Dr. Emin KARACAŞubat‐2019
Lösemi Genetiği
Haploid genom, 3.2 milyar baz çiftidizisi A,G,T,CYaklaşık 1 m,
diploid genom 2m20.000 gen%1.5
Çekirdekli hücrelerde eksprese olurlar, mRNA;Genin ürününün oluşturulması için gereken ara molekül
Çoğu hücre 10.000‐15.000 geni eksprese eder
Genom
Genom DNA’nın tamamı
Genetik ilişkili hastalıklar
DNA değişiklikleriKalitatif
Kantitatif
DNA dışı değişiklikler(epigenetik)Metilasyon
Histon değişikliklerimikroRNA’lar
Genetik Değişiklikler
KantitatifDeğişiklikler
Kayıplar
Kazançlar Anormaltekrarlar
KalitatifDeğişiklikler
Yer değişiklikleri(Translokasyonlar)
Ters dönmeler(İnversiyonlar)
Farklılıklar(Baz
değişiklikleri)
Genetik Değişiklikler
Sitogenetik ve MolekülerSitogenetik Karyotipleme Floresan insituhibridizasyon Array‐CGH
Moleküler Genetik Testler
10.000kat kondansasyon farkı
Genetik DeğişiklikleriNasıl Saptıyoruz?
Genetik Testler
Işık mikroskopunda görülebilirboyut• Kromozom Anomalisi
Işık mikroskopunda görülemezboyut• FISH• Array‐CGH• MLPA• PCR tabanlı yöntemler
Işık mikroskopunda görülemezboyut• Dizi analizi• Sanger• NGS
Işık mikroskopunda görülebilir boyuttaSitogenetik inceleme>3Mb (3 milyon baz)
Floresan mikroskopta tespit edilebilir özellikteFloresan in situ hibridizasyon>100 kb delesyon(100.000 baz); >500 kb duplikasyon
Moleküler karyotipleme‐Array‐CGH0.5‐1 (500‐1000 baz) kb üzeri değişiklikler
Dizi analizi
Genetik Hastalıklar Nasıl Oluşur İnceleme Yöntemleri
Kromozom incelemesi : SitogenetikFISHArray‐CGHSanger dizi analiziYeni nesil dizi analizi (NGS)Real time PCR…
Genetik Testler
Moleküler Sitogenetik
Moleküler
Karyotip FISH PCR
Hangi Test?
SİTOGENETİK MOLEKÜLER SİTOGENETİK MOLEKÜLER GENETİK
LösemiOluşmaNedenleri
Kromozom DNA değişikliği
Lösemilerde Moleküler Düzenlenmeler
Lösemi
Lösemilerde Genetik Belirteçler
• Tanı• Risk sınıflaması• Tedavi hedefi belirleme• İzlem‐MRD
Neden Genetik?
ALL de moleküler mekanizmalar
ALL Genomunda neler oluyor? • Sayısal kromozom bozuklukları– Hiperdiploidi– Hipodiploidi
• Yapısal kromozom bozuklukları– Translokasyon–İnversiyon
• Gen ekspresyon değişiklikleri
• Epigenetik değişiklikler
• Tek gen mutasyon ve delesyonları
ALL’de Genetik Belirteçlerin Sıklığı
ALL’de Yaşlara Göre Genetik Belirteçlerin Sıklığı
Hiperdiploidi/Hipodiploidi
• Hiperdiploidi (>46 kromozom)• Düşük Hiperdiploidi (47‐50)• Yüksek Hiperdiploidi (51‐65)• 4, 10, 14, 17, 18, 21, X
• Hipodiploidi (<45 kromozom)• Düşük Hipodiploidi (31‐39)• Yüksek Hipodiploidi (40‐45)
ETV6/RUNX1 t(12;21)(p13q;q22)
• Pediatrik olgularda % 22• PreB olgularda %25• İyi prognostik belirteç• DİKKAT
• Sitogenetik atlayabilir• TEL delesyonu
TCF3/PBX1 t(1;19)(q23;p13.3)
• Pediatrik olgularda % 3• Kötü prognostik belirteç
KMT2A yeniden düzenlenmeleri
• 11q23 • 70’ten fazla translokasyon• Pediatrik olgularda % 8 • Erişkin olgularda % 10 • Kötü prognostik belirteç
t(11;19)
t(4;11)
t(9;11)
iAMP21
• Bir kromozom üzerinde en az 4 kopya RUNX1• Kötü prognoz• Kromozom 21’in kompleks yeniden düzenlenmeleri
BCR/ABL t(9;22)(q34;q11.2)
• Pediatrik olgularda % 3‐5 • Kötü prognostik belirteç• İlaç direnci
• Trizomi 8
ALL Sitogenetik Risk Gruplaması
ALL için WHO klasifikasyonu
• B‐lenfoblastik lösemi/lenfoma• •B‐lenfoblastik lösemi/lenfoma, NOS• •B‐lenfoblastik lösemi/lenfoma tekrarlayan genetik değişikliklere göre• –t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR‐ABL1 pozitif B‐ALL• –t(v;11q23.3);KMT2A yeniden düzenlenmesi pozitif B‐ALL• –t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6‐RUNX1 pozitif B‐ALL• –Hyperdiploidy pozitif B‐ALL• –Hypodiploidy pozitif B‐ALL• –t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3‐IGH pozitif B‐ALL• –t(1;19)(q23;p13.3);TCF3‐PBX1 pozitif B‐ALL• –BCR‐ABL1–like B‐ALL• –iAMP21 pozitif B‐ALL• –T‐lenfoblastik lösemi/lenfoma• •Early T‐cell precursor lymphoblastic leukemia: FLT3, NRAS/KRAS, DNMT3A,IDH1, IDH2
Ph‐like(BCR‐ABL1‐like) B‐ALL
• Ph+ (BCR‐ABL1+) ALL benzeri ekspresyon profili• Çocukluk çağında %10‐15%, genç erişkinlerde%30’a kadar• IKZF1 delesyon veya mutasyonları çok sık• ABL veya JAK/STAT yolağı mutasyonları yüksek• %50 olguda CRLF2 değişimleri±JAK2 mutasyonları• Kötü prognoz
Ph‐like ALL altgrupları
• Sitokin reseptör ekspresyon kontrolünü bozan yeniden düzenlenmeler(CRLF2,EPOR)
• Kimerik TK oluşumuna yol açan yeniden düzenlenmeler (ABL1, JAK2)• Mutasyonlar (IL7R, JAKs, Ras)• Delesyonlar (SH2B3/LNK)
Ph‐like ALL altgruplarının yaşlara göre dağılımı
Ph‐like ALL tedavi hedefleri
ALL’de Genetik Test
Tanı Aşamasında Risk Sınıflaması• Sitogenetik inceleme (G band)• iFISH
• BCR/ABL• KMT2A füzyonları• ETV6/RUNX1 • TCF3/PBX1 • IL3/IGH
• RT‐PCR • BCR/ABL• BCR/ABLnegatif ise: Ph‐likeALLfüzyonları
• CRLF2, PAX5, JAK1, JAK2, IKZF1 mutasyonları(B‐ALL)
• NOTCH1 veFBXW7 mutasyonları(T‐ALL)
• Sitogenetik inceleme başarısız veya anöploidi(+) ise: arrayCGH
ALL’de Genetik Test Algoritması
ALL’de Genetik Test MRD izlemi
AML
• Çocukluk çağı akut lösemilerinin yalnızca %15‐20• Herediter AML
• TP53 • RUNX1 • GATA2 • CEBPA
AML Tanı ve Sınıflandırma
• FAB ve WHO sınıflamaları
AML’deki Sitogenetik Biyobelirteçler
• Olguların yaklaşık %20’sinde tespit edilebilen karyotipikanomali yoktur• Günümüze kadar 100’den fazla dengeli kromozomal değişiklik
• Kromozomal anomalilerin büyük çoğunluğu translokasyonlar ve büyük delesyonlar
• Konvensiyonel sitogenetik yapısal ve sayısal kromozomal anomalilerin %70‐80’ini saptayabilir
• Kriptik translokasyonlar• FISH• RT‐PCR
AML’deki Sitogenetik Biyobelirteçler
• t(8;21)(q22;q22),• inv(16)(p13.1q22) • t(15;17)(q22;q21)/PML‐RARA • 11q23/MLL‐rearranged
%50
Myelodisplastik sendrom ile ilişkili AML
• del 5q• ‐7, del 7q• del 9q• del 20q• +8• kompleks karyotipler• t(1;3) • t(2;11)
AML’de karşılaşılan kromozomal anomaliler ve sıklıkları%
t(8;21)(q22;q22)
• Çocukluk çağı AML’sinde en sık görülen yapısal anomalilerden• AML1/ETO füzyon geni • AML‐M2 • Yüksek remisyon ve sağkalım oranı • Ek anomali varlığının klinik önemi • Yaklaşık %50’sinde relaps meydana gelir
t(11q23) ⁄ KMT2A (MLL)
• Çocukluk çağı AML’lerinde en sık görülen yeniden düzenlemedir (%14‐22)
• Bu anomalilerin yaklaşık %50’sini t(9,11)(p22,q23) kapsar• Geri kalanı
• t(6;11)(q27;q23)• t(10;11)(p12;q23) • t(11;19)(q23;p13.1) • t(1;11)(q21;q23)
• t(9;11) hariç kötü prognoz• FAB M5 ile ilişkili• Trizomi 8 en sık eşlik eden kromozomal anomalidir
t(15;17)(q22;q21)• Akut promyelositik lösemi (AML‐M3)• PML/RARa füzyon geni meydana gelir• Maturasyonun promyelositik evrede durmasına neden olur• %45 hastada +8
t(9;22)(q34;q11)
• de Novo AML’de %1 sıklıkta• M1 ya da M2 akla gelmeli• Ph+ AML’ye eşlik eden kromozomal anomaliler
• Trizomi 8• Monozomi 7• İzokromozom 17q
INV(16)(p13q22) ⁄ t(16;16)(p13;q22)
• AML‐M4 ile ilişkilendirilmiştir• En sık trizomi 22 ile birliktelik gösterir • Diğer AML sınıflarında da görülebilir
• M0 • M1 • M2 • M5
• MRP delesyonu• En iyi prognoz
AML’de Sitogenetik Belirteçlere Göre Risk Grupları
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
• AML’de görülen mutasyonlar 3 sınıfa ayrılır• Sınıf I Mutasyonlar: Sinyal iletimi ile ilgili genlerin mutasyonu• Myeloproliferasyon bozulur
• FLT3 • KIT • N‐RAS• K‐RAS • PTPN11
• İzole sınıf I mutasyonları, myeloproliferatif hastalıklar (örn; KML)Neden olabilir
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
• Sınıf II Mutasyonlar: Hematopoetik transkripsiyon faktör genlerinde mutasyon
• Diferansiyonu bozarlar• NPM1• CEBPA
• İzole sınıf II mutasyonları MDS gelişimine neden olabilir
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
• Sınıf III Mutasyonlar: Epigenetik genlerdeki mutasyonlar
• DNA dizisinden bağımsız olarak gen ifadesinde meydana gelen kalıtsal değişiklikler
x Gen Ekspresyonu
Gen Ekspresyonu
Epigenetik
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
• Sınıf III Mutasyonlar: Epigenetik genlerdeki mutasyonlar • IDH1 • IDH2• TET2• ASXL1 • DNMT3A
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
• 3 tane genin mutasyonlarının pediatrik AML ilekesin ilişkisi gösterilmiştir
• FLT3 • NPM • CEBPA
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
AML’de Moleküler Düzenlenmeler
FTL3 (Fms‐Related Tyrosine Kinase 3)
• FTL3, hematopoetik progenitör hücreler tarafından ekspreseedilen bir reseptör protein kinaz• 13q12’de lokalize• FTL3 mutasyonları AML’de en sık görülen somatik mutasyonlardır
• %20
• Yüksek relaps riski oluşturması nedeniyle kötü prognozla ilişkili• İki tip mutasyon görülmekte
• ITD (Tandem duplikasyonu ) • TKD (nokta mutasyonu)
FTL3 (Fms‐Related Tyrosine Kinase 3)
• FLT3 ITD
• t(15;17) ile beraber görülür• Hastaların %30’u normal sitogenetik sonuçlu AML ile beraberdir• Relapsda mutasyon kaybolur ve dolayısıyla stabil olmayan bir moleküler değişikliktir
• NPM1 ile birliktelik iyi prognoz
FTL3 (Fms‐Related Tyrosine Kinase 3)
• TKD • Mutasyonlar ekzon 20’de kodon 835 ve 836’da yer alır• AML’lerde %10 sıklıkta• Prognoza etkisi belli değil• Normal karyotip ile daha sık görülür• Diğer genler ile birliktelik
• NPM1• CEBPA• NRAS
NPM1 (Nucleolar Phosphoprotein B23) Mutasyonları
• NPM1• Ribozom biosentezinde, proteinlerin çekirdeğe taşınması• Sentromer duplikasyonu
• AML olgularının %10’nunda • 40 civarı mutasyon tarif edilmiş
• En sık mutasyon TCTG şeklinde 4 bazlık duplikasyon• %50‐60’ı normal karyotip• Diğer genler ile birliktelik
• FLT3• DNMT3A • IDH
• FLT3‐ITD olmaksızın iyi prognostik özellik• AML takibinde çok iyi bir biomarkırdır, çünkü remisyonda kaybolur ve relapsda ortaya çıkar
CEBPA (CCAAT/Enhancer Binding Protein) Mutasyonları
• Nötrofil diferansiyasyonunda görevli transkripsiyon faktörü• Mutasyonunda hematopoetik diferansiyonda blok meydana gelir• AML’li çocuklarda %4‐8 oranında görülmekte• İyi prognoz ile ilişkili
Yeni Nesil Dizi Analizi
4. Nesil Dizi Analizi
DNA İzolasyonu PCR Dizileme
62
2010: 5K$, a few days?
2009: Illumina, Helicos40-50K$
Yıl
Log 1
0(m
aliy
et)
201020052000
10
8
6
4
22015: 100$, <24 hrs?
2008: ABI SOLiD60K$, 2 hafta
2007: 4541M$, 3 ay
2001: Celera100M$, 3 yıl
2001: Human Genome Project2.7G$, 11 yıl
Top Related