De kracht van immunogenetica in 2014 bij de diagnose van HLA-geassocieerde ziektebeelden en

transfusie gerelateerde problemen”

Emonds Marie-Paule, HILA

03 juni 2014 Gent

Goals presentatie vandaag

− Rol van Immunogenetica begrijpen & verhouding tot antropogenetica

− Meerwaarde van HLA typering bij HLA geassocieerde aandoeningen & hoe “multifactorieel” stilaan inhoud krijgt

− Toegevoegde waarde van typering bij NAITP

− Toegevoegde waarde van RBC typeringen

Overzicht

Adaptieve Immuunresponse

Bestudeert het verband tussen genetica & de immuunresponse.

Is een subcategorie van de constitutionele genetica

In geval van auto immuunziekten die een complexe entiteit zijn met multifactoriële en ook genetische factoren kan de immunogenetica bijdragen tot

− De ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen

− Het ontrafelen van het mechanisme dat aan de basis ligt van deze aandoeningen.

− Ondersteuning van de diagnostiek

Immunogenetica

Genetische diversiteit & verschillen die aanleiding geven tot antistoffen

− Orgaantransplantatie

• ABH & HLA

− Moeder/kind

• ABH, HPA, Rh, andere RBC gensystemen

− Transfusieproblemen

• ABH, HPA, Rh, andere RBC gensystemen

Genetische diversiteit & antigenpresentatie

− Stamceltransplantatie

• HLA (genotypische identiteit) / GVHD / immuunreconstitutie

− Ziekte associaties

• HLA & andere gensystemen betrokken bij de immuunreactie

− Drug hypersensitiviteit

• HLA & andere gensystemen betrokken bij de immuunreactie

Immunogenetica in HILA

B

A

Type voorbeeld:

− ABACAVIR & HLA-B*57:01

• AIDSREMMER

• Ernstige anafylactische reacties

• HLA molecules hebben sleutelrol in

> Antigenherkenning (door presentatie van peptiden aan T cellen)

> Presentatie van antigen aan T cellen

Drug hypersensitiviteit

RR (ratio in populatie die HLA antigen heeft vs niet heeft)

PPV (kans dat de patient met een positieve test ook de aandoening heeft)

Typeringsmethoden

Real Time PCR LR of HR Light cycler

Luminex principe

xMAP™ bead technology:

iedere bead heeft

een eigen identiteit

• xMAP™ bead

technology:

iedere bead is gecoat

met een specifiek product

Generisch & automatiseerbaar zowel HR als LR typering

Bead reactiviteit

Bead identificatie

2.2 HLA: techniques – HLA typing : SSO ___________________________________________

2.1 HLA: techniques – HLA typing : SSP ___________________________________________

More SSPs on one strip (8 reactions)

or on a plate (96 reactions)

Ex: combitray

Ampliconpatron on agarose gel gives the identification:

Commercieel beschikbaar ovv generische lage

resolutietest of ovv test set per aandoening

Dit is een methode die vaak wordt gebruikt voor HLA-B27 typering (2 primersets

volstaan) & aangeboden door firma’s specifiek voor bepaalde aandoeningen.

Ook mogelijk ovv Real Time PCR

Type voorbeeld Ankyloserende spondilitis

(HLA-B27)

Ziekte associaties

Ontsteking

littekenweefsel gevormd dat de ruimte tussen

twee beenderen (bijvoorbeeld wervels) opvult. ->

bamboospine

SA veroorzaakt soms de typische verstijving van

de nek en de rug.

Pijn & typische houding door de verstijving met

bewegingsbeperking.

Meestal zijn het de gewrichten van de rug en het

bekken die aangetast worden.

Multifactorieel – Wat is verband met HLA?

− Vb Hemochromatosis (associatie met HLA-A3,B14)

• Owv lokatie van hemochromatose gen tussen HLA genen

• Nu gebeurt directe typering van het polymorfisme in het hemochromatose gen (HFE gen voor type 1).

• Verband met immuunsysteem

> Ja owv het belang van Fe in innate immuunresponse & granulocyte functie

Geldt dit ook voor Ankyloserende spondilitis SA & HLA-B27?

Multifactoriële aandoeningen & HLA

HLA-B27 positive first-degree relatives of AS cases

− are 5.6–16 times more likely to develop disease themselves than HLA-B27 positive carriers in the generalcommunity (Calin et al., 1983; van der Linden et al., 1983).

− Identical twins are much more likely to be concordant for AS (60–75%)than HLA-B27-positive dizygotic twins (24%)

Ankyloserende spondilitis

Ubiquitination, aminopeptidases & MHC class I presentation -> important role

− The proteasome degradeert eiwit

• recycleert de resulterende producten

of

• De peptides kunnen gepresenteerd worden via de MHC class I molecules aan het celoppervlak.

Ubiquitination (bereid eiwitten voor op afbraak) & speelt een belangrijke rol in de bepaling welke antigenen zullen gepresenteerd worden aan het immune systeem.

Ankyloserende spondilitis

Two loci (chromosomes 5p15 and 17q21) containing genes encoding four aminopeptidases have now been implicated in AS aetiology (International Genetics of Ankylosing Spondylitis

et al.,2013).

ERAP1 and 2 are resident in the endoplasmic reticulum (ER) and are an integral part of the MHC class I presentation pathway.

Ankyloserende spondilitis

Roles of ERAPs in the regulation of immune responses.

Hattori A , and Tsujimoto M J Biochem 2013;154:219-228

© The Authors 2013. Published by Oxford University Press on behalf of the Japanese

Biochemical Society. All rights reserved

Multifactorieel – Wat is verband met HLA?

- omgevingsfactoren

• Peptiden uit bepaalde E-Coli stammen

− Immuun genetische aspecten

• Antigen processing: ERAP-1

• Antigen herkenning & presentatie: HLA klasse I polymorfisme – HLA-B27

• Effector mechanisme

Ankyloserende spondilitis

Once peptides have been processed through the proteasome,

the Transporter associated with Antigen Processing (TAP) takes the

resultant peptide from the cytoplasm into the ER.

ERAP1 and ERAP2 then trim any N-terminally extended peptides longer

than 9 amino-acids down to that length (Chang et al., 2005; York et al.,

2002),

which is the favoured length for subsequent loading onto MHC classI

molecules such as HLA-B27.

-> HLA-B27 type is direct betrokken in de pathogenese,

doch op zich een onvoldoende voorwaarde voor

ontwikkeling van de aandoening (lage PPV).

Narcolepsie

- neurological disorder characterized by excessive daytime sleepiness, cataplexy,

hallucinations, sleep, paralysis, and disturbed nocturnal sleep patterns. (freq: 0,02

– 0,067 %)

-specific loss of hypothalamic hypocretin (orexin) producing neurons in the lateral

hypothalamus.

An autoimmune basis for the disease has long been suspected based on its strong

association with the genetic marker DQB1∗06:02.

Narcolepsy with hypocretin deficiency is associated with:

-human leukocyte antigen (HLA) and

-T cell receptor (TCR) polymorphisms, targeting a peptide unique to

hypocretin-producing neurons via specific HLA-peptide-TCR interactions.

Arguments: increase of childhood narcolepsy in 2010 following the 2009 H1N1

pandemic (pH1N1) in China and vaccination with Pandemrix, an adjuvanted H1N1

vaccine that was used in Scandinavia.

-

Narcolepsie – pathogenese

Crossreactive T cells

Molecular mimicry at the

MHC/TCR synapse (bvb H1N1

of Strept. Pyogenes met

hypocretin neuron auto

antigens)

DQA1*01:02/DQB1*06:02

HLA-DQB1*06:02

− > 85% van patienten met Narcolepsie & Cataplexie zijn positief voor DQB1*06:02 (hoge RR)

− Slechts 40% van patienten zonder cataplexie zijn eveneens DQB1*06:02 positief (lage PPV)

− 12%-38% van de populatie zijn positief voor DQB1*06:02.

− Diagnose van Cataplexie als symptoom van Narcolepsie is duidelijk zonder DQ typering

− > waarde van screening is eerder beperkt

wel vereiste parameter voor terugbetaling bepaalde therapie. (nog gebaseerd op oude nomenclatuur & linkage : DR2, DR15,DQ1,DQ6)

Rol van HLA in Diagnose van Narcolepsie

Auto immune aandoening die dundarm aantast, getriggerd door inname van GLUTEN.

Sterke linkage met:HLA- DQA1*05:01/DQB1*02:01 (sommige DQ2) & DQB1*03:02 (DQ8)

Ook associatie met andere auto immuunziekten

Rol van Gliadine antistoffen in pathogenese is niet duidelijk

Anti-tissue transglutaminase 2 antistoffen

Potentieel andere genen (reeks gekend maar nog niet volledig ontrafeld)

Verband met o.a.:

− Diabetes Mellitus

− Dermatitis herpetiformis

− Vitamine D deficientie

Ref: Curr Allergy Asthma Rep.(2013) 13: 347-353

Coeliakie

-> Birdshot retinopathie & HLA-A29 (HLA-A*29:02): RR 50-224

− 70-97 % van patienten met Birdshot Retinopathie zijn HLA-A29 positief

− 7% van de bevolking is HLA-A29 positief

− Ziekte is erg zeldzaam. PPV is dus erg laag

− Pathogenetische rol niet gekend

Uveitis – Rol van LR HLA typering

ABD (Adamantaides-Behçet ziekte)

-> HLA-B5 (B51)

− Geen echte rol in diagnose of prognose

− Regio gebonden (Japan, Turkije, Duitsland & Griekenland)

− Zijderoute

− Pathogenetische rol niet gekend

Uveitis – Rol van LR HLA typering

Andere oogaandoeningen geassocieerd aan:

− HLA-DRB1*04:05/10

− HLA-B27

Globaal:

HLA typering (niet enkel HLA-B27,A29,B51) is nuttig bij anterior, intermediate & posterior uveitis; doch niet conclusief & vooral belangrijk om pathogenese te begrijpen.

HILA voelt generische test uit die per locus alles in 1 bepaling opneemt.

Uveitis – Rol van LR HLA typering

Diabetes Mellitus

Rheumatoide Arthritis

…..

Andere

Geen RIZIV terugbetaling

B*57:01 tot voor kort door Firma. Nu Genetica?

HLA-DQB1*06:02 & HLA-B*57:01: companion tests

− Voorwaarde voor terugbetaling van medicatie

Standaardtarieven DvB

− 87 Euro per locus Lage resolutie (A, B, DRB1)

− 175 Euro per locus Hoge resolutie (DQB1)

Voor een aantal aandoeningen zoals voor Uveitis & Narcolepsie met Cataplexie wordt het eerder gezien als hulp bij ontrafelen mechanisme dan bij diagnostiek.

RIZIV en kosten

Genetische diversiteit & verschillen die aanleiding geven tot antistoffen

− Orgaantransplantatie

• ABH & HLA

− Moeder/kind

• ABH, HPA, Rh, andere RBC gensystemen

− Transfusieproblemen

• ABH, HPA, Rh, andere RBC gensystemen

Genetische diversiteit & antigenpresentatie

− Stamceltransplantatie

• HLA (genotypische identiteit) / GVHD / immuunreconstitutie

− Ziekte associaties

• HLA & andere gensystemen betrokken bij de immuunreactie

− Drug hypersensitiviteit

• HLA & andere gensystemen betrokken bij de immuunreactie

Immunogenetica in HILA

Bloedplaatjes immunologie

− Neonatale trombopenie

− Refractoriteit aan bloedplaatjes

− Post Transfusie purpura

Rode Bloedcel immunologie

− Auto immune hemolytische anemie

− Congenitale hemoglobinopathien

− HFA (high frequency antigens)

Transfusie & Zwangerschap geassocieerde allo-immuniteit

neonatale allo immune cytopenie (vb NAITP)

Moeder O /partner A of B of AB

Moeder Rhesus neg /partner Rhesus pos

Moeder Kell neg /partner Kell pos

Moeder HPA-1a neg /partner HPA-1a pos

HLA

Presentatie:

− Intracraniële bloeding tijdens zwangerschap

− Neonatale trombopenie (petechiën & mucosale bloedingen )

Diagnose: detectie van anti-HPA-1a antistoffen bij mama & HPA-1a typering baby & mama negatief.

Voorkomen:

− Frequentie : 1/1000 geboorten in W.Europa

• 50% met bloedingen

• 10% ICH

NAITP

NAITP (neonatale allo immune trombopenie) - focus op aan-/afwezigheid van HPA- antistoffen

− Meestal: anti-HPA-1a antistoffen (sterk reactief)

• >90% is DRB3*01:01 positief (

• Frequentie van afwezigheid HPA-1a (HFA) : < 2% in populatie W.Europa

− HPA-1a typering mama vervolledigt diagnose

− Prenataal advies volgende zwangerschap:

• HPA typering partner vereist

HPA-typering & NAITP

DRB3*01:01 is geassocieerd aan sterk reactieve HPA owv “adequate antigen presentatie door dit HLA-antigen”

Negatieve/zwak reactieve antistoffen – neonatale trombopenie meestal milder: slechts 25% is positief voor DRB3*01:01

Predispositie

Data DvB

Strategie DvB

Aanvraagpad neonatale trombopenie (Mama, Papa, Baby)

Telkens HLA antistoffen & HPA antistoffen

HPA typering van mama, papa, baby: methode PCR-SSP (geschikt voor

uitvoeren van 1 staal / Beadchip (batch testing)

Zo mogelijk ook antistoffen bij baby.

- titers

- HLA antistoffen transplacentair bij zeer hoge titer bij mama

Diagnose

-> Follow up met behandeling IV-Ig tijdens de zwangerschap

-> transfusie met compatibele plaatjes post nataal

-> prenataal advies voor volgende zwangerschap (zygotie partner)

Nog niet voorzien op voorschriftformulier: follow up antistoftiter tijdens

zwangerschap

− HILA screent & identificeert HPA antistoffen:

• EIA werd verlaten & vervangen door Luminex methode

• geen MAIPA,

• geen immunofluorescentie (interferentie HLA antistoffen)

• geen SPR

− HILA voert HPA typeringen uit in parallel (vangt evt vals negatieve screeningen op)

• Direct, onafhankelijk van de resultaten van de antistoffen

• Deze strategie wordt soms gecontesteerd door perifere ziekenhuizen (owv “te duur” & “nodig?”).

− DRB3 typering wordt aangeboden en aangeraden maar owv “geen terugbetaling” niet standaard uitgevoerd, enkel na overleg met behandelende arts.

•

Strategie DvB (2)

Terugbetaling

Uitgebreide bloedgroepen

„bloedgroep‟: welke variatie?

- ABO

> Zeer complex / Met DNA typeer je transferases, niet hun activiteit.

− Rhesus D

> Deleties

> Crossing over (hybride)

> Inserties

> Exon duplicaties

> Alternatieve RNA splicing

- Ee, Cc en Fya/Fyb, M/N, S/s, Jka/Jkb,…

> Puntmutaties

Wat is een bloedgroep?

Rhesus D: naast RhD+ en RhD-…

Rhesus

Klassificatie D antigen fenotype

Variatie in eiwitstructuur

Gevolgen

Zwakke D kwantitatief # aminozuren intramembranair of –cellulair

Minder antigenen op RBC oppervlak Alle antigenen zijn aanwezig • patiënt: RhD pos • donor: RhD pos

Partiële D* kwalitatief # aminozuren op RBC membraan (extracellulair)

Ontbrekende RHD epitopen zijn lichaamsvreemd • patiënt: RhD neg • donor: RhD pos

Hybride CE - D

idem

idem Andere epitopen: CE • patiënt: RhD neg • donor: RhD pos

* Meer bij etnische minderheden

− Chronische transfusie

• Sikkelcelanemie

• Warme autoantistoffen

• Stamceltransplantatie

patiënten en donoren

− Bloedgroep (uitz. ABO) recent getransfundeerde patiënten

− Zwakke reacties (RhD)

− Auto- of alloantistoffen?

− Geen serologische reagentia beschikbaar

− Risico foetus op hemolytische ziekte pasgeborene

Indicaties andere moleculaire testen

Real time PCR op foetaal DNA uit materneel bloed

− Beschikbaar voor resus D

− In sommige lab‟s ook voor “c” & voor “Kell”

Standaardmethode: Foetaal DNA (afkomstig van chorionvlokken of van amniosvocht)

− Voor elk RBC antigen waarvoor standaardmethode beschikbaar is

− Voor HPA antigenen,

− ……………….

Terugbetaling?

Prenatale typering

RIZIV

555015 – 555026 B 150

Bepalen van bloedgroepen ABO-RH1 (maximum 1)

555030 – 555041 B 250

Bepalen van RH fenotype (antigenen RH2 C, RH3 E, RH4 c RH5 e) (maximum 1)

555052 – 555063 B 125

Opsporen van een zwak RH1 fenotype (maximum 1)

Diagnoseregel 23: enkel igv RhD negatieve zwangere vrouwen en pasgeborenen van RhD negatieve moeders.

Terugbetaling

RIZIV

55772 – 554783 B 150

Bepalen van andere erythrocyten antigenen dan ABO en RH. Per bepaald antigen (maximum 16)

Diagnoseregel 33: enkel igv onregelmatige antistoffen, igv orgaan, stamcel of beenmerg transplantatie of igv chronische anemie die veelvuldige transfusies vergt gespreid over meerdere maanden.

Terugbetaling

DNA typering RBC

Aangerekend ten laste aanvragend labo (onderaanneming) – patient (hoofdaanneming)

Niet -Terugbetaald

In principe permanent gegeven.

Enkel nog IH nodig voor opvolging medische pathologie

Geen nood aan vooraf opsturen van stalen voor differentiële allo adsorptie (om de 8 dagen indien transfusie) – Spaart vaak 2 transporten H/T naar IH-labo‟s

Bloed direct beschikbaar (geen 24h vertraging)

Organisatie dagziekenhuis (slechts 1 opname vereist)

Actueel nog niet aanvraagbaar via standaardformulier

Verrekening

Immunogenetica

− Geneesmiddelen overgevoeligheid - Abacavir

− Ziekte associaties - AS

− Allo immune cytopeniën

• HPA - NAITP

• RBC

− Genetische polymorfismen met invloed op bloedtransfusiestrategie

Samenvatting