1

FACULTEIT GENEESKUNDE EN

GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2013 - 2014

Het therapeutisch effect van nitriet bij ischemie-reperfusie

letsels

Stijn Vanneste

Promotor: Prof. Dr. Romain Lefebvre

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3

INHOUDSOPGAVE

INLEIDING ............................................................................................................................................... 7

MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................................................. 12

RESULTATEN ......................................................................................................................................... 13

Hoofdstuk 1. De bronnen van nitriet .................................................................................................... 13

1.1 De endogene bron van nitriet: oxidatie van NO ......................................................................... 13

1.2 De exogene bronnen van nitriet.................................................................................................. 15

1.3 Nitrietconcentraties in het lichaam ............................................................................................. 17

Hoofdstuk 2. De bioactivatie van nitriet naar NO ................................................................................. 18

2.1 De non-enzymatische reductie van nitriet .................................................................................. 19

2.2 Reductie van nitriet door heem-bevattende globinen ................................................................ 20

2.2.1 Reductie door hemoglobine ................................................................................................. 21

2.2.2 Reductie door myoglobine ................................................................................................... 23

2.2.3 Reductie door neuroglobine ................................................................................................. 23

2.3 Reductie van nitriet door molybdeen-bevattende enzymes ...................................................... 24

2.4 Reductie van nitriet door eiwitten uit de mitochondriale transportketen ................................. 25

2.5 Andere nitrietreductasen ............................................................................................................ 25

Hoofdstuk 3. Mechanismen van de cytoprotectieve effecten van nitriet tijdens I/R ........................... 26

3.1 Nitriet-gemedieerde cytoprotectie is NO-afhankelijk en NOS-onafhankelijk ............................. 26

3.2 Enkele pathofysiologische kenmerken van I/R letsels ................................................................ 27

3.2.1 Generatie van ROS ................................................................................................................ 28

3.2.2 Opening van de mitochondrial permeability transition pore (mPTP) .................................. 30

3.3 Mechanismen van nitriet-gebaseerde cytoprotectie .................................................................. 31

3.3.1 Reversibele S-nitrosilatie van complex I ............................................................................... 32

3.3.2 Reversibele nitrosilatie van complex IV ............................................................................... 33

3.3.3 De mechanismen van nitriet bootsen ischemische preconditionering (IPC) na .................. 34

3.3.4 De opening van ATP-dependente kaliumkanalen door nitriet ............................................. 36

3.3.5 Inhibitie van mitochondriale fissie door fosforylatie van Drp1 ............................................ 37

Hoofdstuk 4: Nitriet als potentieel therapeuticum bij I/R letsels ......................................................... 39

4.1 Dierstudies betreffende nitriettoediening bij I/R ........................................................................ 39

4.2 Veiligheid van nitriettherapie bij I/R ........................................................................................... 43

4.3 Nitriettherapie bij acuut myocardinfarct (AMI) .......................................................................... 44

4.4 Nitriettherapie bij beroerte ......................................................................................................... 45

4

DISCUSSIE ............................................................................................................................................. 47

REFERENTIELIJST .................................................................................................................................. 49

Afkortingen:

5-HD 5-hydroxydecanoaat

AMI Acuut myocard-infarct

AMPK AMP-kinase

ATP Adenosinetrifosfaat

cGMP Cyclisch guanosinemonofosfaat

CVA Cerebrovasculair accident

CVA Cardiovasculair accident

DLT Dose limiting toxicity

Drp1 Dynamin-related protein-1

eNOS Endotheliaal NOS

GC Guanylaatcyclase

H202 Waterstofperoxide

Hb Hemoglobine

HNO3 Salpeterzuur

HO-°

Hydroxyl radicaal

I/R Ischemie-reperfusie

iNOS Induceerbaar NOS

IPC Ischemische preconditionering

K+

ATP kanalen ATP-gevoelig kaliumkanaal

Mb Myoglobine

metHB Methemoglobine

Mo-co Molybdeen-cofactor

MnSOD Mangaan superoxide dismutase

mPTP Mitochondrial permeability transition pore

MTD Maximal tolerated dose

Ngb Neuroglobine

nNOS Neuronaal NOS

NO Stikstofmonoxide

NO2- Nitriet

NO3- Nitraat

NOS NO synthase

5

O2-°

Superoxide anion

ONOO-

Peroxynitriet

PCI Percutane coronaire interventie

PKA Proteïne kinase A

PKG Proteïne kinase G

R-ONO2 Organische nitraten

ROS Reactive oxygen species

SAH Subarachnoïdale hemorragie

STEMI ST-elevated acute myocard infarct

XDH Xanthine-dehydrogenase

XO Xanthine-oxidase

XOR Xanthine oxireductase

6

SAMENVATTING

Achtergrond: Nitriet werd jarenlang beschouwd als een inert eindproduct van het metabolisme

van stikstofmonoxide (NO). Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat nitriet in weefsels

een belangrijk reservoir is van NO. Tijdens ischemie of hypoxie kan nitriet terug worden

omgezet tot NO. Omstandigheden van slechte weefselperfusie worden gekenmerkt door een

verlaagde beschikbaarheid aan NO. De ontdekking van de nitraat-nitriet-NO pathway

verklaart de cytoprotectieve effecten van nitriet in hypoxische omstandigheden. Dit heeft

geleid tot een herevaluatie van de rol die nitriet speelt in verschillende ziektetoestanden. De

mogelijkheid om nitriet aan te wenden in de therapie van ischemie/reperfusie (I/R) letsels is

hier één van.

Doelstelling: In deze literatuurstudie geven we een overzicht van de bronnen van nitriet. De

mechanismen van de omzetting van nitriet naar NO en de mechanismen van nitriet-

gemedieerde cytoprotectie worden eveneens besproken. Daarnaast gaan we na hoe ver men

staat in het onderzoek naar nitriet als mogelijk therapeuticum bij I/R letsels. Hierbij bespreken

we de reeds uitgevoerde dierstudies, de veiligheid van nitriettoediening en de vertaling naar

de kliniek voor acuut myocardinfarct (AMI) en cerebrovasculair accident.

Resultaten: Toediening van nitriet werd bestudeerd in talrijke diermodellen en heeft zich

bewezen als een effectief middel om I/R schade te verminderen in het hart, de hersenen, de

lever en de longen. Het cytoprotectief effect van nitriet tijdens I/R gebeurt via NO als

intermediair. Er zijn reeds verschillende eiwitten geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn

voor de reductie van nitriet naar NO in het bloed en in de weefsels, de belangrijkste zijn

deoxyhemoglobine, deoxymyoglobine en xanthine-oxidase. De mitochondriën zijn de centrale

plaats waar de mechanismen van cytoprotectie zich afspelen.

Klinische studies hebben aangetoond dat nitriettoediening in therapeutische dosissen veilig is

bij gezonde mensen. De resultaten van een eerste klinische studie konden, in vergelijking met

de controlegroep, geen reductie van de infarctzone aantonen bij AMI. In de hersenen werd het

eerste klinisch onderzoek naar nitriettoediening uitgevoerd bij patiënten met subarachnoïdale

hemorragie (SAH). Er werd aangetoond dat potentieel therapeutische dosissen nitriet veilig

zijn bij patiënten met SAH, dit zet de deur open voor het ontwikkelen van andere klinische

studies die de neuroprotectieve effecten van nitriet evalueren.

7

INLEIDING

In deze masterscriptie bespreken we het gebruik van nitriet bij ischemie-reperfusie letsels.

Deze materie is complex en dient in de juiste context geplaatst te worden. Omdat nitriet een

eindproduct is van stikstofmonoxide (NO) maar via NO zijn werkingsmechanisme uitoefent,

vertrekken we vanaf deze molecule om uiteindelijk tot nitriet en de aanwending ervan bij

ischemie-reperfusie letsels te komen.

NO is een intra- en intercellulaire signaalmolecule die een belangrijke rol speelt in vele

fysiologische en pathofysiologische processen zoals vasodilatatie, neurotransmissie,

immunomodulatie, cardiale contractie, inhibitie van plaatjesaggregatie, inhibitie van de

mitochondriale respiratie (cytoprotectie), stamceldifferentiatie en proliferatie.(1)

NO wordt in het lichaam geproduceerd door de inbouw van zuurstof (oxidatie) in het

aminozuur L-arginine, een reactie die wordt gekatalyseerd door NO synthasen (NOS); zie

figuur 1.(2)

Deze familie van enzymen bestaat uit 3 isovormen genoemd naar de plaats waar ze initieel

werden ontdekt: endotheliaal NOS (eNOS), induceerbaar NOS (iNOS) en neuronaal NOS

(nNOS).

Het best gekend is NO gevormd door endotheelcellen (eNOS) dat een belangrijke rol speelt

als vaatdilatator. In 1980 ontdekten Robert F.Furchgott, Louis J.Ignarro en Ferrid Murad het

belang van NO als endotheel-afhankelijke relaxatiefactor (endothelial derived

relaxationfactor, EDRF).(3) In 1998 kregen ze hiervoor de Nobelprijs voor fysiologie en

geneeskunde.

In het cardiovasculaire systeem wordt NO afgegeven door gezond vaatendotheel, o.a. als

reactie op weefselhypoxie. NO diffundeert naar de vasculaire gladde spiercellen waar het

zorgt voor de activatie van guanylaatcyclase (GC), waardoor de concentratie cGMP stijgt en

vaatverwijding optreedt. (1)

Deze inzichten in het NO-systeem hebben geleid tot farmacologische strategieën die direct

gebruik maken van de vaatverwijdende capaciteit van NO. Bij pulmonale hypertensie

bijvoorbeeld wordt beademing met NO toegepast bij pasgeborenen met persisterende

pulmonaire hypertensie om vaatverwijding in het longvaatbed te verkrijgen.(4) Welbekend

zijn de organische nitraten (R-ONO2, vaak aangeduid als ‘nitraten’), zoals nitroglycerine, die

sinds de vroege jaren 1800 gebruikt worden in de behandeling van angina pectoris.(5) Sinds

de ontdekking van NO als vasodilatator heeft men gevonden dat de werking van dergelijke

8

medicijnen in feite steunt op de vrijzetting van NO uit deze nitraten binnen de gladde

spiercellen van de vaatwand.

Figuur 1: Vereenvoudigde biochemie van stikstofmonoxide in het cardiovasculaire systeem. Behalve een

vaatverwijdend effect heeft NO ook een remmende werking op plaatjesadhesie en –aggregatie en speelt

het een rol in de endotheelfunctie en contractiliteit van het myocard. (bron:

http://www.nhlbi.nih.gov/funding/training/redbook/K23Blood.htm)

NO kent een korte werkingsduur, wordt snel geoxideerd tot nitriet (NO2-) en vervolgens tot

nitraat (NO3-). Figuur 1 illustreert nitraat en nitriet nog als stabiele eindproducten van het

katabolisme van NO. Recent is in dit concept echter verandering gekomen.

Onderzoek dat gedurende de laatste twintig jaar werd uitgevoerd, heeft aangetoond dat nitraat

en nitriet in bloed en weefsels terug kunnen worden gerecycleerd tot NO en dit vooral tijdens

hypoxie.(6)(7)(8)(9) In omstandigheden van lage zuurstofspanning en pH kan nitriet worden

gereduceerd tot biologisch beschikbare NO. Op die manier worden verschillende antwoorden

op zuurstoftekort geboden, zoals hypoxische vasodilatatie. Nitriet zou dus dienst doen als een

NO ‘pro-drug’ die selectief kan worden gereduceerd. De ontdekking van deze wederkerige

relatie tussen nitriet en NO heeft bij wetenschappers gezorgd voor een vernieuwde interesse in

de biologische rol van nitriet.

Een verlaagde beschikbaarheid van NO draagt namelijk bij tot talrijke ziektes en dit zou het

therapeutisch aanwenden van nitriet als een endogeen reservoir voor NO bijzonder interessant

maken. De waarschijnlijk meest gedocumenteerde relatie tussen NO en ziekte is deze in het

9

cardiovasculaire systeem. Verlaagde concentraties van NO worden geassocieerd met

dysfunctie van het endotheel, vorming van atherosclerotische plaques, arteriële restenose,

perifeer vaatlijden, en ischemie-reperfusie letsels.(1) Vele andere pathologische condities

zoals chronische inflamatie, neurologische dysfunctie en kanker worden ook gekenmerkt door

verstoorde beschikbaarheid van NO. Figuur 2 geeft een overzicht van dergelijke ziektes en

illustreert de verscheidenheid aan therapeutische mogelijkheden voor nitriet.

Figuur 2: Effecten van op nitriet gebaseerde therapie. Overzicht van de belangrijkste mogelijke effecten

van nitriet als potentieel therapeuticum bij verschillende pathologische condities.(10)

In deze scriptie zal de nadruk worden gelegd op ischemie-reperfusie (I/R) letsels.

I/R is een complex pathofysiologisch proces verantwoordelijk voor orgaanschade in

omstandigheden waarbij de bloedtoevoer gecompromitteerd wordt (vb. acuut myocardinfarct

(AMI), cardiovasculair accident (CVA) en orgaantransplantaties). I/R letsels dragen in grote

mate bij tot de morbiditeit en mortaliteit van vele ziektes in de westerse wereld. Ondanks

jaren onderzoek bestaan slechts weinig specifieke farmacologische behandelingen om I/R

letsels te bestrijden. Zoals vermeld neemt men in de pathogenese van I/R letsels een gedaalde

beschikbaarheid van NO waar. De gedaalde concentratie van NO wordt onder andere

10

verklaard doordat tijdens ischemie minder NO kan worden gevormd door NOS, daar deze

enzymen zuurstof nodig hebben om L-arginine te oxideren. Tevens werd aangetoond dat

toevoeging van een NOS-inhibitor gedurende I/R letsels de schade aan weefsels nog

vergroot.(11) De reductie van nitriet wordt in deze situaties als een belangrijke bron van NO

gezien.(3)

De laatste jaren werd aangetoond dat NO, naast een vaatverwijderend effect, ook een

cytoprotectief effect heeft bij I/R letsels. Bij proefdieren behandeld met NO werd, na inductie

van een I/R letsel, een verkleining van de infarctzone gezien in het hart, de lever, de longen en

de nieren.(1) Verschillende therapeutische strategieën worden nu onderzocht om de

beschikbaarheid van NO te verhogen bij I/R letsels. Dit is onder andere mogelijk via inhalatie

van NO, inname van medicijnen die fungeren als NO-donor of NO-substraat (vb. L-arginine)

en toediening van de anionen nitriet en nitraat.(1) In 2005 was er de eerste studie die bij in

vivo muismodellen het cytoprotectief van een lage dosis nitriet kon aantonen na I/R van het

hart en de lever.(12) Bij het myocardiaal I/R letsel zorgde nitriet voor een vermindering van

de infarctzone van 67 procent. In deze masterscriptie zal worden ingegaan op de toediening

van nitriet bij I/R letsels en het cytoprotectief effect daarvan.

In de eerste drie hoofdstukken van de resultaatsectie in deze scriptie worden achtereenvolgens

besproken 1) de bronnen van nitriet, 2) hoe de omzetting van nitriet naar NO (dit wordt de

‘bioactivatie’ van nitriet naar NO genoemd) precies gebeurt en 3) wat de mechanismen zijn

achter de cytoprotectieve effecten van nitriet.

1) Naast NO als endogene bron kan nitriet ook via de voeding worden opgenomen als nitraat.

Voor deze omzetting spelen commensale bacteriën in het digestief stelsel een belangrijke rol.

2) Hoe de bioactivatie van nitriet naar NO gebeurt, is nog niet volledig opgehelderd. Naast de

non-enzymatische vorming kan nitriet door diverse eiwitten tot NO worden gerecycleerd. Dit

noemt men de enzymatische vorming van nitriet. Dergelijke eiwitten beschikken over de

capaciteit om nitriet tot NO te reduceren en werden gevonden in het bloed en in de weefsels.

Opvallend is dat de functie van deze eiwitten sterk afhankelijk is van zuurstof en dat ze pas tot

NO producerende ‘enzymen’ worden omgevormd in omstandigheden van hypoxie. Zo is

deoxyhemoglobine geïdentificeerd als het reductase van nitriet in het bloed. Waarschijnlijk

zijn er afhankelijk van het weefsel specifieke reductasen. In het hart bijvoorbeeld wordt

deoxymyoglobine gezien als het belangrijkste nitriet-reductase tijdens ischemie.

Mitochondriën spelen bij nitrietreductie, net zoals bij cytoprotectie, ook een belangrijke rol.

11

Zo kunnen tijdens hypoxie verschillende eiwitten uit de electronentransportketen nitriet

reduceren.

Over de regulatorische pathways van hoe ischemische omstandigheden de activiteit van de

nitrietreductasen verhogen is nog niet veel geweten. Naast een overzicht van de belangrijkste

nitrietreductasen, duiden we enkele van deze hypoxie- en redox-regulerende mechanismen die

hun activiteit controleren.

3) Nitriet kan de uitgebreidheid van I/R letsels beperken door het vasodilaterend en anti-

aggregerend effect ervan op de bloedvaten, maar ook door een protectief effect op de cellen

van het letsel zelf. De mechanismen achter deze nitriet-gemedieerde cytoprotectie zijn

complex en worden nog niet volledig begrepen. Nitriet zou enkel zijn effect kunnen

uitoefenen via NO als intermediair. Vast staat dat de mitochondriën de centrale plaats zijn

waar de mechanismen van cytoprotectie zich afspelen. Bij I/R letsels ziet men namelijk dat de

schade geïnitieerd wordt ter hoogte van deze organellen: er worden reactive oxygen species

(ROS) - dit zijn zuurstofradicalen en ionen - geproduceerd die lipiden, proteïnen en DNA

beschadigen en zo de normale celfunctie aantasten wat uiteindelijk leidt tot apoptose of

necrose van de cel. Nitriet is tijdens ischemie in staat de mitochondriale respiratie te

moduleren wat leidt tot daling in de generatie van ROS en minder oxidatieve schade aan

mitochondriale eiwitten wat uiteindelijk zorgt voor een verkleining van de infarctzone.

Gezien de aanzienlijke resultaten in preklinische studies met betrekking tot het cytoprotectief

effect van nitriet, lijkt de klinische vertaling naar op nitriet gebaseerde therapieën bij I/R

letsels logisch. In het vierde hoofdstuk van de resultaatsectie in deze scriptie zal een overzicht

worden gegeven van de studies die reeds zijn uitgevoerd bij dier en mens. Tevens worden de

uitdagingen in de potentiële nitrietbehandeling bij acuut myocardinfarct en beroerte (stroke)

besproken, omdat dit de I/R letsels zijn waar meest onderzoek wordt naar verricht.

12

MATERIALEN EN METHODEN

De informatie voor deze literatuurstudie werd uit relevante artikels gehaald die gezocht

werden via de database ‘Pubmed’ en in mindere mate via ‘ISI Web of Knowledge’.

Om een globaal beeld te bekomen over nitriet als potentiële therapie bij I/R letsels, de

reductiemechanismen en de cytoprotectieve effecten van nitriet werden eerst enkele

systematische reviews doorgenomen. Op basis hiervan konden we een grove structuur maken

van de verschillende te bespreken onderdelen. Uiteindelijk kwamen we tot een reeks

zoekopdrachten via combinaties van de volgende trefwoorden: nitrite, ischemia, ischemia

reperfusion, reduction, hemoglobin, myoglobin, neuroglobin, xanthineoxireductase,

mitochondria, reactive oxygen species, cytoprotection, ischemic preconditioning,

preconditioning, therapy, sodium nitrite, myocard, kidney, liver, brain, stroke. De

restrictiecriteria waren: artikels gepubliceerd in de laatste 10 jaar en opgesteld in het Engels.

De resultaten van de zoekopdracht werden geselecteerd op basis van de titel en daarna werd

het abstract gelezen. Tenslotte gingen we de impactfactor na van het tijdschrift waarin het

geselecteerde artikel werd gepubliceerd, om zo het belang van de gevonden literatuur in reliëf

te kunnen plaatsen. Artikels uit een tijdschrift met een impactfactor lager dan 1 werden niet

behouden. We vonden ook bruikbare artikels via de functie ‘related articles’ in Pubmed.

De geselecteerde artikels werden gelezen en daarnaast kon nog bruikbare literatuur gevonden

worden via de referenties uit de discussiesecties van de geanalyseerde artikels. Om de artikels

te classificeren werd gebruik gemaakt van het programma ‘Mendeley Desktop’. Hierbij

werden de artikels geordend volgens de indeling die overeenkwam met de inhoudsopgave van

de literatuurstudie. Mendeley werd ook gebruikt tijdens het schrijven van de masterscriptie,

om referenties in te voeren.

Om up-to-date te blijven met de literatuur gebruikten we op aanraden van professor R.

Lefebvre het programma ‘Pubcrawler’. Dit is een programma dat via Pubmed de laatste

treffers opzoekt voor de ingegeven zoektermen en deze per mail doorstuurt met een regelmaat

die men zelf kan bepalen.

13

RESULTATEN

Hoofdstuk 1. De bronnen van nitriet

De hoeveelheid nitriet in het lichaam wordt gevormd door drie bronnen van nitriet. Een eerste

bron is de endogene vorming van nitriet via de oxidatie van NO in het bloed.

De tweede en derde bron van nitriet zijn exogene bronnen en worden hoofdzakelijk via het

dieet ingenomen. Dit gebeurt ofwel via de inname van nitraat dat gereduceerd wordt tot

nitriet, ofwel via de inname van nitriet.

1.1 De endogene bron van nitriet: oxidatie van NO

De endogene bron van nitriet bestaat uit de oxidatie van NO (zie figuur 3). NO wordt onder

andere in endotheelcellen gevormd door eNOS uit L-arginine (de klassieke L-arginine-NOS-

NO pathway) en is welgekend als signaalstof in de regeling van de bloedstroom en de

hartfunctie. De molecule NO komt voor als een gasvormig vrij radicaal dat in fysiologische

omstandigheden snel oxideert tot nitriet (NO2-) en daarna tot nitraat (NO3

-).(13) Deze oxidatie

gebeurt traag in vitro maar wordt versneld door de zuurstofrijke omgeving in het plasma en

door de aanwezigheid van ceruloplasmine, een transporteiwit voor koper dat dienst doet als

oxidase.(14) Naast de snelle oxidatie van NO reageert het grootste gedeelte van NO snel met

oxyhemoglobine en vormt methemoglobine en nitraat.(13)

14

Figuur 3: NO geproduceerd door eNOS diffundeert ofwel in de onderliggende gladde spiercel, of wordt

vrijgesteld in het lumen van het bloedvat. In het lumen wordt het grootste gedeelte van NO opgenomen

door de rode bloedcel en reageert met oxyhaemoglobine tot methaemoglobine en nitraat. Een minderheid

ontsnapt aan de scavengerfunctie van haemoglobine en reageert met plasmabestanddelen tot nitriet en

andere ‘nitrosilated species’(13)

Nitriet is veel stabieler dan NO en heeft door zijn unieke redoxpositie tussen NO en nitraat

een relatief lange halfwaardetijd in het bloed en de weefsels (na diffusie vanuit het bloed).(13)

Zoals we hebben vermeld kan nitriet in situaties van hypoxie en metabole stress, wanneer het

zuurstofafhankelijke NOS tekortschiet, terug worden gereduceerd tot NO (zie hoofdstuk 3).

Deze omvorming maakt deel uit van de nitraat-nitriet-NO pathway. Nitriet, eerst een

afbraakproduct van het endogeen NO-metabolisme, fungeert dus in pathofysiologische

omstandigheden als een endogene bron van NO. Dit komt het ischemische weefsel ten goede

door de vaatverwijdende en cytoprotectieve effecten die NO bewerkstelligt. Sinds de

ontdekking van de nitraat-nitriet-NO pathway is de cirkel tussen de omzetting van NO, nitriet

en nitraat rond en kan men nitriet bij zoogdieren schematisch voorstellen in een

‘stikstofcyclus’. (zie figuur 4)

15

Figuur 4: De plaats van nitriet in ‘een stikstofcyclus’(15)

1.2 De exogene bronnen van nitriet

Een kleine fractie van de nitrietspiegel in het bloed is afkomstig van nitriet in het dieet.

Nitrieten worden toegevoegd aan vleeswaren om hun kleur te bewaren of om de groei van

bacteriën te remmen.

De grootste fractie van de dieetcomponent wordt echter opgenomen als nitraat, dat kan

worden omgevormd tot nitriet. Voedsel rijk aan nitraten zijn rode bieten, selder en groene

bladgroenten zoals spinazie en sla.

In de mondholte kunnen commensale bacteriën aanwezig in de posterieure crypten van de

tong, nitraat reduceren tot nitriet.

Bacteriën spelen in de ‘stikstofcyclus’ bij zoogdieren een essentiële rol in de stap van nitraat-

omzetting naar nitriet, daar ze over enzymatische machinerie beschikken om nitraat op een

veel efficiëntere manier te reduceren in vergelijking met de eukaryote cel.(16)

Als we het spijsverteringsstelsel verder doorlopen (zie figuur 5) zien we vervolgens dat door

de zuurtegraad in de maag een deel van het nitriet wordt geprotoneerd tot salpeterzuur

(HNO3) en dan verder reageert tot NO en andere stikstofoxides.

Het grootste gedeelte van het ingeslikte nitriet ontsnapt echter aan het zure milieu van de

maag, wordt opgenomen door de dunne darm en komt terecht in de systemische circulatie.

Slechts een heel klein gedeelte van het ingenomen nitraat wordt onmiddellijk door bacteriën

in de mondholte gereduceerd tot nitriet. Nadat nitraat wordt ingeslikt, wordt het geabsorbeerd

= nitriet

= nitraat

16

door het bovenste gedeelte van de dunne darm. Zo komt nitraat in het bloed terecht en mengt

zich vervolgens met het endogene nitraat. 75 procent van het plasmanitraat wordt via de

nieren in de urine afgescheiden.

Terwijl de overige 25 procent actief wordt opgenomen door de speekselklieren en zo

gesecreteerd in de mondholte.(16) 20 procent van het nitraat in het speeksel wordt door de

commensale bacteriën in de mondholte omgezet tot nitriet.(16) Uiteindelijk wordt dus 5 à 8

procent van het nitraat ingenomen via de voeding omgezet naar nitriet in het speeksel. De weg

van nitraatinname tot opname in de speekselklier noemt men de enterosalivaire-cyclus van

nitraat. Deze cyclus zorgt ervoor dat verhoogde hoeveelheden nitraat beschikbaar worden

gesteld voor commensale bacteriën.

Figuur 5: De enterosalivaire-cyclus van nitraat(17)

17

Het belang van de enterosalivaire-cyclus en de commensale nitraat-nitriet pathway werd

aangetoond in studies waaruit bleek dat de plasmaconcentratie van nitriet daalde als de

proefpersonen hun speeksel niet doorslikten of bij muizen waar men antiseptische

mondspoeling gebruikte, ter eradicatie van de nitraat-reducerende bacteriën in de

mondholte.(16)(18) Zonder bacteriën zouden zoogdieren wellicht geen nitraat kunnen

metaboliseren. Omgekeerd gebruiken bacteriën nitraat als een terminale electronenacceptor

om tijdens de respiratie ATP te produceren, wat een symbiotische relatie suggereert.

Sinds in 2004 door Lundberg et al. werd ontdekt dat de inname van nitraat de

plasmaconcentratie van nitriet en de NO-spiegels in het bloed doet stijgen is er de laatste jaren

veel onderzoek verricht naar de cardiovasculaire effecten van nitraat.(16) Bij gezonde

individuen heeft nitraat via zijn omzetting naar NO een bloeddrukverlagend effect. De

diastolische bloeddruk werd met 4 mm Hg verminderd na inname van een natrium-nitraat

oplossing in vergelijking met een placebogroep.(19) Gezien nitraat zo alomtegenwoordig is in

ons dagelijks dieet is er een stijgende interesse om nitraatrijk voedsel te implementeren in het

cardiovasculair risicomanagement. Een recente studie toonde reeds aan dat nitraat een

bloeddrukverlagend effect heeft bij patiënten met hypertensie.(20) Ook in de sportfysiologie

is nitraat veelbelovend. Inname van het sap van rode bieten en van natrium-nitraat toonde een

gedaalde zuurstofkost tijdens submaximale inspanning.(21)

1.3 Nitrietconcentraties in het lichaam

De drie bronnen (endogeen NO, exogeen nitriet en exogeen nitraat) dragen bij tot de

hoeveelheid nitriet in de circulatie. De plasmaconcentratie aan nitriet is variabel en bedraagt

bij gezonde individuen in nuchtere toestand tussen de 0,1 en 0,5 µM.(22) Nitrietconcentraties

verschillen per weefsel en in de rode bloedcel is de concentratie hoger dan in het plasma.(13)

Factoren zoals fysieke activiteit, gezondheid en levensstijl beïnvloeden de nitrietspiegels in

het plasma. Zo zijn lagere nitrietconcentraties beschreven bij patiënten met myocardinfarct en

endotheliale dysfunctie.(23) Fysische activiteit verhoogt bij gezonde individuen de

plasmaconcentratie aan nitriet, maar niet bij patiënten met cardiovasculaire ziektes.(22)

18

Hoofdstuk 2. De bioactivatie van nitriet naar NO

Eens gevormd, kan nitriet in het bloed en in de weefsels worden gereduceerd tot bioactief NO.

Dit kan door een non-enzymatische reductie en een enzymatische reductie.

De non-enzymatische reductie van nitriet gebeurt via een protonatiereactie en werd al eerder

aangehaald in hoofdstuk 1 (bronnen van nitriet). Een tweede reactie is de enzymatische

reductie van nitriet. Verschillende eiwitten met een dergelijke reductasecapaciteit zijn

vooropgesteld. De belangrijkste zijn de heem-bevattende globines, molybdeen-bevattende

enzymen en eiwitten uit de mitochondriale elektronentransportketen (zie figuur 6). Terwijl de

reactiemechanismen achter deze verschillende reductiesystemen elk in verschillende mate zijn

opgehelderd, is het duidelijk dat de reductie van nitriet door alle ontdekte reductasen wordt

geoptimaliseerd in omstandigheden van hypoxie en acidose. Welke reductase aangesproken

wordt voor de omzetting van nitriet naar NO zou afhangen van het type weefsel, van de mate

van acidose en van de mate van hypoxie en oxidatieve stress.

Figuur 6: Overzicht van de belangrijkste groepen van nitrietreductasen bij zoogdieren en hun

regulatiemechanismen (24)

19

2.1 De non-enzymatische reductie van nitriet

Dat NO, onafhankelijk van het eNOS, in het lichaam kan worden gevormd (de nitriet-NO

pathway) werd in 1994 voor het eerst ontdekt onder niet-ischemische omstandigheden. Twee

onderzoeksgroepen stelden vast dat een deel van het speeksel-nitriet, afkomstig uit de entero-

salivaire circulatie van dieet-nitraat, wordt omgezet tot NO-gas in de maag (zie figuur

5).(6)(7) Het zure milieu van de maag bewerkstelligt een protonatiereactie waardoor nitriet tot

HNO2 wordt gereduceerd, en dan verder een decompositie ondergaat tot NO (zie tabel 1:

Eq.(1), (2), (3)). De productie van NO door de maag, is sterk afhankelijk van de pH en kan na

inname van protonpompinhibitoren nagenoeg volledig worden geremd.(7) Vermoedelijk heeft

de lokaal sterk verhoogde concentratie van NO een bacteriedodende functie tegen ingeslikte

enteropathogenen. We merken op dat in aanwezigheid van polyfenolen (aanwezig in groeten

en fruit) en ascorbaat (vitamine C), de reductie van nitriet in de maag wordt versterkt (zie

tabel 1: Eq.(4), Eq.(5) en figuur 4).(25)

In 1995 vonden Zweier et al. dat de omzetting van nitriet ook gebeurde onder ischemische

omstandigheden, in het myocard van de rat.(8) Dit zorgde voor een shift in de zienswijzen van

de nitriet-fysiologie. In plaats van een afbraakproduct zou nitriet nu dienst kunnen doen als

een reservoir voor NO, dat tijdens periodes van slechte weefselperfusie zou kunnen worden

aangewend. Later werden de eerste eiwitten (her)ontdekt die tijdens ischemie als

nitrietreductasen fungeren.

Tabel 1: Reductiereacties van nitriet naar NO bij zoogdieren (Fe2+

= actieve vorm van heemijzer dat

reversibel O2 kan binden, Fe3+

= met-heem, de niet actieve vorm van heemijzer)(26)

20

2.2 Reductie van nitriet door heem-bevattende globinen

De meest bestudeerde groep van nitrietreductasen is deze uit de familie van de globinen. Dit

zijn kleine globulaire metalloproteïnen met een karakteristieke structuur. Globinen

beschikken over een heemgroep. Heem bestaat uit een porfyrine-ring met centraal een

ijzeratoom dat de heempocket wordt genoemd. Deze heempocket kan op een reversibele

manier binden met gassen zoals O2, CO en NO. Globinen zijn het best gekend om hun functie

als zuurstoftransporter die de mitochondriën in de cel van brandstof voorzien . Ze bestaan uit

hemoglobine (Hb) in de rode bloedcellen en myoglobine (Mb) in hart- en

skeletspierweefsel.(27) Recent werd ook neuroglobine (Ngb) ontdekt in de hersenen en de

retina.(28) De heemgroep van de globinen is echter ook in staat om nitriet te reduceren tot

NO. Dit werd reeds in 1937 voor het eerst ontdekt bij Hb.(29) Hoewel bij alle heemglobinen

de snelheid van reductie verschillend is, gebeurt de reductie van nitriet volgens eenzelfde

reactie (zie tabel 1, Eq.(6)). Via welke intermediairen deze reductie door heem-bevattende

globinen gebeurt, is nog niet duidelijk.

We merken op dat deoxy-heem (= heem dat niet gebonden is aan O2) nodig is als reactant

voor de reductiereactie van de heem-globinen. Nitrietreductie vereist namelijk een

deoxygenatie van de heemgroep, want dan is het heemijzer vrij van zuurstof en zijn er meer

bindingsplaatsen voor nitriet.

Zoals in hoofdstuk 1 vermeld, reageert het oxyhemoglobine in normoxische omstandigheden

snel met NO tot methemoglobine en nitraat. Hetzelfde wordt gezien bij oxyMb en

oxyNgb.(30)(31) Tijdens hypoxie verandert de rol van de heem-bevattende globinen dus van

een NO-scavenger naar een producent van NO. Zo werd bij alle heemglobinen vastgesteld

dat de reductiesnelheid van nitriet naar NO maximaal is bij een pO2 waarbij het heem-globine

voor de helft gesatureerd is met O2 (deze pO2 waarde duidt men aan met p50).(32) Dit maakt

dat de reductie van nitriet door Mb (p50= 2,2 mm Hg) en Ngb (p50= 2,4 mm Hg) pas optreedt

bij een veel lagere zuurstofspanning dan de reductie van nitriet door hemoglobine (p50= 26

mm Hg).(32)(33)(34)

Er is ook H+ nodig om de reductie van nitriet door heem-bevattende globinen te voltrekken.

Een verlaging van pH zorgt voor een toename in reactiesnelheid.

Dit alles suggereert dat nitrietreductasen uit de familie van de heem-globines de loslating van

NO via hypoxie- en/of pH-sensing moduleren. Dit leidt dan tot de inductie van een breed

spectrum aan NO-gemedieerde responsen in gebieden onderhevig aan ischemische stress.

21

2.2.1 Reductie door hemoglobine

In het bloed gebeurt de vorming van NO via de reductaseactiviteit van Hb in de rode

bloedcellen. De snelheid van bovenvernoemde nitriet-reductasereactie wordt in het geval van

hemoglobine geregeld door veranderingen in de quaternaire structuur van het eiwit Men

spreekt van een ‘allosterisch’ geregelde nitrietreductie (zie figuur 6). De allosterische

eigenschappen van de binding tussen zuurstof en Hb zijn al meer dan 100 jaar gekend. Huang

et al. ontdekten in 2005 dat de binding tussen nitriet en Hb ook een allosterisch karakter

vertoont. (32)

Deze allosterisch geregelde vorming van NO wordt beïnvloed door de zuurstofspanning en

gebeurt als volgt. Afhankelijk van de zuurstofspanning onderscheiden we een R-conformatie

en een T-conformatie van Hb1. Huang et al. ontdekten dat de R-conformatie van Hb, door zijn

welbepaalde tertiaire vorm, een meer negatieve redox potentiaal heeft dan de T-conformatie

en nitriet dus efficiënter kan reduceren tot NO.(32) Het reactant voor nitrietreductie is echter

deoxyhemoglobine en in deze omstandigheden van lage pO2 wordt Hb net gekarakteriseerd

door een gedaalde R-status. Wanneer de O2-saturatie van Hb stijgt, komt Hb meer voor als R-

tetrameer en stijgt dus enerzijds de snelheid van nitrietreductie. Anderzijds zorgt de gestegen

O2-saturatie van Hb ervoor dat de concentratie aan deoxyHb daalt, en er dus minder

bindingsplaatsen zijn voor nitriet, waardoor de snelheid in nitrietreductie terug daalt. Tussen

deze twee tegengestelde processen wordt nu een evenwicht gezocht (zie figuur 7).

1 Een eigenschap van Hb is dat de bindingsaffiniteit voor zuurstof wordt vergroot bij een verhoging

van de O2-saturatie en wordt verlaagd bij een daling van de O2-saturatie. Dit gebeurt via sterische

veranderingen in het Hb. Binding van een eerste molecule O2 zorgt namelijk voor een

vormverandering in de tetramere structuur van het Hb, waardoor de affiniteit voor een tweede

zuurstofbinding wordt vergroot. Zo komt bij hoge pO2, Hb voor als een molecule met hoge

zuurstofaffiniteit, in een vorm die de R(relaxed)-conformatie wordt genoemd. Omgekeerd komt bij

een lage pO2, Hb voornamelijk voor in een T(tense)-conformatie met een lage zuurstofaffiniteit.(27)

22

Figuur 7: Schematische voorstelling van de nitrietreductase-activiteit van hemoglobine(35)

Dit geeft een verklaring voor het feit dat de maximale reductiecapaciteit van Hb precies wordt

bereikt op het punt wanneer Hb voor de helft verzadigd is met O2 (p50) en zich dus in een

toestand bevindt tussen de R en de T-conformatie.

Deze allosterisch gecontroleerde bioactivatie van nitriet zou belangrijk zijn in het mechanisme

van hypoxische vasodilatatie.(9) De rode bloedcel fungeert als een soort zuurstofsensor, die

via de productie van NO, vasodilatatie in slecht doorstroomde gebieden mogelijk maakt.

Eén van de uitdagingen in het onderzoek naar de reductie van nitriet in het bloed is het

vraagstuk hoe NO, gevormd door Hb, zijn werking kan uitoefenen. Het is namelijk zo dat NO

grotendeels word gecapteerd en inactief wordt gemaakt alvorens het de rode bloedcel kan

verlaten. Dit gebeurt via de onderstaande reactie.

Deoxyhemoglobine(Fe2+

) + NO → ijzer−nitrosyl−hemoglobine(Fe2+

−NO )

NO raakt gevangen tussen de heemgroepen van het deoxyhemoglobine (dat niet reageerde

met nitriet) en vormt zich om tot het stabiele ijzer-nitrosyl-hemoglobine. Er zijn verschillende

theoriën aangebracht over hoe NO de rode bloedcel kan verlaten. Deze mechanismen vallen

buiten de focus van deze thesis. Het is een onderwerp dat fel besproken en slecht begrepen

wordt.(36)

23

2.2.2 Reductie door myoglobine

Nitriet kan ook in de weefsels worden gereduceerd. In hart- en skeletspierweefsel gebeurt dit

door Mb.

Alhoewel de structuur van Mb homoloog is aan die van Hb, zijn er geen allosterische

wijzigingen mogelijk zoals die worden gezien bij Hb. De Mb structuur is ‘locked’ in een R-

stand.(37) De heemgroep van myoglobine heeft hierdoor een zeer lage redox potentiaal. Dit

zorgt ervoor dat, wanneer Mb gedeoxygeneerd is, nitriet zeer snel kan reduceren tot NO. Men

heeft gemeten dat deoxyMb, nitriet 30 maal sneller reduceert dan deoxyHb.(32)(33)

De Mb-afhankelijke reductie van NO2- is niet alleen betrokken bij hypoxische

vasodilatatie.(38) Maar NO gevormd door de reductiecapaciteit van Mb speelt ook een rol bij

cytoprotectie na I/R.(33) Het bewijs en het werkingsmechanisme hiervan zullen we zien in het

volgende hoofdstuk.

Mb zou het dominante nitrietreductase zijn in het hart. Nitriet heeft ook een cytoprotectief

effect op de lever en de hersenen. Welke nitrietreductasen in deze weefsels de belangrijkste

rol spelen in cytoprotectie zijn minder gekend. Neuroglobine bijvoorbeeld is exclusief

aanwezig in de hersenen en is in staat de reductie van nitriet te katalyseren. Het is echter ook

mogelijk dat er in de hersenen en in de lever geen dominante nitrietreductasen zijn en deze rol

vervuld wordt door een combinatie van verschillende reductasen.

2.2.3 Reductie door neuroglobine

Neuroglobine werd voor het eerst beschreven in 2000, toen het geïdentificeerd werd in de

hersenen van muizen.(28) Alhoewel Ngb een zuurstof-bindend globine is, wordt zijn functie

als zuurstofleverancier aan neuronen in twijfel getrokken. In tegenstelling tot Hb en Mb heeft

Ngb namelijk een lage affiniteit voor zuurstof. Bovendien maakt de lage concentratie aan Ngb

gevonden in de hersenen, Ngb minder geschikt voor deze functie.

Hoewel de fysiologische rol van Ngb nog grotendeels onbekend is, heeft men gevonden dat

tijdens hypoxie de expressie van Ngb opgeregeld wordt. Tevens hebben in vitro en in vivo

studies aangetoond dat Ngb een beschermend effect heeft op neuronen tijdens I/R.(39)(40).

Petersen et al. vonden dat tijdens hypoxie Ngb in staat is nitriet te reduceren tot NO, wat kan

zorgen voor cytoprotectie.(41) De snelheid van deze nitrietreductie zou redox-afhankelijk

zijn. Tiso et al. toonden aan dat oxidatieve stress in staat is de structuur van de Ngb-molecule

te veranderen waardoor Ngb een betere NO-producent wordt.(42) Omdat Ngb (net zoals

24

cytochroom c, zie 2.4) over een bijzondere structuur beschikt, wordt veel onderzoek verricht

naar welke de post-translationele modificaties van dit eiwit zijn. Het mechanisme van redox-

afhankelijke modificatie van Ngb is hier één van, en suggereert een soort van redox-sensor

voor de modulatie van de nitrietreductie. Hieronder leggen we dit mechanisme uit.

Ngb vertegenwoordigt de typische monomere structuur van het Mb-type. Het Ngb verschilt

structureel van Mb en Hb door het zogenaamde bis-histidine hexa-coordinated

bindingschema van het heemijzer. Bij Hb en Mb is het heemijzer penta-coordinated.2 Het bis-

histidine hexa-coordinated bindingsschema houdt in dat in afwezigheid van een extern ligand

(zoals O2 , CO, of nitriet) het distale histidine rechtstreeks gebonden is aan het heemijzer. Zo

vereist de binding van nitriet met het heemijzer een dissociatie van de distale histidine-

binding. De transitie van een hexa-coordinated naar een penta-coordinated heem bij Ngb (zie

figuur 6) kan nitriet vele malen sneller reduceren dan Mb en Hb. Tiso et al. ontdekten dat

oxidatie van twee cysteïneresiduen aan de oppervlakte van de Ngb-molecule zorgde voor de

transitie naar het penta-coordinated heem. De heempocket wordt dus als het ware opengezet

voor nitrietreductie wanneer neuronen worden blootgesteld aan oxidatieve stress.

2.3 Reductie van nitriet door molybdeen-bevattende enzymes

Van de molybdeen-bevattende enzymen is xanthine oxireductase (XOR) het best gekend.

XOR is een belangrijk enzyme in het nucleotidenmetabolisme. Het katalyseert de laatste twee

reacties in de degradatie van de purinebasen: de oxidatie van hypoxanthine naar xanthine en

van xanthine naar urinezuur. XOR komt onder twee vormen voor: het xanthine-

dehydrogenase (XDH) en het xanthine-oxidase (XO). Onder pathologische omstandigheden,

zoals bij I/R, wordt XDH omgezet tot XO en kan het bijdragen tot celschade via de productie

van ROS (zie hoofdstuk 3, generatie van ROS).(43) Wanneer XOR echter met nitriet wordt

gecombineerd kwam men tot de vaststelling dat dit enzyme, tijdens hypoxie, protectieve

effecten kan uitoefenen via de reductie van nitriet naar NO.(44)(45) Het exacte

reactiemechanisme achter deze XOR-gemedieerde nitrietreductie is niet gekend. Wel is

2 Het heemijzer heeft bij Hb en Mb, wanneer het niet gebonden is aan O2, vijf bindingen. Vier

bindingen met de vier stikstofatomen uit de porfyrinering van de heemgroep. En een 5de

binding met

een histidine-aminozuur (HisF8, het proximale histidine) uit het globine. We spreken van een penta-

coordinated heem. Bij oxygenatie van Mb of Hb wordt O2 enerzijds aan het Fe van de heemgroep

gebonden (een 6e binding aan Fe) en anderzijds aan een histidine (HisE7, het distale histidine) uit het

globine.

25

geweten dat deze reactie zich voordoet op de molybdeen–cofactor (Mo-co) van XOR (zie

tabel 1, Eq.(7)). Hoe XOR in hypoxische omstandigheden switcht van een oxidant-producent

naar een NO-producent moet nog verder worden onderzocht. Ondertussen suggereert men dat

XOR betrokken is in de mechanismen van cytoprotectie na I/R.(45)(46)(47) Overigens

werden andere molybdeen-bevattende enzymen, zoals aldehydeoxidase en sulfietoxidase (zie

figuur 6) geïdentificeerd met een nitrietreductasecapaciteit.(48)

2.4 Reductie van nitriet door eiwitten uit de mitochondriale transportketen

Mitochondriën hebben naast hun functie als energieproducerende organellen ook een

belangrijke taak als initiator van celschade bij I/R. Ze spelen eveneens een rol in de

beschermende anti-apoptotische signaalwegen die geactiveerd worden na ischemie (zie

hoofdstuk 3). Voor de eiwitten uit de mitochondriën werd een nieuwe rol voorgesteld als

potentiële nitrietreductasen.

Nohl et al. onderzochten of cytochromen in de elektronentransportketen van de mitochondriën

in aanmerking komen voor de reductie van nitriet naar NO. Cytochromen zijn heem-

bevattende eiwitten, maar behoren niet tot de familie van de heem-bevattende globinen. Men

vond dat mitochondriën uit de lever van de rat in staat waren nitriet tot NO te reduceren

tijdens anoxie en acidose. Men identificeerde het cytochroom bc1 complex (complex III) uit

de elektronentransportketen, als de plaats waar de reductie optrad.(49) Een latere studie door

Castello et al. toonde aan dat ook het cytochroom c oxidase (complex IV) uit de

elektronentransportketen, en de mitochondriale elektrondrager cytochroom c over een

reductasecapaciteit voor nitriet beschikken.(50) De rol van cytochroom c als nitrietreductase

werd verder onderzocht. Net zoals bij Ngb, is nitrietreductie pas mogelijk nadat het hexa-

coordinated heem van cytochroom c geconverteerd wordt naar zijn penta-coordinated vorm

(zie figuur 7).(51) Bovendien werd aangetoond dat NO, gevormd door cytochroom c tijdens

ischemie, in staat is de mitochondriale respiratie te inhiberen.(51) Zoals we in het volgende

hoofdstuk zullen zien kan dit zorgen voor cytoprotectie tijdens I/R.

2.5 Andere nitrietreductasen

Naast de hierboven besproken mechanismen van nitrietreductie werden talrijke andere

nitrietreductasen geïdentificeerd, waaronder het enzym carboanhydrase en zelfs

eNOS.(52)(53) Vanin et al. toonden aan dat in omstandigheden van anoxie, wanneer eNOS

geen L-arginine kan oxideren tot NO, eNOS i.p.v. L-arginine nitriet kan gebruiken om NO te

26

vormen. eNOS zou dus zowel in hypoxie als in normoxie een bron zijn van NO. Door de

veelheid aan nitrietreductie-mechanismen is het evenwel moeilijk om de bijdrage van eNOS

aan de totale productie van NO tijdens hypoxie te bepalen.

Hoofdstuk 3. Mechanismen van de cytoprotectieve effecten van

nitriet tijdens I/R

Cytoprotectie is het proces waarbij chemische verbindingen bescherming bieden aan cellen

tegen schadelijke effecten. Hoe nitriet en NO deze rol vervullen in de adaptatie bij

ischemische stress blijft onduidelijk. Men hoopt I/R letsels te beperken door een beter begrip

van deze processen.

3.1 Nitriet-gemedieerde cytoprotectie is NO-afhankelijk en NOS-

onafhankelijk

Uit in vitro modellen met geïsoleerde mitochondriën werd aangetoond dat de mitochondriën

de belangrijkste organellen zijn waar de mechanismen van cytoprotectie door nitriet zich

afspelen. De omzetting naar NO blijkt hierbij essentieel te zijn. Dat nitriet zijn effect uitoefent

via NO werd bewezen in dierstudies. Dieren vertoonden bij inname van nitriet en na het

induceren van een I/R letsel, allen een verlies aan cytoprotectie door nitriet wanneer ze met de

NO-scavenger carboxy-PTIO behandeld werden.(12)(45)

Er werd ook vastgesteld dat NOS knockout muizen en muizen behandeld met een inhibitor

van eNOS de cytoprotectieve effecten van nitriet niet konden inhiberen.(12)(45) Dit bewijst

dat het effect van nitriet onafhankelijk is van eNOS. Evenzeer klopt dit met het feit dat de

vorming van NO door eNOS zuurstofafhankelijk is en dat de activiteit van deze enzymen

verzwakt tijdens ischemie. Toevoeging van nitriet zorgt dus voor cytoprotectie door NO maar

zonder tussenkomst van NOS. Welke de pathways zijn die NO vormen in hypoxemische

situaties is grotendeels onbekend. In het vorige hoofdstuk gaven we een overzicht van de

belangrijkste reductoren van nitriet. Met betrekking tot het cytoprotectief effect werd

aangetoond dat myoglobine in het hart noodzakelijk is om nitriet-gemedieerde cytoprotectie

mogelijk te maken.(33)(54) De waargenomen vermindering van de infarctzone werd namelijk

volledig teniet gedaan in myoglobine knockout (-/-) muizen: de in vivo toediening van nitriet

verkleinde de myocardinfarctzone met 61% in myoglobine(+/+) muizen, terwijl nitriet geen

protectief effect had in myoglobine(-/-) muizen.(54) Hetzelfde werd vastgesteld voor Ngb in

27

de hersenen. Knock-down van Ngb-genen verslechterde de uitkomst van hersenschade tijdens

I/R.(40) Ook het nitrietreductase XOR zou een belangrijke rol spelen in nitriet-gemedieerde

cytoprotectie. In diermodellen verminderde de toediening van de XOR-remmer allopurinol de

protectieve effecten van nitrietbehandeling na geïnduceerde I/R letsels in de lever en het hart.

(45)(46)

Het is weinig waarschijnlijk dat de reductasecapaciteit van hemoglobine een rol speelt in

nitriet-gemedieerde cytoprotectie van het hart. Dit werd vastgesteld uit het feit dat nitriet zijn

protectief effect blijft uitoefenen in studies waarin het Langendorff hartmodel wordt

gebruikt.(45)(47) Dit is een vaak gebruikte in vitro techniek waarbij een geïsoleerd

proefdierhart doorstroomd wordt met een voedende oplossing in plaats van bloed.

Om de cytoprotectieve mechanismen van nitriet beter te begrijpen lichten we eerst kort een

aantal belangrijke kenmerken van de pathofysiologie van I/R letsels toe. We zullen zien dat

mitochondriale dysfunctie een belangrijk initiator is van schade bij I/R letsels. Het

voorgestelde werkingsmechanisme van protectie door nitriet (en NO) bestaat dan ook vaak uit

de modulering van specifieke eiwitten in de mitochondriën.

3.2 Enkele pathofysiologische kenmerken van I/R letsels

Het hart, de nieren en de hersenen zijn de organen die het snelst schade ondervinden bij

ischemie. Insufficiënte bloedaanvoer naar het hart kan leiden tot een myocardinfarct. Tijdig

herstel (reperfusie) van het bloeddebiet naar het acute ischemische myocard is essentieel om

de mortaliteit en morbiditeit van deze patiënten te beperken. Toch kan het proces van

reperfusie na een ischemische periode paradoxaal genoeg ook leiden tot een vorm van schade,

vandaar de term reperfusie-letsel. Dit werd voor het eerst beschreven door Hearse et al. in

1973. De reoxygenatie bij reperfusie na myocardischemie genereert reactive oxygen species

(ROS) welke celschade triggeren.(55)

Het wordt nu erkend dat de gestegen productie van ROS door mitochondriën tijdens

reperfusie een van de majeure mechanismen is onderliggend aan I/R letsels. ROS werden

reeds binnen de 10 seconden na reperfusie gedetecteerd.(56)

De mitochondriën zijn een belangrijke aandrijver van post-ischemische celdood. En dit niet

alleen door een toegenomen ROS-productie, maar ook door de opening van de mitochondriale

permeability transition pore (mPTP) gevolgd door de vrijstelling van pro-apoptotische

proteïnen zoals cytochroom c.

28

3.2.1 Generatie van ROS

ROS zijn een groep van oxidanten waarin we twee soorten moleculen onderscheiden: de vrije

radicalen en de niet-radicalen. Vrije radicalen hebben een ongepaard elektron op hun

buitenste schil en zijn daarom zeer reactief. Voorbeelden zijn het superoxide anion (O2-°) en

het hydroxyl radicaal (HO-°). De niet-radicalen zijn reactieve componenten zonder ongepaard

elektron op hun buitenste schil zoals bijvoorbeeld: waterstofperoxide (H2O2) en peroxynitiriet

(ONOO-). ROS kunnen door middel van oxidatie schade aan celstructuren aanrichten, zowel

binnen als buiten de mitochondria.

Onder normoxische omstandigheden worden kleine hoeveelheden ROS geproduceerd door de

mitochondriën, meer bepaald in de elektronentransportketen (respiratory chain); zie figuur 8.

In de elektronentransportketen worden energierijke elektrondonoren (vb. NADH) gebruikt om

uiteindelijk ATP te produceren. Dit is de belangrijkste energiebron bij zoogdieren.

Elektrondonoren komen de elektronentransportketen binnen in complex I of II en worden

getransfereerd naar complex III en IV. Complex IV (cytochroom c oxidase) is de terminale

elektronacceptor in de keten en gebruikt de elektronen voor de reductie van zuurstof tot water.

De transfer van elektronen van complex I tot IV zorgt voor energie die nodig is om protonen

van de mitochondriale matrix naar de intermembranale ruimte te pompen. Dit protongradiënt

wordt door complex V, het ATP synthase, gebruikt om ATP te vormen. Een kleine gedeelte

van de elektronen die de elektronentransportketen doorlopen raken niet tot complex IV en

ontsnappen de keten ter hoogte van complex I en III waar ze zorgen voor de generatie van

superoxide.

Er wordt geschat dat onder fysiologische omstandigheden 1 à 2 procent van de elektronen uit

de elektrontransportketen verantwoordelijk zijn voor de vorming van superoxide.(57) Deze

kleine hoeveelheden ROS kunnen efficiënt worden geneutraliseerd door antioxidanten zoals

mangaan superoxide dismutase (MnSOD).

29

Figuur 8: De mitochondriale elektronentransportketen; reductie van zuurstof naar water en vorming van

superoxide tijdens normoxie (bron: http://www.vmi.pitt.edu/index.html)

De situatie tijdens I/R letsels is anders. Na de ischemische fase leidt reperfusie tot een

buitengewone productie van ROS. Deze oxidatieve uitbarsting zorgt voor een depletie van de

pool aan beschikbare antioxidanten en leidt tot weefselschade. De verhoogde mitochondriale

ROS productie tijdens reperfusie wordt veroorzaakt door de opeenstapeling van elektronen in

de elektronentransportketen. Deze accumulatie van elektronen ontstaat tijdens ischemie, door

een verlaagd O2 aanbod aan de elektronentransportketen, en zorgt voor een verhoogd

reductiepotentiaal van de mitochondriale complexen. Wanneer de concentratie van O2 tijdens

reperfusie terug stijgt, zorgt dit in combinatie met het overaanbod aan elektronen voor een

incomplete reductie van O2 waardoor ROS gevormd worden. De belangrijkste plaatsen van

ROS-productie tijdens dit proces zijn de mitochondriale complexen I en III van de

elektronentransportketen.(58) Er worden tijdens reperfusie na myocardischemie concentraties

aan superoxide anion, H2O2 en hydroxyl radicaal gemeten die het dubbel bedragen van de

concentratie in een niet-ischemische achtergrond.(59)

De dysfunctie van de elektronentransportketen-complexen staat centraal in de progressie van

I/R-letsels: de geproduceerde radicalen zullen de complexen beschadigen, wat leidt tot nog

meer productie van ROS tijdens reperfusie en verdere beschadiging.

We merken op dat naast de mitochondriën ook verscheidene enzymen verantwoordelijk zijn

voor de productie van ROS na I/R. XO is hier een voorbeeld van. Tijdens ischemie wordt

30

ATP voornamelijk gemetaboliseerd tot hypoxanthine die door het XO verder wordt

geoxideerd tot urinezuur. XO gebruikt bij deze reactie O2 als elektronenacceptor, dat wordt

omgezet tot O2-°. Op die manier zorgt het enzyme XO dus voor de vorming van ROS tijdens

reperfusie.(43)

3.2.2 Opening van de mitochondrial permeability transition pore (mPTP)

De mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is een kanaal van het binnenste

mitochondriale membraan, dat geopend wordt in pathologische omstandigheden en dat

bijdraagt tot de opeenvolging van veranderingen die uiteindelijk leiden tot I/R geïnduceerde

celdood door activatie van de mitochondriale apoptotische pathway.(60)

Een beperking van de bloedstroom tijdens ischemie zal het niveau van O2 snel doen dalen. Dit

zorgt ervoor dat mitochondriën, die zuurstof (aeroob metabolisme ) nodig hebben voor hun

ATP-productie, overschakelen naar een anaeroob metabolisme. Deze anaerobe

energieproductie geeft slechts 2 molecules ATP in plaats van 38 molecules ATP. Na verloop

van tijd zullen de energiedependente mechanismen in de cel lijden onder dit tekort aan ATP.

De ATP-afhankelijke Na+/K

+ pomp zal geïnhibeerd worden waardoor de cel zal depolariseren

en een influx van Ca2+

de mitochondriën zal binnendringen. De influx van Ca2+

triggert de

opening van de mPTP. De opening van dit kanaal zal via loslating van cytochroom c een

reactie (zie figuur 9) in gang zetten waardoor de cel in apoptose of necrose gaat.

De mPTP is bovendien zeer gevoelig aan oxidatieve stress. In een ratmodel, waarbij hersenen

werden blootgesteld aan ischemie en reperfusie zorgde de productie van ROS tijdens

reperfusie voor triggering van de mPTP, wat leidde tot mitochondriale zwelling, ruptuur en

vrijstelling van cytochroom c en uiteindelijk tot apoptotische celdood.(61)

31

Figuur 9: Apoptotische pathway in de mitochondriën na I/R en de centrale rol van de mPTP (62)

3.3 Mechanismen van nitriet-gebaseerde cytoprotectie

We nemen het hart als model om uit te leggen wat geweten is over de mechanismen achter de

nitriet-gemedieerde cytoprotectie na een I/R letsel. Er zijn reeds veel mechanismen ontdekt

van NO-gemedieerde cytoprotectie in de mitochondriën zoals de inductie van anti-apoptose

pathways en pathways die de mitochondriale respiratie vertragen. Hoewel het cytoprotectief

effect van nitriet werkt via NO als intermediair (nitrite-derived NO mediated cytoprotection),

zijn de veelheid aan targets zoals gezien wordt bij studies waar toediening van NO het

uitgangspunt is, (nog) niet allemaal aangetoond in studies waar nitriettoevoeging het

vertrekpunt is. Een overzicht geven van deze NO-gemedieerde mechanismen van

cytoprotectie valt buiten de focus van deze thesis. We bespreken enkel die mechanismen van

NO-gemedieerde cytoprotectie die ook geobserveerd werden in studies waarbij nitriet werd

toegediend.

32

3.3.1 Reversibele S-nitrosilatie van complex I

Nitriet oefent op de mitochondriën zijn cytoprotectief effect uit, onder andere via modulatie

van complexen in de elektronentransportketen. Shiva et al. toonden aan dat nitriet tijdens I/R

zorgt voor reversibele inhibitie van complex I.(60) Dit mechanisme van nitriet-gemedieerde

cytoprotectie werd reeds in verschillende diermodellen van I/R gedemonstreerd.(63)(64)

Inhibitie van complex I zorgt voor verminderde productie van ROS tijdens reperfusie en dus

voor een beperking van oxidatieve schade. Zo vond men dat nitriet een verlaagde productie

van H2O2 teweegbracht en dat de activiteit van aconitase, een mitochondriaal enzyme dat zeer

gevoelig is aan oxidatieve schade, werd bewaard. Complex I voorkomt indirect, via de

gedaalde generatie van ROS, opening van de mPTP en hierdoor het vrijkomen van

cytochroom c en pro-apotatische signalisatie (zie figuur 10).(60)

De inhibitie van complex I gebeurt via een post-translationele modificatie van het eiwit,

namelijk via S-nitrosilatie. Hierbij wordt NO gebonden aan de thiol groep (-SH) van het

aminozuur cysteïne in complex I wat leidt tot de vorming van een S-nitrosothiol groep (-

SNO). Het chemisch mechanisme waardoor nitriet kan zorgen voor S-nitrosylatie is niet

helemaal duidelijk. Men denkt dat tijdens I/R S-nitrosylatie mogelijk wordt gemaakt door een

reactie die zorgt voor de conversie van nitriet naar N2O3.(60) De reactieproducten tijdens de

klassieke reductiereactie, wanneer nitriet wordt omgezet tot NO door heemmoleculen (in I/R

omstandigheden), reageren verder tot N2O3. Het voorgestelde reactiemechanisme voor de S-

nitrosilatie van complex I is als volgt. Na de reductiereactie van nitriet door deoxyHb, waarbij

nitriet wordt omgezet naar NO en metHb, reageert een andere molecule nitriet met metHb.

Het gevormde ‘nitriet-metHb’-intermediair ziet er dan als volgt uit: Fe2+

– NO2°

. Hierna

reageert NO2° met NO tot N2O3. N2O3 is reactiever dan NO door zijn hogere oxidatiestatus en

zorgt zo voor S-nitrosylatie.

33

Figuur 10: Nitriet-gemedieerde cytoprotectie; nitriet bewerkstelligt reversibele inhibitie van complex I en

IV en zorgt zo voor cytoprotectie (bron: http://www.vmi.pitt.edu/index.html)

Het feit dat de remming van complex I transiënt gebeurt is belangrijk. Het onomkeerbaar

remmen van de mitochondriale respiratie zou de productie van ATP drastisch verminderen,

waardoor cellulaire herstelmechanismen die voor hun functie afhankelijk zijn van ATP,

zouden worden tegengewerkt.(60)

3.3.2 Reversibele nitrosilatie van complex IV

De inhibitie van cytochroom c oxidase (=complex IV) is betrokken in nitriet-gemedieerde

protectie na I/R.(54) Cytochroom c oxidase is het terminale complex van de

elektronentransportketen, O2 bindt hierop en wordt gereduceerd tot water. Voor NO is

complex IV het primair doelwit in de mitochondriën. NO bindt op Complex IV, gaat in

competitie met O2 en kan zo de mitochondriale respiratie inhiberen. Deze NO-dependente

inhibitie gebeurt volledig reversibel. Studies waarin bewezen werd dat nitriet-gemedieerde

protectie in het hart afhankelijk is van de reductaseactiviteit van deoxymyoglobine toonden

aan dat dit cytoprotectief effect te wijten is aan de binding van NO aan complex IV.(1)(33)

Inhibitie van complex IV zorgt niet rechtstreeks voor een daling in de productie van ROS,

zoals gezien wordt bij inhibitie van complex I. Het zijn voornamelijk complex I en III die

verantwoordelijk zijn voor de productie van schadelijke ROS tijdens reperfusie. Het is zelfs

34

zo dat inhibitie van complex IV kan zorgen voor een verhoogde productie van ROS door

vertraging van de elektronenstroom en de hiermee gepaarde accumulatie van elektronen in

complex I en III.(65) Deze kleine stijging van ROS speelt echter geen grote rol in de

progressie van het letsel tijdens I/R en zet zelfs beschermende reacties in gang (zie 3.3.3).

De vertraging van het tempo van de mitochondriale ademhaling tijdens ischemie en reperfusie

door inhibitie van complex IV door NO, gebeurt zo dat de zuurstofconsumptie daalt terwijl de

generatie van ATP behouden blijft.(66) Hierin zit het cytoprotectief effect vervat.

Dit mechanisme zou ten grondslag liggen aan het fenomeen van "myocardial hibernation". Bij

dit fenomeen wordt in de setting van chronische ischemie de metabole activiteit van het hart

tijdelijk stilgelegd om zo de energiereserves niet uit te putten en het weefsel te sparen van

oxidatieve schade. Eens reperfusie optreedt wordt deze inhibitie opgeheven en keert de

normale metabole functie terug.(54)

3.3.3 De mechanismen van nitriet bootsen ischemische preconditionering (IPC)

na

Nitriet- en NO-gemedieerde cytoprotectie zijn niet de enige cytoprotectieve middelen waarbij

modulatie van de mitochondriale functie belangrijk is.

De meest succesvolle cytoprotectieve strategie tot dusver is ischemische preconditionering

(IPC). IPC is een experimenteel procedé waarbij door korte periodes van ischemie gevolgd

door reperfusie, het weefsel kan worden beschermd tegen navolgende periodes van

aanhoudende ischemie en zo de infarctzone kan reduceren. Dit fenomeen werd door Murry et

al. voor het eerst beschreven bij honden en werd ondertussen bij verschillende diersoorten

geobserveerd, alsook bij mensen. We vermelden IPC omdat er opmerkelijk veel parallellen

zijn met de mechanismen achter nitriet-gemedieerde cytoprotectie.

De idee achter IPC is dat de korte intervallen van ischemie gevolgd door reperfusie,

protectieve pathways activeren (die o.a. geïnduceerd worden door ROS), welke de infarctzone

significant kunnen reduceren.

Het spreekt voor zich dat de klinische bruikbaarheid van IPC enkel beperkt is tot geplande I/R

letsels, zoals bij een harttransplantatie, een coronaire bypassoperatie en bij percutane

coronaire interventies.

De laatste 20 jaar is sinds de ontdekking van IPC-gemedieerde protectie veel onderzoek

verricht naar de mechanismen achter IPC met als doel medicijnen te ontwikkelen die de

protectieve effecten van IPC mimeren.

35

De exacte signalisatiewegen van dit fenomeen zijn nog grotendeels onbekend en vallen buiten

de focus van deze masterscriptie. Ondertussen is wel gebleken dat onder andere ROS en NO

belangrijke mediatoren zijn.(67)(68)

Zoals vermeld leidt de uitbarsting van grote hoeveelheden ROS tijdens reperfusie tot

cellulaire schade, necrose en apoptose. Generatie van ROS door de mitochondriën blijkt

echter essentieel te zijn in de signalisatiewegen bij IPC-gemedieerde cytoprotectie.(67) Lage

concentraties ROS induceren beschermende pathways waaronder de activering van AMP-

Kinase (AMPK).(69) AMPK functioneert als een metabole sensor en speelt in het hart een

belangrijke rol als signaalstof in de cellulaire respons op ischemische stress die verder anti-

apoptose pathways kan activeren.

Hoewel NO betrokken is bij de protectieve mechanismen van ischemische preconditionering,

werd aangetoond dat blokkade van NOS niet zorgde voor inhibitie van IPC-gemedieerde

cytoprotectie. Dit zorgde voor de hypothese dat nitriet als NOS-onafhankelijke bron van NO,

van groot belang zou zijn bij cytoprotectie door IPC.(60) Meer studies zijn nodig om deze

hypothese te testen, want in tegenstelling tot ROS en NO is de betrokkenheid van nitriet in de

signaalweg bij IPC-gemedieerde cytoprotectie niet aangetoond. Het is wel zo dat de tot nu toe

bekende mechanismen van protectie door nitriet deze van IPC bijna lijken te mimeren.

Onderstaande parallellen tussen IPC- en nitrietgemedieerde cytoprotectie suggereren een

potentiële rol voor nitriet als een mediator van IPC. Net zoals bij toediening van nitriet

moduleert IPC de mitochondriale uitbarsting van ROS en dit leidt tot een onderdrukking van

oxidatieve schade in het weefsel. Burwell et al. toonden door het gebruik van een hartmodel

aan dat cytoprotectie door IPC geassocieerd is met de vorming van S-nitrosothiolen in het

hartspierweefsel en met inhibitie van de activiteit van complex I.(58)

Het is welbekend dat het effect van IPC zich voordoet in twee tijdsvensters. Meteen na de

toepassing van IPC is er een acuut of klassiek tijdsvenster van protectie dat zich gedurende

minuten of uren voordoet. Dit wordt gevolgd door een tweede tijdsvenster 24 tot 72 uur na

IPC, de zogenaamde vertraagde cytoprotectie.(68)

In de studie van Shiva et al. suggereert men dat nitriet ook werkt via twee vensters van

protectie. Men stelde vast dat nitriet niet alleen toegediend tijdens ischemie (net voor

reperfusie), maar ook toegediend 24h vóór de inductie van een I/R letsel zorgde voor

cytoprotectie. In beide gevallen zag men bij muizen een even grote vermindering van het

mycardinfarct of de leverischemie. Verder onderzoek naar hoe nitriet kan zorgen voor

vertraagde cytoprotectie leverde volgende vaststellingen op.(60)

36

Men kon niet aantonen dat de nitrietbehandeling een invloed had op de expressie van mRNA

van de belangrijkste genen betrokken bij mitochondriale biogenese, antioxidatieve defensie en

bio-energetica. Maar via de detectie van S-nitrosothiolen vond men dat bij deze late vorm van

cytoprotectie hetzelfde mechanisme van mitochondriale S-nitrosilatie actief was en dit terwijl

de halfwaardetijd van nitriet in het bloed ongeveer 15 minuten bedraagt. Dit suggereert dat S-

nitrosilatie van de mitochondriale complexen zich snel voltrekt en tenminste 24 uur stabiel

blijft. Verrassend hierbij was dat er ondanks de vorming van S-nitrosothiolen 24 uur voor

ischemie geen verandering in mitochondriale respiratie of gedaalde productie van ATP te

detecteren was tot na inductie van het IR-letsel. Complex I wordt dus pas geïnhibeerd in

omstandigheden van ischemie. De mechanismen achter deze I/R-afhankelijke modulatie van

het ge-S-nitrosyleerde complex zijn niet duidelijk.

3.3.4 De opening van ATP-dependente kaliumkanalen door nitriet

Baker et al. evalueerden de betrokkenheid van mitochondriale ATP-gevoelige kalium (K+

ATP)

kanalen (gelegen op de binnenste mitochondriale membraan) in nitriet-geïnduceerde

cardioprotectie.(47) De opening van de K+

ATP kanalen is een belangrijk protectief

mechanisme bij NO- en IPC-gemedieerde cytoprotectie.

De opening van K+

ATP kanalen lijkt te lijden tot depolarisatie van de mitochondriale

membraan en een kleine stijging van ROS. Er werd aangetoond dat dit leidt tot de activering

van anti-apoptose pathways.(70) Zo werd de opening van K+

ATP kanalen geassocieerd met

verminderde calciumaccumulatie in de mitochondriën en preventie van opening van de

mPTP. In geïsoleerde mitochondria toonde men aan dat inactivatie van mitochondriale K+

ATP

kanalen ook zorgt voor preventie van de loslating van cytochroom c.(70)

Cytoprotectie door de opening van K+

ATP kanalen bij toediening van exogeen NO tijdens I/R

gebeurt, net zoals bij NO-gemedieerde vasodilatatie, door activatie van het oplosbaar

guanylaatcyclase (sGC). De gestegen concentratie van cGMP leidt tot activatie van proteïne

kinase G (PKG) en beschermt de cel tegen I/R letsels door opening van mitochondriale K+

ATP

kanalen.(70)

Om de rol van K+

ATP kanalen als mediator van nitriet-gemedieerde cytoprotectie te

onderzoeken werd aan ratten, die voor inductie van I/R in het myocard al dan niet behandeld

werden met nitriet, 5-hydroxydecanoaat (5-HD) en HMR 1098 toegediend. 5-HD en HMR

1098 blokkeren de K+

ATP kanalen. De toediening ervan bij nitriet behandelde ratten zorgde

ervoor dat de vermindering van de infarctzone werd teniet gedaan. Bij ratten die niet waren

37

behandeld met nitriet, had zowel 5-HD als HMR 1098 geen effect op de infarctzone na

inductie van een I/R letsel.(47) Hieruit werd besloten dat activatie van het K+

ATP kanaal deel

uitmaakt van nitriet-gemedieerde protectie.

Shiva et al. suggereerden dat K+

ATP kanalen geen target zijn van nitriet-gemedieerde

cytoprotectie.(60) Ze gebruikten hiervoor een K+

ATP kanaal blokker (diazoxide) en een K+

ATP

kanaalopener (glibenclamide) en vonden geen significant verschil in cytoprotectie na I/R bij

toediening van nitriet samen met diazoxide versus toediening van enkel nitriet. Hetzelfde

werd gezien bij de combinatie glibenclamide en nitriet. En dit terwijl beide farmaceutica, elk

toegediend zonder nitriet, wel cytoprotectie beïnvloedden na I/R. Hieruit blijkt dat ondanks

het sterke protectieve effect dat de activatie van de K+

ATP kanalen teweegbrengt, de

betrokkenheid ervan in het beschermend effect van nitriet controversieel is.

3.3.5 Inhibitie van mitochondriale fissie door fosforylatie van Drp1

In tegenstelling tot wat vaak wordt gedacht, is de mitochondriale populatie van een cel erg

fluctuerend. De processen die leiden tot veranderingen in hoeveelheid, vorm en distributie van

mitochondriën - kortweg de mitochondriale dynamiek - zijn fissie (splitsen) en fusie

(samensmelten). Enkele eiwitten die betrokken zijn bij mitochondriale fissie zijn

geïdentificeerd en sommige van hen zijn geassocieerd met mitochondriale ziekten.

De betrokkenheid van veranderde mitochondriale dynamiek in de pathogenese van I/R werd

onderzocht en recent werd gevonden dat inhibitie van mitochondriale fissie het hart beschermt

tegen I/R letsels. Zo zorgde de farmacologische inhibitie van het eiwit dat mitochondriale

fissie regelt, dynamin-related protein-1 (Drp1), voor een verkleining van de myocardiale

infarctzone in knaagdiermodellen.(71)

Recent toonden Kamga Pride et al. aan dat ook nitriet de mitochondriale dynamiek kan

moduleren.(72) In een I/R model bij in cultuur gebrachte H9c2 rat-cardiomyocyten werd de

volgende signalisatiecascade waargenomen (zie figuur 11).

38

Nitriet is in staat proteïne kinase A (PKA) te activeren. Dit eiwit fosforyleert en inhibeert

Drp1. Inhibitie van Drp1 zorgt structureel voor een stijging van de mitochondriale fusie.

Functioneel zorgt dit voor een verhoging van de membraanpotentiaal over de mitochondriën

en een toename van de mitochondriale productie van ROS. Deze productie van ROS leidt tot

oxidatie en activatie van de AMPK-pathway, een essentiële stap in cytoprotectie die ook

belangrijk is in IPC-gemedieerde cytoprotectie. Dat mitochondriale productie van ROS hierin

essentieel is werd aangetoond door het gebruik van een ROS scavenger. Dit inhibeerde de

activatie van AMPK waardoor de cytoprotectie, waargenomen na toediening van nitriet, werd

verhinderd.(72)

In de studie van Kamga Pride et al. wordt nitriettherapie toegediend tijdens normoxie, 1 uur

voor inductie van het I/R letsel. Dit zorgt voor een significante vertraging van celdood in de

cardiomyocyten. De vaststelling door verschillende andere studies, dat nitriet toegevoegd

vóór I/R een (vertraagd) cytoprotectief heeft, doet vermoeden dat nitriet in niet-ischemische

omstandigheden een signaalstof is.(73)(60) Tot voor kort was er geen enkele studie die deze

hypothese hard kon maken. Inhibitie van complex I bijvoorbeeld, een belangrijk mechanisme

van met nitriet bekomen cytoprotectie zoals hierboven uitgelegd, werd enkel waargenomen in

omstandigheden van ischemie/reperfusie. Ook in de studie van Kamga Pride et al. kon na

nitriettoediening en voor inductie van het I/R letsel in de cardiomyocyten, geen inhibitie van

complex I worden geobserveerd.

Figuur 11: Nitriet-afhankelijke activatie van de PKA-Drp1-AMPK pathway (er werd aangetoond dat deze

pathway ook actief is tijdens normoxie) (72)

39

Tijdens normoxie werd echter wel een verhoogde PKA activiteit door nitriet waargenomen.

Voor het eerst werd een nitriet-signaalweg blootgelegd die leidt tot cytoprotectie in

omstandigheden van normoxie. Een toestand waarin het onwaarschijnlijk is dat nitriet naar

NO wordt omgezet gezien deze reductie voornamelijk gebeurt in omstandigheden van

hypoxie en lage pH. Hoe of via welk intermediair nitriet kan zorgen voor activatie van PKA

tijdens normoxie is onduidelijk.

Hoofdstuk 4: Nitriet als potentieel therapeuticum bij I/R letsels

De resultaten uit talrijke dierstudies met nitriettoediening bij I/R letsels van zowel het hart, de

hersenen, de lever en de nieren zijn veelbelovend te noemen. De inzichten die deze studies

ons hebben bijgebracht op het gebied van mechanismen van cytoprotectie en identificatie van

nitrietreductasen werden reeds besproken in de vorige hoofdstukken. In dit hoofdstuk

bespreken we de resultaten van deze studies in functie van de toepasbaarheid naar de kliniek.

Tevens bespreken we de veiligheid van nitriettherapie. Daarna gaan we na hoe ver men staat

in het onderzoek naar nitriet als mogelijk therapeuticum bij AMI en stroke.

4.1 Dierstudies betreffende nitriettoediening bij I/R

Sinds ontdekt werd dat nitriet in ischemische omstandigheden een alternatieve bron is van

NO, zijn veel studies verricht naar de effecten van nitriettoediening bij diermodellen in

ischemische condities. Het eerste effect van de omzetting van nitriet naar NO dat men vond,

was vasodilatatie.(9)(74) Kort daarop volgden een hele reeks studies die in diermodellen

demonstreerden dat exogeen toegediend nitriet de uitgebreidheid van geïnduceerde I/R letsels

kon beperken. In tabel 2 vinden we een overzicht van dierstudies gepubliceerd tussen 2004 en

2009 waarin de toediening van nitriet zorgde voor een reductie van I/R letsels. Als we nitriet

therapeutisch benaderen is het nuttig om na te gaan in welke grootteorde van concentraties en

via welke toedieningswegen nitriet werkzaam is in ischemische modellen. Bovendien is het

belangrijk om te weten wat de invloed is van de timing en duur van nitriettoediening op het

cytoprotectief effect.

40

(73)

(12)

(60)

(47)

(47)

(45)

(75)

(12)

(46)

(60)

(76)

(77)

Ta

bel

2:

Ov

erzi

cht

va

n d

iers

tud

ies

wa

ar

nit

riet

toed

ien

ing

een

gu

nst

ig e

ffec

t h

ad

op

het

I/R

let

sel

(met

bij

gev

oeg

de

refe

ren

ties

) (7

8)

41

Dosis

De eerste studie in deze reeks werd uitgevoerd door Webb et al. in 2004. Webb et al.

demonstreerden dat in een Langendorff hartmodel van de rat, infusie van (lage) concentraties

natrium-nitraat (van 10 tot 100 µM), voor en tijdens een ischemisch insult, zorgde voor de

productie van NO.(45) Er werd hierbij een behoud van de functie van het linker ventrikel

vastgesteld en een kleinere infarctzone in vergelijking met ratten die een zoutoplossing kregen

toegediend. Hoewel men vaststelde dat de concentratie van NO steeg naarmate men de dosis

nitriet opdreef (van 10 tot 100 µM), merkte men hierbij geen verschil in de mate van protectie

van het myocardweefsel. Kort daarna rapporteerden Duranski et al. dat nitriet protectief was

in in vivo muismodellen van myocard- en leverischemie.(12) In deze studies werden

oplossingen van natrium-nitriet (dosis van 2,4 tot 960 nmol) toegediend tijdens myocard- en

leverischemie. Voorts vertoonde het efficiëntieprofiel van de nitriettherapie een U-vormige

curve. Dit betekent dat zowel zeer lage als zeer hoge dossisen van nitriet niet leiden tot

protectie van het weefsel. We merken hierbij op dat supra-fysiologische concentraties (van

hoog µM tot laag mM) zelfs cellulaire apoptose en necrose promoten (zie 4.2).(79) Er werd in

de studie van Duranski et al. een maximale protectie van de lever en het hart bereikt bij een

bijna-fysiologische (48nmol) dosis van nitriet.

Het feit dat het cytoprotectief effect reeds in lage, bijna-fysiologische dosissen optreedt, is een

pluspunt voor potentieel therapeutisch gebruik (Vb. minder kans op bijwerkingen, zie 4.2).

Tevens suggereert dit dat nitriet pathofysiologische responsen op ischemische stress

moduleert.

Toedieningsweg

In de meerderheid van de dierstudies werd nitriet systemisch (intraveneus of intraperitoneaal)

toegediend. Bij myocardiale I/R letsels echter, zorgden verschillende toedieningswegen niet

voor een significant verschil in het protectieve resultaat van de nitriettherapie. Zo was oraal

toegediend nitriet evenzeer in staat het I/R letsel te beperken als intraveneus toegediend

nitriet. Muizen die een standaarddieet kregen en waarbij gedurende 7 dagen nitriet in hun

drinkwater werd toegevoegd, vertoonden bij inductie van een myocardiaal I/R letsel een

reductie van de infarctzone van 48 procent.(73)

Bij studies met I/R van de nieren zouden discrepanties in werkzaamheid van nitriettherapie te

wijten kunnen zijn aan een verschil in de toedieningsweg van nitriet. Basireddy et al.

observeerden dat systemische toediening (intraveneus of intraperitoneaal) geen bescherming

42

bood bij inductie van een I/R letsel in de nieren van ratten.(80) Tripatara et al. bevestigden

deze resultaten in een gelijkaardig model, maar konden bij toediening van dezelfde

hoeveelheden nitriet wel een protectief effect aantonen wanneer nitriet topisch werd

toegediend.(76)

Nitriet heeft, naast een beschermend effect op I/R wanneer het systemisch of oraal wordt

toegediend, ook protectieve eigenschappen via een endocrinologische manier. Dit werd

geïllustreerd in een dierstudie met transgene muizen waarbij humaan eNOS, specifiek voor

cardiomyocten, tot overexpressie werd gebracht. NO wordt afgebroken tot nitriet, waarvan

men verhoogde spiegels detecteerde in het bloed. Wanneer bij deze dieren een I/R letsel in de

lever werd geïnduceerd, werd een significante reductie van het I/R letsel waargenomen in

vergelijking met wildtype muizen.(81) Nitriet afkomstig van het hart zorgt dus via transport

door het bloed, voor protectie in verder gelegen organen.

In de klinische praktijk van de behandeling van I/R letsels zou de intraveneuze

toedieningsmogelijkheid van nitriet het interessantst zijn. We merken op dat, gezien de

verscheidenheid aan effecten van nitriet (zie figuur 1 in de inleiding), de veelheid aan

effectieve toedieningswijzen een voordeel zou zijn voor een aangepaste behandeling per

conditie (bvb orale inname van nitriet bij chronische ischemie zoals perifeer arterieel lijden).

Timing

Gonzalez et al. toonden aan dat nitriet, toegediend gedurende 5 minuten net voor het begin

van de reperfusie-fase, ook zorgde voor myocardiale cytoprotectie.(75) Dit werd aangetoond

in een model bij de hond waarbij de periode van coronaire occlusie 2 uur bedroeg.

Intraveneuze toediening van natrium-nitriet gedurende de laatste 5 minuten van deze

ischemische periode zorgde voor een vermindering van de myocardiale infarctzone van 70

procent (= de infarctzone van de controlegroep die een zoutoplossing kreeg toegediend) naar

36 procent. In vergelijking met een groep dieren die reeds natrium-nitriet kregen toegediend

gedurende 60 minuten voor reperfusie, en waarvan de infarctzone 23 procent bedroeg, is dit

verschil niet zo groot. Uit de zeer gunstige protectieve effecten van nitriettoediening vlak voor

reperfusie besloten Gonzalez et al. dat nitriet een aanzienlijk potentieel zou kunnen hebben als

aanvullende therapie bij AMI. In deze setting zou nitriet kunnen worden toegediend net voor

PCI of trombolyse.

Zoals vermeld in het vorige hoofdstuk bleek toediening van nitriet, 24 uur voor inductie van

ischemie, ook bescherming te bieden (de zogenaamde vertraagde cytoprotectie). Deze

eigenschap van nitriet, waarbij weefsels als het ware ‘gepre-conditioneerd’ worden aan een

43

ischemische periode, zou nuttig kunnen zijn bij transplantaties. Zowel het donororgaan als de

recipiërende patiënt zouden 24 uur voor de transplantatie kunnen behandeld worden met

nitriet. Zo zou een omgeving worden gecreëerd waarin de schade van I/R tijdens en na de

transplantatie wordt beperkt.

4.2 Veiligheid van nitriettherapie bij I/R

Ondanks het enthousiasme voor nitriettherapie is het van belang om behoedzaam te blijven.

Als we het gebruik van nitriet als mogelijk therapeuticum bij de mens nagaan is het belangrijk

de potentiële gevaren in acht te nemen.

Er zou na nitriettoediening hypotensie kunnen optreden door de verhoogde beschikbaarheid

van NO en de daarmee gepaard gaande vasodilatatie. Dit zou de omvang van het I/R letsel,

een situatie waar reeds hypoperfusie van het orgaan aanwezig is, negatief kunnen

beïnvloeden.

Een te sterke stijging van de beschikbaarheid van NO kan cytotoxische effecten hebben. Men

is het erover eens dat zeer hoge concentraties NO weefselschade kunnen promoten.(79) Dit is

te wijten aan de vorming van peroxynitriet, een zeer potent ROS dat ontstaat door de snelle

reactie van NO met een ander zuurstofradicaal, namelijk het superoxide-anion (zie figuur

1).(77)

De bezorgdheid voor bovenstaande speelt ook mee in het onderzoek van toediening van NO

(Vb. via inhalatie van NO-gas of intra-veneuze toediening van NO-donoren) als potentiële

therapie bij I/R-letsels. En is een reden waarom na succesvolle dierstudies slechts weinig

klinische studies werden uitgevoerd.(82)

Een voordeel echter van nitriet boven therapie met NO of NO-donoren, ligt in de stabiliteit

van de molecule nitriet. Zoals eerder vermeld kan nitriet na transport door het bloed, worden

opgeslagen in de weefsels. Bovendien gebeurt de reductie van nitriet naar NO preferentieel in

weefsels onderhevig aan ischemie. Nitriet-afhankelijke vrijstelling van NO zorgt op die

manier voor een gerichte bescherming, en vermindert hierbij het risico op systemische

bijwerkingen van NO.

Een ander gevaar van nitriet is methemoglobinemie. Net zoals NO (zie figuur 3) kan nitriet

namelijk reageren met oxyhemoglobine. Door oxydatie van het heemijzer (van Fe3+

naar Fe2+

)

ontstaat methemoglobine (metHb). MetHb kan geen zuurstof binden en bij te hoge

plasmaconcentraties kan dit interfereren met de capaciteit van de rode bloedcellen om

zuurstof te transporteren. Dit gebeurt wanneer de plasmaconcentratie van metHb 20 tot 30

procent van de totale concentratie van Hb bedraagt.(83)

44

De veiligheid van de toediening van nitriet bij mensen werd in 2011 bestudeerd in een

klinische studie (fase1).(83) Bij gezonde individuen werd in een stijgende dosis natrium-

nitriet systemisch toegediend, en dit gedurende 48 uur. Men bepaalde de hoogste dosis die

geen bijwerkingen veroorzaakte (maximal tolerated dose (MTD)) en de dosis waarbij

bijwerkingen optraden (dose limiting toxicity (DLT)). Deze bedroegen respectievelijk 267 en

446 mg/kg/u. De toxische effecten van nitriet waren: een asymptomatische verhoging van de

bloeddruk die transiënt was, en een zeer lichte stijging van de plasmaconcentratie van metHb.

Gezien de therapeutische dosissen van nitriet, afgeleid uit preklinische studies, onder de MTD

en DLT vallen, besloot men dat intraveneuze toediening van nitriet veilig is. Voorts besloot

men dat deze studie zeer waardevol is om de stap te maken naar klinische trials die

nitriettherapie onderzoeken bij specifieke condities zoals I/R van het hart, de lever, de nieren

en de hersenen. We merken op dat nog niet geweten is of nitrietbehandeling zou kunnen

leiden tot pathologische accumulatie van NO (door de vorming van peroxynitriet) in het

ischemische weefsel.

4.3 Nitriettherapie bij acuut myocardinfarct (AMI)

Vandaag is de behandeling van I/R letsels gebaseerd op het tijdig herstellen van de

orgaanperfusie. Bij een acuut myocardinfarct (AMI) bijvoorbeeld, bestaat de therapie uit het

opheffen van de arteriële occlusie door percutane coronaire interventie (PCI; dit is het

plaatsen van een stent die de vernauwde coronair openzet) of door intraveneuze toediening

van trombolytica. Voor het aandeel van de weefselschade die, zoals eerder vermeld, ontstaat

tijdens reperfusie, bestaat echter geen effectieve therapie. Het cytoprotectief effect van nitriet,

dat voornamelijk optreedt tijdens reperfusie, zou één van de mogelijkheden kunnen zijn om

aan het gebrek aan ‘reperfusie-therapie’ tegemoet te komen.

Uit de reeds aangehaalde dierstudies (zie tabel 2) is duidelijk dat nitriet bij I/R een

cardioprotectief effect heeft, en dit zowel toegediend vóór ischemie, als net vóór reperfusie.

Onlangs werden de resultaten gepubliceerd van een gerandomiseerde klinische studie bij

patiënten met een eerste acuut STEMI (ST-elevated acute myocard infarct) die nitriet

intraveneus kregen toegediend, net voor reperfusie d.m.v. PCI.(84) Dit is de eerste klinische

studie waarbij het therapeutisch effect van nitriettherapie werd getest bij patiënten die een

spontaan I/R letsel doormaken. De resultaten van deze studie waren echter negatief. Men

repliceerde hetzelfde protocol (timing, duur, en dosis van nitriettoediening) als gebruikt werd

45

door Gonzalez et al. in het model bij de hond (zie 4.1). In tegenstelling tot de veelbelovende

resultaten in deze dierstudie, kon bij mensen geen reductie van de infarctzone worden

aangetoond. Het is niet duidelijk waarom de gunstige resultaten uit dierstudies niet konden

worden bevestigd in deze klinische studie. Een mogelijke verklaring voor deze verschillen,

die wordt aangehaald in het artikel, is het feit dat bijna alle patiënten voor reperfusie, als

standaardtherapie, organische nitraten kregen toegediend. Het zou kunnen dat deze NO-

donoren reeds een bepaalde graad van cardioprotectie geïnduceerd hadden, en hierdoor het

potentieel voor een bijkomstig cardioprotectief effect door nitriet inperken. Of erger nog,

zouden de organische nitraten, in combinatie met nitriet, kunnen zorgen voor een hoge

concentratie aan NO in het hartspierweefsel, dat schadelijk zou zijn.

4.4 Nitriettherapie bij beroerte

Beroerte (stroke) of een cerebrovasculair accident (CVA) is een I/R letsel van de hersenen en

kunnen we afhankelijk van het ontstaansmechanisme opdelen in twee types, ischemische

CVA en hemorragische CVA. 80 procent van alle CVA’s zijn ischemisch en ontstaan

wanneer de bloedtoevoer onderbroken wordt door een bloedklonter. Een hemorragische CVA

ontstaat, zoals het woord het zegt, door een bloeding, meestal na het barsten van een

aneurisma.

Tot op vandaag bestaat de enige behandeling van ischemische CVA uit het intraveneus

toedienen van een trombolyticum. Een beperking van deze therapie is het risico op

bloedingen, daarom mag trombolyse slechts worden uitgevoerd tot 3 uur na het begin van het

infarct. Aangezien, in tegenstelling tot AMI, het gevoel van urgentie bij ischemische CVA

veel lager ligt, krijgen een meerderheid van de patiënten mensen geen tijdige behandeling met

trombolyse. Voor hemorragische CVA bestaat tot op heden geen farmacologische therapie.

Jung et al. hebben veel onderzoek verricht naar het gebruik van nitriet bij ischemische CVA.

In 2006 werd in een dierstudie met ratten aangetoond dat nitriet intraveneus (in nanomolaire

dosissen) toegediend op het tijdstip van reperfusie, na occlusie van de arteria cerebri media,

leidde tot een significante vermindering van de infarctzone en een verbetering van functioneel

herstel.(77) Wanneer men in een volgende studie de timing van nitriettoediening wijzigde,

ontdekte men dat nitriet ook neuroprotectief was, wanneer toegediend 3 uur na cerebrale

I/R.(85) Dit zou het gebruik in acute setting bijzonder nuttig maken.

46

Een andere studie door Jung et al. onderzocht het effect van chronische nitriettherapie 24 uur

voor het I/R letsel. Er werd aangetoond dat continue toediening van nitriet, gedurende 7

dagen, zorgde voor neuronale en vasculaire regeneratie, en beter functioneel herstel van de

hersenen.(86) Terwijl de dosis aan nitriet nodig voor neuroprotectie in acute cerebrale

ischemie bijzonder laag was, waren in deze studie dosissen van 100 µg/kg nodig om protectie

te bieden. Het mechanisme achter deze discrepantie is niet duidelijk.

Voor (intracraniële) hemorragische CVA werden ook positieve resultaten geboekt met

nitriettherapie.(87)

Bij subarachnoïdale hemorragie (SAH), een ander subtype van hemorragische CVA, treedt de

bloeding op in de met liquor gevulde ruimte tussen de hersenen en de arachnoïdale

hersenvliezen. Een verwikkeling geassocieerd met SAH zijn cerebrale vasospasmen. Fathi et

al. toonden aan dat infusie met nitriet in een model van vasospasme bij apen, zorgde voor een

omkering van vasospasmen geïnduceerd door SAH.(88) Er wordt namelijk gedacht dat

dysfunctioneel eNOS verantwoordelijk is voor de vasospastische respons na SAH.

In 2013 werd een klinische studie gepubliceerd die de veiligheid van nitriettherapie bij

patiënten met SAH testte. Gedurende 2 weken kregen patiënten met SAH nitriet toegediend,

en dit in gelijkaardige dosissen die in preklinische studies voor een therapeutisch effect

zorgden. Er werd geen toxiciteit (de concentraties aan metHb gingen niet hoger dan 3,3

procent van de totale concentratie aan Hb) of hypotensie waargenomen.(89) Deze gunstige

resultaten tonen aan dat potentieel therapeutische dosissen voor de mens, veilig zijn bij

patiënten met SAH, en zet de deur open voor het ontwikkelen van andere klinische studies die

de neuroprotectieve effecten van nitriet evalueren.

47

DISCUSSIE

Onderzoek dat gedurende de laatste 20 jaar gevoerd werd, heeft de manier waarop we over

nitriet en nitraat denken drastisch veranderd. De ontdekking van de nitraat-nitriet-NO

pathway toonde aan dat deze anionen veel meer zijn dan de voedingsadditieven waarmee men

ze in het verleden hoofdzakelijk associeerde. Er is in het onderzoek rond nitriet als het ware

een shift gebeurd van nitriet als mogelijk toxische stof, naar nitriet als een biologisch

relevante molecule. Het is nu duidelijk dat nitriet een belangrijke rol speelt in de homeostase

van NO en zo verscheidene ziektetoestanden, waaronder I/R, gunstig zou kunnen

beïnvloeden.

In het eerste deel van de masterscriptie zijn we dieper ingegaan op wat reeds gekend is over

de bronnen, de bioactivatie en de werkingsmechanismen van nitriet tijdens I/R. We hebben

gezien dat bij zoogdieren verschillende eiwitten in het bloed en de weefsels kunnen dienen als

reductasen voor de omzetting van nitriet naar NO. Er zijn nog veel onduidelijkheden en

wellicht zullen in de toekomst de reactiemechanismen en de zuurstof- en redoxafhankelijke

regulatiemechanismen achter de besproken reductiesystemen verder worden opgehelderd.

Bovendien vermelden vele auteurs dat, hoewel in de literatuur de meeste aandacht gaat naar

deoxyHb, deoxyMb en XO, het mogelijk is dat in de nabije toekomst nog meer

nitrietreductasen zullen worden geïdentificeerd. De overvloed aan kandidaat ‘enzymes’ voor

nitrietreductie zou een overblijfsel zijn van ons preaeroob verleden als bacteriën, waarbij

stikstofoxiden zoals nitriet werden gebruikt als terminale elektronenacceptor in de

energieproductie.

Ook over de cytoprotectieve effecten van nitriet die in deze masterscriptie werden besproken,

bestaan nog veel onbeantwoorde vragen. Zo is het chemisch mechanisme achter nitriet-

gemedieerde S-nitrosylatie van het mitochondriale complex I niet helemaal duidelijk. De

mechanismen achter de I/R-afhankelijke inhibitie van het ge-S-nitrosyleerde complex (bij

vertraagde cytoprotectie door nitriet) zijn eveneens onduidelijk. In de studie van Kamga Pride

et al. (72), waarin als cytoprotectief effect de inhibitie van de mitochondriale fissie werd

vooropgesteld, is niet geweten hoe nitriet (tijdens normoxie en waarschijnlijk onafhankelijk

van de reductie van nitriet naar NO) kan zorgen voor de activatie van PKA. Tevens is de

betrokkenheid van nitriet in IPC-gemedieerde cytoprotectie nog niet aangetoond. Ook over de

K+

ATP kanalen als target van nitriet-gemedieerde cytoprotectie bestaat controverse. We

48

kunnen besluiten dat verder onderzoek nodig is naar de cytoprotectieve mechanismen van

nitriet tijdens I/R. Een beter begrip van deze nitriet-gemedieerde beschermingsmechanismen

zou ons verder kunnen brengen in klinische studies rond het therapeutisch aanwenden van

nitriet. Bovendien zou de verdere ontrafeling van cytoprotectieve signaalwegen van nitriet,

targets kunnen blootleggen waarop farmacotherapeutisch kan worden ingewerkt.

In het tweede deel van de masterscriptie gingen we de mogelijkheid na van nitriet-gebaseerde

therapie bij I/R, waarbij we de uitdagingen voor nitriet in de behandeling van twee specifieke

ziektebeelden (AMI en CVA) bespraken. Het onderzoek naar nitriet als mogelijk

therapeuticum bij I/R heeft een kritisch punt bereikt tussen pre-klinische studies en klinische

studies. Bij AMI is men reeds het verst gevorderd. Hier zagen we echter dat, ondanks de

gunstige resultaten in dierproeven, de eerste klinische studie dit echter niet kon bevestigen.

Als we in het onderzoeksveld van cardioprotectie de resultaten van andere ‘reperfusie-

therapiëen’ nagaan, valt het op dat er reeds een groot aantal mislukte pogingen geweest zijn

om veelbelovende strategieën in dierproeven te vertalen naar de klinische setting. Volgens D

Hausenloy et al. is deze discrepantie o.a. te wijten aan het feit dat vele experimentele

modellen voor AMI te veel verschillen van de klinische setting van AMI in termen van

comorbiditeit (leeftijd, diabetes, dylipidemie en hypertensie) en concomitante medicatie.(90)

Als we deze afweging toepassen op de literatuur rond het onderzoek van nitriet als mogelijk

therapeuticum bij I/R letsels is het inderdaad zo dat er weinig bekend is over interacties met

andere medicatie. Dit aspect zal verder onderzoek vereisen om (mogelijke schadelijke)

interacties te evalueren.

Klinische studies betreffende de veiligheid van nitriettoediening rapporteerden dat

intraveneuze toediening van nitriet veilig is bij gezonde vrijwilligers en ook reeds bij

patiënten met SAH. Bovendien is toediening van nitriet zoals eerder vermeld uniek ten

opzichte van andere farmacologische behandelingen bij I/R letsels, daar het een stabiele

molecule is, die fungeert als een endocrien reservoir van NO en pas wordt ‘geactiveerd’ in

weefels in zuurstofnood.

Het is duidelijk dat nitriet-gebaseerde therapie bij I/R een zeker potentieel heeft, de resultaten

van klinische studies zullen uitwijzen welke richting het zal uitgaan.

49

REFERENTIELIJST

1. Lei J, Vodovotz Y, Tzeng E, Billiar TR. Nitric oxide, a protective molecule in the cardiovascular system.

Nitric Oxide [Internet]. Elsevier Inc.; 2013 Nov 30 [cited 2014 Jan 23];35:175–85. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24095696

2. S. Moncada, A. Higgs. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med. 1993;329:2002–12.

3. Bian K, Doursout M-F, Murad F. Vascular System: Role of Nitric Oxide in Cardiovascular Diseases. J

Clin Hypertens [Internet]. 2008 Apr [cited 2014 Mar 14];10(4):304–10. Available from:

http://doi.wiley.com/10.1111/j.1751-7176.2008.06632.x

4. Roberts JD Jr, et al. Inhaled nitric oxide and persistent pulmonary hypertension of the newborn. The

Inhaled Nitric Oxide Study Group. N Engl J Med. 1997;336:605–10.

5. Butler AR, Feelisch M. Therapeutic uses of inorganic nitrite and nitrate: from the past to the future.

Circulation [Internet]. 2008 Apr 22 [cited 2014 Mar 10];117(16):2151–9. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18427145

6. Benjamin N, O’Driscoll F, Dougall H, Duncan C, Smith L, Golden M, et al. Stomach NO synthesis.

Nature [Internet]. 1994 Apr 7 [cited 2014 Mar 14];368(6471):502. Available from:

http://dx.doi.org/10.1038/368502a0

7. Lundberg J, Weitzberg E, Lundberg J, Alving K. Intragastric nitric oxide production in humans:

measurements in expelled air. Gut [Internet]. 1994 [cited 2014 Mar 14];0:1543–6. Available from:

http://gut.bmj.com/content/35/11/1543.abstract

8. Zweier JL, Wang P, Samouilov A, Kuppusamy P. Enzyme-independent formation of nitric oxide in

biological tissues. Nat Med. 1995;1:804–9.

9. Cosby K, Partovi KS, Crawford JH, Patel RP, Reiter CD, Martyr S, et al. Nitrite reduction to nitric oxide

by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nat Med [Internet]. 2003 Dec [cited 2014 Feb

19];9(12):1498–505. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14595407

10. Kevil CG, Kolluru GK, Pattillo CB, Giordano T. Inorganic nitrite therapy: historical perspective and

future directions. Free Radic Biol Med [Internet]. Elsevier Inc.; 2011 Aug 1 [cited 2013 Jun

18];51(3):576–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21619929

11. Hoshida S, Yamashita N, Igarashi J, Nishida M, Hori M, Kamada T, et al. Nitric oxide synthase protects

the heart against ischemia-reperfusion injury in rabbits. J Pharmacol Exp Ther [Internet]. 1995 Jul 1

[cited 2014 Mar 15];274(1):413–8. Available from: http://jpet.aspetjournals.org/content/274/1/413.short

12. Duranski MR, Greer JJM, Dejam A, Jaganmohan S, Hogg N, Langston W, et al. Cytoprotective effects

of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver. J Clin Invest [Internet]. 2005

May;115(5):1232–40. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1077170&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

13. Dejam A, Hunter CJ, Pelletier MM, Hsu LL, Machado RF, Shiva S, et al. Erythrocytes are the major

intravascular storage sites of nitrite in human blood. Blood [Internet]. 2005 Jul 15 [cited 2014 Mar

24];106(2):734–9. Available from:

50

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1895176&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

14. Shiva S, Wang X, Ringwood LA, Xu X, Yuditskaya S, Annavajjhala V, et al. Ceruloplasmin is a NO

oxidase and nitrite synthase that determines endocrine NO homeostasis. Nat Chem Biol [Internet].

Nature Publishing Group; 2006 Sep [cited 2014 Mar 23];2(9):486–93. Available from:

http://dx.doi.org/10.1038/nchembio813

15. Lundberg JO, Gladwin MT, Ahluwalia A, Benjamin N, Bryan NS, Butler A, et al. Nitrate and nitrite in

biology, nutrition and therapeutics. Nat Chem Biol [Internet]. Nature Publishing Group; 2009 Dec [cited

2014 Mar 24];5(12):865–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nchembio.260

16. Lundberg JO, Govoni M. Inorganic nitrate is a possible source for systemic generation of nitric oxide.

Free Radic Biol Med [Internet]. 2004 Aug 1 [cited 2014 Mar 23];37(3):395–400. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15223073

17. Lundberg JO, Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and

therapeutics. Nat Rev Drug Discov [Internet]. 2008 Feb [cited 2014 Jan 21];7(2):156–67. Available

from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18167491

18. Hendgen-Cotta UB, Luedike P, Totzeck M, Kropp M, Schicho A, Stock P, et al. Dietary nitrate

supplementation improves revascularization in chronic ischemia. Circulation [Internet]. 2012 Oct 16

[cited 2014 Mar 24];126(16):1983–92. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992322

19. Larsen FJ, Ekblom B, Sahlin K, Lundberg JO, Weitzberg E. Effects of dietary nitrate on blood pressure

in healthy volunteers. N Engl J Med [Internet]. 2006 Dec 28 [cited 2014 Mar 24];355(26):2792–3.

Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17192551

20. Ghosh SM, Kapil V, Fuentes-Calvo I, Bubb KJ, Pearl V, Milsom AB, et al. Enhanced vasodilator

activity of nitrite in hypertension: critical role for erythrocytic xanthine oxidoreductase and translational

potential. Hypertension [Internet]. 2013 May 15 [cited 2014 Mar 24];61(5):1091–102. Available from:

http://hyper.ahajournals.org/content/early/2013/04/15/HYPERTENSIONAHA.111.00933.

21. Larsen FJ, Weitzberg E, Lundberg JO, Ekblom B. Effects of dietary nitrate on oxygen cost during

exercise. Acta Physiol (Oxf) [Internet]. 2007 Sep [cited 2014 Mar 1];191(1):59–66. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17635415

22. Rassaf T, Heiss C, Mangold S, Leyendecker T, Kehmeier ES, Kelm M, et al. Vascular formation of

nitrite after exercise is abolished in patients with cardiovascular risk factors and coronary artery disease.

J Am Coll Cardiol [Internet]. Journal of the American College of Cardiology; 2010 Apr 6 [cited 2014

Mar 24];55(14):1502–3. Available from: http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1142692

23. Kehmeier ES, Kropp M, Kleinbongard P, Lauer T, Balzer J, Merx MW, et al. Serial measurements of

whole blood nitrite in an intensive care setting. Free Radic Biol Med [Internet]. 2008 Jun 1 [cited 2014

Mar 24];44(11):1945–50. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18374662

24. Shiva S. Nitrite: A Physiological Store of Nitric Oxide and Modulator of Mitochondrial Function. Redox

Biol [Internet]. 2013 Jan [cited 2014 Jan 24];1(1):40–4. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3661298&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

25. Rocha BS, Gago B, Barbosa RM, Laranjinha J. Dietary polyphenols generate nitric oxide from nitrite in

the stomach and induce smooth muscle relaxation. Toxicology [Internet]. 2009 Nov 9 [cited 2014 Apr

9];265(1-2):41–8. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300483X09004818

51

26. Bueno M, Wang J, Mora AL, Gladwin MT. Nitrite signaling in pulmonary hypertension: mechanisms of

bioactivation, signaling, and therapeutics. Antioxid Redox Signal [Internet]. 2013 May 10 [cited 2013

Jun 21];18(14):1797–809. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22871207

27. Voet, D. (2008) Fundamentals of Biochemistry, 3rd. ed., Fig. 07_06, John Wiley & Sons [Internet].

[cited 2014 Apr 1]. Available from: http://eu.wiley.com/WileyCDA/WileyTitle/productCd-

0470228423.html?filter=TEXTBOOK

28. Burmester T, Weich B, Reinhardt S, Hankeln T. A vertebrate globin expressed in the brain. Nature

[Internet]. 2000 Sep 28 [cited 2014 Apr 3];407(6803):520–3. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11029004

29. Brooks J. The Action of Nitrite on Haemoglobin in the Absence of Oxygen. Proc R Soc B Biol Sci

[Internet]. 1937 Aug 3 [cited 2014 Apr 14];123(832):368–82. Available from:

http://rspb.royalsocietypublishing.org/cgi/doi/10.1098/rspb.1937.0057

30. Gödecke A, Molojavyi A, Heger J, Flögel U, Ding Z, Jacoby C, et al. Myoglobin protects the heart from

inducible nitric-oxide synthase (iNOS)-mediated nitrosative stress. J Biol Chem [Internet]. 2003 Jun 13

[cited 2014 Apr 3];278(24):21761–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12665503

31. Van Doorslaer S, Dewilde S, Kiger L, Nistor S V., Goovaerts E, Marden MC, et al. Nitric Oxide Binding

Properties of Neuroglobin: A CHARACTERIZATION BY EPR AND FLASH PHOTOLYSIS. J Biol

Chem [Internet]. 2003 Feb 14 [cited 2014 Apr 3];278(7):4919–25. Available from:

http://www.jbc.org/content/278/7/4919.short

32. Huang Z, Shiva S, Kim-Shapiro DB, Patel RP, Ringwood LA, Irby CE, et al. Enzymatic function of

hemoglobin as a nitrite reductase that produces NO under allosteric control. J Clin Invest [Internet]. 2005

Aug [cited 2014 Mar 30];115(8):2099–107. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1177999&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

33. Shiva S, Huang Z, Grubina R, Sun J, Ringwood LA, MacArthur PH, et al. Deoxymyoglobin is a nitrite

reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circ Res [Internet]. 2007

Mar 16 [cited 2014 Mar 3];100(5):654–61. Available from:

http://circres.ahajournals.org/content/100/5/654.long

34. Giuffrè A, Moschetti T, Vallone B, Brunori M. Neuroglobin: enzymatic reduction and oxygen affinity.

Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2008 Mar 21 [cited 2014 Apr 14];367(4):893–8. Available

from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18198128

35. Castiglione N, Rinaldo S, Giardina G, Stelitano V, Cutruzzolà F. Nitrite and nitrite reductases: from

molecular mechanisms to significance in human health and disease. Antioxid Redox Signal [Internet].

2012 Aug 15 [cited 2013 Jun 20];17(4):684–716. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22304560

36. Patel RP, Hogg N, Kim-Shapiro DB. The potential role of the red blood cell in nitrite-dependent

regulation of blood flow. Cardiovasc Res [Internet]. 2011 Feb 15 [cited 2014 Apr 14];89(3):507–15.

Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3028972&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

37. Huang KT, Keszler A, Patel N, Patel RP, Gladwin MT, Kim-Shapiro DB, et al. The reaction between

nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. J Biol Chem

[Internet]. 2005 Sep 2 [cited 2014 Apr 1];280(35):31126–31. Available from:

http://www.jbc.org/content/280/35/31126.long

38. Totzeck M, Hendgen-Cotta UB, Luedike P, Berenbrink M, Klare JP, Steinhoff H-J, et al. Nitrite

regulates hypoxic vasodilation via myoglobin-dependent nitric oxide generation. Circulation [Internet].

52

2012 Jul 17 [cited 2014 Mar 20];126(3):325–34. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3410747&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

39. Liu J, Yu Z, Guo S, Lee S-R, Xing C, Zhang C, et al. Effects of neuroglobin overexpression on

mitochondrial function and oxidative stress following hypoxia/reoxygenation in cultured neurons. J

Neurosci Res [Internet]. 2009 Jan [cited 2014 Apr 5];87(1):164–70. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2631383&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

40. Sun Y, Jin K, Peel A, Mao XO, Xie L, Greenberg D a. Neuroglobin protects the brain from experimental

stroke in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2003 Mar 18;100(6):3497–500. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21441145

41. Petersen MG, Dewilde S, Fago A. Reactions of ferrous neuroglobin and cytoglobin with nitrite under

anaerobic conditions. J Inorg Biochem [Internet]. 2008 Sep [cited 2014 Apr 2];102(9):1777–82.

Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18599123

42. Tiso M, Tejero J, Basu S, Azarov I, Wang X, Simplaceanu V, et al. Human neuroglobin functions as a

redox-regulated nitrite reductase. J Biol Chem [Internet]. 2011 May 20 [cited 2014 Apr

2];286(20):18277–89. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3093900&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

43. Thompson-Gorman SL, Zweier JL. Evaluation of the role of xanthine oxidase in myocardial reperfusion

injury. J Biol Chem [Internet]. 1990 Apr 25 [cited 2014 Apr 7];265(12):6656–63. Available from:

http://www.jbc.org/content/265/12/6656.abstract?ijkey=2a6fea9cce020333bce617f4e099c3b5f553fc42&

keytype2=tf_ipsecsha

44. Millar TM, Stevens CR, Benjamin N, Eisenthal R, Harrison R, Blake DR. Xanthine oxidoreductase

catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Lett

[Internet]. 1998 May [cited 2014 Apr 7];427(2):225–8. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001457939800430X

45. Webb A, Bond R, McLean P, Uppal R, Benjamin N, Ahluwalia A. Reduction of nitrite to nitric oxide

during ischemia protects against myocardial ischemia-reperfusion damage. Proc Natl Acad Sci U S A

[Internet]. 2004 Sep 14 [cited 2014 Mar 21];101(37):13683–8. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=518813&tool=pmcentrez&rendertype=abstra

ct

46. Lu P, Liu F, Yao Z, Wang C-Y, Chen D-D, Tian Y, et al. Nitrite-derived nitric oxide by xanthine

oxidoreductase protects the liver against ischemia-reperfusion injury. Hepatobiliary Pancreat Dis Int

[Internet]. 2005 Aug [cited 2014 Apr 3];4(3):350–5. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16109514

47. Baker JE, Su J, Fu X, Hsu A, Gross GJ, Tweddell JS, et al. Nitrite confers protection against myocardial

infarction: role of xanthine oxidoreductase, NADPH oxidase and K(ATP) channels. J Mol Cell Cardiol

[Internet]. 2007 Oct [cited 2014 Mar 20];43(4):437–44. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2735077&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

48. Li H, Kundu TK, Zweier JL. Characterization of the magnitude and mechanism of aldehyde oxidase-

mediated nitric oxide production from nitrite. J Biol Chem [Internet]. 2009 Dec 4 [cited 2014 Apr

7];284(49):33850–8. Available from: http://www.jbc.org/content/284/49/33850.long

49. Nohl H, Staniek K, Sobhian B, Bahrami S, Redl H, Kozlov A V. Mitochondria recycle nitrite back to the

bioregulator nitric monoxide. Acta Biochim Pol [Internet]. 2000 Jan [cited 2014 Apr 8];47(4):913–21.

Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11996114

53

50. Castello PR, David PS, McClure T, Crook Z, Poyton RO. Mitochondrial cytochrome oxidase produces

nitric oxide under hypoxic conditions: implications for oxygen sensing and hypoxic signaling in

eukaryotes. Cell Metab [Internet]. Elsevier; 2006 Apr 4 [cited 2014 Mar 19];3(4):277–87. Available

from: http://www.cell.com/article/S1550413106000714/fulltext

51. Basu S, Azarova NA, Font MD, King SB, Hogg N, Gladwin MT, et al. Nitrite reductase activity of

cytochrome c. J Biol Chem [Internet]. 2008 Nov 21 [cited 2014 Apr 2];283(47):32590–7. Available

from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2583304&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

52. Aamand R, Dalsgaard T, Jensen FB, Simonsen U, Roepstorff A, Fago A. Generation of nitric oxide from

nitrite by carbonic anhydrase: a possible link between metabolic activity and vasodilation. Am J Physiol

Heart Circ Physiol [Internet]. 2009 Dec [cited 2014 Apr 14];297(6):H2068–74. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19820197

53. Vanin AF, Bevers LM, Slama-Schwok A, van Faassen EE. Nitric oxide synthase reduces nitrite to NO

under anoxia. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2007 Jan [cited 2014 Apr 14];64(1):96–103. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17160351

54. Hendgen-Cotta UB, Merx MW, Shiva S, Schmitz J, Becher S, Klare JP, et al. Nitrite reductase activity

of myoglobin regulates respiration and cellular viability in myocardial ischemia-reperfusion injury. Proc

Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2008 Jul 22 [cited 2014 Mar 9];105(29):10256–61. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2481313&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

55. Hearse DJ, Humphrey SM, Chain EB. Abrupt reoxygenation of the anoxic potassium-arrested perfused

rat heart: a study of myocardial enzyme release. J Mol Cell Cardiol [Internet]. 1973 Aug [cited 2014 Mar

18];5(4):395–407. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4355339

56. Ambrosio G, Zweier JL, Duilio C, Kuppusamy P, Santoro G, Elia PP, et al. Evidence that mitochondrial

respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit hearts subjected to

ischemia and reflow. J Biol Chem [Internet]. 1993 Sep 5 [cited 2014 Mar 18];268(25):18532–41.

Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8395507

57. E G, A K. Mitochondrial respiration at low levels of oxygen and cytochrome c. Portland Press Ltd.; 2001

Apr 1 [cited 2014 Mar 18]; Available from:

http://www.biochemsoctrans.org/bst/030/0252/bst0300252.htm

58. Burwell LS, Nadtochiy SM, Tompkins AJ, Young S, Brookes PS. Direct evidence for S-nitrosation of

mitochondrial complex I. Biochem J [Internet]. 2006 Mar 15 [cited 2014 Feb 18];394(Pt 3):627–34.

Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1383712&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

59. Zweier J, Kuppusamy P, Williams R, Rayburn B, Smith D, Weisfeldt M, et al. Measurement and

characterization of postischemic free radical generation in the isolated perfused heart. J Biol Chem

[Internet]. 1989 Nov 15 [cited 2014 Mar 18];264(32):18890–5. Available from:

http://www.jbc.org/content/264/32/18890.abstract?ijkey=0d1663d41788474cc6c9486284eea96ac45cbbd

0&keytype2=tf_ipsecsha

60. Shiva S, Sack MN, Greer JJ, Duranski M, Ringwood L a, Burwell L, et al. Nitrite augments tolerance to

ischemia/reperfusion injury via the modulation of mitochondrial electron transfer. J Exp Med [Internet].

2007 Sep 3 [cited 2014 Mar 3];204(9):2089–102. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2118713&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

54

61. Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, Watanabe M, Nishimaki K, Yamagata K, et al. Hydrogen acts as a

therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med [Internet]. 2007 Jun

[cited 2014 Jan 24];13(6):688–94. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17486089

62. Halestrap AP. A pore way to die: the role of mitochondria in reperfusion injury and cardioprotection.

Biochem Soc Trans [Internet]. 2010 Aug [cited 2014 Mar 23];38(4):841–60. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20658967

63. Dezfulian C, Shiva S, Alekseyenko A, Pendyal A, Beiser DG, Munasinghe JP, et al. Nitrite therapy after

cardiac arrest reduces reactive oxygen species generation, improves cardiac and neurological function,

and enhances survival via reversible inhibition of mitochondrial complex I. Circulation [Internet]. 2009

Sep 8 [cited 2014 Mar 18];120(10):897–905. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2755623&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

64. Raat NJH, Noguchi AC, Liu VB, Raghavachari N, Liu D, Xu X, et al. Dietary nitrate and nitrite

modulate blood and organ nitrite and the cellular ischemic stress response. Free Radic Biol Med

[Internet]. 2009 Sep 1 [cited 2014 Mar 18];47(5):510–7. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584909002950

65. Poderoso J. Nitric Oxide Inhibits Electron Transfer and Increases Superoxide Radical Production in Rat

Heart Mitochondria and Submitochondrial Particles. Arch Biochem Biophys [Internet]. 1996 Apr 1

[cited 2014 Mar 18];328(1):85–92. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003986196901460

66. Clerc P, Rigoulet M, Leverve X, Fontaine E. Nitric oxide increases oxidative phosphorylation efficiency.

J Bioenerg Biomembr [Internet]. 2007 Apr [cited 2014 Feb 11];39(2):158–66. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17447126

67. Vanden Hoek TL. Reactive Oxygen Species Released from Mitochondria during Brief Hypoxia Induce

Preconditioning in Cardiomyocytes. J Biol Chem [Internet]. AMER SOC BIOCHEMISTRY

MOLECULAR BIOLOGY INC, 9650 ROCKVILLE PIKE, BETHESDA, MD 20814 USA; 1998 Jul 17

[cited 2014 Mar 2];273(29):18092–8. Available from:

http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=5&SI

D=T1Fok1GCC23dhjWLucW&page=1&doc=2

68. Bolli R, Dawn B, Tang XL, Qiu Y, Ping P, Xuan YT, et al. The nitric oxide hypothesis of late

preconditioning. Basic Res Cardiol [Internet]. 1998 Oct [cited 2014 Mar 22];93(5):325–38. Available

from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3701309&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

69. Zmijewski JW, Banerjee S, Bae H, Friggeri A, Lazarowski ER, Abraham E. Exposure to hydrogen

peroxide induces oxidation and activation of AMP-activated protein kinase. J Biol Chem [Internet]. 2010

Oct 22 [cited 2014 Mar 19];285(43):33154–64. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2963401&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

70. Xu Z, Ji X, Boysen PG. Exogenous nitric oxide generates ROS and induces cardioprotection:

involvement of PKG, mitochondrial KATP channels, and ERK. Am J Physiol Heart Circ Physiol

[Internet]. 2004 Apr 1 [cited 2014 Mar 22];286(4):H1433–40. Available from:

http://ajpheart.physiology.org/content/286/4/H1433

71. Ong S-B, Subrayan S, Lim SY, Yellon DM, Davidson SM, Hausenloy DJ. Inhibiting mitochondrial

fission protects the heart against ischemia/reperfusion injury. Circulation [Internet]. 2010 May 11 [cited

2014 Mar 19];121(18):2012–22. Available from: http://circ.ahajournals.org/content/121/18/2012.long

55

72. Kamga Pride C, Mo L, Quesnelle K, Dagda RK, Murillo D, Geary L, et al. Nitrite activates protein

kinase A in normoxia to mediate mitochondrial fusion and tolerance to ischaemia/reperfusion.

Cardiovasc Res [Internet]. 2014 Jan 1 [cited 2014 Mar 5];101(1):57–68. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24081164

73. Bryan NS, Calvert JW, Elrod JW, Gundewar S, Ji SY, Lefer DJ. Dietary nitrite supplementation protects

against myocardial ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2007 Nov 27 [cited

2014 Mar 19];104(48):19144–9. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2141922&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

74. Modin A, Björne H, Herulf M, Alving K, Weitzberg E, Lundberg JO. Nitrite-derived nitric oxide: a

possible mediator of “acidic-metabolic” vasodilation. Acta Physiol Scand [Internet]. 2001 Jan [cited

2014 Apr 9];171(1):9–16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11350258

75. Gonzalez FM, Shiva S, Vincent PS, Ringwood LA, Hsu L-Y, Hon YY, et al. Nitrite anion provides

potent cytoprotective and antiapoptotic effects as adjunctive therapy to reperfusion for acute myocardial

infarction. Circulation [Internet]. 2008 Jun 10 [cited 2014 Mar 24];117(23):2986–94. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2587279&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

76. Tripatara P, Patel NSA, Webb A, Rathod K, Lecomte FMJ, Mazzon E, et al. Nitrite-derived nitric oxide

protects the rat kidney against ischemia/reperfusion injury in vivo: role for xanthine oxidoreductase. J

Am Soc Nephrol [Internet]. 2007 Feb 1 [cited 2014 Apr 12];18(2):570–80. Available from:

http://jasn.asnjournals.org/content/18/2/570.long

77. Jung K-H, Chu K, Ko S-Y, Lee S-T, Sinn D-I, Park D-K, et al. Early intravenous infusion of sodium

nitrite protects brain against in vivo ischemia-reperfusion injury. Stroke [Internet]. 2006 Nov [cited 2014

Apr 14];37(11):2744–50. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17008610

78. Raat NJH, Shiva S, Gladwin MT. Effects of nitrite on modulating ROS generation following ischemia

and reperfusion. Adv Drug Deliv Rev [Internet]. Elsevier B.V.; 2009 Apr [cited 2014 Feb

11];61(4):339–50. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0169409X09000283

79. Yasmin W. Generation of peroxynitrite contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts.

Cardiovasc Res [Internet]. 1997 Feb 1 [cited 2014 Apr 13];33(2):422–32. Available from:

http://cardiovascres.oxfordjournals.org/content/33/2/422.long

80. Basireddy M, Isbell TS, Teng X, Patel RP, Agarwal A. Effects of sodium nitrite on ischemia-reperfusion

injury in the rat kidney. Am J Physiol Renal Physiol [Internet]. 2006 Apr [cited 2014 Apr

12];290(4):F779–86. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16278276

81. Elrod JW, Calvert JW, Gundewar S, Bryan NS, Lefer DJ. Nitric oxide promotes distant organ protection:

evidence for an endocrine role of nitric oxide. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2008 Aug 12 [cited

2014 Apr 13];105(32):11430–5. Available from: http://www.pnas.org/content/105/32/11430.full

82. Roberts BW, Mitchell J, Kilgannon JH, Chansky ME, Trzeciak S. Nitric oxide donor agents for the

treatment of ischemia/reperfusion injury in human subjects: a systematic review. Shock [Internet]. 2013

Mar [cited 2014 Feb 5];39(3):229–39. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23358103

83. Pluta RM, Oldfield EH, Bakhtian KD, Fathi AR, Smith RK, Devroom HL, et al. Safety and feasibility of

long-term intravenous sodium nitrite infusion in healthy volunteers. PLoS One [Internet]. 2011 Jan [cited

2014 Apr 8];6(1):e14504. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3018414&tool=pmcentrez&rendertype=abstr

act

84. Siddiqi N, Neil C, Bruce M, Maclennan G, Cotton S, Papadopoulou S, et al. Intravenous sodium nitrite

in acute ST-elevation myocardial infarction: a randomized controlled trial (NIAMI). Eur Heart J

56

[Internet]. 2014 Mar 17 [cited 2014 Mar 23]; Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24639423

85. Jung K-H, Chu K, Lee S-T, Park H-K, Kim J-H, Kang K-M, et al. Augmentation of nitrite therapy in

cerebral ischemia by NMDA receptor inhibition. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2009 Jan 16

[cited 2014 Apr 14];378(3):507–12. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08022705

86. Jung K-H, Chu K, Lee S-T, Sunwoo J-S, Park D-K, Kim J-H, et al. Effects of long term nitrite therapy

on functional recovery in experimental ischemia model. Biochem Biophys Res Commun [Internet].

Elsevier Inc.; 2010 Dec 3 [cited 2014 Apr 14];403(1):66–72. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21040706

87. Jung K-H, Chu K, Lee S-T, Kim J-M, Park D-K, Kim M, et al. Tolerated nitrite therapy in experimental

intracerebral hemorrhage: Rationale of nitrite therapy in a broad range of hyperacute strokes. Neurochem

Int [Internet]. Elsevier B.V.; 2011 Aug [cited 2014 Apr 14];59(1):5–9. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21672590

88. Fathi AR, Pluta RM, Bakhtian KD, Qi M, Lonser RR. Reversal of cerebral vasospasm via intravenous

sodium nitrite after subarachnoid hemorrhage in primates. J Neurosurg [Internet]. American Association

of Neurological Surgeons; 2011 Dec 1 [cited 2014 Apr 15];115(6):1213–20. Available from:

http://thejns.org/doi/abs/10.3171/2011.7.JNS11390?url_ver=Z39.88-

2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub=pubmed

89. Oldfield EH, Loomba JJ, Monteith SJ, Crowley RW, Medel R, Gress DR, et al. Safety and

pharmacokinetics of sodium nitrite in patients with subarachnoid hemorrhage: a phase IIa study. J

Neurosurg [Internet]. American Association of Neurological Surgeons; 2013 Sep 30 [cited 2014 Apr

15];119(3):634–41. Available from:

http://thejns.org/doi/abs/10.3171/2013.3.JNS13266?url_ver=Z39.88-

2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub=pubmed&

90. Hausenloy DJ, Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. J

Clin Invest [Internet]. American Society for Clinical Investigation; 2013 Jan 2 [cited 2014 Mar

19];123(1):92–100. Available from: http://www.jci.org/articles/view/62874