EDNA Validering 080115

8/18/2019 EDNA Validering 080115

1/22

Evaluering af eDNA detektion til

overvågning af vandhulsarter


2/22

Indhold

1. SAMMENFATNING (2012-2014).................................................................. 3 2. BAGGRUND ................................................................................................... 6

3. METODER ...................................................................................................... 7

3.1 Vandkalve lokaliteter og overvågningstidspunkt ..................................... 7

3.2 Løgfrø lokaliteter 2014 ........................................................................... 8

3.3 Overvågning med konventionelle metoder .............................................. 8 3.4 eDNA prøvetagning ................................................................................ 9

Etanol fældning ....................................................................................... 9 Sterivex filtrering .................................................................................... 9

Amphiltrator sampling ............................................................................ 9

3.5 eDNA ekstraktion ................................................................................. 10

3.6 Tolkning og evaluering af eDNA resultater ........................................... 11

4. RESULTATER .............................................................................................. 13

4.1 bred vandkalv og lys skivevandkalv (feltundersøgelser) ........................ 13 4.2 Lys skivevandkalv Graphoderus bilineatus (eDNA resultater) .............. 14

4.3 Bred vandkalv Dysticus latissimus (eDNA resultater) ........................... 15 4.4 Sammenfatning af resultater for vandkalve............................................ 16

4.5 Løgfrø 2013 (ny præsentation af data) ................................................... 17 4.6 Løgfrø 2014 .......................................................................................... 18

4.7 Stor vandsalamander 2014 .................................................................... 19 4.8 Spidssnudet frø 2014 ............................................................................. 20

5. PERSPEKTIVER OG FORSLAG TIL VIDERE ARBEJDE ..................... 21

6. REFERENCER ............................................................................................. 22

Forsidefoto: Løgfrø (Martin Hesselsøe), stor kærguldsmed, lys skivevandkalv, bred

vandkalv (Lars L. Iversen), stor vandsalamander (Kåre Fog)

Rekvirent: Naturstyrelsen

Feltarbejde og prøveindsamling: Lars L. Iversen, Jos Kielgast, Lars Chr. Adrados og Morten Larsen.

Laboratoriearbejde: Vibeke Rudkjøbing og Morten Larsen

Tekst: Martin Hesselsøe, Vibeke Rudkjøbing, Lars L. Iversen og Jos Kielgast.

Version: 1. udgave 8. januar 2015


3/22

www.amphi-consult.dk

3

1. Sammenfatning (2012-2014) Ny forskning har vist, at DNA i miljøet (eDNA) kan anvendes til overvågning af dyr

som lever i vand. Amphi Consult har undersøgt mulighederne for, at Naturstyrelsen kan

anvende denne teknologi til overvågning af vandlevende dyrearter.

De anvendte laboratoriemetoder til detektion af artsspecifik eDNA (”eDNA

detektionssystemer”) er udviklet, optimeret og testet af forskere fra Købehavns

Universitet i samarbejde med Amphi Consult. Dette udviklingsarbejde er ikke en del af

den aktuelle opgave. Opgaven for Naturstyrelsen har alene fokuseret på at sammenligne

eDNA metoder med den konventionelle naturovervågning (”validering”).

Undersøgelserne i 2012, 2013 og 2014 var rettet mod udvalgte internationalt beskyttede

vandlevende padder og insekter (stor vandsalamander, løgfrø, stor kærguldsmed, bred

vandkalv og lys skivevandkalv). Disse arter indgår alle i Naturstyrelsens nationale

overvågningsprogram NOVANA.

Alle de undersøgte dyrearter lever i ferskvand. På de undersøgte lokaliteter blev arterneeftersøgt dels med konventionelle metoder (fiskenet, lytteudstyr mm.) og dels ved

eftersøgning af DNA, med henblik på sammenligning af resultaterne fra de to metoder.

De konventionelle undersøgelser blev alle udført af de mest anerkendte eksperter iDanmark.

For stor vandsalamander viste resultaterne i 2012 næsten komplet sammenfald (op til

97%) mellem resultatet af den konventionelle undersøgelse og eDNA-analysen.

Metoden er således klar til at bruge ved kvalitativ overvågning af denne art med de

procedure som de positive resultater er opnået ved.

Løgfrø overvågning med eDNA havde en mindre overensstemmelse med de konven-

tionelle undersøgelser end stor vandsalamander. To forskellige eDNA detektions-systemer til løgfrø er derfor afprøvet i 2012, 2013 og 2014. Særligt det ene system

(nyudviklet i 2013) peger på stor overensstemmelse mellem DNA resultat og

feltundersøgelse, men kun i de prøver, hvor der er relativt meget DNA. Det første

detektionssystem til løgfrø, som blev publiceret i 2012 (Thomsen et al. 2012), kan

tilsyneladende give falske positive resultater i nogle tilfælde, og dette detektionssystem bør derfor fremover anvendes med stor forsigtighed. Alle kvantitative DNA målinger

udført i 2013 og 2014 har vist, at mængden af DNA fra løgfrø i de fleste analyserede prøver var meget lavt, og tæt på metodens detektionsgrænse. I de lokaliteter med >10

kvækkende løgfrøer, er der i alle tilfælde et positivt eDNA signal, og eDNA mængden

(udtrykt som eDNA-index) varierer i nogen grad med antallet af observerede dyr.

Således ses entydigt de højeste koncentrationer af eDNA i lokaliteter med flestobserverede dyr.Til gengæld tyder resultaterne på, at metoden stadig er mindre følsom

end den dygtige feltbiolog, hvis bestanden af løgfrøer er lille.

Overvågningen af stor kærguldsmed med eDNA metoden var også mindre effektiv end

stor vandsalamander. Konventionel overvågning dokumenterede arten dobbelt så mange

steder som eDNA metoden ved undersøgelsen i 2012. DNA metoden påviste DNA fra

stor kærguldsmed i tre lokaliteter (6%), hvor denne art ikke var observeret ved

feltundersøgelsen.

For vandkalvene (bred vandkalv og lys skivevandkalv) er prøver indsamlet i 2013 og

analyseret i 2014. Med eDNA metoden blev der detekteret forekomst på 3 ud af 17

lokaliteter, hvor lys skivevandkalv blev fundet af feltbiologen. For bred vandkalv


4/22


4

( Dysticus latissimus) blev der fundet eDNA i 10 ud af 15 lokaliteter, hvor arten blev

fundet af feltbiologen. Bedste DNA resultater blev opnået ved prøvetagning om foråret.Af de 19 lokaliteter undersøgt for vandbiller, har DNA metoden kun påvist DNA fra de

beskyttede vandkalve i to lokaliteter, hvor arterne ikke er observeret ved

feltundersøgelsen.

Som supplement er udvalgte prøver i 2014 analyseret med et nyudviklet eDNA

detektionssystem rettet mod spidssnudet frø. Resultaterne af disse analyser viser forførste gang, at det er muligt også at detektere denne art ved brug af eDNA. Dette på

trods af, at prøverne blev indsamlet sent på sæsonen hvor haletudser af spidssnudet frø

forlader vandet.

Analyserne udført i 2014 af eDNA fra stor vandsalamander og løgfrø anviser forslag til

kvantitativ præsentation af analyseresultaterne baseret på et beregnet DNA-index.DNA-index indikerer koncentrationen af artsspecifik eDNA i prøven i forhold til

detektionsgrænsen. DNA-index kan anvendes til at sammenligne prøver fra forskellige

lokaliteter, når de analyseres med samme eDNA detektionsmetode, og på samme

analyseplade. De kvantitative resultater indikerer, at de største koncentrationer af eDNA

er fundet i lokaliteter hvor feltbiologen har observeret flest dyr. Dette er et potentielt perspektiv for eDNA metodens fremtidige anvendelse. Der kræves dog flere

undersøgelser for at dokumentere det kvantitative potentiale yderligere.

Generelt viser resultaterne at de eDNA detektionssystemer som anbefales anvendt, ikke

giver anledning til falske positive resultater. Der er kun få eksempler på positive

resultater fra lokaliteter, hvor arterne ikke er registreret ved den konventionelle

undersøgelse. Dermed er eDNA metodens sensitivitet i forhold til lave koncentrationer

af artsspecifikt eDNA i prøven det største problem for anvendelsen. Der er i 2014 vist

resultater fra to forskellige metoder til opkoncentrering af eDNA før analyse

(Amphiltrator og Sterivex). Disse to metoder har vist at øget prøvetagningsvolumen

øger eDNA signalet, sammenlignet med den hidtidigt anvendte metode (etanolfældning). Der er vist eksempler på at Sterivex metoden giver op til 5x mere targeteDNA og Amphiltrator op til 10x mere target eDNA end etanol fældning. Derudover er

der en række prøver hvor der slet ikke registreres et eDNA signal uden anvendelse af

opkoncentreringsmetoderne.

På den baggrund er det afgørende fortsat at arbejde med forbedring og afprøvning afmetoder til prøvetagning og opkoncentrering af eDNA fra vandprøver i felten og/eller i

laboratoriet. Det er sandsynligt at disse opkoncentreringsmetoder kan forbedresvæsentligt. Forbedringer vil kunne afprøves i den kommende sæson 2015.

Generelt viser resultatet af undersøgelserne gennemført fra 2012-2014 at eDNA

metoden har potentiale for anvendelse i naturovervågning, men at dette potentiale erforskelligt fra art til art. Analyse af eDNA til naturovervågning omfatter en række

perspektiver. Fx kan man forvente at det optimale tidspunkt for prøvetagning til DNA

analyse er mindre vejrafhængigt i forhold til de konventionelle undersøgelser, der typisk

kun kan udføres under særlige vejrforhold. Man må dog også være opmærksom på, at

anvendelse af eDNA-metoden kan introducere nye usikkerheder, fx i forhold til

ombytning af analyser, samt at DNA-analysen naturligvis ikke giver relevante

informationer om lokaliteternes fysiske og øvrige biologiske forhold. Yderligere er det

et problem, at DNA-analysen i nogle prøver på nuværende tidspunkt ikke kan

gennemføres, på grund af inhiberende stoffer i vandet.

De næste skridt før implementering af metoderne i Naturstyrelsens overvågningsarbejde

kan være:


5/22


5

o Stor vandsalamander: Metoden kan implementeres kvalitativt umiddelbart ved

anvendelse af de protokoller som er anvendt i nærværende undersøgelser. Detanbefales at udføre supplerende undersøgelser i 2015, for at dokumentere eDNA

metodens kvantitative muligheder i forhold til overvågningen.

o Løgfrø og invertebrater: Fremtidig fokus bør rettes mod forbedret indsamling,

opkoncentrering og DNA ekstraktionsmetode. Resultaterne bør fortsat

sammenlignes med den eksisterende overvågning fx i NOVANA programmet.o Andre arter: Det anbefales i 2015 at fokusere på valideringsstudier i forhold til

andre arter, hvor der er nyudviklede og allerede afprøvede eDNA

detektionssystemer til rådighed. Amphi Consult har aktuelt detektionssystemerfor følgende relevante arter til rådighed for validering: Spidssnudet frø,

springfrø, løvfrø, klokkefrø, strandtudse, grønbroget tudse.


6/22


6

2. Baggrund Amphi Consult har i 2012 og 2013 testet en nyudviklet overvågningsmetode baseret på

eDNA. Metoden er sammenlignet med den eksisterende NOVANA overvågning af stor

vandsalamander og andre vandhulsarter (fx løgfrø). Resultaterne blev afrapporteret til

NST i januar 2013 og januar 2014 (Amphi Consult, 2013 og 2014).

For stor vandsalamander var der næsten komplet sammenfald (97%) mellem resultatet

af den konventionelle undersøgelse og eDNA-analysen. Metoden er således klar til at

bruge ved kvalitativ overvågning af denne art.

For øvrige arter viste arbejdet i 2012 og 2013, at der endnu er en række begrænsninger.

På den baggrund har Naturstyrelsen i 2014 rekvireret enkelte supplerende undersøgelser

og analyser. Dette omfatter dels analyse af prøver indsamlet i 2013 og dels indsamling

af nye prøver til analyse i 2014 som følger:

o DNA-analyser er i 2014 udført af vandprøver indsamlet i 2013 i vandprøver fra

lokaliteter med beskyttede arter af vandkalve: Bred vandkalv ( Dytiscuslatissimus) og lys skivevandkalv (Graphoderus bilineatus).

o Afprøvning af ny metode til opkoncentrering af DNA i 20 lokaliteter som

indgik i NOVANA overvågningen af løgfrø i 2014.

Denne rapport præsenterer resultatet af de undersøgelser og analyser som er udført i

2014.

Resultater der tidligere er afrapporteret fra 2012 og 2013 gentages ikke. Yderligere

sammenfattes i denne rapport, resultatet af alle de eDNA afprøvninger, som Amphi

Consult har udført for Naturstyrelsen i perioden 2012-2014.


7/22


7

3. Metoder

3.1 Vandkalve lokaliteter og overvågningstidspunkt

For bred vandkalv og lys skivevandkalv blev udvalgt 19 lokaliteter til eftersøgning af

begge arter i Skåne og Småland i Sverige (Figur 1). Fokus for undersøgelsen i 2013 var atklarlægge, om det er muligt at spore vandkalvearterne ved hjælp af eDNA med den

teknologi, som er til rådighed på nuværende tidspunkt. Prøverne er indsamlet i 2013, og

resultatet af den konventionelle undersøgelse er tidligere afrapporteret. Vandprøverne er

ikke tidligere analyseret.

Figur 1: Lokaliteter i Sydsverige udvalgt til undersøgelse af potentialet for eDNA-baseret overvågning afbred vandkalv og lys skivevandkalv. De undersøgte områder er angivet på oversigtskortet, mens de

specifikke lokaliteter fremgår på detailkortene. Ved forårsbesøg (20.05.13 og 21.05.13) blev lokaliteterneundersøgt for forekomst af Graphoderus bilineatus og Dytiscus latissimus med ketjser. Samtidig blev der(af en anden person) taget prøver til eDNA analyse. Ved efterfølgende genbesøg i sommer (14.07.13 og

15.07.13) og efterår (08.09.13 og 09.09.13) blev arterne ikke eftersøgt manuelt, men der blev taget prøvertil eDNA-analyse.

Der blev indsamlet DNA-prøver i tre forskellige perioder, hhv. maj, juli og september

(etanol fældning), for at sikre og undersøge optimal prøvetagning i forhold til arternes

aktivitet og livsstadier. Ud over etanol fældnings prøver, blev der yderligere indsamlet

vandprøver fra alle 19 lokaliteter i foråret ved Sterivex filtrering.


8/22


8

3.2 Løgfrø lokaliteter 2014

Lokaliteter hvor der er indsamlet vandprøver til DNA analyse fremgår af Figur 2.

Løgfrø er registreret om foråret 2014 i alle de udvalgte lokaliteter.

Indsamlingen af eDNA prøver i disse lokaliteter blev udført i perioden 23. juni til 2. juli

2014. Eftersøgningen af løgfrø haletudser blev udført i samme periode af en anden

person.

Figur 2: Lokaliteter fra NOVANA overvågningen af løgfrø, hvor vandprøver er indsamlet i juli 2014.Udover 19 NOVANA lokaliteter er inddraget en lokalitet (den nordligste) med en meget tæt bestand af

løgfrøer. De steder hvor der er observeres stor vandsalamander og spidssnudet frø ved NOVANAovervågningen, er disse arter også eftersøgt ved DNA.

3.3 Overvågning med konventionelle metoder

Den konventionelle overvågning af løgfrø fulgte den tekniske anvisning for NOVANA

overvågning TA-A17 (Søgaard et al., 2011). Om foråret blev overvågningen således

gennemført som natlytning med undervandsmikrofon, og om sommeren blev efter-søgningen af larver baseret på grundig eftersøgning med ketsjer. Den konventionelleovervågning af løgfrø blev ikke finansieret af dette projekt, da arbejdet blev udført

under det normale NOVANA program.

Bred vandkalv og lys skivevandkalv blev aktivt eftersøgt i maj måned med ketsjer i

henhold til den tekniske anvisning TA-A05 (Søgaard et al., 2004) og registreret på presence/absence-niveau, dels som larver (bred vandkalv) og dels som voksne (lys

skivevandkalv).

Alle eftersøgninger med konventionelle metoder blev udført af personer med stor

artsspecifik overvågningserfaring.


9/22


9

3.4 eDNA prøvetagning

Etanol fældningFor hver lokalitet blev tre vandprøver af 15 ml indsamlet i 5-10 centimeters dybde på

kanten af bredzonen med en rummelig fordeling der så godt som muligt dækkede

vandhullets struktur. Vandprøverne blev taget og håndteret i felten iførtengangshandsker for at minimere risiko for kontaminering mellem lokaliteter.

Prøvetageren var i øvrigt på indsamlingsdagene på intet tidspunkt i fysisk kontakt med

fokus-arterne eller andre åbenlyse kontamineringskilder.

Umiddelbart efter indsamling af prøver tilsattes 1,5 ml Natriumacetat (3M, pH 4.8).

Derefter blev prøven rystet, og der blev påfyldt 96 % etanol indtil 50 ml total volumen.

Under prøvetagning blev allerede indsamlede prøver opbevaret i termoboks medfryseelementer, og derefter hurtigst muligt ved -20 °C indtil den videre bearbejdning.

Steri vex fi ltr eri ngSterivex filtrering forgik ved at en 60 mL sprøjte blev fyldt gentagne gange i 5-10

centimeters dybde på kanten af bredzonen med en rummelig fordeling der så godt sommuligt dækkede vandhullets struktur. Sprøjten blev fæstnet til Sterivex filteret, og

indholdet presset gennem filtermembranen. Processen blev gentaget indtil det ikke varmuligt at presse mere væske gennem filteret. Afhængig af vandkvaliteten blev der

indsamlet 240 - 720 mL ved de 19 vandbille lokaliteter i foråret 2013. Filtrene blev

straks efter feltfiltreringen bragt på køl, og hurtigst muligt frosset ved -20 °C.

Amphil trator sampli ngAlle 20 løgfrø lokaliteter blev i 2014 samplet med det nyudviklede prototype til

prøvetagning, som er udviklet af Amphi Consult (”Amphitrator”). Amphiltratoren gørdet muligt at opkoncentrere store vandvolumener på optil 1,6 L. Dette øger

følsomheden og mulighederne for at kvantificere DNA efterfølgende. Ved hver lokalitet blev der opsamlet 1,6 L søvand langs kanten af vandhullerne. Væsken blev indsamlet

rundt i hele vandhullet. Vandprøven blev efterfølgende opkoncentreret til et volume på

ca 10 ml ved brug af maskinen. Derefter er DNA ekstraheret fra prøven.

Figur 3: Indsamling af prøve fra sø (ca 2 liter)


10/22


10

Figur 4. Feltfiltrering og efterfølgende fixering af opkoncentreret sample. Efter fixering er prøve klar tilat sende til analyse. Filtreringen bør foretages hurtigst muligt efter indsamling, fx under transportmellem lokaliteter.

3.5 eDNA ekstraktion

For alle indsamlede prøver fra 2013 og frem er eDNA blev renset og ekstraheret ved en

ny protokol, som både giver forbedret udbytte og renhed i forhold til metoder som ellershar været beskrevet (Thomsen et al., 2012).

Det resulterende DNA blev opbevaret ved -20 °C indtil analyse ved qPCR. Analyserne

er udført i Amphi´s laboratoriefaciliteter i Aalborg af faguddannet personale med

molekylærbiologisk ekspertise.

Analyserne tager udgangspunkt i opformering af artsspecifikke DNA-sekvenser, og

analyseres ved hjælp af fluorescerende reportermolekyler (hydrolyse/Taqman-prober),

som gør det muligt at visualisere DNA-fragmenterne under opformering.

De specifikke detektionssystemer mod alle arter der er præsenteret i denne rapport er

ikke offentlig gjort. Detektions systemerne er udviklet uden omkostninger for Naturstyrelsen som en del af et forskningsprojekt finansieret af Innovationsfonden.

Alle analyser inkluderer både negative kontroller (n=4), negative ekstraktionskontroller

(n=3) og fortyndingsrække af standard-DNA (der fungerede både som positiv kontrol,

sensitivitetskontrol og fastlæggelse af detektionsgrænse). Ud fra DNA-standarden er det

yderligere muligt at estimere prøvens koncentration af target DNA, med henblik på en

kvantitativ vurdering af artsspecifik DNA-indhold i prøven. Alle målinger af prøverne

blev udført med tre gentagelser. Som en yderligere kvalitetssikring blev der kontrolleret

for falske negative resultater (som kan opstå på grund af PCR-inhiberende stoffer).

Dette skete ved at inkludere intern positiv kontrol (IPC, Applied Biosystems) til et

replikat for hver prøve. På grund af antallet af reaktioner, der blev analyseret, var det

nødvendigt at dele prøverne op på flere 96-brønds reaktionsplader, som blev analyseret i


11/22


11

separate kørsler. Det er velkendt, at forskellige kørsler introducerer en vis variation,

som er iboende i qPCR metoden, hvorved sensitiviteten kan variere mellem forskelligekørsler.

De nye detektionssystemer er ikke offentliggjort, og systemernes tekniske detaljer og

sekvenser er fortroligt materiale. De nye detektionssystemer er ikke udviklet som en del

af denne opgave.

3.6 Tolkning og evaluering af eDNA resultater

Da eDNA-analyser som metode til overvågning af biodiversitet i ferskvand endnu er

relativt nyt og under stadig udvikling, er der visse forbehold, som må tages ved tolkning

af data.

Først og fremmest må det understreges, at det på nuværende tidspunkt ikke er muligt at

anvende et negativt resultat som et bevis på artens fravær på lokaliteten. Tilsvarende

begrænsning gælder dog for de fleste overvågningsmetoder.

I de følgende defineres den afrapporteringen af positive, negative og kvantitative

resultater, som den er fremlagt i denne rapport (bemærk at tilsvarende evaluering af data

ikke er anvendt i de tidligere rapporter).

1)

De negative kontroller skal være negative, eller ligge under ”reportable range”.

2) Den interne positive kontrol som er tilsat prøven skal give et signal, som er

sammenligneligt med det niveau, der er opnået i de negative og positivekontroller.

3) Målinger skal være indenfor det rapporterbare område ”reportable range”. Det

rapporterbare område defineres ud fra fortyndingsrækken af standard-DNA, som

den mest fortyndede standard, der giver et reproducerbart qPCR signal. Et

reproducerbart qPCR signal defineres som tre tekniske replikater der maximal

viser en forskel på 3 Ct enheder (Smith, 2013). Dette kan også betegnes

detektionsgrænsen.4)

Antal target DNA kopier beregnet for nedre grænse af det rapporterbare område

(detektionsgrænsen), defineres som DNA-index=1.

5) DNA-index værdi beregnes for samtlige analyser på det grundlag, ud fra detantal kopier af target DNA som er fundet i prøven. Hvis DNA-index fx er 2,

svarer det til en DNA koncentrationen i prøven på det dobbelte afdetektionsgrænsen.

6) Spredningen på DNA-index svarer til spedningen på antal kopier af target DNAsom beregnes af analyseudstyrets software (MxPro).

Prøver der giver et DNA-index >1 anses som positive, hvis resultatet er reproducerbart(Dette markeres med GRØN).

Prøver med positive PCR reaktioner der ligger under det rapporterbare område (DNA

index1 ikke er reproducerbart anses for

usikre og dermed negative (markeres med RØD).

Prøver der ikke giver PCR signal markeres som negative (RØD).

Kvantitative resultater opnås i qPCR ved at estimere antallet af DNA-molekyler i prøver

ud fra sammenligning med resultater fra samtidig kørsel af en fortyndingsrække afkendt DNA-koncentration. Vi har valgt at anvende DNA-index værdier som et

proportionalt udtryk for de kvantitative resultater. DNA-index værdien illustrerer

mængden af target DNA i den analyserede prøve, i forhold til den mindste standard der


12/22


12

giver et reproducerbart signal. DNA-index kan især anvendes til intern sammenligning

af target-DNA koncentration mellem undersøgte lokaliteter.

Sammenligning af kvantitative resultater baseret på PCR skal altid udføres med stor

forsigtighed. Det er muligt at skelne mellem prøver med meget og lidt DNA. Lignende

usikkerhed gælder mange andre kvantitative metoder til biologisk monitering.


13/22


13

4. Resultater

4.1 bred vandkalv og lys skivevandkalv (feltundersøgelser)

Bred vandkalv ( D. latissimus) blev i 2013 registreret på 15 lokaliteter og lysskivevandkalv (G. bilineatus) på 17 (Tabel 1). Bred vandkalv blev registreret som

eneste art på 2 lokaliteter og lys skivevandkalv blev registreret som eneste art på 4

lokaliteter. Resultaterne og nærmere oplysninger om lokaliteterne fremgår af tidligereafrapportering (Amphi Consult, 2014). Dele af resultaterne gentages i det følgende

Tabel 1: Resultater af konventionel eftersøgning af bred vandkalv og lys skivevandkalv på de 19 svenskelokaliteter. Registrering af arterne på en given lokalitet er angivet med y. I kolonnerne forår, sommer og

efterår er det angivet med x, hvornår der er taget prøver til eDNA-undersøgelser. Enkelte lokaliteter faldtmeget i vandstand efter prøvetagningen om foråret og er således behæftet med en vis usikkerhed i forholdtil detektion af DNA fra vandkalvene. Disse lokaliteter er angivet med * ved den givne årstid.

Feltovervågning eDNA prøvetagning

Lokalitet Længdegrad Breddegrad D. latissimus G. bilineatus Forår Sommer Efterår

VK1 13.89979 56.38851 y y x x x

VK2 13.90507 56.38720 y y x x xVK3 13.90790 56.38712 y y x x x*

VK4 14.39833 56.33528 y y x x x

VK5 14.39874 56.33819 y y x x x

VK6 14.40160 56.33776 y x x x

VK7 14.39961 56.33797 y x x* x*

VK8 14.38445 56.42525 y y x x x

VK9 14.38482 56.42299 y x x x

VK10 14.19080 56.71003 y y x x x

VK11 14.19424 56.71352 y x x*

VK12 14.59909 56.75851 y y x x xVK13 14.59965 56.75994 y y x x x

VK14 14.76045 56.76696 y x x x

VK15 14.76338 56.77728 y x x x

VK16 15.42564 56.87151 y y x x x

VK17 15.51458 56.83978 y y x x x

VK18 15.57626 56.84732 y y x x x

VK19 15.69321 56.85248 y y x x x

Fund af larver af bred vandkalv indikerer, at de lokaliteter, der blev undersøgtrepræsenterer faktiske ynglesteder for arten. Ligeledes må det antages, at fund af voksne

dyr af lys skivevandkalv også repræsenterer faktiske ynglesteder for arten. Dels på

baggrund af artens begrænsede flyveevne, et-årige livscyklus og de relativt stabileforhold i de undersøgte søer (Iversen et al., 2013). Dels fordi lys skivevandkalv tidligere

er kendt fra alle de lokaliteter hvor den blev fundet under denne undersøgelse.

Med henblik på sammenligningen af konventionel eftersøgning af vandkalvearterne og

muligheden for detektion af eDNA, er de indsamlede vandprøver DNA-oprenset oganalyseret.


14/22


14

4.2 Lys skivevandkalv Graphoderu s bil ineatus (eDNA resultater)

Lokalitet FeltovervågningForårDNA-index

Forår

(sterivex)DNA-index

SommerDNA-index

EfterårDNA-index

VK1 0,7 (± 0,0) 0,2 (± 0,0)

VK2 0,1 (± 0,0)

VK3 0,3 (± 0,0) 0,5 (± 0,7)

VK4 0,3 (± 0,0) 0,4 (± 0,0)

VK5 0,2 (± 0,0)

VK6 0,6 (± 0,3)

VK7 1,2 (± 0,0)

VK8 0,4 (± 0,2)

VK9 0,2 (± 0,2)

VK10 0,2 (± 0,1) 3,0 (± 2,6) 0,2 (± 0,0)

VK11 2,3 (± 2,0) 4,3 (± 1,5)

VK12 0,8 (± 0,0)

VK13 0,2 (± 0,2)

VK14 0,1 (± 0,1)

VK15 0,4 (±0,0)

VK16 0,7 (± 0,2) 0,1 (± 0,0)

VK17 0,1 (± 0,0) 6,4 (± 8,0) 1,9 (± 0,0)

VK18 1,0 (± 0,0) 0,1 (± 0,0) 0,4 (± 0,0)

VK19 0,6 (± 0,5) 0,7 (± 0,1)

Figur 5. Graphoderus bilineatus. Resultat af felteftersøgning (maj 2013) sammenholdt med resultatet afeDNA analyser. GRØN: Arten er fundet/eDNA er fundet. RØD med tal: usikkert eDNA signal: DNAindex1 er ikke reproducerbart. RØD: Intet fundet (felt eller DNA). Blank: prøve

mangler.

Konklusionen baseret på de positive eDNA prøver (GRØN) i Figur 5 er, at det er muligt

at detektere eDNA fra Graphodeus bileneatus. Dog er effektiviteten ganske lav, da dertotalt set kun er observeret positivt eDNA signal fra 3 af i alt 17 lokaliteter hvor arten er

observeret i felten. Med kun en positiv eDNA prøve om foråret og sommeren og i alt 2

positive ved brug af Sterivex filteret, er der ikke grundlag for at vurdere forskelle

mellem sampling metoder og årstider for denne art.


15/22


15

4.3 Bred vandkalv Dysticus latissimus (eDNA resultater)

FelteftersøgningForårDNA-index

Forår

(sterivex)DNA-index

SommerDNA-index

EfterårDNA-index

VK1 0,6 (± 0,0)

VK2 0,3 (± 0,3) 1,9 (± 0,5)

VK3 6,6 (± 2,3)

VK4 3,5 (± 0,3)

VK5 12,8 (±3,0)

VK6 2,2 (± 0,2)

VK7 60,3 (± 18,7) 7,8 (± 0,7)

VK8 1,4 (± 0,5)

VK9VK10 3,1 (± 0,0) 1,7 (± 0,3)

VK11 5,3 (± 3,1) 8,1 (± 1,5)

VK12 4,0 (± 3,2) 2,7 (± 0,3)

VK13 3,3 (± 0,0) 0,7 (± 0,9)

VK14 9,1 (± 3,7) 52,9 (± 5,2)

VK15 1,7 (± 0,8) 0,2 (± 0,0) 0,1 (± 0,0) 0,1 (±0,0)

VK16

VK17

VK18 0,1 (± 0,0)

VK19 3,8 (± 3,2) 2,4 (± 0,5)

Figur 6. Dysticus latissimus. Resultat af felteftersøgning (maj 2013) sammenholdt med resultatet af eDNAanalyser. GRØN: Arten er fundet/eDNA er fundet. RØD med tal: usikkert eDNA signal (DNA index1 er ikke reproducerbart). RØD: Intet fundet (felt eller DNA). Blank: prøve mangler

Konklusionen baseret på de positive eDNA signaler (GRØN) i Figur 6 er, at de bedste

resultater opnås ved at indsamle prøver om foråret. Prøvetagning med opkoncentrering

på Sterivex filter er mere effektiv end prøvetagning med etanol udfældning. Andre

prøvetagningsmetoder er ikke afprøvet.


16/22


16

4.4 Sammenfatning af resultater for vandkalve

I Figur 7 introduceres de farvekoder der anvendes ved grafisk sammenligning af

resultaterne mellem feltundersøgelse og eDNA undersøgelse. I Figur 8 sammenholdes

resultatet af feltundersøgelser og eDNA analyse for de to vandbillearter der er

undersøgt.

Det fremgår at det var muligt at detektere eDNA for lys skivevandkalv, men med laveffektivitet sammenlignet med den trænede observatør. Således var kun 3 eDNA

positive lokaliteter ud af 17, hvor arten blev fundet af den trænede observatør.

For bred vandkalv blev eDNA detekteret i 10 ud af 15 lokaliteter, hvor arten var

registreret af feltbiolog. I to lokaliteter blev der detekteret eDNA fra bred vandkalv uden

arten var fundet ved den feltbiologiske undersøgelse.

Figur 7. Komparativ klassifikation af resultater af eDNA baseret og konventionel artsovervågning. Grønbetyder overensstemmelse mellem resultater af de to overvågningsmetoder, blå betyder at arten kun findes ved eftersøgning med konventionel metode og rød at arten kun er fundet ved eftersøgning baseret på eDNA.

Figur 8. Sammenstilling af feltundersøgelse og DNA analyse. DNA analyse resultatet er evalueret ud fra

summen af prøver indsamlet med Sterivex filter og etanol udfældning på alle årstider. Positive DNAresultater inkluderer kun prøver med reproducerbare resultater og DNA-index >1.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Graphoderus bilineatus (Lys skivevandkalv) Dysticus latissumus (Bred vandkalv )

N u m b e r o

f p o n d s


17/22


17

4.5 Løgfrø 2013 (ny præsentation af data)

I Figur 7 introduceres de farvekoder der anvendes ved grafisk sammenligning af

resultaterne mellem feltundersøgelse og eDNA undersøgelse.

Ved undersøgelserne i 2013 blev to forskellige eDNA detektionssystemer til løgfrø

testet. Nedenstående figur (Figur 9) illustrerer dele af de data der blev analyseret i 2013

(Amphi Consult, 2013). Data sammenstilles i figuren for de to detektionssystemer, så

resultaterne bedre kan sammenlignes. Det gamle system som er publiceret i 2012

(Thomsen et al., 2012) giver i flere tilfælde positive signaler fra lokaliteter, hvor løgfrø

ikke er kendt. Det nye system som er udviklet i 2013 er mere konservativt. Det nye

system giver svagere DNA signal (lavere DNA-index, data ikke vist). Til gengæld er

der ingen eksempler på positive signaler fra lokaliteter, hvor arten ikke er observeret af

feltbiolog.

På det grundlag anbefales det fremover at anvende det gamle system med stor

forsigtighed, da der er risiko for falske positive prøver. Eventuelt anvendelse af det

gamle system bør ske i kombination med det nyudviklede eDNA detektionssystem tilløgfrø.

Figur 9. Sammenstilling af feltundersøgelse og DNA analyse for løgfrø lokaliteter analyseret i 2013. To forskellige DNA detektionssystemer er afprøvet. Systemerne rammer forskellige DNA sekvenser. Det sesat den nyeste metode udviklet i 2013 ikke giver eksempler på resultater, hvor der findes DNA uden at

arten er observeret i felten.

7 15 5 6

13

6

2112

107

3

2

02

0

9

0

5

10

15

20

25

30

35

Forår (Ny eDNA metode) Forår (gl DNA metode) Sommer (Ny DNA) Sommer (gl DNA)

N u m b e r o f

p o n d s


18/22


18

4.6 Løgfrø 2014

I forbindelse med NOVANA overvågningen af løgfrø, blev der i 2014 fundet 20

lokaliteter med observation af løgfrø i den nordlige del af Jylland. Der blev i juli 2014

indsamlet eDNA prøver fra disse lokaliteter. Prøverne blev indsamlet dels ved etanolfældning og dels med Amphiltrator for at sammenligne indsamlingsmetoderne.Resultaterne fremgår af Figur 10. Analyserne er kun analyseret med det nye eDNA

detektionssystem til løgfrø som er udviklet i 2013.

Feltgennemgang eDNA analyse (Sommer)

Forår (løgfrøkvæk)

Sommer (haletudser) Etanol

(DNA-index)

Amphiltrator

(DNA-index)

622-59-Pf2 4

622-59-Pf5 12 1-10

623-59-Pf1 2

623-59-Pf2 5 1-10

623-60-Pf3 2

626-59-Pf6 2

627-53-Pf1 6

627-53-Pf2 1

627-53-Pf3 11

627-53-Pf4 17

627-56-Pf1 14 10-100 0,6 (± 0,3)

627-56-Pf2 18

627-56-Pf6 3

628-52-Pf1 5

628-52-Pf2 2

628-53-Pf4 3

630-54-Pf1 6 0,4 (± 0,0)

630-54-Pf2 8

630-54-Pf4 15

Brønderslev >500 Ikke undersøgt, men en afde største bestande der

kendes i DK0,3 (± 0,2) 2,5 (± 0,6)

Figur 10. Løgfrø (Pelobates fuscus). Resultat af felteftersøgning i 2014 sammenholdt med resultatet afeDNA analyser. GRØN: Arten er fundet/eDNA er fundet. RØD med tal: usikkert eDNA signal (DNAindex1 er ikke reproducerbart). RØD: Intet fundet (felt eller DNA). Blank: prøve

mangler


19/22


19

4.7 Stor vandsalamander 2014

Af de 20 lokaliteter der blev undersøgt for løgfrø i 2014, blev der desuden registreret

stor vandsalamander på 8 lokaliteter. Disse 8 lokaliteter analyseret for eDNA fra stor

vandsalamander ved brug af samme metoder som tidligere (Amphi Consult, 2013).

Analysen blev udført med henblik på at sammenligne indsamlingsmetoderne.

Resultaterne fremgår af Figur 11.

Stor vandsalamander

Feltgennemgang (sommer) eDNA analyse

Larver Etanol

DNA-index

Amphiltrator

DNA-index

622-59-Pf2 1-10 2,1 (± 0,1) 1,4 (± 0,4)

622-59-Pf5 1-10 0,9 (± 0,6)

623-60-Pf3 10-100 5,4 (± 10,3) 28,1 (± 2,7)626-59-Pf6 1-10 0,5 (± 2,5) 3,9 (± 0,4)

627-56-Pf1 10-100 0,5 (± 0,0)

627-56-Pf6 1-10 0,7 (± 2,5) 4,5 (± 2,4)

628-52-Pf2 1-10 0,8 (± 3,2) 4,7 (± 2,0)

630-54-Pf1 10-100 2,0 (± 2,0) 5,5 (± 2,8)

Figur 11. Stor vandsalamander (Triturus cristatus). Resultat af felteftersøgning (2014) sammenholdt medresultatet af eDNA analyser. GRØN: Arten er fundet/eDNA er fundet. RØD med tal: usikkert eDNA

signal (DNA index1 er ikke reproducerbart). RØD: Intet fundet (felt eller DNA).


20/22


20

4.8 Spidssnudet frø 2014

Af de 20 lokaliteter der blev undersøgt for løgfrø i 2014, blev der desuden registreret

spidssnudet frø på 6 lokaliteter. Disse 6 lokaliteter er analyseret for eDNA fra

spidssnudet frø for at sammenligne indsamlingsmetoderne. Resultaterne fremgår af

Figur 12. Det anvendte eDNA detektionssystem til spidssnudet frø er ikke tidligereafprøvet. Systemet er udviklet i samarbejde mellem Københavns Universitet og AmphiConsult.

Prøverne er indsamlet i perioden 23/6 til 2/7-2014, med primært fokus på eDNA

detektion af løgfrø. På grund af det varme forår i 2014 må det forventes at langt

hovedparten af haletudserne af spidssnudet frø på dette tidspunkt har forladt

vandhullerne. De registreringer som feltbiologen har noteret i forbindelse med

NOVANA feltarbejdet viser, at der kun er registreret haletudser i en af de 6 søer medspidssnudet frø.

Resultaterne af eDNA analysen for spidssnudet frø viser, at det er muligt at detektere

eDNA fra spidssnudet frø, selvom prøverne er indsamlet efter langt hovedparten afhaletudserne fra spidssnudet frø må forventes at have forladt vandhullet. Det rette

prøvetagningstidspunkt for denne art må forventes at være omkring 1. juni, hvor alle

haletudserne fortsat må forventes at være i vandhullerne.

Spidssnudet frø

Feltgennemgang (sommer) eDNA analyse

Haletudser Juvenile Adulte Etanol

(DNA index)

Amphiltrator

(DNA index)

623-59-Pf2 1-10

623-60-Pf3 2

627-53-Pf3 1-10

627-56-Pf1 1-10 2,0 (± 0,3) 6,1 (± 0,0)

627-56-Pf2 1-10 11,5 (± 2,7) 117,5 (± 5,8)

630-54-Pf1 1-10

Figur 12. Spidssnudet frø (Rana avarlis). Resultat af felteftersøgning (2014) sammenholdt med resultatet

af eDNA analyser. GRØN: Arten er fundet/eDNA er fundet. RØD: Intet fundet (felt eller DNA). Blank: Ikke observeret/data mangler.


21/22


21

5. Perspektiver og forslag til videre arbejde Stor vandsalamander kan fremover overvåges kvalitativt med eDNA. Det anbefales dogfortsat at kombinere eDNA analyse med konventionel overvågning.

Det anbefales at udføre supplerende undersøgelser i 2015, for at dokumentere eDNAmetodens kvantitative muligheder i forhold til overvågning af stor vandsalamander.

Eftersøgning af eDNA fra løgfrø indikerer fortsat visse begrænsninger og usikkerheder

ved metoden for denne art. Specielt i lokaliteter med meget små bestande. Lignende

begrænsninger ses i forhold til de undersøgte invertebrater. Fremtidig fokus bør derfor

rettes mod forbedret indsamlings- og opkoncentrerings- og DNA ekstraktionsmetode.

Resultaterne bør fortsat sammenlignes med den eksisterende overvågning fx i

NOVANA programmet.

Derudover anbefales det i 2015 at fokusere på valideringsstudier i forhold til andre arter,

hvor der er nyudviklede og allerede afprøvede eDNA detektionssystemer til rådighed.

På baggrund af det igangværende forskningssamarbejde mellem Amphi Consult ogKøbenhavns Universitet er der i 2015 adgang til at validere et eller flere af følgende

artsspecifikke eDNA systemer, som allerede nu er afprøvet i forskningsarbejdet medomfattende in sillico, in vitro og in vivo test (se tekstboks):

o Spidssnudet frø (se også begrænset afprøvning i denne rapport)

o Springfrø

o Løvfrø

o Klokkefrø

o Strandtudse

o Grønbroget tudse

Forløb og betegnelser for udvikl ing af nye eDNA detektionssystemer baseret påqPCR:

o I n sill ico test: qPCR detektionssystem udviklet på computer ud fra DNA

databaser med sekvensoplysninger om target og non-target arter

o I n vitr o test: In sillico testede qPCR detektionssystemer afprøves på DNA

ekstraheret fra væv af target-art, og nærtstående non-target arter.

Vævsprøver hentes fra DNA-bank.

o I n vivo test: In vitro testede qPCR systemer afprøves på prøver indsamlet i

felten fra steder hvor vi ved at target arten findes.

o Validering: Test af de bedste qPCR systemer på samples fra områder hvor

target arten vides at forekommer eller kendes i forvejen baseret på andre

grundige undersøgelser (udføres ikke i forskningsprojektet).


22/22


22

6. Referencer Amphi Consult (2013): Evaluering af eDNA detektion til overvågning af vandhulsarter

(2012), Amphi Consult, 3. udgave 11. januar 2013

Amphi Consult (2014): Evaluering af eDNA detektion til overvågning af vandhulsarter(2013), Amphi Consult, 3. udgave 31. januar 2014

Iversen, L.L., Rannap, R., Thomsen, P.F., Kielgast, J., Sand-Jensen, K., (2013). How do

low dispersal species establish large range sizes? The case of the water beetle

Graphoderus bilineatus. Ecography 36, 770 – 777

Smith, M., (2013). The Validation of Real-time PCR Assays for Infectious Diseases, in:Saunders, N.A., Lee, M.A. (Eds.), Real-Time PCR: Advanced Technologies and

Applications. Caister Academic Press., Norfolk, pp. 213 – 245.

Søgaard, B., Adrados, L.C., Fog, K., Jensen, M.W., Svendsen, A., (2011). Overvågning

af padder: Ver. 1, Teknisk anvisning fra Fagdatacenter for Biodiversitet og Terrestrisk Natur, DCE. Aarhus Universitet, DCE - Nationalt Center for Miljø og Energi.

Søgaard, B., Holmen, M., Holm, T.E., (2004). Vandkalve: Teknisk anvisning til

ekstensiv overvågning, Teknisk anvisning fra DMU’s Fagdatacenter for Biodiversitet

og Terrestrisk Natur. Danmarks Miljøundersøgelser, Aarhus Universitet

Thomsen, P.F., Kielgast, J., Iversen, L.L., Wiuf, C., Rasmussen, M., Gilbert, M.T.P.,

Orlando, L., Willerslev, E.(2012). Monitoring endangered freshwater biodiversity using

environmental DNA. Mol. Ecol. 21, 2565 – 2573.

EDNA Validering 080115

Documents

Transcript of EDNA Validering 080115