Dr. Emin KARACAŞubat‐2019

Lösemi Genetiği 

Haploid genom, 3.2 milyar baz çiftidizisi A,G,T,CYaklaşık 1 m, 

diploid genom 2m20.000 gen%1.5

Çekirdekli hücrelerde eksprese olurlar, mRNA;Genin ürününün oluşturulması için gereken ara molekül

Çoğu hücre 10.000‐15.000 geni eksprese eder

Genom

Genom DNA’nın tamamı

Genetik ilişkili hastalıklar

DNA değişiklikleriKalitatif

Kantitatif

DNA dışı değişiklikler(epigenetik)Metilasyon

Histon değişikliklerimikroRNA’lar

Genetik Değişiklikler

KantitatifDeğişiklikler

Kayıplar

Kazançlar Anormaltekrarlar

KalitatifDeğişiklikler

Yer değişiklikleri(Translokasyonlar)

Ters dönmeler(İnversiyonlar)

Farklılıklar(Baz

değişiklikleri)

Genetik Değişiklikler

Sitogenetik ve MolekülerSitogenetik Karyotipleme Floresan insituhibridizasyon Array‐CGH

Moleküler Genetik Testler

10.000kat kondansasyon farkı

Genetik DeğişiklikleriNasıl Saptıyoruz?

Genetik Testler

Işık mikroskopunda görülebilirboyut• Kromozom Anomalisi

Işık mikroskopunda görülemezboyut• FISH• Array‐CGH• MLPA• PCR tabanlı yöntemler

Işık mikroskopunda görülemezboyut• Dizi analizi• Sanger• NGS

Işık mikroskopunda görülebilir boyuttaSitogenetik inceleme>3Mb (3 milyon baz)

Floresan mikroskopta tespit edilebilir özellikteFloresan in situ hibridizasyon>100 kb delesyon(100.000 baz); >500 kb duplikasyon

Moleküler karyotipleme‐Array‐CGH0.5‐1 (500‐1000 baz) kb üzeri değişiklikler

Dizi analizi

Genetik Hastalıklar Nasıl Oluşur İnceleme Yöntemleri 

Kromozom incelemesi : SitogenetikFISHArray‐CGHSanger dizi analiziYeni nesil dizi analizi (NGS)Real time PCR…

Genetik Testler

Moleküler Sitogenetik

Moleküler

Karyotip FISH PCR

Hangi Test?

SİTOGENETİK                                         MOLEKÜLER SİTOGENETİK                    MOLEKÜLER GENETİK

LösemiOluşmaNedenleri

Kromozom DNA değişikliği

Lösemilerde Moleküler Düzenlenmeler

Lösemi

Lösemilerde Genetik Belirteçler

• Tanı• Risk sınıflaması• Tedavi hedefi belirleme• İzlem‐MRD

Neden Genetik? 

ALL de moleküler mekanizmalar

ALL Genomunda neler oluyor? • Sayısal kromozom bozuklukları– Hiperdiploidi– Hipodiploidi

• Yapısal kromozom bozuklukları– Translokasyon–İnversiyon

• Gen ekspresyon değişiklikleri

• Epigenetik değişiklikler 

• Tek gen mutasyon ve delesyonları

ALL’de Genetik Belirteçlerin Sıklığı

ALL’de Yaşlara Göre Genetik Belirteçlerin Sıklığı

Hiperdiploidi/Hipodiploidi

• Hiperdiploidi (>46 kromozom)• Düşük Hiperdiploidi (47‐50)• Yüksek Hiperdiploidi (51‐65)• 4, 10, 14, 17, 18, 21, X

• Hipodiploidi (<45 kromozom)• Düşük Hipodiploidi (31‐39)• Yüksek Hipodiploidi (40‐45)

ETV6/RUNX1 t(12;21)(p13q;q22) 

• Pediatrik olgularda % 22• PreB olgularda %25• İyi prognostik belirteç• DİKKAT

• Sitogenetik atlayabilir• TEL delesyonu

TCF3/PBX1 t(1;19)(q23;p13.3) 

• Pediatrik olgularda % 3• Kötü prognostik belirteç

KMT2A yeniden düzenlenmeleri 

• 11q23 • 70’ten fazla translokasyon• Pediatrik olgularda % 8 • Erişkin olgularda % 10 • Kötü prognostik belirteç 

t(11;19)

t(4;11)

t(9;11)

iAMP21

• Bir kromozom üzerinde en az 4 kopya RUNX1• Kötü prognoz• Kromozom 21’in kompleks yeniden düzenlenmeleri 

BCR/ABL t(9;22)(q34;q11.2)

• Pediatrik olgularda % 3‐5 • Kötü prognostik belirteç• İlaç direnci

• Trizomi 8

ALL Sitogenetik Risk Gruplaması

ALL için WHO klasifikasyonu

• B‐lenfoblastik lösemi/lenfoma• •B‐lenfoblastik lösemi/lenfoma, NOS• •B‐lenfoblastik lösemi/lenfoma tekrarlayan genetik değişikliklere göre• –t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR‐ABL1 pozitif B‐ALL• –t(v;11q23.3);KMT2A yeniden düzenlenmesi pozitif B‐ALL• –t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6‐RUNX1 pozitif B‐ALL• –Hyperdiploidy pozitif B‐ALL• –Hypodiploidy pozitif B‐ALL• –t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3‐IGH pozitif B‐ALL• –t(1;19)(q23;p13.3);TCF3‐PBX1 pozitif B‐ALL• –BCR‐ABL1–like B‐ALL• –iAMP21 pozitif B‐ALL• –T‐lenfoblastik lösemi/lenfoma• •Early T‐cell precursor lymphoblastic leukemia: FLT3, NRAS/KRAS, DNMT3A,IDH1, IDH2

Ph‐like(BCR‐ABL1‐like) B‐ALL

• Ph+ (BCR‐ABL1+) ALL benzeri ekspresyon profili• Çocukluk çağında %10‐15%, genç erişkinlerde%30’a kadar• IKZF1 delesyon veya mutasyonları çok sık• ABL veya JAK/STAT yolağı mutasyonları yüksek• %50 olguda CRLF2 değişimleri±JAK2 mutasyonları• Kötü prognoz

Ph‐like ALL altgrupları

• Sitokin reseptör ekspresyon kontrolünü bozan yeniden düzenlenmeler(CRLF2,EPOR)

• Kimerik TK oluşumuna yol açan yeniden düzenlenmeler (ABL1, JAK2)• Mutasyonlar (IL7R, JAKs, Ras)• Delesyonlar (SH2B3/LNK)

Ph‐like ALL altgruplarının yaşlara göre dağılımı

Ph‐like ALL tedavi hedefleri

ALL’de Genetik Test

Tanı Aşamasında Risk Sınıflaması• Sitogenetik inceleme (G band)• iFISH

• BCR/ABL• KMT2A füzyonları• ETV6/RUNX1 • TCF3/PBX1 • IL3/IGH

• RT‐PCR • BCR/ABL• BCR/ABLnegatif ise: Ph‐likeALLfüzyonları

• CRLF2, PAX5, JAK1, JAK2, IKZF1 mutasyonları(B‐ALL)

• NOTCH1 veFBXW7 mutasyonları(T‐ALL)

• Sitogenetik inceleme başarısız veya anöploidi(+) ise: arrayCGH

ALL’de Genetik Test Algoritması

ALL’de Genetik Test MRD izlemi

AML

• Çocukluk çağı akut lösemilerinin yalnızca %15‐20• Herediter AML 

• TP53 • RUNX1 • GATA2 • CEBPA

AML Tanı ve Sınıflandırma

• FAB ve WHO sınıflamaları 

AML’deki Sitogenetik Biyobelirteçler

• Olguların yaklaşık %20’sinde tespit edilebilen karyotipikanomali yoktur• Günümüze kadar 100’den fazla dengeli kromozomal değişiklik

• Kromozomal anomalilerin büyük çoğunluğu translokasyonlar ve büyük delesyonlar

• Konvensiyonel sitogenetik yapısal ve sayısal kromozomal anomalilerin %70‐80’ini saptayabilir

• Kriptik translokasyonlar• FISH• RT‐PCR

AML’deki Sitogenetik Biyobelirteçler

• t(8;21)(q22;q22),• inv(16)(p13.1q22) • t(15;17)(q22;q21)/PML‐RARA • 11q23/MLL‐rearranged

%50

Myelodisplastik sendrom ile ilişkili AML

• del 5q• ‐7, del 7q• del 9q• del 20q• +8• kompleks karyotipler• t(1;3) • t(2;11)

AML’de karşılaşılan kromozomal anomaliler ve sıklıkları%

t(8;21)(q22;q22)

• Çocukluk çağı AML’sinde en sık görülen yapısal anomalilerden• AML1/ETO füzyon geni • AML‐M2 • Yüksek remisyon ve sağkalım oranı • Ek anomali varlığının klinik önemi • Yaklaşık %50’sinde relaps meydana gelir

t(11q23) ⁄ KMT2A (MLL)

• Çocukluk çağı AML’lerinde en sık görülen yeniden düzenlemedir (%14‐22)

• Bu anomalilerin yaklaşık %50’sini t(9,11)(p22,q23) kapsar• Geri kalanı 

• t(6;11)(q27;q23)• t(10;11)(p12;q23) • t(11;19)(q23;p13.1) • t(1;11)(q21;q23)

• t(9;11) hariç kötü prognoz• FAB M5 ile ilişkili• Trizomi 8 en sık eşlik eden kromozomal anomalidir

t(15;17)(q22;q21)• Akut promyelositik lösemi (AML‐M3)• PML/RARa füzyon geni meydana gelir• Maturasyonun promyelositik evrede durmasına neden olur• %45 hastada +8 

t(9;22)(q34;q11)

• de Novo AML’de %1 sıklıkta• M1 ya da M2 akla gelmeli• Ph+ AML’ye eşlik eden kromozomal anomaliler

• Trizomi 8• Monozomi 7• İzokromozom 17q

INV(16)(p13q22) ⁄ t(16;16)(p13;q22)

• AML‐M4 ile  ilişkilendirilmiştir• En sık trizomi 22 ile birliktelik gösterir • Diğer AML sınıflarında da görülebilir

• M0 • M1 • M2  • M5

• MRP delesyonu• En iyi prognoz

AML’de Sitogenetik Belirteçlere Göre Risk Grupları

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

• AML’de görülen mutasyonlar 3 sınıfa ayrılır• Sınıf I Mutasyonlar: Sinyal iletimi ile ilgili genlerin mutasyonu• Myeloproliferasyon bozulur

• FLT3 • KIT • N‐RAS• K‐RAS • PTPN11

• İzole sınıf I mutasyonları, myeloproliferatif hastalıklar (örn; KML)Neden olabilir

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

• Sınıf II Mutasyonlar: Hematopoetik transkripsiyon faktör genlerinde mutasyon 

• Diferansiyonu bozarlar• NPM1• CEBPA

• İzole sınıf II mutasyonları MDS gelişimine neden olabilir

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

• Sınıf III Mutasyonlar: Epigenetik genlerdeki mutasyonlar 

• DNA dizisinden bağımsız olarak gen ifadesinde meydana gelen kalıtsal değişiklikler 

x Gen Ekspresyonu

Gen Ekspresyonu

Epigenetik

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

• Sınıf III Mutasyonlar: Epigenetik genlerdeki mutasyonlar • IDH1 • IDH2• TET2• ASXL1 • DNMT3A

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

• 3 tane genin mutasyonlarının pediatrik AML ilekesin ilişkisi gösterilmiştir

• FLT3 • NPM • CEBPA

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

AML’de Moleküler Düzenlenmeler

FTL3 (Fms‐Related Tyrosine Kinase 3)

• FTL3, hematopoetik progenitör hücreler tarafından ekspreseedilen bir reseptör protein kinaz• 13q12’de lokalize• FTL3 mutasyonları AML’de en sık görülen somatik mutasyonlardır 

• %20

• Yüksek relaps riski oluşturması nedeniyle kötü prognozla ilişkili• İki tip mutasyon görülmekte

• ITD (Tandem duplikasyonu ) • TKD (nokta mutasyonu)

FTL3 (Fms‐Related Tyrosine Kinase 3)

• FLT3 ITD

• t(15;17) ile beraber görülür• Hastaların %30’u normal sitogenetik sonuçlu AML ile beraberdir• Relapsda mutasyon kaybolur ve dolayısıyla stabil olmayan bir moleküler değişikliktir

• NPM1 ile birliktelik iyi prognoz

FTL3 (Fms‐Related Tyrosine Kinase 3)

• TKD • Mutasyonlar ekzon 20’de kodon 835 ve 836’da yer alır• AML’lerde %10 sıklıkta• Prognoza etkisi belli değil• Normal karyotip ile daha sık görülür• Diğer genler ile birliktelik 

• NPM1• CEBPA• NRAS

NPM1 (Nucleolar Phosphoprotein B23) Mutasyonları

• NPM1• Ribozom biosentezinde, proteinlerin çekirdeğe taşınması• Sentromer duplikasyonu

• AML olgularının %10’nunda • 40 civarı mutasyon tarif edilmiş

• En sık mutasyon TCTG şeklinde 4 bazlık duplikasyon• %50‐60’ı normal karyotip• Diğer genler ile birliktelik

• FLT3• DNMT3A • IDH

• FLT3‐ITD olmaksızın iyi prognostik özellik• AML takibinde çok iyi bir biomarkırdır, çünkü remisyonda kaybolur ve relapsda ortaya çıkar

CEBPA (CCAAT/Enhancer Binding Protein) Mutasyonları

• Nötrofil diferansiyasyonunda görevli transkripsiyon faktörü• Mutasyonunda hematopoetik diferansiyonda blok meydana gelir• AML’li çocuklarda %4‐8 oranında görülmekte• İyi prognoz ile ilişkili

Yeni Nesil Dizi Analizi

4. Nesil Dizi Analizi

DNA İzolasyonu  PCR Dizileme

62

2010: 5K$, a few days?

2009: Illumina, Helicos40-50K$

Yıl

Log 1

0(m

aliy

et)

201020052000

10

8

6

4

22015: 100$, <24 hrs?

2008: ABI SOLiD60K$, 2 hafta

2007: 4541M$, 3 ay

2001: Celera100M$, 3 yıl

2001: Human Genome Project2.7G$, 11 yıl