dus meer lymfocyten die zich in
lymfoïde follikels kunnen groeperen. Er is meer lymfoïd neogenese bij CCR7 KO muizen. De
CCR7-deficiëntie zorgt ervoor dat de lymfocyten niet naar de lymfeknopen homen en dus in
de long blijven. Daar vormen ze lymfoïde follikels.
De verhoogde graad van lymfoïd neogenese na rookblootstelling bij CCR7 KO muizen gaat
echter niet gepaard met ernstiger emfyseem. De lymfoïde follikels zorgen dus niet
rechtstreeks voor de beschadiging van de longblaasjes. In tegenstelling tot vroegere
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
45
bevindingen [44] vinden we hier een dissociatie tussen het aantal lymfoïde follikels en
emfyseem.
Bij het chronische experiment zijn er duidelijk meer cellen van het adaptieve immuunsysteem
aanwezig, wat ook logisch is aangezien eerst het aangeboren en dan pas het adaptieve
immuunsysteem in werking treedt.
Zowel op mRNA- als op eiwitniveau verhoogt de expressie van CCL19 na rookblootstelling
bij wildtypes. CCR7 KO muizen hebben baseline al een hoger niveau van CCL19-expressie.
Deze resultaten worden bevestigd door het scoren van de intensiteit van de CCL19
aankleuring. Een dubbelkleuring voor zowel CCL19 als ProSP-C, een merker voor type 2
pneumocyten, toont aan dat dit chemokine door type 2 pneumocyten aangemaakt wordt. Veel
aangekleurde cellen zijn dubbelpositief. Er zijn zeer weinig cellen te vinden die alleen positief
zijn voor CCL19, wat suggereert dat er weinig tot geen andere cellen zijn in de long die
CCL19 produceren. Er zijn ook weinig ProSP-C enkel positieve cellen te vinden, die geen
CCL19 produceren.
De cellen komen in aanraking met de sigarettenrook en maken CCL19 aan, dat een ligand is
van CCR7. Hierdoor worden er wellicht meer CCR7-positieve cellen (zoals T-lymfocyten)
naar de long aangetrokken. CCL19 kan ook, net zoals in de lymfeknopen, een rol spelen in de
juiste positionering van de lymfocyten en DC‟s in de lymfoïde follikels. CCR7 KO muizen
maken baseline meer CCL19 aan in de long. Hoewel de T-lymfocyten de receptor voor dit
ligand missen, is er toch een accumulatie van T-lymfocyten in de long. De verhoogde
productie van CCL19 na blootstelling aan sigarettenrook, gaat ook gepaard met een verhoogd
aantal T-lymfocyten in de long. De grootste productie van CCL19 bevindt zich echter in de
lymfeknopen [45]. De opstapeling van T-lymfocyten in de long van CCR7 KO muizen is
wellicht eerder een gevolg van een deficiënte homing naar de lymfeknoop dan van een factor
die hen in de long houdt.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
46
5. Algemeen besluit
1) Chronische sigarettenrookblootstelling induceert de migratie van DC‟s van de long naar de
lymfeknopen. Deze migratie is sterk verminderd bij CCR7 knock-out muizen. CCR7 KO
muizen hebben meer dendritische cellen en T-lymfocyten in het BAL-vocht en in de longen
en minder in de lymfeknopen in vergelijking met wildtypes. Dit wijst op een deficiënte
homing naar de lymfeknopen.
2) Naar analogie met het aantal dendritische cellen en T-lymfocyten in de longen, neemt het
aantal lymfoïde follikels toe na chronische blootstelling aan rook en dit aantal is ook
significant hoger bij de CCR7 KO groep in vergelijking met de wildtypes.
3) CCR7 is essentieel voor de vorming van lymfeknopen (secundaire lymfoïde organen),
maar niet voor de sigarettenrookgeïnduceerde vorming van lymfoïde follikels (tertiaire
lymfoïde organen) in de long in dit muismodel van COPD.
4) De Lm-waarde, die een maat is voor de graad van emfyseem, stijgt na rookblootstelling bij
de wildtypes, maar niet bij de CCR7 KO muizen. De CCR7 KO muizen hebben baseline
echter al een hogere Lm-waarde.
5) Bij de CCR7 KO‟s gaat een stijging in aantal lymfoïde follikels niet gepaard met een
hogere graad van emfyseem. Er is een dissociatie tussen het aantal lymfoïde follikels en de
graad van emfyseem.
6) Na chronische rookblootstelling is er een gestegen aantal regulatorische T-cellen in de long
en de lymfeknopen, zowel bij WT als bij CCR7 KO. In de longen van CCR7 KO muizen is
deze stijging meer uitgesproken in vergelijking met de wildtypes. Niettegenstaande er meer
regulatorische T-cellen aanwezig zijn, is er toch nog emfyseem. Dit pleit tegen de hypothese
van COPD als auto-immuunziekte.
7) CCL19, een ligand van CCR7, wordt naast de lymfeknopen ook geproduceerd door type 2
pneumocyten in de long.
8) De expressie van CCL19 in de long stijgt na rookblootstelling en is baseline reeds hoger bij
de CCR7 KO muizen.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
47
6. Referentielijst
1. http://www.goldcopd.org/Guidelineitem.asp?l1=2&l2=1&intId=996
2. Bracke KR (2007). Role of proteases and chemokine receptors in a murine model of
chronic obstructive pulmonary disease. Gent: Universiteit Gent.
3. Chung KF, Adcock IM (2008). Multifaceted mechanisms in COPD: inflammation,
immunity, and tissue repair and destruction. European Respiratory Journal 31(6):1334-
1356.
4. Joos GF (2007). Chemische noxen: roken en COPD. Pathogenese:1-15.
5. Hogg JC, et al. (2004). The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive
pulmonary disease. The New England Journal of Medicine 350(26):2645-2653.
6. Agusti A, Soriano JB (2008). COPD as a systemic disease. COPD 5(2):133-138.
7. Wise RA (2006). The value of forced expiratory volume in 1 second decline in the
assessment of chronic obstructive pulmonary disease progression. American Journal of
Medicine 119(10 Suppl 1):4-11.
8. Barnes PJ, et al. (2003). Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and
cellular mechanisms. European Respiratory Journal 22(4):672-688.
9. Aloisi F, Pujol-Borrell R (2006). Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory
diseases. Nature Reviews Immunology 6(3):205-217.
10. Curtis JL, et al. (2007). The Immunopathogenesis of Chronic Obstructive Pulmonary
Disease: Insights from Recent Research. The Proceedings of the American Thoracic
Society 4(7):512-521.
11. Lee SH, et al. (2007). Antielastin autoimmunity in tobacco smoking-induced
emphysema. Nature medicine 13(5):567-569.
12. Brusselle GG, et al. (2006). Murine models of COPD. Pulmonary pharmacology &
Therapeutics 19(3):155-165.
13. Hedrich H. (2004). The laboratory mouse. Bullock G. PP, editor. London: Elsevier.
14. D'Hulst A I, et al. (2005). Time course of cigarette smoke-induced pulmonary
inflammation in mice. European Respiratory Journal 26(2):204-213.
15. Bracke KR, et al. (2006). Cigarette smoke-induced pulmonary inflammation and
emphysema are attenuated in CCR6-deficient mice. Journal of Immunology
177(7):4350-4359.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
48
16. Bracke KR, et al. (2007). Cigarette smoke-induced pulmonary inflammation, but not
airway remodelling, is attenuated in chemokine receptor 5-deficient mice. Clinical and
Experimental Allergy 37:1467-1479.
17. Wright JL, et al. (2008). Animal models of chronic obstructive pulmonary disease.
American Journal of Physiology. Lung cellular and molecular Physiology 295(1):L1-
15.
18. Murphy K, et al. Janeway's immunobiology. 7th ed. New York: Garland Science, 2008.
19. Drayton DL, et al. (2006). Lymphoid organ development: from ontogeny to
neogenesis. Nature Immunology 7(4):344-353.
20. Plumb J, et al. (2009). Increased T regulatory cells within lymphocyte follicles in
moderate COPD. European Respiratory Journal (published online before print).
21. Thaunat O, et al. (2006). Is defective lymphatic drainage a trigger for lymphoid
neogenesis? Trends in Immunology 27(10):441-445.
22. Schweickart VL, et al. (1994). Cloning of human and mouse EBI1, a lymphoid-
specific G-protein-coupled receptor encoded on human chromosome 17q12-q21.2.
Genomics 23(3):643-650.
23. Chen SC, et al. (2002). Ectopic expression of the murine chemokines CCL21a and
CCL21b induces the formation of lymph node-like structures in pancreas, but not skin,
of transgenic mice. Journal of Immunology 168(3):1001-1008.
24. Muller G, et al. (2003). The impact of CCR7 and CXCR5 on lymphoid organ
development and systemic immunity. Immunological Reviews 195:117-135.
25. Sanchez-Sanchez N, et al. (2006). The multiple personalities of the chemokine
receptor CCR7 in dendritic cells. Journal of Immunology 176(9):5153-5159.
26. Lira SA (2005). A passport into the lymph node. Nature Immunology 6(9):866-868.
27. Wengner A, et al. (2007). CXCR5- and CCR7-dependent lymphoid neogenesis in a
murine model of chronic antigen-induced arthritis. Arthritis & Rheumatism
56(10):3271-3283.
28. Hopken UE, et al. (2007). CCR7 deficiency causes ectopic lymphoid neogenesis and
disturbed mucosal tissue integrity. Blood 109(3):886-895.
29. Forster R, et al. (2008). CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance.
Nature Reviews Immunology 8(5):362-371.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
49
30. Weyand CM, et al. (2001). Ectopic Lymphoid Organogenesis : A Fast Track for
Autoimmunity. American Journal of Pathology 159(3):787-793.
31. Riol-Blanco L, et al. (2005). The chemokine receptor CCR7 activates in dendritic cells
two signaling modules that independently regulate chemotaxis and migratory speed.
Journal of Immunology 174(7):4070-4080.
32. Yu CR, et al. (2008). SOCS1 regulates CCR7 expression and migration of CD4(+) T
cells into peripheral tissues. Journal of Immunology 181(2):1190-1198.
33. Croker BA, et al. (2008). SOCS regulation of the JAK/STAT signalling pathway.
Seminars in Cell & Developmental Biology 19(4):414-22.
34. Garcia-Zepeda EA, et al. (2007). Janus kinase 3-deficient T lymphocytes have an
intrinsic defect in CCR7-mediated homing to peripheral lymphoid organs.
Immunology 122(2):247-260.
35. Schneider MA, et al. (2007). CCR7 is required for the in vivo function of CD4(+)
CD25(+) regulatory T cells. Journal of Experimental Medicine 204(4):735-745.
36. Menning A, et al. (2007). Distinctive role of CCR7 in migration and functional
activity of naive- and effector/memory-like Treg subsets. European Journal of
Immunology 37:1575-1583.
37. Isajevs S, et al. (2009). Decreased FOXP3 expression in small airways of smokers
with COPD. European Respiratory Journal 33(1):61-67.
38. GeurtsvanKessel CH, Lambrecht BN (2008). Division of labor between dendritic cell
subsets of the lung. Mucosal Immunology 1(6):442-450.
39. Vermaelen KY, et al. (2001). Specific migratory dendritic cells rapidly transport
antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. Journal of Experimental
Medicine 193(1):51-60.
40. Worbs T, Forster R (2007). A key role for CCR7 in establishing central and peripheral
tolerance. Trends in Immunology 28(6):274-280.
41. Bromley SK, et al. (2005). Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from
peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology 6(9):895-
901.
Onderwerp: „Onderzoek naar lymfoïd neogenese in een experimenteel model van Chronisch Obstructief Bronchiaal Lijden
(COPD)‟
Dupont Lisa Promotor: Brusselle Guy
Begeleider: Bracke Ken
50
42. Kocks JR, et al. (2007). Regulatory T cells interfere with the development of
bronchus-associated lymphoid tissue. Journal of Experimental Medicine 204(4):723-
734.
43. Rouse BT (2007). Regulatory T cells in health and disease. Journal of Internal
Medicine 262(1):78-95.
44. van der Strate BW, et al. (2006). Cigarette smoke-induced emphysema: A role for the
B cell? American journal of respiratory and critical care medicine 173(7):751-758.
45. Britschgi MR, et al. (2008). Dynamic modulation of CCR7 expression and function on
naive T lymphocytes in vivo. Journal of Immunology 181(11):7681-7688.