Laboverslag geïntegreerd practicum

Geıntegreerd practicum: gevorderde biotechnologie, deel I

Filip Deblaere - Groep 12

2 december 2014

1

Contents

1 Experiment 1: Onderzoek naar de functie van het KRP2-gen in Arabidopsisthaliana 31.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.2 Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.1 Fenotypische analyse en eiwitextractie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.2.2 Scheiding van de eiwitten door middel van SDS-PAGE . . . . . . . . . . . 31.2.3 Detectie van het KRP2-eiwit door middel van Western-analyse . . . . . . 41.2.4 Vergelijking van genoomploıdie in de bladcellen van wild type en mutant

aan de hand van flowcytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.3 Resultaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.4 Besluit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2 Experiment 2: Studie van KRP2-CDK interacties in Arabidopsis thaliana 112.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.2 Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.3 Resultaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.4 Besluit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.5 Extra vragen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3 Experiment 3: Ontwikkelingsbiologie van bloeiende planten 153.1 Doel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.2 Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.3 Resultaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.4 Besluit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2014 - 2015 2 Filip Deblaere - groep 12

1 Experiment 1: Onderzoek naar de functie van het KRP2-genin Arabidopsis thaliana

1.1 Doel

We onderzoeken hoe sterk het bladfenotype van Arabidopsis thaliana gecorreleerd is met hetKRP2 eiwitniveau.

1.2 Methode

1.2.1 Fenotypische analyse en eiwitextractie

Ten eerste analyseren we de fenotypes van de Arabidopsis planten. Er wordt gebruik gemaaktvan een hemizygote overexpressielijn voor krp2, bekomen door krp2 onder invloed te stellenvan constitutieve promotor CaMV 35S. De zaden van deze transgene plantenlijn, geproduceerddoor zelfbestuiving, worden gekiemd en gegroeid, waarna er in de populatie twee fenotypeszichtbaar zijn. De wild type planten bevatten het transgen niet, terwijl de mutante planten hetzijhemizygoot, hetzij homozygoot zijn voor het transgen. Dit gen wordt dominant overgeerfd.

De segregatie van de fenotypes wordt nagegaan door de wild types en de mutante planten tetellen en deze verhouding te vergelijken met wat we verwachten indien een dominant kenmerkovergeerfd wordt: 75% van de planten draagt het dominante kenmerk of is dus mutant, terwijlde overige 25% het wild type fenotype draagt.

De planten worden eerst macroscopisch bestudeerd. Meer bepaald wordt er naar het verschilin bladfenotype gekeken tussen de wild type en de mutante plant.

Daarna worden de planten microscopisch bestudeerd. Hiervoor knippen we blaadjes van heteerste bladpaar van een wild type en mutante plant af en voegen we ethanol toe om chlorophylin de blaadjes op te lossen. Bovendien wordt er zuiver melkzuur toegevoegd, teneinde detransparantie en brekingsindex van het preparaat te verhogen en een beter resultaat te verkrijgenonder de microscoop. Daarna bestuderen we de verschillen in celgrootte en cellenaantal tussenwild type en mutante planten.

Vervolgens trachten we de eiwitten te extraheren uit een wild type en mutante plant. Dezeextractie moet volledig bij lage temperatuur gebeuren aangezien het KRP2-eiwit labiel is. Omwillehiervan vermalen we het plantenmateriaal in aanwezigheid van vloeibaar stikstof. Aan het pulpvan de plant wordt extractiebuffer toegevoegd, zodat het KRP2-eiwit zich na centrifugatie inhet supernatans bevindt.

Ten slotte wordt de eiwitconcentratie spectrofotometrisch bepaald voor de wild type enmutante plant. Hiervoor wordt eerst een verdunningsreeks gemaakt van Bovine Serum Albu-mine (BSA) in gedestilleerd water. Uit deze verdunningsreeks worden acht standaarden metverschillende concentraties en een blancostandaard gehaald om een ijklijn op te stellen aan dehand van de gemeten absorbanties bij 595 nm. De absorptie van de eiwitstalen wordt eveneensgemeten, waarna de concentratie van het eiwit aan de hand van de ijklijn kan bepaald worden.

1.2.2 Scheiding van de eiwitten door middel van SDS-PAGE

In de volgende fase van het onderzoek worden de eiwitten die geextraheerd werden uit de wildtype en mutante planten gescheiden volgens grootte op een SDS-PAGE gel.

Eerst worden beide eiwitstalen opgemengd met SDS-PAGE ladingsbuffer, ter voorbereidingvan de elektroforese. Van elk staal wordt 25 µl geladen, samen met een moleculaire merker:Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-RAD).


Table 1: Segregatieanalyse van Arabidopsis thaliana. De geanalyseerde planten zijn afkomstig vaneen hemizygote overexpressielijn voor krp2. Het krp2 -gen is een dominant kenmerk, waardoorwe een 3:4 uitsplitsing verwachten met 75% mutante planten. Bij deze analyse werden echter7,4% meer wild type planten waargenomen dan verwacht.

Klassen # Waargenomen # Verwacht

Wild Type 12 (32,4%) 9 (25%)

Mutant 25 (67,6%) 28 (75%)

1.2.3 Detectie van het KRP2-eiwit door middel van Western-analyse

Na het scheiden van eiwitten op een gel trachten we specifiek het KRP2-eiwit te detecteren aande hand van een Western-analyse. Hierbij blotten we de SDS-PAGE gel op een nitrocellulose-membraan.

Vervolgens moet het KRP2-eiwit specifiek worden gedetecteerd. Aspecifieke bindingsplaatsenworden geblokkeerd met behulp van 3% melkpoeder in TBS-T. De immunodetectie gebeurt aande hand van een primair en secundair antilichaam. Anti-KRP2, aangemaakt in konijn, dient alsprimair antilichaam dat zal binden op het KRP2-eiwit. Het secundaire antilichaam is anti-konijnen bindt aan het HRP (horseradish peroxidase). Ten slotte wordt luminolreagens toegevoegddat gebruikt wordt als detectiemiddel. In aanwezigheid van H2O2 wordt het peroxidase enzymegeactiveerd, wat op zijn beurt het luminol zal oxideren. Geoxideerd luminol zendt licht uit datgedetecteerd wordt op een fotografische film.

Op deze manier kunnen we besluiten of het KRP2-eiwit meer of minder tot expressie wordtgebracht in de mutante plant ten opzichte van de wild type plant.

1.2.4 Vergelijking van genoomploıdie in de bladcellen van wild type en mutantaan de hand van flowcytometrie

Figure 1: DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)wordt gebruikt om degeısoleerde kernen tekleuren.

Ten slotte wordt ook het aantal genoomkopijen tussen bladcellenvan wild type en mutante planten vergeleken en bekijken we ofer een verband is tussen de overexpressie van krp2 en de genoom-ploıdie. Dit gebeurt aan de hand van een flowcytometrischeanalyse. Aan de geısoleerde kernen van het bladmateriaal van deplanten wordt DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) toegevoegd(Figure 1). Wanneer de gekleurde kernen passeren langs de laser-straal van een cytometer worden ze geexciteerd en wordt hetuitgezonden licht door detectoren opgevangen, die de informatieomzetten in een DNA-histogram van kernen met verschillendeploıdie.

1.3 Resultaten

De resultaten van de tellingen betreffende de segregatie van fenotypes van Arabidopsis thalianaworden weergegeven in Table 1. Uit een macroscopische analyse besluiten we dat een wild typeplant meestal groter is en ovale, donkerdere blaadjes heeft, terwijl de mutante plant meestalkleiner is en lichter gekleurde, gekartelde blaadjes heeft.

Deze tellingen werden door 22 verschillende groepen uitgevoerd (Table 2 ). In totaal werden231 wild type en 548 mutante planten geteld van de 779 planten. Er werden dus 36 of 4,7%


Table 2: Segregatieanalyse van Arabidopsis thaliana: resultaten van alle 22 groepen. Net als bijde segregatieanalyse van onze eigen resultaten, werden in totaal minder mutanten geteld (70,3%)dan verwacht (75%).

Groep # Wild Type # Mutant Groep # Wild Type # Mutant

1 9 24 12 12 25

2 9 25 13 9 28

3 13 23 14 11 26

4 11 25 15 10 27

5 11 21 16 10 26

6 9 25 17 9 25

7 14 24 18 9 22

8 9 24 19 9 25

9 15 25 20 9 24

10 11 27 21 12 26

11 8 29 22 12 22

VERWACHT 195 (25%) 584 (75%) TOTAAL 231 (29,7%) 548 (70,3%)

minder mutante planten geteld dan wat men verwacht van een dominant kenmerk.De significantie van dit verschil gaan we na met behulp van een χ2-test. χ2 wordt voor n

fenotypische klassen als volgt berekend:

χ2(df = n− 1) =n∑

i=1

(Oi − Ei)2

Ei

In dit geval is n = 2, zodat χ2 = 8, 865. De nulhypothese stelt dat er geen significant verschilis tussen de verwachte en waargenomen verhoudingen in fenotypes. Voor χ2 = 8, 865 is deovereenkomstige p-waarde kleiner dan 0,05 (p < 0, 005). De nulhypothese mag bijgevolgverworpen worden. We kunnen dus met 95% zekerheid stellen dat de waargenomen en verwachteverhoudingen significant van elkaar verschillen. Hieruit besluiten we dat de segregatie vanhet krp2 transgen niet beantwoordt aan de wetten van Mendel. Hierbij mogen we echter nietvergeten te vermelden dat heel wat mutante zaden nog niet gekiemd waren, waardoor er mindermutante planten geteld waren dan er effectief zijn. Waarschijnlijk beantwoordt de segregatiedan net wel aan de wetten van Mendel.

De microscopische analyse van een wild type blad gaf volgende resultaten. De ondersteepidermis bestaat uit puzzelvormige cellen, net zoals de bovenste epidermis. De cellen van debovenste epidermis zijn echter veel groter en minder afgerond. Het sponsparenchym bestaatuit mooi afgeronde cellen met grote intercellulaire ruimtes, terwijl het pallisadeparenchym ookafgeronde cellen heeft die echter sterk aansluiten op elkaar. Bovendien zijn ook trichomen,stomata en bladnerven duidelijk zichtbaar onder de lichtmicroscoop.

De voornaamste verschillen tussen wild type en mutante planten bevinden zich in de epidermis.Opvallend is dat de epidermiscellen van de mutante planten veel groter zijn ten opzichte van dewild type plant. Er zijn ook minder huidmondjes aanwezig, al kan dit gewoon liggen aan hetfeit dat er ook minder cellen zijn. Op sommige delen van het preparaat lijken sommige cellagenverdwenen te zijn. Indien ze wel zichtbaar zijn, zijn ook daar de cellen groter dan normaal.

In Table 3 zijn de celtellingen weergegeven van alle groepen. Alle cellen van de ondersteepidermis die in een beeld geteld kunnen worden op een 40x vergroting worden in rekening


Table 3: Resultaten van microscopische analyse. Op 40x vergroting werden in een microscopischbeeld de cellen van de onderste bladepidermis geteld bij wild type en mutante planten die krp2overexpresseren. Vervolgens werd de gemiddelde waarde van alle 22 groepen genomen.

Groep # Wild Type # Mutant Groep # Wild Type # Mutant

1 41 16 12 46 18

2 44 19 13 50 19

3 38 16 14 41 13

4 43 16 15 38 20

5 46 19 16 48 18

6 44 17 17 42 16

7 37 14 18 40 14

8 56 18 19 41 16

9 23 12 20 39 14

10 37 12 21 66 22

11 33 19 22 63 22

TOTAAL 956 370 GEM. 43, 4545 16, 8181

gebracht. We voeren een ongepaarde t-test uit om te kijken of het verschil in gemiddeld celaantalsignificant verschilt tussen wild type en mutante planten. De nulhypothese stelt hier dat ergeen significant verschil is, terwijl de alternatieve hypothese stelt dat er juist wel een significantverschil is. De kans die gekoppeld is aan deze ongepaarde t-test wordt berekend op 2.065 ∗ 10−12.We kunnen dus met 95% zekerheid, of op 5% significantieniveau, stellen dat er een significantverschil is in gemiddeld bladaantal bij wild type en mutante planten. De nulhypothese wordtverworpen ten voordele van de alternatieve hypothese.

De BSA standaarden werden gemaakt aan de hand van de berekeningen gemaakt in Table4. In dezelfde tabel staan ook de resultaten voor de absorptiemetingen van de standaarden dienodig zijn om de ijklijn op te stellen. Om 100 µg/ml BSA te verkrijgen, werd een stockoplossingvan 10 mg/ml 100x verdund. Vanuit die oplossing werden de standaarden bereid en werd eenijklijn opgesteld (Figure 2). Hoewel de absorbanties bij 4 en 6,4 µg/ml wat afwijken van deijklijn, stelt de determinatiecofficint R2 dat de opgestelde ijklijn de werkelijkheid relatief goedbenadert (R2 = 0, 97274).

Analoog werd de absorptie van de eiwitstalen van de wild type (0,598) en mutante (0,157)plant gemeten. Via de ijklijn konden we de eiwitconcentratie berekenen (Figure 2): de wild typeplant bevat 17,74 µg/ml eiwitten terwijl de mutante plant 4,66 µg/ml eiwitten bevat. Rekeninghoudend met een 500x verdunningsfactor komt de totaalconcentratie dus op 8 870 µg/ml (wildtype) en 2 330 µg/ml (mutant).

Voor de SDS-PAGE werd van beide plantfenotypes 50 µg eiwit gebruikt. Het aantalovereenkomstige µl eiwitextract werd als volgt berekend: V (eiwitextract) = m(eiwit)/c(eiwit),waarbij m = 50µg. Voor de wild type plant (c = 8870µg/ml) en de mutante plant (c =2330µg/ml) komen we dan respectievelijk 5,64 µl en 21,5 µl als volume uit. Aangezien we slechtsmet een maximum van 20 µl kunnen werken, herberekenen we de volumes voor 46,6 µg (alsV (eiwit) = 20, 0µl het maximum is, dan is m(eiwit) = 0, 0200µl ∗ 2330µg/ml = 46, 6µg). Vanhet eiwitextract van de wild type plant nemen we dan 46, 6µg/8870µg/ml = 5, 25µl en lengenwe aan tot 20 µl met gedestilleerd water.

De resultaten van de Western Blot worden weergegeven in Figure 3. Hoewel er in wild typeplanten ook KRP2-eiwit aanwezig is, maar dan in veel mindere mate, is de hoeveelheid in deze


Table 4: Berekeningen bij het maken van een verdunningsreeks van BSA in gedestilleerd water.Elke verdunning werd gebruikt als standaard voor het opstellen van een ijklijn. Voor elkestandaard werd de absorptie gemeten bij 595 nm. Aangezien voor de spectrofotometrischeanalyse Bradfordreagens toegevoegd moest worden, moet de BSA-concentratie gecorrigeerdworden.

BSA standaard(µg/ml)

25 20 10 8 5 3 2 1 0

Volume 100 µg/ml BSAstandaard (µl)

250 200 100 80 50 30 20 10 0

Volume gedestilleerd wa-ter (µl)

750 800 900 920 950 970 980 990 1000

Totaal volume (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Gecorrigeerde BSAconcentratie na toevoe-gen Bradfordreagens(µg/ml)

20 16 8 6,4 4 2,4 1,6 0,8 0

Absorbantie bij 595 nm 0,627 0,545 0,285 0,284 0,193 0,100 0,067 0,027 0,000

planten waarschijnlijk niet groot genoeg om deze te kunnen detecteren. Bij de mutante planten,waar krp2 tot overexpressie werd gebracht, is wel een sterk bandje aanwezig rond 32 kDa, watwijst op het KRP2-eiwit. Normaal gezien heeft het KRP2-eiwit echter een moleculair gewichtvan ongeveer 24 kDa. Dit fenomeen, waarbij een proteıne niet migreert volgens zijn voorspeldemoleculaire gewicht, wordt gel shifting genoemd en kan veroorzaakt worden door verschillendefactoren. Indien het proteınestaal onvolledig gereduceerd is, zijn meestal verschillende bandenaanwezig rond de verwachte grootte. De mobiliteit van een eiwit kan ook abnormaal zijn indienhet een sterk hogere of lagere affiniteit heeft voor het SDS. Als de primaire structuur van hetgedenatureerde proteıne erg rigide is, kan de migratie ook trager verlopen. Een laatste mogelijkeoorzaak is de variabiliteit van de moleculaire gewichtsmerkers. De andere bandjes die zichtbaarzijn op de Western Blot ontstaan door aspecifieke binding van antilichamen. Via cross-linkingkunnen deze met andere eiwitten associeren, waardoor ook deze eiwitten gedetecteerd worden.

Aan de hand van een flowcytometrische analyse besluiten we of KRP2 interageert metofwel CDKA, ofwel CDKB. CDKA is een eiwit dat invloed uitoefent op de volledige celcyclus.Indien CDKB echter door KRP2 geınhibeerd wordt, zal na de DNA-synthese de mitotischecelcylus overgaan op de endoreplicatie. Hierbij zal de genoomploıdie steeds verdubbelen, watook leidt tot expansie van de cel. Indien KRP2 interageert met CDKB verwachten we uit deflowcytometrische analyse van de mutante plant, waar KRP2 in overexpressie gebracht werd,verhoogde ploıdieniveaus.

In Figure 4 worden de resultaten van de flowcytometrische analyse weergegeven. Bij dewild type plant zien we voornamelijk een sterke piek bij 8C ploıdie. Bij de KRP2 overex-pressiemutant nemen we echter licht verlaagde ploıdieniveaus waar, het tegenovergestelde vanwat we zouden verwachten indien CDKB geınhibeerd wordt. De toename in celgroei die wetijdens de microscopische analyse geobserveerd hebben, is dus te wijten aan ploıdieonafhankelijkecompensatiegroei. Hierbij wordt een vermindering in aantal celdelingen gecompenseerd doorcelgroei. Uit deze bevindingen kunnen we besluiten dat KRP2 zeker CDKB niet inhibeert, maarwel CDKA.


0 5 10 15 20 250

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

concentratie [µg/ml]

abso

rban

tie

Absorbantie in functie van de BSA-concentratie: ijklijn

y = 0, 0337x

Figure 2: Op basis van een verdunningsreeks van Bovine Serum Albumine (BSA) werden achtstandaarden (×) en een blanco voorbereid waaruit een ijklijn werd opgesteld. Vervolgens werdde eiwitconcentratie van een wild type plant (•) en mutante plant (4) berekend aan de handvan vergelijking y = 0, 0337x met R2 = 0, 97274.

1.4 Besluit

Uit dit experiment kunnen we onder andere besluiten dat de segregatie van krp2 beantwoordtaan de wetten van Mendel, al is dit niet met volle zekerheid te stellen aangezien door ongekiemdezaden de chi-kwadraattest geen betrouwbaar resultaat gaf.

Uit de microscopische analyse is de invloed van krp2 overexpressie duidelijk: de epidermis-cellen zijn groter dan hun wild type tegenhanger.

Uit de flowcytometrie besluiten we dat KRP2 geen interactie aangaat met CDKB, maarwel met CDKA, aangezien verlaagde ploıdieniveaus onmogelijk het gevolg kunnen zijn vanCDKB-inhibitie. Ten slotte kunnen we besluiten dat de grotere epidermiscellen bij de mutanteplanten ontstaan door ploıdieonafhankelijke compensatiegroei.


Figure 3: Western Blot van het KRP2-eiwit. In laantjes 12 wordt respectievelijk de expressievan het KRP2-eiwit bij de wild type en mutante plant weergegeven. Hoewel we een bandje bij24 kDa verwachten, treedt het bandje van KRP2 op bij 32 kDa ten gevolge van gel shifting.De overige zichtbare bandjes zijn afkomstig van antilichamen die aspecifiek door cross-linkingbinden met andere eiwitten.

Figure 4: Flowcytometrische analyse. Links: ploıdieniveaus bij de wild type plant. Er is eensterke piek waarneembaar bij 8C. Rechts: ploıdieniveaus bij de KRP2 overexpressiemutant. De4C piek is het sterkst. Bovendien nemen we een lichte verlaging van ploıdieniveaus waar.


2 Experiment 2: Studie van KRP2-CDK interacties in Ara-bidopsis thaliana

2.1 Doel

We bekijken hoe goed KRP2 in de cel interageert met enerzijds CDKA;1 en anderzijds CDKB1;1

en welke van deze twee interacties het beste doorgaat. Bovendien vergelijken we de lokalisatievan de drie celcycluseiwitten met de lokalisatie van drie eiwitten afkomstig van subcellulairestructuren: ER, ABD2 en EB1a.

2.2 Methode

De interactie tussen KRP2 en de CDK-eiwitten wordt bepaald aan de hand van BiFC (bi-moleculaire fluorescentiecomplementatie). In dit experiment wordt de N-terminale head van hetGFP (green fluorescent protein) gefusioneerd aan het KRP2-eiwit terwijl de C-terminale tailgefusioneerd wordt met het CDK-eiwit. Indien er interactie is tussen het CDK-eiwit en KRP2zullen de twee GFP-fragmenten terug bij elkaar worden gebracht, waardoor fluorescentie ontstaatdie gedetecteerd kan worden door een confocale laser scanning microscoop. De interactie tussenKRP2-h en CDKA-t enerzijds en KRP2-h en CDKB-t anderzijds wordt gevisualiseerd.

Hetzelfde principe geldt voor het vergelijken van de lokalisatie van de celcyluseiwitten metdie van de subcellulaire structuureiwitten. Hierbij bevat een stam de volledige GFP-fusie van decelcylusgenen. Bovendien wordt er een extra merkersconstruct mee ingespoten om de lokalisatieste vergelijken. Dit merkersconstruct visualiseert de specifieke subcellulaire structuren door dezeeiwitten te fusioneren met volledig RFP (red fluorescent protein). De lokalisatie van het CDKAwordt vergeleken met die van het ABD2, een actinebindend eiwit. Bij het CDKB wordt eenmerkersconstruct van EB1a ingespoten, een microtubulibindend eiwit. Ten slotte wordt delokalisatie van het KRP2 vergeleken met die van het ER, een eiwit van het endoplasmatischreticulum. Deze constructen zullen in feite dienen als controles, zodat we in het geval van geeninteractie nog steeds kunnen weten waar de celcycluseiwitten zich bevinden in de cel.

Alle nodige constructen zijn in verschillende plasmiden aanwezig in LBA4404 Agrobacteriumtumefaciens stammen. Deze stammen worden eerst gewassen in infiltratiebuffer. In een volgendestap bevat deze ook acetosyringon, een stof die het Agrobacterium activeert en efficiente transfectievan plantencellen promoot.

Naast de twee stammen met de celcyluseiwitten of het merkersconstruct wordt bij elketransfectie ook nog een P19 stam toegevoegd. Deze stam bevat een additioneel helperplasmidewaardoor het P19 eiwit van het Bushy Stunt Virus van tomaten tot expressie gebracht zalworden. Normaal gezien zal de PTGS of post-transcriptionele gene silencing machinerie vaneen plantencel expressie inhiberen. Het P19 kan echter de PTGS onderdrukken, zodanig dat deinhibitie van silencing leidt tot een hoger expressieniveau van de ingebrachte transgenen. Deinteracties zullen dan makkelijker door de confocale microscoop gedetecteerd worden.

Vervolgens wordt de optische densiteit van de stammen bepaald, opdat tijdens het maken vande verdunningen een finale OD van 0,5 per construct wordt bekomen. Uiteindelijk bekomen wevijf verschillende constructen waarmee we tabaksplanten zullen infecteren. KRP2-h + CDKA;1-t+ P19 en KRP2-h + CDKB1;1-t + P19 zijn de constructen die gebruikt worden om de hoeveelheidinteractie te meten, terwijl constructen KRP2-GFP + ER-RFP + P19, CDKA-GFP + ABD2-RFP + P19 en CDKB-GFP + EB1a-RFP + P19 gebruikt worden om de lokalisatie te vergelijkentussen celcycluseiwitten en eiwitten van celstructuren.

Vervolgens transfecteren we het exogene DNA door de tabaksplant Nicotiana benthamianate infecteren via de abaxiale epidermis. Drie tot vijf dagen na infiltratie wordt een stukje


geınfecteerde cellaag microscopisch onderzocht op fluorescentie met behulp van een OlympusFV1000 confocale laser scanning microscoop.

2.3 Resultaten

Ten eerste bekijken we de resultaten van de lokalisatie van de celcycluseiwitten ten opzichtevan die van de eiwitten van de celstructuren. Indien er geen interactie op zou treden tussen hetCDK-eiwit en KRP2, weten we op die manier in ieder geval wel de lokalisatie van alle eiwitten.

De eerste infiltratie die werd uitgevoerd bevatte het construct KRP2-GFP + ER-RFP +P19 (zie Figure 5). De confocale microscoop detecteerde duidelijk enkel KRP2 in de nucleusterwijl het ER-eiwit zich vooral rond de kern en in het cytoplasma bevindt. De cytoplasma heeftde vorm van een celmembraan doordat de centrale vacuole deze naar de celwand toe duwt. Er isgeen overlap tussen de twee eiwitten.

Figure 5: Visualisatie van abaxiale epidermiscellen van N. benthamiana. Links: visualisatieKRP2-GFP; midden: visualisatie ER-RFP; rechts: combinatie.

Een tweede tabaksplant werd geınjecteerd met construct CDKA-GFP + ABD2-RFP + P19(zie Figure 6). Naast de celkern is het CDKA-eiwit ook aanwezig in het cytoplasma, opnieuwaan de kant geduwd door de centrale vacuole. Het ABD2-eiwit, dat bindt op actine, bevindtzich rondom de kern en niet erin. In vele cellen zijn ook ’kabels’ van actine zichtbaar. Er is geenoverlap tussen de twee eiwitten.

Figure 6: Visualisatie van abaxiale epidermiscellen van N. benthamiana. Links: visualisatieCDKA-GFP; midden: visualisatie ABD2-RFP; rechts: combinatie.

Het derde construct dat in de tabaksplant gebracht werd is CDKB-GFP + EB1a-RFP +


P19 (Figure 7). Net als het CDKA-eiwit is CDKB in de celkern en in het cytoplasma aanwezig.EB1a is een microtubulibindend eiwit en is aanwezig in het cytoplasma, vaak in buisvormigestructuren aangezien microtubuli deel uitmaken van het cytoskelet. Er is geen overlap tussende twee eiwitten. Uit de lokalisaties van de celcycluseiwitten kunnen we besluiten dat CDKA,CDKB en KRP2 enkel samen voorkomen in de celkern en de interactie dus daar zal plaatsvinden.

Figure 7: Visualisatie van abaxiale epidermiscellen van N. benthamiana. Links: visualisatieCDKB-GFP; midden: visualisatie EB1a-RFP; rechts: combinatie.

Vervolgens bestuderen we of er wel dan niet interactie is tussen de CDK-eiwitten en hetKRP2-eiwit. In Figure 8 (links) zien we dat het construct KRP2-h + CDKA-t + P19 eengroene fluorescentie oplevert in de nucleus. Het complex wordt dus enkel in de celkern gevormd.Veel fluorescentie zien we echter niet; dit komt waarschijnlijk omdat de probabiliteit dat tweebacterien de tabaksplant infecteren redelijk laag ligt. We kunnen echter besluiten dat er weldegelijk interactie is tussen CDKA en KRP2. In tegenstelling tot dit construct levert het KRP2-h+ CDKB-t + P19 construct geen fluorescentie op. Het resultaat is negatief: er is geen interactietussen KRP2 en CDKB. Dit besluit vereist echter nog een controle; een van de eiwitten kanimmers niet aanwezig zijn. Men kan KRP2 en CDKB trachten te extraheren en te visualiseren opeen Western Blot om ze te identificeren. Een andere mogelijkheid bestaat erin andere interactieste bestuderen, met behulp van antilichamen of het yeast-two-hybrid systeem. Bovendien bestaatook nog de mogelijkheid dat de head en tail op een verkeerde wijze aan KRP2 en CDKB hangen,waardoor de tonstructuur van GFP niet gevormd kan worden en er geen fluorescentie optreedt.Het is dus noodzakelijk om head en tail van GFP op alle acht mogelijke wijzen aan de eiwittente hangen vooraleer we mogen concluderen dat er geen interactie is.

2.4 Besluit

Met behulp van BiFC werd aangetoond dat KRP2 geen interactie aangaat met het CDKB-eiwit,maar met CDKA. KRP2 inhibeert dus de activeit van CDKA, die (zoals besproken in experiment1) invloed heeft op de hele celcyclus en niet de activiteit van CDKB, die slechts invloed heeft nade synthesefase.

2.5 Extra vragen

Waarom is de wijze van het he- en te-fusie (N- of C-terminaal) zo belangrijk in deze technologie?BiFC of bimoleculaire fluorescentiecomplementatie werkt op basis van de vorming van een

fluorescerend complex. Dit complex wordt gevormd indien twee delen, een head en een tail,van een fluorescerende molecule, zoals GFP of RFP, samen worden gebracht. Deze head en tail


Figure 8: Visualisatie van abaxiale epidermiscellen van N. benthamiana. Links: visualisatieKRP2-h + CDKA-t; rechts: visualisatie KRP2-h + CDKB-t.

worden gefusioneerd op twee eiwitten waarvan de interactie bestudeerd moet worden. Indiendeze eiwitten inderdaad interageren, zullen ook de head en tail van de fluorescerende moleculebij elkaar gebracht worden, waardoor de interactie door fluorescentie gedetecteerd kan worden.In het geval van GFP wordt er bij interactie van head en tail een tonstructuur gevormd dienoodzakelijk is voor het uitsturen van fluorescentie.

Het is echter mogelijk dat de eiwitten wel reageren, maar dat de tonstructuur van hetGFP niet gevormd wordt. Er wordt dan een vals negatief signaal gedetecteerd. Hierbij is vanbelang dat de head en tail aan de juiste eiwitten gefusioneerd worden opdat de tonstructuurgevormd zou worden. Er zijn acht mogelijke fusiekoppels, waarbij de head en tail telkens opverschillende wijzen aan de eiwitten gefusioneerd worden en de twee constructen ook ten opzichtevan elkaar kunnen varieren. Pas als in geen enkele van de acht mogelijke fusiekoppels een signaalgedetecteerd wordt, kunnen we besluiten dat er geen interactie is tussen de bestudeerde eiwitten.


3 Experiment 3: Ontwikkelingsbiologie van bloeiende planten

3.1 Doel

We trachten inzicht te verwerven in de ontwikkeling van bloemen bij Arabidopsis thalianadat gereguleerd wordt door het genetisch ABC(E)-model. Door middel van verschillendebloemmutanten te analyseren bekijken we hoe dit model tot stand is gekomen.

3.2 Methode

De bloemen van Arabidopsis thaliana worden zowel macroscopisch geanalyseerd als microscopischmet behulp van een stereomicroscoop. Ten eerste wordt het fenotype van een wild type plantbestudeerd, met name zijn algemene opbouw en bloemsamenstelling. Vervolgens wordt hetfenotype van vijf verschillende bloemmutanten geanalyseerd en vergelijken we deze met de wildtype plant om verschillen te ontdekken en te achterhalen om welke mutant het gaat.

3.3 Resultaten

Eerst werd een wild type Arabidopsisplant bestudeerd. Deze bevat zoals verwacht vier sepalenof kelkbladeren, vier petalen of kroonbladeren, zes stamen of meeldraden en twee carpellenof vruchtbladeren. Het ABC-model van een wild type plant wordt weergegeven in Figure 9-a.Vervolgens werd er naar vijf bloemmutanten gekeken. Hun bloemmodellen worden, indienrelevant, eveneens in Figure 9 weergegeven.

Op het eerste zicht lijkt er niets mis te zijn met bloemmutant 1, aangezien alle bloemorganenaanwezig zijn. Er zijn echter veel meer bloemen aanwezig bij de mutant dan bij planten vangelijkaardige leeftijd. We besluiten dat deze plant een mutatie heeft in terminal flower 1. Dit iseen bloeiwijzemeristeemidentiteitsgen dat codeert voor een kinase inhibitor en zo de overgang vaninflorescentiemeristeem naar bloemmeristeem verhindert. Een mutatie in dit gen zorgde ervoordat de overgang onmiddellijk gebeurde. Bovendien groeien bloemen in Arabidopsis thalianaenkel op de laterale posities en verhindert het tfl-1 gen de vorming van een terminale bloemknop.Een mutatie kan dit echter wel veroorzaken, waardoor het inflorescentiemeristeem niet meerbehouden wordt.

Bij bloemmutant 2 (Figure 9-b) is het duidelijk dat er geen sepalen en petalen aanwezigzijn. Deze zijn vervangen door respectievelijk carpellen en meeldraden. Aangezien sepalen enpetalen beiden gecodeerd worden door A-klasse genen, stellen we dat deze mutant behoort totde A-klasse. Mutaties die dit fenotype kunnen veroorzaken zijn onder andere mutaties in hetapetala1 gen.

Bloemmutant 3 vertoont bloemkoolvormige structuren. Dit zijn in feite inflorescentiemeriste-men die secundaire meristemen initieren in plaats van bloemen. Dit specifiek fenotype wordtveroorzaakt indien de plant dubbel mutant is voor apetala1 (ap1) en cauliflower (cal). Beidegenen zijn bloemmeristeemidentiteitsgenen en vallen dus niet onder het ABC-model.

Bij bloemmutant 4 (Figure 9-c) zijn de petalen en meeldraden verdwenen en vervangen doorrespectievelijk sepalen en carpellen. Petalen worden gevormd door de co-expressie van A-klasseen B-klasse genen, terwijl stamen gevormd worden door B-klasse en C-klasse genen. Aangeziensepalen en carpellen wel nog tot uiting gebracht worden, besluiten we dat er een mutatie heeftplaatsgevonden in een B-klasse gen, zoals pistillata.

Bij bloemmutant 5 (Figure 9-d) valt meteen op dat in het midden van een bloem eennieuw inflorescentiemeristeem groeit. Bovendien zijn enkel petalen en sepalen aanwezig; demeeldraden en carpellen zijn vervangen door respectievelijk petalen en de nieuwe bloem. Volgens


Figure 9: Bloemmodellen van Arabidopsis thaliana volgens het ABC-model. (a) De wild typevertoont een normaal patroon van vier sepalen, vier petalen, zes meeldraden en 2 carpellen. (b)Bloemmutant 2 heeft een mutatie in apetala1 waardoor de C-klasse genen de activeit overnemenvan de A-klasse. (c) Bloemmutant 4 heeft gemuteerde B-klasse genen, waardoor er geen co-expressie kan ontstaan om aanleiding te geven tot petalen en stamen. (d) In bloemmutant 5 nemende A-klasse genen de activiteit over van de C-klasse naar aanleiding van een mutatie in de C-klassegenen. Op de plaats van de wild type carpellen groeit hier een nieuw inflorescentiemeristeem.

het ABC-model wordt dit fenotype veroorzaakt door een mutatie in een C-klasse gen, zoalsagamous.

3.4 Besluit

We hebben inzicht verworven in hoe het ABC-model tot stand is gekomen. Sepalen wordendoor A-klasse genen gevormd, petalen door de co-expressie van A-klasse en B-klasse genen,meeldraden door de co-expressie van B-klasse en C-klasse genen en carpellen door C-klassegenen. Aangezien A-klasse en C-klasse genen antagonistisch werken, neemt de ene klasse deactiveit van de andere klasse genen over bij een mutatie in een A-klasse of C-klasse gen. Indieneen B-klasse gen gemuteerd is, zal het bloemorgaan verschijnen dat gecodeerd wordt door slechtseen A-klasse of C-klasse gen.

Belangrijk op te merken is dat de ectopische expressie van ABC-genen niet voldoende isom bloemorganen te ontwikkelen. Wat niet mag ontbreken is de constitutieve expressie vaneen E-klasse gen, zoals sepallata, die de omvorming van vegetatieve bladen in kroonbladerenreguleert.


Laboverslag geïntegreerd practicum

Documents

Transcript of Laboverslag geïntegreerd practicum