Jean Weissenbach

(Genoscope – Centre national de séquençage)

Saint-Pères 15 Juin 2008

La génomique nouvel observatoire du monde microbien

Université de tous les savoirs

Quelques dates de l'histoire de la microbiologie

1684 Antonie van Leeuwenhoek

Quelques dates de l'histoire de la microbiologie

1684 Antonie van Leeuwenhoek

1838 Schwann (levure ferment vivant)

1857 Pasteur (fermentation lactique)

1860 Pasteur (fermentation alcoolique)

1864 Pasteur (génération spontanée)

1881 Koch (cultures pures)

Postulats de Koch

Par l'utilisation de cultures pures on peut montrer que des

organismes distincts ont des propriétés biologiques différentes

Au cours des années 70 Carl Woese procède à

des comparaisons systématiques de séquences

d ’ARN des ribosomes de bactéries

TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG

TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCTTGAACGAGCGCAACCCCTG

TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTG

TGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG

TGTCGTGAGATGTTGGGGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA

TGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA

TGCCGTGAGGTGTACCCTTAAGTGGGGAAACGAGCGTAACCCCTA

a

b

c

d

e

f

g

f g

e

a c b

d

Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces

ADN

Ext

ract

ion

Echantillon de l'environnement

PCR

gènes d‘ARNr 16S

amplifiés

Clona

ge d

ans E

. col

i

Clones

séqu

ença

ge

sequences d‘ARNr 16S

Analyse de séquences

Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces

ADN

Ext

ract

ion

séqu

ença

ge

PCR

gènes d‘ARNr 16S

amplifiés

Clona

ge d

ans E

. col

i

Clones

sequences d‘ARNr 16S

Analyse de séquences

3 5 5 P D (2 c lo n e s )2 8 3 P D (1 )

B a ctero id e s the ta io ta o m icro n3 9 6 P D (4 )

B a ctero id e s o v a tu s2 6 0 P D (1 )

B a ctero id e s c a cca e0 5 1 J 7 (3 )

0 1 2 5 C (2 )B a ctero id e s fra g ilis

B a ctero id e s u n ifo rm is

2 3 9 P D (1 0 )1 0 2 5 C (2 )

B a ctero id e s e g g er th iiB a ctero id e s s te rc o r is

P rev o te lla h ep a rin o ly tica

0 6 1 J 7 (2 )2 6 2 5 C (2 )

4 8 2 5 C (2 )3 6 7 P D

3 4 3 P D (6 )B a ctero id e s v u lg a tu s

2 5 5 P D (1 )1 2 2 5 C (1 )

2 %

Ext

ract

ion

Echantillon de l'environnement

Par cette approche Norman Pace observe dans les

années 90 des séquences de rDNA qui ne correspondent

pas à des espèces connues cultivées.

Minimum Optimum Maximum

Température élevée thermophile Pyrolobus fumarii 90°C 106°C 113°C

basse psychrophile Polaromonas vacuolata 0°C 4°C 12°C

pH acide acidophile Picrophilus oshimae 0,06 0,7 (60°C) 4

alcalin alcalinophile Natrialba magadii 8,5 9 12

pression élevée barophileMT41 (Mariana Trench)11033 mètres de profondeur

500 atm700 atm

4°C> 1000 atm

salinité élevée halophileHalobacterium salinarum

15 % 25 %32 %

(saturation)

Les bactéries sont partout, nombreuses et vivent parfois dans des conditions particulièrement inhospitalières …

Avec l'augmentation de leur nombre, une compétition s'est instaurée pour les sources

• énergie

• matières premières (minérales ou organiques)

Pour échapper à la compétition les bactéries ont recouru à

l'innovation

1) en diversifiant leurs sources d'énergie et de matières premières

2) en s'adaptant à des environnements particuliers

• énergie• oxydoréductions chimiques

• différents oxydants, différents réducteurs• lumière

• plusieurs utilisations de la lumière• avec ou sans production d'O2

• matières premières (minérales ou organiques)• C minéral (CO2 ou organique)• N atmosphérique ou sels

• conditions du milieu• température• pH• ions

Streptococcus pneumoniae

Vibrio cholerae

Streptococcus pyogenes

Salmonella

Pseudomonas

Vue en m.e coloration négative vue en m. e à balayage

Chondromyces

Habitat Nombre de bactéries % de bactéries cultivables

Sol 1010 - 1013 / kg 0,01 - 0,1

Rivières, lacs 109 - 1010 / l 0,01 - 0,1

Océans (surface) 107 - 109 / l 0,001 - 0,1

Océans (profondeur) 107 - 108 / l indéterminé

Océans (sédiments) 109 - 1012 / l < 1 %

Plus de 99% des bactéries sont encore inconnues de nos jours

Sols   107 à 1010 bactéries / g

Eaux potable en général maximum 1000 bactéries / mL

bassin de natation 100 bactéries / mL

mer peu polluée 10.000 bactéries / mL

Aliments lait stérilisé maximum 100 bactéries / mL

viande hachée 106 bactéries / g

Corps humain sain et propre

peau du dos 100 à 1000 bactéries / cm2

peau des aisselles ou du pubis

106 bactéries / cm2

fèces 50 % de la masse soit 1011 bactéries / g

Les bactéries sont partout et nombreuses ...

La flore intestinale humaine

Cent mille milliards de bactéries !!!

Chacun de nous héberge cent mille milliards de bactéries constituant la flore digestive.

Stérile avant la naissance, notre tube digestif est rapidement colonisé par cette flore complexe et diversifiée qui se stabilise au cours des premières années de la vie.

Les interactions entre l’organisme et la flore digestive participent au maintien en bonne santé, alors que nous associons souvent "bactéries" et "maladie". Les bactéries que nous hébergeons ont un rôle bénéfique en termes de nutrition et de santé.

Au niveau de la planète

la biomasse microbienne représente

plus de la moitié de la biomasse terrestre

0,01 0,1 1 10 100

100

10

1

0,1

Si

Mg

O

Ca

Na

P

NC

S

H

Croûte terrestre

Biomasse

D'où vient le carbone ?

Carbone minéral : CO2 (bactéries autotrophes :chimiolithotrophes, phototrophes)

Carbone organique (bactéries hétérotrophes)

0,01 0,1 1 10 100

100

10

1

0,1

Si

Mg

O

Ca

Na

P

NC

S

H

Croûte terrestre

Biomasse

D'où vient l'azote ?

Azote atmosphérique N2

Composés minéraux de l'azote (NH4+, NO2

-, NO3-)

Le rôle de l'infiniment petit dans la nature

est infiniment grand

Louis Pasteur

Nos connaissances en microbiologie ont été obtenues à partir de quelques centaines d’espèces parmi les quelques 5000 espèces répertoriées

Moins de 1% des bactéries sont cultivées

Le monde microbien reste encore pratiquement inexploré

La plupart des contributions du monde microbien à la vie de la biosphère ne sont connues que superficiellement

A ce jour

De nombreuses raisons de s'intéresseraux communautés bactériennes

- impact sur les équilibres biogéochimiques- quels sont les acteurs ?- nouvelles étapes des cycles biologiques des éléments

- impact sur la santé (flores microbiennes humaines)

- modèles d'écosystèmes (structure des communautés bactériennes)

- utilisation de la biodiversité à des fins d'applications- substances thérapeutiques- substances d'intérêt industriel- enzymes utiles pour la chimie de synthèse- bioremédiation

- nouveaux éclairages sur l'évolution

Comment aborder la question de la composition des communautés bactériennes ?

- rDNA 16S

- FISH

- métagénomique

- techniques sur cellules isolées

- culture

ADN

Ext

ract

ion

séquençageClonage dans E. coli Clones sequences

d‘ADN Analyse de séquences

Ext

ract

ion

Echantillon de l'environnement

La métagénomique

Tous les génomes de bactéries possèdent au moins une copie du gène rouge

Ce gène rouge présent chez toutes les bactéries est en fait composé - de parties communes retrouvées dans ce gène dans toutes les bactéries- de parties qui sont propres à une seule espèce de bactéries

Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des

- parties communes (noir) qui sont présentes sur la séquence de ce gène dans toutes les bactéries

ceci permet de le retrouver à partir d'un mélange des ADN extraits de bactéries vivant dans un environnement particulier

Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des

- parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries

ceci permet de distinguer ce gène chez une espèce du même gène chez les autres espèces du mélange

Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des

- parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries

ceci permet aussi savoir quelles espèces connues et inconnues sont dans le mélange et d'avoir une idée du nombre d’espèces de bactéries qui sont dans le mélange et de leur abondance

Résultats : Hybridation in situ sur les boues

10 µm

10 µm

Floc du bassin aérobie (BA)photo CLSM (gross. 630)

hybridation avec sonde :

- groupe Planctomycetales Pla46F marqué au CY5

- sonde spécifique « nouveau genre » 322R marqué au CY3

- superposition Pla46F et 322R

- autofluorescence

Problèmes d'analyses des données d'un métagenome

• Données très fragmentaires

• Liens perdus avec les cellules d'origine

• La grande majorité de ces cellules sont inconnues

Quelques résultats de la métagénomique

- reconstitution de la séquence génomique complète de plusieurs

bactéries non cultivables

- présence d'un grand nombre de gènes de proteorhodopsine

dans les bactéries

- découverte de dizaines de milliers de gènes de fonction

inconnue

- association entre type de flore bactérienne intestinale et obésité