CLASIFICACIÓN DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN ...eprints.uanl.mx/18070/1/2015 - 2019 Dr. Luis...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE MEDICINA

“CLASIFICACIÓN DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN

DIFUSOS DE CÉLULAS GRANDES B EN BASE AL

ALGORITMO DE HANS Y AL ESTADO DE MYC Y BCL-2

POR ESTUDIOS DE IHQ Y FISH”

Por

DR. LUIS ARTURO ACOSTA CALDERÓN

COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE ESPECIALISTA

EN ANATOMÍA PATOLÓGICA

FEBRERO 2019

3

TABLA DE CONTENIDO

CAPITULO I:

1. RESUMEN………………………………………………………………………………………….6

CAPITULO II:

2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………7

2.1 CD 10, BCL-6 Y MUM-1 COMO MARCADORES DE IHQ………………………7

2.2 CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS LINFOMAS DE CÉLULAS

GRANDES B………………………………………………………………………………………………8

2.3 IMPORTANCIA DE LA CLASIFICACIÓN MOLECULAR…………………………10

2.4 LINFOMAS B DE ALTO GRADO………………………………………………………..10

2.5 LINFOMAS DOBLE EXPRESORES………………………………………………………13

2.6 USO DE INUMOHISTOQUÍMICA PARA DETECCIÓN DE PROBABLES

LINFOMAS B DE ALTO GRADO…………………………………………………………………13

CAPITULO III:

3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………..15

CAPITULO IV:

4. OBJETIVO…………………………………………………………………………………………16

4.1 OBJETIVO SECUNDARIO…………………………………………………………………16

CAPITULO V:

5. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………………….17

5.1 HIPÓTESIS NULA……………………………………………………………………………17

CAPITULO VI:

6. MATERIAL Y METODOS……………………………………………………………………18

6.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN………………………………………………………………18

6.2 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN……………………………………………………………..18

6.4 CRITERIOS DE ELIMINACIÓN………………………………………………………….19

6.5 METODOLOGÍA DEL ESTUDIO………………………………………………………..19

CAPITULO VII

7. RESULTADOS…………………………………………………………………………………23

CAPITULO VIII

8. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………33

CAPITULO IX

9. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………….36

4

CAPITULO X

10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………….37

CAPITULO XI

11. RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO………………………………………………………...46

5

LISTA DE ABREVIATURAS

LNH: Linfoma No Hodgkin

LBDCG: Linfoma B de células grandes

FISH: Hibridación fluorescente in situ

LBDCG NOS: Linfoma B de células grandes “Not Otherwise Specified”

R-CHOP: rituximab, ciclofosfamida, clorhidrato de doxorubicina

(hidroxidaunorubicina), sulfato de vincristina (Oncovin) y prednisona

R-ECHOP: rituximab, etopósido, ,,ciclofosfamida, clorhidrato de

doxorubicina (hidroxidaunorubicina), sulfato de vincristina (Oncovin) y

prednisona

6

CAPITULO I

1. RESUMEN

Luis Arturo Acosta Calderón Fecha de graduación: Febrero, 2019

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Medicina

Título del estudio: CLASIFICACIÓN DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN

DIFUSOS DE CÉLULAS GRANDES B EN BASE AL ALGORITMO DE HANS Y

AL ESTADO DE MYC Y BCL-2 POR ESTUDIOS DE IHQ Y FISH

Número de páginas: 45

Candidato para obtener el grado de especialista en Anatomía Patológica

Área de estudio: Anatomía Patológica

Propósito y Método del estudio: El linfoma B Difuso de Células Grandes

(LBDCG) es el linfoma más frecuente a nivel mundial, estos pueden ser

clasificados molecularmente (derivado del centro germinal y post

germinal) utilizando marcadores de inmunohistoquímica para CD 10, BCL-

6 y MUM-1, además es posible buscar el estado doble receptor (

positividad para inmunohistoquímica para BCL-2 y MYC) y los rearreglos

de BCL-2 y/o BCL-6 con MYC mediante técnica de FISH, todo esto con

impacto pronóstico en la sobrevida del paciente. En el presente trabajo se

estudiaron 80 casos de linfomas B de células grandes, realizando su

clasificación molecular, buscando el estado doble receptor, aquellos casos

que resultaron doble receptor fueron sometidos a búsqueda de los

rearreglos de BCL-2, BCL-6 y MYC, mediante estudios de FISH

Contribuciones y conclusiones: Los casos fueron clasificados según el

algoritmo de Hans, se lograron identificar 19 casos de linfomas doble

expresores y 5 linfomas B de alto grado, este estudio demuestra que es

posible realizar la clasificación molecular solo usando MUM-1, CD 10 y

BCL-6, la base de datos obtenida en este trabajo puede ser utilizada en el

futuro para nuevas investigaciones

7

FIRMA DEL DIRECTOR DE TESIS:

CAPITULO II

2. INTRODUCCIÓN

El Linfoma No-Hodgkin (LNH) es una neoplasia del linaje linfoide, que el

cual entre las neoplasias malignas ocupa el décimo lugar de incidencia a

nivel mundial y se estima que para el 2020 aumente un 20%. En México el

LNH representa la novena neoplasia maligna en incidencia y la décima en

mortalidad. Entre los LNH el Linfoma B Difuso de Células Grandes

(LBDCG) es el linfoma más frecuente a nivel mundial (3) con una sobrevida

a 5 años de aproximadamente 30 al 80% (11). Se presenta como una

neoplasia heterogénea y clínicamente agresiva con variantes morfológicas

y características genéticas diversas. Estas neoplasias pueden presentarse

como tumor primario en ganglio (nodal) en el 68.4% de los casos y

extranodal en el 31.6%(11).

2.1- CD 10, BCL-6 Y MUM-1 COMO MARCADORES DE IHQ

El CD 10 es una glicoproteína de superficie con actividad de endopeptidasa neutra (60,61), se expresa en una variedad de células hematolinfoides, incluyendo precursores linfoides, linfocitos B del centro germinal y los granulocitos (62,63). Aunque el CD 10 no es específico de linaje, es un marcador útil debido a que es expresado en la gran mayoría de los linfomas del centro folicular, en linfomas de Burkitt y un subconjunto de linfomas difusos de células grandes B. El CD 10 puede ser detectado mediante citometría de flujo multiparámetro con una sensibilidad del 98% y especificidad del 95% para linfomas foliculares de bajo grado contra algún otro tipo de linfoma de células pequeñas (64). Existen marcadores de inmunohistoquímica para CD 10 que pueden ser utilizados en tejido fijado en parafina, Xu et al. compararon la expresión de CD 10 mediante citometría de flujo y análisis de inmunohistoquímica en casos de linfomas difusos de células grandes B, encontrando que el marcador de inumonohistoquímica tiene una sensibilidad del 75% (65).

8

MUM-1 es un miembro de la familia de los interferones reguladores de los factores de transcripción específico de linfocitos (67), el interés de la molécula surgió al evidenciar que la pérdida de función de MUM1 resulta en la ausencia de células linfoides y de células plasmáticas secretoras IgG (68), después de varios estudios (69) se llegó a la conclusión de que quizás la expresión de MUM-1 denote el paso final en la diferenciación de la célula del centro germinal, este reacciona con la mayoría de los LBDCG que además frecuentemente expresan BCL-6, lo que sugiere que una gran fracción de estas entidades pueden estar relacionadas a las fases tardías de la maduración de las células B (69). El gen de BCL-6 localizado en el cromosoma 3q27 codifica una proteína de unión con actividad transcripcional represora que parece estar involucrada en la supresión del crecimiento (73), en los tejidos linfoides, BCL-6 se expresa en las células B del centro germinal en los folículos secundarios tanto en la zona obscura (rica en centroblastos) y la zona clara (rica en centrocitos) (74). Algunos autores han sugerido que la expresión de BCL-6 mediante estudios de inmunohistoquímica es un factor pronóstico en los LBDCG pero otros han contradicho esto (75,76,77). En un estudio realizado por Colomo et al. (78), BCL-6 fue expresado en 91% de los casos de LBDCG (23% solo BCL-6 y 49% con otros marcadores), el grupo de pacientes con expresión restringida de BCL-6 se presentaron con en un estadio más temprano, un índice internacional de pronóstico de bajo riesgo y valores normales de DHL, sin embargo, aunque este grupo de pacientes tiene la taza de sobrevida más alta, la diferencia no alcanzó a ser estadísticamente significativa. En una revisión realizada por Mahmoud, H. M., & El-Sakhawy (79) indican que en general los casos con positividad para BCL-6 tienen mejor pronóstico.

2.2 CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS LINFOMAS DE CÉLULAS

GRANDES B

Mediante los perfiles de expresión génica los LBDCG pueden ser clasificados en subtipos biológicos con impacto pronóstico basados en la célula de origen, siendo el perfil de célula B activada (post-germinal) asociado con peor pronóstico a comparación del subtipo de tipo centro germinal , sin embargo, debido a que los perfiles de expresión génica no son posibles de realizar en tejido incluido en parafina y además requieren tejido fresco, se han usado a algoritmos con marcadores de inmunohistoquímica para determinar su célula de origen, siendo los

9

Figura 1: Algoritmo de Hans

resultados de estos algoritmos variables (2). Hans et. al. elaboraron un algoritmo para determinar el perfil de célula B activada y el perfil de centro germinal, usando 3 marcadores de inmunohistoquímica para CD 10, BCL-6 y MUM-1, al ser comparados con los microarreglos de cDNA, el panel de inmunohistoquímica reprodujo los resultados de la expresión genética en 71% de los linfomas de centro germinal y 88% de los linfomas de tipo célula B activada, siendo este el primero estudio que correlacionó la subclasificación por la expresión génica con la subclasificación mediante la expresión de proteínas en el LBDCG B (25), el algoritmo se muestra en la figura 1.

Posteriormente Choi et al. mencionan que los resultados de varias investigaciones muestran que la concordancia entre los perfiles de expresión génica y el algoritmo de Hans es de aproximadamente del 70%, y postulan que estos resultados son probablemente secundarios a la identificación subóptima de casos del centro germinal debido a un número insuficiente de marcadores de inmunohistoquímica específicos para el centro germinal, por lo que desarrollan un algoritmo usando 5 marcadores de inmunohistoquímica: GCET, MUM-1, CD 10, BCL-6 monoclonal, FOXP-1, encontrando una correlación con los perfiles de expresión génica del 93% mientras que el diagrama de Hans de 86%, dicho diagrama se presenta en la figura 2. (66). Además de lo anterior también mencionan que al evaluar el CD 10 como marcador aislado, usando un punto de corte de >20% de positividad para el marcador de inmunohistoquímica, se obtiene una sensibilidad del 60% y una especificidad del 95% para determinar el inmunofenotipo de centro germinal en los LBDCG (66), mientras que para MUM-1 al usar un punto de corte del 70%, se obtiene una sensibilidad del 58% y especificidad del 94% para el inmunofenotipo de célula B activada (66).

10

2.3.- IMPORTANCIA DE LA CLASIFICACIÓN MOLECULAR

La clasificación de los LBDCG en derivado del centro germinal o post germinal tiene impacto pronóstico, los casos derivados del centro germinal se considera tienen mejor pronóstico que los post germinales, en la era del rituximab la sobrevida a 5 años para los casos del centro germinal es del 87-92% a comparación de 44% para aquellos post germinales (66,80). Esta clasificación molecular fue incluida en el 2008 por la OMS, la cual reconoció los sub-grupos del centro germinal y postgerminal basado en el algoritmo de Hans, sin embargo, como los perfiles de expresión génica no se encontraban como una prueba clínica de rutina, y como había problemas en la reproducibilidad y confiabilidad en los algoritmos de inmunohistoquímica, esta clasificación molecular se consideraba opcional en la clasificación del 2008 (81), sin embargo, el mejor entendimiento en la patogénesis de estos 2 subgrupos ha llevado a la investigación de terapias más específicas para mitigar el peor pronóstico en aquellos casos clasificados como post-germinales que se reporta en la mayoría de los estudios, hay ensayos prospectivos en curso para determinar si estas terapias deberían ser incorporadas a la práctica clínica (82), por esta razón la clasificación revisada de 2017 requiere la identificación de estos 2 subtipos, siendo que los perfiles de expresión génica aún no son una prueba clínica de rutina, el uso de los algoritmos de inmnunohistoquímica se considera aceptable (81).

2.4.- LINFOMAS B DE ALTO GRADO

-

- Figura 2: Algoritmo de Choi

11

Kanungo y colaboradores (1), definieron un subgrupo de linfomas a los

que nombraron “linfomas doble hit”, los cuales muestran rearreglos

concurrentes entre IGH-BCL-2 y/o BCL-6, y MYC , estos se caracterizan por

ser clínicamente agresivos, presentar cariotipos complejos, así como un

amplio espectro morfológico e inmunofenotípico que se sobrepone con el

linfoma de Burkkit, linfoma de células grandes B y ocasionalmente con

linfomas linfoblasticos de tipo B (3), siendo la mayoría diagnosticados

inicialmente como “linfoma no clasificable con caracteres entre linfoma

difuso de células grandes B y linfoma de Burkitt” (26). Las 2

translocaciones más comunes son las que involucran el gen BCL-2 y el gen

MYC, la translocación t (14; 18) (q32; q21) yuxtapone BCL-2 en 18q21 con

el gen de inmunoglobulinas de cadenas pesadas en 14q32 resultando en la

sobreexpresión de BCL-2 siendo esta translocación característica del

linfoma folicular, pero que también se puede presentar en 20-30% de los

linfomas difusos de células grandes B de novo. Las translocaciones que

involucra a MYC incluyen t(8,14)(q24,q32), t (2,8)(p12;q24) y

t(8;22)(q24;q11), las cuales yuxtaponen al gen MYC en 8q24 con los genes

para inmunoglobulina de cadenas pesadas, gen Kappa y gen Lambda,

respectivamente, siendo el resultado final la sobrexpresión de MYC (5). Si

bien la translocación de MYC es característica del linfoma de Burkitt, esta

no es específica, debido a que puede ocurrir en el 5-10% de los linfomas

difusos de células grandes B, y hasta en el 50% de los linfomas B de alto

grado (6,7), los linfomas con rearreglos del gen MYC tienen peor

pronóstico y presentan pobre respuesta al tratamiento con R-CHOP

(8,9,10,11).

En 2011 Sietse M. Aukema et, al. (83) realizaron una revisión de la

literatura y artículos publicados al momento, en su artículo mencionan

que la mayoría de los linfomas doble hit muestran el rearreglo BCL-

2/MYC, pero también hay una menor proporción que presentan el

rearreglo BCL-6/MYC , al momento la mayoría de los estudios se

centraban en los linfomas con rearreglo de BCL-2/MYC y poco se podía

concluir de los linfomas BCL-6/MYC y de hecho se describen los linfomas

triple hit con rearreglo BCL-2/BCL-6/MYC , englobando la definición de

linfomas doble hit y triple hit como aquellos “caracterizados por una

translocación cromosomal recurrente en combinación con un punto de

12

quiebre en MYC/8q24”, la mayoría tiene una combinación BCL-2/MYC y la

mayoría de los linfomas BCL-6/MYC representan linfomas triple hit BCL-

2/BCL-6/MYC.

Desde el punto de vista inmunofenotípico, los linfomas doble hit expresan

antígenos de célula B, siendo que el 64-100% (la mayoría de los estudios

>80%) presenta un inmunofenotipo de tipo centro germinal a

comparación del inmunofenotipo de célula B activada (10, 31, 32, 33, 34,

35, 37,46,47,48, 49) . Los linfomas doble hit BCL-6 positivos son similares

en varias formas a los linfomas doble hit BCL-2 positivos excepto que

tienden a ser CD 10 negativos (36% vs 10%) y MUM-1 positivos (75% vs

18%), además infrecuentemente expresan BCL-2 (22% vs 92%) y pueden

llegar a tener menor complejidad citogenética (50).

El diagnóstico puede ser confirmado mediante la técnica de FISH ya sea en

tejido fijado en parafina, extendidos, improntas por toque y células frescas

en interfase o metafase, la reproducibilidad es muy alta con concordancia

entre 2 observadores mayor del 98% (44,45).

En la clasificación de 2017 de los tumores hematopoyéticos y tejidos

linfoides de la OMS, los linfomas doble y triple hit quedan agrupados bajo

el nombre de “linfomas B de alto grado” (72), reconociendo los linfomas

de alto grado con rearreglos de MYC BCL-2 y/o BCL-6, mencionando

además, que debido a que estos linfomas pueden ser indistinguibles de los

LBDCG, el estado doble/triple hit debería ser investigado en todos los

casos de LBDCG NOS, usando citogenética o estudios moleculares, que por

definición deben contar con un rearreglo en MYC (8q24.2), 65% de las

veces yuxtapuesto a uno de los genes de IG (IGH), en adición todos

contienen un rearreglo de BCL-2 en 18q21.3 o BCL-6 en 3q27.3.

Los linfomas B de alto grado muestran respuesta completa relativamente baja con la terapia R-CHOP con sobrevida media de 4.5 a 18.5 meses (72), por lo que se han propuesto terapias de inducción más intensivas, la terapia con dosis ajustada de rituximab más etopósido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida y doxorubicina (R-ECHOP) tiene mayor respuesta completa a comparación de R-CHOP, aun así 20-30% de los pacientes presentan enfermedad primaria refractaria por lo que es necesaria realizar ensayos clínicos con prueba de nuevas terapias (70).

13

2.5.- LINFOMAS DOBLE EXPRESORES

Los LBDCG que expresan por inmunohistoquímica MYC y BCL-2 son llamados linfomas doble expresores o doble proteína y están asociados con parámetros clínicos de mayor agresividad, tienen frecuentemente factores independientes de mal pronóstico comparados con otros tipos de linfomas difusos de células grandes B, aunque no son tan agresivos como un linfoma doble hit (35, 37, 55, 56), hay que reconocer además que un linfoma doble proteína no es lo mismo que un linfoma doble hit, aunque 80-90% de los linfomas doble hit resultan ser doble proteína (35, 37), Hasta 19-34% de los linfomas de difusos de células grandes B (34, 37,49, 57) y 20% de los casos de linfomas no clasificables con caracteres entre linfoma difuso de células grandes B y linfoma de Burkitt (58) han sido reportados con linfomas doble proteína, y a diferencia de los linfomas doble hit que se han relacionado con un fenotipo de centro germinal, los linfomas doble proteína presentan un fenotipo de tipo célula B activada hasta en el 60% de los casos (14, 35, 37). La mayoría de los estudios toman un punto de corte del 40% para tomar como positivo un estudio de inmunohistoquímica para MYC, los puntos de corte para BCL-2 han sido desde 10% a 70%, la mayoría requiriendo al menos 50% de positividad (14, 15, 34, 35, 37, 59) La importancia en reconocer los linfomas doble expresores radica en que varios estudios han mostrado que estos linfomas tienen pobre pronóstico después de la quimioterapia estándar o después de la quimioterapia de alta dosis con trasplante autólogo de células hematopoyéticas (70,71). 2.6.- USO DE INUMOHISTOQUÍMICA PARA DETECCIÓN DE PROBABLES

LINFOMAS B DE ALTO GRADO

Los estudios de inmunohistoquímica se han propuesto como estudios de tamizaje costo-efectivos para disminuir el número de estudios de FISH usados para detectar linfomas doble hit, muchos han buscado estos linfomas sólo cuando se trata de un linfoma de Burkitt o cuando un linfoma de células grandes B tienen un índice de proliferación muy alto basado en el porcentaje de positividad de Ki67%, pero ambas estrategias

14

van a pasar por alto una minoría de casos (28). Algunos casos morfológicamente semejan algún otro tipo de linfoma difuso de células grandes B y muchos tienen índice de proliferación menor del <90% y algunos aún mucho menos. Con un punto de corte de >90% la sensibilidad para detectar los linfomas doble hit es sólo de 0.54 y usando >75% sólo aumenta hasta 0.77 (51). Otra serie que buscaba solamente linfomas doble hit de tipo linfoma difuso de células grandes B encontró que sólo 7% de los linfomas doble hit presentaban un Ki 67>90% (14) . Hablando del uso de MYC por inmunohistoquímica se ha reportado que una positividad mayor del 70% tiene una sensibilidad del 100% y una especificidad del 93% para el “break” de MYC (13), otro estudio reportó que su máxima sensibilidad/especificidad fue lograda usando un punto de corte de >95%, con una sensibilidad del 91% pero solo una especificidad del 36% con valor predictivo positivo del 60% (16). Hay diversos reportes que evalúan la relación entre la presencia del rearreglo MYC y la expresión del mismo con marcadores de inmunohistoquímica: uno de estos encontró que 41% de sus casos con rearreglo del gen MYC mostraron una positividad celular menor del 50% para el marcador de inmunohistoquímica para MYC (31), otro reporta <40% de positividad en 29% casos de linfoma doble hit (14) y un último reporte menciona menos de <30% de positividad en 17% de sus casos con rearreglo de MYC (34) . Otro estudio en donde 31% de sus casos con rearreglo para MYC presentaron baja positividad para MYC por inmunohistoquímica sugiere que el estudio de FISH sólo debería ser omitido si hay menos de 20% de células positivas para MYC con sensibilidad del 92.3% (15). Se ha reportado una concordancia entre 3 patólogos del 94% en la valoración de inmunohistoquímica para MYC, considerando que existe poca variación por diferentes técnicas de fijación y técnicas en diferentes institutos (14). Bajo esta evidencia algunos sugieren que el tamizaje sea realizado en casos de linfoma de Burkitt o en casos con diagnóstico de linfoma no hodgkin difuso de células grandes B del centro germinal (52), otros recomiendan hacer tamizaje en búsqueda para rearreglos de MYC a todos los casos de linfomas difusos de células grandes B y linfomas de Burkitt (46,53) e incluso realizar FISH para BCL-2 y MYC a todos los casos nuevos de linfoma difuso de células grandes B (54). Actualmente la OMS recomienda realizar estudios de FISH a todos los

casos de nuevo diagnóstico de linfoma difuso de células grandes B en

busca de los rearreglos BCL-2/BCL-6/MYC, sin embargo, menciona en uno

de sus párrafos que algunos autores sugieren realizar los estudios de FISH

solo en casos en que MYC sea positivo por inmunohistoquímica en 30% a

40% de las células tumorales (72).

15

CAPITULO III

3. JUSTIFICACIÓN

En México no se ha realizado ningún trabajo que clasifique a los LNH de

tipo LBDCG según el algoritmo de HANS, estado doble receptor, y la

presencia de rearreglos Myc, BCL-2/BCL-6

16

CAPÍTULO IV

4. OBJETIVO

Clasificar los linfomas B de células grandes diagnosticados en nuestro

servicio en base al algoritmo de Hans en el período de tiempo de enero

2013 a junio 2016

4.1 OBJETIVO SECUNDARIO

Conocer cuántos DLBC diagnosticados en el período de tiempo de enero

2013 a junio 2016 resultan ser linfomas doble expresores y de estos

cuantos resultan tener rearreglos de MYC con BCL-2 y/o BCL-6

17

CAPÍTULO V

5. HIPÓTESIS

Todos los linfomas de células grandes B pueden ser clasificados según el

algoritmo de Hans en nuestro servicio

5.1 HIPÓTESIS NULA

Los linfomas de células grandes B no pueden ser clasificados según el

algoritmo de Hans en nuestro servicio

18

CAPÍTULO VI

6. MATERIAL Y MÉTODOS

Para la realización de este trabajo se realizó una búsqueda retroespectiva

de casos con diagnóstico de LBDCG desde el 1ero de enero 2013 al 1ero

junio 2016 del servicio de anatomía patológica y citopatología del hospital

universitario Dr. José Eleuterio González, usando como motor de

búsqueda el sistema Pathox (TesiUpDate). La población de estudio son

todos los casos resultantes de la base de datos.

6.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Todos los casos con diagnóstico de histológico de linfoma B de células

grandes que cuenten con los bloques de parafina

6.2 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN


grandes que NO cuenten con los bloques de parafina

6.3 CRITERIOS DE ELIMINACIÓN


grandes que en los que el bloque de parafina no cuenta con suficiente

material o se encuentre en mal estado

19

6.4. DECLARACIÓN DE PRIVACIDAD Y DE RESGUARDO DE MATERIAL

En ningún momento de la investigación fueron utilizadas las

identificaciones de los pacientes, solo se usó el número de registro

otorgado por parte del departamento de Anatomía Patológica y

Citopatología del Hospital Dr. José Eleuterio González, de igual forma no

se afectó el material de los pacientes, de forma que estos podrán ser

utilizados de nuevo, en caso de que se requieran estudios

complementarios que influyan en el pronóstico o tratamiento del

paciente.

6.5 METODOLOGÍA DEL ESTUDIO

Se realizó una base de datos en donde se documentó el registro usado en

nuestro servicio, el sexo del paciente, la edad, el diagnóstico original, los

marcadores de inmunohistoquímica además de los comentarios y notas

de cada caso. Se buscó intencionadamente si se realizó el algoritmo de

Hans a los casos y si quedo documentado en cada caso la clasificación

molecular, en base a esto a cada caso le fue asignada una de las siguientes

categorías:

- Casos clasificados como derivados del centro germinal

- Casos clasificados como post germinales

- Casos donde no se específica la clasificación y/o no cuenta con panel de

Hans completo y/o que no se realizó ningún marcador para la clasificación

de Hans

- Caso clasificados como alto grado y/o parecido Burkitt y/o parecido a

linfoblástico

- Casos que fueron catalogados como no clasificables

20

- 1 caso que fue catalogado como compuesto (folicular/difuso)

Posteriormente se obtuvieron los bloques y laminillas de todos los casos,

en caso de que no se contase con las laminillas de algún caso se realizaron

nuevos cortes a los bloques de parafina de los mismos

Un patólogo quirúrgico revisó todas la laminillas, seleccionó un área

representativa de donde se obtuvo un cilindro de tejido de 2 mm, con los

que se realizaron 10 histoarreglos por medio de la plataforma

automatizada TMA Master II (3D Histech), usando una muestra de

rabdiomiosarcoma de 2mm como tejido guía.

Los histoarreglos fueron teñidos con la técnica de Hematoxilina y Eosina

para corrobar que el área muestreada fuese representativa del tumor, se

realizaron marcadores de inmunohistoquímica para la expresión de CD10,

MUM-1, KI67, BCL-2, C-MYC y BCL6 usando la plataforma automatizada

Ventana Benchmark XT, con las clonas mencionadas en la tabla 1.

Anticuerpo Tipo Clona Fuente Dilución

CD10 Monoclonal 56C6 Dako

Denmark

A/S

1:100

BCL6 Monoclonal PG-B6p Dako

Denmark

A/S

1:100

Ki67 Monoclonal MIB-1 Dako

Denmark

A/S

1:500

MUM1 Monoclonal MUM1p Dako

Denmark

A/S

1:500

BCL-2 Policlonal Ab 59348 Abcam

England A/S

1:100

C-MYC Monoclonal Y69 Abcam

England A/S

1:100

Tabla 1: Marcadores de imnuhistoquímica

que fueron usados en este estudio.

21

Para la interpretación de los resultados de inmnunohistoquímica Se

tomaron como porcentajes de positividad los valores descritos en el

algoritmo de Hans, además de lo descrito en la OMS para BCL-2 y MYC

- CD 10: 30% de positividad en las células tumorales

- BCL-6: 30% de positividad en las células tumorales

- MUM-1: 30% de positividad en las células tumorales

- C-MYC: 40% de positividad en las células tumorales

- BCL-2: 50% de positividad en las células tumorales

- Además se reportó el valor de Ki67 en porcentaje para cada caso

A cada caso en particular se le otorgó la clasificación molecular según el

algoritmo de Hans de la siguiente manera

- Centro germinal: casos que resulten ser CD 10 (+) o casos que

resulten CD 10 (-), MUM-1 (-) pero BCL-6 (+)

- Post germinal: aquellos casos que resulten CD 10 (-) y MUM-1 (+) o

aquellos casos que resulten CD 10 (-), BCL-6 (-) y MUM-1 (+), o

aquellos casos que resulten CD 10 (-) , BCL-6(-) y MUM-1 (-)

- No valorables: Casos en los que no fue posible interpetar el CD 10,

casos en que CD 10 fue negativo pero no fue posible interpretar

MUM-1, casos en que CD 10 fue negativo y además MUM-1

negativo pero no fue posible interpetar BCL-6.

Además se específica para cada caso si resultó ser doble expresor o no. Se

revisaron las laminillas de los casos clasificados como doble expresores, el

mismo patólogo quirúrgico seleccionó otra área representativa del tumor,

de los casos que aún contasen con el bloque de parafina y con suficiente

material en el mismo se obtuvo otro cilindro de tejido de 2mm del cual se

realizó un histoarreglo en donde se incluyeron todos los casos de linfomas

doble proteína que aún contasen con material, por medio de la

plataforma automatizada TMA Master II (3D Histech), usando una muestra

de adenocarcinoma de colon de 2mm como tejido guía

22

A este bloque se le realizó Hibridación fluorescente in situ (FISH) con el

protocolo del servicio de anatomía patológica y citología según los

lineamientos del manual de operaciones usando las siguientes sondas:

- LSI BCL-6 (ABR) dual color break apart probe

- LSI BCL-2 dual color break apart rearrengement probe

- LSI MYC dual color break apart rearrangement probe

Se tomó como positividad para las pruebas de FISH una positividad de más

del 15% de los núcleos con señalas separadas (patrón Split). Los casos

positivos para el rearreglo BCL-2 y/o BCL-6 con MYC fueron asignados

como "Linfomas B de alto grado".

Se analizaron los resultados, dividiendo los casos por localización como

nodales o extranodales, se clasificaron los casos como derivados del

centro germinal, post germinales, y no valorables (según los criterios

antes mencionados) además de un caso que fue reclasificado como

folicular, se comparó la clasificación original de los casos antes del estudio

y posterior al estudio, finalmente se identificaron los casos doble proteína

y aquellos positivos para rearreglos BCL-2y/o BCL-6 con MYC fueron

clasificados como linfomas B de alto grado

23

CAPÍTULO VII

7. RESULTADOS

Se obtuvieron 83 casos diagnosticados como linfomas de células grandes B

de la base de datos de nuestro servicio en el período del 1 ero de enero de

2013 a 1ero de junio de 2016, 3 casos fueron excluidos debido a que 2 de

ellos se trataban de linfomas no Hodgkin foliculares de alto grado y uno de

ellos de un linfoma de Burkitt, por lo que la población de estudio es de 80

casos. El rango de edad de los 80 casos fue de 11 a 92 años con una edad

promedio de 58.75 años, 41 pacientes masculinos y 39 femeninos con una

relación hombre:mujer de 1.05:1.

Al dividirlos por localización 40 casos fueron nodales y 40 extranodales,

correspondiendo cada uno al 50% del total de los casos (Gráfica 1)

Gráfica 1 : Localización de los 80 casos (nodales y extranodales)

De los 40 casos extranodales, la localización más frecuente fue la región

de cabeza y cuello con 14 casos representando 35% de los casos

extranodales y 14% del total de los casos, a su vez el sitio más común en

cabeza y cuello fue en la amígdala con 8 casos que equivalen al 57.14% de

los casos de cabeza y cuello, 20% de los casos extranodales y 10% del

total de los 80 casos. El resto de la localización de los linfomas

24

extranodales se muestra en la tabla 2 y en la gráfica 2, también se muestra

la localización de los linfomas de cabeza y cuello en la tabla 3 y la gráfica 3

Tabla2 : Localización de los linfomas de células grandes B extranodales

Gráfica 2: Localización de los linfomas de células grandes B extranodales

25

Tabla 3 : Localización de los linfomas de células grandes B extranodales

en cabeza y cuello

Gráfica 3 : Localización de los linfomas de células grandes B extranodales

en cabeza y cuello

Antes de este estudio 39 casos (48.75% del total) de los 80 casos contaba

originalmente con una clasificiación según el algoritmo de Hans

(germinales, post germinales y no clasificables). Al analizar el diagnóstico

original junto con las notas y comentarios, los 80 casos se catalogaron de

la siguiente forma:

26

- En 30 casos (37.5% del total) no se realizó el algoritmo de Hans, o

no fue específicado en el diagnóstico o no se realizo el algoritmo de

forma completa

- 6 casos (7.5% del total) fueron clasificados como derivados del

centro germinal

- 23 casos (28.75% del total) fueron clasificados como post

germinales

- 10 casos (12.5% del total ) fueron clasificados como alto

grado/parecido a Burkitt/parecido a linfoblástico

- 10 casos (12.5% del total ) fueron catalogados como no clasificables

- 1 caso (1.25% del total) fue clasificado como compuesto

(folicular/difuso)

Estos resultados de la clasificación antes del estudio se pueden apreciar en

la gráfica 4

Gráfica 4 : Clasificación de los 80 casos antes del estudio

Al analizar los resultados de inmunohistoquímica realizados a los

histoarreglos y clasificar los casos según el algoritmo de Hans,

encontramos que 39 casos (48.75% del total) corresponden a casos

derivados del centro germinal , otros 38 (47.5% del total) son

postgerminales, en 3 casos (3.75% del total) no se pudo evalular el

27

algoritmo de Hans debido a que no fue posible interpetear el CD 10 , y

estos casos no contanban con suficiente tejido para volver a realizar el

marcador de inmunohistoquímica. Los resultados de la clasificación

después del estudio se pueden apreciar en la gráfica 5

Gráfica 5 : Clasificación de los 80 casos después del estudio

De los 39 casos que originalmente contaban con una clasificación según el

algoritmo de Hans, la clasificación fue cambiada en 16 de estos casos

(41.02% de los casos que originalmente contaban con clasificación de

Hans). Al analizar las categorías de clasificación antes del estudio,

observamos lo siguiente:

- De los 30 casos en los que no se realizó el algoritmo de Hans, o no

fue específicado en el diagnóstico o no se realizo el algoritmo de

forma completa, 19 casos fueron clasificados como germinales

(63.3% de estos casos), 10 como post germinales (33.3% de estos

casos) y uno de ellos no fue valorable (3.3%) que no fue posible

interpetear el CD 10 , por lo que en 96.6% de los casos de esta

categoría fue posible clasificarlos según el algoritmo de Hans.

28

- De los 23 casos clasificados originalmente como post germinales, la

clasificación se conservó en 17 casos (73.91% de estos casos), sin

embargo 6 casos fueron reclasificados como derivados del centro

germinal (26.08% de estos casos), ningún caso fue no valorable.

- De los 6 casos clasificados originalmente como derivados del centro

germinal, 5 casos conservaron la clasificación original ( 83.4% de

estos casos), 1 solo caso fue reclasificado como post germinal

(16.6% de estos casos), ningún caso fue no valorable.

- De los 10 casos que originalmente se catalogaron como no

clasificables, 4 de ellos fueron clasificados como derivados del

centro germinal (40% de estos casos) y 5 fueron clasificados como

post germinales (50% de estos casos), 1 caso fue no valorable por

las razones ya antes comentadas. El 90% de estos casos que

originalmente fueron catalogados como no clasificables se les pudo

asignar una clasificación según el algoritmo de Hans

- De los 10 casos catalogados originalmente como linfoma B de alto

grado/parecido a Burkitt/parecido a linfoblástico, 4 fueron

clasificados como derivados del centro germinal (40% de estos

casos), 5 como post germinales (50% de estos casos), 1 caso fue no

valorable (10% de estos casos) por las razones antes comentadas.

- El único caso que originalmente fue diagnósticado como compuesto

(linfoma no Hodgkin de tipo folicular/linfoma de células grandes B),

fue rediagnosticado y reclasificado como un linfoma de células

grandes B derivado del centro germinal

La gráfica 6 muestra la comparación de la clasificación antes y después de

este estudio.

29

Gráfica 6 : Clasificación de los 80 casos antes y después del estudio

Al valorar el estado doble expresor, se encontró que de los 80 casos en

este estudio, 19 fueron positivos tanto para BCL-2 y C-MYC (figura 1) por

inmunohistoquímica, representando el 23.75% del total, el rango de edad

de estos pacientes fue de 27 a 84 años con un promedio de edad de 61.42

años, 9 pacientes son hombres y 10 son mujeres, con una relación

hombre:mujer de 1:1.1. 6 casos fueron nodales (31.57%) y 13

extranodales (68.43%), 10 casos fueron clasificados en este estudio como

derivados del centro germinal (52.63%) y 8 como post germinales

(42.10%), un caso (5.26%) no fue valorable para clasificarlo según el

algoritmo de Hans. También es importante recalcar que de los 10 casos

originalmente diagnósticados como linfoma B de alto grado/parecido a

Burkitt/ parecido a linfoblástico, solo 1 caso resultó ser doble expresor, sin

embargo fue negativo para los rearreglos de BCL-2, BCL-6 y MYC (veáse

mas adelante).

30

Figura 1 : Linfoma B doble expresor, se muestra la tinción de HyE, además

de la positividad para C-MYC y BCL-2

La tabla 4 resume las características encontrados en los 19 linfomas que

resultaron ser doble expresores, además de mostrar los marcadores de

inmunohistoquímica que resultaron positivos, el porcentaje de Ki67% y la

clasificación de Hans que fue asignada en este estudio.

Tabla4 : Características de los 19 linfomas doble expresores

31

De estos 19 casos catalogados como doble expresores, se pudo volver a

conseguir el bloque de parafina a 15 de ellos los cuales fueron sometidos a

estudios de FISH, se lograron identificar 5 linfomas de alto grado (33.3%

de los 15 casos evaluables) , en 2 casos el tejido obtenido para el

histoarreglos se perdió en el proceso (13.3% de los 15 casos evuables). De

los 5 linfomas B de alto grado, el rango de edad fue de 27 a 62 años con

un promedio de 47.2 años, 2 de ellos con localización nodal y 3

extranodales, en el estudio 3 de estos 5 linfomas B de alto grado fueron

clasificados como post germinales según el algoritmo de Hans , un caso

como derivado del centro germinal, y en un caso no fue posible valorar el

algoritmo de Hans. Se muestran imágenes representativa del linfoma B de

alto grado que resultó ser triple hit en la figura 2.

Figura 2: Linfoma B de alto grado, se muestra la tinción de HyE además de

los marcadores para BCL-2, C-MYC y Ki67, también se muestra la

positividad para los rearreglos de BCl-2, C-MYC y BCL-6 por FISH

32

Los 5 linfomas B de alto grado identificados en este estudio corresponden

al 6.25% de los 80 casos analizados en este caso, 3 de ellos mostraron

rearreglo de BCL-2 con MYC, 1 caso mostró rearreglo de BCL-6 con MYC y

un caso mostró rearreglo de BCL-2/BCL-6 y MYC, la tabla 5 resume las

características de los 15 linfomas doble expresores que fue posible

evaluar.

Tabla5 : Características de los 15 linfomas doble expresores evuables con

estudios de FISH y cuales resultaron ser linfomas B de alto grado

33

CAPÍTULO VIII

8. DISCUSIÓN

El diagnóstico de LBDCG es primordialmente morfológico, con

confirmación inmunofenotípica de su estirpe B, en este estudio 40 casos

(50%) resultaron ser nodales y la otra mitad (40 casos) extranodales,

siendo el sitio extranodal más común la región de cabeza y cuello (14

casos que representan el 35% de los casos extranodales), estos resultados

son similares a los reportados en la literatura en donde se menciona que

aproximadamente 40% de los casos se presentan de forma extranodal, sin

embargo, el sitio más común de presentación según la literatura es el

tracto gastrointestinal (84), en nuestro estudios el tracto gastrointestinal

fue el segundo sitio más común de presentación extranodal (8 casos que

representan el 20% de los casos extranodales),

Si bien en nuestro servicio no será posible clasificar todos los subtipos

histológicos específicos reconocidos por la OMS, todos los diagnósticos de

linfoma B con células grandes (ya sea en ganglio, extranodal y trucut)

deberían ser sometidos al algoritmo de Hans, de hecho en la actualización

de la clasificación de la OMS del 2016 se menciona que la clasificación

según la célula de origen (centro germinal o post germinal) debería ser

incluida en el reporte patológico (84).

Un panel de inmunohistoquímica en base a CD 10, MUM-1 y BCL-6 es

suficiente para realizar la clasificación molecular de todos los casos de

linfomas B de células grandes ( siempre y cuando se tenga suficiente tejido

disponible), de esta forma en este estudio fue posible realizar la

clasificación molecular en todos los casos (excepto 3 casos en que no fue

posible interpretar el CD 10), además se identificaron 39 casos que

originalmente contaban con una clasificación según el algoritmo de Hans,

al realizar el estudio, la clasificación fue modificada en 16 casos (41.02%

de los casos que originalmente contaban con clasificación de Hans).de

estos 39 casos, esta discrepancia puede ser debida a que varios casos

clasificados según Hans no contaban originalmente con CD 10 en el panel

34

de interpretación, de hecho en solo 35 de los 80 casos de este estudio

(43.75%) se realizó CD 10 desde el principio, siendo que CD 10 es el

marcador que debe ser evaluado al principio del algoritmo.

Se identificaron 19 casos que resultaron ser doble expresores (23.75% del

total de casos), el cual es similar al porcentaje reportado en la literatura

(19-34%) (11, 35, 37,59), la actualización de la OMS del 2016 hace enfásis

en el factor pronóstico adverso en los casos que expresan MYC y BCL-2 por

estudios de inmunohistoquímica (84), de hecho son varios los estudios

que han mostrado que los linfomas doble expresores tiene pobre

pronóstico después de la quimioterapia estándar o después de la

quimioterapia de alta dosis con transplante autólogo de células

hematopoyéticas (71,85) , por esto creemos que posterior a la

clasificación molecular según el algoritmo de Hans, debería buscarse el

estado doble expresor en todos los linfomas B de células grandes.

Se buscó la presencia de los rearreglos de MYC, BCL-2 y/o BCL-6 con

técnica de FISH de 15 linfomas doble expresores, de estos 5 resultaron ser

linfomas B de alto grado (4 doble hit y un triple hit) que representan el

33.3% del total de los 15 linfomas doble expresores evaualbes y 6.25% de

los 80 casos incluidos en este estudio, solo 1 caso de los 10 casos

originalmente catalogados como alto grado resultó ser doble proteína, sin

embargo fue negativo para rearreglos de BCL-2 y/o BCL-6 con MYC, estos

resultados son similares a los descritos por la actualización de la OMS

2016, donde mencionan que aproximadamente 4-8% de los DLBCL son "B

de alto grado" , sin embargo, la OMS solo menciona que la mayoría de los

linfomas Doble hit son doble expresores y que la mayoría de los doble

expresores no son doble hit, pero no ofrece una relación en porcentaje y

estadística entre estas 2 entidades (72, 85), además la clasificación actual

de la OMS requiere que todos los casos de DLBC de nuevo diagnóstico

sean sometidos a estudio de FISH en búsqueda de los rearreglos de MYC

con BCL-2 y/o BCL-6, independientemente de los resultados de los

estudios de inmunohistoquímica, esto pudiese no ser factible desde el

punto de vista económico en todos los laboratorios de patología

quirúrgica, varios autores emiten recomendaciones, por ejemplo Shaoying

Li et al. (84) menciona que la clasificación de la célula de origen puede ser

realizada usando cualquier algoritmo de inmunohistoquímica (que quizás

35

sea remplazado en el futuro por perfiles de expresión génica realizado en

bloques de parafina), posteriormente buscar el estado de doble expresor

mediante marcadores de imunohistoquímica para MYC y BCL-2 (con

puntos de corte de 40% y 50% respectivamente) y finalmente realizar

estudios de FISH de forma secuencial empezando con el rearreglo de MYC,

si este resulta positivo continuar con BCL-2 y BCL-6. Wang XJ et al (86)

mencionan que usando un punto de corte del 40% para MYC por

inmunohistoquímica, la expresión de este marcador tiene una sensibilidad

del 81% y especificidad del 61% para predecir el rearreglo de MYC. Una

limitante de este estudio es que solo se realizó la búsqueda de los

rearreglos de MYC con BCL-2 y/o BC-6 en casos que resultaron ser doble

expresores, por que cabe la posibilidad que el número de linfomas B de

alto grado en nuestro servicio sea mayor, por lo que la búsqueda del

estado doble hit o triple hit debería ser según el juicio del patólogo,

integrando la información clínica del paciente con los resultados de los

estudios de inmunohistoquímica, además de que empezar únicamente

con la búsqueda del rearreglo de MYC, es una idea razonable que pudiese

reducir los costos. La importancia de reconocer a los linfomas B de alto

grado es que estos linfomas con la terapia R-CHOP presentan una

respuesta completa es relativamente baja con sobrevida media de 4.5 a

18.5 meses, por lo que se han propuesto terapias de inducción más

intensivas. La terapia con dosis ajustada de rituximab más etopósido,

prednisona, vincristina, cliclofosfamida y doxorubicina (R-EPOCH) tiene

mayor respuesta completa a comparación de R-CHOP, aun así 20-30% de

los pacientes presentan enfermedad primaria refractaria, por lo que es

necesario realizar ensayos clínicos con prueba con nueva terapias.

36

CAPÍTULO IX

9. CONCLUSIONES

Todos los casos de linfomas B de células grandes deberían ser clasificados

con el algoritmo de Hans, de esta forma con un panel de CD 10, BCL-6 y

MUM-1 todos los casos pueden ser clasificados en nuestro servicio,

además, debido a la importancia pronostica del estado doble expresor, en

todos los casos se podría realizar además marcadores de

inmunohistoquímica para BCL-2 y MYC.

La búsqueda de los rearreglos de MYC y BCL-2 y/o BCL-6 podría ser

factible en aquellos casos en donde la presentación clínica es agresiva,

pudiendo realizar al principio solo la búsqueda del rearreglo de MYC de

esta forma se evita la realización de pruebas de FISH innecesarias.

Los objetivos de este estudio se cumplieron, esta base de datos podría ser

utilizada en el futuro para la realización de otras investigaciones.

37

CAPÍTULO X

10. BIBLIOGRAFÍA

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46

CAPITULO XI

11. RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO

Tesis: CLASIFICACIÓN DE LOS LINFOMAS NO HODGKIN DIFUSOS DE

CÉLULAS GRANDES B EN BASE AL ALGORITMO DE HANS Y AL ESTADO DE

MYC Y BCL-2 POR ESTUDIOS DE IHQ Y FISH

Área de estudio: Anatomía Patológica

Biografía:

Datos personales: Nacido en Chihuahua, Chihuahua el 21 de junio

de 1990, hijo de Héctor Manuel Acosta Arzate y Guadalupe

Calderón Ochoa

Educación:

Egresado de la Universidad Autónoma de Chihuahua, grado

obtenido: Médico Cirujano y Partero

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