Ge nes de adap ta ciónlo ca li za dos en el plás mi dopUM505 de Pseu do mo nasae ru gi no sa

Car los Cer van tes y Mart ha I. Ra mí rez DíazInsti tu to de Inves ti ga cio nes Quí mi co-Biológicas, UMSNH

(cvega1999@yahoo.com; marthaisela_ramirez@hotmail.com)

Re su menEn bac te rias la trans fe ren cia ho ri zon tal de ge nes es me dia da por ele men tos mó vi lescomo plás mi dos y trans po so nes. El plás mi do con ju ga ti vo pUM505 fue ais la do de unacepa clí ni ca de Pseu do mo nas ae ru gi no sa y con fie re re sis ten cia a cro ma to y mer cu -rio. La se cuen cia ción y el aná li sis de la se cuen cia del plás mi do pUM505 de ter mi nóque este re pli cón con tie ne 138 re gio nes co di fi can tes. pUM505 pre sen ta dos re gio nesbien de fi ni das, la pri me ra co rres pon de a una isla ge nó mi ca (IG) de ~31 ki lo ba ses (kb), la cual po see los ge nes de re sis ten cia a cro ma to y mer cu rio, y la se gun da re gión, de~67 kb, co rres pon de a una isla ge nó mi ca de pa to ge ni ci dad (PAI). Esta isla, ade másde con te ner los ge nes de re pli ca ción del DNA y de la trans fe ren cia con ju ga ti va, po see ge nes pro ba ble men te in vo lu cra dos en vi ru len cia como, virB4/virD4, y ge nes ho mó lo -gos a los de la PAI de P. ae ru gi no sa PA14, una cepa al ta men te vi ru len ta. Adi cio nal -men te, pUM505 po see ge nes pro ba ble men te in vo lu cra dos en la to le ran cia al es trésoxi da ti vo como umuD, umuC y pdi, así como ge nes aún no iden ti fi ca dos de re sis ten -cia a an ti bió ti cos. Con el pro pó si to de es ta ble cer la par ti ci pa ción de los di ver sos ge -nes de adap ta ción que po see pUM505, pri me ra men te se rea li zó la cons truc ción de un ban co de clo nas y un ban co de mu tan tes para la iden ti fi ca ción de ge nes de vi ru len ciay de re sis ten cia a qui no lo nas, res pec ti va men te. Ade más, se está ana li zan do la fun -cio na li dad de los ge nes de to le ran cia a es trés oxi da ti vo por clo na ción y trans fe ren cia

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a ce pas de P. ae ru gi no sa sen si bles a com pues tos ge ne ra do res de es pe cies reac ti -vas de oxí ge no. El pro pó si to de este tra ba jo es dar una des crip ción de las ca rac te rís ti -cas ge né ti cas del plás mi do pUM505, así como los avan ces y el en fo que ac tual que seem plea para el es tu dio de este plás mi do, lo que per mi ti rá en ten der el pa pel de los ge -nes de adap ta ción que po see en la pre va len cia y evo lu ción de las bac te rias que locon tie nen.

Pa la bras cla ve: Pseu do mo nas, plás mi dos, vi ru len cia, qui no lo nas.

AbstractIn bac te ria, ho ri zon tal gene trans fer is me dia ted by mo bi le ele ments such as plas midsand trans po sons. The con ju ga ti ve pUM505 plas mid was iso la ted from a cli ni cal strainof Pseu do mo nas ae ru gi no sa and con fers re sis tan ce to chro ma te and mer cury.Sequen cing and se quen ce analy sis of pUM505 sho wed that this plas mid con tains 138 co ding re gions. pUM505 pre sents two well-defined re gions, the first one co rres pondsto a ge no mic is land (GI) of ~31 ki lo ba ses (kb), which pos ses ses the chro ma te andmer cury re sis tan ce ge nes; the se cond re gion, of ~67 kb, co rres ponds to a ge no mic is -land of pat ho ge ni city (PAI). This is land, in ad di tion to re pli ca tion and con ju ga ti ve trans -fer ge nes, has ge nes pro bably in vol ved in vi ru len ce, such as virB4/virD4 and ge nesho mo logs to the PAI from P. ae ru gi no sa PA14, a highly vi ru lent strain. Addi tio nally,pUM505 pos ses ses ge nes pro bably in vol ved in to le ran ce to oxi da ti ve stress likeumuD, umuC and pdi, as well as ge nes not yet iden ti fied for an ti bio tic re sis tan ce. Withthe aim to de ter mi ne the par ti ci pa tion of the adap ta ti ve ge nes of pUM505, firstly werecons truc ted li bra ries of clo nes and mu tants for vi ru len ce ge nes and qui no lo nes re sis -tan ce ge nes, res pec ti vely. Furt her mo re, the func tio na lity of to le ran ce ge nes to oxi da ti -ve stress is being analy zed by their clo ning and trans fer to P. ae ru gi no sa strainssen si ti ve to com pounds which ge ne ra te reac ti ve oxy gen spe cies. The aim of this workis to give a ge ne ral des crip tion about the ge ne tic cha rac te ris tics of pUM505 plas mid,as well as the ad van ces and the cu rrent ap proa ches em plo yed for the study of thisplas mid, which will allow us to un ders tand the role of adap ta tion ge nes on the pre va -len ce and evo lu tion of bac te ria that pos sess it.

Key words: Pseu do mo nas, plas mids, vi ru len ce, qui no lo nes.

Intro duc ciónPseu do mo nas ae ru gi no sa es una bac te ria Gram-negativa am plia men te dis tri bui da

en el am bien te, in clu yen do sue lo y agua, así como en aso cia ción con va rios ti pos de or ga -nis mos vi vos (Batt le y col., 2008). P. ae ru gi no sa tie ne la ca pa ci dad de cre cer en con di cio nesae ro bias y anae ro bias y po see nu me ro sos fac to res de vi ru len cia que con tri bu yen a su pa to -gé ne sis (Schu rek y col., 2012). Adi cio nal men te, esta bac te ria po see una re sis ten cia in trín -

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se ca a mu chos an ti bió ti cos de bi do a la ba rre ra que re pre sen ta la mem bra na ex ter na y a lapre sen cia de trans por ta do res de ex pul sión de dro gas de la mem bra na in ter na (Poo le,2011). Obser va cio nes en mo de los de in fec ción in di can que la vi ru len cia de P. ae ru gi no sava ría de cepa a cepa y que los ge nes que par ti ci pan en la vi ru len cia es tán lo ca li za dos en elge no ma cen tral y por lo tan to es tán pre sen tes en to das las ce pas. Sin em bar go, los ge nesac ce so rios de P. ae ru gi no sa con te ni dos en plás mi dos e is las ge nó mi cas pue den con tri buir a la he te ro ge nei dad de la vi ru len cia (Lee y col., 2006).

El plás mi do con ju ga ti vo pUM505 fue ais la do de una cepa clí ni ca de P. ae ru gi no sa deun pa cien te hos pi ta li za do, se de ter mi nó que es ca paz de con fe rir re sis ten cia a cro ma to ymer cu rio (Cer van tes y Ohta ke, 1988). El me ca nis mo de re sis ten cia a cro ma to con fe ri do porel gen chrA co di fi ca do en pUM505 fue el pri mer me ca nis mo des cri to (Alva rez y col., 1999) yes el me jor ca rac te ri za do en bac te rias (Ra mí rez-Díaz y col., 2008). La se cuen cia ción y elaná li sis de los ge nes del plás mi do pUM505 in di ca ron que éste es un re pli cón cir cu lar que po -

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Fi gu ra 1. Mapa genético del plásmi do pUM505 de P. ae ru gi no sa. Las re gio nes co di fi can tes se mues tran por fle chas opun tas de fle cha in di can do la di rec ción de la trans crip ción de los ge nes. La po si ble fun ción de las pro teí nas se in di ca en co -lo res de acuer do al re cua dro de la de re cha. Las dos prin ci pa les re gio nes del plás mi do se in di can: 1) Isla de pa to ge ni ci dadPAI (ba rra roja), po see ge nes re la cio na dos con trans fe ren cia con ju ga ti va, re pli ca ción, vi ru len cia y to le ran cia a es trés; 2)Isla de re sis ten cia a me ta les pe sa dos IG (ba rra ne gra) que po see los ge nes que par ti ci pan en la re sis ten cia a cro ma to (CrR) ymer cu rio (HgR). Adap ta do de Ra mí rez-Díaz y col., 2011.

see 123,322 pa res de ba ses (pb) y que con tie ne 138 re gio nes co di fi can tes (orf’s) (Fig. 1).Del to tal de los orf’s de pUM505, 64 co di fi can pro teí nas con fun ción des co no ci da (pro teí nashi po té ti cas, PH), 15 co di fi can a ele men tos mó vi les, 13 se re la cio nan con trans fe ren cia delplás mi do, 13 con re sis ten cia a me ta les, 13 se re la cio nan con el me ta bo lis mo y 5 es tán im pli -ca dos en la re gu la ción trans crip cio nal, en tre otros (Ra mí rez-Díaz y col., 2011). pUM505 pre -sen ta dos re gio nes bien de fi ni das, la pri me ra re gión, de ~31 ki lo ba ses (kb), co rres pon de auna isla ge nó mi ca (IG) que con tie ne de ter mi nan tes de re sis ten cia a cro ma to y mer cu rio(Fig. 1). La se gun da re gión, de ~67 kb, co rres pon de a una isla ge nó mi ca de pa to ge ni ci dad(PAI) (Fig. 1). Estas is las son seg men tos de DNA que in clu yen ele men tos mó vi les y po seengru pos de ge nes de vi ru len cia que es tán pre sen tes en or ga nis mos pa tó ge nos, pero au sen -tes en bac te rias be nig nas es tre cha men te em pa ren ta das. Así, pUM505 po see gru pos de ge -nes que con fie ren po ten cial men te di ver sas pro pie da des de adap ta ción, pero que encon jun to como par te de un plás mi do re pre sen ta rían una ven ta ja evo lu ti va. Se ha des cri toque las IGs pue den in cre men tar la ver sa ti li dad me ta bó li ca, me jo rar la adap ta bi li dad, pro mo -ver la in te rac ción bac te ria-hospedero e in cre men tar la vi ru len cia (Klock get her y col., 2007).El pro pó si to de este tra ba jo es dar una des crip ción ge ne ral de los avan ces que se tie nen res -pec to a la ca rac te ri za ción de los ge nes de adap ta ción iden ti fi ca dos en pUM505, con el pro -pó si to de en ten der cómo este plás mi do pue de con tri buir en el de sa rro llo y en la evo lu ción deP. ae ru gi no sa en los dis tin tos am bien tes que ha bi ta.

Ge nes de adap ta ción

1.1. Isla ge nó mi ca con ge nes de re sis ten cia a me ta lesComo se men cio nó, los ge nes de pUM505 in vo lu cra dos en la re sis ten cia al ión me tá li -

co mer cu rio y al oxia nión cro ma to se lo ca li zan agru pa dos den tro de una IG que in clu ye losorf’s 59-94 (Fig. 1). Esta re gión po see un con te ni do de G+C de 64%, mien tras que el res todel plás mi do y el cro mo so ma tie nen un con te ni do de G+C de 61% y 66%, res pec ti va men te;esta pe que ña va ria ción su gie re que los ge nes pre sen tes en la isla tie nen un ori gen di fe ren te. Adi cio nal men te, esta re gión con tie ne ele men tos co mún men te re la cio na dos con la trans fe -ren cia ge né ti ca como re pe ti dos in ver ti dos (IR), se cuen cias de in ser ción (IS) y ge nes de mo -vi li dad (por ejem plo, los que co di fi can a in te gra sas, re sol va sas y trans po sa sas)(Ra mí rez-Díaz y col., 2011).

1.1.1. De ter mi nan tes de re sis ten cia a cro ma to (CrR)La IG de pUM505 po see el gen chrA que con fie re re sis ten cia a cro ma to me dian te un

me ca nis mo que ha sido des cri to con gran de ta lle. chrA co di fi ca a la pro teí na ChrA, la cual lle -va a cabo la ex pul sión de los io nes cro ma to uti li zan do el po ten cial elec tro quí mi co de la mem -bra na como fuen te de ener gía (Alva rez y col., 1999). Me dian te un aná li sis fi lo ge né ti co sede ter mi nó que la pro teí na ChrA de pUM505 for ma par te de la su per fa mi lia CHR, que estácons ti tui da por cien tos de ho mó lo gos (Díaz–Pé rez y col., 2007). La su per fa mi lia CHR estácon for ma da por dos fa mi lias: la fa mi lia SCHR, con pro teí nas de un ta ma ño de ~200 ami noá -

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ci dos (aa) y la fa mi lia LCHR, con un ta ma ño de ~400 aa (Díaz–Pé rez y col., 2007). Di ver saspro teí nas ho mó lo gas a ChrA de am bas fa mi lias han sido ca rac te ri za das y se ha de mos tra do que son ca pa ces de con fe rir re sis ten cia a cro ma to (Agui lar-Barajas y col., 2008;Díaz-Magaña y col., 2009; Agui lar-Barajas y col., 2012).

El gen chrA de pUM505 se en cuen tra for man do par te de un pro ba ble ope rón chrBAC,el cual está si tua do den tro de una po si ble re gión de trans po si ción que está a su vez flan -quea da por los ge nes tnpA, que co di fi ca una trans po sa sa/re sol va sa, y tnpR, que co di fi cauna re sol va sa/in te gra sa (Fig. 2A) (Ra mí rez-Díaz y col., 2011). La pre sen cia de ope ro nescon arre glo gé ni co si mi lar se ha iden ti fi ca do en el plás mi do pMOL28 de la bac te riaGram-negativa Cu pria vi dus me ta lli du rans (Juhn ke y col., 2002), en un trans po són de la bac -te ria ae ró bi ca es tric ta Gram-negativa Ochro bac trum tri ti ci (Bran co y col., 2008) y en el me -ga plás mi do de la bac te ria ae ró bi ca Gram-negativa Burk hol de ria xe no vo rans LB400(Acos ta-Navarrete y col., 2014). Se ha des cri to que el gen chrC del plás mi do pMOL28 de C.me ta lli du rans CH34 co di fi ca a una pro teí na ChrC con fun ción de su pe ró xi do dis mu ta sa(Juhn ke y col., 2002). Sin em bar go, el aná li sis de la se cuen cia del gen chrC de pUM505mos tró que este co di fi ca a una pro teí na qui mé ri ca de 86 aa, en don de el ex tre mo ami nomues tra si mi li tud con ChrC mien tras que el ex tre mo ca bo xi lo mues tra si mi li tud con una pro -

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Fi gu ra 2. Trans po so nes de re sis ten cia a cro ma to (A) y mer cu rio (B y C) del plásmi do pUM505. Se mues tran los de ter -mi nan tes de re sis ten cia a cro ma to (fle chas ama ri llas) y mer cu rio (fle chas azu les). Con fle chas ro jas se in di can los ele men -tos mó vi les, en co lor na ran ja un gen que co di fi ca a una pro teí na hi po té ti ca (PH), y con lí neas ver ti ca les las se cuen ciasre pe ti das in ver ti das (IR). Los pro ba bles pro mo to res (P) se se ña lan con fle chas del ga das y el ta ma ño en aa de las pro teí nasco di fi ca das son in di ca dos.

teí na con fun ción no co no ci da del trans po són Tn5719 del plás mi do pB4 de Pseu do mo nas,esto in di ca que ChrC de pUM505 no es fun cio nal. Se ha su ge ri do que chrB de pMOL28 co di -fi ca un re gu la dor trans crip cio nal de la ex pre sión del gen chrA (Juhn ke y col., 2002). Esta hi -pó te sis ha sido re for za da por la ca rac te ri za ción de la pro teí na ChrS, co di fi ca da por el genchrS (ho mó lo go a chrB) de Ba ci llus sub ti lis 168, la cual for ma par te de la fa mi lia de los re gu -la do res LrpC y cuya ex pre sión dis mi nu ye la re sis ten cia a cro ma to, pro ba ble men te por dis mi -nuir los ni ve les de ex pre sión de los ge nes chr, la cual es in cre men ta da en pre sen cia del ión(Agui lar-Barajas y col., 2013).

1.1.2. De ter mi nan tes de re sis ten cia a mer cu rioLa IG del plás mi do pUM505 con tie ne dos pro ba bles ope ro nes de re sis ten cia a mer cu -

rio (mer): un ope rón com ple to, cons ti tui do por los ge nes merRTPFADE (orf’s 68 a 74) y unope rón in com ple to, for ma do so la men te por los ge nes merRTP (orfs 60 a 62) (Fig. 2, pa nel By C). Se ha des cri to que los ge nes que co di fi can pro teí nas que con fie ren re sis ten cia a mer -cu rio (Hg2+) se en cuen tran lo ca li za dos en cro mo so mas, plás mi dos y trans po so nes en unagran di ver si dad de arre glos, a me nu do con la du pli ca ción y dis tri bu ción de ge nes mer en treva rios re pli co nes en una mis ma cé lu la (Bar kay y col., 2003).

El ope rón mer com ple to de pUM505 se en cuen tra for man do par te de un pro ba ble ele -men to de trans po si ción, flan quea do por los ge nes que co di fi can a la re sol va sa Bin (orf 67) yla trans po sa sa TnpA (orf 75) (Fig. 2B). Adi cio nal men te, se iden ti fi ca ron se cuen cias re pe ti -das in ver ti das ca rac te rís ti cas del trans po són Tn3 al fi nal del gen tnpA y cer ca del gen binR,lo que su gie re que esta re gión es un re ma nen te de un even to de trans po si ción (Ra mí -rez-Díaz y col., 2011). El aná li sis de la se cuen cia mos tró pro ba bles pro mo to res río arri ba delos ge nes merT y merR (Ra mí rez-Díaz y col., 2011), lo que su gie re que los ge nes mer for -man par te de un ope rón fun cio nal. El gen merP co di fi ca a la pro teí na MerP que par ti ci pa en la unión ini cial de Hg2+ y los ge nes merTFE co di fi can las pro teí nas de mem bra na MerT, MerF yMerE, res pec ti va men te, que par ti ci pan en la cap tu ra de Hg2+ (Bar kay y col., 2003; Ki yo no ycol., 2009). El gen merA co di fi ca a MerA, la en zi ma re duc ta sa de mer cu rio que ca ta li za la re -duc ción de Hg2+ a Hg0 vo lá til (Bar kay y col., 2003). Fi nal men te, MerR y MerD es tán in vo lu -cra dos en la re gu la ción de la ex pre sión de los ge nes es truc tu ra les en res pues ta a los io nesde mer cu rio.

Por otra par te, el ope rón mer in com ple to de pUM505 (Fig. 2C) se lo ca li za re la ti va -men te cer ca del ope rón mer com ple to y las pro teí nas RTP co di fi ca das por es tos ge nes tie -nen 47, 46 y 49% de iden ti dad con las pro teí nas co di fi ca das por sus ho mó lo gos si tua dos enel ope rón com ple to (Ra mí rez-Díaz y col., 2011). Adi cio nal men te, este ope rón está flan quea -do por ge nes que co di fi can a una trans po sa sa TnpA (orf 64) y una re com bi na sa (orf 59). Esto in di ca que este ope rón for ma par te de un trans po són, pero que de bi do a que ca re ce de la re -duc ta sa MerA, es tos de ter mi nan tes no son los res pon sa bles de la re sis ten cia a mer cu rio.

El plás mi do pUM505 con fie re re sis ten cia a mer cu rio cuan do es trans fe ri do a la cepaes tán dar P. ae ru gi no sa PAO1, lo que ha su ge ri do que el ope rón merRTPFADE es fun cio naly que éste es el res pon sa ble de la re sis ten cia a mer cu rio, ya que po see el gen de la re duc ta -

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sa merA que es esen cial para di cho fe no ti po. Sin em bar go, la pre sen cia de los ge nes de re -sis ten cia a mer cu rio y cro ma to flan quea dos por ele men tos mó vi les y lo ca li za dos en la IG depUM505 su gie re que és tos po drían ha ber sido ad qui ri dos por trans fe ren cia ho ri zon tal y queesta ca rac te rís ti ca es un fac tor se lec ti vo para la pre va len cia y dis tri bu ción del plás mi do enbac te rias hos pe de ras.

Con el pro pó si to de de ter mi nar si los pro ba bles trans po so nes de mer cu rio y cro ma toiden ti fi ca dos tie nen la ca pa ci dad de trans lo car se a otra mo lé cu la de DNA, en nues tro la bo ra -to rio se trans fi rie ron el plás mi do pUM505 y el vec tor pUCP20 (que con tie ne un gen que con -fie re re sis ten cia a car be ni ci li na) a la cepa de P. ae ru gi no sa PAO1 y se se lec cio na ronmu tan tes sen si bles al an ti bió ti co. Las mu tan tes pre sen ta ron re sis ten cia a am bos io nes mer -cu rio y cro ma to y esta re sis ten cia pudo ser trans fe ri da a cé lu las de E. coli por me dio de latrans for ma ción con DNA plas mí di co de las mu tan tes, se lec cio nan do trans for man tes por lare sis ten cia a cro ma to y/o mer cu rio (Re yes-Gallegos, 2013). Su gi rien do que la sen si bi li dadal an ti bió ti co se debe a la trans lo ca ción de am bos trans po so nes en el gen que co di fi ca a lare sis ten cia al an ti bió ti co lo ca li za do en pUCP20. Sin em bar go, el fe no ti po de re sis ten cia a los io nes no de ter mi na si la IG de re sis ten cia fue trans fe ri da en su to ta li dad o si los ge nes de re -sis ten cia a cro ma to y mer cu rio cons ti tu yen un trans po són com pues to que fue trans fe ri do,por lo que el aná li sis está aún en pro ce so.

Por lo tan to, su ge ri mos que la pre sen cia de ge nes de re sis ten cia a me ta les enpUM505 es un ele men to im por tan te para la pre va len cia y dis tri bu ción de este plás mi do enhués pe des que ha bi tan am bien tes con ta mi na dos por cro ma to y mer cu rio.

1.2. Isla de pa to ge ni ci dadLa PAI de pUM505 (Fig. 1) con sis te de 78 orf’s (1-51 y 112-138) de los cua les 64 han

sido en con tra dos en las is las de pa to ge ni ci dad PAPI-1 y PAPI-2 de P. ae ru gi no sa PA14, unais la do clí ni co sig ni fi ca ti va men te más vi ru len to que la cepa P. ae ru gi no sa PAO1 (He y col.,2004). La PAI de pUM505 con tie ne los ge nes de re pli ca ción del DNA y de la trans fe ren ciacon ju ga ti va, así como 41 ge nes que co di fi can PH. La isla po see el ope rón pil com pues to porge nes que co di fi can a pro teí nas in vo lu cra das en la bio gé ne sis de un pi lus tipo IV, es truc tu raesen cial para la trans fe ren cia de plás mi dos (Juhas y col., 2008) y que par ti ci pa en la ad he -sión de bac te rias pa tó ge nas a cé lu las epi te lia les pro mo vien do la re la ción pa tó ge no–hos pe -de ro (He y col., 2004). Esta pro pie dad cla si fi ca a pUM505 como un miem bro de la fa mi lia deplás mi dos tipo IncI, que se han en con tra do con ma yor fre cuen cia en ce pas de E. coli pa tó ge -nas que en ce pas co men sa les (John son y col., 2007).

Adi cio nal men te, la PAI po see ge nes ho mó lo gos a los ge nes virB4/virD4 de la bac te riade la ri zós fe ra de plan tas Agro bac te rium tu me fa ciens, que co di fi can a pro teí nas que for manpar te del sis te ma de se cre ción tipo IVA (T4SS), el cual está con for ma do por una do ce na depro teí nas y que se es pe cia li za en la trans fe ren cia de ma cro mo lé cu las a tra vés de la mem -bra na (Llo sa y col., 2009). Los ge nes virB4/virD4 de pUM505, a di fe ren cia de sus ho mó lo gos de A. tu me fa ciens, no se en cuen tran for man do par te del mis mo ope rón, por el con tra rio,

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cada uno for ma par te de un pro ba ble ope rón cu yos miem bros no han sido aún ca rac te ri za -dos (Ro drí guez-Andrade, 2015). El sis te ma T4SS de A. tu me fa ciens me dia la trans fe ren ciade ge nes on co gé ni cos a cé lu las ve ge ta les, re sul tan do en la for ma ción de tu mo res en lasplan tas (Juhas y col., 2008). Los ge nes virB4/virD4 pre sen tes en Bar to ne lla bacilli for mis,bac te ria en dé mi ca de al gu nos paí ses de Amé ri ca del Sur que pro du ce in va sión ma si va deeri tro ci tos y con se cuen te men te ane mia he mo lí ti ca in tra vas cu lar se ve ra, co di fi can a pro teí -nas im pli ca das en la trans lo ca ción de pro teí nas efec to ras al in te rior de cé lu las epi te lia les,es ta ble cien do la in fec ción cró ni ca al per tur bar fun cio nes ce lu la res crí ti cas (Llo sa y col.,2009).

La pre sen cia de la isla de pa to ge ni ci dad en pUM505 su gie re que los ge nesvirB4/virD4, y pro ba ble men te otros ge nes lo ca li za dos en esta re gión, pue de in cre men tar lavi ru len cia de P. ae ru gi no sa. En con cor dan cia con esta hi pó te sis, re sul ta dos pre li mi na res ennues tro la bo ra to rio, me dian te en sa yos de vi ru len cia em plean do el mo de lo de in fec ción enho jas de le chu ga, han mos tra do que la cepa de P. ae ru gi no sa PAO1 trans for ma da con elplás mi do pUM505 es más vi ru len ta, que la cepa sin el plás mi do. Por tal ra zón ha sido de in te -rés de nues tro gru po de tra ba jo el iden ti fi car cuá les son los ge nes de pUM505 que par ti ci panen el in cre men to de la vi ru len cia en P. ae ru gi no sa. Para esto se ha cons trui do un ban co dege nes de pUM505 (Ro drí guez-Andrade, 2015) y a las clo nas ob te ni das se les está eva luan -do el ni vel de vi ru len cia que son ca pa ces de con fe rir.

1.3. Ge nes de re pa ra ción de daño al DNA y de re sis ten cia a es trés oxi da ti voAle da ño a la PAI de pUM505, se iden ti fi ca ron los ge nes umuD y umuC (orfs 55 y 56,

res pec ti va men te) que for man par te de un pro ba ble ope rón (Fig. 3A). Se ha des cri to que, encon jun to, los ge nes umuD/umuC co di fi can a una DNA po li me ra sa tipo V pro pen sa a error,en zi ma im pli ca da en la re pa ra ción de da ños al DNA en la res pues ta SOS en E. coli (Fe rentzy col., 2001). P. ae ru gi no sa no con tie ne en su ge no ma ge nes umuD/umuC o ge nes ho mó lo -gos, lo cual se ha re la cio na do con su sig ni fi ca ti va sus cep ti bi li dad y baja tasa de mu ta gé ne sis ante la ex po si ción a luz ul tra vio le ta (UV) en com pa ra ción con E. coli, la cual es re sis ten te aluz UV de bi do a la in duc ción de un re per to rio de sis te mas de in duc ción que in clu ye a los ge -nes umuD/umuC (Si mon son y col., 1990). El gen umuD de pUM505 co di fi ca a una pro teí nade 143 aa que pre sen ta 41% de iden ti dad con la pro teí na umuD de E. coli.

El gen umuC, por su par te, co di fi ca a una pro teí na de solo 46 aa; sin em bar go, las pro -teí nas UmuC con fun ción re por ta da tie nen un ta ma ño de ~400 aa, lo que su gie re que el genumuC de pUM505 co di fi ca a una pro teí na trun ca da y por lo tan to no fun cio nal. Río arri ba delgen umuD se lo ca li zó una re gión ope ra do ra tipo caja SOS tras la pa da con el po si ble pro mo -tor iden ti fi ca do para umuD (Fig.3A). En E. coli la caja SOS es re co no ci da por la pro teí naLexA que re gu la ne ga ti va men te la trans crip ción de di ver sos ge nes (Fer nán dez de He nes -tro sa y col., 2003), su gi rien do que los ge nes umuD y umuC de pUM505 po drían es tar re gu la -dos por el daño al DNA. En B. sub ti lis, la ex pre sión de ge nes que per te ne cen al re gu lónSOS, como recA y lexA que co di fi can a pro teí nas cru cia les del sis te ma de re pa ra ción, se in -cre men ta pos te rior al daño al DNA; adi cio nal men te, es tos ge nes son in du ci dos a ni vel trans -

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crip cio nal des pués de ex po si ción a H2O2, in di can do que este agen te, que pro du ce daño alDNA, ori gi na la ac ti va ción de pro teí nas de re pa ra ción (Mos tertz y col., 2004). Se ha de mos -tra do que la trans fe ren cia del gen umuD a ce pas de E. coli y P. ae ru gi no sa con fie re to le ran -cia a agen tes que ge ne ran es trés como pa ra quat y mi to mi ci na C, res pec ti va men te y que laex pre sión de este gen se in du ce por mi to mi ci na C (Díaz-Magaña, Te sis doc to ral en pro ce -so). Esto su gie re que el gen umuD de pUM505 co di fi ca a un sis te ma de to le ran cia a agen tesque oca sio nan daño al DNA en P. ae ru gi no sa.

pUM505 tam bién po see el gen pdi (orf 32) el cual po see un pro ba ble pro mo tor sig ma70 y que co di fi ca a una di sul fu ro iso me ra sa (PDI) de 219 aa (Fig. 3 B), en zi ma que en otros

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Fi gu ra 3. Arre glo es truc tu ral de operón umuDC (A) y del gen pdi (B) del plásmi do pUM505. Las re gio nes co di fi can -tes se mues tran con fle chas an chas, mos tran do la di rec ción de la trans crip ción. Se in di can tam bién los pro ba bles pro mo to -res (P) con fle chas del ga das, la caja SOS de umuDC (rec tán gu lo blan co) y el ta ma ño de las pro teí nas co di fi ca das en aa. Enla par te in fe rior de cada pa nel se mues tra la com pa ra ción de la se cuen cia de nu cleó ti dos del pro ba ble pro mo tor de los ge nes umuDC y pdi con las se cuen cias con sen so del pro mo tor sig ma 70, in di can do las re gio nes -10 y -35 (re cua dros azu les), asícomo la re gión es pa cia do ra. Adi cio nal men te, se pre sen ta tras la pa do con el pro mo tor de umuDC la se cuen cia de la cajaSOS.

or ga nis mos ca ta li za la for ma ción y rup tu ra de en la ces di sul fu ro en tre re si duos de cis teí na en pro teí nas de se cre ción. Du ran te la for ma ción de los en la ces di sul fu ro, los elec tro nes sontrans fe ri dos has ta PDI y fi nal men te al oxí ge no mo le cu lar, cuya re duc ción pue de re sul tar enla for ma ción de es pe cies reac ti vas de oxí ge no (ERO) (Hay nes y col., 2004). La for ma re du ci -da (di tiol) de PDI ca ta li za la re duc ción de re si duos del tiol de un sub stra to par ti cu lar, ac tuan -do como iso me ra sa (Tian y col., 2008). Ade más, PDI pre sen ta ac ti vi dad de cha pe ro na,ayu dan do a las pro teí nas a adop tar un co rrec to ple ga mien to al ca ta li zar el in ter cam bio depuen tes di sul fu ro, su gi rien do que PDI está re la cio na da con la pro tec ción de pro teí nas ha ciael daño oxi da ti vo (Mis sia kas y col., 1994). El gen pdi de pUM505 au men tó su ex pre sión du -ran te la fase de cre ci mien to es ta cio na rio (Díaz-Magaña, Te sis doc to ral en pro ce so). En bac -te rias Gram-negativas se ha des cri to que en la fase es ta cio na ria se acu mu lan com pues tosque ge ne ran es trés oxi da ti vo y se in cre men ta la ex pre sión de ge nes de re sis ten cia a va riascon di cio nes de es trés (es trés oxi da ti vo, es trés os mó ti co y cam bios de pH) (Na va rro y col.,2010). Adi cio nal men te, la trans fe ren cia del gen pdi a P. ae ru gi no sa PAO1 in cre men tó dema ne ra mo de ra da la re sis ten cia a cro ma to, com pues to ge ne ra dor de es trés oxi da ti vo(Díaz-Magaña, Te sis doc to ral en pro ce so). Estos da tos in di can que la pre sen cia de sis te -mas fun cio na les de to le ran cia a es trés en pUM505 pue den cons ti tuir una ven ta ja evo lu ti vabajo con di cio nes am bien ta les hos ti les, lo que re pre sen ta ría una ven ta ja para las bac te riasque po seen este plás mi do.

1.4. Re sis ten cia a an ti bió ti cosLa trans fe ren cia del plás mi do pUM505 a P. ae ru gi no sa PAO1 con fie re un ni vel ele va -

do de re sis ten cia a ci pro flo xa ci na, en com pa ra ción con la cepa sin plás mi do (Fig. 4); sin em -bar go, el aná li sis in si li co de la se cuen cia de nu cleó ti dos de pUM505 no mos tró nin gún genre por ta do de re sis ten cia para este an ti bió ti co. Ci pro flo xa ci na, un an ti bió ti co del gru po de lasqui no lo nas, es una dro ga de am plio es pec tro que ac túa so bre bac te rias Gram-positivas yGram-negativas in hi bien do a las to poi so me ra sas IV y II (DNA gi ra sa), en zi mas que ac túanso bre la to po lo gía del DNA en ro llan do y de sen ro llan do la do ble hé li ce du ran te la re pli ca cióny la trans crip ción (Luz za ro, 2008). En P. ae ru gi no sa se ha des cri to que la re sis ten cia a qui no -lo nas se debe prin ci pal men te a mu ta cio nes en el gen que co di fi ca a la DNA gi ra sa (Cam bauy col., 1995). Con el pro pó si to de iden ti fi car los ge nes res pon sa bles de la re sis ten cia secons tru yó en nues tro la bo ra to rio un ban co de mu tan tes sen si bles a ci pro flo xa ci na (Cps) ob -te ni das por trans po si ción al azar. A la fe cha se han se lec cio na do al gu nas mu tan tes Cps

(Chá vez-Jacobo, 2015) cuya ca rac te ri za ción está en pro ce so. Au na do a ésto, se rea li zó laclo na ción y trans fe ren cia del con jun to de orf’s 35, 36 y 37 a E. coli J53-2, ob ser van do en en -sa yos pre li mi na res que es tos ge nes con fie ren re sis ten cia a ci pro flo xa ci na. El aná li sis in si li -co de las pro teí nas co di fi ca das por es tos ge nes su gie re que pue den cons ti tuir un sis te matri par ti ta de trans por te con for ma do por una pro teí na de mem bra na ex ter na, una de mem bra -na in ter na y una de es pa cio pe ri plás mi co, res pec ti va men te, el cual po dría par ti ci par en la re -sis ten cia a qui no lo nas me dian te la ex pul sión del an ti bió ti co del ci to sol ha cia el es pa cioex tra ce lu lar (Ro jas-Rojas, 2012).

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Con clu siónEl plás mi do pUM505 es un plás mi do con ju ga ti vo, ca paz de ser trans fe ri do bajo cier -

tas con di cio nes a otras ce pas de Pseu do mo nas, cons ti tu yen do un me ca nis mo para la trans -fe ren cia ho ri zon tal de ge nes. La pre sen cia de ge nes no ve do sos que pue den pro veer ace pas de Pseu do mo nas con una am plia va rie dad de pro pie da des para la adap ta ción, comore sis ten cia a me ta les pe sa dos, vi ru len cia, sis te mas de to le ran cia a es trés y re sis ten cia a an -ti bió ti cos, pue de con tri buir a la pre va len cia de este plás mi do en bac te rias de am bien te clí ni -co o am bien tal y por lo tan to in fluir en la evo lu ción de las bac te rias hos pe de ras.

Agra de ci mien tosTra ba jo rea li za do con apo yos de la Coor di na ción de Inves ti ga ción Cien tí fi ca

(UMSNH, No. 2.6 y No. 2.35) y del Con se jo Na cio nal de Cien cia y Tec no lo gía (CONACYT,No. 181747).

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Fi gu ra 4. Sus cep ti bi li dad a ci pro flo xa ci na de Pseu do mo nas ae ru gi no sa PAO1 con el plásmi do pUM505. Los cul ti vosse cre cie ron en cal do nu tri ti vo por 18 h a 37°C con agi ta ción cons tan te. Pos te rior men te se mi dió la ab sor ben cia a 590 nm.P. ae ru gi no sa PAO1 (O) y P. ae ru gi no sa PAO1 (pUM505) (). Se mues tran las ba rras de error es tán dar de la me dia, n= 6.

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