INSTRUKSI KERJA VALIDASI METODE UJI

1. Acuan

1.1. Eurachem (The Fitness for Purpose of Analytical Methods)

1.2. Pedoman mutu 5.9.1

2. Tujuan

Validasi metode bertujuan untuk membuktikan melalui studi Laboratorium, bahwa unjuk

kerja karakteristik metode tersebut sesuai dengan tujuan penerapan analisisnya.

3. Ruang Lingkup

Instruksi kerja ini digunakan sebagai petunjuk teknis validasi terhadap metode tidak

baku, metode yang didesain/dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan

di luar lingkup yang dimaksud, penguatan (amplification) serta metode baku yang

dimodifikasi untuk mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang

dimaksud Laboratorium. Tahapan dalam instruksi ini hanya sebagai petunjuk, tidak

ditekankan bahwa semua metode yang digunakan Laboratorium harus divalidasi sesuai

dengan semua tahapan dalam instruksi ini. Pemakaiannya disesuaikan dengan jenis uji

yang diaplikasikan.

4. Definisi

4.1. Akurasi

Kedekatan antara nilai nyata, yang diterima sebagai nilai benar yang konvensional

atau nilai standar yang dapat diterima, dengan nilai hasil pengukuran dari komponen

yang sama.

4.2. Presisi

Kedekatan antara hasil pengujian individu dalam serangkaian pengukuran

terhadap suatu contoh homogen yang dilakukan pengambilan contoh secara

berganda menurut prosedur yang telah ditetapkan.

4.2.1. Repitabilitas

Menyatakan presisi yang dilakukan pada kondisi yang telah ditentukan di

Laboratorium yang sama dalam interval waktu yang pendek oleh analis yang

sama dengan menggunakan peralatan dan pereaksi yang sama.

4.2.2. Presisi Intermediet

Menyatakan presisi yang dilakukan pada kondisi yang telah ditentukan di

Laboratorium yang sama pada hari yang berbeda oleh analis yang berbeda dengan

menggunakan peralatan dan pereaksi yang berbeda.

4.2.3. Reproduksibilitas

Menyatakan presisi yang dilakukan pada kondisi yang dilakukan di laboratorioum

yang berbeda pada hari yang berbeda, oleh analis yang berbeda, dengan

menggunakan peralatan dan pereaksi yang berbeda.

4.3. Limit Deteksi

Konsentrasi analit terendah dalam contoh yang dapat dideteksi, akan tetapi tidak

perlu ditentukan secara kuantitatif hingga didapatkan nilai yang persis.

4.3.1. Limit Deteksi Terendah

Adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi oleh metode dan secara

statistik berbeda dari sinyal latar belakang (noise) blangko pelarut sebesar 2 x

1,645 x Sdblangko.

4.3.2. Limit Deteksi Instrumen

Adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi oleh instrumen (alat ukur)

dan secara statistik berbeda dari sinyal latar belakang (noise) instrumen.

4.3.3. Limit Deteksi Metode

Merupakan konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi oleh metode dan

secara statistik berbeda terhadap sinyal dari blangko pelarut yang diperlakukan

melalui keseluruhan metode, termasuk ekstraksi kimia, dan atau persiapan contoh.

4.4. Linieritas

Adalah kemampuan (dalam rentang tertentu) suatu penetapan kadar untuk

memperoleh hasil uji (respon analitik) yang sebanding dengan konsentrasi analit

dalam contoh.

4.5. Limit Linieritas

Yaitu nilai ukur tertinggi yang masih memiliki hubungan linier antara skala ukur

dengan satuan yang diukur.

4.6. Rentang

Merupakan interval di antara konsentrasi analit tertinggi (limit linieritas) dan

terendah (limit kuantitasi) dalam contoh yang dapat ditetapkan dengan akurasi,

presisi dan linieritas yang dapat diterima menggunakan metode pengujian

tersebut.

4.7. Selektifitas

Merupakan kemampuan metode untuk dapat mendiferensiasi analit dari

konkomitan lain dalam matrik contoh.

4.8. Limit Kuantitasi

Konsentrasi analit terendah dalam contoh yang dapat diukur secara kuantitatif

dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima.

4.9. Robustness (Ketegaran)

Merupakan kapasitas suatu prosedur analitik untuk tidak terpengaruh oleh variasi

kecil dalam parameter metode

4.10. Matriks

Merupakan suatu kesatuan system dalam contoh.

4.11. Konkomitan

Adalah zat ikutan / zat selain analit dalam contoh.

4.12. Blangko Matriks

Suatu preparat koreksi latar belakang yang terdiri dari semua zat dalam contoh,

atau setidaknya mendekati contoh, tanpa analit.

4.13. Blangko Pereaksi

Suatu preparat koreksi latar belakang yang terdiri dari pelarut analit dan semua

pereaksi yang digunakan dalam metode pengujian.

4.14. Blangko Pelarut

Suatu preparat koreksi latar belakang yang terdiri dari hanya pelarut yang

digunakan dalam preparat uji akhir.

4.15. Konsentrasi Uji

Merupakan konsentrasi analit yang dijadikan patokan dalam pengujian. Pada

produk-produk hasil buatan, konsentrasi uji sama dengan konsentrasi analit yuang

tertera pada etiket/label produk. Pada kasus tidak ditemui label Nilai kandungan

analit yang yang menjadi syarat keberterimaan objek uji berdasar standar yang

berlaku (misal : SNI)

5. Cara Kerja

5.1. Akurasi

Terdapat sedikitnya empat macam metode untuk mengevaluasi akurasi suatu metode

uji, harus dipilih salah satunya sesuai dengan ketersediaan prasyarat dan metode uji.

5.1.1. Analisis Reference Material (RM)

Metode ini hanya dilakukan jika tersedia RM yang sesuai.

5.1.1.1 Lakukan analisis berulang sebanyak minimal dua kali ulangan terhadap RM.

5.1.1.2 Reratakan kadar hasil uji, lalu bandingkan terhadap rentang keberterimaan nilai

acuan RM.

5.1.1.3 Metode uji terbukti akurat jika rerata hasil uji masuk ke dalam rentang

keberterimaan nilai acuan RM

5.1.2. Spike Recovery

5.1.2.1. Buat preparat contoh uji dengan konsentrasi 50, 100, dan 150% dari konsentrasi

uji melalui penambahan analit standar terhadap blangko matriks dengan

konsentrasi yang terukur secara pasti.

5.1.2.2. Lakukan analisis berulang dengan jumlah pengulangan tiga kali untuk tiap-tiap

preparat menggunakan metode yang akan divalidasi bersamaan dengan

pengukuran standar.

5.1.2.3. Hitung kadar analit dalam contoh yang kemudian dibandingkan terhadap kadar yang

didapat dari perhitungan teoretis, nyatakan sebagai % recovery untuk akurasi.

5.1.2.4. Metode terbukti akurat jika kisaran % recovery sesuai syarat keberterimaan yang

bergantung pada jenis dan konsentrasi analit.

5.1.2.5. Perhitungan:

Level Konsentrasi Replikat

Konsentrasi Teoretis Analit dalam Contoh (μ )

Konsentrasi Praktis Analit dalam Contoh (x )

% Recovery (%R )

50% 1 μ 1x 1 %1

2 μ 2x 2 %2

3 μ 3x 3 %3

100% 1 μ 4x 4 %4

2 μ 5x 5 %5

3 μ 6x 6 %6

150% 1 μ 7x 7 %7

2 μ 8x 8 %8

3 μ 9x 9 %9

Akurasi dinyatakan sebagai rentang % recovery %terkecil s.d. %terbesar

Rumus perhitungan % recovery

%Recov ery= xμ

x 100 %

Keterangan :

(μ ) = Konsentrasi Teoretis Analit dalam Contoh

(x ) = Konsentrasi Praktis Analit dalam Contoh

5.1.3. Uji Komparatif

Metode ini dilakukan jika tersedia data akurat dan lengkap tentang data validasi

metode yang akan dijadikan pembanding.

5.1.3.1. Lakukan analisis berulang dengan sedikitnya tiga kali ulangan terhadap satu

contoh QC dengan konsentrasi uji 100% menggunakan metode yang telah

diketahui pasti validitasnya.

5.1.3.2. Lakukan pula minimal tiga kali ulangan analisis terthadap contoh QC yang sama

menggunakan metode uji yang akan divalidasi.

5.1.3.3. Lakukan perhitungan uji F yang dilanjutkan dengan uji t student terhadap rerata

masing-masing hasil uji metode dengan tingkat keyakinan 95%.

5.1.3.4. Metode uji valid jika memberikan hasil uji yang tidak berbeda nyata dengan

hasil uji metode yang telah diketahui validitasnya.

5.2. Presisi

5.2.1. Repitabilitas

Evaluasi repitabilitas dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu pengukuran

berulang pada 100% konsentrasi uji produk/objek uji, dan pengukuran berulang

pada tiga level konsentrasi uji produk/objek uji (20, 50, dan 100%). Metode

evaluasi yang digunakan dipilih berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.2.1.1. Pengukuran berulang pada 100% konsentrasi uji

5.2.1.1.1. Lakukan analisis berulang terhadap produk atau contoh QC dengan

konsentrasi analit 100% konsentrasi yang tertera pada etiket produk yang

sama dengan jumlah ulangan minimal sebanyak enam kali.

5.2.1.1.2. Lakukan pula pengukuran standar.

5.2.1.1.3. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang tidak berjauhan (hari

yang sama) dan oleh analis yang sama.

5.2.1.1.4. Hitung nilai repitabilitas sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasil-

hasil kadar yang didapat.

5.2.1.1.5. Repitabilitas metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai % SBR

batas keberterimaan pada konsentrasi uji.

5.2.1.1.6. Perhitungan:

Replikat(n )

Respon Analitik

Contoh ( y )

Faktor Konsentrasi

Analit( f )

Respon Analitik

Standar ( ys)

Faktor Konsentrasi

Standar(fs )

Kadar Analit dalam

Contoh (x )1 y 1 f 1

ys 1 fs 1x 1

2 y 2 f 2ys 2 fs 2

x 2

3 y 3 f 3ys 3 fs 3

x 3

4 y 4 f 4ys 4 fs 4

x 4

5 y 5 f 5ys 5 fs 5

x 5

6 y 6 f 6ys 6 fs 6

x 6

Jumlah ∑ xRerata xSimpangan Baku ∂

Rumus perhitungan rerata

x=∑ xn

Rumus perhitungan simpangan baku

∂=√∑ (x i−x )2

n−1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR=∂x×100 %

Keterangan :x = Rerata∑ x = Jumlah kadar analit dalam contoh(n ) = Jumlah replikat∂ = Simpangan baku

5.2.1.2. Pengukuran berulang pada tiga level konsentrasi uji

5.2.1.2.1. Lakukan analisis berulang terhadap produk atau contoh QC dengan

konsentrasi analit 80, 100, dan 120% konsentrasi yang tertera pada etiket

produk yang sama dengan jumlah ulangan minimal sebanyak tiga kali untuk

masing-masing level konsentrasi.

5.2.1.2.2. Lakukan pula pengukuran standar.

5.2.1.2.3. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang tidak berjauhan (hari

yang sama) dan oleh analis yang sama.

5.2.1.2.4. Hitung nilai repitabilitas sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasil-

hasil % recovery yang didapat.

5.2.1.2.5. Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas

keberterimaan.

5.2.1.2.6. Perhitungan ;

Level Konsentrasi

Replikat(n )

Respon Analitik Contoh ( y )

Faktor Konsentrasi

Analit( f )

Respon Analitik Standar (

ys )

Faktor Konsentrasi

Standar(fs )

Kadar Analit dalam

Contoh (x )

80% 1 y 1 f 1ys 1 fs 1

x 1

2 y 2 f 2ys 2 fs 2

x 2

3 y 3 f 3ys 3 fs 3

x 3

Jumlah ∑ xRerata xSimpangan baku ∂%SBR %

100% 1 y 1 f 1ys 1 fs 1

x 1

2 y 2 f 2ys 2 fs 2

x 2

3 y 3 f 3ys 3 fs 3

x 3

Jumlah ∑ xRerata xSimpangan baku ∂%SBR %

120% 1 y 1 f 1ys 1 fs 1

x 1

2 y 2 f 2ys 2 fs 2

x 2

3 y 3 f 3ys 3 fs 3

x 3

Jumlah ∑ xRerata xSimpangan baku ∂%SBR %

Presisi dinyatakan sebagai rentang %SBR %terkecil s.d. %terbesar

Rumus perhitungan rerata

x=∑ xn

Rumus perhitungan simpangan baku

∂=√∑ (x i−x )2

n−1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR=∂x×100 %

Keterangan :x = Rerata∑ x = Jumlah kadar analit dalam contohn = Jumlah replikat

∂ = Simpangan baku

5.2.2. Presisi intermediet

Evaluasi presisi intermediet dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu pengukuran

berulang pada 100% konsentrasi uji produk/objek uji, dan pengukuran berulang

pada tiga level konsentrasi uji produk/objek uji (80, 100, dan 120%). Metode

evaluasi yang digunakan dipilih berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.2.2.1. Pengukuran berulang pada 100% konsentrasi uji

5.2.2.2.1. Buat objek uji atau contoh QC dengan konsentrasi analit 100% konsentrasi

yang tertera pada etiket produk.

5.2.2.2.2. Objek uji atau contoh QC tersebut didistribusikan minimal kepada dua

orang analis.

5.2.2.2.3. Lakukan analisis berulang menggunakan metode yang akan divalidasi

terhadap produk atau contoh QC tersebut dengan jumlah ulangan masing-

masing analis minimal sebanyak enam kali.

5.2.2.2.4. Lakukan pula pengukuran standar.

5.2.2.2.5. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang berjauhan (hari yang

berbeda) dan lebih baik menggunakan peralatan berbeda.

5.2.2.2.6. Hitung nilai presisi intermediet sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari

hasil-hasil kadar yang didapat dari pengulangan analisis yang dilakukan

oleh para analis tersebut.

5.2.2.2.7. Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas

keberterimaan.

5.2.2.2.8. Perhitungan:

Replikat(n )

Respon Analitik

Contoh ( y )

Faktor Konsentrasi

Analit( f )

Respon Analitik

Standar ( ys )

Faktor Konsentrasi

Standar(fs )

Kadar Analit dalam Contoh (x

)

Analis 11 y 1 f 1

ys 1 fs 1x 1

2 y 2 f 2ys 2 fs 2

x 2

3 y 3 f 3ys 3 fs 3

x 3

4 y 4 f 4ys 4 fs 4

x 4

5 y 5 f 5ys 5 fs 5

x 5

6 y 6 f 6ys 6 fs 6

x 6

Analis 21 y 1 f 1

ys 1 fs 1x 1

2 y 2 f 2ys 2 fs 2

x 2

3 y 3 f 3ys 3 fs 3

x 3

4 y 4 f 4ys 4 fs 4

x 4

5 y 5 f 5ys 5 fs 5

x 5

6 y 6 f 6ys 6 fs 6

x 6

Jumlah ∑ xRerata xSimpangan Baku ∂

Rumus perhitungan rerata

x=∑ xn

Rumus perhitungan simpangan baku

∂=√∑ (x i−x )2

n−1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR=∂x×100 %

Keterangan :x = Rerata∑ x = Jumlah kadar analit dalam contoh(n ) = Jumlah replikat∂ = Simpangan baku

5.2.2.2. Pengukuran berulang pada tiga level konsentrasi uji

5.2.2.2.1. Buat objek uji atau contoh QC dengan konsentrasi analit 80, 100, dan 120%

konsentrasi yang tertera pada etiket produk.

5.2.2.2.2. Objek uji atau contoh QC tersebut didistribusikan minimal kepada dua orang

analis.

5.2.2.2.3. Lakukan analisis berulang menggunakan metode yang akan divalidasi

terhadap produk atau contoh QC tersebut dengan jumlah ulangan masing-

masing analis minimal sebanyak tiga kali.

5.2.2.2.4. Lakukan pula pengukuran standar.

5.2.2.2.5. Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang berjauhan (hari yang

berbeda) dan lebih baik menggunakan peralatan berbeda.

5.2.2.2.6. Hitung % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasil-hasil kadar yang didapat

dari pengulangan analisis yang dilakukan oleh para analis tersebut.

5.2.2.2.7. Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas

keberterimaan.

5.2.2.2.8. Perhitungan:

Rumus perhitungan rerata

x=∑ xn

Rumus perhitungan simpangan baku

∂=√∑ (x i−x )2

n−1

Rumus perhitungan simpangan baku relatif

% SBR=∂x×100 %

Keterangan :x = Rerata

∑ x = Jumlah kadar analit dalam contoh(n ) = Jumlah replikat∂ = Simpangan baku

5.2.3. Reproduksibilitas

5.2.3.1 Buat objek uji atau contoh QC dengan konsentrasi analit 100% konsentrasi yang

tertera pada etiket produk.

5.2.3.2 Objek uji atau contoh QC tersebut didistribusikan minimal kepada dua

laboratorium berbeda.

5.2.3.3 Lakukan analisis berulang menggunakan metode yang akan divalidasi terhadap

produk atau contoh QC tersebut dengan jumlah ulangan masing-masing

laboratorium minimal sebanyak enam kali.

5.2.3.4 Lakukan pula pengukuran standar.

5.2.3.5 Ulangan analisis dilakukan pada interval waktu yang berjauhan (hari yang

berbeda).

5.2.3.6 Hitung nilai reproduksibilitas sebagai % SBR (Standar Baku Relatif) dari hasil-

hasil kadar yang didapat dari pengulangan analisis yang dilakukan di dua

laboratorium berbeda tersebut.

5.2.3.7 Metode uji memenuhi syarat jika memiliki nilai presisi (% SBR) batas

keberterimaan.

5.2.4. Linieritas

5.2.4.1 Buat preparat deret standar menggunakan plasebo yang ke dalamnya ditambahkan

secara kuantitatif analit standar yang diketahui konsentrasinya secara pasti.

5.2.4.2 Konsentrasi preparat yang dibuat minimal enam level konsentrasi yang

melingkupi konsentrasi uji contoh seperti yang tertera pada etiket (0, 60, 80, 100,

120, dan 150%).

5.2.4.3 Lakukan analisis pada masing-masing preparat menggunakan metode yang akan

divalidasi dengan jumlah pengulangan sebanyak dua kali.

5.2.4.4 Hitung korelasi antara respon analitik yang didapat dengan konsentrasi teoretis

analit dalam preparat.

5.2.4.5 Linieritas metode memenuhi syarat jika nilai koefisien korelasi (r) 0,99.

5.2.5. Limit Deteksi

Limit deteksi dapat ditentukan dengan setidaknya tiga cara, yang harus dipilih

salah satu berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.2.5.2. Berdasar Simpangan Baku Blangko

5.2.5.2.1. Lakukan analisis berulang terhadap plasebo sebanyak minimal lima kali

ulangan.

5.2.5.2.2. Lakukan pula pengukuran deret standar.

5.2.5.2.3. Hitung standar deviasi dari data analisis plasebo (blangko matriks) dan slope

dari data deret standar yang didapat.

5.2.5.2.4. Hitung nilai limit deteksi sebagai sinyal analitik rerata blangko ditambah tiga

kali standar deviasinya.

5.2.6. Limit Kuantitasi

Limit kuantisasi dapat ditentukan dengan setidaknya tiga cara, yang harus dipilih

salah satu berdasar kesesuaian dengan sistem.

5.2.6.1. Berdasar Simpangan Baku Blangko

5.2.6.1.1. Lakukan analisis berulang terhadap plasebo sebanyak minimal lima kali

ulangan.

5.2.6.1.2. Lakukan pula pengukuran deret standar.

5.2.6.1.3. Hitung standar deviasi dari data analisis plasebo (blangko matriks) dan slope

dari data deret standar yang didapat.

5.2.6.1.4. Hitung nilai limit kuantitasi sebagai respon analitik blangko matriks ditambah

sepuluh kali standar deviasi.

5.2.7. Spesifitas

5.2.8.1. Lakukan minimum tiga kali analisis terhadap contoh QC dengan konsentrasi 100

% konsentrasi uji.

5.2.8.2. Buat preparat spesifitas dengan menambahkan senyawa pengotor yang memiliki

kemiripan rumus molekul dan atau sifat-sifat fisika-kimia yang diduga kuat dapat

terkandung dalam produk dan atau dapat mengganggu analisis.

5.2.8.3. Lakukan minimum tiga kali analisis terhadap preparat spesifitas tersebut di atas.

5.2.8.4. Lakukan uji beda nyata terhadap rerata hasil uji kedua objek uji tersebut.

5.2.8.5. Metode dapat dikatakan spesifik bila tidak memberikan hasil uji yang berbeda

nyata.

5.2.8. Robustness

5.2.9.1. Tentukan satu atau lebih faktor yang akan diteliti efeknya terhadap hasil analisis

(suhu, waktu, dan atau salah satu kemungkinan variasi kecil yang dapat terjadi

dalam analisis rutin).

5.2.9.2. Buat preparat yang memadai untuk tiap percobaan.

5.2.9.3. Lakukan sedikitnya dua kali pengukuran untuk tiap preparat sesuai dengan

kondisi yang dipersyaratkan dalam percobaan.

5.2.9.4. Lakukan pula pengukuran standar fresh untuk tiap-tiap pengukuran preparat.

5.2.9.5. Bandingkan hasil yang didapat pada tiap eskalasi percobaan dengan kontrol.

5.2.9.6. Metode dapat dikatakan Robust jika tidak terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan tervariasi dengan perlakuan kontrol pada taraf kepercayaan 95%.

5.3. Evaluasi

5.3.1. Lampirkan semua catatan data dan grafik, kromatogram, dan atau spektrogram bila ada.

5.3.2. Lakukan semua perhitungan sebelum, selama, dan setelah pelaksanaan evaluasi serta

analisis statistik.

5.3.3. Bandingkan hasil yang diperoleh terhadap kriteria penerimaan tiap parameter validasi.

5.3.4. Bila terdapat penyimpangan siapkan laporan termasuk justifikasi dan dampaknya

terhadap validitas metode uji.

5.4. Dokumentasi dan Laporan Validasi

Buat laporan atas validasi yang telah dilaksanakan, mencakup :

- Tanggal mulai dan selesainya validasi

- Identitas metode dan objek uji

- Hasil pengamatan

- Hasil perhitungan dan analisis statistik

- Simpulan atas validitas metode uji

- Informasi lainnya yang relevan dengan pelaksanaan validasi.

5.5. Serahkan laporan validasi pada yang berwenang untuk memperoleh persetujuan

akhir dan pengesahan.

Dokumen Terkait

PR-5.4. Prosedur Pengujian dan Validasi Metode

-F- Formulir Rencana Kerja Validasi Metode

F- Formulir Akuisisi Data Validasi Metode

F- Formulir Laporan Validasi Metode