De structuur en stabiliteit van natuurlijke en …...o.a. met de fameuze ‘contaminatie’, stond...

Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep NMRSTR

De structuur en stabiliteit van natuurlijke en gemodificeerde deoxyoligonucleotiden

Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door

Dieter BUYST

Academiejaar 2010-2011

Promotor: Prof. Dr. Annemieke Madder Copromotor: Prof. Dr. José Martins

Begeleiders: Bjorn Van Gasse – Vicky Gheerardijn

Dankwoord

1e jaar bachelor, op het einde van de 1e dag na de 1e les fysica maakte ik de bedenking of chemie wel

de juiste studiekeuze was. Nu, na het schrijven van deze thesis, lijkt het alsof die 5 jaar voorbij zijn

gevlogen en ben ik er blij om dat ik die dag heb besloten om toch verder te doen. Maar, zoals altijd,

voltooi je zoiets niet op je eentje en er zijn genoeg mensen die me geholpen hebben over de jaren

heen. Ook bij het schrijven van dit werk zijn er mensen die me hebben geholpen en die ik hierbij wil

bedanken.

Eerst en vooral wil ik Prof. José Martins en Prof. Annemieke Madder bedanken voor de kans die zij

me gegeven hebben om binnen hun onderzoeksgroepen deze thesis aan te vatten. Beiden hebben

mij geholpen om alle ‘buystismen’ te stroomlijnen en wanneer ik vragen of moeilijkheden had, zoals

o.a. met de fameuze ‘contaminatie’, stond hun deur altijd open en namen ze de tijd om mij te helpen

en alles duidelijk uit te leggen.

Mijn twee begeleiders, Bjorn en Vicky, ben ik ook zeer dankbaar voor alle geduld en hulp die ze mij

geboden hebben gedurende dit project. Zij stonden ook mee in voor de toffe sfeer die er heerste op

de hipste bureau van de S4 of in het labo, zij het o.a. met de beruchte wekelijkse verkiezing of de

leuke babbels over een gedeelde passie voor muziek (nu ja, eurosong uitgezonderd).

Daarnaast wil ik graag nog Tim en Katrien bedanken voor het aanleren van een aantal nieuwe

praktische vaardigheden en de vrolijke noten tussendoor. Ook wanneer ik dacht dat ik iets had

mispeuterd aan de 700, stond Tim altijd paraat om mij gerust te stellen.

De altijd goed gehumeurde Freya was ook altijd beschikbaar voor een snelle vraag, een toffe babbel

of een mopje tussendoor, net als Katelijne en als ik een probleem had waar niemand mee kon

helpen, was er Davy die wel een passend antwoord wist.

Een thesis schrijven onderga je nooit alleen, en op momenten dat het tegenzat, waren er altijd mijn

klasgenoten Matthias, Gertjan, Evelien, Sven en Korneel waarbij ik even mijn zegje kon doen.

Ten slotte wil ik nog een aantal mensen bedanken die me nauw aan het hart liggen, zoals Lise die

steeds geduldig wachtte tot ik klaar was met werken aan ‘die thesis’, Greet en Bruno met hun opvang

voor thesisstudenten en last but not least, mijn papa voor de kans die hij me heeft gegeven om die 5

jaar aan de ‘unief’ te kunnen doorbrengen.

i

Inleiding

In dit werk wordt dieper ingegaan op de studie van DNA duplexen aan de hand van NMR. In het

eerste gedeelte is er tijdens de temperatuurstudie uitsluitend gewerkt met natuurlijke

oligonucleotiden terwijl in het tweede deel een opstap wordt gemaakt naar de synthese en studie

van gemodificeerde DNA duplexen.

Dit werk kent twee overkoepelende delen, NMR en synthese, en heeft de volgende indeling:

In hoofdstuk 1 wordt de algemene context geschetst waarin dit werk kadert, het ontwikkelen van

een serine protease mimic op basis van een DNA scaffold.

Hoofdstuk 2 bevat de materialen en methoden die werden toegepast om de NMR temperatuurstudie

en toekenning van de verschillende DNA sequenties uit te voeren.

In hoofdstuk 3 wordt dieper ingegaan op de toekenning van de duplexen aan de hand van 2D NOESY

spectra en de bijhordende T1‐metingen.

Hoofdstuk 4 handelt over de eigenlijke temperatuurstudie waar de verschillende resultaten worden

geïnterpreteerd aan de hand van vooraf besproken theoretische aspecten en modellen.

Hoofdstuk 5 is een zijsprong van de temperatuurstudie in hoofdstuk 4. Hierin wordt een poging

ondernomen om via het fenomeen van cryorestrictie meer informatie te verkrijgen die behulpzaam

kan zijn bij de toekenningen van de bestudeerde oligonucleotiden.

Ten slotte in hoofdstuk 6 wordt dieper ingegaan op de synthese van gemodificeerde DNA duplexen,

die reeds een eerste stap zijn richting de eigenlijke serine protease mimic. Hier wordt tevens een

studie uitgevoerd betreffende de smelttemperaturen van alle bestudeerde en gesynthetiseerde

duplexen die kunnen gecorreleerd worden met eerder gemaakte observaties.

ii

Inhoudsopgave

Hoofdstuk 1 Algemene Inleiding .............................................................................................................1

1.1 Serine proteasen en α‐chymotrypsine ..........................................................................................1

1.2 Nood aan ‘enzyme mimics’ ............................................................................................................2

1.3 Bouwstenen van nucleotiden en nucleosiden ...............................................................................5

1.3.1 Algemene opbouw DNA ......................................................................................................5

1.3.2 Basenparing en duplexvorming ...........................................................................................7

1.3.3 Base en basenpaar flexibiliteit ............................................................................................8

1.3.4 Suiker pucker .......................................................................................................................9

1.3.5 Algemene DNA‐structuur ................................................................................................. 10

1.4 Doelstellingen .............................................................................................................................. 12

1.4.1 DNA als scaffold .................................................................................................................... 12

1.4.2 Screening van alternatieve sequenties en bijhorende temperatuurstudies ........................ 14

1.4.3 Metingen op 1mm‐probe met behulp van het cryorestrictie fenomeen ............................. 15

1.4.4 Nagaan van de invloed van introductie van modificaties in sequenties .............................. 15

1.5 Referenties .................................................................................................................................. 17

Hoofdstuk 2 Staalvoorbereiding en meetmethoden ........................................................................... 18

2.1 Overzicht bestudeerde DNA sequenties ..................................................................................... 18

2.2 Staalvoorbereiding ...................................................................................................................... 19

2.3 Meetmethoden en pulssequenties ............................................................................................. 20

2.3.1 Eendimensionale technieken .............................................................................................. 20

2.3.2 2D NOESY techniek ............................................................................................................... 24

2.3.3 Meten van T1 via het inversion recovery experiment ......................................................... 26

2.4 Referenties .................................................................................................................................. 27

Hoofdstuk 3 Toekenning van de DNA sequenties via 2D NOESY ........................................................ 28

3.1 Wild type ..................................................................................................................................... 28

3.2 C9G20 .......................................................................................................................................... 31

3.3 G5C24 .......................................................................................................................................... 32

3.4 C2G27 .......................................................................................................................................... 34

3.5 G2C27 .......................................................................................................................................... 35

3.6 Conclusie...................................................................................................................................... 37

3.7 Referenties .................................................................................................................................. 38

iii

Hoofdstuk 4 Temperatuurstudie wild type en alternatieve sequenties ............................................. 39

4.1 “Two‐state” model voor DNA ...................................................................................................... 39

4.2 Aard van de iminoprotonen en de gevolgen op hun waarneembaarheid in de spectra ........... 41

4.3 Wild type (T‐Tmismatch) ............................................................................................................ 44

4.3.1 Chemische verschuiving in functie van temperatuur .......................................................... 44

4.3.2 Maximale waarneembare temperatuur TMax ....................................................................... 47

4.3.3 Maximale T2*‐tijd ................................................................................................................. 47

4.4 C9G20 ......................................................................................................................................... 51



4.4.3 Maximale T2*‐tijd ................................................................................................................. 55

4.4.4 Thymine 5‐methyl signalen in functie van de temperatuur ................................................. 56

4.5 G5C24 ......................................................................................................................................... 58



4.6 C2G27 ......................................................................................................................................... 61



4.6.3 Maximale T2*‐tijd ................................................................................................................. 64

4.7 G2C27 ......................................................................................................................................... 65



4.7.3 Maximale T2*‐tijd ................................................................................................................. 69

4.7.4 Vergelijking C2G27 met G2C27 ............................................................................................ 70

4.8 Conclusie...................................................................................................................................... 71

4.9 Referenties ................................................................................................................................. 72

Hoofdstuk 5 NMR onder het vriespunt met cryorestrictie ................................................................. 73

5.1 Wat is cryorestrictie ? ................................................................................................................. 73

5.2 Metingen bij lage temperatuur (<0°C) ....................................................................................... 73

5.3 Vereisten cryorestrictie en staalvoorbereiding ........................................................................... 74

5.4 Resultaten temperatuurstudies .................................................................................................. 76

5.4.1 Sucrose ................................................................................................................................. 76

5.4.2 Temperatuurstudies duplexen: wild type en G2C27 ........................................................... 80

5.5 Conclusie...................................................................................................................................... 86

iv

5.6 Referenties .................................................................................................................................. 86

Hoofdstuk 6 Synthese en inbouwen van een gemodificeerde THis bouwsteen .................................. 87

6.1 Gemodificeerde nucleotiden ...................................................................................................... 87

6.2 Heterocyclische base modificaties .............................................................................................. 87

6.3 Doel .............................................................................................................................................. 89

6.4 Algemeen overzicht van de synthese .......................................................................................... 89

6.4.1 Voorbereiding gemodificeerde bouwsteen ......................................................................... 89

6.4.2 Geautomatiseerde DNA synthese ........................................................................................ 90

6.4.3 Algemene synthese van het histidine analoog..................................................................... 92

6.5 Experimenteel gedeelte .............................................................................................................. 85

6.6 Referenties ................................................................................................................................ 105

Algemene conclusie ............................................................................................................................ 106

Appendix ............................................................................................................................................. 108

Engelstalige samenvatting .................................................................................................................. 124

1

Hoofdstuk1:Algemeneinleiding

1.1 Serineproteasenenα‐chymotrypsine

Peptidebindingen staan over het algemeen bekend als zeer stabiele bindingen, voornamelijk door de

resonantiestructuur van dit type binding. Mede dankzij deze delokalisatie van het vrije

elektronenpaar zal enerzijds de carbonylfunctionaliteit gekenmerkt worden door een afgenomen

elektrofiel karakter, anderzijds zal de binding tussen het carbonylkoolstofatoom en het stikstofatoom

van het volgende aminozuur in de binding versterkt worden door een partieel dubbel

bindingskarakter. Een willekeurige peptidebinding met overeenkomstige resonantiestructuur kan

worden voorgesteld zoals in figuur 1.1.

Omwille van de stabiliteit van deze peptidebindingen is er nood aan enzymen, die instaan voor het

afbreken van eiwitten en die het breken van deze bindingen vereenvoudigen. Zo kunnen serine

proteasen dit gebrek aan reactiviteit overwinnen door gebruik te maken van een reactieve,

nucleofiele hydroxylgroep, afkomstig van een serine residu aanwezig in de actieve site. Deze klasse

van enzymen is bovendien selectief voor peptidebindingen die gelegen zijn naast aminozuren met

grote hydrofobe zijgroepen, dit door de aanwezigheid van een hydrofobe binding ‘pocket’ die instaat

voor het tot stand komen van hydrofobe contacten met deze hydrofobe zijketens [1].

De katalytische site, waar deze geactiveerde hydroxylgroep kan worden teruggevonden, komt tot

stand door de samenwerking tussen drie verschillende aminozuren: Ser195, His57 en Asp102. Deze

drie aminozuren vertonen een unieke samenwerking via een onderling waterstofbrugnetwerk, zoals

schematisch geïllustreerd in figuur 1.2, ook wel de katalytische triade genoemd.

Het carboxylaatanion van Asp102 (pKa 2,02) is bij fysiologische pH negatief geladen en kan, mede

door de proximiteit in het enzyme, een waterstofbrug vormen met het imidazool amino proton van

His57 . Hierdoor vindt er een oriëntatie plaats van het vrije elektronenpaar van het andere

stikstofatoom van His57 naar het hydroxylproton van Ser195, hetgeen uiteindelijk zorgt voor een

activatie van deze hydroxylgroep. In werkelijkheid blijkt het mechanisme iets subtieler te zijn: het

Figuur 1.1 Resonantiestructuur peptidebinding

Figuur 1.2 Katalystische triade uit α‐chymotrypsine met ladingsstabilisatie mechanisme

2

waterstofbrugnetwerk komt enkel tot stand bij de binding van een geschikt subtraat en bijgevolg ook

de activering van Ser195. Dit is in overeenstemming met het ‘induced fit’‐model waarbij centraal

staat dat de actieve site zich lichtjes aanpast bij de binding van het substraat, hetgeen uiteindelijk

zorgt voor een sterkere interactie tussen beide [2]. Verder komt de activatie van Ser195 zelf niet neer

op een deprotonatie (pKa~15), maar omvat eerder een sterke polarisatie van de O‐H‐binding door de

actie van His57, wat uiteindelijk leidt tot een toename in nucleofiel karakter van het beschouwde

zuurstofatoom. De hydrolyse van peptidebindingen wordt dus vergemakkelijkt door een

ladingsstabilisatie mechanisme. De ruimtelijke situering van de triade in de volledige structuur van α‐

chymotrypsine kan worden voorgesteld zoals het geval is in figuur 1.3. De drie residuen van de

katalytische triade zijn in de detailweergave aangeduid volgens de kleurcode rood (zuurstof), groen

(koolstof) , blauw (stikstof) terwijl de molecule in het donkerblauw overeenkomt met een inhibitor

gebonden in de actieve site. Hiermee kan tevens worden aangetoond dat de drie essentiële

functionaliteiten van de katalytische triade zich wel degelijk aan het oppervlak bevinden in de

“binding pocket” van het enzym.

1.2Noodaan‘enzymemimics’

Er zijn verschillende redenen waarom men zou trachten een katalytisch systeem, zoals het

bovenstaand enzyme, na te bootsen. Een eerste reden bestaat erin dat het toelaat na te gaan wat de

individuele bijdrage is van iedere functionaliteit aan het volledige biokatalytische proces: een inzicht

in de effectieve werking van biomoleculen is dan ook zeer belangrijk wanneer men artificiële

katalysatoren wil ontwerpen die meer robuust zijn dan de oorspronkelijke enzymen [3]. Ook andere

aspecten, zoals eventuele preorganisatie van groepen onderling, voorafgaand aan het eigenlijke

katalyseproces, kunnen worden opgehelderd met behulp van een vereenvoudigd, kunstmatig

katalytisch systeem of katalyse ‘mimic’ . Het potentiele synthesegemak van dit systeem kan ook een

van de grote voordelen zijn: eventuele vereenvoudigingen in het syntheseproces dienen niet ten

Figuur 1.3 Positie (rood) en uitvergroting van de katalytische triade Asp102, His57 en Ser195 in α‐chymotrypsine

PDB identificatienummer 1AFQ. Deze figuur werd geproduceerd met PyMol 1.3

3

koste te gaan van de activiteit terwijl dit bij enzymen wel het geval is daar aanpassingen in de

primaire structuur hun weerslag kunnen hebben op de latere structuren waardoor de activiteit

mogelijk verloren gaat. Historische voorbeelden van ‘enzyme mimics’ terug te vinden in de literatuur

zijn legio:

De eerste systemen geïntroduceerd als algemeen

‘kunstmatig’ enzyme waren gebaseerd op een cyclodextrine

structuur [4] en worden verder ook specifiek toegepast in de

ontwikkeling van een mimic voor chymotrypsine (D’Souza et

al. [5]). Samen met deze ‘mimic’ werd er ook een mogelijk

mechanisme voorgesteld omtrent de katalytische activiteit.

Er werd echter aangetoond dat dit mechanisme niet

optreedt: de aanwezige imidazool‐ en

carboxylaatfunctionaliteit hebben geen katalytische activiteit

maar belemmeren juist de reactie door het optreden van

sterische hinder. Deze uitleg wordt gesteund door de

observatie dat β‐cyclodextrine alleen de hydrolyse vier maal

sneller katalyseert dan het geval is bij het voorgestelde

mimicsysteem [6], [7].

Verder stelden Cram et al. een ‘spherand’ gebaseerd

model voor als mimic van chymotrypsine met de

functionele groepen verantwoordelijk voor de biologische

functie verbonden aan de algemene structuur van de

macrocylische ring [8]. De ringstructuur zelf, welke dienst

doet als bindingssite, is in staat om selectief

alkylammonium gebaseerde ionen te complexeren. De

molecule zelf zoals hier voorgesteld is nooit volledig

gesynthetiseerd. Bijgevolg is de katalytische activiteit van

dit model nooit uitvoerig getest. Echter het feit dat de

gedeeltelijke synthese alleen al minstens 30 stappen

vereist en een magere opbrengst kent van 0,9% zijn niet

echt hoopgevende vooruitzichten voor de verdere

ontwikkeling van dit type mimic.

Nog een andere bekende methode is gebaseerd op het

ontwerp van een (cyclisch) peptide dat de aminozuren, die

de actieve site van het eiwit vormen, in een geschikte oriëntatie en gewenste onderlinge

afstand draagt. Deze residuen zijn in de structuur rechtsreeks met elkaar verbonden aan de

hand van peptidebindingen. Deze aanpak staat ook bekend als de ‘surface simulation’

synthesis methode en het peptide dat hiervan het resultaat is, wordt een ‘pepzyme’

genoemd. Ondermeer Atassi en Manshouri publiceerden een voorbeeld van dergelijke

aanpak met een mimic van de actieve site van chymotrypsine [9]. Figuur 1.6 toont een

voorbeeld van dergelijke pepzymes die de actieve site van α‐chymotrypsine nabootsen. De

Figuur 1.4 Enzymemimic van de katalytische triade via cylcodextrinescaffold

Figuur 1.5 Synthetische mimic voorgesteld door Cram. Molecule enkel gesynthetiseerd zonder carbonzuurfunctie in lichtgrijs

4

residuen aangeduid in het lichtgrijs

vervullen de rol van actieve site terwijl

de andere residuen overeenkomen met

glycine “spacers” gebruikt voor het

verkrijgen van de geschikte afstanden

tussen actieve residuen. Deze mimic

vertoont volgens de gepubliceerde

resultaten goede activiteit ten opzichte

van ester substraten als ook t.o.v.

eiwitten. Bovendien zou dit mimic‐

systeem nog katalytische activiteit

vertonen bij temperaturen waarbij

chymotrypsine zelf over geen of heel

beperkte activiteit beschikt. Aan de hand

van inhibitie en kinetische studies zou men kunnen aantonen hebben dat het

werkingmechanisme van dit model sterk analoog zou zijn aan dat van chymotrypsine. Latere

papers, zoals onder andere [10] hebben nooit de eerder geclaimde resultaten betreft de

katalytische activiteit van deze mimic kunnen bevestigen. Hieruit wordt besloten dat de

aanwezigheid van de benodigde functionaliteiten niet voldoende is voor het verkrijgen van

katalytische activiteit, maar dat hun onderlinge precieze en stabiele oriëntatie ook

noodzakelijk zijn.

Een laatste voorbeeld, ontwikkeld in de groep van prof. Dr. Madder, maakt gebruik van een

drietands basisstructuur als startpunt voor serine protease mimics. Deze bestaan uit drie

onafhankelijke peptide ketens gekoppeld aan een centrale core. Elke peptide keten bevat

dan één van de drie benodigde residuen uit de katalytische triade, waarbij de specifieke

ruimtelijke oriëntatie van de drie afzonderlijke ketens de nabijheid en interacties tussen de

verschillende katalytische residuen gaat bevorderen [11]. De synthese van bibliotheken met

potentiële serine protease modellen zoals hier kort weergegeven wordt momenteel nog

onderzocht.

Figuur 1.7 Serine protease mimic op basis van 1ste generatie tripodale scaffold

Figuur 1.6 Pepzyme als mimic van chymotrypsine ontwikkeld aan de hand van de “surface simulation”

methode

5

Dit huidig werk kadert in een groter onderzoek naar een nieuwe variant van dergelijke enzyme

mimics waarbij analoog gebruik wordt gemaakt van de drie benodigde katalytische residuen uit de

actieve site van α‐chymotrypsine nl. serine, histidine en aspartaat. Het grote verschil met voorgaand

werk is evenwel dat deze worden ingebouwd in een andere biologische basisstructuur: DNA. Deze

structuur heeft als grootste voordeel dat de manier waarop twee strengen met elkaar zullen

koppelen, gegeven de opeenvolging van de verschillende basen, volledig kan worden voorspeld.

Daarnaast is de sterk pregedefinieerde structuur ook een groot pluspunt, wat van DNA een

uitstekend skelet of ‘scaffold’ maakt. Het grootste nadeel van deze scaffold daarentegen is het

gebrek aan een grote diversiteit van de bouwstenen en daarmee samenhangend het gebrek aan

diverse chemische functionaliteiten, nodig voor de beoogde katalyseactiviteit. Dit laatste nadeel is

duidelijk niet het geval bij eiwitten. Een van de mogelijke manieren om de chemische diversiteit van

nucleïnezuren te vergroten, en zo dus ook het katalytische potentieel, is het inbouwen van

gemodificeerde DNA bouwstenen om op die manier de drie benodigde residuen te introduceren in

de DNA structuur. Afhankelijk van de wijze waarop deze worden ingebouwd, kunnen dankzij de

structuur van de scaffold, opnieuw de nodige interacties en nabijheid tussen de residuen tot stand

worden gebracht noodzakelijk voor het verkrijgen van de katalytische activiteit. Gezien het belang

van de DNA structuur in het tot stand komen van deze zogenaamde deoxyribozymen, wordt kort

ingegaan op de algemene structuur van DNA , waarna dieper wordt ingegaan op de werkwijze voor

de introductie van gemodificeerde bouwstenen en de daarmee samenhangende praktische

vereisten.

1.3Bouwstenenvannucleotidenennucleosiden

1.3.1 AlgemeneopbouwDNA

DNA behoort tot de klasse van de nucleïnezuren. Een nucleïnezuur kan beschouwd worden als een

macromolecule opgebouwd uit een aantal verschillende nucleotide‐bouwstenen, net zoals een

polymeer kan bestaan uit verschillende monomeren. Een nucleotide is zelf opgebouwd uit 3

verschillende bouwstenen, namelijk een fosfaatgroep, een suiker en één van de vier mogelijke,

stikstofbevattende heterocyclische basen: adenine, guanine, cytosine en thymine. Buiten de

verschillende mogelijke basen, zijn de overige bouwstenen nl. de fosfaatgroep en het suiker

(deoxyribose of ribose) identiek voor alle nucleotide‐eenheden in een DNA of RNA‐sequentie, zoals

kan gezien worden in figuur 1.8.

Figuur 1.8 Fosfaatgroep met ribose‐eenheid

Figuur 1.9 Stereochemie van een natuurlijk β‐nucleoside

O4'

C4'

C3' C2'

C1'Base

O3'

C5'

O5'

P

O3'

O O

O4'

C4'

C3' C2'

C1'

Base

HO

C5'HO

H

H

H

6

De individuele nucleotiden zijn in een nucleïnezuur aan elkaar verbonden op een lineaire manier aan

de hand van een eigen fosfaatgroep die gebonden is aan de 5’‐positie van het suiker, met de 3’ OH‐

functionaliteit van het voorafgaand nucleotide. In het geval van RNA wordt thymine vervangen door

uracil en draagt de suiker nog een extra hydroxylgroep op het C2’‐koolstofatoom.

De ‘glycosidische binding’ vormt de binding tussen het suiker en de base van éénzelfde

oligonucleotide en kan zowel α of β ingeplant zijn. De stereochemie van deze binding is wel degelijk

van belang. In natuurlijke nucleïnezuren is de configuratie van deze binding altijd β, wat er op neer

komt dat de glycosidische binding altijd boven het vlak van het suiker staat, in dezelfde richting als

het C5’‐koolstofatoom. In de volledige oligonucleotidesequentie zal het O3’‐atoom zich aan de

onderkant bevinden ten opzichte van het vlak van het suiker en dus tegengesteld aan de ruimtelijke

situering van de base. De ruimtelijke configuratie van de substituenten op het suiker kan voor een β‐

nucleoside worden voorgesteld zoals in figuur 1.9.

De basen zijn heterocyclische moleculen met aromatisch karakter en zijn bijgevolg individueel

volledig vlak qua structuur. Afzonderlijk worden ze verder ingedeeld in de pyrimidine basen thymine

en cytosine en de purine basen guanine en adenine. De structuur van de verschillende basen kan

worden teruggevonden in figuur 1.10.

Figuur 1.10 De vijf heterocyclische basen van DNA en RNA

Nucleïnezuren of oligonucleotides maken gebruik van éénlettercodes voor de vijf verschillende

basen en verder ook voor het aanduiden van de verschillende nucleotiden in een bepaalde

Adenine Guanine

Cytosine Thymine Uracil

7

sequentie. Een groot voordeel van deze benadering is dat de vrij uitgebreide structuur van DNA

duplexen eenvoudig kan worden voorgesteld.

Tenslotte kan nog worden opgemerkt dat volgens conventie oligonucleotidesequenties worden

voorgesteld vertrekkende van het 5’‐koolstof (links) naar het 3’‐koolstof (rechts), zoals ook het geval

zal zijn in de verschillende sequenties die hier aan bod komen. Bij de synthese wordt er gewerkt in de

omgekeerde richting maar dit komt later in verder detail nog aan bod, zie hoofdstuk 6, paragraaf

6.4.2.1.

1.3.2 Basenparingenduplexvorming

De bepaling van de karakteristieke DNA structuur was oorspronkelijk gebaseerd op rudimentaire

modellen en X‐straaldiffractiepatronen. Bijkomende informatie afkomstig uit chemische analyses,

uitgevoerd door Chargaff [12], toonden bovendien aan dat het aantal adenine basen steeds gelijk

was aan het aantal thymine basen en dit analoog het geval was bij de basen cytosine en guanine.

Beide aspecten werden gebruikt door Watson en Crick als bewijs om te besluiten dat DNA bestaat

uit twee volledig complementaire polynucleotideketens die rond elkaar wikkelen met de vorming van

een dubbele helix [13]. Binnen de DNA‐structuur wordt telkens een purine met pyrimidine base bij

elkaar gehouden door waterstofbruggen met de vorming van een basenparen. Zo komen de basen

adenine‐thymine samen voor in een complementair basenpaar via vorming van twee

waterstofbruggen en guanine‐cytosine, het andere mogelijke basenpaar, met de vorming van drie

waterstofbruggen, zoals voorgesteld wordt in figuur 1.11.

Deze waterstofbrugvorming kan gezien worden als de voornaamste interactie die de uiteindelijke

duplexstructuur zal stabiliseren; het is echter niet de enige. Zo is er ook nog de π‐π stacking interactie

tussen de verschillende basenparen onderling die zorgt voor extra stabiliteit. Verder zijn er ook nog

externe factoren die de duplexstructuur extra kunnen stabiliseren, zoals onder andere de

aanwezigheid van zouten. Met name tweewaardige ionen, zoals bv Ca2+ of Mg2+ , zijn in staat om de

fosfaatruggegraat extra te stabiliseren, daar deze negatief geladen is (zie figuur 1.8). Via

A:T

G:C

Figuur 1.11 Watson‐Crick waterstofbrugvorming

8

elektrostatische interacties zorgen deze ionen voor een gereduceerde elektrostatische repulsie

tussen de verschillende strengen onderling, wat resulteert in een stabielere structuur.

1.3.3 Baseenbasenpaarflexibiliteit

De individuele basen in nucleïnezuren zijn vlak, gezien het aromatische karakter, maar hoeven in een

basepaar niet noodzakelijkerwijs in eenzelfde vlak te liggen, zodat een zekere flexibiliteit kan worden

verwacht. Deze wordt gedeeltelijk bepaald door de aard van de beschouwde basen en basenparen

maar is het meest afhankelijk van de directe omgeving. Zo kan er bij een sequentie van bv. twee

opeenvolgende basenparen, verwacht worden dat wanneer één basenpaar een lichte ’twist’

vertoont naar links of rechts het bovenstaande of onderliggende basepaar ook deels zo’n ‘twist’ zal

vertonen door de eerder vernoemde π‐π stacking interacties die optreden tussen deze

opeenvolgende basen.

Om deze geometrische relaties te kunnen beschrijven tussen individuele en opeenvolgende

basenparen zijn er een aantal rotationele en translationele parameters beschreven die oorspronkelijk

werden gedefinieerd in 1989 in het zgn. ‘Cambridge Accord’ en in zijn opvolger uit 1999: het

‘Tsukuba Accord’ [14].

Een volledige beschrijving van deze verschillende parameters is hier niet aan de orde, maar er

worden bij wijze van voorbeeld twee verschillende mogelijkheden voor individuele basenparen kort

besproken [15]:

Propeller twist (ω): deze ‘afwijking’ kan het best beschreven worden door te vertrekken van

de situatie waar er geen propeller twist optreedt; in deze situatie liggen beide basen in

hetzelfde horizontale vlak. Deze situatie staat ook wel bekend als de ‘zero propeller twist’.

Wanneer echter één van de basen een zekere kanteling (rotatie rondom een as in het vlak en

in het verlengde van de basepaar) vertoont uit het vlak, dan kan men wel degelijk spreken

van een hoge of lage propeller twist naargelang van de grootte van de kanteling.

Buckle (κ): zoals de voorgaande vervorming kan deze beschreven worden als een afwijking

van het basenpaar t.o.v. de situatie waarbij ze allebei in hetzelfde horizontale vlak liggen. De

vervorming is hier echter concaaf (hol) of convex (bol). Ook is een verandering in ‘buckle’

mogelijk voor opeenvolgende basenparen, deze situatie wordt dan aangeduid als ‘cup’. Cup

wordt gedefinieerd als het verschil in ’buckle’ tussen een bepaalde groep van basenparen en

de daaropvolgende groep.

Figuur 1.12 Schematische weergave buckle (afkomstig van image library of Biological Macromolecules)

Figuur 1.13 Schematische weergave propellor twist (afkomstig van image library of Biological Macromolecules)

9

1.3.4 Suikerpucker

Naast het feit dat de basenparen een zekere flexibiliteit vertonen, heeft ook de deoxyribose suiker

vijfring een niet‐vlakke structuur. Deze afwijking ten opzichte van een planaire vijfring staat bekend

als ‘puckering’. Deze ’puckering’ kan volledig beschreven worden aan de hand van de vijf

endocyclische torsiehoeken, zoals aangeduid in figuur 1.12.

Figuur 1.14 De vijf interne torsiehoeken in ribose

De oorsprong van deze ‘puckering’ kan gevonden worden in het optreden van niet‐gebonden

interacties tussen de substituenten op de vier koolstofatomen van de ring en er valt te verwachten

dat de energetisch meest stabiele conformatie diegene zal zijn met alle substituenten zo ver mogelijk

van elkaar verwijderd. Verder kan er ook verwacht worden dat verschillende substituenten

aanleiding zullen geven tot verschillende vormen van puckering. In principe is er een heel continuüm

van puckers die in elkaar kunnen overgaan en die van elkaar gescheiden zijn via diverse

energiebarrières, zoals bv. ook het geval is bij de diverse conformaties van butaan.

Het is dan ook geen verrassing dat er zowel via X‐straal diffractie als NMR een hele variëteit aan

geometriën kan worden waargenomen. Het komt echter meer voor dat twee opeenvolgende atomen

afwijken uit de vlakke ringstructuur, waarbij zij zich aan weerszijden bevinden van het vlak

gedefinieerd door de resterende drie atomen. Gewoonlijk heeft ook één van de twee atomen een

grotere afwijking ten opzichte van dat vlak als het andere atoom, wat uiteindelijk resulteert in een

twist conformatie. Als de grootste afwijking gebeurt in dezelfde richting als de C4’‐ en C5’‐

koolstofatomen, dan kan er gesproken worden van een ‘endo‐conformatie’, gelijkaardig als de

afwijking in tegengestelde richting gebeurt van de C4’‐ en C5’‐ koolstofatomen is het een ‘exo‐

conformatie’. De meest geobserveerde conformaties bij natuurlijke oligonucleotiden zijn ofwel sterk

gelijkaardig aan een C2’‐endo of C3’‐endo type conformatie, zoals (enigszins overdreven) aangegeven

in figuur 1.15 en 1.16.

O4’

C1’

C2’C3’

C4’

τ0

τ1

τ2

τ3

τ4

Figuur 1.15 C2’ endo conformatie Figuur 1.16 C3’ endo conformatie

10

Er zijn verschillende aspecten die mee bepalen welke pucker het meest zal voorkomen, zoals het

type base gebonden aan de riboses. Zo verkiezen de natuurlijke purine basen een C2’‐endo pucker,

terwijl pyrimidines eerder een C3’ endo pucker vertonen. Ten slotte kan er nog opgemerkt worden

dat veranderingen in de suiker‐pucker belangrijke determinanten zijn van oligo‐ en polynucleotide

structuren aangezien ze leiden tot wijzigingen in de oriëntatie van C1’, C3’ en C4’ substituenten, die

op hun beurt weer leiden tot significante veranderingen in de backbone conformatie en ruimtelijke

structuur van de nucleotidesequentie. Bovenstaande zaken zijn de voornaamste maar zeker niet alle

mogelijke conformationele vrijheidsgraden, meer informatie over deze basisstructuren kan worden

teruggevonden in de literatuur [15], [16].

1.3.5 AlgemeneDNA‐structuur

Zoals eerder vermeld, vormen complementaire poly‐ of

oligonucleotiden een dubbele helix. Er zijn echter binnen deze

helixstructuur opnieuw verschillende mogelijkheden wat betreft

de uiteindelijke conformatie. De meest voorkomende (natuurlijke)

vorm van DNA is het zogenaamde B‐DNA (een 3D weergave kan

teruggevonden worden in figuur 1.17). Echter er bestaan ook

andere secundaire structuren, afhankelijk van de condities zoals

de aard van de positieve ionen die geassocieerd zijn met de DNA‐

structuur en de specifieke sequentie van basen. De twee meest

voorkomende conformaties naast B‐DNA zijn A‐DNA en Z‐DNA. A‐

DNA is een andere mogelijke structuur van DNA. Deze alternatieve

conformatie heeft 11 in plaats van 10 basenparen in één volledige

omwenteling en de basenparen liggen niet loodrecht ten opzichte

van de helicale as maar in een hoek van 20°. Een gelijkenis tussen

A‐DNA en B‐DNA is dat beide een rechtsdraaiende helicale

structuur bezitten. De A‐DNA structuur werd oorspronkelijk

teruggevonden in gedehydrateerde DNA stalen waarbij men

aannam dat dit louter een gevolg was de DNA

staalvoorbereidingsprocedure. Naast omstandigheden met een

lage vochtigheidsgraad, wordt dit type DNA structuur ook

teruggevonden in oplossingen waarbij de activiteit van het water

wordt verminderd door het toevoegen van diverse alcoholen.

Deze structuur wordt echter ook teruggevonden tijdens de

belangrijke biologische processen van transcriptie en replicatie

waarbij RNA‐DNA hybride structuren worden gevormd.

Een derde en laatste mogelijke DNA structuur is het zogenaamde

Z‐DNA. In tegenstelling tot de twee voorgaande structuren vertoont deze een linkshandige helicale

structuur. De Z‐DNA structuur kan beschouwd worden als een derivaat van de B‐DNA structuur die

wordt verkregen door een zijde van de fosfaatruggegraat 180° te draaien zonder de ruggegraat of

waterstofbruggen tussen de basen te breken. De ‘Z’ naamgeving is afkomstig van het zig‐zag motief

dat de fosfaatdiester backbone vertoont bekeken van de zijkant [16]. Z‐DNA kan dus worden

beschouwd als een polymorf van DNA maar dan met een beduidend hogere energie‐inhoud. Deze is

in zijn lineaire vorm minder stabiel dan zowel een A‐ als B‐DNA duplex. Dit type van duplex komt

Figuur 1.17 B‐DNA duplexstructuur

PDB identificatienummer 2JYK. Deze figuur werd geproduceerd met VMD

1.8.7

11

enkel voor bij hoge concentraties van zouten of alcoholen, dewelke ook noodzakelijk zijn voor het in

stand houden van deze structuur. Deze verminderen de repulsie tussen de fosfaatgroepen van de

complementaire strengen die in Z‐DNA veel dichter bij elkaar zitten dan het geval is bij B‐DNA. In de

natuur is er ook een verhoogde kans op het voorkomen van een dergelijke DNA structuur wanneer

de sequentie wordt gekenmerkt door een continue afwisseling van purine en pyrimidine basen.

Verder zou Z‐DNA een rol kunnen spelen in het mechanisme van genexpressie maar dit is nog altijd

onderwerp van onderzoek onder biochemisten.

Uit figuur 1.17 blijkt onmiddellijk dat, ongeacht de ruimtelijke vorm, de fosfaatruggengraat van beide

strengen de ruimte niet volledig inneemt maar dat er uitsparingen aanwezig zijn in de denkbeeldige

cilinder rond de duplex. Deze uitsparingen zijn bekend onder de naam van groeven en er kan een

onderscheid gemaakt worden tussen twee verschillende types: de grote groeve (‘major groove’) en

de kleine groeve (‘minor groove’). Het is in deze groeves dat zowel medicijnen als polypeptiden

(eiwitten) kunnen binden aan de DNA‐structuur. Nog een belangrijk aspect van DNA‐structuur

waarmee rekening moet worden gehouden, is de lading van de fosfaatruggegraat: bij fysiologische

pH draagt elke fosfaatgroep een negatieve lading. Deze lading, aanwezig op beide strengen, zorgt

voor een onderlinge repulsie en heeft tot gevolg dat wanneer peptiden of andere residuen willen

interageren met een duplex, positief geladen zijketens zullen moeten instaan voor de neutralisatie

hiervan. Zo is binnen de celnucleus bij eukaryoten de DNA structuur gecomplexeerd met histonen,

deze zijn positief geladen eiwitten, en ze staan in voor de neutralisatie van de negatief geladen

backbone.

Verder heeft een DNA molecule op zich een lengte die beduidend groter is dan zijn diameter, d.w.z.

dat de structuur zeer anisotroop is. Bovendien is de dubbele helixstructuur niet rigide en kan het op

zichzelf terugvouwen, zoals ook het geval is bij eiwitten wanneer deze opvouwen in hun tertiaire

structuren. De duplex, zoals hier besproken, is een gerelaxeerde structuur en zal geen ‘twist’

vertonen met uitzondering van de helicale twist. Dit sluit echter niet uit dat het voorkomen van

‘nieuwe twists’, die gepaard gaan met het optreden van ‘supercoiling’, niet mogelijk zou zijn [16].

De eerder vermelde conformationele aspecten spelen allemaal een rol in de uiteindelijk helicale

structuur van DNA, die sinds zijn ontdekking wel degelijk bekend is bij de meeste mensen. De

buitenste diameter van de (hier ideale) helix bedraagt in totaal 20 Å (2nm). De lengte van één

volledige omwenteling in de structuur is 34 Å (3.4nm) en bevat 10 basenparen (B‐DNA). De grote

groeve is zo’n 22 Å groot, naast de kleine groeve die iets meer dan helft bedraagt van deze

voorgaande (12 Å). A‐DNA daarentegen heeft een iets kleinere kleine groeve van zo’n 11 Å, terwijl de

grote groeve beduidend kleiner is en deze is bovendien ook onderhevig aan de temperatuur waarbij

deze wordt gemeten, gaande van 5 tot iets meer dan 12 Å. Bij metingen via vezel‐diffractie wordt

zelfs nog een kleinere waarde gevonden van zo’n 2,2 Å.

Z‐DNA is zoals eerder vermeld een linkshandige helix, ten opzichte van de andere twee

rechtshandige helices. Dit is echter niet het enige grote verschil. De N7 en C8 atomen van de

imidazoolring van guanine (en in mindere mate) de C5 atomen van cytosine puilen een beetje uit in

het oppervlak wat zou overeenkomen met de grote groeve, waardoor het oppervlak in het algemeen

ook een licht bol karakter verkrijgt. Met andere woorden, een Z‐DNA helix heeft totaal geen grote

groeve. Tegelijkertijd is de kleine groeve heel klein (zo’n 2 Å) maar tegelijkertijd heel diep (13,8 Å) en

wordt deze langs weerszijden omringd met fosfaatgroepen [15].

12

Een visueel overzicht van de drie voornaamste DNA helices, kan worden teruggevonden in figuur

1.18. De kleurencode is als volgt: stikstof (donkerblauw), koolstof (lichtblauw), zuurstof (rood), fosfor

(bruin), en waterstof (wit, de groene kleur bij Z‐DNA zijn nog solventmoleculen die niet konden

verwijderd worden en dus hier niet van belang zijn).

1.4Doelstellingen

1.4.1 DNA alsscaffold

Zoals eerder vermeld is het uiteindelijke doel van het onderzoek waarin deze thesis kadert de

ontwikkeling van een α‐chymotrypsine mimic gebaseerd op een DNA‐scaffold via de introductie van

de drie benodigde katalytische groepen: een imidazool, alcohol en carboxylaat functionaliteit. Op

deze manier verkrijgt men een aantrekkelijke combinatie van pregedefinieerde structurele

organisatie (duplexvorming) enerzijds en de aanwezigheid van katalytische groepen die fungeren als

Lewis basen of Lewis zuren anderzijds. De actieve site wordt hier gecreëerd door de combinatie van

twee gemodificeerde oligonucleotidesequenties van telkens veertien eenheden lang waarbij elke

streng één of meerdere modificaties draagt in het midden van de sequenties. De splitsing van de

peptidebindingen vindt dan plaats via deze functionaliteiten in de grote groeve van de DNA

structuur.

Preliminaire modellingstudies [17] hebben reeds aangetoond op welke posities de modificaties

moeten worden aangebracht opdat de verschillende functionaliteiten zich in elkaars buurt bevinden.

Er werd besloten om in de streng Ser‐modificaties te introduceren op T6 en T8, met daartussen een

His‐modificatie op T7. In de 2de streng wordt nog een Asp‐modificatie ingevoerd op T21.

Figuur 1.18 Overzicht van de verschillende DNA structuren. Deze figuur werd geproduceerd met VMD 1.8.7 (A‐DNA PDB identificatienummer 3QK4, B‐DNA PDB identificatienummer 3IXN, Z‐DNA PDB identificatienummer 3QBA)

A‐DNA B‐DNA Z‐DNA

13

Het centrale gedeelte (groen) is op een dergelijke manier

samengesteld dat de drie residuen zich voldoende dicht bij

elkaar bevinden opdat de vorming van een waterstofbrug

netwerk, nodig voor de biologische functie van de triade,

mogelijk zou zijn. Wat ook meteen opvalt is dat er twee

serine functionaltiteiten aanwezig zijn alhoewel er in de

oorspronkelijke actieve site slechts één aanwezig is. De

reden hiervoor is dat op deze manier de rotatie van de

histidine functionaliteit sterisch wordt gehinderd en,

indien de rotatie toch zou doorgaan, er een alternatieve

triade kan worden gevormd. Deze duplex bevat met

andere woorden een semi‐dimeer triade systeem. Wat

meteen ook opvalt is dat er een mismatch aanwezig is in

deze duplex: twee thymine basen ter hoogte van posities

8 en 21. Het voorkomen van de T‐T mismatch is een

gevolg van het feit dat initieel enkel met thymine

nucleosiden zal worden gewerkt voor het introduceren van de extra modificaties, dit om redenen van

synthetische toegankelijkheid. Deze twee basen zijn identiek en bijgevolg niet complementair met

elkaar. Ondanks het feit dat dit basenpaar geen ‘ideaal’ paar betreft is het toch mogelijk dat

waterstofbrugvorming tussen de twee residuen zal optreden: de lokale structuur en conformatie van

de duplex kan zich zodanig aanpassen dat er toch een interactie mogelijk is en in de literatuur wordt

dit ook bevestigd [18]. Zo is er via NMR en molecular modelling aangetoond dat deze centrale basen

betrokken zijn in “wobble” basenparing, die aanleiding geeft tot twee imino‐carbonyl

waterstofbruggen. Opmerkelijk genoeg zijn er voor dit type basenpaar twee mogelijke conformaties

die naast elkaar kunnen voorkomen in een snel evenwicht, waarbij de ene vorm (W↑) kan overgaan

in de andere (W↓) door een transla onele beweging zonder dat daar een opening van de

basenparen is vereist (zie figuur 1.21).

Figuur 1.20 Resultaat modelling actieve site, zie [17]

Figuur 1.19 Actieve site (groen) in DNA scaffold

5’-GACCATSerTHisTSerGCAGCG-3’3’-CTGGTA A TAspCGTCGC-5’

Figuur 1.21 W(↑) links, W(↓) rechts

14

Door deze vervorming van de ideale duplexstructuur zal de sterkte van deze niet‐covalente interactie

beduidend zwakker zijn dan een normale waterstofbrug. De samenstelling en plaatsing van de

overige basenparen daarentegen staat niet echt vast en er zijn aanpassingen mogelijk. De originele

DNA sequentie werd geïnspireerd op basis van eerder werk uitgevoerd in het kader van het

doctoraatswerk van Kristof Stevens, waarbij de keuze van de lengte van het beschouwde systeem om

deze vast te leggen op veertien eenheden opnieuw samenhangt met het voorkomen van de T‐T

mismatch: een kortere sequentie zou geplaagd worden door een lage stabiliteit en op deze manier

kan de duplexconformatie niet in stand worden gehouden. Dit gegeven geeft dan ook meteen

aanleiding tot het eerste deel van dit werk: onderzoek naar mogelijke optimalisatie van de

resterende sequentie.

1.4.2 Screeningvanalternatievesequentiesenbijhorendetemperatuurstudies

Zoals eerder reeds vermeld staat enkel het centrale gedeelte van de DNA scaffold vast en kunnen de

overige basenparen in principe worden aangepast. De eerste doelstelling in deze thesis is dan ook

nagaan van het effect van de introductie van alternatieve basenparen in deze sequentie. De

bedoeling is het vinden van een duplex die ‘verder geoptimaliseerd’ kan worden voor NMR studie en

meer bepaald aanleiding geeft tot zogenaamde ‘kwaliteitsvolle’ spectra. Concreet zullen de signalen

overeenkomstig met de iminoprotonen betrokken in de waterstofbrugbindingen tussen de

complementaire basen geanalyseerd worden. Signalen die overlappen met elkaar en dus de

karakterisatie in de weg staan is een voorbeeld van één van de mogelijke aspecten die zoveel

mogelijk moeten worden vermeden. Daarnaast wordt van elke alternatieve sequentie een

temperatuurstudie uitgevoerd om een indicatie te kunnen krijgen van de stabiliteit van de

verschillende mogelijke sequenties. Inderdaad valt niet uit te sluiten dat kleine wijzingingen in de

DNA sequentie een (on)gunstige invloed kunnen hebben op de stabiliteit van de DNA scaffold. Het

grote voordeel van het uitvoeren van dergelijke studie aan de hand van NMR, eerder dan met UV of

CD spectroscopie is dat de verschillende waterstofbruggen tussen de afzonderlijke basenparen elk

individueel gevolgd kunnen worden en de signalen van het T‐T mismatch basenpaar, door hun unieke

ligging, gemakkelijk gevolgd kunnen worden. Wanneer bij een bepaalde temperatuur geen signaal

meer wordt waargenomen van een zeker iminoproton, kan worden aangenomen dat deze

waterstofbrug een te korte levensduur heeft om waargenomen te worden en dus niet langer als

stabiliserend beschouwd kan worden. Hier moet bovendien ook nog de bijdrage van de uitwisseling

van het labiele iminoproton met het aanwezige water worden bijgerekend. De lijnbreedte zal

toenemen naarmate de temperatuur stijgt en dus ook de snelheid van deze chemical exchange

groter wordt. Uiteindelijk evolueert de duplex steeds meer naar een toestand van “single stranded”

DNA naarmate het aantal waterstofbruggen afneemt. De temperatuurstudie zal worden uitgevoerd

aan de hand van eenvoudige 1D 1H spectra bij toenemende temperaturen. De lijnverbreding ten

gevolgde van de verkorte levensduur van de waterstofbruggen werd ook kwantitatief bepaald door

de transversale relaxatietijden af te leiden via de lijnbreedte van de individuele iminosignalen op

halve hoogte. De evolutie van deze T2‐relaxatietijdsconstanten in functie van de temperatuur kan op

deze wijze een duidelijker beeld geven in welke temperatuursrichting het best kan gezocht worden

voor het verkrijgen van de meest duidelijke spectra (lees dewelke gekenmerkt worden door de

meest intense en gespreide scherpe signalen) .

15

1.4.3 Metingenop1mm‐probemetbehulpvanhetcryorestrictiefenomeen

In voorgaande paragraaf werd er melding gemaakt van een temperatuursstudie. Aanvankelijk werd

deze studie uitgevoerd bij hogere temperaturen om de stabiliteit van de verschillende duplexen te

kunnen inschatten. Zo kan de temperatuur waarbij geen enkel iminoprotonsignaal meer waar te

nemen is principieel in overeenstemming worden gebracht met de teloorgang van de duplex

structuur. Verder is het reeds aangetoond in de literatuur dat het uitvoeren van metingen beneden

0°C ook voordelen kan opleveren betreffende de signaalintensiteit van de met het solvent

uitwisselbare protonen. Meer bepaald werd dit in het beschouwde artikel toegepast op de labiele

hydroxylprotonen van o.a. methyl‐β‐D‐glucopyranoside [19]. Dit is ook het geval voor de

bestudeerde iminoprotonen: bij het dalen van de temperatuur zal de uitwisseling met het aanwezige

water (solvent) afnemen en worden de signalen van deze labiele protonen in principe duidelijker

waarneembaar. Het uitvoeren van dergelijke metingen kan niet worden uitgevoerd op een normale

5mm probe en daartoe werd overgeschakeld op de 1mm probe waar, door het optreden van

cryorestrictie effecten, het mogelijk is om metingen uit te voeren bij een temperatuur lager dan 0°C,

zonder dat het solvent (water) bevriest. Volgens de literatuur is het mogelijk om hierdoor te zakken

tot een temperatuur van ongeveer ‐17°C. Concreet gezien zijn deze metingen op het testmodel

sucrose gereproduceerd en vervolgens toegepast op zowel de wild type als sequentie G2C27 om te

zien of dergelijke metingen enige meerwaarde kunnen betekenen in de toekenning en

stabiliteitsanalyse van de sequenties.

1.4.4 Nagaanvandeinvloedvanintroductievanmodificatiesinsequenties

In een laatste fase wordt, na de studie van de verschillende alternatieve sequenties, nagegaan wat

de invloed is op de gemeten spectra bij de introductie van de eerder vooropgestelde katalytische

residuen in de duplex. Hiertoe wordt eerst en vooral een His‐gemodificeerde thymine bouwsteen

gesynthetiseerd en geïntroduceerd op drie verschillende posities in de standaard sequentie: op base

T6, T7 en T8, zoals aangegeven in figuur 1.22. Deze standaard sequentie word eveneens bestudeerd

met de reeds eerder vermelde meetmethoden:

Figuur 1.22 Overzicht gemodificeerde duplexen

His‐modificatie op positie T6 (THis 6)



5’-GACCATHisTTGCAGCG-3’3’-CTGGTA ATCGTCGC-5’

5’-GACCATTHisTGCAGCG-3’3’-CTGGTAA TCGTCGC-5’

5’-GACCATTTHisGCAGCG-3’3’-CTGGTAAT CGTCGC-5’

16

De beoogde modificatie is aangeduid in het groen, terwijl de T‐T mismatch aangeduid staat in het

oranje. Het voornaamste doel van deze modificatie op verschillende plaatsen ten opzichte van de

positie van de T‐T mismatch is na te gaan of de positie van de modificatie enige invloed heeft op de

stabiliteit van de duplex en het gedrag van de overeenkomstige signalen in de NMR spectra. Concreet

kan dit worden afgeleid door het uitvoeren van de reeds eerder vermelde temperatuurstudies om na

te gaan of de imino signalen al dan niet vroeger verdwijnen in functie van de temperatuursverhoging.

Verder kan ook een idee verkregen worden van de stabiliteit aan de hand van het opnemen van de

smelttemperaturen (Tm). De stabiliteit van de verschillende gemodificeerde duplexen kunnen met

elkaar vergeleken worden alsook met de stabiliteit van de andere niet gemodificeerde duplexen,

waarmee een inschatting kan worden gemaakt van de impact van de modificatie op de stabiliteit van

de uiteindelijke dupexstructuur. De praktische aspecten van de synthese van deze modificatie zullen

aan bod komen wanneer dit onderdeel in detail zal worden besproken (zie hoofdstuk 6).

17

1.5Referenties

1. Hedstrom, L., Serine protease mechanism and specificity. Chemical Reviews, 2002. 102(12): p. 4501‐4523.

2. Koshland, D.E., Application Of A Theory Of Enzyme Specificity To Protein Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1958. 44(2): p. 98‐104.

3. Benkovic, S.J. and A. Ballesteros, Biocatalysts ‐ the next generation. Trends in Biotechnology, 1997. 15(10): p. 385‐386.

4. Breslow, R. and S.D. Dong, Biomimetic reactions catalyzed by cyclodextrins and their derivatives. Chemical Reviews, 1998. 98(5): p. 1997‐2011.

5. Dsouza, V.T., et al., Synthesis And Evaluation Of A Miniature Organic‐Model Of Chymotrypsin. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1985. 129(3): p. 727‐732.

6. Zimmerman, S.C., On The Evaluation Of A Small Molecule Mimic Of Chymotrypsin. Tetrahedron Letters, 1989. 30(33): p. 4357‐4358.

7. Breslow, R. and S. Chung, A Novel Synthesis Of Substituted Imidazoles, And A Reeaxamination Of A Purported Chymotrypsin Model. Tetrahedron Letters, 1989. 30(33): p. 4353‐4356.

8. Cram, D.J., P.Y.S. Lam, and S.P. Ho, Synthesis Of A Partial Transacylase Mimic. Annals of the New York Academy of Sciences, 1986. 471: p. 22‐40.

9. Atassi, M.Z. and T. Manshouri, Design Of Peptide Enzymes (Pepzymes) ‐ Surface‐Simulation Synthetic Peptide That Mimic The Chymotrypsin And Trypsin Active‐Sites Exhibit The Activity And Specificity Of The Respective Ezyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993. 90(17): p. 8282‐8286.

10. Wells, J.A., et al., A Reinvestigation Of A Synthetic Peptide (TRPEPZ) Designed To Mimic Trypsin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994. 91(10): p. 4110‐4114.

11. Gea, A., et al., Solid‐supported synthesis of highly functionalized tripodal peptides with flexible but preorganized geometry: Towards potential serine protease mimics. European Journal of Organic Chemistry, 2006(18): p. 4135‐4146.

12. E. Chargaff, E.V., The Seperation and Quantitative Estimation of Purines and Pyrimidines in Minute Amounts. The Journal of Biological Chemistry, 1948. 176: p. 703‐714.

13. Watson J.D., C.F.H.C., Molecular Structure of Nucleic Acids: A structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature, 1953. 171: p. 737‐740.

14. Olson, W.K., et al., A standard reference frame for the description of nucleic acid base‐pair geometry. Journal of Molecular Biology, 2001. 313(1): p. 229‐237.

15. Neidle, S., Principles of Nucleic Acid Structure. First Edition ed. 2008: Academic Press, Elsevier. 289. 16. Mary K. Campbell, S.O.F., Biochemistry. sixth edition ed. 2009: Thomson Brooks/Cole. 751. 17. In samenwerking met Prof. Dr. G. Bifulco, Universiteit van Salerno 18. Gervais, V., et al., Solution Structure Of 2 Mismatches A‐Center‐Dot‐A And T‐Center‐Dot‐T In The K‐RAS

Gene Context By Nuclear‐Magnetic‐Resonance And Molecular‐Dynamics. European Journal of Biochemistry, 1995. 228(2): p. 279‐290.

19. Poppe, L. and H. Vanhalbeek, NMR‐Spectroscpoy Of Hydroxyl Protons In Supercooled Carbohydrates. Nature Structural Biology, 1994. 1(4): p. 215‐216.

18

Hoofdstuk2:Staalvoorbereidingenmeetmethoden

2.1OverzichtbestudeerdeDNAsequenties

Tijdens de studie van de alternatieve sequenties worden er in totaal vijf verschillende sequenties

bestudeerd die enkel van elkaar verschillen op het vlak van 1 basenpaar. De plaats en aard van het

aangepaste basenpaar wordt gereflecteerd in de naamgeving van deze verschillende duplexen: de

letter duidt op het type base, gevolgd door het cijfer wat de plaats van diezelfde base aanduidt.

Wild type: dit is de referentieduplex die dienst doet als scaffold voor de beoogde serine

protease mimic. Alle andere bestudeerde sequenties worden met deze sequentie vergeleken

wat betreft temperatuurgedrag, stabiliteit, gevoeligheid voor het optreden van chemische

uitwisseling en kwaliteit van de 1D 1H spectra.

C9G20: een eerste aanpassing van de standaardsequentie komt overeen met een “base‐flip”

van een GC basenpaar direct na de T‐T mismatch. Het doel van deze variatie is na te gaan of

er al dan niet een effect kan worden teruggevonden op het gedrag van de T‐T mismatch

wanneer het bovenliggende basenpaar, en dus ook de π‐π stacking interactie tussen de

naburige basenparen, wordt aangepast.

G5C24: in de standaardsequentie wordt deze positie bezet door een AT basenpaar. Gezien de

kern van iedere sequentie, bestaande uit basenparen T6A23, T7A22 en T8T21, steeds

dezelfde moet blijven, is dit dichtst mogelijke positie ten opzichte van de T‐T mismatch

waarbij de impact van veranderen van het type basenpaar kan worden onderzocht.

5’-GACCATTTGCAGCG-3’3’-CTGGTAATCGTCGC-5’

5’-GACCATTTCCAGCG-3’3’-CTGGTAATGGTCGC-5’

5’-GACCGTTTGCAGCG-3’3’-CTGGCAATCGTCGC-5’

19

C2G27: opnieuw is in de standaardsequentie deze positie bezet door een AT basenpaar. De

redenering achter deze aanpassing is analoog aan diegene bij de G5C24 duplex maar dan op

een positie de duidelijk verderaf gelegen is ten opzichte van de mismatch.

G2C27: deze laatste alternatieve duplex komt overeen met een “base‐flip” van de

voorgaande sequentie. Hiermee wordt de mogelijke impact onderzocht van het alterneren

van de oorspronkelijke CG‐basenpaar aanpassing bij C2G27 op ruime afstand van de TT

mismatch. Naargelang de verschillen die optreden tussen deze en de voorgaande sequentie

kan een schatting worden gemaakt van de mogelijke impact van de verschillen in π‐π

stacking binnen de duplex. De vergelijking die hier wordt gemaakt is analoog aan de

vergelijking bij de C9G20 en wild type sequentie.

2.2Staalvoorbereiding

Alle bovenstaande sequenties werden aangekocht als single strands bij de firma IDT. Om de

zuiverheid van de verschillende oligonucleotiden te kunnen garanderen ondergaan alle stalen een

dialyseprocedure, dit om eventuele, nog aanwezige onzuiverheden te kunnen verwijderen. De

dialyseprocedure werd ons ter beschikking gesteld door Dr. G. Bruylants en Prof. K. Bartik (Molecular

and Biomolecular Engineering Group, ULB)

Zo is onder andere de aanwezigheid van TEA een mogelijk probleem aangezien de signalen in het

NMR‐spectrum overlappen met de signalen van de methylprotonen van thymine en dient dit eerst

verwijderd te worden [1].

In een eerste dialyseronde worden de single strands eerst voor telkens 6 uur behandeld met

volgende oplossingen van telkens 1L:

Na2CO3 (1M)

NaCl (0,5M)

NaCl (0,1M)

3 maal milliq H20

Om er voor te zorgen dat de relatief kleine verontreinigingen kunnen worden verwijderd maar de

single strands wel degelijk in de staaloplossing blijven, word er gebruik gemaakt van een

dialysemembraan met een molecular weight cut‐off (MWCO) van 1 kDa.

Na deze eerste dialyseronde worden equimolaire hoeveelheden van beide strands bij elkaar gevoegd

en vervolgens opgewarmd tot rond 95°C om daarna langzaam te worden afgekoeld tot

kamertemperatuur. In dit proces wordt de meeste stabiele (en gewenste) duplexstructuur gevormd.

5’-GCCCATTTGCAGCG-3’3’-CGGGTAATCGTCGC-5’

5’-GGCCATTTGCAGCG-3’3’-CCGGTAATCGTCGC-5’

20

Eventueel nog aanwezige enkelvoudige strengen die niet betrokken zijn in de vorming van een

duplex worden verwijderd door een tweede dialyse. Dit bestaat erin de oplossing met de

duplexstructuur te dialyseren voor opnieuw telkens 6 uur ditmaal enkel driemaal in milliq H2O in

combinatie met een dialysemembraan met een MWCO van 3,5 kDa, m.a.w. groot genoeg voor de

enkelvoudige strengen maar te klein voor de volledige duplexstructuur.

Na deze tweede dialyse gebruikt men lyofilisatie (vriesdroogstap) ter verwijdering van residuele

solventen, waarna het product kan worden heropgelost in de gewenste hoeveelheid staaloplossing

bestaande uit 90% H2O en 10%D2O met daarin opgelost:

NaCl (100 mM)

EDTA (0,1 mM) (dit ter complexering van mogelijke aanwezige Ca2+ en Mg2+‐ionen die op zich

kunnen complexeren met de duplex)

DSS (0,05mM) (intern referentiesignaal)

NaN3 (0,05mM) (antibacteriële werking)

2.3Meetmethodenenpulssequenties

In deze paragraaf worden de pulssequenties besproken die worden gebruikt in de studie van de DNA

duplexen. Dit zijn louter de theoretische aspecten. De toepassing en verwerking van de verschillende

metingen is hier niet aan de orde en komt aan bod in hoofdstuk 3 en hoofdstuk 4. Alle metingen

werden uitgevoerd op de Bruker 700MHz Avance type II spectrometer van de Interuniversitaire NMR

Faciliteit. De spectrometer is uitgerust met een triple resonantie inverse (TXI) probe uitgerust met Z‐

gradiënten en een BTV3000 Eurotherm eenheid voor temperatuurscontrole. De parameters die

verder van belang zijn worden hierna vermeld bij de bespreking van de verschillende

pulstechnieken.

2.3.1 Een‐dimensioneletechnieken

2.3.1.1 1D 1H experiment

Het grootste aantal metingen die werden verricht zijn standaard 1D 1H metingen, uitgevoerd tijdens

de temperatuurstudies van de diverse oligonucleotiden. Het enkel‐puls experiment dat hiervoor

gebruikt wordt kan schematisch als volgt worden voorgesteld:

De belangrijkste parameter die in dit type meting moet worden geoptimaliseerd is de excitatiepuls θ.

Deze komt doorgaans overeen met een 90°‐puls. Wanneer een dergelijke puls wordt gegeven aan

een spinsysteem bij thermisch evenwicht zal de volledige (bulk)magnetisatie worden overgebracht

Figuur 2.1 1D enkele‐puls experiment

Relaxatie‐periode

θ

Puls

Acquisitie

n

21

naar het transversaal vlak en bijgevolg verkrijgt men de grootst mogelijke signaalintensiteit. In alle

toepassingen van deze pulssequentie maakt men gebruik van “signal averaging”, waarbij een

toename in signaal‐ruisverhouding wordt verkregen door het accumuleren van meerdere spectra. Dit

wil dus zeggen: het toepassen van meerder pulsen na elkaar met daarin een zekere relaxatieperiode.

De optimale lengte van deze periode wordt bepaald door de T1‐relaxatietijdsconstante. Immers, het

is noodzakelijk om tussen de opeenvolgende pulsen in dit 1D experiment een periode van een aantal

keer T1 te wachten opdat het spinsysteem kan relaxeren zodat de magnetisatie zich kan herstellen,

zodat een maximaal signaal gegarandeerd wordt. Zo leidt een rustperiode tr = 5*T1 tot een

recuperatie van de longitudinale magnetisatie met 99,3%. Het toepassen van dit criterium kan vrij

tijdsintensief zijn en is doorgaans ook niet de meest efficiënte manier om “signal averaging” toe te

passen, tenzij er kwantitatieve metingen zijn vereist. In de praktijk worden de pulscondities dan ook

zodanig aangepast dat dit leidt tot een maximalisatie van de steady‐state longitudinale magnetisatie.

In 1H NMR zijn de T1‐tijden meestal vrij gelijkaardig en worden de intensiteiten dan ook vrij goed

gereproduceerd zelfs wanneer tr < 5* de langste T1.

Het grootste gevaar schuilt in het te snel op elkaar volgen van de verschillende pulsen, zodanig dat

de wachtperiode beduidend kleiner is dan de gemiddelde T1‐tijd. In deze omstandigheden leidt dit

tot een substantiële afname in signaal‐ruisverhouding en in het extreme geval heeft de magnetisatie

geen tijd om te recupereren tussen de pulsen en wordt er bijgevolg ook geen signaal meer

waargenomen. Deze situatie staat ook bekend als saturatie.

Afhankelijk van de omstandigheden kan de hierboven vermelde situatie van saturatie beschouwd

worden als een voor‐ of nadeel. Wanneer een intens solventsignaal dient te worden verwijderd, zoals

hier het geval zal zijn aangezien er wordt gewerkt met water als voornaamste solvent, biedt dit een

mogelijkheid om deze te onderdrukken. Dit principe wordt dan ook toegepast in de presaturatie‐

pulssequentie, de oudste en meest robuuste vorm van solventonderdrukking. Deze sequentie houdt

in dat er een continue, zwakke rf‐puls wordt toegepast op de frequentie van het solvent voor de

excitatie en acquisitie. Hierdoor worden de spins van het solvent gesatureerd en is het

overeenkomstige signaal niet langer zichtbaar in het spectrum. De wateronderdrukking zelf wordt

uitgevoerd tijdens de relaxatieperiode van de 1D 1H pulssequentie.

2.3.1.2 Wateronderdrukking via WATERGATE

Het grootste nadeel van presaturatie solventonderdrukkingsmethode is dat ze ook leidt tot het

onderdrukken van eventuele uitwisselbare protonen door het proces van saturatietransfer. In

sommige (gunstige) gevallen is het mogelijk om de solventcondities (bv. temperatuur en pH) zodanig

aan te passen dat de uitwisseling voldoende wordt vertraagd, zodat het verlies in signaalintensiteit

beperkt blijft. Deze aanpak is echter beperkt qua mogelijkheden en vereist een extra inspanning en

tijd. Gezien de aard van de iminoprotonen die hier worden geobserveerd, is het toepassen van deze

pulssequentie dan ook uit den boze.

De meest effectieve aanpak om het solventsignaal te onderdrukken, zonder dat daarbij de

uitwisselbare protonen worden onderdrukt, is de WATERGATE pulssequentie. Bij deze methode vindt

er een vernietiging plaats van de netto solvent magnetisatie aan de hand van “pulsed field gradients”

(PFG’s) wat er voor zorgt dat er geen solventsignaal meer zichtbaar is voor de acquisitie, terwijl de

signalen van alle andere spins behouden blijven en dus gedetecteerd kunnen worden. De

pulssequentie kan worden voorgesteld zoals in figuur 2.2.

22

Deze sequentie bestaat uit een spin‐echo sequentie, samen met twee selectieve 90°‐x pulsen ‘on

resonance’ voor water met daarnaast nog twee gelijke gradiënt pulsen die inwerken op alle spins. De

spin echo sequentie zorgt ervoor dat alle evolutie ten gevolge van chemical shift wordt

gerefocuseerd na de 180° puls. De gradiëntpulsen zijn werkzaam op alle spins en zorgen in het eerste

geval voor een uitwaaiering van alle spins met de vorming van een helixachtige structuur over het

volledige staal en alle spins. Door de tussenkomst van 180° puls gevolgd door een tweede

gradiëntpuls wordt deze uitwaaiering volledig tenietgedaan en worden alle vectoren opnieuw

gerefocuseerd over het volledige staal zodat uiteindelijk deze kunnen gemeten worden tijdens de

acquisitie.

90°x 180°x

90°‐x 90°‐x

1H

Gz

Figuur 2.2 WATERGATE met pulsed field gradiënts

z

x

y

z

x

y

z

x

y

ω

z

x

y

x

y

90°x 180°x

90°‐x 90°‐x

1H

Gz

x

y

z

x

y

z

x

y

z

ω

z

Figuur 2.3 Overzicht evolutie magnetisatie (uitgezonderd solvent)

23

Het solventsignaal, in dit geval water, ondergaat hetzelfde regime, maar hier zijn er twee extra 90 ‐x

pulsen werkzaam. Netto gezien lijkt het of de volledige pulssequentie geen enkel effect heeft en

bevindt de magnetisatie zich ongewijzigd in het transversale vlak. Dit is echter zonder de PFG’s in

rekening te brengen. Deze zorgen ervoor dat zowel voor als na de 180° puls, de magnetisatie van

water volledig wordt gedefaseerd door de gradiëntpulsen en er dus geen netto magnetisatie

aanwezig is in het transversale vlak. Hierdoor wordt er dan ook geen signaal voor het solvent

gedetecteerd en is het watersignaal effectief onderdrukt.

Omdat de presaturatie onderdrukkingstechniek een typische duur heeft van om en bij de seconde

kan er ook saturatietransfer optreden van het solventsignaal naar uitwisselbare protonen. Dit is bij

de WATERGATE‐sequentie, die slechts enkele milliseconden duurt, nauwelijks het geval en dus is

deze methode van solventonderdrukking veel selectiever. De gradiënten grijpen in op de transverse

magnetisatie en zijn dus toepasbaar op zowel 1D als multidimensionale sequenties. Concreet gezien

wordt de WATERGATE toegepast op zowel de 1D 1H metingen als bij de 2D NOESY metingen,

besproken in de volgende paragraaf.

Praktisch werden de 1D WATERGATE 1H metingen uitgevoerd met het pulsprogramma zggpwg van

de Bruker bibliotheek [2]. De 90° puls lengte was 8,5 tot 11,5 µs voor een vermogen van 1 dB. De

spectrale vensterbreedte was 30,0 ppm (21008.40 Hz). De draagfrequentie voor de pulsen werd

ingesteld op de frequentie van water en was temperatuursafhankelijk. Voor de 5 mm metingen

werden 128 tot 256 FIDs geaccumuleerd. Elke FID werd bemonsterd met 32768 punten voor een

totale acquisitie tijd van 0,780 s. De repetitietijd werd ingesteld op 2,0 s. Bij de verwerking werd het

signaal voorafgaandelijk vermenigvuldigd met een gekwadrateerd cosinusvenster venster voor

fourier transformatie tot een spectrum van 32768 datapunten. Voor het WATERGATE pulse element

werd gekozen voor sinusoïdale gradiënten met een duur van 1 ms en een maximale amplitude van

20 % van de maximale gradiëntsterkte die bereikbaar is op de TXI probe. De duur van de selectieve

90° puls werd ingesteld op 1 ms en bereikt voor een vermogen van 36,0 tot 38,0 dB in functie van het

z

x

y

z

x

y

z

x

y

z

x

y

x

y

90°x 180°x

90°‐x 90°‐x

1H

Gz

z

Figuur 2.4 Overzicht evolutie magnetisatie solvent (water)

24

staal. Voor de metingen met de 1 mm probe waren alle parameters dezelfde behalve de 90 puls die

typisch 3,0 µs bedroeg voor een vermogen van 1 dB.

2.3.2 2DNOESYtechniek

Dit type metingen wordt toegepast om de verschillende iminoprotonen te kunnen toekennen aan de

verschillende basenparen in de sequenties. De eigenlijke toekenningen kunnen worden

teruggevonden in hoofdstuk 3.

2D NOESY experimenten zorgen voor het tot stand komen van correlaties tussen

resonantiefrequenties van nuclei die hun magnetisatie uitwisselen. Het uitwisselingsproces kan

enerzijds tot stand komen door chemische uitwisseling of anderzijds door het optreden van kruis‐

relaxatie geïnduceerd door de magnetische dipool‐dipool interactie. Dit laatste heeft als voorwaarde

dat de beschouwde nuclei zich ruimtelijk gezien dicht genoeg bij elkaar bevinden, met als bovengrens

een afstand van 4,5 a 5 Å. De NOESY correlaties die hier tot stand komen zijn incoherent, omdat

deze worden bepaald door het chemische systeem, de uitwisselingsprocessen of de moleculaire

structuur en onafhankelijk van de NMR hardware. Bijgevolg moeten sommige delays binnen deze

pulssequentie overeenkomen met die moleculaire karkateristieken.

De NOESY pulssequentie kan worden voorgesteld zoals het geval is in figuur 2.5.

Periode t1 komt overeen met de evolutieperiode: de magnetisatie van een kern A wordt door de

eerste 90°‐puls in het transverse vlak gebracht en zal precesseren met angulaire frequentie ωA. De

tweede 90°‐puls zorgt ervoor dat de magnetisatie van A nu terecht komt op de –z‐as. Tijdens de

mengperiode tm kan de longitudinale magnetisatie van spin A gedeeltelijk getransfereerd worden

naar spin B, hetzij door dipolaire kruisrelaxatie, hetzij omdat de kern uitwisselt tussen 2 verschillende

chemische omgevingen. Na een voldoende lange mengtijd, worden de nieuwe populaties

bemonsterd door een derde 90°‐puls waarna het FID kan worden gemeten. Deze sequentie wordt

een aantal keer herhaald om voldoende transiënten te kunnen registreren om zo een acceptabele

signaal tot ruis verhouding te verkrijgen. De relaxatieperiode ingebouwd aan het begin van de

sequentie zorgt ervoor dat de populaties voldoende tijd krijgen om zich terug in hun

evenwichtstoestand te herstellen.

Figuur 2.6 Overzicht gedrag magnetisatievectors tijdens de 2D NOESY pulssequentie

z

x

y

z

x

y

z

x

y

z

x

y

z

x

yω

90°x90°x 90°xt1 z

x

tm

M0AMtA MtA(t1)

MzAMx’AMzB

‐My’B

90°x

1H

90°x 90°xRelaxatie delay

t1 tmAcquisitie

Figuur 2.5 Overzicht 2D NOESY pulssequentie

25

De coherente transverse component Mx’A die wordt bekomen na de tweede 90°‐puls bij het begin

van de mengperiode geeft aanleiding tot het voorkomen van ongewenste COSY correlaties en niet de

gewenste NOESY correlaties. Deze component moet dus verwijderd worden aan het begin van de

mengperiode. Deze ongewenste component kan worden verwijderd door gebruik te maken van

enerzijds ‘phase cycling’ waarbij de beschouwde component afwisselend gericht is langs de positieve

en negatieve kant van de x‐as. Door vervolgens de successieve scans op te tellen, wordt deze herleidt

tot nul.

Een tweede mogelijkheid berust weer op het gebruik maken van een pulsed field gradiënt Gz. Deze

zorgt ervoor dat de transverse magnetisatievectoren worden gedefaseerd over de volledige lengte

van het staal. De vectorsom van alle gedefaseerde magnetisatievectoren leidt uiteindelijk tot het

verdwijnen van de ongewenste component zodat deze niet langer wordt gedecteerd.

Binnen het NOESY experiment kan de mengtijd tm worden aangepast om te trachten intensere

kruispieken te verkrijgen tussen de beschouwde protonen. Doorgaans kan men verwachten dat een

langere tm leidt tot intensere kruispieken omdat de transfer d.m.v. het NOE effect langer heeft

kunnen inwerken. Echter dient hier een belangrijke kanttekening bij te worden gemaakt: na een

zekere duur van tm zal de intensiteit van de kruispieken alleen nog maar afnemen ten gevolge van het

verdwijnen van de longitudinale magnetisatie als gevolg van relaxatie. Dit staat ook bekend als de T1‐

leaching. In functie van de kruis‐relaxatiesnelheid die de kruispiek opbouwt, en de longitudinale

relaxatiesnelheid die de kruispiek reduceert, bestaat er een optimale mengtijd tm die aanleiding zal

geven tot een maximale kruispiekintensiteit. Daarom kan het nuttig zijn om een idee te hebben van

de T1‐relaxatietijdsconstante van de geobserveerde signalen. Zo kan het immers zijn dat bij een

bepaalde mengtijd de T1‐relaxatie al voldoende is opgetreden om aanleiding te geven tot kruispieken

die minder intens zijn dan wanneer men de tm zou verkleinen. Het is dus goed mogelijk dat door tm te

verkleinen er toch een intensere kruispiek kan worden verkregen in de NOESY‐spectra. De manier

waarop men een idee kan krijgen van de lengte van deze T1‐tijden is via het inversion‐recovery

experiment (zie verder).

Een ander fenomeen dat kan optreden bij langere tm‐waarden voor grotere moleculen zoals de

oligonucleotiden in dit werk is spin diffusie. Hierbij lijkt magnetisatie getransfereerd te worden naar

kernen die in principe te ver van elkaar gelegen zijn om aanleiding te geven tot directe kruispieken.

De magnetisatie wordt evenwel doorgegeven via een derde tussenliggende site die ruimtelijk dicht

genoeg is gelegen bij de eerste twee om als tussenstation te dienen en de magnetisatie te

transferen.

De 2D NOESY experimenten die worden gebruikt zijn uitgerust met een extra WATERGATE sequentie

na de 3e puls om het intense solventsignaal te onderdrukken en de toekenning te bevorderen.

Eenmaal de parameters voor deze onderdrukking zijn geoptimaliseerd in de 1D experimenten,

kunnen deze moeiteloos overgedragen worden op de NOESY‐metingen.

Praktisch werden 2D NOESY spectra opgemeten met het noesyfpgpphwg pulsprogramma uit de

Bruker bibliotheek [3]. Er werdend doorgaans 512 t1 waarden opgemeten, telkens bestaande uit 64

of 96 FIDs bemonsterd met 4096 punten. De mengtijd varieerde van 80 tot 150 ms. De

relaxatieperiode was 2,0 s. De WATERGATE parameters waren deze die eerder gespecifieerd werden

(zie 2.3.1.2). De verwerking bestond in vermenigvuldiging met een gekwardateerd sinusvenster langs

26

t2 en t1, gevolgd door fourier transformatie naar een 2D data matrix van 2048 bij 2048 punten.

Basislijncorrecties werden waar nodig uitgevoerd met een polynoom functie.

2.3.3 MetenvanT1viahetinversionrecoveryexperiment

De algemene pulssequentie en de evolutie van de bulkmagnetisatie kan worden teruggevonden in

figuur 2.7. In het volledige experiment worden in totaal n individuele spectra opgemeten waarbij

telkens het delay τ wordt aangepast. In totaal worden er n 1D 1H spectra verkregen waarbij de

intensiteit van de signalen evolueert van volledige negatief naar volledig positieve waarden.

Omwille van radiation damping van de zeer intense waterresonantie en om saturatie transfer te

vermijden, werd de niet‐selectieve 180° puls in de inversion revovery sequentie vervangen door een

selectieve 180° DANTE puls [1].

Hoe is men nu in staat om uit deze meting een waarde te verkrijgen voor de karakteristieke T1‐tijd

van een spin in een willekeurige molecule ? Voor een spinsysteem met één enkele chemische

omgeving en geen scalaire koppeling geldt:

Met T1 de spin‐rooster of longitudinale relaxatietijdsconstante, Mz de bulkmagnetisatie bij een

willekeurige tijd t (Mzt) en M0 de bulkmagnetisatie bij evenwicht (t = ∞, Mz

ev). Deze uitdrukking kan

worden herschreven tot een eerste orde differentiaalvergelijking.

90°x Acquisitie180°x

Inversie puls Uitlees‐puls

τ

90°x180°x

τ1

z

x

y

z

x

y

z

x

y

z

x

y

Inversie relaxatie uitlezen

τ2 > τ1

90°xz

x

y

z

x

y

FT

Figuur 2.7 Overzicht pulssequentie en evolutie bulkmagnetisatie

27

Hierbij is k1 de longitudinale relaxatiesnelheidsconstante gedefinieerd volgens

Na het uitwerken van de differentiaalvergelijking wordt er een algemene oplossing bekomen van de

vorm

De exacte vorm van de oplossing is dus afhankelijk van , met andere woorden de

grootte van de perturbatie van de evenwichtspopulatie. Gezien een vaste waarde heeft, zal

, de bulkmagnetisatie na de aangebrachte perturbatie, de uitkomst gaan bepalen. Juist na het

toepassen van de 180°‐puls verkrijgen we de volgende situatie:

2

1 2

Deze laatste vergelijking geeft ons de mogelijkheid om k1 en dus ook T1 te weten te komen. Door het

uitzetten van de signaalintensiteit in functie van de gebruikte delay τ en vervolgens deze te fitten aan

de afgeleide functie kan k1 worden bepaald, wat gewoon de inverse is van T1 voor dat specifiek

signaal. Eens de waarde van T1 voor een specifieke set van signalen is geweten, kan een intelligente

keuze gemaakt worden voor de duur van de mengtijd tm in het 2D NOESY experiment.

2.4Referenties

1. Bruylants, G., et al., Comparison of the Thermodynamics and Base‐Pair Dynamics of a Full

LNA:DNA Duplex and of the Isosequential DNA:DNA Duplex. Biochemistry, 2009. 48(35): p. 8473‐8482.

2. M. Piotto, V.S.V.S., Water Supression using watergate sequence. Journal of Magnetic Resonance, 1993. Series A 102: p. 241‐245.

3. V. Sklenar, M.P., R. Leppik & V. Saudek, 2D Homonuclear correlation via dipolar coupling. Journal of Magnetic Resonance, 1993. A102: p. 241‐245.

28

Hoofdstuk3:ToekenningvandeDNAsequentiesvia2DNOESY

Voor alle hier bestudeerde duplexen kan men drie sets van iminoprotonen onderscheiden: thymine

protonen in de regio van 14,3 – 13,5 ppm, guanine protonen meestal in de regio gaande van 13,3 –

12,4 ppm en ten slotte een set van iminoprotonen overeenkomstig met die van de T‐T mismatch in

de regio rond 11,2 – 10,8 ppm.

De iminoprotonen voldoen aan de voorwaarden die aanleiding kunnen geven tot het ontstaan van

onderlinge nOe‐kruispieken: de B‐DNA duplexstructuur plaatst de iminoprotonen binnen een

maximale afstand van 3,4 Å boven of onder elkaar en kunnen dan ook via dit type meting worden

toegekend. De twee voornaamste zaken waarmee rekening moeten worden gehouden is enerzijds

het feit dat enkel de thymines (N3H) en guanines (N1H een iminoproton dragen en dus enkel deze

twee basen zichtbaar zullen zijn in het spectrum. Anderzijds kunnen kruispieken zowel afkomstig is

van een direct naburige base in dezelfde streng dan wel van een boven‐ of onderliggende base in de

complementaire streng. Dit laat in principe toe om van het éne naar het andere uiteinde van de

duplex te ‘stappen’ via een sequentie van imino–imino nOe contacten tussen opeenvolgende

baseparen.

In wat volgt zal, voor elk bestudeerd duplex de toekenning beschreven worden aan de hand van

dergelijke sequentiële wandeling (‘sequential walk’, [1]). Belangrijke parameter hierbij is de keuze

van de mengtijd in het NOESY experiment. Een te lange mengtijd kan immers een nefaste invloed

hebben op de intensiteit van de kruispieken of spin diffusie doen optreden, met het risico van een

bemoeilijkte toekenning als gevolg. Daarom wordt er voor iedere sequentie een T1‐bepaling

uitgevoerd aan de hand van het inversion‐recovery experiment bij een temperatuur van 5°C. De 2D

NOESY‐metingen worden meestal opgemeten bij een temperatuur waarbij de signalen individueel

het beste te onderscheiden zijn, waardoor er een verschil zit in de temperatuur waarbij de T1‐meting

is uitgevoerd en de 2D NOESY.

3.1Wildtype

De T1 relaxatietijdsconstanten voor het wild type duplex zijn verzameld in Tabel 3.1. De volgorde in

de tabel stemt overeen met het voorkomen van de signalen in het spectrum, gerangschikt van

hoogste naar laagste chemische verschuiving. De waarden spreiden zich uit van zo’n 40 tot 120 ms,

waarbij de T‐T mismatch wordt gekenmerkt door de kleinste T1‐waarden (44,6 en 47,9 ms), en dit

geeft meteen aan dat het toepassen van de gebruikelijke meettijd van 150 ms hier tot sterke

vermindering van de intensiteiten van sommige kruispieken kan leiden.


Figuur 3.1 Sequentie wild type

29

Base T1 (ms)

T18 117,6

T7, T27 a

T6 97,8

T24 59,6

G16 66,7

G9 91,2

G12 87,1

G26 91,5

G19 116,9

G25 72,7

TT(1) 44,6

TT(2) 47,9 a kan niet bepaald worden door signaaloverlap

Tabel 3.1 T1‐tijdsconstante van de iminoprotonen van het wild type duplex bij 5°C

Daarom werd het 2D NOESY spectrum opgenomen met een mengtijd van 80ms, in totaal 96 scans en

bij een temperatuur van 25°C. De toekenning van het wild type duplex m.b.v. het onderstaande

NOESY spectrum is een voorbeeld van het voordeel dat een kortere mengtijd tm kan opleveren in het

kunnen waarnemen van signalen met een kortere T1‐tijd.

T18

T27

T7T6 T24

G16G9

G12 G26

G19

G25 TT(1)TT(2)

Figuur 3.2 Toekenning iminoprotonen wild type via 2D NOESY

30

Hier is het signaal overeenkomstig met de kruispiek tussen basen T24 en G25 een dergelijk ‘type’

signaal: de T1‐waarden van beide signalen zijn beduidend lager en dit heeft tot gevolg dat de

kruispiek tussen beide een lagere intensiteit heeft dan het geval is bij basen gekenmerkt door een

langere T1‐tijd zoals bijvoorbeeld de kruispiek tussen T18 en G19. Wanneer de tabel met de

verschillende T1‐waarden wordt overlopen, dan valt het op dat er nog een aantal signalen zijn met

een nog kortere T1; een aantal van die signalen kunnen dus ook voordeel ondervinden bij deze

kortere mengtijd van 80ms.

Zoals blijkt uit het spectrum is de toekenning dan ook vrij vlot door te voeren op basis van het 80ms

NOESY spectrum, dat opgenomen werd bij een temperatuur waar er bijna geen last is van

signaaloverlap, wat een ondubbelzinnige toekenning vergemakkelijkt. In principe worden er 15

verschillende signalen verwacht. Dit komt overeen met het totaal aantal basenparen in de

bestudeerde veertienmeren, plus één extra signaal afkomstig van de tweede thymine van de T‐T

mismatch. In het spectrum kunnen er totaal 12 verschillende basenparen worden toegekend,

inclusief de T‐T mismatch. De twee terminale GC‐basenparen aan elk uiteinde van de sequentie

ontbreken.

De toekenning vertrekt van het iminosignaal van TT(1) en TT(2) die makkelijk worden teruggevonden

door hun duidelijk lagere chemische verschuiving tussen 10 en 11ppm die het gevolg is van “wobble”

basenparing [2]. Deze vertonen sterke contacten tussen elkaar en komen overeen met T8 en T21.

Een onderscheid tussen deze is echter niet mogelijk, aangezien beide eenzelfde patroon vertonen

van nOe‐contacten naar de omliggende basen. Beide signalen van de mismatch vertonen dus

kruispieken naar twee andere protonen, één in de regio van de guanines en één in de regio van de

reguliere thymines. De guanine moet overeenkomen met G9, die een direct nabuur is van de

mismatch. Hetzelfde geldt voor de thymine, dat moet overeenkomen met T7. Eens deze twee

signalen zijn toegekend, kunnen deze gebruikt worden als ankerpunt voor de toekenning van de

andere signalen, waarbij de toekenning van de sequentie respectievelijk naar de rechterzijde en

linkerzijde uitgebreid wordt.

T7 toont een kruispiek naar het eerste signaal aan zijn rechterkant, wat dan overeenkomt met T6.

Deze T6 toont dan weer, zij het iets minder duidelijk, een contact naar zijn rechterbuur in de

sequentie, die overeenkomt met T24 in de complementaire streng. Deze beschikt over een kruispiek

naar het signaal met de laagste ppm waarde in de regio van de guanines. Logischerwijs moet dit

iminosignaal overeenkomen met die van G25.

G25 toont een contact naar een diagonaalpiek waartoe bijgedragen wordt door twee signalen die

dicht bij elkaar zijn gelegen. Er is echter nog een thymine signaal, met de op één na hoogste

chemische verschuiving, dat ook een kruispiek vertoont in deze regio. Aan de hand van deze twee

kruispieken kan een onderscheid gemaakt worden tussen de bijdrage van de twee overlappende

signalen. Het betreffende signaal is een directe nabuur van G25 en heeft ook nog een thymine als

nabuur zodat deze guanine komt overeen met G26, terwijl de thymine dan moet overeenkomen met

T27. Op deze manier is de volledige linkertak van de sequentie dus toegekend.

De rechtertak is iets moeilijker, dit door het gebrek aan diversiteit tussen de basenparen.

Vertrekkende van G9, kan er een kruispiek worden teruggevonden naar de voorlaatste guanine. Dit

signaal komt overeen met G19, directe nabuur van G9. G19 vertoont dan weer een kruispiek naar

een thymine met de hoogste chemische verschuiving, deze komt overeen met de enige thymine

31

aanwezig in de sequentie na de mismatch, T18. Deze thymine vertoont nog een kruispiek naar een

guanine die gelegen is net voor G26 en komt overeen met G12. Deze laatste heeft ten slotte nog een

duidelijk contact naar de laatste niet‐geïdentificeerde guanine, G16.

G1 en G14 kunnen niet worden teruggevonden in de spectra en zijn dus bij alle temperaturen in

snelle uitwisseling op de NMR‐tijdschaal met het aanwezige solvent.

De toekenning van de alternatieve sequenties verloopt sterk analoog aan deze toekenning, met als

enige verschillen dat er enerzijds een nieuw iminosignaal kan worden toegekend dat overeenkomt

met het aangepaste basenpaar. Anderzijds kan het zijn dat door de wijziging van één basenpaar een

aantal iminosignalen verschuiven in het spectrum of overlappen met andere signalen.

3.2C9G20

Figuur 3.3 Sequentie C9G20

De 2D NOESY werd bij deze duplex opgemeten bij een temperatuur van 10°C.. Wanneer de

verschillende T1‐tijden in beschouwing worden genomen is het duidelijk dat vooral de thymines

worden gekenmerkt door een beduidend minder efficiënte longitudinale relaxatie. Er werden zowel

NOESY experimenten met een mengtijd van 80 als 150 ms opgenomen, elk met in totaal 64 scans,

met alle kruispieken zichtbaar in beide spectra. De T1‐tijden van de mismatchprotonen ontbreken

aangezien deze aanleiding geven tot onrealistische waarden. Niettemin zijn er duidelijke kruispieken

zichtbaar in het 2D‐spectrum. De reden voor het sterke afwijken van de berekende waarden in de T1‐

meting is het gevolg van afwijkingen in het verloop van de inversiekromme, waardoor de fitting niet

goed kan worden uitgevoerd. De oorsprong van deze afwijking is voorlopig nog onduidelijk.

Base T1 (ms)

T18 186,1

T7 185,2

T6 148,3

T24 156,2

G16 74,0

G20 63,6

G19 84,3

G12, G26 a

G25 71,0 a kan niet bepaald worden door signaaloverlap

Tabel 3.2 T1‐tijdsconstante van de iminoprotonen van C9G20 bij 5°C


32

In totaal kunnen er opnieuw 12 basenparen worden toegekend, met in totaal 13 iminosignalen

zichtbaar in het spectrum. Het aangepaste basenbaar C9G20 kan op dezelfde manier worden

geïdentificeerd als het geval was bij G9C20 in het wild type duplex via de nOe‐contacten met de

mismatchprotonen.

Deze sequentie heeft duidelijk iets meer last van signaaloverlap, vooral in de regio van de guanines,

maar een volledige toekenning is mogelijk. Het aangepaste basenpaar C9G20 is ook duidelijk toe te

kennen en situeert zich rond dezelfde chemische verschuiving als oorspronkelijk het geval was met

G9 (12,96 ppm t.o.v. 12,92 ppm). Verder heeft G19 een iets hogere chemische verschuiving (12,88

ppm versus 12,72 ppm bij de wild type) en vallen de signalen van G12 en G26 nagenoeg samen.

3.3G5C24

De inversion‐recovery experimenten uitgevoerd om de T1‐tijd te meten hebben aanleiding gegeven

tot onbruikbare resultaten als gevolg van problemen met de wateronderdrukking en werden omwille

van tijdsgebrek niet meer opnieuw uitgevoerd. De reden voor dit mislukken is onduidelijk, aangezien

hetzelfde protocol als voor de andere duplexen werd aangewend om deze metingen uit te voeren.


T18

T27

T7

T6 T24G16

G20G12

G19

G25TT(1) TT(2)

G26

Figuur 3.4 Toekenning iminoprotonen C9G20 via 2D NOESY

Figuur 3.5 Sequentie G5C24

33

De 2D NOESY metingen daarentegen hebben wel bruikbare resultaten opgeleverd en de toekenning

van deze sequentie kan worden teruggevonden in figuur 3.3. De meting werd uitgevoerd bij 25°C,

met een tm van 150ms en 96 scans. Het feit dat alle signalen aanleiding geven tot duidelijke

onderlinge nOe‐contacten is een indicatie dat de T1‐tijden voor deze sequentie ongeveer in dezelfde

grootteorde liggen als de voorgaande twee sequenties.

In totaal zijn er 10 signalen onderscheidbaar, wat een kleiner aantal is in vergelijking met de

voorgaande sequenties. De reden is eenvoudig: deze sequentie heeft te kampen met een aanzienlijke

signaaloverlap. Dit is waarschijnlijk ook te wijten aan de aard van het aangepaste basenpaar: een AT‐

eenheid wordt vervangen door GC‐basenpaar. Deze laatste zijn al sterk vertegenwoordigd in de

sequentie en het is dan ook niet echt een verassing dat er een aantal signalen samenvallen in de

spectra. Een welbepaald signaal, gelegen tussen G16 en G9 vertoont geen diagonaal‐ of kruispieken

in het spectrum. Dit doet vermoeden dat het signaal verloren gaat onder dat van G9 en dat de T1 te

kort is om bij de gekozen mengtijd nog nOe‐contacten te kunnen ontwikkelen. Ondanks het feit dat

een toekenning van dit signaal niet mogelijk is, kan het worden aangenomen dat dit overeenkomt

met het iminosignaal van het aangepaste basenpaar G5C24. Aanwijzingen hiervoor zijn dat enerzijds

alle andere signalen wel kunnen worden teruggevonden en anderzijds de twee uiterste basenparen,

G1 en G14, ook niet voorkomen in alle andere sequenties, waardoor dit de enig overgebleven

mogelijkheid is.

T18

T27 + T7

T6

G5

G16

G9G12, G26 + G25

G19

TT(1)TT(2)

Figuur 3.6 Toekenning iminoprotonen G5C24 via 2D NOESY

34

De thymine iminosignalen vertonen een vrij grote overlap, met uitzondering van deze van de

mismatch. Daarnaast is het duidelijk dat ook de guanines enige hinder ondervinden, zo overlappen

G12, G26 en G25. Ondanks deze complicaties is het toch mogelijk om alle basenparen toe te kennen

via een sequentiële wandeling, opnieuw met uitzondering van de terminale GC‐eenheden.

Het mag duidelijk zijn dat deze sequentie wat betreft toekenning duidelijk minder ideaal is dan de

wild type. Ook andere bemerkingen in de verdere analyse sluiten aan bij deze conclusie (zie verder).

3.4C2G27

De T1‐waarden bekomen voor deze sequentie liggen in dezelfde grootteorde als diegene bij de wild

type. G16 is de enige waarde die opvallend klein is (11,9ms), maar dit levert zoals blijkt uit het 2D

NOESY spectrum, geen probleem op betreffende de toekenning. De enige T1‐waarde die hier

ontbreekt is G12, de fitting van deze waarde leverde een niet bruikbaar resultaat op. Gezien de

gelijkenissen met de voorgaande sequentie kan verwacht worden dat deze een waarde heeft van zo

rond de 80ms.

Base T1 (ms)

T18 139,1

T7 79,3

T6 130,4

T24 22,9

G27 90,9

G26 74,4

G16 11,9

G9 30,5

G25 30,5

G19 110,8

TT(1) 71,4

TT(2) 82,7

Tabel 3.3 T1‐tijdsconstante van de iminoprotonen van C2G27 bij 5°C

De volledige toekenning van deze sequentie kan worden teruggevonden in figuur 3.4. De meting

werd uitgevoerd bij een temperatuur van 5°C, met een tm van 150ms en 96 scans. Het aangepaste

basenpaar kan worden geïdentificeerd door een kruispiek met zijn directe en enige zichtbare nabuur,

G26. De sequentie in het algemeen wordt gekenmerkt door een degelijke resolutie van de

iminosignalen. Zo zijn de verschillende thymines duidelijk te onderscheiden en ook de guanines

lijken, althans bij de gekozen temperatuur, geen hinder te ondervinden van signaaloverlap. De

grootste wijziging in de volgorde van de signalen is terug te vinden bij G27, het aangepaste

basenpaar, en het naburige G26. Deze komen nu voor het signaal overeenkomstig met G16 te liggen

in het spectrum, bij 13,18 en 13,12 ppm respectievelijk. Dit heeft als voordeel dat G12 nu vrij is van



35

signaaloverlap ten opzichte van de wild type; langs de keerzijde zijn G16, G26 en G27 zelf iets minder

duidelijk geresolveerd.

Een laatste kleine wijziging in het spectrum is het wisselen van de signalen van G25 met G19. Voor de

resterende signalen is de volgorde en toekenning analoog aan de wild type.

3.5G2C27

Bij deze laatste sequentie valt het vooral op dat de thymines gekenmerkt worden door vrij hoge T1‐

tijdsconstanten in vergelijking met deze van de wild type. De guanines daarentegen beschikken dan

weer over iets lagere waarden. Dit gedrag lijkt ook min of meer te worden weerspiegeld in het 2D

spectrum: de guanines vertonen onderling iets minder intense nOe‐contacten dan de thymines. Een

toekenning blijft mogelijk maar wordt hier iets moeilijker om uit te voeren door de hoge mate van

signaaloverlap in het guaninegebied. Dit kan wederom verklaard worden door het introduceren van

een GC‐basenpaar, analoog aan de voorgaande sequentie.


Figuur 3.5 Toekenning iminoprotonen C2G27 via 2D NOESY

T18

T7

T6

G16

G9G12

G19TT(1) TT(2)T24

G26

G25

G27


36

Base T1 (ms)

T18 203,3

T7 159,0

T6 163,9

T24 173,2

G16 79,7

G26, G9 a

G12 89,1

G25, G19 a

TT(1) 19,3

TT(2) 53,5 akan niet bepaald worden door signaaloverlap

Tabel 3.4 T1‐tijdsconstante van de iminoprotonen van G2C27 bij 5°C

Het spectrum werd opgenomen bij een temperatuur van 15°C, met een tm van 150ms en 64 scans.

Zoals verder ook in de analyse van de temperatuurstudies zal blijken, is het aangepaste basenpaar

niet zichtbaar in het spectrum. Een meting met een mengtijd van 80ms zou dus hier ook geen nut

hebben.

De thymines kunnen duidelijk van elkaar worden onderscheiden, terwijl de guanines bijna volledig

samenvallen onder 4 gezamenlijke signalen. G16 en G12 zijn de enige guanine basenparen die vrij

zijn van overlap terwijl G26, G9 en G25, G19 paarsgewijs met elkaar overlappen. Het aangepaste

T18 T7

T6

G16G9G12

G19TT(1)

TT(2)

T24

G26G25

Figuur 3.9 Toekenning iminoprotonen G2C27 via 2D NOESY

37

basenpaar lijkt dus een extra vorm van symmetrie te introduceren in de sequentie waardoor er

zoveel signalen samenvallen. Vanuit het oogpunt van toekenbaarheid van het iminogebied, moet

deze sequentie het dus duidelijk ook afleggen ten opzichte van de wild type.

3.6Conclusie

De toekenning van de verschillende sequenties aan de hand van de 2D NOESY spectra is vrij makkelijk

door te voeren al blijkt sequentie G2C27 toch wel duidelijk enige hinder te ondervinden van de hoge

mate van signaaloverlap.

Aangezien alle bestudeerde sequenties veertien basenparen bevatten en de mismatch aanleiding

geeft tot twee individuele signalen, zijn er maximum 15 signalen die men kan verwachten om toe te

kennen. Zoals reeds aangegeven, zijn bij alle sequenties echter de twee terminale GC‐basenparen

niet terug te vinden in de spectra. Dit brengt het maximum aantal toekenbare signalen terug op 13.

Hoewel bij alle sequenties, met uitzondering van G2C27, deze 13 basenparen kunnen worden

toegekend, zijn niet alle iminoprotonen vrij van enige overlap. Wanneer enkel de signalen in

beschouwing worden genomen die relatief vrij zijn van overlap, komt dit niet noodzakelijk overeen

met het aantal toekenbare basenparen. Zo zijn enkel bij de wild type als bij C2G27 alle signalen vrij

duidelijk geresolveerd. Bij C9G20 wordt dit aantal al teruggebracht tot 11 stuks, terwijl bij G5C24 en

G2C27 nog 10 vrij duidelijke signalen kunnen worden teruggevonden. Het is dus duidelijk dat op het

vlak van toekenning of de wild type of C2G27 te verkiezen zijn. Wanneer dan ten slotte nog de

toekenbaarheid over het volledige temperatuurbereik in beschouwing wordt genomen (zie ook

hoofdstuk 4), is het duidelijk dat ook hier de wild type in eerste instantie naar voor komt als de beste

kandidaat, daar waar C2G27 bij bepaalde temperaturen toch geplaagd wordt door beduidend meer

signaaloverlap.

Wanneer de T1‐waarden worden vergeleken tussen de verschillende duplexen, zijn er duidelijke

trends vast te stellen. Bij 2 sequenties, C9G20 en G2C27, worden de thymines gekenmerkt door een

beduidend grotere waarde voor de T1 dan het geval is bij de guanines. Bij de wild type en C2G27 is dit

niet het geval, hoewel basen T18 en T6 steeds over hoge T1‐waarden beschikken. Ook is het

opmerkelijk dat bij deze twee laatstgenoemde sequenties beide iminoprotonen van de T‐T mismatch

overeenkomen met de minima in T1‐tijden. Daar waar ze bij C2G27 beter aansluiten bij de andere

waarden.

Buiten T18 en T6, blijkt er dus geen echte trend te ontdekken in de T1‐waarden voor de verschillende

signalen en zijn deze eerder afhankelijk van duplex tot duplex. Het is ook opmerkelijk dat ondanks

minimale wijzigingen G2C27 en C2G27 duidelijke verschillen vertonen. De oorzaak hiervan is niet

duidelijk.

38

3.7Referenties

1. Wuthrich, K., et al., Sequential Resonance Assignments As A Basis For Determination Of Spatial Protein Structures By High‐Resolution Proton Nuclear Magnetic‐Resonance. Journal of Molecular Biology, 1982. 155(3): p. 311‐319.

2. Gervais, V., et al., Solution Structure Of 2 Mmismatches A‐Center‐DOT‐A And T‐Center‐DOT‐T In The K‐RAS Gene Context By Nuclear‐Magnetic‐Resonance And Molecular‐Dynamics. European Journal of Biochemistry, 1995. 228(2): p. 279‐290.

39

Hoofdstuk4:Temperatuurstudiewildtypeenalternatievesequenties

In dit hoofdstuk wordt de temperatuurstudie van de referentiesequentie (wild type) en de 4

alternatieve sequenties besproken. Meer specifiek wordt er van elk zichtbaar basenpaar, waar

mogelijk, een temperatuurscoëfficiënt bepaald wat ons toelaat om op een kwantitatieve wijze het

gedrag van de basenparen te vergelijken. Naast het gedrag in functie van de temperatuur wordt er

ook gekeken naar de maximale temperatuur waarbij de individuele basenparen nog zichtbaar zijn,

wat ons een idee kan geven van de stabiliteit van de sequentie in haar duplex vorm. Verder wordt er

een analyse doorgevoerd van de overkoepelende transversale relaxatieconstante T2* aan de hand

van de lijnbreedtes op halve hoogte over de verschillende temperaturen voor een aantal op

voorhand gekozen, wel gedefinieerde en geresolveerde signalen. Vooral dit laatste is van belang

aangezien het optreden van spectrale overlap aanleiding kan geven tot fouten in de bepaling van de

lijnbreedte, wat op zijn beurt dan weer aanleiding kan geven tot verkeerde interpretaties.

Het feitelijk doel van de studie is om na te gaan of er vertrekkende van het wild type duplex bepaalde

wijzigingen doorgevoerd kunnen worden aan de sequentie zodat een grotere stabiliteit verkregen

wordt en even goede of betere spectra verkregen kunnen worden. Bij dit laatstgenoemde wordt er

vooral gelet op de individuele onderscheidbaarheid van de geobserveerde iminoprotonen. Zekerheid

omtrent bovenvermelde eigenschappen is een noodzaak aangezien de optimale duplex dienst zal

doen als scaffold voor de verdere ontwikkeling van een serine protease mimic. Wanneer de

gemodificeerde bouwstenen worden ingebracht in de voor NMR meest geschikte scaffold, zal de

toekenning eenvoudiger verlopen en zal de stabiliteit van de duplex eenvoudiger kunnen worden

geanalyseerd.

4.1Het“two‐state”modelvoordeuitwisselingvaniminoprotonenbetrokkeninwaterstofbruggenbinneneenDNAduplexinoplossing

Vooraleer de resultaten per sequentie worden besproken is het belangrijk om de observaties te

kunnen kaderen binnen een theoretisch model. Door ons te voorzien van de nodige achtergrond kan

tot een duidelijkere interpretatie overgegaan worden. Het model dat hier wordt aangereikt staat

bekend als het zogenaamde “two‐state model” en beschrijft hoe een DNA duplex zich gedragen in

een protisch solvent en hoe dit gedrag zich manifesteert in het gedrag van de iminosignalen in het 1H

NMR spectrum [2], [3].

Een iminoproton betrokken in een waterstofbrugbinding binnen een DNA basenpaar is, in eerste

instantie, beschermd tegen het aanwezige solvent en zal dus ook niet uitwisselen met de labiele

waterprotonen. De typische weergave van de dubbele helix suggereert een starre structuur. Het is

echter een feit dat een DNA duplex behoorlijk wat flexibiliteit vertoont waarbij deze

waterstofbruggen niet continu intact worden gehouden maar op gezette tijden worden verbroken.

Ieder basenpaar wordt dus onderworpen aan een evenwicht tussen een open en gesloten toestand.

Dit fenomeen staat ook bekend als “basepair breathing”. Wanneer het basenpaar zich bevindt in de

open toestand, zijn de iminoprotonen wel toegankelijk voor de aanwezige solventmoleculen en kan

dus het iminoproton uitwisselen met één van de in nabijheid aanwezige solventprotonen.

40

Dit uitwisselingsproces kan onderverdeeld worden in drie verschillende stappen of fasen [4], [5].

1. Opening van het beschouwde basenpaar

2. Uitwisseling van het nu toegankelijke iminoproton met een proton van het aanwezige

solvent (de eigenlijke chemische uitwisseling)

3. Sluiting van het basenpaar

De verschillende stappen, schematisch uitgewerkt, kunnen worden teruggevonden in figuur 4.1

Binnen deze figuur stel Kd de dissociatieconstante voor van het basenpaar dat bepaald wordt door de

verhouding van de snelheidsconstante voor de opening en sluiting van het basenpaar, respectievelijk

kop en kcl.Ten slotte is ktr de snelheidsconstante voor de uitwisseling van het iminoproton met het

solvent. De levensduur van het basenpaar in gesloten toestand, τcl en de levensduur van het

basenpaar in open toestand τop, samen met de dissociatieconstante Kd kunnen aan de hand van

bovenstaande snelheidsconstanten worden gedefinieerd als volgt:

1

1

De uitwisselingstijd (exchange time, figuur 4.1), τex, komt overeen met de tijdsduur van het volledige

uitwisselingsproces samen met het openen en sluiten van het basenpaar. In de literatuur wordt

hiervoor typisch een waarde gevonden dat zich situeert op de tientallen ms tijdschaal of groter.

De snelheidsbepalende stap binnen dit meerstapsproces is de uitwisseling van het iminoproton naar

het solvent wanneer het basenpaar zich in de open toestand bevindt [6]. Deze stap kan worden

versneld door de aanwezigheid van een protonacceptor zoals ammoniak, NH3, die deze stap

katalyseert en dus de duur van het totale uitwisselingsproces zal verkorten. Dit type van katalysator

wordt ondermeer gebruikt in metingen voor het bepalen van τcl, d.i. de levensduur van een

basenpaar in de gesloten toestand [7].

Verder is het nog belangrijk om op te merken dat de snelheidsconstanten kop en kcl niet worden

beïnvloed door de aanwezigheid van een protonacceptor, maar karakteristiek zijn voor het type

τcl τop

Kd ktr Kd

τ ex , exchange time

Figuur 4.1 Schema met verschillende stappen betrokken in de chemische uitwisseling van een iminoproton met een proton van het aanwezige solvent. Rode bolletjes stellen protonen van water voor, zwarte de iminoprotonen.

41

basenpaar. Daarentegen gaat een verandering in temperatuur wel degelijk een invloed hebben op

alle snelheidsconstanten in dit proces.

Met deze theoretische achtergrond moet het nu mogelijk zijn om de verschillende observaties

gedurende de metingen beter te kunnen interpreteren.

4.2Aardvandeiminoprotonenendegevolgenophunwaarneembaarheidindespectra

Naast bovenstaand model dat het mogelijk maakt om de latere observaties te helpen interpreteren is

er nog een ander aspect waarmee rekening moet worden gehouden, meer bepaald de aard van de

geobserveerde iminoproton. Deze zijn uitwisselbaar met het solvent water. Bovendien zijn de

protonen van het solvent water nog eens in sterke overmaat aanwezig, wat de uitwisseling alleen

nog maar bevoordeelt.

Door het proces van chemische uitwisseling, wisselen de betrokken protonen continu van chemische

omgeving. Dit kan als volgt schematisch worden voorgesteld:

waarbij:

A en B twee verschillende chemische omgevingen voorstellen voor een proton (bvb: een

hydroxylgroep van sucrose en een watermolecule), elk gekenmerkt door een verschillende

chemische verschuiving ωA en ωB.

k1 en k‐1 de snelheidsconstanten zijn voor de uitwisselingsreactie van het proton van A naar B

en omgekeerd

Verder wordt gewerkt met een totale uitwisselingssnelheidsconstante kex dat gedefinieerd wordt als:

waarbij:

En overeenkomt met de gemiddelde levensduur van het proton in de onderscheidbare

chemische omgevingen A en B.

Het feit dat zo’n chemisch uitwisselingsproces aan de gang is tijdens de meting heeft zijn gevolgen in

het al dan niet waarnemen van (één, twee of geen) signalen. Schematisch gezien kunnen de

verschillende situaties worden weergegeven zoals voorgesteld in figuur 4.2.

Hierbij zijn twee grootheden van belang. Enerzijds is er het frequentieverschil = |ωA – ωB| van een proton tussen beide chemische omgevingen. Deze bepaalt de zogenaamde NMR tijdschaal.

Anderzijds is er de uitwisselingssnelheidsconstante kex die de tijdschaal van het uitwisselingsproces

42

kenmerkt. In functie van hun onderlinge relatie kunnen 3 verschillende regimes onderscheiden

worden:

Trage uitwisseling:

Bij een voldoende lage

temperatuur verloopt de

uitwisseling van de labiele

iminoprotonen zoals alle andere

kinetische processen doorgaans

trager dan bij hogere

temperaturen. In deze situatie

zal de uitwisselingsnelheids‐

constante kleiner zijn dan

het frequentieverschil van de

twee signalen van de

beschouwde protonen die

overeenkomen met twee

(verschillende) chemische

omgevingen A en B. We zeggen

dat de uitwisseling traag is op de

NMR tijdschaal. Bijgevolg zijn

deze twee signalen ook elk apart

zichtbaar in het 1H 1D‐spectrum.

Snelle uitwisseling:

Bij een voldoende hoge temperatuur verloopt de uitwisseling van de labiele iminoprotonen

naar water en terug zodanig snel dat de uitwisselingsnelheidsconstante groter is dan het

frequentieverschil ∆ tussen de twee chemische omgevingen A en B. In deze situatie zal

slechts één enkel uitgemiddeld signaal zichtbaar zijn, we zeggen dat de uitwisseling snel is op

de NMR tijdschaal.

Middelmatige uitwisseling:

Wanneer de temperatuur niet hoog genoeg is voor een snelle uitwisseling maar ook niet laag

genoeg is voor een trage uitwisseling op de NMR tijdschaal, wordt er gesproken van een

situatie van middelmatige of intermediaire uitwisseling op de NMR tijdschaal. In deze situatie

is de uitwisselingsnelheidsconstante ongeveer gelijk aan het frequentieverschil ∆ en

kan er gesproken worden van een regime dat tussen de twee extremen (snelle en trage

(a) (b)

kex = 0 s-1

kex/ = 0

kex = 300 s-1

kex/ = 0.12

kex = 1500 s-1

kex/ = 0.60

kex = kex/ = 1

kex = 7000 s-1

kex/ = 2.79

kex = 30000 s-1

kex/ = 11.94

Figuur 4.2 [1] Drie mogelijke situaties van uitwisseling van een proton tussen twee onderscheidbare chemische omgevingen. (a) gelijke populaties beide omgevingen (b) één omgeving in overmaat

aanwezig

43

uitwisseling) inzit. Dit resulteert in een spectrum waar de beschouwde signalen breed

worden uitgesmeerd over het frequentie interval dat zich tussen de twee oorspronkelijke

afzonderlijke signalen bevond. We spreken van coalescentie.

De lijnverbreding waarneembaar bij intermediaire uitwisseling op de NMR tijdschaal verschijnt niet

plotseling, maar groeit gestaag naarmate van trage tot intermediaire uitwisseling overgegaan wordt,

b.v. omdat bij vast frequentieverschil ∆ , vergroot naarmate de temperatuur stijgt. Na

coalescentie, neemt de lijnverbreding vervolgens weer af, naarmate overgegaan wordt van

intermediaire naar snelle uitwisseling.

Zoals reeds duidelijk blijkt uit de bovenstaande figuur kan binnen deze regimes nog eens een

onderscheid worden gemaakt in functie van de relatieve populatie van de twee chemische

omgevingen. In werklijkheid is het solvent (water) in zeer sterke overmaat aanwezig. Voor dergelijke

situatie kan aangetoond worden dat het intense signaal geen verbreding noch verschuiving zal

ondervinden in het spectrum. Voor het minderheidssignaal (hier de iminoprotonen) zullen de

signalen sterk verbreden en verschuiven lang voordat het intermediair uitwisselingsregime bereikt is

[1]. Als gevolg hiervan kunnen deze signalen reeds verdwijnen terwijl er nog sprake is van trage

uitwisseling op de NMR tijdschaal, deze situatie kan worden teruggevonden in figuur 4.2 situatie (b).

Wanneer beide omgevingen in gelijke mate zijn vertegenwoordigd, is situatie (a) van toepassing en

zijn beide signalen langer zichtbaar dan het geval is in situatie (b).

Teruggrijpend naar het two‐state model, moeten twee verschillende uitwisselingsprocessen tussen

drie verschillende omgevingen beschouwd worden. Enerzijds is er de conformationele uitwisseling

tussen een gesloten en open vorm van het basenpaar, waardoor het iminosignaal afwisselend de

chemische verschuiving van de open of gesloten vormt aanneemt. Daar waar de iminosignalen in de

gesloten vorm typisch boven de 12 ppm gelegen zijn, is dit in de open vorm eerder onder de 11 ppm

[8]. Daarnaast kan het imino waterstof in de open vorm uitwisseling met een watermolecule, dat

typisch rond 4.8 ppm aangetroffen wordt. Bij neutrale pH, zoals hier gebruikt werd, gebeurt het 2e

uitwisselingsproces nog voldoende traag op de NMR tijdschaal opdat de imino signalen zichtbaar

zouden zijn; we zitten in een situatie analoog aan Figuur 4.2[b] bovenaan. De “basepair breathing”

gebeurt dan weer snel op de NMR tijdschaal, en aangezien de gesloten toestand veruit de meest

voorkomende is, wordt de uitgemiddelde chemische verschuiving gedomineerd door deze vorm.

Naarmate de temperatuur verhoogt, nemen de snelheidsconstanten in waarde toe terwijl ook de

fractie aan open vorm toeneemt, waardoor de chemische verschuiving in toenemende mate

verschuift naar deze van de open vorm en het solvent. Dit wordt evenwel nooit bereikt omdat de

steeds snellere uitwisseling met het solvent leidt tot het verdwijnen van het signaal, zoals

aangegeven in figuur 4.4(b), zelfs indien de voorwaarde ~∆ nog niet bereikt is. Naarmate de

temperatuur verder verhoogt wordt, gaat uiteindelijk ook de duplexstructuur verloren omdat de

opeenvolgende basenparen nauwelijks tot niet meer in de gesloten vorm voorkomen.

De verandering in chemische verschuiving en de lijnbreedte van de iminosignalen kan ons dus

kwalitatieve informatie verschaffen over het gedrag van elk individueel basenpaar in de DNA duplex.

Op dit vlak, biedt dit een andere blik dan deze verkregen uit de smelttemperaturen Tm, opgemeten

met UV‐spectroscopie.

44

4.3Wildtype(T‐Tmismatch)4.3.1 Chemischeverschuivinginfunctievantemperatuur

De sequentie van de wild type wordt hieronder weergegeven in figuur 4.3. Deze werd onderworpen

aan een temperatuurstudie waarbij de temperatuur vertrekkende van 5°C systematisch werd

verhoogd tot een temperatuur waarbij er geen signalen van de iminoprotonen zichtbaar zijn.

De toekenning werd reeds toegelicht in het voorgaande hoofdstuk en is ter verduidelijking nog eens

aangebracht op het overzicht van de temperatuurstudie (Figuur 4.4). Niet alle temperaturen worden

weergegeven omdat de meerwaarde hiervan eerder beperkt is. De resultaten van deze metingen zijn

wel volledig meegenomen in de verdere dataverwerking.

Uit figuur 4.4 blijkt duidelijk dat bij 25°C het spectrum 13 toekenbare iminoprotonen vertoont. Deze

zijn dus in trage uitwisseling met het solvent op de NMR tijdschaal. Het opvallende aan de spectra is

het ontbreken van de terminale GC‐basenparen die over het volledige temperatuursbereik nooit

terug te vinden zijn. Dit is een gevolg van het feit dat de beschouwde basenparen meer tijd

doorbrengen in de open toestand en bovendien gemakkelijker toegankelijk zijn voor het solvent,

zodat hun iminoprotonen vertoeven in een regime van snelle uitwisseling op de NMR‐tijdschaal en

dus niet zichtbaar zijn de spectra. Deze observatie kan, zoals verder ook blijkt, worden

doorgetrokken worden naar alle sequenties: steeds zijn de buitenste basenparen afwezig in de

spectra.

5°C

15°C

25°C

35°C

45°C

55°C

60°C

G26

T18

T27

T7T6 T24

G16 G9 G12

G19G25 TT(1) TT(2)

Figuur 4.3 Sequentie wild type

Figuur 4.4 Overzicht temperatuurstudie iminoprotonen wild type


45

Verder verschuiven sommige signalen duidelijk meer dan andere en ontstaan of verdwijnen er

overlappingen (bv. T27 en T7 bij 5°C), naarmate de temperatuur daalt of stijgt. Bij 60°C zijn alle

iminoprotonen verdwenen. Een meer kwantitatief beeld van het temperatuursgedrag van de

iminoprotonen wordt gegeven in figuur 4.5, waar de chemische verschuiving van de iminoprotonen

wordt uitgezet in functie van de temperatuur.

Figuur 4.5 Chemische verschuiving in functie van de temperatuur voor wild type

Bij deze figuur wordt voor alle imino signalen de chemische verschuiving gevolgd in functie van de

temperatuur. Vervolgens wordt aan elke dataset een trendlijn gefit met een richtingscoëfficiënt

waaruit dan de zgn. temperatuurscoëfficiënt, afgekort als TC, kan worden bepaald. De waarden voor

TC voor elke base kan worden teruggevonden in tabel 4.1. T7

en T27 worden hier samen vermeld aangezien ze bij de meeste

temperaturen gezamenlijk verschuiven. Aan de hand van deze

coëfficiënten kan een inschatting worden gemaakt van het

gedrag van de chemische verschuiving van elk individueel

iminoproton in functie van de temperatuur en kan later een

vergelijking worden gemaakt met de andere sequenties om de

mogelijke impact van de modificaties in beeld te brengen.

Een eerste duidelijke trend in deze temperatuurscoëfficiënten

is het feit dat ze allemaal een negatief teken hebben. Dit komt

erop neer dat naarmate de temperatuur toeneemt de

chemische verschuiving van de iminoprotonen daalt. Zoals

eerder aangegeven zorgt een hogere temperatuur voor een

toename in snelheid van uitwisseling, waardoor de

9,750

10,250

10,750

11,250

11,750

12,250

12,750

13,250

13,750

14,250

0 10 20 30 40 50 60

Chemische verschuiving δ(ppm)

Temperatuur (°C)

T18T7 & T27T6T24G16G9G12G26G19G25TT(1)TT(2)

Base TC (ppb/K)

T6 ‐6,40 ± 0,06

T24 ‐6,20 ± 0,13

T18 ‐5,30 ± 0,05

T7 &T27 ‐4,60 ± 0,58

TT(1) ‐4,00 ± 0,16

G9 ‐3,10 ± 0,10

G16 ‐2,60 ± 0,16

G25 ‐2,60 ± 0,06

G19 ‐2,20 ± 0,04

G26 ‐2,20 ± 0,16

G12 ‐1,90 ± 0,08

TT(2) ‐0,70 ± 0,08

Tabel 4.1: Temperatuurscoëfficiënten wild type

46

iminoprotonen verschuiven in de richting van het watersignaal. Er is dus sprake van een evolutie van

een regime van trage uitwisseling naar een regime van snelle uitwisseling op de NMR‐tijdschaal voor

het 2e uitwisselingsproces. Ten tweede is het duidelijk uit het verschil in grootte van de

temperatuurscoëfficiënten dat de thymines een grotere temperatuursafhankelijkheid vertonen dan

het geval is bij de guanines. Dit kan worden verklaard door het verschil in het aantal

waterstofbruggen tussen beide typen basenparen. Dit wordt ook ondersteund door de observatie

dat de levensduur van een GC basenpaar in de gesloten vorm tot ~10 maal groter is dan dat van een

AT‐basenpaar [6]. Hieruit kan dus besloten worden dat een GC‐basenpaar aanzienlijk stabieler is.

Een derde en belangrijke observatie is het gedrag van de iminoprotonen van de thymines in de T‐T

mismatch. Zoals eerder gezegd zijn deze betrokken in een “wobble” type basenpaar vorming, zoals

reeds aangegeven in hoofdstuk 1. Het eerste iminoproton TT(1) sluit qua grootte van de

temperatuurscoëfficiënt min of meer aan bij de andere thymines maar het tweede, TT(2), vertoont

een afwijkend gedrag. De positie verandert nauwelijks naarmate de temperatuur stijgt. Dit lijkt te

suggereren dat dit iminoproton niet of nauwelijks beïnvloedt wordt door het proces van chemische

uitwisseling ter hoogte van dit basenpaar.

4.3.2 MaximalewaarneembaretemperatuurTmax

De maximale temperatuur Tmax waarbij er nog signalen van de iminoprotonen zichtbaar zijn geeft een

indicatie van de stabiliteit van de verschillende duplexen. Er moet echter een waarschuwing gegeven

worden voor een al te letterlijke interpretatie: wanneer de signalen niet langer zichtbaar zijn wil dit

niet zeggen dat de duplexstructuur reeds volledig verloren gegaan is. Er moet namelijk rekening

worden gehouden met de chemische uitwisseling ter hoogte van de iminoprotonen. Zoals reeds

eerder in paragraaf 4.1 werd aangetoond, moet er in de regimes van trage en snelle uitwisseling

verder nog extra rekening worden gehouden met het populatieverschil tussen de iminoprotonen en

het solvent. Juist door dit populatieverschil kunnen de signalen sneller verdwijnen dan men zou

verwachten louter op basis van de overgangen tussen de verschillende uitwisselingsregimes bepaalt

door de relatie tussen en .

Ondanks dit voorbehoud stellen we vast dat de Tmax vrij goed

overeenkomt met de smelttemperatuur Tm bepaald door UV‐

spectroscopie(zie hoofdstuk 6) Gezien de definitie van de

smelttemperatuur (= temperatuur waarbij er 50% duplex en 50%

simplex aanwezig is) en het feit dat dit een parameter is die typisch

wordt gebruikt voor het aangeven van de stabiliteit van de duplex,

kan de interpretatie van de maximale temperatuur hier ook bij

aansluiten.

Bij het aanduiden van de maximale temperatuur wordt er gebruik

gemaakt van de rechts afgebeelde (universele) kleurencode.

niet zichtbaar

5°C

7,5°C

10°C

12,5°C

15°C

20°C

25°C

30°C

35°C

40°C

45°C

50°C

55°C

47

Toegepast op de individuele basenparen, geeft dit volgend resultaat:

Figuur 4.6 Grafische weergave van de maximale waarneembare temperatuur voor wild type

Een opmerkelijk feit is dat de T‐T‐mismatch protonen zelf zichtbaar blijven tot de maximale

temperatuur bereikt is. Men zou verwachten dat deze mismatch door de niet ideale Watson‐Crick

basenparing een verminderde stabiliteit zou vertonen en sneller beïnvloedt worden door

uitwisseling. Wel kan er verwacht worden dat door de aanwezigheid van de mismatch de stabiliteit in

het algemeen lager ligt dan bij een duplex zonder mismatch [6].

Wanneer de sequentie wordt opgedeeld in twee verschillende takken voor en na de mismatch, dan is

de rechtertak (na de mismatch) iets stabieler te noemen dan de linkertak. Dit is waarschijnlijk het

gevolg van een extra GC‐basenpaar in de rechtertak ten opzichte van de linker.

De smelttemperatuur (Tm) van deze duplex bedraagt ongeveer 48,6°C. Gezien het vrij uniforme

gedrag van alle basenparen die zichtbaar blijven tot die temperatuur of hoger, zijn deze twee

gegevens in vrij goede overeenstemming met elkaar.

4.3.3 MaximaleT2*‐tijd

Analoog aan de maximale temperatuur wordt een analyse uitgevoerd op vlak van de T2‐tijd. Deze

wordt bepaald uit de lijnbreedtes op halve hoogte (FWHM) van de individuele signalen door in

Topspin (Bruker) het deconvolutiealgoritme toe te passen en met behulp van onderstaand verband.

1 ∗

∗ 1

De reden waarom deze analyse wordt uitgevoerd is enerzijds om na te gaan wat de impact van de

temperatuur is op de lijnbreedte. Anderzijds kan op deze manier ook worden nagegaan in welke

mate de aangebrachte basenpaaraanpassingen een invloed zullen hebben op de relatieve stabiliteit,

immers het verdwijnen van de imino signalen met toenemende temperatuur wordt voorafgegaan

door lijnverbreding. Het feit dat hiervoor geen extra metingen nodig zijn is ook mooi meegenomen.

In het eerste gedeelte van figuur 4.7 is duidelijk te zien dat de T2* voor de meeste signalen toeneemt

in functie van de temperatuur, met andere woorden de lijnen scherpen op. Dit kan beschouwd

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

48

worden als normaal gedrag. Immers, voor T2*, de overkoepelende transversale

relaxatietijdsconstante, geldt algemeen volgende uitdrukking:

1∗

1

,

1

,

met

- , de natuurlijke transversale relaxatietijdsconstante

- , = de transversale relaxatie veroorzaakt door de aanwezigheid van inhomogeneïteiten in het magneetveld B0

Theoretisch gezien zou een toename in de temperatuur een daling veroorzaken in de rotatie

correlatietijd ,i.e. de gemiddelde tijd tussen twee willekeurige magnetische perturbaties die een

relaxatie‐overgang induceren. Deze daling in leidt op zijn beurt dan weer tot een toename van de

transversale relaxatietijdsconstante T2* , waarbij de relaxatie wordt geïnduceerd door magnetische

dipool‐dipool interacties die willekeurig variëren in tijd bij moleculaire reoriëntatie. Er zijn ook nog

andere mogelijke mechanismen die relaxatie kunnen induceren, echter rond kamertemperatuur is

het dipool‐dipool mechanisme het meest efficiënte en dus meest relevante mechanisme.

Zolang de T2* lineair toeneemt in functie van de temperatuur, is het mechanisme van de dipolaire

relaxatie overheersend. Echter bij een bepaalde temperatuur vertonen de curven een maximum om

daarna plots weer te dalen tot de signalen uiteindelijk te sterk verbreed zijn om ze nog te kunnen

volgen. Deze ogenschijnlijke tegenstelling met de bovenstaande theoretische verwachtingen kan

worden verklaard, zoals reeds eerder is aangehaald, door de bijdrage van een ander mechanisme nl.

chemische uitwisseling van de beschouwde iminoprotonen met het aanwezige solvent, water.

Als er rekening wordt gehouden met de bovenstaande verklaring, dan kan de uitdrukking voor T2*

als volgt worden uitgebreid:

1∗

1

,

1

,

1

,

Veronderstellend dat de bijdrage in T2* ten gevolge van veldinhomogeneïteiten constant blijft over

het volledige temperatuursbereik, dan kan de plotse daling in T2* worden verklaard door het

dominant worden van de bijdrage afkomstig van de chemische uitwisseling bij de hogere

temperaturen.

Vooraleer de chemische uitwisseling een “bijdrage” kan leveren tot de lijnbreedte moet het

iminoproton wel beschikbaar zijn voor uitwisseling, dus moet het basenpaar voldoende in de open

vorm beschikbaar zijn. Hoe minder tijd het basenpaar doorbrengt in de open vorm, hoe minder snel

lijnverbreding zal optreden ten gevolgde van de exchange. Verder geldt dat de grootteorde van τc

voor alle duplexen gelijk is (het zijn allemaal 14‐meren), dus enige verschillen in dit gedrag moeten

wel afkomstig zijn van de uitwisselingsbijdrage in T2*. Bijgevolg kan de evolutie van T2* en het

karakteristieke maximum gebruikt worden als een maat voor de stabiliteit van de duplex.

49

Zoals vrij duidelijk blijkt uit figuur 4.7 zijn er een aantal signalen die duidelijk te volgen zijn over het

volledige temperatuursbereik. Echter zijn er ook een groot deel die slechts beperkt te volgen zijn of

die overlap vertonen met andere signalen waardoor de lijnbreedtes niet betrouwbaar bepaald

kunnen worden en hierdoor geen echt duidelijk verloop vertonen. Daarom wordt analyse enkel

uitgevoerd op signalen die volledig te volgen zijn over het volledige temperatuursbereik en geen last

ondervinden van signaaloverlap. De signalen die hiervoor worden gevolgd zijn T18, T6, T24 en beide

iminoprotonen overeenkomstig met de TT‐mismatch.

0,002

0,007

0,012

0,017

0,022

0,027

0 10 20 30 40 50 60

T 2*‐tijd (s)

Temperatuur (°C)

T18

T7 & T27

T7 & T27

T6

T24

G16

G9

G12

G26

G19

G25

TT(1)

TT(2)

Figuur 4.7 Overzicht T2* in functie van temperatuur van de wild type

50

Een vergelijking van T24 met T6 maakt dit duidelijk: de maximale T2*‐tijd van T24 bevindt zich bij

45°C, terwijl die van T6 zich al bij 40°C bevindt. Dit wil dus zeggen dat de chemische uitwisseling bij

T6 sneller zal ingrijpen dan het geval is bij T24. Bijgevolg kan het A5T24 basenpaar als iets stabieler

worden beschouwd dan T6A23.

Specifiek in de wild type, vertonen T18 en T24 een iets hoger maximum dan het geval is bij T6.

Daarnaast is één van de mismatch thymines ongeveer gelijkwaardig aan T6 terwijl de andere nog een

iets lager maximum vertoont.

Volledig gelijkaardige analyses werden uitgevoerd voor de 4 voorgestelde alternatieve sequenties en

worden hierna één voor één besproken.

0,002

0,007

0,012

0,017

0,022

0,027

0 10 20 30 40 50 60

T 2*‐tijd (s)

Temperatuur (°C)

T18

T6

T24

TT(1)

TT(2)

Figuur 4.8 T2* in functie van de temperatuur voor een selectie van signalen van de wild type

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

Figuur 4.9 Grafische weergave maximale T2* wild type

51

4.4C9G204.4.1 Chemischeverschuivinginfunctievantemperatuur

De aanpassing in de sequentie, C9G20, komt overeen met een base‐flip juist na de mismatch: een

GC‐basenpaar wordt vervangen door een CG‐basenpaar.

Zoals figuur 4.11 lijkt te suggereren is deze duplex iets minder stabiel dan de wild type. De signalen

zijn al volledig verdwenen bij 55°C terwijl dit bij de wild type pas bij 60°C waargenomen werd. Ook

het verschil in smelttemperatuur lijkt dit te bevestigen: een gemiddelde smelttemperatuur van

45,2°C. Ten opzichte van de wildtype (48,6°C) is dit toch een significant verschil. Dit lijkt eerder

onverwacht aangezien de basen hetzelfde zijn gebleven, enkel de inplanting is anders. Dit kan duiden

op een algemene verstoring van de duplexstructuur door een minder efficiënte stacking van de

opeenvolgende basen. In dit opzicht is het ook opmerkelijk dat de modificatie zelf (G20) maar te

volgen is over een beperkt temperatuursbereik (5‐15°C) en daarna plots verdwijnt, zoals later ook te

zien zal zijn in de maximale waarneembare temperatuur. Bij 5°C lijkt deze sequentie zich beter te

gedragen dan de wild type in termen van signaaloverlap, maar dit gaat verloren eens de temperatuur

toeneemt.

5°C

15°C

25°C

35°C

45°C

50°C

55°C

G20


Figuur 4.11 Overzicht temperatuurstudie iminoprotonen C9G20

T18 T27

T7

T6 T24

G16

G19G26

G25

TT(1) TT(2)


52

De temperatuurscoëfficiënten zijn opgenomen in Tabel 4.2

terwijl de vergelijking met de wild type wat betreft

temperatuursgedrag teruggevonden wordt in figuur 4.13 en

4.14. Wat wel rechtstreeks uit bovenstaande grafiek en

tabel kan worden afgeleid is het plotse verschil in het

gedrag van de thymines in de mismatch: deze zijn

omgewisseld in temperatuursgedrag. In dit geval gedraagt

TT(2) zich als een vrij normale thymine daar waar de imino

op deze positie in de wild type en tevens alle andere

sequenties (zie verder) juist diegene was die nauwelijks

variatie in chemische verschuiving vertoont in functie van

de temperatuur. Hetzelfde met TT(1), deze heeft een bijna

constante chemische verschuiving met stijgende

temperatuur daar waar deze oorspronkelijk zich juist

gedroeg als een vrij normale thymine.

Er zijn twee mogelijke verklaringen voor dit gedrag:

De thymines blijven hetzelfde gedrag vertonen als voorheen maar wisselen gewoon van

plaats in het spectrum (chemische verschuiving) door een verandering in de onmiddellijke

chemische omgeving veroorzaakt door de base‐flip.

Tabel 4.2: Temperatuurscoëfficiënten C9G20

Base TC (ppb/K)

T7, T27 ‐8,80 ± 0,29

T6 ‐6,60 ± 0,05

T18 ‐6,50 ± 0,16

T24 ‐6,00 ± 0,09

TT(2) ‐4,70 ± 0,29

G19 ‐3,80 ± 0,03

G26 ‐3,50 ± 0,40

G16 ‐3,30 ± 0,14

G25 ‐3,10 ± 0,21

G12 ‐2,20 ± 0,10

G20 ‐2,00 ± 0,12

TT(1) ‐1,20 ± 0,29

Figuur 4.12 Chemische verschuiving in functie van de temperatuur voor C9G20

9,500

10,000

10,500

11,000

11,500

12,000

12,500

13,000

13,500

14,000

14,500

0 10 20 30 40 50 60


Temperatuur (°C)

T18T27 T7T6T24G16G20G19G12G26TT(1)TT(2)G25

53

T6

G12

G16

G19

G25

G26 G20

T18

T24

T27T7

TT(1)

TT(2)

TC(C9G20) = 0,81TC(wt) + 1,76R² = 0,3265

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0Temperatuurscoëfficiën

t C9G20 (ppb/K)

Temperatuurscoëfficiënt wild type (ppb/K)

Beide thymines blijven hun oorspronkelijke positie behouden in het spectrum maar wisselen

in gedrag door een gewijzigd waterstofbrugpatroon dat geïnduceerd wordt door een verschil

in interactie met het bovenliggende gewisselde basenpaar.

Deze laatste mogelijkheid impliceert dus een verandering in conformatie van de mismatch zelf onder

invloed van de omgekeerde π‐π stacking van bovenliggend basenpaar. Zoals reeds eerder vermeld in

hoofdstuk 3 is het heden onmogelijk om beide TT signalen toe te kennen naar het respectievelijke

thymine in de mismatch.

Om een onderscheid te kunnen maken tussen beide mogelijkheden is het noodzakelijk om over te

gaan tot een poging beide mismatchen te identificeren. Een mogelijkheid zou zijn om in het T‐T

basenpaaréén thymine bouwsteen in te bouwen, zowel in de wild type als C9G20 sequentie, voorzien

van een stabiel isotoop, zoals een 15N in de plaats van het stikstofatoom waarop het beschouwde

iminoproton gebonden is. Door de scalaire 1J1H‐15N koppeling zal het signaal van één van beide

iminoprotonen van de T‐T mismatch worden opgesplitst en dus kunnen worden geïdentificeerd.

T27G26

G25T24 T6

T7

TT(1)

TT(2)

G20

G19T18 G12 G16

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Verhouding TC

Sequentievolgorde basenparen

Figuur 4.13 Vergelijking temperatuurscoëfficiënten C9G20 met wild type

Figuur 4.14 Verhouding temperatuurscoëfficiënten wild type/ C9G20

54

Bovenstaande figuren dienen hetzelfde doel, namelijk een vergelijking maken tussen het

temperatuursgedrag van de wild type en de C9G20 sequentie.

In figuur 4.12 worden de temperatuurscoëfficiënten t.o.v. elkaar uitgezet waarbij een best passende

rechte door de datapunten wordt gefit. In het ideale geval is de richtingscoëfficiënt van de rechte

gelijk aan 1 en vertonen beide sequenties hetzelfde gedrag. Zoals blijkt uit de figuur is dit duidelijk

niet het geval. De voornaamste afwijking is uiteraard te vinden bij de modificatie zelf (G20). Indien

we ervan uitgaan dat het TT1 signaal behoort tot hetzelfde thymine in de sequentie dan is er ook

speake van een belangrijke afwijking voor de iminoprotonen van de mismatch. Bij omwisseling zou er

sprake zijn van een goede overeenkomst. In dit geval zijn de richtings‐ en correlatiecoëfficient

respectievelijk 1,12 ppb/K en 0,62. Worden beide TT en de omwisseling uit de fit verwijderd dan zijn

deze waarden 1,09 ppb/K en 0,55.

Een iets meer intuïtieve interpretatie is mogelijk bij figuur 4.13. Hier wordt de verhouding van

temperatuurscoëfficiëten uitgezet in volgorde van de sequentie. Wanneer het beschouwde

basenpaar hetzelfde gedrag vertoont, ligt de verhouding op een y‐waarde van 1. De grootste

verstoring bevindt zich duidelijk op en rond de mismatch samen met het gewijzigde basenpaar.

Daarnaast lijken de basenparen in de onmiddellijke omgeving (T7 en G19) ook iets te ondervinden

van de gewijzigde situatie. Naarmate men zich verwijdert van de mismatch lijkt het effect af te

zwakken. Echter ook de uiteinden lijken enigszins een ander gedrag te vertonen, een directe

verklaring hiervoor is moeilijk. De gegevens lijken aan te geven dat de omwisseling van één

basenpaar naast de T‐T mismatch toch een globaal effect heeft op de stabiliteit van de volledige

duplex waardoor het gedrag in functie van de temperatuur wijzigt.

4.4.2 MaximalewaarneembaretemperatuurTMax

G26 en G19 zijn omgrind aangeduid aangezien deze signalen niet volledig te volgen zijn over het

volledige temperatuursbereik zodat zij niet vergeleken kunnen worden met de gegevens van de

andere sequenties. Beiden signalen ondervinden overlap met het signaal van G12. Globaal gezien is

er een verschuiving naar lagere temperaturen met zo’n 5 à 10°C, afhankelijk van het type basenpaar

dat wordt bekeken. Dit is dus ook in overeenstemming met de lagere smelttemperatuur voor deze

sequentie ten opzichte van de wild type.

Figuur 4.15 Grafische weergave van de maximale waarneembare temperatuur voor C9G20 (basenparen omringd in het zwart zijn niet te volgen over het volledige temperatuursbereik)

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

55

Meer specifiek lijkt het basenpaar van G20 duidelijk veel vroeger te verdwijnen, zoals ook al werd

opgemerkt de temperatuurstudie. Dit lijkt te suggereren dat het betreffende basenpaar in mindere

mate een stabilisatie ondervindt door de π‐π stacking interactie met zijn T‐T nabuur dan het geval

was met het oorspronkelijke basenpaar G9C20.


Wanneer er een vergelijking wordt gemaakt tussen de temperatuur waarbij de maximale T2* wordt

bereikt, kan er weer een daling gezien worden van 5 à 10°C al naargelang het beschouwde

basenpaar. Dit is opnieuw een bevestiging van de verminderde stabiliteit. Er kan worden

aangenomen dat de rotatie correlatietijd voor beide duplexen gelijk is, gezien hun gelijke moleculaire

dimensies, en dus zijn de verschillen in T2* enkel te wijten aan de invloed van chemische uitwisseling.

Aangezien T2* voor C9G20 in het algemeen bij een lagere temperatuur een maximum bereikt, kan

worden gesteld dat deze duplex in zijn geheel minder stabiel is.

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0 10 20 30 40 50

T 2*‐

tijd (s)

Temperatuur (°C)

T18

T6

T24

TT(1)

TT(2)

Figuur 4.16 T2* in functie van de temperatuur voor een selectie van signalen van C9G20

Figuur 4.17 Grafische weergave maximale T2* C9G20

56

Een laatste opmerking is het feit dat het profiel van de T2* in functie van temperatuur voor

iminoprotonen T18, T24 en T6 niet echt goed zijn gedefinieerd. Een mogelijke verklaring is het

optreden van signaaloverlap waardoor de breedtes op halve hoogtes niet altijd even goed zijn af te

leiden. Het algemene profiel wordt wel min of meer bewaard.

4.4.4 Chemischeverschuivingvandethymine5‐methylsignaleninfunctievandetemperatuur

Bij het opmeten van de smelttemperaturen via UV‐VIS (zie hoofdstuk 6), waarbij de absorbantie in

functie van de temperatuur wordt gemeten, is er een duidelijke evolutie van dubbelstrengs‐ naar

enkelstrengs‐DNA en wordt een typische “S”‐vormige curve verkregen die deze evolutie aantoont.

Indien men een vergelijkbare studie wenst uit te voeren met NMR, ontstaat het probleem dat de

enkelstreng vorm niet gemeten kan worden. Immers, de uitwisselbare iminosignalen verdwijnen

door uitwisseling met water. Indien men de temperatuurafhankelijke denaturatie van DNA met NMR

wenst te volgen, dienen dus andere resonanties gevolgd te worden.

Daarom werden hier de chemische verschuivingen van de individuele thymine methylsignalen van de

duplex gevolgd in functie van de temperatuur. Deze methylsignalen zijn niet‐uitwisselbare protonen

die bijgevolg zichtbaar zouden moeten blijven naarmate de temperatuur wordt verhoogd aangezien

deze niet worden blootgesteld aan chemische uitwisseling met water. Deze signalen genieten

bovendien een gelijkaardig voordeel als de iminoprotonen: ze liggen afgezonderd van de andere

signalen binnen een vrij beperkte spectrale regio tussen 1 en 2 ppm. Nadeel is dat deze signalen niet

zo eenvoudig toe te kennen zijn als de imino signalen. In afwezigheid van toekenningen worden de

thymine signalen daarom benoemd in functie van het voorkomen in het spectrum (van hoge naar

lage ppmwaarde).

1,250

1,350

1,450

1,550

1,650

1,750

1,850

0 20 40 60 80


Temperatuur (°C)

Me1

Me2

Me3

Me4

Me5

Me6

Me7

Me1(HT)

Me2(HT)

Me3(HT)

Me4(HT)

Me5(HT)

Me6(HT)

Me7(HT)

Figuur 4.18 Chemische verschuiving in functie van temperatuur methylsignalen C9G20

57

Zoals blijkt uit figuur 4.18, kan een soortgelijke “S”‐vormige curve min of meer worden waargenomen

[9]. De chemische verschuiving neemt in eerste instantie beperkt toe naarmate de temperatuur

toeneemt. Vanaf 45°C beginnen de methyl‐signalen sterke verbreding te vertonen om daarna

volledig te verdwijnen tussen 50 en 55°C. Vanaf 60°C wordt een nieuwe set methylresonanties

waargenomen, die vervolgens verder opscherpen, en neemt de neiging om op te schuiven naar

hogere ppm‐waarden af te zwakken. Omdat de signalen in het interval 50‐60°C niet gevolgd kunnen

worden is het ook niet mogelijk de data beneden en boven dit temperatuursinterval met elkaar te

verbinden, zodat de “S”‐vormige curven zelf niet kunnen worden geconstrueerd.

De verklaring van het temperatuursafhankelijke gedrag van de thymine methylsignalen kan als volgt

worden gerationaliseerd. Initieel bevinden alle methylgroepen zich in een dubbele DNA helix en

worden ze dus, per methylsignaal, gekenmerkt door 1 type chemische omgeving. Naarmate de

temperatuur toeneemt is er een langzame evolutie naar meer en meer “single stranded” DNA. tot op

een bepaald punt dat de signalen sterke verbreding ondervinden. Dit is het gevolg van het feit dat de

methylgroepen op dat moment in een evenwicht zitten tussen verschillende “vormen” van DNA. Met

andere woorden, er zullen DNA strengen aanwezig zijn die volledige gesloten zijn, een aantal

waarvan een willekeurige reeks van basenparen zich al voldoende lang in open toestand bevinden,

en dan nog een zekere populatie van DNA strengen die volledig in de “single strand” vorm vertoeven.

Dit veelvoud aan verschillende chemische omgevingen zorgt ervoor dat de methylsignalen verbreden

en uiteindelijke ook verdwijnen.

Bij hogere temperaturen komen de signalen terug duidelijk te voorschijn omdat eens voorbij de

smelttemperatuur van de duplex, het DNA bijna uitsluitend aanwezig is als single strand. Dit wil dus

zeggen dat er opnieuw een uniforme chemische omgeving is die alle methylgroepen ervaren,

overeenkomstig met een uniforme (hogere) chemische verschuiving dan het geval is in de DNA

duplex.

Het midden van deze curven wordt dus ook verwacht zich rond de smelttemperatuur (Tm), bepaald

via UV‐VIS, te situeren. Op het eerste zicht is dit rond de 50°C, de temperatuur waarbij de

iminoprotonen van deze duplex ook verdwijnen. Dit is dus een vrij goede overeenkomst met de UV‐

VIS bepaalde Tm (45,2°C). Er kan dus wel een zekere analogie worden gemaakt tussen de observaties

verkregen via NMR en die van de met UV‐VIS bepaalde smeltpunten.

Dit bewijst ook dat er naast het belang van chemische uitwisseling bij het verdwijnen van de

iminoprotonen ook een zekere bijdrage afkomstig is door de overgang van duplex naar simplex DNA.

Deze metingen werden, in de context van deze thesis, niet uitgevoerd op alle duplexen maar het zou

interessant zijn om dit in een later stadium wel door te voeren om vervolgens te controleren in

hoeverre er overeenkomsten zijn tussen de via UV‐VIS bepaalde Tm en de “via NMR bepaalde” Tm.

58

4.5G5C244.5.1 Chemischeverschuivinginfunctievantemperatuur

In deze sequentie wordt er een extra GC‐basenpaar geïntroduceerd, ter vervanging van een AT

basenpaar, op een zo dicht mogelijke positie bij de T‐T mismatch.

Deze sequentie wordt gekenmerkt door een behoorlijke resolutie bij lagere temperaturen , maar

deze gaat vrij snel verloren naarmate de temperatuur toeneemt. Ook valt het op dat het gebied van

de thymines wordt gekenmerkt door een sterke overlap, daar waar bij andere sequenties deze

doorgaans toch duidelijk te volgen zijn over het volledige temperatuursgebied. Ook valt het op dat de

signalen van G5 en G9 vrij snel verdwijnen onder een gezamelijk breed signaal. De verminderde

resolutie op zichzelf is eigenlijk al voldoende om deze sequentie te beschouwen als minder ideaal op

het vlak van NMR.

De smelttemperatuur van deze duplex ligt iets hoger dan het geval is bij de wiltype: 52,1°C versus

48,6°C. Dit valt te verwachten aangezien een AT‐basenpaar hier is vervangen door een GC, die door

een extra waterstofbrug ook extra stabilisatie met zich meebrengt.

5°C

15°C

25°C

35°C

45°C

55°C

60°C

T7 T6 G5 T18

T27

G16 G19G9

G12+G26 G25

TT(1) TT(2)


Figuur 4.20 Overzicht temperatuurstudie iminoprotonen G5C24


59

De temperatuurscoëfficiënten zijn opgenomen in Tabel 4.3 terwijl de vergelijking met de wild type

wat betreft temperatuursgedrag teruggevonden

wordt in figuur 4.22 en 4.23.

In tegenstelling tot C9G20 is hier wel een vrij

goede overeenkomst wat betreft gedrag met de

wild type. Bij figuur 4.20 is de richtingscoëfficiënt

van de trendlijn afgerond gelijk aan 1, al toont de

correlatiecoëfficient dat er een aantal afwijkingen

zijn. Zo verschillen vooral T7, T27 duidelijk van

mekaar. Anderzijds vertoont het aangepaste

basenpaar (G5C24) ook een duidelijke afwijking.

Dit laatste is verwacht gezien het een totaal ander

basenpaar betreft ten opzichte van de wild type.

De mismatchprotonen gedragen zich hier vrijwel

identiek als in de wild type: TT(1) sluit min of meer

aan bij de andere thymines terwijl TT(2) weer duidelijk de laagste temperatuurscoëfficiënt heeft van

alle beschouwde iminoprotonen.

Figuur 4.22 toont een analoog beeld: er is een vrij goede overeenkomst tussen de meeste

basenparen. De twee zaken die het meest in het oog springen zijn, ten eerste, het gedrag van de

temperatuurscoëfficiënten van de basen rond het aangepaste basenpaar. Het is duidelijk dat er hier

een afwijking is die ook iets verder draagt dan op de plaats van de modificatie alleen (zie T6 en T7).

10,000

10,500

11,000

11,500

12,000

12,500

13,000

13,500

14,000

0 10 20 30 40 50 60


Temperatuur (°C)

T18T7 & T27T18 T7 & T27T6G16G5G9G12 G26 G25G19TT(1)TT(2)

Base TC (ppb/K)

T6 ‐8,00 ± 0,10

T7, T27 ‐7,40 ± 0,12

T18 ‐5,60 ± 0,07

TT(1) ‐4,60 ± 0,17

G16 ‐3,40 ± 0,09

G5 ‐3,30 ± 0,29

G9 ‐2,90 ± 0,08 G26, G12,

G25 ‐2,70 ± 0,11

G19 ‐2,40 ± 0,05

TT(2) ‐1,10 ± 0,09

Tabel 4.3 Temperatuurscoëfficiënten G5C24

Figuur 4.21 Chemische verschuiving in functie van de temperatuur voor G5C24

60

Ten tweede zit er ook een kleine afwijking ter hoogte van de T‐T mismatch en aan de uiteinden van

de sequentie (T27, G12 en G16) .


Op het vlak van de maximale waarneembare temperatuur zijn er geen al te grote verassingen te

bespeuren. Over het algemeen is het gedrag hetzelfde als het geval was bij de wild type. Twee zaken

die toch min of meer in het oog springen zijn enerzijds het feit dat de modificatie zelf geen extra

stabilisatie ondervindt ondanks de extra waterstofbrug. Anderzijds lijkt de rechtertak van de

T6

G12

G16

G19

G25

G26

G9

T18

G5

T27 T7

TT(1)

TT(2) TC(G5C24) = 1,00TC(wt) + 0,66R² = 0,5769

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7

Temperatuurscoëfficiën

t G5C24 (ppb/K)


T27 G26 G25

G5

T6T7

TT(1)TT(2)

G9G19 T18

G12 G16

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Verhouding TC


Figuur 4.22 Vergelijking temperatuurscoëfficiënten G5C24 met wild type

Figuur 4.23 Verhouding temperatuurscoëfficiënten wild type/ G5C24

61

sequentie iets minder stabiel te zijn dan het geval is bij de wild type maar echt veel verschil is er niet

te zien.

Figuur 4.24 Grafische weergave van de maximale waarneembare temperatuur voor G5C24

Een analyse van T2* is niet uitgevoerd gezien de resolutie van de verschillende signalen over het

volledige temperatuursbereik te laag is om een bruikbare analyse door te voeren. Bij de

temperatuurstudie zelf is er echter geen bijzonder gedrag op te merken dus kan er verwacht worden

dat er weinig extra info zou kunnen toegevoegd worden.

4.6C2G274.6.1 Chemischeverschuivinginfunctievantemperatuur

In deze set van aanpassingen in de sequentie wordt een AT‐basenpaar vervangen voor een CG‐

basenpaar. In essentie is het “type” modificatie dus dezelfde als de voorgaande sequentie, enkel is

dit op een grotere afstand van de mismatch. Er kan dus verwacht worden dat de impact van deze

aanpassing eerder beperkt zal zijn aangezien ze zich meer aan de uiteinden van de sequentie bevindt.

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

5°C

15°C

25°C

35°C

45°C

55°C

60°C

G9 G12

T18G27

T7

T6T24

G16

G26 G25

TT(1) TT(2) G19


Figuur 4.26 Overzicht temperatuurstudie iminoprotonen C2G27


62

Uit het overzicht blijkt dat deze sequentie ook bij 25°C gekenmerkt wordt door een vrij goede

resolutie, er zijn namelijk dertien signalen zichtbaar. Enkel G19 en G25 hebben last van enige

overlap. De introductie van een extra GC‐basenpaar zorgt er wel voor dat de resolutie in de regio van

de guanines iets minder ideaal is ten opzichte van de wildtype. De thymines kennen een bijna

identiek verloop in functie van de temperatuur als bij de wild type.

De smelttemperatuur van deze sequentie ligt ook iets hoger, en bedraagt 53,2°C. Dit valt opnieuw te

verwachten door de introductie van een nieuwe GC‐eenheid in plaats van de AT.

Figuur 4.27 Chemische verschuiving in functie van de temperatuur voor C2G27

De temperatuurscoëfficiënten zijn opgenomen in Tabel 4.4

terwijl de vergelijking met de wild type wat betreft

temperatuursgedrag teruggevonden wordt in figuur 4.28 en

4.29. Volgens figuur 4.28 zijn er geen al te grote afwijkingen

terug te vinden, buiten T7 en het aangepaste basenpaar zelf

(G27). Wanneer er echter wordt gekeken naar figuur 4.29

kunnen er twee grote afwijkingen worden teruggevonden.

Een eerste afwijking, die ook binnen de verwachtingen valt, is

te situeren op en rond het aangepaste basenpaar. Het GC‐

basenpaar verschuift duidelijk minder snel in functie van de

temperatuur in vergelijking met de oorspronkelijke AT‐

eenheid.

9,5

10,5

11,5

12,5

13,5

14,5

0 10 20 30 40 50 60


Temperatuur (°C)

T18T7T6T24G27G26G16G9G12G25G19TTTT

Base TC (ppb/K)

T7 ‐7,40 ± 0,17

T24 ‐6,40 ± 0,06

T6 ‐6,10 ± 0,08

T18 ‐5,50 ± 0,06

TT(1) ‐4,50 ± 0,18

G27 ‐3,50 ± 0,15

G26 ‐3,20 ± 0,08

G9 ‐3,10 ± 0,10

G25 ‐3,10 ± 0,04

G16 ‐3,20 ± 0,06

G19 ‐2,30 ± 0,08

G12 ‐2,3 ± 0,05

TT(2) ‐0,2 ± 0,04

Tabel 4.4 Temperatuurscoëfficiënten C2G27

63

De aangebrachte aanpassing heeft duidelijk ook zijn gevolgen op het gedrag van de directe naburen.

Voorts neemt het effect af naarmate men zich verder in de sequentie begeeft, en dit is ook wat er

verwacht wordt. Een tweede afwijking die duidelijk zichtbaar is in de figuur is de afwijking van TT(2).

Deze lijkt plots veel minder op te schuiven naar lagere ppm‐waarden dan het geval is bij de wild type

naarmate de temperatuur toeneemt. Bij nadere inspectie blijkt dit verschil in

temperatuurscoëfficiënt in absolute waarde niet al te groot te zijn: ‐0,7 ppb/K voor de wild type in

vergelijking met ‐0,2 ppb/K voor C2G27. Het feit dat dit al kleinere waarden zijn, zorgt ervoor dat de

verhouding van beide waarden een grotere verandering inhoudt dan dat deze eigenlijk is.

T6

G12 G16

G19

G25G26

G9

T18T24

G27

T7

TT(1)

TT(2)

TC(C2G27) = 1,2TC(wt) + 0,24R² = 0,7942

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7


t C2G27 (ppb/K)


G27

G26 G25T24 T6

T7 TT(1)

TT(2)

G9 G19 T18G12

G16

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Verhouding TC


Figuur 4.28 Vergelijking temperatuurscoëfficiënten C2G27 met wild type

Figuur 4.29 Verhouding temperatuurscoëfficiënten wild type/ C2G27

64


Gezien de directe omgeving rond het aangepast basenpaar niet te volgen is over het volledige

bereik, is het aan te raden enkel een vergelijking te maken met de regio’s de wel goed te volgen zijn.

In die context valt het op dat er weinig verschil is met de wild type. G9 lijkt iets vroeger te verdwijnen

dan oorspronkelijk het geval is, maar andere verschillen nauwelijks. Dit is ook vrij logisch gezien de

aanpassing zich bijna uiterst links bevindt in de sequentie en dus de meer centrale basenparen,

samen met die in de rechtertak, hiervan geen invloed ondervinden. Zoals ook te zien is in de

vergelijking van de temperatuurscoëfficiënten, gedraagt deze sequentie zich dus sterk analoog aan

de wild type maar zijn de basenparen uiterst links (G27 en G26) minder ver te volgen.


0,003

0,008

0,013

0,018

0,023

0,028

0 10 20 30 40 50 60

T 2*tijd (s)

Temperatuur (°C)

T18

T6

T24

TT(1)

TT(2)

Figuur 4.31 T2* in functie van de temperatuur voor een selectie van signalen

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

Figuur 4.30 Grafische weergave van de maximale waarneembare temperatuur voor C2G27 (basenparen omlijnd in het zwart zijn niet te volgen over het volledige temperatuursbereik)

65

Ook hier wordt weer bevestigd wat reeds kan worden geobserveerd in de voorgaande figuren: deze

sequentie gedraagt zich voor de selectie van gevolgde signalen nagenoeg identiek aan de wild type.

De mate waarin chemische uitwisseling met het solvent gaat ingrijpen op de verschillende, zij het

centraal gelegen, signalen wordt dus niet beïnvloed door de aanpassing van het basenpaar. Het zou

interessant geweest zijn om te kunnen zien hoe het aangepaste basenpaar zelf verschilt in dit gedrag

maar door het feit dat ze niet te volgen is over het volledige temperatuursgebied (het signaal is

slechts te volgen van 5 tot 30°C), kan er geen betrouwbare conclusie worden getrokken.

4.7G2C274.7.1 Chemischeverschuivinginfunctievantemperatuur

Deze laatste alternatieve sequentie die onderzocht werd is van hetzelfde genre als de voorgaande:

het AT basenpaar is vervangen door een GC, m.a.w. het betreft hier een “base‐flip” van het CG‐

basenpaar in de voorgaande sequentie.

De smelttemperatuur ligt ook iets hoger dan die van de wild type, zo’n 51°C. Dit is dezelfde

observatie als het geval is bij de voorgaande sequentie. Dit is dus opnieuw een bevestiging van de

extra stabilisatie door de introductie van een extra waterstofbrug.

Wat opvalt wanneer er wordt gekeken naar het algemene uitzicht van de spectra is dat, ondanks het

feit dat er gewoon een basenpaar wordt omgedraaid, er een vrij groot verschil is waar te nemen.

Deze sequentie blijkt veel hinder te ondervinden van signaaloverlap in de regio van de guanines. De

thymines zijn, zoals in de meeste gevallen, goed te volgen over het volledige temperatuursbereik.

De signalen blijven duidelijk zichtbaar over nagenoeg het volledige temperatuursbereik, maar zijn

door de overlap van de guanines niet goed te onderscheiden. Dit laatste maakt een volledige analyse

van de duplex moeilijk. In dit opzicht is deze sequentie dus ook minder ideaal voor NMR onderzoek

dan de wild type.


5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

Figuur 4.32 Grafische weergave maximale T2* C2G27


66

Figuur 4.35 Chemische verschuiving in functie van de temperatuur voor G2C27

9

10

11

12

13

14

0 10 20 30 40 50 60


Temperatuur (°C)

T18T7T6T24G16G26 G9G12G25TT(1)TT(2)G19

5°C

15°C

25°C

35°C

45°C

55°C

60°C

Figuur 4.34 Overzicht temperatuurstudie iminoprotonen G2C27

G19

T18

G9

T7

T6 T24

G16

G26

G25

TT(1) TT(2)

G12

67

De temperatuurscoëfficiënten zijn opgenomen in Tabel

4.5 terwijl de vergelijking met de wild type wat betreft

temperatuursgedrag teruggevonden wordt in figuur 4.36

en 4.37. Opnieuw wordt er weinig verschil waargenomen,

gezien de richtingscoëfficiënt van de trendlijn nagenoeg

gelijk is aan 1. Enkel T7, G9 en TT(2) lijken enige afwijking

te vertonen. Uit voorgaande analyses blijkt echter dat

deze basenparen wel altijd in een kleine hoeveelheid

afwijken in de vergelijkingen. Wat echter wel opmerkelijk

is, is dat het aangepast basenpaar zelf niet zichtbaar is in

de spectra en dus ook niet opgenomen is in deze analyse.

Het iminosignaal van dit basenpaar wordt dus ook

verondersteld continu in het regime van snelle

uitwisseling op de NMR tijdschaal te vertoeven, net als

het geval is met de twee uiteinden van alle sequenties.

In figuur 4.37 is het duidelijk dat de aanpassing van het basenpaar een invloed heeft op zijn directe

naburen en dat deze afneemt naarmate men verder kijkt in de sequentie. Zoals ook eerder vermeld,

vertoont TT(2) ook enige wijziging in gedrag. Dit hangt samen met het bovenliggende basenpaar, zij

het dat dit in iets mindere mate afwijkt dan TT(2). De schijnbare wijziging in het gedrag van TT(2)

heeft hoogstwaarschijnlijk dezelfde reden als bij de voorgaande sequentie. Door de kleine

temperatuurscoëfficiënt in TT(2) worden verschillen uitvergroot. Bij G9 heeft het afwijkende gedrag

waarschijnlijk meer te maken met het feit dat deze overlapt met G26, waardoor de analyse zelf niet

altijd even nauwkeurig kan verlopen.

Tabel 4.5 Temperatuurscoëfficiënten G2C27

Base TC (ppb/K)

T7 ‐7,76 ± 0,15

T24 ‐6,54 ± 0,10

T6 ‐6,36 ± 0,05

T18 ‐5,74 ± 0,08

TT(1) ‐4,35 ± 0,24

G16 ‐4,01 ± 0,23

G25 ‐3,30 ± 0,15

G12 ‐2,73 ± 0,10

G26, G9 2,49 ± 0,13

G19 ‐2,39 ± 0,09

TT(2) ‐0,47 ± 0,06

T6

G12

G16

G19G25

G26

G9

T18

T24T7

TT(1)

TT(2)

TC(G2C27) = 1,06TC(wt) + 0,35R² = 0,8136

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0


t G2C27 (ppb/K)


Figuur 4.36 Vergelijking temperatuurscoëfficiënten G2C27 met wild type

68


Figuur 4.38 Grafische weergave van de maximale waarneembare temperatuur voor G2C27 (basenparen omlijnd in het zwart zijn niet te volgen over het volledige temperatuursbereik)

De basenparen die in deze figuur staan aangeduid, zijn te volgen over het volledige

temperatuursbereik, maar vallen wel altijd deels samen met een ander signaal. Zo overlappen G9 en

G26 bij nagenoeg alle temperaturen, terwijl G19 en G25 ook een overlap ondervinden. Hiermee

rekening houdend lijkt de rechtertak van deze sequentie niet erg veel te verschillen met de wild type.

De linkertak daarentegen lijkt iets stabieler te zijn: zelfs wanneer de overlappende signalen niet

worden meegerekend, vertoont T7 nog altijd een iets stabieler gedrag (45°C in wild type versus 50°C

hier). Verder zijn er echter geen grote veranderingen te bemerken, wat ook weer als verwacht

gedrag kan worden beschouwd gezien de aard en plaats van de aanpassing.

G26 G25 T24 T6

T7

TT(1)

TT(2)G9

G19 T18G12 G16

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Verhouding TC


Figuur 4.37 Verhouding temperatuurscoëfficiënten wild type/ G2C27

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

69


Figuur 4.39 T2* in functie van de temperatuur voor een selectie van signalen

Figuur 4.40 Grafische weergave maximale T2* G2C27

Voor de selectie van signalen die worden gevolgd voor het bepalen van de temperatuur waarbij hun

T2* maximaal wordt, is er geen verschil met de overeenkomstige signalen van de wild type.

Aangezien het hier opnieuw vrij centrale basenparen betreft die op voldoende afstand liggen van de

aanpassing in de sequentie is dit ook vrij normaal gedrag dat in de lijn der verwachtingen ligt.

Als algemene conclusie voor het maximum in T2*worden per gevolgd signaal voor alle sequenties de

verlopen van de T2* in functie van de temperatuur nog eens uitgezet om na te gaan of het algemeen

profiel van de curven overeenkomt (niet getoond). Dit blijkt inderdaad het geval en het is ook

duidelijk dat alle signalen van de C9G20 sequentie wel degelijk een verschuiving naar lagere

temperaturen vertonen. Dit bevestigd dus nog eens de conclusie dat er bij lagere temperaturen de

basenparen al voldoende in de open toestand vertoeven om snelle uitwisseling mogelijk te maken.

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0 10 20 30 40 50 60

T 2*‐tijd (s)

Temperatuur (°C)

T18

T6

T24

TT(1)

TT(2)

5’

3’

3’

5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15

70

De andere sequenties worden gekenmerkt door een bijna volledig uniform verloop in T2*. Dit leidt

dan tot de conclusie dat de chemische uitwisseling bijna altijd bij dezelfde temperatuur ingrijpt.

4.7.4 VergelijkingC2G27metG2C27

Net zoals het interessant is om alle alternatieve sequenties te vergelijken met de wild type is het in

dit geval ook nuttig om een vergelijking te maken tussen de twee laatst besproken duplexen.

Aangezien deze twee enkel verschillen op het vlak van de positionering van het 2e basenpaar, zullen

enige wijzigingen in het gedrag gevolg zijn van de manier waarop de verschillende basen met elkaar

interageren.

Aangezien bij G2C27 het aangepaste basenpaar zelf niet te volgen is, wordt deze weggelaten uit de

vergelijking.

Zoals duidelijk blijkt uit zowel figuur 4.41 en 4.42 zijn de verschillen tussen beide sequenties miniem.

Zoals al meermaals is gebleken, blijkt TT(2) weer een afwijking te vertonen die groter lijkt dan ze

eigenlijk is: ‐0,2 ppb/K voor C2G27 en ‐0,47 voor G2C27. Daarnaast lijkt er ook enig verschil te zijn in

gedrag aan de rechteruiteinden van de sequenties, een verklaring daarvoor is niet direct duidelijk.

Wat wel binnen de verwachtingen valt is het afwijkend gedrag van G26 aangezien deze zich net naast

de site van modificatie bevindt en dus een andere π‐π stacking interactie ondervindt al naargelang de

oriëntatie van zijn directe nabuur. Eens voorbij G26 lijkt de impact van het gewisselde GC‐basenpaar

miniem.

T24

T6

T18

TT(1)

G16

G25

G12

G26G9

G19

TT(2) TC(G2C27) = 0,96TC(C2G27) + 0,03R² = 0,9427

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0Temperatuurscoëfficiën

t G2C27 (ppb/K)

Temperatuurscoëfficiënt C2G27 (ppb/K)

Figuur 4.41 Vergelijking temperatuurscoëfficiënten G2C27 met C2G27

71

4.8Conclusie

Het mag duidelijk zijn dat aan de hand van de temperatuurstudies er wel degelijk een aanzienlijke

hoeveelheid van informatie over het gedrag en stabiliteit van de verschillende sequenties naar voor

is gekomen.

Zo kan aan de hand van de temperatuurscoëfficiënten voor elke basenpaar individueel een mooi

beeld geschetst worden van zijn afhankelijkheid van de temperatuur. Bij elke sequentie vertonen de

temperatuurscoëfficiënten een negatief teken wat er op duidt dat de chemische uitwisseling in

functie van de temperatuur toeneemt naarmate de temperatuur stijgt. Er is dus sprake van een

evolutie van trage uitwisseling naar een regime van steeds snellere uitwisseling op de NMR tijdschaal

met een stijgende temperatuur. Evenwel verdwijnen de signalen overeenkomstig met de

iminoprotonen vooraleer de situatie van coalescentie bereikt wordt, gezien het relatieve

populatieverschil voor protonen op een iminosite versus het solvent.

Verder kan bij alle sequenties een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen de thymines en

guanines: het verschil in stabiliteit ten gevolgen van het verschillend aantal waterstofbruggen wordt

ook gereflecteerd in grootte van de temperatuurscoëfficiënten. De iminoprotonen van de mismatch

vertonen meer een eigen karakter dat bovendien, zoals blijkt uit de observaties bij C9G20 ten

opzichte van de andere sequenties, afhankelijk kan zijn van de π‐π stacking interactie met de

naburige basenparen. Verder onderzoek naar de oorsprong van dit opvallend gedrag is dan ook

aangeraden.

Ten slotte leveren de temperatuurscoëfficiënten ook een handig manier om het gedrag van de

basenparen in functie van de temperatuur te vergelijken tussen de verschillende sequenties. Zoals

G26

G25T24 T6 T7 TT(1)

TT(2)

G9G19 T18

G12

G16

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Verhouding TC


Figuur 4.42 Verhouding temperatuurscoëfficiënten G2C27/C2G27

72

blijkt uit de resultaten, kan de grootste verandering in gedrag worden teruggevonden op de plaats

van het aangepaste basenpaar en zijn onmiddellijke omgeving.

Parallel met deze evolutie van trage uitwisseling naar snellere uitwisseling, zal ook de

duplexstructuur meer en meer verloren gaan omdat de opeenvolgende basenparen steeds meer tijd

doorbrengen in open vorm en dus ook steeds meer beschikbaar zijn voor chemische uitwisseling. Het

punt waarop deze chemische uitwisseling overheersend wordt op de andere processen, kan in beeld

gebracht worden door het volgen van de T2* in functie van de temperatuur voor een bepaalde set

van goed geresolveerde signalen over het volledige temperatuursbereik. Deze observaties kunnen

bovendien in overeenstemming worden gebracht met de opgenomen smelttemperaturen. Zo kan in

het geval van C9G20 een duidelijke parallel worden getrokken tussen de lagere smelttemperatuur en

de duidelijke shift van het maximum in T2* naar een lagere temperatuur. Dit impliceert dat

uitwisseling hier ook vroeger zal optreden wat leidt tot de conclusie dat dit een minder stabiele

sequentie is.

Ten slotte, wanneer alle factoren in rekening worden gebracht, blijkt de wild type over de ideale

balans tussen zowel stabiliteit als toekenbaarheid over het volledige temperatuursinterval te

beschikken. Dit is dan ook de aan te raden sequentie bij het verder ontwikkelen van de voorgestelde

serine protease mimic.

4.9Referenties

1. Doctoraatsthesis Dr. Davy Sinnaeve, NMRSTR 2. Nonin, S., J.L. Leroy, and M. Gueron, Terminal Base‐Pairs Of Oligonucleotides ‐ Imino Proton‐

Exchange And Fraying. Biochemistry, 1995. 34(33): p. 10652‐10659. 3. Englander, S.W. and N.R. Kallenbach, Hydrogen‐Exchange And Structural Dynamics Of

Proteins And Nucleic Acids. Quarterly Reviews of Biophysics, 1983. 16(4): p. 521‐655. 4. Doctoraatsthesis van M. Boccongelli, ULB 5. Gueron, M. and J.L. Leroy, Studies of base pair kinetics by NMR measurement of proton

exchange, in Nuclear Magnetic Resonance and Nucleic Acids. 1995, Academic Press Inc: San Diego. p. 383‐413.

6. Bhattacharya, P.K., J. Cha, and J.K. Barton, H‐1 NMR determination of base‐pair lifetimes in oligonucleotides containing single base mismatches. Nucleic Acids Research, 2002. 30(21): p. 4740‐4750.

7. Kochoyan, M., J.L. Leroy, and M. Gueron, Proton‐Exchange And Base‐Pair Lifetimes In A Deoxy‐Duplex Containing A Purine‐Pyrimidine Step And In The Duplex Of Inverse Sequence. Journal of Molecular Biology, 1987. 196(3): p. 599‐609.

8. Gervais, V., et al., Solution Structure Of 2 Mismatches A‐Center‐DOT‐A AND T‐Center‐DOT‐T In The K‐RAS Gene Context By Nuclear‐Magnetic‐Resonance And Molecular‐Dynamics. European Journal of Biochemistry, 1995. 228(2): p. 279‐290.

9. Kemmink, J., et al., H‐1‐NMR Study Of The Exchangeable Protons Of The Duplex D(GCGTTGCG).D(CGCAACGC) Containing A Thymine Photodimer. Nucleic Acids Research, 1987. 15(11): p. 4645‐4653.

73

Hoofdstuk5:NMRonderhetvriespuntmetcryorestrictie

5.1Watiscryorestrictie?

Cryorestrictie is een fenomeen waarbij een vloeistof niet bevriest bij temperaturen (en druk) waarbij

dit normaal gezien wel het geval zou zijn ( voor water bij 0°C en lager) door een fysieke inperking van

de afmetingen van het staal. Anders uitgedrukt: het vriespunt van een vloeistof daalt proportioneel

met het beschikbare volume [1]. In dit hoofdstuk wordt de mogelijkheid nagegaan om via

cryorestrictie in 1mm capillairen metingen bij T<0°C uit te voeren en het gedrag van de uitwisselbare

protonen ook bij deze lage temperaturen te bestuderen. Hierbij zal gebruik gemaakt worden van een

1mm TXI probe. In eerste instantie worden deze metingen uitgevoerd op sucrose, analoog aan een

reeds eerder beschreven studie [1]. Vervolgens wordt de techniek van deze metingen ook toegepast

op enkele van de beschikbare DNA duplexen.

Het vertrekpunt van dit hoofdstuk is de vraag: “wat valt er te winnen met het toepassen van

cryorestrictie op de duplexstalen?” In hoofdstuk 4 is reeds gebleken dat de evolutie van T2* in functie

van de temperatuur voor de gevolgde signalen recht evenredig is, met andere woorden, er is een

toename in T2* naarmate de temperatuur toeneemt. Dit verwacht verloop blijft gehandhaafd totdat

de exchange bijdrage de bovenhand krijgt en er een plotse daling is in T2*. In eerste instantie lijkt het

meten bij lagere temperaturen voor bovenvermelde signalen weinig nut te hebben, immers T2* daalt

naarmate de temperatuur afneemt (zie ook 5.2). Wat echter niet geweten is, is of dat er mogelijk

meer signalen zichtbaar zouden zijn wanneer er wordt gemeten bij lagere temperaturen.

5.2Metingenbijlagetemperatuur(<0°C)

De magnetisatie, die mede bepalend is voor de intensiteit van het gemeten signaal, wordt gegeven

door de wet van Langevin‐Curie (1). Deze formule geeft aan dat de bulkmagnetisatie op

verschillende manieren kan worden beïnvloed. Een triviale manier is om het totaal aantal nuclei ,

en dus de concentratie van een staal te verhogen. De mate waarin men de concentratie kan

verhogen is echter afhankelijk van de beschikbare hoeveelheid product, en is dus vaak ook vrij

beperkt. Bovendien dient men rekening te houden met het optreden van mogelijke concentratie‐

afhankelijke fenomenen, die de mate waarin de concentratie kan worden verhoogd mee zullen

bepalen.

(1)

Met N, het aantal nuclei, γ de gyromagnetische constante, verhouding constante van Planck en 2π, kB constante van Boltzmann, T de temperatuur en B0 de uitwendige magneetveldsterkte. De reden

om te meten bij lage temperaturen heeft, naast het omgekeerd evenredige verband met T in (1), ook

te maken met de aard van de iminoprotonen die geobserveerd worden in de 1D‐spectra: ze zijn

74

uitwisselbaar met het solvent water. Zoals ook reeds eerder werd uiteengezet in hoofdstuk 4,

kunnen er drie verschillende regimes worden onderscheiden al naargelang de verhouding van de

uitwisselingsnelheidsconstante kex en het frequentieverschil ∆ van de iminoprotonen tussen hun

twee chemische omgevingen. Dit maakt meteen ook duidelijk waarom het interessant kan zijn om

naar een situatie van trage uitwisseling te streven, bv. door de temperatuur te verlagen. Omdat

beide omgevingen apart waarneembaar zijn, kunnen ze ook bestudeerd worden en

structuurinformatie leveren. Daarnaast is het in principe ook mogelijk om uit de studie van de

invloed van de uitwisseling op de lijnbreedte ook kinetische informatie over het uitwisselingsproces

te verkrijgen.

Een laatste factor waarmee rekening moet worden gehouden, is de impact van de verandering van

de rotatiecorrelatietijd τC in functie van de temperatuur. Dit is vervat in formule van Debye (2).

(2)

Kleine moleculen worden gekenmerkt door een beduidend kleinere τC dan grote (bio)moleculen (a =

radius van de molecule, verondersteld sferische vorm). Dit heeft zijn gevolgen voor de transversale

relaxatietijdsconstante T2*: hoe groter de rotatiecorrelatietijd, hoe efficiënter de transversale

relaxatie en dus bijgevolg ook hoe groter de lijnbreedte op halve hoogte (FWHM) van de

waargenomen signalen [2]. De vergelijking toont dat naarmate de temperatuur daalt, de

rotatiecorrelatietijd en dus de transversale relaxatiesnelheid toeneemt. Dit wordt verder versterkt

doordat de viscositeit van de oplossing (η) toeneemt met dalende temperatuur. We kunnen dus

besluiten dat het effect van de temperatuur op de lijnbreedte van de signalen van labiele resonanties

complex kan zijn. De dalende temperatuur leidt tot lijnverbreding, wat de resolutie en de signaal‐ruis

verhouding negatief beïnvloedt. Anderzijds zal bij een lagere temperatuur ook de

uitwisselingssnelheid van de labiele protonen met het solvent vertragen, waardoor de signalen

kunnen opscherpen en signalen die bij hogere temperatuur niet zichtbaar waren ook kunnen worden

teruggevonden, naarmate van intermediair naar trage uitiwsseling overgegaan wordt. Dit beïnvloedt

de resolutie en signaal‐ruis verhouding in positieve zin. Het uiteindelijk resultaat zal afhangen van de

balans tussen beide tegengesteld werkende mechanismen. Door cryorestrictie toe te passen willen

we nagaan in welke mate de lijnbreedte van de imino signalen geoptimaliseerd kan worden in een

temperatuursgebied onder het vriespunt van water.

5.3Vereistencryorestrictieenstaalvoorbereiding

Cryorestrictie treedt, zoals eerder vermeld, enkel op wanneer het

volume van een staal wordt beperkt. De 1mm TXI probe, die

beschikbaar is op de 700MHz spectrometer, leent zich hier

uitstekend toe, aangezien de stalen die met deze probe kunnen

worden gemeten bestaan uit een capillair met een diameter van

slechts 1mm, met een staalinhoud van 10 µl.

Figuur 5.1 TXI 1mm probe (Afbeelding van website Bruker)

75

Wanneer er wordt gewerkt met de 1mm TXI probe, in plaats van de 5mm TXI probe, dient men

rekening te houden met de verschillende concentratie‐ en massagevoeligheid van beide probes.

Wanneer er wordt gewerkt bij een gelijke concentratie, zal men op de 1mm probe door het kleiner

staalvolume, ook beschikken over een kleiner aantal nuclei (aantal mol). De reductie van de diameter

van 5 mm naar 1 mm bij eenzelfde hoogte van het meetvolume, veroorzaakt daarom een reductie in

nuclei met een factor 25. Wanneer men echter de performantie van een 5mm en 1mm probe

vergelijkt voor eenzelfde hoeveelheid staal (aantal mol), beschikt de 1mm probeintrensiek over een

vijfvoudig hogere gevoeligheid omdat de gevoeligheid evenredig is met de inverse van de diameter

van de detectiespoel. Wanneer deze twee effecten worden samengeteld, zal men op de 1mm, voor

een staal met een gelijke concentratie, een vermindering in signaal‐ruisverhouding hebben met een

factor 5/25 of ‘slechts’ 5 ten opzichte van de 5mm probe. Dit kan uiteraard opgevangen worden door

een hogere concentratie te gebruiken bij de 1mm probe tov de 5mm probe.

Voor de metingen op sucrose werden drie verschillende stalen voorbereid en onderworpen aan een

temperatuurstudie:

1. 10mM Sucrose in 100mM NaCl en 0,05mM EDTA [S1]

2. 10mM Sucrose in H2O/D2O (90/10) [S2]

3. 10mM Sucrose in H2O/D2O (90/10) + 500mM NaCl [S3]

Elke oplossing werd voorzien van 0,05 mM DSS en 0,01mM NaN3. De staaloplossing die hier wordt

gebruikt voor het eerste staal is dezelfde als eerder vermeld in hoofdstuk 2. Voor de bereiding van

elk van de sucrosestalen werd telkens 6,85 mg sucrose opgelost in 2ml van het vereiste solvent om

vervolgens daaruit een volume van 10µl te gebruiken voor het vullen van een 1mm capillair.

De reeds eerder gebruikte 5mm duplexstalen moeten voor een omschakeling naar de 1mm probe in

een eerste stap worden gevriesdroogd om daarna te worden heropgelost in een kleiner volume van

doorgaans 50µl van de staaloplossing. Dit heeft tot gevolg dat er een hogere concentratie van

zowel duplex als zouten zal aanwezig zijn in deze kleinere volumes. Deze verandering aan

zoutconcentratie kan leiden tot zoutconcentratieafhankelijke veranderingen in de spectra. De meest

logische oplossing van dit probleem is een nieuwe dialysestap, vooraleer de stalen te vriesdrogen,

bestaande uit drie opeenvolgende dialyses, elk over een periode van 4 uur in milliQ H2O, waarbij alle

aanwezige zouten worden verwijderd. Hierbij wordt opnieuw gebruik gemaakt van een filter met

MWCO van 1kDa om zeker te zijn dat er geen staalmateriaal verloren zou gaan. Van de nieuwe

oplossing wordt uiteindelijk 10µl gebruikt voor het vullen van een 1mm NMR buis. Hierdoor werd er

een concentratie bereikt gelegen tussen de 5 en 10mM.

Voor de metingen zelf werd vertrokken van 4°C om vervolgens stapsgewijs de temperatuur te laten

dalen. Hierbij wordt er gelet op de kwaliteit van het lock‐signaal waarbij een plotse afname zou

kunnen wijzen op het bevriezen van het staal, waardoor het uitvoeren van metingen bij deze

temperatuur onmogelijk wordt. Bij de overschakeling naar de verschillende temperaturen werd er

gebruik gemaakt van een N2‐luchtstroom met een debiet van 1335l/h om het staal voldoende te

kunnen afkoelen. Verder werd er tussen het instellen van de temperaturen een wachtperiode van 15

à 20 minuten gerespecteerd om de temperatuur van het staal voldoende tot evenwicht te laten

komen en om zeker te zijn dat de ingestelde temperatuur ook daadwerkelijk de gewenste

temperatuur is.

76

5.4Resultatentemperatuurstudies5.4.1 Sucrose

5.4.1.110mMSucroseinduplexstaaloplossing[S1]

Zoals reeds werd vermeld in de inleiding van dit hoofdstuk, zijn deze metingen eerst uitgevoerd op

het testsysteem sucrose.

Algemeen ziet het 1D 1H spectrum van sucrose er als volgt uit, met de verschillende regio’s van

interesse aangeduid op de figuur.

Figuur 5.2 1D 1H spectrum sucrose 10mM in staaloplossing (4°C)

De hydroxylprotonen zijn al zichtbaar bij 4°C.

Deze signalen zullen echter verder

opscherpen naarmate de temperatuur wordt

verlaagd. Een volledige toekenning van deze

signalen is mogelijk door het opmeten van

een COSY‐spectrum bij ‐10°C. De globale toe‐

kenning van de signalen uit het 1D proton

spectrum kan worden teruggevonden in

figuur 5.4. De volledige structuuranalyse van

de verschillende protonen en bijhorende

spectra kunnen terug worden gevonden in de

appendix (hoofdstuk 7).

Niet‐uitwisselbare protonen

Hydroxylprotonen

Anomeer proton DSS

O

HO

OH

OHHO

O

O

OH

HO

OH

OH

1

2

3

45

6

1'

2'

3'4'

5'6'

Figuur 5.3 Overzicht toekenning sucrose

77

Eenmaal duidelijk is welke signalen overeenkomen met welke protonen, kan de temperatuurstudie in

de staaloplossing [S1] worden overlopen. Aangezien de nadruk in deze metingen ligt op het

observeren van de uitwisselbare hydroxylprotonen wordt in de overzichten alleen nog de spectrale

regio van deze signalen getoond.

De laagst mogelijke temperatuur bij deze metingen was ‐13°C, hierna werd er een sterke daling in

het lock‐signaal waargenomen wat een indicatie kan zijn van het bevriezen van het staal.

Figuur 5.5: 1D 1H spectra gaande van 4°C t.e.m. ‐13°C (staaloplossing, 10mM)

6OH 1’OH 2OH

4, 3, 6’OH

3’OH 4’OH

‐10°C

‐8°C

‐4°C

0°C

4°C

‐13°C

‐12°C

‐11°C

Figuur 5.4 Toekenning uitwisselbare en niet‐uitwisselbare protonen(staaloplossing, ‐10°C )

1’

2 43

5, 6, 6’

5’4’

3’

78

Zoals eerder reeds vermeld neemt de intensiteit van de verschillende signalen duidelijk toe naarmate

de temperatuur verder daalt, samen met de het vertonen van kleinere lijnbreedtes wat verklaard kan

worden door een vertraging in de uitwisselingsnelheid met het solvent water. Bovendien kunnen de

signalen van hydroxylgroep 3’OH en 4, 3 en 6’OH die oorspronkelijk samenvallen steeds beter

onderscheiden worden van elkaar, m.a.w. ook de resolutie van de spectra gaat er op vooruit. Er blijkt

echter wel min of meer een bovengrens te zijn betreft de toename in signaalintensiteit: gaande van ‐

10°C tot ‐13°C zijn de veranderingen in intensiteit miniem en is het twijfelachtig of het nuttig is om te

proberen om de temperatuur nog verder te laten dalen.

Het is echter wel opmerkelijk dat de hydroxylsignalen reeds vrij duidelijk te voorschijn komen bij een

temperatuur van 4°C, terwijl in de literatuur vermeld wordt dat brede hydroxylsignalen in

geconcentreerde suikeroplossingen pas te zien zijn bij een temperatuur van ‐6°C [3]. Om na te gaan

of het aanwezige NaCl in de standaardoplossing (100mM) hier enige invloed zou kunnen hebben,

werden er nog twee nieuwe stalen met eenzelfde sucroseconcentratie voorbereid en gemeten (zie

ook paragraaf 5.3):

10 mM Sucrose in H2O/D2O (90/10) [S2]

10 mM Sucrose in H2O/D2O (90/10) + 500mM NaCl [S3]

5.4.1.2 10 mM Sucrose in H2O/D2O (90/10) [S2]

Dit staal werd op een identieke manier opgemeten aan het voorgaande staal en de resultaten van de

temperatuurstudie kunnen worden teruggevonden in figuur 5.6 waarbij opnieuw enkel de regio van

de hyroxylprotonen wordt getoond aangezien de overige signalen in het spectrum identiek zijn aan

het voorgaande staal.

Figuur 5.6 1D 1H spectra gaande van 4°C t.e.m. ‐16°C (H2O/D2O 90/10, 10mM)

‐12°C

‐8°C

‐4°C

0°C

4°C

‐14°C

‐16°C

79

Het is duidelijk dat hier weer dezelfde trend naar voor komt als het geval was bij de metingen in de

staaloplossingen: de hydroxylprotonen worden vrij snel en duidelijk zichtbaar, Bij overeenkomstige

temperaturen zijn de hydroxylresonanties er echter breder en minder intens dan het geval is bij S1.

Dit is bv. heel duidelijk het geval bij een temperatuur van 4°C. Dit impliceert dat de uitwisseling van

deze labiele protonen wordt beïnvloed door de aanwezigheid van NaCl.

In een poging na te gaan of het effect van het aanwezige NaCl concentratieafhankelijk is werd nog

een derde staal S3, met een hoge NaCl concentratie onderworpen aan een dergelijke

temperatuurstudie.

5.4.1.3 10 mM Sucrose in H2O/D2O (90/10) + 500mM NaCl [S3]

Dit staal werd opnieuw op een volledige analoge manier verwerkt aan de twee voorgaande stalen en

de resultaten van deze temperatuurstudie kunnen op hun beurt worden teruggevonden in figuur 5.7.

Er kan worden opgemerkt dat de resultaten gelijklopend zijn aan het eerste staal: reeds bij een

temperatuur van 4°C zijn de hydroxylprotonen vrij duidelijk zichtbaar en het verloop van de

signaalintensiteit en lijnbreedte in functie van de temperatuur is consistent met de andere stalen.

Er zijn hier echter twee verschillen die naar voor komen. Bij een temperatuur van ‐12°C wordt het

duidelijk dat het signaal overeenkomstig met hydroxylprotonen 4, 3 en 6’OH wel degelijk een

bijdrage kent van meerdere protonen: een tweede signaal wordt duidelijk zichtbaar. Dit lijkt ook het

geval te zijn bij het signaal van proton 6OH, echter komt dit niet overeen met de gegevens uit de

structuuranalyse: in het COSY‐spectrum is er slechts één enkele kruispiek bij dit signaal wat

suggereert dat er wel degelijk maar een bijdrage is van één enkel proton. Ook na controle aan de

hand van integratie (zie Hoofdstuk 7 Appendix) blijft de conclusie dezelfde. Deze schijnbare

opsplitsing wordt geïnterpreteerd als een gevolg van de scalaire koppeling van dit labiele proton die

er lichtjes doorkomt. Normaal hebben deze protonen geen scalaire koppeling omdat ze juist continu

worden uitgewisseld. In dit geval wordt de uitwisseling met het aanwezige water voldoende

vertraagd zodat de koppeling een kans krijgt om tot uiting te komen.

Figuur 5.7 1D 1H spectra bij 4, 0 en ‐12°C (H2O/D2O 90/10 + 500mM NaCl, 10mM)

‐12°C

0°C

4°C

80

Een tweede verschil met staal S2 en tegelijkertijd een overeenkomst met staal S1 is het feit dat de

signalen bij bv. 4°C bij staal 1 en staal 3 er duidelijker scherper doorkomen dan het geval is bij staal 2

waar sucrose zich gewoon een in waterige oplossing zonder zout bevindt. Het al dan niet aanwezig

zijn van het zout heeft dus wel degelijk een invloed op de intensiteit van deze signalen. Om dit effect

te verduidelijken worden de spectra van de drie stalen bij ‐12°C nog eens over elkaar gelegd, zodat

het verschil in intensiteit meteen duidelijk wordt.

Het sucrosestaal in water (rood) heeft duidelijk de laagste intensiteit terwijl sucrose in de

staaloplossing (groen) een zo goed als gelijke intensiteit heeft als het sucrosestaal in water en

500mM NaCl. De ogenschijnlijke lagere intensiteit van staal 3 bij het derde en laatste signaal is

gewoon te wijten aan de extra signaalopsplitsing. Het is duidelijk dat de aanwezigheid van NaCl in de

meetoplossing dus wel degelijk een gunstige invloed heeft op de signaalintensiteit bij deze labiele

protonen. Er blijkt geen significant verschil te zijn in lijnbreedte tussen 100 en 500 mM NaCl, wat

aantoont dat het effect in dit bereik niet concentratieafhankelijk is en reeds bereikt is bij 100 mM

NaCl. Bovendien is het duidelijk dat metingen bij lage temperatuur een meerwaarde betekenen bij

het bestuderen van uitwisselbare protonen, aangezien ze betrokken kunnen worden bij de

structuuranalyse van het product.

5.4.2 Temperatuurstudiesduplexen:wildtype(TTmismatch)enG2C27

Bovenstaande paragrafen hebben aangetoond dat het aanwenden van cryorestrictie wel degelijk een

meerwaarde kan betekenen voor het toekennen van de labiele hyrdoxylprotonen in kleine

moleculen. Het is nu echter de vraag of het ook nuttig is dit type metingen te gebruiken voor een

gemakkelijkere toekenning bij DNA duplexen, ook gekenmerkt door de aanwezigheid van labiele

protonen: de iminoprotonen. De logica achter deze toepassing is opnieuw dezelfde: door het

voldoende vertragen van de chemische uitwisseling tussen de iminoprotonen en het aanwezige

solvent water, kunnen de iminosignalen mogelijks opscherpen [1].

Figuur 5.8 Weergave van het hydroxylgebied van 1D 1H spectra bij ‐12°C voor staal 1 (rood), staal 2( groen) en staal 3 (blauw)

81

5.4.2.1 Wild Type (TT mismatch)

De resultaten van de temperatuurstudie uitgevoerd op deze duplex kunnen worden teruggevonden

in figuur 5.9.

Zoals blijkt uit bovenstaande figuur blijft de volgorde van de verschillende iminoprotonen gelijk ten

opzichte van de spectra bekomen op de 5mm probe, enkel de relatieve posities zijn een beetje

verschoven. Dit wordt duidelijk gemaakt aan de hand van de toekenning aanwezig in de figuur van de

temperatuurstudie (figuur 5.9).

Er zijn echter geen nieuwe signalen terug te vinden en is er ook geen sprake van opscherpening van

de signalen. Dit leert ons dat de naarmate de temperatuur daalt, de transversale relaxatie steeds

efficiënter wordt en hier het overheersende effect is, gezien alle signalen duidelijk verbreden. Zo

beschikt bv. TT(2) bij 25°C nog over een lijnbreedte van 20,6Hz terwijl dit bij ‐5°C al 62,1Hz bedraagt.

Een analyse voor andere signalen zal geen nieuwe informatie met zich meebrengen aangezien ze

allemaal duidelijk verbreden. Het verlagen van de temperatuur heeft duidelijk geen meerwaarde in

de toekenning en studie van de iminoprotonen bij deze sequentie.

Wanneer de resultaten van deze metingen worden vergeleken met de metingen op de 5mm probe is

het uitzicht van de spectra op de 1mm toch enigszins verschillend en is het interessant om na te gaan

of hier een gelijkaardig gedrag in functie van de temperatuur kan worden vastgesteld. Een meer

bruikbare weergave van de gegevens kan worden verkregen door voor elk signaal de chemische

verschuiving in functie van de temperatuur te gaan volgen (figuur 5.10).

5°C

10°C

15°C

25°C

0°C

‐5°C

‐10°C

T24

T18

T7 &T27 T6 G16

G9

G12 G26 & G19

G25

TT(1) TT(2)

Figuur 5.9 Overzicht 1D 1H spectra Wildtype (H20/D20 90/10, 5‐10mM)

82

Deze methode werd reeds eerder gebruikt in hoofdstuk 4 bij de analyse van de temperatuurstudies

van de alternatieve sequenties.

Figuur 5.10 Chemische verschuiving van de imino protonen in WT TT in functie van temperatuur (1mm)

Op het eerste zicht geeft deze figuur een vrij analoog beeld als deze verkregen bij de

temperatuurstudie met de 5mm probe. Om een betere vergelijking te kunnen maken tussen beide

worden de richtingscoëfficiënten van de trendlijnen en de daaruit berekende

temperatuurscoëfficiënten hieronder weergegeven.

Base TC (ppb/K) 1mm TC (ppb/K) 5mm

T6 ‐6,00 ± 0,26 ‐6,40 ± 0,06

T24 ‐4,90 ± 0,25 ‐6,20 ± 0,13

T7 & T27 ‐4,40 ± 0,65 ‐4,60 ± 0,58

T18 ‐3,80 ± 0,60 ‐5,30 ± 0,05

G9 ‐2,50 ± 0,03 ‐3,10 ± 0,10 G26 & G19 ‐2,20 ± 0,15 ‐2,20 ± 0,16

TT(1) ‐1,90 ± 0,20 ‐4,00 ± 0,16

G12 ‐1,40 ± 0,17 ‐1,90 ± 0,08

G16 ‐1,40 ± 0,24 ‐2,60 ± 0,16

TT(2) ‐1,40 ± 0,20 ‐0,70 ± 0,08

G25 ‐1,10 ± 0,15 ‐2,60 ± 0,06

Tabel 5.1 Overzicht TC op 1mm en 5mm wild type

9,500

10,000

10,500

11,000

11,500

12,000

12,500

13,000

13,500

14,000

14,500

‐10 ‐5 0 5 10 15 20 25 30

Chemische verschuiiving δ(ppm)

Temperatuur (°C)

T18T7 & T27T6T24G16G9G12G26 &G19G25TT(1)TT(2)

83

Enigszins verrassend kan worden vastgesteld dat de temperatuurscoëfficiënten bijna allemaal kleiner

zijn bij de metingen op de 1mm probe dan het geval is bij metingen op de 5mm probe. Weliswaar

blijft de numerieke volgorde van de temperatuurscoëfficiënten gehandhaafd: de thymines

verschuiven duidelijker sneller in functie van de temperatuur dan het geval is bij de guanines.

Wederom kan het verschil in het aantal waterstofbruggen tussen beide typen basenparen hiervoor

een verklaring bieden. De thymines van de mismatch vertonen in de 1mm metingen een beduidend

sterker afwijkend gedrag: bij de 5mm metingen gedraagt TT(1) zich als een vrij normaal thymine ( TC

= ‐4ppb/K) en TT(2) (TC = ‐0,7ppb/K) wijkt duidelijk af. Echter bij de metingen op de 1mm probe

bevindt de temperatuurscoëfficiënt van TT(1) (TC = ‐1,9ppb/K), samen met TT(2) (TC = ‐1,4ppb/K),

zich eerder in de grootteorde van de guanines.

Verder blijkt het verschil in temperatuurscoëfficiënt tussen beide protonen van de mismatch niet

meer zo groot te zijn bij metingen op de 1mm probe (0,5) als bij metingen op de 5 mm probe (3,3).

De vergelijking van temperatuurscoefficient valt aldus in twee groepen uiteen. Enerzijds komen T6,

T7, T27, G26 en G19 goed overeen tussen beide sets metingen. Anderzijds is er ook een groep waar

de overeenkomst veel minder goed is, met als uitschieters G25, T18, G16, T24 en beide

mismatchprotonen TT(1) en TT(2). G9 en G12 ten slotte, vallen tussen beide groepen in. Aangezien

de temperatuurstudies op beide meetprobes 4 meetpunten gemeenschappelijk hebben, zo is er bij

de 1mm metingen vertrokken vanaf 25°C, is het weinig waarschijnlijk dat het temperatuursgedrag

verschillend zou zijn in de respectieve temperatuursintervallen die bestudeerd werden met elke

probe. Aangezien er geen systematische trend is in de afwijkingen lijkt het waarschijnlijker dat de

oorzaak van deze verschillen gezocht moet worden in de verschillen in duplexconcentratie tussen

beide stalen, een andere verhouding van het aanwezige zout ten opzichte van de duplexen in

oplossing, een combinatie van de twee of een andere nog onbekende oorzaak. Het is in ieder geval

moeilijk om hier een eenduidig antwoord op te formuleren en verder onderzoek kan hier misschien

een ander licht op werpen.

Om er zeker van te zijn dat het gedrag van deze duplex bij de 1mm metingen representatief is voor

andere duplexen, zowel wat betreft de evolutie van de lijnbreedte als het opvallende verschillend

temperatuursgedrag, werden deze metingen nog eens herhaald op een andere duplex: G2C27.

5.4.2.2 G2C27 14meer

Deze metingen werden, om praktische redenen, uitgevoerd op een andere staal dan ditgene dat

bestudeerd wordt in hoofdstuk 4. Alhoewel dit enige directe vergelijkingen in de weg staat,

verandert dit niets in de uiteindelijke conclusie van dit hoofdstuk en blijven deze resultaten even

goed van toepassing. Het globale uitzicht van de spectra ziet er nagenoeg gelijk uit en de toekenning

uitgevoerd op het 5mm staal kan dan ook zonder problemen worden overgedragen. De resultaten

van de temperatuurstudie op de 1mm probe worden teruggevonden in figuur 5.11.

Na een analyse van de lijnbreedtes op halve hoogte (FWHM) bij G2C27 blijkt dat deze bij de

‘normale’ iminoprotonen alleen toeneemt naarmate de temperatuur verder daalt. Daarentegen

scherpen de protonen van de TT mismatch eerst op, wanneer er wordt overgegaan van 10° naar 5°C

(30 Hz naar 27 Hz), om na 0°C opnieuw een grotere breedte op halve hoogte te vertonen dan het

geval is bij 10°C (32 Hz en groter).

84

Dit is opnieuw tegengesteld aan de observaties bij de sucrosestalen, waarbij het meten bij lagere

temperaturen wel degelijk zijn voordelen heeft betreffende de signaalintensiteit van de labiele

hydroxylprotonen.

Figuur 5.11: Overzicht 1D 1H spectra G2C27 (H20/D20 90/10, 5‐10mM)

De situaties zijn, achteraf bekeken, dan ook niet volledig vergelijkbaar. Er is het verschil in grootte

van de moleculen (en dus de verschillen in initiële lijnbreedte) alsook het feit dat bij de DNA

duplexen, de iminoprotonen reeds waarneembaar zijn reeds bij kamertemperatuur, terwijl de

hydroxylsignalen van suikers, pas duidelijk waarneembaar worden rond 0°C.

In het geval van suikers, blijkt verdere verlaging van de temperatuur een spectaculair effect te

hebben, omdat hier de bijdrage van de chemische uitwisseling tot de lijnbreedte groot is, t.o.v. de

bijdrage van de transversale relaxatie, die eerder klein is.

Voor beide DNA duplexen, blijkt de verlaging van de temperatuur geen verder effect te hebben op de

meeste iminoprotonen, d.w.z. dat er hier nauwelijks nog een verbetering is van de lijnbreedte,

omdat men reeds verder verwijderd is van de intermediaire uitwisselingsomstandigheden, die

aanleiding geven tot sterke lijnverbreding. Hier domineert de transversale relaxatie en wordt een

toenemende verbreding vastgesteld bij een verdere daling van de temperatuur onder 0°C.

Het uiterlijk verschil met de spectra bij de 5mm metingen lijkt hier zeer klein of onbestaande te zijn.

Doch het temperatuurafhankelijk gedrag kan hier ook worden geanalyseerd en het is interessant om

na te gaan of een soortgelijke afwijking wordt gevonden zoals het geval is bij de wild type wanneer

de metingen op de 5mm en 1mm probe met elkaar worden vergeleken.

T18TT(1) TT(2)

T7

T6 T24

G16

G26, G9

G12

G25, G19

5°C

10°C

0°C

‐5°C

85

Figuur 5.12 Chemische verschuiving in functie van temperatuur G2C27 (1mm)

Met behulp van de eerder doorgevoerde toekenning, is het mogelijk om de verandering van de

chemische verschuiving in functie van de temperatuur op een meer bruikbare manier te volgen, zoals

wordt aangetoond in bovenstaande figuur 5.12. De overeenkomstige temperatuurscoëfficiënten

kunnen worden teruggevonden in tabel 5.2.

Base TC (ppb/K) 1mm TC (ppb/K) 5mm

T7 ‐7,60 ± ‐7,76 ± 0,15

T24 ‐5,60 ± 0,10 ‐6,54 ± 0,10

T6 ‐5,47 ± 0,64 ‐6,36 ± 0,05

TT(1) ‐3,16 ± 0,18 ‐4,35 ± 0,24

T18 ‐2,88 ± 0,43 ‐5,74 ± 0,08

G26, G9 ‐2,80 ± 2,49 ± 0,13

G25, G19 ‐2,58 ± 0,26 ‐3,3/‐2,39 ± 0,15/0,09

G12 ‐1,71 ± 0,16 ‐2,73 ± 0,10

TT(2) ‐0,62 ± 0,22 ‐0,47 ± 0,06

G16 ‐0,33 ± 0,01 ‐4,01 ± 0,23

Tabel 5.2 Overzicht TC op 1mm en 5mm wild type (gearceerde gebieden hebben slechts twee bruikbare meetpunten en bijgevolg is het niet mogelijk hier een fout op te berekenen)

De iminoprotonen van de mismatch gedragen zich hier weer zoals het geval is bij de meeste 5mm

stalen: TT(2) heeft de op één na laagste temperatuurscoëfficiënt, daar waar deze bij de meeste

andere 5mm stalen de laagste waarde heeft. Het feit dat deze nu hier net niet de laagste waarde

heeft kan eerder worden toegeschreven aan het ‘abnormaal’ gedrag van G16. TT(1) heeft deze keer

opnieuw een duidelijkere grotere waarde (TC =‐3,16 ppb/K) en vertoont dus een aanzienlijk grotere

afhankelijkheid van de temperatuur dan zijn partner.

9,500

10,000

10,500

11,000

11,500

12,000

12,500

13,000

13,500

14,000

14,500

‐8 ‐3 2 7 12


Temperatuur (°C)

T18T7T6T24G16G26, G9G12G25, G19TT(1)TT(2)

86

De observaties van toepassing bij de wild type (zie pg 10) zijn hier ook weer relevant: de trendlijnen

zijn lineair van aard, alle temperatuurscoëfficiënten zijn negatief en er kan weer een duidelijk verschil

in grootte van de temperatuurscoëfficiënt worden onderscheiden al naargelang het type basenpaar.

Wanneer de temperatuursfoëfficiënten van de 1mm metingen globaal worden vergeleken met de

metingen bij 5mm, valt het ook weer op dat de meeste overeenkomstige signalen een kleinere

waarde hebben. Sommige verminderingen zijn al wat drastischer dan andere, en voor een tweetal

iminoprotonen wordt bij 1mm juist een iets grotere temperatuurscoefficient vastgesteld dan bij

5mm. Ook bij de eerste metingen op de wild type is dit het geval, en er is dus wel een zekere trend te

herkennen.

5.5Conclusie

Het uitvoeren van de voorgestelde 1mm metingen bij lage temperaturen blijk zijn nut te hebben

vooral blij kleinere moleculen, zoals sucrose, gekenmerkt door de aanwezigheid van labiele protonen

die reeds sterk verbreed of onzichtbaar geworden zijn door chemische uitwisseling met het solvent.

Bij voldoende daling in temperatuur kunnen deze protonen, dankzij voldoende vertraging van de

chemische uitwisseling met water, zichtbaar gemaakt en gebruikt worden als extra informatie bij de

structuuranalyse.

Het uitvoeren van dit type metingen bij de beduidend grotere oligonucleotiden, heeft voornamelijk

extra lijnverbreding tot gevolg voor de uitwisselbare imino protonen en heeft dus geen meerwaarde

in de toekenning en studie van de geobserveerde iminoprotonen. Wat wel werd geobserveerd maar

hier niet verder is op ingegaan is een toename in T1 voor alle iminosignalen naarmate de

temperatuur daalt. Hoewel cryorestrictie op zich geen meerwaarde betekent in het zichtbaar maken

van nieuwe signalen, kan het uitvoeren van bv. 2D NOESY metingen bij lagere temperaturen voor een

toekenning hier duidelijk wel voordeel bij ondervinden.

5.6Referenties

1. Schroeder, K.T., J.J. Skalicky, and N.L. Greenbaum, NMR spectroscopy of RNA duplexes containing pseudouridine in supercooled water. Rna‐a Publication of the Rna Society, 2005. 11(7): p. 1012‐1016.

2. Claridge, T.D.W., High‐Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry. Second Edition ed. Tetrahedron Organic Chemistry Series, ed. J.E.B.a.R.M.W. J.E. Bäckvall. Vol. Volume 27. 2009: Elsevier. 383.

3. John M. Harvey, M.C.R.S., Proton magnetic resonance study of the hydration of glucose. Nature, 1976. 261(3): p. 435‐436.

87

Hoofdstuk6:SyntheseeninbouwenvaneengemodificeerdeTHisbouwsteenineenDNAduplex

6.1Gemodificeerdenucleotiden

Het eerste wat opvalt aan de vergelijking tussen enzymen en (oligo)nucleotiden zijn de verschillen in

bouwstenen. Enzymen bestaan uit aminozuren, met een variatie aan zijketens, daar waar

nucleotiden opgebouwd zijn uit vier verschillende heterocyclische basen met een suiker

(deoxyribose) en een fosfaatbackbone. Dit verschil in structuur heeft duidelijk zijn invloed op de

katalytische activiteit van deze totaal verschillende structuren. Enzymen kennen een rijke variëteit

aan verschillende functionaliteiten in de zijgroepen van hun bouwstenen, terwijl DNA en ook RNA

worden gekenmerkt door de afwezigheid hiervan. Kijkend naar de functie van DNA en RNA in een

organisme, het dragen van de erfelijke informatie, is deze structurele eenvoud juist een voordeel

aangezien dit de processen van transcriptie en replicatie gaat vereenvoudigen. Wil men echter DNA

gaan gebruiken als de basis van een nieuw type katalysatoren, dan werkt deze structurele eenvoud

dat doel juist tegen [1].

Het mag dan ook geen verrassing zijn dat de katalytische snelheidsconstante (kcat) van katalysatoren

gebaseerd op DNA beduidend lager zullen zijn dan de klassieke enzymen, zelfs de gevallen waar

aptameer en antilichaam katalysatoren werden geselecteerd voor het katalyseren van dezelfde

reactie [2].

Naast het algemeen ontbreken van chemische diversiteit in DNA ten opzichte van eiwitten, zijn de

twee meest opvallende verschillen, bij fysiologische pH, het ontbreken van een positieve lading voor

het stabiliseren van anionische transitietoestanden en het ontbreken van functionaliteiten die in

staat zijn algemene zuur‐base katalyse uit te voeren [3]. Dergelijke functionaliteiten, onteleend aan

lysines en histidines respectievelijk, zijn zo goed als altijd vertegenwoordigd in de actieve site van

enzymen [4].

Door gebruik te maken van gemodificeerde nucleotiden waarmee extra functionaliteiten kunnen

worden geïntroduceren in de DNA duplexstructuur, kunnen we bovenstaande beperkingen omzeilen.

6.2Heterocyclischebasemodificaties

In het algemeen zijn er drie mogelijke plaatsen voor het

introduceren van een modificatie in de DNA structuur, de

heterocyclische base, het (deoxy)ribose suiker en de

fosfaatbackbone. Zo werd reeds, in het labo van Prof. Madder,

een poging ondernomen een serine protease mimic te

synthetiseren door het introduceren van de noodzakelijke

functionaliteiten op de C2’ van ribose. Deze modificaties worden

ingevoerd via een amide functie waaraan de katalytische Figuur 6.1 2’‐Amido gemodificeerde

bouwsteen voor serine protease mimic

88

groepen kunnen worden vastgehecht door gebruik te maken van verschillende linkers [5], zoals ook

geïllustreerd in figuur 6.1.

Dit type modificaties sluit nauw aan bij het huidige onderzoek waarin dit werk kadert. Zoals verder in

dit hoofdstuk zal blijken is in dit geval de plaats van de ingevoerde modificaties verschillend. Naast

bovenstaand voorbeeld van modificaties op het suiker, zijn er nog andere mogelijke modificaties

waarbij men uitgaat van de regel dat elke modificatie, die niet interfereert met het vormen van ten

minste één fosfodiesterbinding en het binden van de complementaire heterocyclische base in

principe mogelijk is.

Vele nucleoside analogen gemodificeerd

op de 5‐positie van de heterocyclische

base, beschikken over biologisch actieve

eigenschappen en zijn reeds onderzocht als

mogelijke antivirale en kankerbestrijdende

middelen. Een aantal voorbeelden van

dergelijke modificaties worden

weergegeven in figuur 6.2

De gemodificeerde bouwstenen die instaan

voor de introductie van de drie verschillende essentiële functionaliteiten in de DNA scaffold,

benodigd voor het vormen van de katalytische triade, zijn ook voorbeelden van modificaties aan de

heterocyclische basen. Naast de imidazool functionaliteit van histidine, wordt de benodigde

alifatische hydroxylgroep van serine in een gemodificeerde bouwsteen ingebouwd en ten slotte de

carboxylgroep via een vereenvoudigd aspartaatanaloog. Een overzicht van deze drie bouwstenen kan

worden teruggevonden in figuur 6.3. In dit hoofdstuk wordt enkel de synthese besproken van de

histidine gemodificeerde bouwsteen. Deze zal worden geïntroduceerd in drie DNA duplexen telkens

op een verschillende plaats.

Zoals ook reeds vermeld in de inleiding, werd aan de hand van modelling studies de optimale lengte

van de linker, samen met de ruimtelijke oriëntatie nodig voor het kunnen vormen van een

katalytische triade, bepaald [6].

Figuur 6.2: Voorbeelden van modificaties aan de heterocyclische base, gebruikt als antivirale of antibacteriële middelen

Figuur 6.3: Overzicht van de drie gemodificeerde bouwstenen ter nabootsing van de serine protease actieve site

89

6.3Doel

Zoals vermeld in voorgaande paragraaf zal in dit hoofdstuk enkel de synthese en incorporatie van de

histidine gemodificeerde bouwsteen worden besproken. Deze bouwsteen zal worden geïntroduceerd

in de reeds bekende structuur van de wild type DNA duplex op telkens verschillende posities:

namelijk positie T6, T7 en T8 (zie ook hoofdstuk 1, figuur 1.21).

Samen met deze synthese zal ook een schatting worden gemaakt van de stabiliteit door het opmeten

van de smeltpunten van deze gemodificeerde en reeds eerder bestudeerde commerciële duplexen

via UV‐VIS spectrometrie. Hierbij wordt de wild type duplex gebruikt als referentie en kan deze

vergelijking ons al een idee geven of het introduceren van een niet‐natuurlijke functionaliteit impact

heeft op de stabiliteit van deze DNA structuren. Dit geeft ons indirect een idee of deze modificatie,

die tegelijkertijd ook de grootste functionaliteit omvat, de vooropgestelde duplexstuctuur niet

verstoort of in het optimale geval juist een extra stabilisatie kan betekenen ten gevolge van

verbeterde π‐π stacking. Het uiteindelijke doel is een vergelijkende studie te maken van de drie

gemodificeerde DNA duplexen via NMR om na te gaan wat de impact is van deze modificatie op het

gedrag van de iminoprotonen en de duplex in het algemeen. De uiteindelijke studie via NMR is

jammer genoeg niet kunnen uitgevoerd worden in het beschikbare tijdsbestek, maar de studie van

de smelttemperaturen kan ons zoals eerder vermeld al een indicatie geven van de duplexstabiliteit,

en een idee geven of het uitvoeren van deze NMR metingen in de toekomst al dan niet nuttig kan

zijn. Zo heeft het geen nut om deze op te starten indien men zeker is dat er geen duplexstructuur

gevormd kan worden.

6.4Algemeenoverzichtvandesynthese

De synthese van de histidine gemodificeerde bouwsteen is gebaseerd op methoden uit de literatuur

[7] en standaardprocedures werden gebruikt voor de opzuivering van de drie verschillende single

strands. Waar nodig werd de syntheseroute aangepast of geoptimaliseerd.

6.4.1 Voorbereidinggemodificeerdebouwsteen

Om de mogelijkheid tot nevenreacties, die optreden aan de niet beschermde (exocyclische) amino‐

en imidazoolfunctionaliteiten van de bouwstenen, te vermijden worden er verschillende types

beschermgroepen gebruikt om de gemodificeerde bouwstenen te incorporeren in de single strands.

Dit garandeert dat de vrije aminogroepen van de basen niet interfereren in de koppelingsreactie en

zorgt ervoor dat de optimale DNA structuur bekomen wordt. Specifiek toegepast op de histidine

bouwsteen wordt de imidazoolfunctionaliteit beschermd door gebruik te maken van een t‐

butoxycarbonyl (tBoc)‐groep, vaak gebruikt voor de bescherming van primaire en secundaire amines.

6 7 8

90

Deze is stabiel ten opzichte van basen en nucleofielen en kan afgesplitst worden, samen met de

andere aanwezige beschermgroepen, door gebruik te maken van een geconcentreerde basische

oplossing (bv. 28% NH4OH) en te verwarmen bij 55°C. Deze beschermgroep is stabiel tijdens de

aangewende omstandigheden in de DNA synthesecyclus.

Verder zijn er bij de gemodificeerde bouwsteen nog twee vrije hydroxylgroepen aanwezig, namelijk

de 5’‐ en 3’‐OH groep. In de natuur worden oligonucleotiden gesynthetiseerd vertrekkende van de 5’

naar de 3’‐hydroxylgroep, in de toegepaste vaste fase synthesestrategie echter wordt er gewerkt

vertrekkende van 3’ naar 5’. De sleutelstap in de synthese is de specifieke en sequentiële vorming

van de internucleoside 3’‐5’ fosfodiesterverbinding waarbij de specificiteit van deze reactie wordt

gewaarborgd door de eerder vermelde gebruikte

beschermgroepen.

In het algemeen syntheseprotocol van DNA wordt de 5’‐OH

functionaliteit beschermd door een 4,4’‐dimethoxytritylgroep

(DMTr), stabiel onder milde basische condities en tijdens de

effectieve koppeling. Deze DMTr‐groep wordt selectief

afgesplitst tijdens de synthesecyclus, aan de hand van

trichloroazijnzuur (TCA) ,waarbij een sterk oranje gekleurd

dimethoxytritylkation ontstaat. Deze verkleuring geeft aan of

de koppeling tussen de 3’‐ en 5’‐OH groep al dan niet is

doorgegaan. De regioselectiviteit van deze beschermgroep

voor de 5’‐OH functionaliteit wordt verklaard door het

optreden van sterische hinder bij de secundaire 3’‐OH

functionaliteit. Deze laatste OH‐groep, ten slotte, wordt in dit

syntheseprotocol omgevormd tot het overeenkomstige

fosforamidiet, wat ook de basis vormt voor de

fosfaatbackbone van het verkregen single strand DNA.

Een illustratie van de beschermde bouwsteen die kan worden

ingebouwd in DNA is terug te vinden in figuur 6.4

6.4.2 GeautomatiseerdeDNA synthese

Omwille van de repetitieve aard van het DNA

syntheseproces, kan dit op een automatische synthesizer

uitgevoerd worden. Doorgaans wordt de synthese van

enkel strengs DNA uitgevoerd via vaste fase synthese.

Hierbij wordt er vertrokken van een vaste drager (silica)

gemodificeerd met de eerste gewenste bouwsteen in de

sequentie. Deze vaste drager bevindt zich doorgaans op

een kleine kolom waarover solventen en reagentia

worden gestuurd in een welbepaalde volgorde. Na afloop van de synthese kan de gewenste keten

worden afgesplitst met behulp van ammoniak of een waterige oplossing van ammoniak, waarbij de

esterbinding tussen de vaste drager en keten verbroken wordt. In tegenstelling tot het volledige

syntheseproces verloopt deze laatste stap manueel.

Figuur 6.4 Fosforamidiet Histidine gemodificeerde bouwsteen

Figuur 6.5 Vaste fase met eerste deoxynucleoside bouwsteen

91

6.4.2.1 De oligonucleotide synthesecyclus

Nadat het eerste nucleotide is bevestigd aan de vaste fase, verloopt de synthese volgens een cyclisch

proces. Nadat deze cyclus eenmaal doorlopen is, groeit de keten telkens met één bouwsteen. De

eerste stap bestaat uit een detritylatie, of met andere woorden, de ontscherming van de 5’‐OH groep

van het nucleotide met een zuur, bv. trichloroazijnzuur. Op deze manier wordt deze 5’‐functionaliteit

beschikbaar voor de volgende stap, namelijk de reactie met het 3’‐ fosforamidiet van het volgende

nucleoside in de sequentie. Voorafgaand aan de koppeling moet het fosforamidiet worden

geactiveerd. Hiervoor wordt er doorgaans gebruik gemaakt van een zuur, zoals bv. tetrazool (pKa=

4.9), dat in staat is om een stiktofatoom van de diisopropylgroep te protoneren. Deze activator

vervangt vervolgens de geprotoneerde diisopropylgroep met de vorming van een reactief

intermediair dat in staat is om op zijn beurt verder te reageren met de ontschermde 5’‐OH groep van

het voorgaande nucleoside met de vorming van de gewenste 3’‐5’ fosfodiesterverbinding.

Ondanks de genomen voorzorgsmaatregelen zijn niet alle koppelingsreacties kwantitatief en zal er

dus nog altijd een fractie van niet gereageerde terminale 5’‐OH functionaliteiten aanwezig zijn.

Indien de volgende stap hier gewoon zou op volgen, verkrijgt men een complex mengsel van

sequenties met een verschillende lengte waarbij een of meerder basen ontbreken. Om dit te

voorkomen wordt er een extra stap geïntroduceerd die alle niet gereageerde strengen gaat ‘cappen’

1. Ontscherming

2. Koppeling 3. Capping

4. Oxidatie en start

nieuwe cyclus

5. Ontscherming en

afsplitsing

Figuur 6.6 Cyclus bij oligonucleotidesynthese, waarbij B overeenkomt met een willekeurige base

92

na de koppelingstap. Deze stap wordt uitgevoerd door gebruik te maken van een acetyleringsreactie.

In de daaropvolgende stap wordt het fosfiet geoxideerd tot een fosfotriester met behulp van I2 en

water. Bij deze stap wordt er ook nog gebruik gemaakt van pyridine om het gevormde HI te

neutraliseren. Na deze stap vindt er nog een laatste wasstap plaats om alle resterende reagentia te

verwijderen en hierna kan de cyclus van vooraf aan weer opnieuw beginnen tot de gewenste lengte

van de DNA single strand is bereikt.

Om de sequentie af te splitsen van vaste fase wordt er gebruik gemaakt van ammoniak of een andere

milde base bij verhoogde temperatuur. Hiermee worden tegelijkertijd ook de beschermende groepen

op de heterocyclische basen en de 2‐cyanoethyl groep nog aanwezig op de fosfaten afgesplitst.

Eens de synthese compleet is, kunnen gecapte sequenties en andere onzuiverheden worden

verwijderd door gebruik te maken een standaardprocedure aan de hand van een C18 Seppak kolom,

zie ook 6.5.5.

Na de afsplitsing en opzuivering worden de verschillende strands gecontroleerd aan de hand van

HPLC om na te gaan of de ontscherming wel degelijk volledig is doorgegaan en alle onzuiverheden

ook voldoende verwijderd zijn. Indien dit niet het geval is, wordt de ontscherming gewoon herhaald,

maar dan bij kamertemperatuur gedurende een langere periode. Hierna kan er opnieuw een

controle worden doorgevoerd. Indien alle beschermgroepen zijn afgesplitst kan men controleren via

massaspectrometrie of de producten de gewenste massa hebben en dus indirect een aanduiding

geven of de synthese al dan is geslaagd.

Voor het bepalen van de concentratie van de gesynthetiseerde strengen wordt er gebruik gemaakt

van UV‐VIS spectroscopie, op basis van de wet van Lambert‐Beer en het feit dat DNA absorbeert bij

een golflente van 260nm. Eens de concentratie gekend is, kan deze streng samengebracht en

gehybridiseerd worden met zijn complementaire streng in de juiste verhouding waarna ook de

smelttemperaturen kunnen worden bepaald, opnieuw via de UV‐VIS methode. Deze laatste geeft,

zoals ook reeds eerder vermeld, een indicatie van de duplexstabiliteit.

6.4.3 Algemenesynthesevanhethistidineanaloog

Een analyse van de synthese van deze gemodificeerde bouwsteen verloopt het makkelijkst aan de

hand van een retrosynthese, zoals aangegeven in figuur 6.7. Er wordt een onderscheid gemaakt

tussen twee grotere onderdelen: in eerste instantie wordt de histidine gemodificeerde bouwsteen

gesynthetiseerd, om deze daarna om te vormen tot de overeenkomstige fosforamidiet. Deze laatste

kan vervolgens worden ingebouwd in de gewenste sequentie.

93

De eerste stap komt overeen met een “one‐pot”

carboxamidatiereactie die gebruik maakt van een

Pd(0)‐complex, Pd(PPh3)4, als katalysator. Direct na

deze reactie wordt de Boc‐bescherming

doorgevoerd dit om de zuivering via

kolomchromatografie te vereenvoudigen [7]. Deze

reactie komt overeen met Pd gekatalyseerde

reactie, waarbij er in de eerste fase een oxidatieve

additie plaatsvindt van het een Pd‐complex in de C‐

I binding van het 5‐iodo‐2’‐deoxyuridine. In de

tweede stap vindt er een CO‐insertie plaats, bij

verhoogde druk in een daartoe ontworpen Parr

hoge druk reactievat, onder CO‐atmosfeer. Hierbij

wordt er een zgn. metaal‐acyl complex gevormd.

Vervolgens wordt een van de liganden van het Pd‐

complex uitgewisseld door het aanwezige

histamine. In de daaropvolgende stap migreert het

gecomplexeerde histamine naar het carbonyl

residu en hierbij wordt een 16‐elektronen Pd

complex gevormd als intermediair.

Figuur 6.7 Retrosynthese van de histamine gemodificeerde bouwsteen

Figuur 6.8 Palladium gekatalyseerde carboxamidatie reactiecyclus

Oxidatieve

additie

CO insertie

Migratie

Reductieve

eliminatie

Ligand

uitwisseling

94

Het uiteindelijke reactieproduct wordt gevormd door een base‐geassisteerde deprotonatie waarbij

ook de dissociatie van het Pd‐complex plaatsvindt en de cyclus weer opnieuw kan beginnen met een

volgende startmolecule. De Pd‐katalysator wordt geregenereerd na een hercoördinatie van het

ligand dat eerder werd uitgewisseld met histamine. De algemene reactiecyclus wordt weergegeven

in figuur 6.8.

De reden waarom de Boc‐bescherming van de imidazoolring van histamine zonder voorafgaande

zuivering wordt doorgevoerd, heeft te maken met de sterke polariteit van het reactieproduct. Dit zou

te sterk interageren met de eveneens polaire silica op de kolom waardoor een vlotte scheiding wordt

belemmerd. Door het direct doorvoeren van de bescherming wordt het product zelf minder polair en

kan het zuiveren vlotter verlopen. Bovendien is deze tert‐butoxycarbonyl groep ook nodig om het

product compatibel te maken met de oligonucleotidesynthese en het voorkomen van de bis‐

dimethoxytritylatie van zowel de 5’‐hydroxyl functionaliteit als de imidazoolgroep in de volgende

stap [7].

De daaropvolgende DMTr‐bescherming van de 5’‐OH functionaliteit wordt uitgevoerd met behulp

van een base, pyridine, in dichloormethaan bij kamertemperatuur gedurende 18 uur. Na deze

reactieperiode wordt de reactie gequenched door het toevoegen van droge methanol. Het bekomen

product wordt opnieuw gezuiverd door gebruik te maken van kolomchromatografie waarbij de

silicagel eerst wordt geneutraliseerd met triethylamine om te voorkomen dat de

dimethoxytritylgroep voortijd wordt afgesplitst door de lichtzure condities van de silicagel.

In de laatste stap tenslotte wordt de gemodificeerde bouwsteen omgezet in het overeenkomstige

fosforamidiet. Bij deze reactie is het zeer belangrijk om te werken in zo droog mogelijke

omstandigheden gezien het fosforamidiet zelf en het 2‐cyanoethyl N,N‐

diisopropylchlorofosforamidiet reagens zeer hydrolysegevoelig zijn. Verder wordt er gebruik gemaakt

van een niet‐nucleofiele base zoals diisopropylethylamine (DIPEA) om mogelijke nevenreacties uit te

sluiten. Om alle kans op overreactie te vermijden worden de reagentia bij elkaar gevoegd bij een

temperatuur van 0°C, om daarna de reactie gedurende 1u bij kamertemperatuur te laten doorgaan.

Uiteindelijk wordt ook hier de reactie gequenched bij 0°C met behulp van een 5%

natriumwaterstofcarbonaat‐oplossing en niet met methanol aangezien dit aanleiding kan geven tot

de vorming van extra nevenproducten [8]. Vooraleer de koppeling wordt doorgevoerd, word het

fosforamidiet zelf nog gedroogd aan de oliepomp en worden voldoende voorzorgen genomen om dit

niet bloot te stellen aan licht, gezien de hoge gevoeligheid van deze molecule.

Eens het fosforamidiet beschikbaar is, kan de koppeling in de gewenste sequentie worden

doorgevoerd. Hierna vinden er nog een aantal zuiveringsprotocollen plaats, zie ook 6.5.5, en ten

slotte ook controle via MALDI‐TOF MS.

95

6.5Experimenteelgedeelte6.5.1 Materialenenmethoden

Alle manipulaties bij lucht‐ en vochtgevoelige bestanddelen worden uitgevoerd onder argon

atmosfeer in vooraf gedroogde reactiekolven. De benodigde solventen zoals triethylamine en

dichloromethaan worden vooraf gedroogd via een droogopstelling met CaH2. Wanneer er gebruik

wordt gemaakt van commerciële droge solventen, worden deze gedroogd door middel van

moleculaire zeven. De reactie onder verhoogde druk bij CO‐atmosfeer wordt uitgevoerd in een

daartoe bestemd Parr hoge druk reactor. De 31P, 1H en 13C NMR spectra die werden opgenomen ter

controle van de bekomen producten werden uitgevoerd aan de hand van een Bruker 300MHz

Avance spectrometer. Hierbij werd er gebruik gemaakt van gedeutereerde solventen afkomstig van

Sigma‐Aldrich. De massaspectra opgenomen na zuivering worden uitgevoerd aan de hand van een

Agilent 1100 serie instrument na een chromatografische scheiding op een Phenomex C18 kolom (250

x 4.6 mm, 5µm bij 35°C) met als eluens 5mM NH4OAC in H2O en MeCN. De TLC’s opgenomen ter

controle tijdens de reacties werden uitgevoerd op glazen plaatjes vooraf behandeld met silicagel met

als eluens dichloormethaan:methanol 9:1. De automatische synthese van de DNA strengen werd

uitgevoerd op een Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer. De concentraties van de single strands

en double strands DNA werden bepaald aan de hand van een UV‐VIS trinean dropwise 96 toestel.

Daarnaast werden de smeltpunten van de verschillende duplexen bepaald aan de hand van een

Varian UV‐VIS spectrofotometer. Alle reagentia werden aangekocht bij Sigma Aldrich, ACROS

Organics of Fluka en werden gebruikt zonder verdere zuivering.

6.5.2 Synthesevan5‐{2‐[1‐(tert‐butoxycarbonyl)imidazole‐4‐yl]ethylaminocarbonyl}‐2’‐deoxyuridine

Aan een oplossing van 5‐iodo‐2’‐deoxyuridine (1,05 g; 2,9 mmol) in 20 ml DMF in een Parr hoge druk

reactievat worden achtereenvolgens histamine (930 mg; 8,4 mmol; 2,8 eq.), droge triethylamine

(2,5ml; 17,9mmol; 6eq.) en (PPh3)4Pd (167 mg; 0,145 mmol; 0,05 eq.) toegevoegd bij

kamertemperatuur onder een stroom van argon. Vervolgens wordt dit reactievat onder CO‐

atmosfeer geplaatst tot een druk van ongeveer 7 bar is bereikt. Het reactievat zelf wordt al roerend

verwarmd bij een temperatuur van 70°C gedurende 24uur. Na deze periode wordt het

reactiemengsel afgekoeld tot kamertemperatuur. Het reactiemengsel wordt vervolgens overgebracht

Figuur 6.9: Overzicht carboxamidatiereactie

O

OH

HO

N

NH

O

O

O

NH

N

N

O

O

O

OH

HO

N

NH

O

O

I

Et3N (droog)HistaminePd(PPh3)4CO 7 bar

DMF (droog)70°C24u

Et3N (droog)Boc2O

DMF (droog)KT

15min

C9H11IN2O5354,10 g/mol

C20H27N5O8465,46 g/mol

1

96

op een glasfilter waarop een laagje celiet is aangebracht, dit ter verwijdering van restanten Pd in de

oplossing. De reactor zelf en ook de filter, na filtratie, worden voldoende afgespoeld met behulp van

tolueen tot deze een heldere kleur heeft. Vervolgens wordt zoveel mogelijk DMF verwijdert met

behulp van co‐evaporatie door het toevoegen van een kleine hoeveelheid tolueen. De resterende

olie wordt hierna opgelost in een kleine hoeveelheid DMF ( 5ml) waarna triethylamine (droog)en

di‐tert‐butylcarbonaat (1,2g; 4,6mmol; 1,6 eq.) worden toegevoegd. De reactie wordt opgezet bij

kamertemperatuur gedurende 15 minuten, onder argon atmosfeer. Na deze reactieperiode wordt

1ml droge MeOH toegevoegd voor het quenchen van de reactie en wordt het solvent opnieuw

verwijderd onder verminderde druk.

Vervolgens wordt het product gezuiverd via kolomchromatografie via een gradiëntelutie van 5‐8%

methanol in dichloormethaan. Deze wordt gevolgd aan de hand van TLC’s van de verschillende

opgevangen fracties en diegene die het gewenste product bevatten worden vervolgens samen

ingedampt. Het uiteindelijke product (882 mg) word verkregen met een opbrengst van 64%.

1H NMR (300MHz, DMSO‐d6): δ 1,6 (9H, s, 3x C‐CH3); 2,2 (2H, m, H2’/2”); 2,7 (2H, t, 3J= 7.0Hz, NH‐

CH2‐CH2); 3,2 (2H, t, 3J=2,4Hz, NH‐CH2); 3,6 (2H, m, H5’/5”); 3,9 (1H,m, H4’); 4,2 (1H, m, H3’); 5,0 (1H,

t, 3J= 4,4 Hz, CH2OH); 6,1 (1H, t, 3J= 6,4Hz, H1’); 7,3 (1H,s, N‐CH‐C); 8,1 (1H, s, N‐CH‐N); 8,7 (1H, s, H6);

8,8 (1H, m, CH2‐NH‐C); 11,8 (1H, s, C‐NH‐C); 1C NMR (APT, 75MHz, DMSO‐d6): δ 27,4 (3x C‐CH3); 22,8

(NH‐CH2‐CH2); 37,9(NH‐CH2); 40,3 (C2’); 61,2 (C5’); 70,4 (C3’); 85,1 (C‐CH3); 85,5 (C1’); 87,9 (C4’);

105,3 (C5’); 113,6 (N‐CH‐C); 140,8 (CH‐C‐N); 145,8 (C6); 149,5 (N‐CO‐NH); 161,4 (CO‐NH‐CO); 163,1

(CH2‐NH‐CO); MS ESI m/z negatieve modus [C20H27N5O8]‐: 465,1 Da (moleculair gewicht 464,46

g/mol). TLC : (9:1 DCM:MeOH, Rf: 0,28)

6.5.3 Synthesevan5’‐O‐(4,4’‐Dimethoxytrityl)‐5‐{2‐[1‐(tert‐butoxycarbonyl)imidazole‐4‐yl]ethylaminocarbonyl}‐2’‐deoxyuridine

Product 1 (406mg; 0,871mmol) wordt driemaal geco‐evaporeerd met droge pyridine en overnacht

gedroogd alvorens het wordt opgelost in droge pyridine (15 ml) onder argon atmosfeer. Hierna

wordt een oplossing van dimethoxytritylchloride (338 mg; 0,999 mmol; 1,2 eq.) opgelost in een 1:1

mengsel van pyridine/dichloromethaan (6 ml) en toegevoegd aan de oplossing. Vervolgens wordt de

reactie gedurende 20u geroerd bij kamertemperatuur. Na deze periode wordt 1 ml droge methanol

toegevoegd om de reactie te quenchen en wordt het reactiemengsel gedroogd aan de oliepomp. De

resterende olie wordt vervolgens opgelost in dichloormethaan en achtereenvolgens gewassen met

een verzadigde oplossing van NaHCO3 en NaCl. Daarna wordt de afgescheiden organische fase

O

OH

DMTrO

N

NH

O

O

O

NH

N

N

O

O

O

OH

HO

N

NH

O

O

O

NH

N

N

O

O

DMTr-Cl

Pyridine (droog)KT 20u

C20H27N5O8465,46 g/mol

C41H45N5O10767,82 g/mol

Figuur 6.10 Overzicht DMTr‐bescherming 5’‐OH functionaliteit

1 2

97

gedroogd op Na2SO4. Ter controle wordt opnieuw een TLC genomen van het bekomen product en

worden de waterige fasen ook gespot om te controleren of er nog product nog aanwezig is. Hierna

wordt het eindproduct opnieuw geconcentreerd en gedroogd aan de oliepomp.

Om het bekomen product te zuiveren wordt er opnieuw gebruik gemaakt van kolomchromatografie,

met als eluens 0‐5% MeOH in DCM. Om te voorkomen dat de 5’‐OH functionaliteit voortijdig zou

worden ontschermd, wordt de kolom eerst doorlopen met 1% Et3N bevattend eluens. Ook hier

worden de verschillende fracties onderzocht aan de hand van TLC en de relevante fracties worden

verzameld, ingedampt en gedroogd aan de oliepomp. Dit levert het gewenste product 2 (512mg) met

een opbrengst van 77%.

1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1,6 (9H, s, 3x C‐CH3); 2,2‐2,3 (2H, m, H2’/2”); 2,8‐2,9 (2H, t, 3J= 7.0Hz, NH‐

CH2‐CH2); 3,3‐3,5 (2H, t, 3J=2,4Hz, NH‐CH2); 3,6‐3,7 (2H, m, H5’/5”); 3,8 (6H, s, O‐CH3, DMT); 3,9‐4,0

(1H,m, H4’); 4,3‐4,4 (1H, m, H3’); 6,2‐6,3 (1H, t, 3J= 6,4Hz, H1’); 6,8‐6,9 (4H, m, CH DMT); 7,2 (1H, s, N‐

CH‐C); 7,3‐7,5 (9H, m, CH, DMT), 8,1 (1H, s, N‐CH‐N); 8,6 (1H, s, H6); 8,7 (1H, s, H6); 9,2 (1H, m, CH2‐

NH‐C), 11,8 (1H, s, C‐NH‐C); 1C NMR (APT, 75MHz, CDCl3): δ 28,0 (3x C‐CH3); 28,4 (NH‐CH2‐CH2); 39,5

(NH‐CH2); 40,4 (C2’); 55,3 (2x ‐0CH3); 63,9 (C5’); 72,4 (C3’); 85,8 (C‐CH3); 85,6 (C1’); 85,9 (C4’); 86,9

(Cq‐allyl, DMT); 106,8 (C5’); 113,4 (4x CH, DMT); 114,0 (N‐CH‐C); 127,0, 2x 128,1 (CH, DMT); 128,1 (N‐

CH‐N); 3x 128,2; 3x 130,2 (CH, DMT); 2x 135,8 (Ar‐Cq, DMT); 140,7 (N‐CO‐O); 144,7 (CH2‐CH2‐C);

145,7 (C6); 150,1 (C2); 2x 158,7 (Cq‐O‐CH3); 161,9 (C4); 163,4 (NH‐CO‐C); MS ESI m/z negatieve

modus [C41H45N5O10]‐ 767,32 Da (moleculair gewicht 767,82 g/mol). TLC : (9:1 DCM:MeOH, Rf: 0,52)

6.5.3 Synthesevandeovereenkomstige3’‐O‐β‐Cyanoethyl‐N,N‐diisopropylfosforamidietvanC41H45N5O10

Product 3 (419,5 mg, 0,546 mmol) wordt opgelost in droge dichloormethaan (10ml) in een vooraf

gedroogde tweenekkolf, al roerend onder argon bij 0°C. Aan deze oplossing wordt vervolgens DIPEA

(4 eq., 2,18mmol, 380 µl) druppelsgewijs toegevoegd. Hierna wordt ten slotte nog 2‐cyanoethyl‐N,N‐

diisopropylchlorofosforamidiet (1,5 eq., 1,092 mmol, 243,60 µl) bijgevoegd. Na 1u wordt de reactie

gequenched door het toevoegen van 3ml 5% NaHCO3 opnieuw bij 0°C. Ter controle wordt er opnieuw

Figuur 6.11 Overzicht fosforamidietreactie

2

3

98

een TLC genomen van zowel begin‐ als eindproduct (9:1 DCM:MeOH, Rf: 0,87 eind, 0,76

beginproduct).

Vervolgens wordt het reactiemengsel gewassen met een 5% NaHCO3 (30ml) oplossing, gevolgd door

een verzadigde NaCl oplossing (3 x 30ml). Hierna wordt de organische fase gedroogd met behulp van

Na2SO4. En ten slotte wordt deze gedroogd aan de oliepomp totdat een wit schuimachtig product

wordt bekomen, met een rendement van 100%.

In plaats van een standaard 1D 1H spectrum wordt hier een 31P opgenomen. Hierbij zijn er 2 signalen

terug te vinden: bij 148,645ppm en 149,032 ppm. Beiden afkomstige van het gewenste fosforamidiet

dat een stereogeen center bevat en aanleiding geeft tot deze twee verschillende signalen [8]. Een

derde intens signaal bevindt zicht bij 14,094 ppm en is afkomstig van gehydrolyseerd startproduct (2‐

cyanoethyl‐N,N‐diisopropylfosforamidiet).

6.5.4 PraktischeuitvoeringvandeautomatischeDNA synthese

Eens het gewenste fosforamidiet bekomen is, wordt dit eerst opnieuw opgelost in acetonitrile en

gemengd samen met 0,5ml dicyano imidazool activator (1M, 59mg per sequentie)[9]. De

bouwsteen wordt op manuele wijze gekoppeld in de gewenste sequentie en op de gewenste plaats.

Juist voor de koppeling worden er nog moleculaire zeven toegevoegd voor de verwijdering van nog

mogelijk aanwezig water.

Elke gewenste streng wordt tweemaal gesynthetiseerd. Hierbij wordt telkens de juiste hoeveelheid

startbase op vaste fase afgewogen: voor thymines en guanines bedraagt dit ongeveer 25mg,

afhankelijk van de loading van de vaste fase, terwijl voor cytosines dit ongeveer met 30mg

overeenkomt. Vervolgens wordt de synthese per twee strengen tegelijkertijd opgestart. De koppeling

van alle niet‐gemodificeerde nucleosides wordt volledig automatisch doorlopen en wordt gestopt op

de positie waar de histamine gemodificeerde bouwsteen moet ingebouwd worden. De koppeling van

deze bouwsteen gebeurt manueel door gedurende een periode van ongeveer 20 minuten de

gewenste hoeveelheid fosforamidiet geleidelijk door de bewuste reactorvaatjes door te duwen.

Daarna wordt de synthese opnieuw volledig automatisch doorgevoerd.

De DNA strengen aanwezig op de vaste fase worden vervolgens overgebracht in epjes samen met

1ml 28% NH4OH voor de volledige ontscherming van de aanwezige beschermende groepen en

afsplitsing van de vaste fase. Hiertoe worden deze overnacht in een zandbad geplaatst bij een

temperatuur van 55°C. Vervolgens wordt van elke streng een HPLC‐meting uitgevoerd om te

controleren of de ontscherming volledig is verlopen. Indien dit niet het geval is, wordt de

ontscherming gewoon herhaald.

99

6.5.5 Zuiveringenkarakterisatie(HPLCenMS)

De ammoniumoplossingen met de afgesplitste oligonucleotiden kunnen gezuiverd worden aan de

hand van verschillende methoden zoals HPLC, gel‐electroforese en vaste fase extractie. De hier

aangewende methode maakt gebruik van een vaste fase extractie kolom, met een C18 “reversed

phase” silica fase. Achtereenvolgens worde de volgende oplossingen over het kolommetje gebracht:

1. 10ml acetonitrile (HPLC‐grade)

2. 10ml 5mM triethylammonium acetaat (TEAA) buffer

3. De oplossing met oligonucleotide samen met zoveel mogelijk vaste fase wordt op de kolom

gebracht en opgevangen (3x)

4. 15ml 2,5% waterige ammonium oplossing

5. 10ml milliQ water

6. 10ml 1,5% trifluorazijnzuur in water

7. 10ml milliQ water

8. 5 x 1ml 20% acetonitrile (HPLC‐grade)

De toevoeging van acetonitrile zorgt voor een activatie van de C18 fase. Vervolgens verwijdert de

TEAA buffer alle acetonitrile en bereidt de vaste fase voor op absorptie van het nog DMTr‐

beschermde oligonucleotide. Omwille van de apolaire karakter van de DMTr‐groep zullen enkel de

oligonucleotidesequenties die nog zo’n beschermgroep hebben worden vastgehouden op de vaste

fase. De andere niet‐voltooide sequenties, die gecapped zijn gedurende de synthese, worden

weggespoeld. De waterige ammoniumoplossing in de vierde stap verwijdert de nog aanwezige

beschermgroepen en gecapte sequenties van de vaste fase. Dit wordt gevolgd door een spoeling met

milliQ vooraleer de DMTr‐beschermende groep, nog aanwezig op de laatste vrije 5’‐OH

functionaliteit, wordt afgesplitst met een 1,5% TFA oplossing in water. Deze wordt opnieuw gevolgd

door een wasstap om de vaste fase te neutraliseren en de DMTr‐kationen te verwijderen. Ten slotte

kan de oligonucleotidesequentie worden opgevangen in nieuwe epjes met een 20% acetonitrile

oplossing.

Om de zuiverheid van de DNA‐streng te controleren, kan opnieuw een HPLC spectrum worden

opgenomen van de verschillende fracties en deze kunnen dan worden vergeleken met de eerder

bekomen spectra. Een voorbeeld van een opgenomen HPLC spectrum wordt getoond in figuur 6.12

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000

DAD1 A, Sig=260,16 Ref=off (D:\DATA\11-05-08\VG000008.D)

3.7

87

3.9

81

4.1

04

8.0

70

8.4

30

13.0

72

13.2

54

13.7

46

13.9

86

14.1

58

14.3

66

14.5

42

14.

757

14.

841

15.

024

15.5

69

15.9

73

16.

142

16.

417

17.

001

17.2

49

17.6

30

19.3

89

23.8

92

24.1

05

24.

402

24.5

63

24.7

57

25.1

15

25.2

78

25.4

42

25.6

91

26.1

00

26.3

82

26.5

33

26.8

58

26.

977

27.3

15

27.8

28

28.

302

Figuur 6.12 Voorbeeld HPLC spectrum THis 6 single strand voor zuivering

DMTr‐beschermde single strand

Onzuiverheden en gecapte sequenties Restanten

TEAA‐buffer

100

Het signaal bij 23,892 min komt overeen met het nog DMTr‐beschermde oligonucleotide. Andere

kleinere signalen komen overeen met onzuiverheden of eventueel nog aanwezige gecapte

sequenties. Na zuivering en ontscherming, in figuur 6.13, is het duidelijk dat het intense signaal

verschoven is naar 14,955min. Ook de kleinere signalen overeenkomstige met de onzuiverheden zijn

duidelijk afgenomen of zo goed als verdwenen.

Ten slotte kan gecontroleerd worden of de

sequenties over de juiste massa beschikken door

ook nog een MS‐spectrum op te meten. Een

voorbeeld dergelijk massaspectrum kan worden

teruggevonden in figuur 6.14

Het moleculair gewicht van de drie

gesynthetiseerde strengen is gelijk aangezien enkel

de plaats van de modificatie verschilt per streng.

Het moleculair gewicht bedraagt 4386,9 g/mol en

zoals te zien is in de spectra komt deze massa

overeen met het meest intense signalen

vermenigvuldigt met de lading (4385,29m/z, dit

spectrum werd opgenomen in negatieve modus

waardoor er één enkel proton per lading in het

moleculair ion ontbreekt).

6.5.6 Bepalingvanconcentratie

Na de zuivering worden de verschillende fracties

gevriesdroogd, bij elkaar gevoegd en daarna

opnieuw opgelost in milliQ H2O. Vervolgens wordt

telkens een aantal µl oplossing gebruikt om de

concentratie van elke streng te bepalen via UV‐VIS,

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000

DAD1 A, Sig=260,16 Ref=off (D:\DATA\11-05-08\VG000024.D) 3

.330

3.7

86 3

.962

4.0

82

4.6

70 4

.99

5

7.2

26

12

.32

0

13

.224

13

.47

3 1

3.6

24 1

3.7

84

13

.93

4 1

4.0

86 1

4.3

05 1

4.4

76 1

4.7

92

14

.94

1

15.

481

15

.67

1

24

.085

24

.28

0 2

4.4

74

25

.073

25

.690

26

.093

26

.270

26

.374

26

.527

26

.970

28.

301

29

.35

6

Figuur 6.13 Voorbeeld HPLC spectrum THis 6 single strand na zuivering

DMTr‐ontschermde single

strand

Figuur 6.14 Voorbeeld MS spectrum THis 6, identificatie mogelijk adhv deconvolutie

[M]8‐

[M]9‐

[M]7‐

[M]6

[M]6‐

[M]5‐

[M]5‐

101

aangezien DNA absorbeert bij een frequentie van 260nm. In principe kan de concentratie worden

bepaald door gebruik te maken van de wet van Lambert‐Beer: waarbij de absorbantie A

opgemeten wordt, overeenkomt met de extinctiecoëfficiënt, die afhankelijk is van de molecule, b

overeenkomt met de weglengte die doorgaans gelijk is aan 1 (cm). c is de enige onbekende factor en

kan dus worden berekend aan de hand van de bovenstaande formule. Natuurlijk moet er ook nog

worden rekening worden gehouden met de verdunningsfactor. De concentratie kan gemeten worden

aan de hand van een klassieke UV‐VIS spectrofotometer maar hier wordt er gebruik gemaakt van een

Trinean Dropwise 96 toestel dat in de basis analoog werkt maar zelf ook concentraties kan

berekenen principe van de

ingegeven sequentie.

Het toestel is gebaseerd op de

nanodroptechnologie

waardoor slechts 3µl van het

staal wordt gebruikt en

waarbij verder ook geen

verdunning dient te worden

gemaakt. Verder beschikt het

toestel over een interne

blanco, waardoor er in

principe geen blanco dient te

worden opgemeten.

Ten opzichte van een

klassieke UV‐meting met 1ml‐

cuvetten, waarbij minimaal

10µl oplossing wordt gebruikt

dat vervolgens sterk verdund

dient te worden om de cuvet

op te vullen, heeft dit toestel

als voornaamste voordelen dat men minder product verliest voor een meting en verdamping wordt

tegengegaan door het systeem met microkanaaltjes. Dit laatste geniet het voordeel van de

nanodroptechnologie, gezien het risico van verdamping van het staal in een korte tijdspanne. Het

enige nadeel is het feit dat het staal zich bevindt in een zeer klein volume waardoor er interacties

tussen de verschillende duplexen kunnen ontstaan wat kan leiden tot een gemeten concentratie die

lager ligt dan ze feitelijk is. In principe kan de verkregen concentratie worden geïnterpreteerd als een

ondergrens.

De resultaten worden weergegeven in ng/µl en kunnen eenvoudig worden omgerekend naar nmol

door te vermenigvuldigen met het totale volume en te delen door molaire massa.

Het uiteindelijke resultaat van zo’n meting ziet er zoals weergegeven in figuur 6.15. De curves stellen

de gemeten absorbantie voor in functie van de gemeten golflengte en de curve vertoont een

duidelijk maximum bij een golflengte van 260nm.

De metingen zelf werden driemaal uitgevoerd en het gemiddelde van de drie metingen werd

gebruikt als de concentratie. De uiteindelijke concentraties worden weergegeven in tabel 6.1

Figuur 6.15 Absorbantie gemeten in functie van de golflengte

102

Staal Concentratie 1 Concentratie 2 Concentratie 3 gemiddelde

(nmol/ml)

THis 6 (1) 347,5 351,6 351,8 350,3

THis 6 (2) 338,5 336,6 338,8 338

THis 7 (1) 375,4 378,9 375,4 376,6

THis 7 (2) 432,8 431,5 431,8 432

THis 8 (1) 389,5 387,7 386,9 388

THis 8 (2) 293,9 293,6 291,7 293,1

Tabel 6.1: Overzicht verschillende concentraties

Het aantal mol waarmee elke synthese werd gestart kwam ongeveer neer op 300nmol. De

bekomen concentraties beschouwend, mag dus besloten worden dat de synthese wel degelijk vlot is

verlopen aangezien het gemiddelde van drie metingen rond deze 300nmol ligt en in alle gevallen,

met uitzondering van één, zelfs een hogere concentratie hebben. Er is met andere woorden meer

dan genoeg materiaal om in een later stadium NMR metingen te verrichten op deze verschillende

strengen.

6.5.7 Bepalingsmeltpunten(Tm)vanDNA duplexen

Zoals reeds eerder aangehaald, kan het bepalen van een smeltpunt bij DNA duplexen een idee geven

van de stabiliteit van de betreffende structuur. Hierbij maakt men gebruik van de redenering: hoe

hoger het smeltpunt, hoe stabieler de duplex. De interpretatie van de betekenis van deze

smelttemperatuur is niet eenduidig, er is namelijk nogal wat speculatie over de moleculaire

achtergrond. Het is echter aannemelijk dat bij deze temperatuur men er kan vanuit gaan dat van alle

aanwezige duplexen in oplossing er zich, ruw gezien, 50% zal bevinden in de ‘simplex’ toestand en

50% in de ‘duplex’ toestand. Naarmate de temperatuur verder wordt verhoogd, zullen alle duplexen

evolueren naar een simplex toestand. Met andere woorden, in de oplossing bevinden zich dan

uitsluitend nog enkelvoudige strengen.

Van de gesynthetiseerde enkelvoudige strengen in duplexvorm, samen met alle NMR bestudeerde

duplexen ter referentie, worden de smelttemperaturen opgenomen om na te gaan of deze

gemodificeerde strengen daadwerkelijk in staat zijn om een duplexstructuur aan te nemen en in

hoeverre de stabiliteit wordt beïnvloed door de aanwezigheid van de niet‐natuurlijke modificatie.

Gezien de gemodificeerde enkelvoudige benodigd zijn in de duplexstructuur, moeten deze eerst nog

een “annealing‐stap” ondergaan. Hiervoor wordt er een equimolaire hoeveelheid complementaire

strand aan de benodigde hoeveelheid single strand toegevoegd. Vervolgens wordt deze oplossing

opgewarmd tot 95°C om daarna heel langzaam te worden afgekoeld tot kamertemperatuur. Door

deze afkoeling heel geleidelijk aan door te voeren, wordt de meest stabiele, en dus gewenste,

duplexstructuur bekomen. De andere stalen hebben reeds een dergelijke stap ondergaan en moeten

bij niet worden meegenomen in deze procedure.

Het bepalen van deze smeltpunten vereist een aangepaste staalvoorbereiding: de oligonucleotiden

worden opgelost in een 1M NaCl oplossing, samen met 0,1M natriumfosfaatbuffer en milliQ H2O. De

natriumfosfaatbuffer bestaat uit 0,0999M NaCl, 0,0710M NaH2PO4.H20 en 0,0288M Na3PO4.12H2O

103

opgelost in milliQ H2O. De pH van deze bufferoplossing wordt gecontroleerd via een pH meter en is in

het ideale geval gelijk aan 7.

Voor één staal wordt op het totale volume 10% van de 1M NaCl oplossing en 10% van de 0,1M

natriumfosfaatbuffer toegevoegd, terwijl de resterende hoeveelheid van het totale gewenste volume

wordt aangelengd met milliQ H2O. De concentratie aan duplex in het totale meetvolume bedraagt

steeds 1µM.

De smelttemperaturen worden bepaald aan de hand van een Varian UV‐VIS spectrofotometer en 900

µl cuvetten. Bij elke meting wordt er gebruik gemaakt van een basislijncorrectie. Hiertoe worden

blanco’s bereid die identiek zijn aan de stalen, met uitzondering van de duplex zelf. Tijdens de meting

zelf worden de cuvetten opgewarmd van 18°C tot 95°C aan een snelheid van 0,3°C/min en wordt de

absorbantie op gezette tijdstippen gemeten. Hierna wordt de meting herhaald maar in de

omgekeerde volgorde. Per duplex worden zo een drietal metingen achtereenvolgens uitgevoerd. Aan

de hand van de beschikbare data kunnen de figuren worden gereconstrueerd, zoals een voorbeeld

weergegeven in figuur 6.16

In bovenstaande figuur komt één “ramp” overeen met een meting vertrekkende van 5°C t.e.m. 95°C,

waarna in de volgende “ramp” er wordt teruggekeerd van hoge naar lage temperatuur. Wat duidelijk

opvalt is het feit dat de eerste meting vrij duidelijk afwijkt van de daaropvolgende twee. De reden

hiervoor is het feit dat in de eerste meting de temperatuur nog niet volledig stabiel is. De

smelttemperatuur zelf kan makkelijker worden teruggevonden aan de hand van de eerste afgeleide

van de verschillende curven. Waar deze een maximum bereikt, bevindt zich bij de overeenkomstige

temperatuur de gezochte Tm. Zoals het geval is bij deze figuur overlappen beide 1ste afgeleiden bijna

volledig, wat er voor zorgt dat de Tm met vrij grote nauwkeurigheid worden bepaald. Deze procedure

‐5,00E‐04

0,00E+00

5,00E‐04

1,00E‐03

1,50E‐03

2,00E‐03

2,50E‐03

3,00E‐03

3,50E‐03

4,00E‐03

0,245

0,255

0,265

0,275

0,285

0,295

0,305

0,315

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

Wild Type

Wild type Ramp 1

Wild type Ramp 2

Wild type Ramp 3

1e afgeleide Ramp 2

1e afgeleide Ramp 3

Figuur 6.16 Smelttemperatuurcurve opgenomen voor de referentieduplex

104

werd herhaald voor alle vermelde duplexen en werden vervolgens nog eens op identiek dezelfde

manier herhaald om te zien of de gevonden waarden consistent zijn. De figuren voor de andere

duplexen kan worden teruggevonden in de appendix. Een kort overzicht kan worden teruggevonden

in tabel 6.2.

Staal Smelttemperatuur (°C) Tm

meting 1 meting 2

THis 6 50,3 50,7

THis 7 49,9 50,3

THis 8 54,7 54,5

Wild type 48,4 48,8

C9G20 44,6 45,9

G5C24 52,1 54,0

C2G27 53,2 52,9

G2C27 50,9 50,5

Tabel 6.2: Overzicht smelttemperaturen verschillende stalen

Kijkend naar de verschillende waarden van de sequenties, met de wild type als referentie voor de

verschillende basenpaar‐ en histidinemodificaties, kunnen er een aantal besluiten worden getrokken:

Wanneer in de sequentie een AT basenpaar wordt vervangen voor een GC, stijgt de stabiliteit

van de betreffende sequentie met een 3 à 4‐tal graden Celsius. Dit is ook logisch gezien het

GC basenpaar één extra H‐brug telt ten opzichte van een AT basenpaar, wat dus een extra

stabilisatie teweegbrengt.

Opvallend is het feit dat een “base‐flip” van een GC naar CG basenpaar juist naast de

mismatch (C9G20) een daling veroorzaakt in de algemene stabiliteit van de duplex. Een

mogelijke verklaring kan gezocht worden in een verstoring teweeggebracht in de duplex door

een aangepaste π‐π stacking ter hoogte van de mismatch. Enige omzichtigheid is wel

geboden, gezien het afwijkende karakter van de T‐T mismatch die geen standaard Watson‐

Crick basenpaar is.

Misschien wel het meest opvallende is dat de Tm’s van de gemodificeerde duplexen geen

lagere maar juist hogere smelttemperatuur hebben dan de referentie ! Bij de duplex waarbij

de modificatie is aangebracht ter hoogte van de T‐T mismatch (THis 8) is er zelfs een

significante verhoging te zien in temperatuur (48,6 t.o.v. 54,6 °C gemiddeld gezien). Met

andere woorden, de introductie van de modificatie heeft juist een extra stabilisatie tot

gevolg in tegenstelling tot wat zou verwacht kunnen worden. Deze toename in Tm is minder

aanwezig bij de andere twee modificaties maar getuigt ook van een stabiliserend effect.

Rekening houdend met deze laatste belangrijke observatie kan er worden besloten dat het zeker en

vast de moeite loont om deze gemodificeerde duplexen ook aan een NMR temperatuurstudie te

onderwerpen. Via NMR kan men ook het gedrag van de T‐T mismatch bestuderen, wat zeker van

belang is bij THis 8 en mogelijk een beter inzicht verwerven in de processen die aan de basis liggen van

de geobserveerde stabilisatie.

105

6.6Referenties

1. Joyce, G.F., Nucleic acid enzymes: Playing with a fuller deck. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998. 95(11): p. 5845‐5847.

2. Fan, E., et al., Antibodies with thiol‐S‐transferase activity. Journal of the American Chemical Society, 1996. 118(23): p. 5474‐5475.

3. Vineetha K. Jayasena, L.G., In vitro selection of self‐cleaving RNAs wih a low pH optimum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997. 94: p. 10612‐10617.

4. Perrin, D.M., T. Garestier, and C. Helene, Expanding the catalytic repertoire of nucleic acid catalysts: Simultaneous incorporation of two modified deoxyribonucleoside triphosphates bearing ammonium and imidazolyl functionalities. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 1999. 18(3): p. 377‐391.

5. Catry, M.A. and A. Madder, Synthesis of functionalised nucleosides for incorporation into nucleic acid‐based serine protease mimics. Molecules, 2007. 12(1): p. 114‐129.

6. In samenwerking met Prof. Bifulco, Universiteit van Salerno 7. Holmes, S.C. and M.J. Gait, Syntheses and oligonucleotide incorporation of nucleoside

analogues containing pendant imidazolyl or amino functionalities ‐ The search for sequence‐specific artificial ribonucleases. European Journal of Organic Chemistry, 2005(24): p. 5171‐5183.

8. Hirschbein, B.L. and K.L. Fearon, P‐31 NMR spectroscopy in oligonucleotide research and development ‐ Commentary. Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 1997. 7(1): p. 55‐61.

9. Vargeese, C., et al., Efficient activation of nucleoside phosphoramidites with 4,5‐dicyanoimidazole during oligonucleotide synthesis. Nucleic Acids Research, 1998. 26(4): p. 1046‐1050.

106

Algemeneconclusie

Vanuit het oogpunt van het ontwikkelen van een nieuw type serine protease mimic op basis van een

DNA scaffold, werd er in het NMR gedeelte gezocht naar een optimale oligonucleotidesequentie.

Hoewel het centrale gedeelte (T6 tot T8) van de sequenties onveranderd moet blijven, is het mogelijk

om basenparen dichtbij of veraf van de T‐T mismatch aan te passen. In dit opzicht werd zowel de

referentie sequentie (wild type) als 4 mogelijke alternatieve sequenties onderzocht aan de hand van

NMR‐spectroscopie, dit met het oog op het bepalen van een voldoende stabiele sequentie die

tegelijkertijd ook gekenmerkt wordt door kwaliteitsvolle spectra die zowel een toekenning van de

basenparen als een verdere analyse bevorderen. In dit opzicht is het mogelijk om via een

temperatuurstudie het gedrag van elk basenpaar in functie van de temperatuur te gaan

karakteriseren aan de hand van temperatuurscoëfficiënten en deze ook te gebruiken als een

hulpmiddel om de verschillende sequenties ten opzichte van elkaar te vergelijken. Zo kan een

duidelijk beeld worden gevormd van de impact van een aangepast basenpaar op het gedrag van de

sequentie. Over het algemeen kan bij G5C24, G2C27 en C2G27 enkel op de plaats van het aangepaste

basenpaar en in de onmiddellijke omgeving ervan enige verandering in het gedrag worden

waargenomen. Dit is ook logisch gezien het telkens een ander type basenpaar betreft. In dit opzicht

kan een verandering in gedrag van de iminoprotonen van de T‐T mismatch, in het geval van C9G20,

als een opmerkelijke observatie worden beschouwd. Dit kan immers duiden op een conformationele

afhankelijkheid van de mismatch bepaald door de π‐π stacking interactie met zijn directe nabuur. Het

zou dan ook nuttig zijn om duidelijkheid te scheppen in dit gedrag door bv. gebruik te maken van een 15N gelabelde bouwsteen die een onderscheid tussen de iminoprotonen van de mismatch toelaat.

Daarnaast kan verdere analyse aan de hand van de lijnbreedtes op halve hoogte een duidelijk beeld

worden gevormd van de bijdrage van de chemische uitwisseling waaraan de bestudeerde

iminoprotonen onderhevig zijn. Het maximum van de T2* in functie van de temperatuur duidt het

punt aan waar het proces van chemische uitwisseling de bovenhand krijgt en bij welke temperatuur

de iminoprotonen zullen vervallen in een regime van snelle uitwisseling op de NMR‐tijdschaal. Ook

deze parameter is een aanwinst in een onderlinge vergelijking van de alternatieve sequenties, en

duidt onder meer aan bij welke sequentie chemische uitwisseling vroeger of later optreedt. Zo is het

duidelijk dat het omwisselen van één enkel basenpaar wel degelijk een impact kan hebben op de

stabiliteit en resistentie ten opzichte van de chemische uitwisseling van de volledige duplex, zoals

opnieuw wordt waargenomen bij sequentie C9G20. Zowel de smelttemperatuur als de profielen van

T2* in functie van de temperatuur duiden een uniforme daling aan in stabiliteit. In deze context is het

bepalen van de duplex smelttemperaturen aan de hand van UV‐VIS spectrometrie dan ook een

waardevolle aanvulling, die bovendien correleert met de observaties op het vlak van NMR. Na een

analyse van alle beschikbare gegevens bleek de wild type de optimale sequentie te zijn in termen van

stabiliteit en toekenbaarheid in de spectra.

Als afsluiter van het NMR deel werd cryorestrictie aangewend in een poging om de chemische

uitwisseling voldoende te vertragen om zo de signalen te laten opscherpen of nieuwe signalen

zichtbaar te maken. In eerste instantie werd dit toegepast op een kleine molecule, sucrose, waarbij

de uitwisseling van de hydroxylprotonen met het solvent voldoende werd vertraagd waardoor deze

107

uitwisselbare protonen zelf ook konden worden gebruikt in de structuuranalyse. Bij de toepassing

van cryorestrictie op DNA duplexen bleek de efficiëntie van de transversale relaxatie echter te groot

bij deze verlaagde temperaturen om aanleiding te geven tot bruikbare resultaten. Een toename in T1‐

tijden echter, maakt meten bij verlaagde temperaturen wel aantrekkelijk wanneer een toekenning

aan de hand van een 2D NOESY problematisch zou blijken.

In het tweede luik van deze thesis werd een poging ondernomen om een serie van gemodificeerde

duplexen te synthetiseren via de introductie van een gemodificeerde THis bouwsteen in de sequentie.

Om de impact van de modificatie en zijn relatieve positie in de sequentie na te gaan, werden de THis

bouwsteen geïntroduceerd op drie verschillende plaatsen: T6, T7 en T8. Hoewel een analyse van

deze sequenties via NMR niet meer tot de mogelijkheden behoorde, kon reeds een vroege indicatie

van de impact op de algemene stabiliteit van de sequenties worden bekomen door het opmeten van

de smelttemperaturen. In vergelijking met de wild type bleek de modificatie in twee gevallen geen

destabilisatie te veroorzaken en in één geval was er zelfs sprake van een extra stabilisatie. De meest

stabiele duplex bleek de THis 8 sequentie te zijn, met de modificatie aangebracht op één van beide

thymines uit de T‐T mismatch.

Latere studies aan de hand van NMR zullen nuttig zijn om enerzijds te zien of vergelijkbare resultaten

kunnen worden teruggevonden, anderzijds de impact van de modificaties op de iminoprotonen na te

gaan en ten slotte de waargenomen stabilisatie te helpen ophelderen.

108

Hoofdstuk7:Appendix

Dit deel bevat de volgende onderdelen:

7.1 NMR‐gedeelte:

Structuuranalyse sucrose ( Hoofdstuk 5)

7.2 Synthese‐gedeelte:

7.2.1 31P spectrum fosforamidiet THis bouwsteen

7.2.2 HPLC spectra van alle gesynthetiseerde strengen, zowel voor en na

ontscherming als na extra ontscherming (indien nodig)

7.2.3 MS spectra van gesynthetiseerde strengen

7.2.4 Smeltcurven van sequenties bestudeerd via NMR als van THis gemodificeerde

spectra

7.1AanvullingbijdeNMRhoofdstukken

In deze paragraaf wordt de structuuranalyse van sucrose weergegeven aan de hand van een DQFCOSY

(cosydfesgpph pulsprogramma uit de Bruker bibliotheek) uitgevoerd op een surcrosestaal opgelost in

42

1’

5,6, 6’

5’4’3’

16OH1’OH2OH

4, 3, 6’OH

3’OH4’OH

109

staaloplossing opgemeten bij ‐10°C op de 1mm probe. De overige parameters zijn dezelfde als de

klassieke 1D 1H metingen.

7.2Synthese

7.2.1 31P Spectrumfosforamidiet bouwsteen

In dit 121 MHz spectrum zijn twee duidelijke signalen te onderscheiden: 14,12 ppm komt overeen met

het gehydrolyseerd startproduct (2‐cyanoethyl‐N,N‐diisopropylchlorofosforamidiet) terwijl de twee

signalen bij 149,03 ppm en 148,64 ppm overeenkomen met de stereo‐isomeren van de fosforamidiet

bouwsteen.

110

7.2.2 HPLCspectragesynthetiseerdeDNAstrengen

Voor de toekenning van de verschillende signalen in het spectrum wordt er verwezen naar hoofdstuk 6.

Van elke streng werden meerder fracties gecontroleerd zowel voor als na zuivering (Sep‐pak C18

kolom). Indien nodig werd een extra ontscherming uitgevoerd en vervolgens gecontroleerd.

THis 8 fractie 1 voor zuivering

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000

1200


3.7

85

3.9

67

4.0

83 4

.499

6.5

86

8.0

83

8.4

32

11.2

98

12.4

04

13.1

08

13.

293

13.5

47 1

3.7

58

13.9

45

14.

253

14.4

26

14.

688

14.8

54

15.0

54

15.

224

15.4

82

15.8

07

15.9

17

16.

434

16.9

55 1

7.3

00

18.0

97

20.4

93

23.

404

23.8

98

24.1

04

24.

273 2

4.4

44 2

4.568

24.

778

24.9

82

25.1

44

25.3

02

25.

462

25.6

98

26.0

97

26.

387

26.

540

26.

862

26.

999

27.8

32

28.3

07

111



min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000

1200


3.3

06

3.4

48

3.7

85

3.9

63

4.0

84 4

.502

6.3

76

8.0

69 8

.420

11.

280

11.6

70

12.3

75

12.5

35

12.

816

13.0

72

13.2

61

13.

362

13.

511

13.

724

13.

909

14.2

15

14.3

92

14.

658

14.

814

15.0

18 1

5.1

83 1

5.4

48 1

5.768

15.

875

16.

411

16.

910

17.

258

18.5

07

23.1

92

23.9

00

24.1

10 2

4.4

03 2

4.566

24.7

64

24.9

78

25.1

29

25.

293

25.4

40

25.6

93

26.1

01

26.

385

26.

537

26.

860

26.

988

27.3

22

27.8

30

28.

305

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400


3.7

85

3.9

69 4

.086

4.5

08

8.0

78

12.

365

13.0

65

13.2

41

13.5

12

13.

811

13.

984 14.1

47 1

4.380

14.5

04 1

4.66

3 1

4.9

92

15.

174

15.3

36

15.4

13

15.6

36 1

5.806

15.

971

16.4

09

16.

960

17.

301

23.

009

23.8

94

24.0

99

24.4

00

24.

566

24.

754

24.

977

25.

288

25.4

43

25.

694

26.

101

26.

385

26.

535

26.8

60 2

6.9

80

27.

319

27.

829

28.3

04

112



min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400


3.2

99

3.4

32

3.7

85 3

.975

4.0

99

8.0

69

11.

283

12.3

70

13.0

65

13.2

41

13.

808

13.

984

14.

140

14.

368

14.5

04

14.

667

14.

814

14.9

15

14.

997

15.

180

15.3

43

15.4

26

15.6

48

15.8

27

15.9

89

16.4

14

16.

968

17.

244

17.4

58

19.

230

23.8

92

24.

108

24.

403

24.

566

24.

758

24.

976

25.

282

25.

447

25.

691

26.

099

26.3

82

26.5

33

26.8

58

26.9

77

27.3

16

27.

827

28.

301

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000


3.7

87 3

.981

4.1

04

8.0

70 8

.430

13.0

72

13.

254

13.7

46

13.9

86

14.1

58 1

4.36

6 1

4.542

14.7

57

14.8

41

15.0

24

15.

569

15.9

73

16.1

42

16.

417

17.0

01

17.

249

17.6

30

19.

389

23.8

92

24.

105

24.4

02 2

4.5

63

24.7

57 2

5.1

15 2

5.2

78

25.

442

25.6

91

26.1

00

26.

382

26.

533

26.

858

26.9

77 2

7.31

5

27.8

28

28.

302

113


THis 8 na zuivering

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

100

200

300

400

500

600

700


3.7

86

3.9

79

4.0

87

8.0

76 8

.428

13.

067

13.

245

13.

739

13.

978 1

4.1

46 1

4.3

52

14.5

34

14.7

65

15.0

01

15.5

48

16.4

09

17.

238

23.

127

23.8

91

24.0

51

24.4

77 2

4.5

64

25.

111

25.

275

25.6

91 2

6.1

01

26.3

83

26.

534

26.

860

26.9

77

27.3

19

27.8

29

28.3

03

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

100

200

300

400

500


3.7

83

3.9

70

4.1

23

13.5

17

13.7

18 1

3.9

10 1

4.2

12 1

4.3

74

14.8

15

14.9

50

15.7

31

15.

844

16.

186

16.4

49 1

6.890

17.

090

23.8

89

24.

486

25.

110

25.6

89 2

6.0

99

26.

381

26.

532

26.8

57 2

6.9

73

27.3

16

27.8

26

28.

301

114

THis 7 na zuivering

THis 6 na zuivering

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

50

100

150

200

250

300

350

400


3.7

89 3

.969

4.1

27

5.0

00

13.

912

14.

011

14.

203

14.3

75

14.5

28

14.

690

14.8

48

15.

864

16.0

68

16.8

62

17.0

17

23.9

52

24.

477

25.1

02

25.

690

26.0

98

26.

378

26.5

29 2

6.973

28.3

01

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

100

200

300

400


3.7

84 3

.972

4.1

23

5.0

04

14.8

08

14.9

54

15.4

81

16.

117

17.

089

24.4

87

25.0

97

25.

697

26.1

01

26.2

76 2

6.381

26.5

32 2

6.977

28.3

05

29.

357

115

THis 8 na extra ontscherming

THis 6 na extra ontscherming

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

50

100

150

200

250

300

350

400


3.7

85 3

.966

4.0

85

5.0

02

13.

201

13.4

45

13.

556

13.

654

13.

845

13.

957

14.1

52 1

4.3

20

14.

787

14.9

33

23.4

09

24.

474

25.0

77

25.

689

26.0

94 2

6.271

26.

375

26.

528

26.

971

28.

302

29.

355

min5 10 15 20 25 30

Norm.

0

200

400

600

800

1000


3.3

30

3.7

86

3.9

62

4.0

82

4.6

70

4.9

95

7.2

26

12.

320

13.

224

13.4

73

13.6

24

13.

784

13.9

34 1

4.0

86

14.

305

14.4

76

14.

792

14.9

41

15.4

81

15.6

71

24.

085

24.2

80 2

4.4

74

25.0

73

25.6

90

26.

093

26.2

70 2

6.374

26.

527

26.9

70

28.

301

29.3

56

116

7.2.3 MSspectragesynthetiseerde strengen

Alle spectra werden opgenomen in negatieve modus, hierdoor ontbreekt telkens 1 proton per extra

lading in het moleculaire ion. De verschillende ionen werden geïdentificeerd a.d.h.v. deconvolutie.

THis 8 fractie 1 voor zuivering (Mw: 4385,92 Da)


m/z200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100

*MSD1 SPC, time=0.484 of G:\072-0201.D API-ES, Neg, Scan, Frag: 70

Max: 25864 625

.5

547

.2

486

.2

730

.0

876

.2

614

.9

460

.9

109

5.5

526

.9

738

.1

437

.6

922

.9

530

.0

606

.3

146

1.1

471

.0

378

.3

707

.6

849

.2

113

.0

409

.6

567

.0

m/z200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100


Max: 16768 547

.3

625

.5

486

.2

876

.2

730

.1

109

5.5

526

.8

614

.9

437

.4

737

.9

584

.2

511

.1

112

.9

923

.1

675

.0 7

07.8

548

.8

320

.5

146

1.2

619

.3

110

1.3

378

.2

471

.3

[M]4‐

[M]5‐ [M]6‐

[M]7‐

[M]8‐

[M]9‐

[M]10‐

[M]4‐

[M]5‐ [M]6‐

[M]7‐

[M]8‐

[M]9‐

117



m/z200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100


Max: 24368 625

.6

547

.1

729

.9

876

.2

486

.2

439

.2

109

5.5

537

.1

613

.9

716

.4

477

.2

112

.9

516

.0

860

.0

437

.4

635

.5

549

.0

707

.1

606

.0

741

.7

146

1.2

378

.2

m/z200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100


Max: 30520 547

.2

625

.6

730

.0

486

.3

876

.1

109

5.5

530

.4

439

.1

613

.6

477

.2

716

.3

146

1.2

544

.8

[M]4‐

[M]5‐

[M]6‐

[M]7‐ [M]8‐

[M]9‐

[M]4‐

[M]5‐

[M]6‐

[M]7‐

[M]8‐

[M]9‐

118

m/z200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100


Max: 20896 625

.5

547

.2

486

.3

730

.0

876

.2

109

5.7

113

.0

530

.2

589

.9

437

.5

146

1.0

490

.2

880

.7

549

.0

628

.8

700

.8

320

.7

248

.0

733

.2

110

1.0

134

.0



m/z200 400 600 800 1000 1200 1400

0

20

40

60

80

100


Max: 20520 547

.2

486

.3

625

.5

730

.0

876

.3

109

5.6

530

.3

612

.9

437

.4

700

.8

490

.4

549

.1

817

.6

146

1.1

628

.6

981

.5

880

.6

578

.9

320

.7

439

.1

134

.0

[M]4‐

[M]5‐

[M]6‐ [M]7‐

[M]8‐

[M]9‐

[M]4‐

[M]5‐

[M]6‐

[M]7‐ [M]8‐

[M]9‐

119

7.2.4 SmelttemperaturenalternatieveenTHisgemodificeerdesequenties.

In deze paragraaf worden de gereconstrueerde figuren getoond, gebruikt voor het aflezen van de

verschillende Tm‐waarden gebruikt tijdens de NMR temperatuurstudie en synthese van de alternatieve

sequenties. Voor elke sequentie wordt slechts een figuur getoond, gezien de herhaalde metingen

aanleiding geven tot dezelfde resultaten. De waarden van beide sets metingen kunnen worden

teruggevonden in hoofdstuk 6 (Synthese). Voor elke duplex werden telkens drie metingen uitgevoerd,

ook eerder vermeld als “ramps”. De eerste ramp toont doorgaans een licht afwijking van de andere

twee en deze wordt niet meegenomen in het berekenen van de smelttemperaturen. Naast de eigenlijke

smeltcurven wordt ook telkens de eerste afgeleide getoond, deze stelt ons makkelijker in staat om de

Tm, die overeenkomt met het maximum, af te lezen.

THis 6

‐0,0005

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,22

0,23

0,24

0,25

0,26

0,27

0,28

0,29

0,3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

120

THis 7

THis 8

‐0,0005

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,2

0,22

0,24

0,26

0,28

0,3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

‐0,0005

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,23

0,24

0,25

0,26

0,27

0,28

0,29

0,3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

121

Wild type

C9G20

‐5,00E‐04

0,00E+00

5,00E‐04

1,00E‐03

1,50E‐03

2,00E‐03

2,50E‐03

3,00E‐03

3,50E‐03

4,00E‐03

0,245

0,255

0,265

0,275

0,285

0,295

0,305

0,315

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0,225

0,235

0,245

0,255

0,265

0,275

0,285

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

122

G5C24

C2G27

‐5,00E‐04

0,00E+00

5,00E‐04

1,00E‐03

1,50E‐03

2,00E‐03

2,50E‐03

3,00E‐03

3,50E‐03

0,225

0,235

0,245

0,255

0,265

0,275

0,285

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

‐0,001

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,425

0,445

0,465

0,485

0,505

0,525

0,545

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

123

G2C27

‐5,00E‐04

0,00E+00

5,00E‐04

1,00E‐03

1,50E‐03

2,00E‐03

2,50E‐03

0,14

0,145

0,15

0,155

0,16

0,165

0,17

0,175

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorban

tie

Temperatuur (°C)

124

Engelstaligesamenvatting

1

Structure and stability of native and modified deoxyoligonucleotides

D. Buysta, B. Van Gassec, V. Gheerardijnb, Prof. Dr. A. Madderb and Prof. Dr. J.C. Martinsc

a Department of Organic Chemistry, Ghent University, 9000 Ghent , Belgium

bLaboratory for Organic and Biomimetic Chemistry, Department of Organic Chemistry, Ghent University, , Krijgslaan 281 (S4) 9000 Ghent, Belgium

cNMR Structure Analysis Unit, Department of Organic Chemistry, Ghent University, , Krijgslaan 281 (S4) 9000 Ghent, Belgium

In the development of a new class of serine protease mimics, DNA has been considered as a suitable scaffold. Through the introduction of modified building blocks, the necessary chemical functionalities will be introduced. This work aims to validate the stability and integrity of the scaffold, starting from the main question: which sequence should one choose for the design of a suitable mimetic of the serine protease catalytic site? To be able to achieve this, five alternative DNA sequences, including the reference design, will be investigated and characterized by NMR.

Keywords: Serine protease mimic, NMR temperature study, DNA sequence stability and behavior in solution, DNA melting temperatures

Introduction

The development of artificial catalysts which mimic enzymatic activity has always been a very challenging area of research. For example, proteases have been intensively studied because of their unequalled capacity for the hydrolysis of amide and peptide bonds under mild conditions. One such enzyme is α-chymotrypsine [1]. The active site of this type of enzyme is realized through the cooperation between three different amino acids: Ser195, His57 and Asp102. These three residues show a unique collaboration through a mutual hydrogen bonding network. This network is also referred to as the so called “catalytic triad” and is depicted in figure 1 [2].

Figure 1. Catalytic triad, from α-chymotrypsine with a charge stabilization mechanism

DNA used as a new type of scaffold This work is part of a broader project, which aims to develop a new type of enzyme mimic based on a DNA scaffold equipped with the functionalities of peptide chains by insertion of suitable modified building blocks. This approach combines both the predefined structural organization of the DNA duplex and the presence of the functionalities which form the catalytic site. In this case, the active site is constructed

2

through two single strands of DNA, each 14 nucleotides long and carrying the necessary modified building blocks in the middle of each sequence. The exact orientation and mutual incorporation of each functionality were investigated through preliminary modeling studies, made available by Prof. Dr. Bifulco at the University of Salerno. The envisaged mimic system can be seen in figure 3. The need for a T-T mismatch is a consequence of the fact that in the first stages of this research only thymines can be used in the synthesis for reasons of synthetic accessibility.

Screening of alternative sequences by NMR temperature studies The central “core” of the DNA sequence used in the mimic system, containing the T-T mismatch, is fixed, this in order not to compromise the necessary proximity between the active site functionalities. The other base pairs however can be replaced. The main objective of this research is to find a sequence which is optimal in terms of NMR. Through this technique, the DNA imino protons of the different sequences will be observed over a wide range of temperatures. The two main principles which are of importance in this study are the stability of the sequence and the signal resolution with a minimal amount of signal overlap in order to facilitate the interpretation of the NMR data. Complementary to these NMR studies, melting points of every sequence will be recorded by UV-VIS spectroscopy and will be correlated to the observations in the temperature study.

Experimental Part

All studied DNA duplexes were purchased as single strands (IDT DNA Technologies, Leuven, Belgium). All measurements were performed on a Bruker Avance type II 700MHz spectrometer, equipped with a triple resonance inverse (TXI) probe together with Z-gradients and a BTV3000 Eurotherm unit for temperature control. The pulse sequences and parameters used can be found in chapter 2. The melting temperatures of the sequences were measured on a UV-VIS Varian spectrophotometer with 900µl measuring cells. The different utilized sample treatment protocols and used reagents and synthesis protocols can be found in chapter 2.

Results and Discussion

As a starting point, the different sequences are subjected to a temperature study. Here a 1D 1H spectrum is measured starting at 5°C and gradually higher temperatures until the imino-protons are no longer visible. The next step consist of a 2D NOESY measurement at the temperature which is the most beneficial in terms of signal intensity and resolution. This spectrum is then used to identify the different imino-protons and correlate them to the base pairs in the sequence. Using this data, temperature coefficients are calculated for each imino signal. Next, the maximum temperature at which each imino signal remains visible is recorded and a profile of the evolution of the T2*-time is constructed by using the full width at half maximum (FWHM) of each signal. The theory accompanying these

Figure 2. Default DNA sequence with the active site depicted in bold

5’-GACCATSerTHisTSerGCAGCG-3’3’-CTGGTA A TAspCGTCGC-5’

3

measurements can be found in chapter 5. The typical analysis will be illustrated for the wild type sequences with results for all duplexes being summarized at the end of this paragraph. The complete more detailed description of the analysis can also be found in chapter 5. Temperature study wild type In figure 4 an overview can be found of the actual temperature study. The assignment is also depicted in the spectrum recorded at 25°C that has the best signal resolution. At this temperature, 13 imino protons are visible, corresponding to 12 basepairs since the mismatch gives rise to two distinct separate signals around 10 and 11 ppm. Comparing this to the other sequences measured, there is no sequence which gives rise to better spectra in terms of resolution. In some cases, the number of imino protons is equal but when this is the case, the signals tend to overlap more in the overall temperature range studied. The signals of the wild type all uniformly disappear at 60°C; at this temperature the base pairs spend sufficiently enough time in an open state for the imino protons to be in a regime of fast exchange with the solvent. Since the melting temperature of this sequence is about 48,6°C, one could expect that the disappearance of the different imino signals is most likely due to the fact that the duplex itself is no longer sustained and the main part of the sample will be present in the form of single strands. This melting temperature corresponds quite well with 45 to 55°C interval where the imino region collapses, the maximum temperature at which the different signals are still marginally visible being 55°C. Overall, there is a good agreement between the melting temperatures measured for each duplex by UV and the temperature at which the imino protons are no longer visible. When an extra GC base pair is introduced in the sequence, (G2C27, C2G27 & G5C24 duplexes) a significant rise of ~5 °C is observed in the melting temperature but the effect is not sufficient for this alternative sequence to be preferred over the wild type. Temperature coefficients can be calculated base on the chemical shift of the imino protons in function of temperature. These values allow us to be able to determine in a

5°C

15°C

25°C

35°C

45°C

55°C

60°C

T6G16

G12

T18

T27T7 T24

G9G19

G25 TT(1) TT(2)

G26

Figure 4. Overview temperature study wild type

Figure 3. Sequence of wild type duplex


4

qualitative way, to which degree the exchange with the solvent increases as the temperature rises.

TABLE I. Temperature coefficients of the imino protons in the wild type duplex. Base TC (ppb/K) Deviation T 6 T 24 T18 T 7 & T 27 TT(1) mismatch G 9 G16 G 25 G 19 G 26

-6,40 -6,20 -5,30 -4,60 -4,00 -3,10 -2,60 -2,60 -2,20 -2,20

0,06 0,13 0,05 0,58 0,16 0,10 0,16 0,06 0,04 0,16

G 12 -1,90 0,08 TT(2) mismatch -0,70 0,08

As can be seen from Table 1, all coefficients have a negative sign, which implies that the degree of exchange, i.e. the fraction of base pairs that are in the open state increases as the temperature rises. Thus there is an evolution of a regime of slow exchange to a regime of fast exchange on the NMR timescale for the imino signals. One last aspect which is not accounted for is the difference in population between the solvent and exchangeable imino-protons: due to the large excess of waterprotons, the linewidth of the imino-protons is more sensitive to the exchange process such that their signals disappear sooner than can be expected in the case of equal populations. These temperature coefficients are also a valuable tool for comparing the behavior of the different sequences in function of the temperature. A nice example of the value of this analysis is the observation of the inverted behavior of the imino-protons, corresponding with the T-T mismatch, when the adjacent GC base pair is flipped. This observation suggests that general behavior of the T-T mismatch is, to a big extent, determined by the π-π interaction with its neighbor. The last analysis that can be made, is the evolution of T2* as a function of temperature. In normal behavior there would be an increase in the T2* in general as the temperature rises, considering that the mechanism of dipolar relaxation is the dominant one. As can be seen in figure 5, which depicts a selection of followed signals, this is the case for a long temperature range until a certain temperature at which a maximum is achieved. After this the T2* values suddenly decrease until the signals broaden beyond detection. This sudden change is the consequence of an

0,002

0,007

0,012

0,017

0,022

0,027

0 20 40 60

T 2*‐time (s)

Temperature (°C)

T18

T6

T24

TT(1)

TT(2)

Figure 5. Overview T2* evolution in function of temperature

5

increasing line broadening effect contributed by the chemical exchange of the imino protons with the solvent. This gives us an additional tool to investigate the impact on the general base pair behavior when a changes are introduced in the sequence. This analysis is carried out on all the alternative sequences and as such they are also compared to each other in order to see if an optimal sequence can be defined. It shows that there is no evidence that the default wild type sequence should be discarded in favor of an alternative sequence. The temperature at which the maximum in T2* is reached, is one of the highest values. This indicates that the contribution of exchange only becomes predominant in the temperature range (>45°C) where the duplex is no longer completely sustained and there is already a considerable fraction of single strands present.

Summary

During this research project, an investigation was performed to define the best DNA sequence in terms of stability and resolution,in terms of NMR-spectroscopy, that could be used to develop a serine protease mimic. As the different sequences were analyzed and compared to one another, the most ideal duplex remained the default sequence used in the proposed mimic system. It is also demonstrated that NMR is a convenient technique to study the behavior of each sequence in solution at the level of the individual base pair as well as to get an idea of the stability of the duplex itself since there are good resemblances between the melting temperature and maximum observable temperatures in NMR. The results of additional investigations, which included the use of cryorestriction to explore the subzero temperature regime in NMR as well as the synthesis and incorporation of a histidine mimicking nucleotide were also performed and a reported in chapters 5 and 6 respectively.

Acknowledgments First of all, I would like to thank Bjorn Van Gasse and Vicky Gheerardijn, my courageous and fearless mentors during this research. I would also like to thank Prof. Madder en Prof. Martins for giving me the possibility to perform this research and their availability when I had any problems or questions. Last but not least, I would like to thank Katrien and Tim for helping me with the practical side of everyday work and teaching me some new and handy practical skills. The 700MHz is part of the interuniversitary NMR faculty jointly operated by UGent, UA en VUB.

References

1. Catry, M.A. and A. Madder, Synthesis of functionalised nucleosides for incorporation into nucleic acid-based serine protease mimics. Molecules, 2007. 12(1): p. 114-129.

2. Hedstrom, L., Serine protease mechanism and specificity. Chemical Reviews, 2002. 102(12): p. 4501-4523.

De structuur en stabiliteit van natuurlijke en …...o.a. met de fameuze ‘contaminatie’, stond...

Documents

Transcript of De structuur en stabiliteit van natuurlijke en …...o.a. met de fameuze ‘contaminatie’, stond...