Cel-cel communicatie in de neuro-glio- vasculaire eenheid tijdens...

Cel-cel communicatie in de neuro-glio-

vasculaire eenheid tijdens inflammatie

Alexander Parmentier

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Dr. Marijke De Bock

Begeleidster: Valérie Van Haver

Vakgroep Medische basiswetenschappen

Academiejaar 2014-2015

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk

de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student) (handtekening promotor)

(Naam student) (Naam promotor)

VOORWOORD

Het schrijven van het voorwoord, het leukste moment van de thesis. Dit betekent dat ik mijn

thesis tot een goed einde heb gebracht. Het heeft veel zweet, koffie en slapeloze nachten gekost,

maar het is gelukt. Het is de bekroning op m’n universitaire studies en een eerste kijk in de

wereld van het onderzoek. Het was super tof om na al die jaren met mijn hoofd in de boeken te

zitten eindelijk eens de theorie om te zetten in de praktijk.

Daarom zou ik graag mijn Promotor Dr. Marijke De Bock bedanken. Zonder haar was dit

allemaal niet mogelijk geweest. Beide geen vroege vogels, maar steeds tot de laatste in het labo.

Ze leerde me vele technieken, kon me steeds motiveren en had oneindig veel geduld wat ze zeker

nodig had met mij. Het was echt leuk om van zo’n spontane, goedlachse persoon te mogen leren.

Ook wil ik mijn begeleidster Valérie Van Haver en de andere onderzoekers van het labo

bedanken voor de tips en extra uitleg bij de technieken en toestellen.

Verder wil ik mijn medestudenten bedanken voor alle steun tijdens de lange dagen en voor de

ambiance en afleiding tijdens de vele uurtjes in de studentenkamer.

Mijn vriendin Astrid Roelant wil ik speciaal bedanken. Ze stond altijd klaar om naar mij te

luisteren wanneer ik het even moeilijk had. Ze gaf me ook de moed om niet op te geven.

Tenslotte wil ik nog mijn ouders, broer en vrienden bedanken voor al hun steun.

INHOUDSTAFEL

LIJST AFKORTINGEN ....................................................................................................................

SAMENVATTING .......................................................................................................................... 1

SUMMARY ..................................................................................................................................... 2

1. INLEIDING ................................................................................................................................. 3

1.1 Introductie ............................................................................................................................... 3

1.2 De bloed-hersen barrière en neuro-glio-vasculaire eenheid ................................................... 4

1.2.1 De functie van de BHB .................................................................................................... 6

1.2.2 Anatomie van de BHB: intercellulaire juncties ............................................................... 7

1.2.3 De rol van Calcium in de regulatie van de BHB ............................................................. 8

1.3 Connexines ............................................................................................................................. 9

1.3.1 Structuur en functie .......................................................................................................... 9

1.3.2 Cx43 ............................................................................................................................... 11

1.3.3 De rol van connexines in endotheliale Ca2+ signalisatie en BHB permeabiliteit.......... 11

1.4 Regulatie van BHB en Ca2+ kanalen in inflammatoire omstandigheden ............................. 12

1.5 Matrix metalloproteinasen .................................................................................................... 14

1.5.1 Regulatie van BHB permeabiliteit door MMPs ............................................................. 16

1.6 Doel van de studie ................................................................................................................ 19

2. MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................................ 20

2.1 Celcultuur ............................................................................................................................. 20

2.1.1 Cellen splitsen en uitzaaien ............................................................................................ 20

2.1.2 Celcultuur opstarten ....................................................................................................... 21

2.1.3 Invriezen van cellen ....................................................................................................... 21

2.1.4 Geconditioneerd medium aanmaken .............................................................................. 21

2.2 Hemikanaal assay ................................................................................................................. 22

2.3 Gap junctie koppeling studie ................................................................................................ 23

2.4 Immuunkleuring ................................................................................................................... 24

2.5 Gelelektroforese en Western Blotting .................................................................................. 25

2.5.1 Cellysaten maken ........................................................................................................... 26

2.5.2 Eiwitconcentratie bepalen .............................................................................................. 27

2.5.3 SDS-PAGE .................................................................................................................... 27

2.5.4 Western Blot en immunodetectie ................................................................................... 28

2.6 Zymografie ........................................................................................................................... 29

2.7 Ca2+ -metingen ...................................................................................................................... 31

2.8 Statistische analyse .............................................................................................................. 32

3. RESULTATEN .......................................................................................................................... 33

3.1 Detectie van MMPs na blootstelling aan LPS ...................................................................... 33

3.1.1 Gelatine Zymografie ...................................................................................................... 33

3.1.2 SDS-PAGE en Western Blot ......................................................................................... 34

3.2 Effect van LPS en MMPs op Cx43 expressie in BHB endotheel RBE4 cellen blootgesteld

aan MMPs ................................................................................................................................... 36

3.3 LPS-CM stimuleert gap junctionele koppeling en hemikanaal activiteit in RBE4 cellen. .. 37

3.3.1 Effect van LPS-CM op gap junctionele koppeling ........................................................ 37

3.3.2 Effect van LPS-CM op hemikanaal activiteit ................................................................ 38

3.4 LPS-CM stimuleert Ca2+ dynamiek in RBE4 cellen ............................................................ 39

3.5 Effect van LPS-CM op expressie en lokalisatie van Cx43, Cx37 en Cx40 .......................... 40

3.6 Batimastat stimuleert gap junctionele koppeling en hemikanaal opening na directe

blootstelling aan LPS .................................................................................................................. 41

4. DISCUSSIE ................................................................................................................................ 43

4.1 Doel van de studie ................................................................................................................ 43

4.2 LPS activeert en verhoogt MMP (-2, -9 en -7) expressie ..................................................... 43


aan MMPs ................................................................................................................................... 44

4.4 LPS-CM stimuleert gap junctionele koppeling en hemikanaal activiteit in RBE4 cellen. .. 45

4.5 LPS-CM stimuleert Ca2+ dynamiek in RBE4 cellen ............................................................ 46


blootstelling aan LPS .................................................................................................................. 47

REFERENTIES .............................................................................................................................. 47

ADDENDUM: SAMENSTELLING BUFFERS EN MEDIA ....................................................... 51

ADDENDUM: STRUCTUUR CHEMISCHE AGENTIA ............................................................ 55

LIJST AFKORTINGEN

6-CF 6-Carboxyfluoresceïne

ABC ATP-binding cassette

AJ adherens juncties

AM acetoxymethyl

ATP adenosine trifosfaat

BB-94 batimastat

BBB blood-brain barrier

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat

bFGF basic fibroblast growth factor

BHB bloed-hersenbarrière

BSA bovine serum albumin

Cbx carbenoxole

CSV cerebrospinaal vocht

CM geconditioneerde medium

Cx connexine

CZS centraal zenuwstelstel

DAPI 4’,6-diamidino-2-fenylindool

dH2O gedestilleerd water

DMEM dulbecco’s modified eagle medium

DMSO dimethylsulfoxide

EAE experimentele autoimmuunencephalitis

ECM extracellulaire matrix

ECn endotheelcellen

ER endoplasmatisch reticulum

ET-1 endotheline-1

FBS Fetal Bovine Serum

GJ Gap junctie

GJC Gap junctionele communicatie/koppeling

HBSS Hank's Balanced Salt Solution

HK hemikanalen

IL-1β interleukine-1 beta

IP intraperitoneaal

IP3 inositol-1,4,5-trifosfaat

ISV interstitieel vocht

JAM junctionele adhesiemolecule

LPS lipopolysaccharide

MAPK mitogen activated protein kinase

MLC myosin light chain

MMP matrixmetalloproteïnase

MW moleculair gewicht

NBT nitro blauw tetrazolium chloride

NF-κB nucleaire factor-κB

NO stikstofoxide

NGVU neuro-glio-vasculaire unit

ODDD oculodentodigitale dysplasie

PBS phosphate buffered saline

PDGF-B platelet-derived growth factor B

PLC fosfolipase C

PI propidium iodide

ROS reactive oxygen species

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SLDT Scrape Loading and Dye Transfer

TGFβ transforming growth factor-β

TIMP tissue inhibitor of metalloproteinases

t-PA tissue plasminogeen activator

TJs tight juncties

TNFα tumornecrosefactor-alfa

TnI troponine I

ZO zonula occludens

1

SAMENVATTING

ACHTERGROND: Connexines (Cxs) komen sterk tot expressie in de cellen van de neuro-glio-

vasculaire eenheid. In endotheelcellen dragen ze bij tot de bloed-hersen barrière (BHB)

permeabiliteit door het stabiliseren van de tight juncties en door de vorming van een directe

communicatieroute voor Ca2+ via de gap juncties (GJ) of door paracriene signalisatie via

hemikanalen (HK). Matrix metalloproteinases (MMPs) zijn actief tijdens inflammatie en ze kunnen

Cx43 in het hart beïnvloeden. METHODES: Lipopolysaccharide (LPS) afkomstig van gram-

negatieve bacterien werd gebruikt om inflammatie te stimuleren in geimmortaliseerde rat brain

endothelial (RBE4) cellen. Zymografie, SDS-PAGE/western blot en immunohistochemie werden

gebruikt om endotheliale Cxs (Cx43, Cx37, Cx40) en MMPs te detecteren. Functionele testen zoals

scrape loading and dye transfer (SLDT) en dye uptake werden uitgevoerd om de impact van MMPs

op gap junctionele communicatie (GJC) en HK activiteit in RBE4 cellen te testen. Ten slotte, omdat

[Ca2+]i een determinant is van BHB permeabiliteit en aangezien Ca2+ signalisatie onveranderd

geassocieerd is met Cxs werd Ca2+-beeldvorming gebruikt om de impact van MMPs op de

endotheliale Ca2+ dynamiek na te gaan. RESULTATEN: Extracellulaire MMPs, aanwezig in het

medium van RBE4 cellen behandeld met LPS, waren in staat Cx43 te beïnvloeden en hadden

positieve effecten op GJC en HK activiteit wat overeenkwam met hun invloed op de endotheliale

Ca2+ veranderingen. Deze effecten konden geïnhibeerd worden door het gebruik van batimastat

(BB-94), een breed sprectrum inhibitor. CONCLUSIE: MMPS zijn in staat om de BHB

permeabiliteit te beïnvloeden op een Ca2+-afhankelijk manier via hun interactie met Cx43.

2

SUMMARY

BACKGROUND: Connexins (Cxs) are widely expressed in the cells of the neuro-glio-vascular

unit. In endothelial cells they contribute to the blood-brain barrier (BBB) permeability by

stabilizing the TJs or by forming a direct route of communication for Ca2+ via the gap junctions or

trough paracrine signaling via hemichannels. MMPs are known to be active during inflammation

and could be able to influence Cx43 channels, as indicated in the heart. METHODS:

Lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria was used to stimulate inflammation in

immortalized rat brain endothelial (RBE4) cells. Zymography, SDS-PAGE/western blot and

immunohistochemistry were used to detect endothelial Cxs (Cx43, Cx37, Cx40) and MMPs.

Functional tests like scrape loading and dye transfer (SLDT) and dye uptake were performed to

assess the impact of MMPs on gap junctional communication (GJC) and hemichannel activity in

RBE4 cells. Finally, since [Ca2+]i is an known determinant for the BBB permeability and Ca2+

signaling is invariably associated with Cx channels, Ca2+-imaging was used to study the impact of

MMPs on endothelial Ca2+ dynamics. RESULTS: Extracellular MMPs, present in the medium of

RBE4 cells treated with LPS, were able to influence Cx43 and had positive effects on the GJC and

hemichannel activity what corresponded with their influence on endothelial Ca2+ changes. These

effects were inhibited by the use of batimastat (BB-94), a broad-spectrum MMP inhibitor.

CONCLUSIONS: MMPs are able to influence BBB permeability in a Ca2+ dependent manner via

their interaction with Cx43.

3

1. INLEIDING

1.1 Introductie

De hersenen en het ruggenmerg zijn de controle centra van het lichaam. Ze verwerken sensoriële

input, reguleren motorische output en coördineren vele van de individuele en gezamenlijke

activiteiten van weefsels. Neuronale signalisatie in het centraal zenuwstelsel (CZS) is strikt

afhankelijk van actiepotentialen en neurotransmissie. Het in stand houden van een stabiele micro-

omgeving waarin neurotransmissie effectief verloopt is de belangrijkste functie van de bloed-

hersenbarrière (BHB) (1-5). De BHB maakt op hoger niveau deel uit van de neuro-glio-vasculaire

eenheid (NGVU). Deze omvat neuronen, een extracellulaire matrix (ECM), pericyten en gliale

cellen (1-6). De BHB is een hoog selectieve barrière die op een strikte manier de passage van

moleculen in en uit het hersenweefsel controleert en zo de hersenhomeostase onderhoudt (1, 2, 4,

6). Deze barrière-functie is een combinatie van een transport barrière (specifieke

transportmechanismen die instaan voor een vaste flux), een metabole barrière (enzymen die

moleculen in transit metaboliseren) en een fysische barrière (2, 3). De basis van deze fysische

barrière zijn de intercellulaire juncties, nl. de tight juncties (TJs) en de adherens juncties (AJs) die

de intercellulaire ruimte tussen de capillaire ECn sterk vernauwen en zorgen voor een erg lage

paracellulaire permeabiliteit en hoge elektrische weerstand over de BHB (1, 2, 4, 6). Het

junctionele complex tussen de BHB-ECn bevat eveneens connexines (Cxs), een belangrijke

junctionele partner die vaak over het hoofd gezien wordt m.b.t. de cerebrale barrières (1, 7-10).

Cxs maken significant deel uit van het junctionele complex en stabiliseren de intercellulaire

juncties waardoor ze bijdragen aan de barrière functie (1, 6). Hun primaire functie is het vormen

van gap juncties (GJ), dit zijn kanalen die het cytoplasma van naburige cellen met elkaar verbinden

en die de passage van kleine hydrofiele moleculen (<1,5 kDa) mogelijk maken, wat zeer belangrijk

is in het coördineren van weefselfuncties, ook in de NGVU (1, 7, 11). GJ kanalen zijn grote, weinig

selectieve, waterige poriën die ontstaan door het dokken van 2 halve GJ kanalen of hemikanalen

(HKn), elk behorend tot één van de partner cellen. De HKn bestaan elk uit 6 Cx eiwitten, geordend

rond een centrale porie (1, 7-10, 12). Waar GJs een directe communicatieroute vormen tussen

cellen, zorgen HKn voor contact tussen het cytosol en de extracellulaire ruimte en vormen zo zowel

een autocriene als paracriene signalisatie route (1, 12). Tijdens neuroinflammatie, wat optreedt bij

verscheidene aandoeningen van het CZS, verliezen de ECn hun barrière functie. Het exacte

mechanisme is echter nog niet goed gekend. De meeste cellen van de NGVU kunnen pro-

4

inflammatoire cytokines vrijstellen die het junctionele complex beïnvloeden en zo de permeabiliteit

van de barrière verhogen (3, 5, 6, 12). De endotheliale cytoplasmatische Ca2+ concentratie ([Ca2+]i)

is onveranderlijk geassocieerd met dysfunctie van de barrière (1, 5, 6). HKn zijn op verschillende

manier gelinkt aan de [Ca2+]i. HKn zijn Ca2+ permeabele kanalen die openen tijdens inflammatie

in respons tot een verhoogde [Ca2+]i (10, 13) en daarmee bijdragen tot een Ca2+-geïnduceerde

BHB dysfunctie. Open HKn mediëren ook de diffusie van ATP, wat via de activatie van purinerge

receptoren, fosfolipase C (PLC) en tenslotte inositol 1,4,5 trisfosfaat (IP3), leidt tot vrijstelling van

Ca2+ uit het endoplamatisch reticulum (ER). GJs kunnen IP3 rechtstreeks doorgeven aan naburige

cellen en zo een lokale, Ca2+-geïnduceerde BHB dysfunctie, verspreiden en amplificeren. Dit toont

aan dat tijdens inflammatie de Ca2+ dynamiek, hand in hand met de Cxs, de BHB functie beïnvloedt

(1, 6, 10). Het aantal ziektes zoals Parkinson, Alzheimer (12) en epilepsie (3, 10) waarbij BHB

ontregeld is blijft toenemen. Een beter inzicht in de rol van Cx kanalen in de BHB tijdens

inflammatie is dan ook noodzakelijk. In deze thesis zal meer specifiek gekeken worden wat de rol

is van Matrix metalloproteïnasen (MMPs) op de Cxs in het barrière endotheel. MMPs worden

eveneens vrijgesteld tijdens neuroinflammatie en beïnvloeden de BHB integriteit (4, 14). Ze

verhogen de permeabiliteit onder andere door degradatie van de ECM eiwitten (15-17) en van TJ

eiwitten (15). Recent is er een eerste evidentie dat Cx43 een mogelijk substraat is van MMP-7 (16)

en MMP-2 (17). Tevens is aangetoond dat in pathologische condities Cx43 expressie daalt en dat

dit correleert met een stijging in MMP expressie (18). Deze data zijn echter allemaal afkomstig van

het hart en over de link tussen Cx43 en MMP is in het CZS nog weinig geweten. Baserend op de

data afkomstig uit het hart plus het feit dat Cxs belangrijke modulatoren zijn van de BHB

permeabiliteit zowel in fysiologische als pathologische condities, laten toe af te vragen wat de rol

is van MMPs in de controle van Cx-gemedieerde BHB regulatie. Betere inzichten in de cel-cel

communicatie binnen de NGVU tijdens neuroinflammatie kunnen mogelijks leiden tot verhinderen

van BHB dysfunctie tijdens neuropathologieën. In de volgende hoofdstukken worden de

verschillende thema’s van deze thesis -BHB, Cxs en MMPs- verder toegelicht.

1.2 De bloed-hersen barrière en neuro-glio-vasculaire eenheid

De BHB bestaat uit endotheelcellen die de wand van de capillairen vormen (1-6). Het oppervlakte

van deze endotheelcellen vormt de grootste plaats voor uitwisseling van moleculen tussen het bloed

en het hersenweefsel (1, 3). Deze oppervlakte is 150 à 200 cm2g-1 weefsel en komt overeen met

een totaal uitwisselingsoppervlakte van 12 tot 18 m2 voor de gemiddelde mens (2). De

5

endotheelcellen van de BHB verschillen van de perifere ECn door een verhoogd aantal

mitochondriën, het ontbreken van fenestraties en minimale pinocytotische activiteit (1, 5). Ze

vormen een hoog gesofisticeerd junctioneel complex bestaande uit AJs en TJs die paracellulaire

diffusie van opgeloste stoffen verhinderen tussen het bloed en de hersenen. Echter, het huidige

concept van de BHB is veranderd van een puur anatomische, endotheliale barrière naar een

complex en dynamisch geheel bestaande uit BHB-ECn en de daarmee geassocieerde gliale cellen,

pericyten en neuronen dat men de NGVU noemt (1-6) (Fig 1).

Fig 1. De neuro-gliovasculaire eenheid. De NVGU is een

complex netwerk van cellen bestaande uit de endotheelcellen,

de pericyten, de astrocyten, neuron en microglia die samen de

BHB vormen (19).

De differentiatie van de endotheelcellen in het gespecialiseerde barrière-endotheel gebeurt tijdens

de angiogenese en wordt later vooral onderhouden door een dichte, inductieve interactie met

verschillende celtypes waaronder de astrocytaire eindvoetjes en pericyten (20, 21). Deze inductie

promoot bv. de op-regulatie van TJs (2). Transplant experimenten tonen mooi hoe de omgeving

van het endotheel de barrièrefunctie bepaalt. Cerebrale bloedvaten die getransplanteerd worden

naar perifeer weefsel worden minder restrictief, terwijl perifere bloedvaten die in het hersenweefsel

worden getransplanteerd juist veel restrictiever worden (22). Astrocytaire eindvoetjes omringen de

hersencapillairen bijna volledig, maar direct contact tussen deze structuren en het endotheel wordt

verhinderd door een basaal membraan wat pleit voor een paracrience signalisatie tussen de

astrocyten en de barrière (1, 2, 5). Alhoewel astrocyten noodzakelijk zijn voor het onderhoud van

de BHB, zijn ze waarschijnlijk niet voldoende om barrière eigenschappen te induceren (1, 5).

Sommige BHB karakteristieken zijn al aanwezig voor er gedifferentieerde astrocyten aanwezig

zijn. Daarom zijn neuronen of pericyten betere kandidaten om TJ formatie te induceren terwijl de

gliogenese overeenkomt met de veranderingen in TJ complexiteit (1). Pericyten staan in nauw

6

contact met de capillairen, zelfs in de vroegste stadia van ontwikkeling. Ze hebben een dendritische

morfologie met verschillende cytoplasmatische uiteinden die zich rond de wand van de capillairen

vasthechten (1, 2, 5) en ze zitten samen met de ECn in het basaal membraan waar zij de meeste

moleculaire componenten van synthetiseren (1). In tegenstelling tot astrocyten staan pericyten in

direct contact met de ECn (1, 2, 5). Pericyten reguleren groei en ontwikkeling van de bloedvaten,

alsook TJ formatie en transport functie via secretie van groeifactoren zoals transforming growth

factor-β (TGFβ) angiopoietine-1, platelet-derived growth factor B (PDGF-B) en basisch fibroblast

groei factor (bFGF) (1). Tenslotte maakt de ECM ook deel uit van de NGVU door interactie met

het cerebrale endotheel. Het verbindt laminine en andere matrix eiwitten met endotheliale integrine

receptoren die op hun plaats intracellulaire signaalcascades kunnen stimuleren. Matrix eiwitten

kunnen de expressie van TJ eiwitten beïnvloeden en hebben zo een ondersteunende rol in de BHB.

Disruptie van de ECM is sterk geassocieerd met een verhoogde BHB permeabiliteit in

pathologische toestanden (5), mogelijk doordat de anatomie van de NGVU, en daarmee de

trofische invloed van astrocyten en pericyten op het endotheel, wordt verstoord.

1.2.1 De functie van de BHB

De BHB verzorgt het CZS van een stabiele omgeving voor een optimale neurale werking (1-5). Ze

draagt bij aan de ionenbalans in het interstitieel vocht en zorgt er voor dat deze optimaal is voor

synaptische transmissie (2, 3, 5). Bloedplasma bevat hoge concentraties van het excitatoir

aminozuur glutamaat die fluctueren na ingestie van eten. Mocht glutamaat in een ongecontroleerde

wijze het interstitieel vocht (ISV) in de hersenen penetreren dan kan er een permanente

neurotoxische en neuroexcitatoire schade optreden aan neuronaal weefsel. Dit wordt bijvoorbeeld

ook geobserveerd in ischemische beroertes waarin verhoogde glutamaat concentraties in het ISV

leiden tot neuronale celdood (2, 3, 20). De BHB zorgt er tevens voor dat neurotransmitters die

zowel door het CZS als het perifeer zenuwstelsel gebruikt worden mooi gescheiden blijven (2, 3).

Verder verhindert de BHB dat macromoleculen in de hersenen terecht komen. Zo is de

eiwitconcentratie in het cerebrospinaalvocht (CSV) vele malen lager dan in het bloed. Plasma-

eiwitten zoals albumine, protrombine en plasminogeen zijn schadelijk voor het zenuwstelsel en

zorgen voor immuunactivatie van cerebrale cellen wat kan leiden tot apoptose en zenuwschade.

Het lekken van deze eiwitten naar de hersenen door een beschadigde BHB kan dus erge

pathologische gevolgen hebben (2). De BHB werkt als protectieve barrière door het beschermen

van het CZS tegen neurotoxische stoffen die in het bloed circuleren (2, 3, 5). Deze toxische stoffen

7

kunnen endogene metabolieten of eiwitten zijn, of stoffen ingenomen via de voeding. Het

volwassen zenuwstelsel heeft een minimale regeneratie capaciteit en gedifferentieerde neuronen

zijn niet in staat te delen en zichzelf te vervangen onder normale omstandigheden. Neuronen

sterven continu af vanaf onze geboorte gedurende ons hele leven, met weinig neurogenese. Elk

proces dat dit versnelt is nefast voor de gezondheid (2).

1.2.2 Anatomie van de BHB: intercellulaire juncties

Een zeer hecht junctioneel complex bestaande uit TJs en AJs tussen de cerebrale ECn is in zeer

sterke mate verantwoordelijk voor barrière functie. De extreem hechte TJs (zonulae occludentes)

tussen de endotheelcellen verhinderen niet alleen de paracellulaire diffusie van polaire stoffen van

het bloed plasma naar het extracellulair vocht van de hersenen (gate functie) (1, 2), maar ze

polariseren ook de cel (fence functie) (1). Ze zorgen voor een hoge transendotheliale elektrische

weerstand van ~ 1800 Ω cm2 (1, 2). De TJs bestaan uit de junctionele eiwitten occludine en claudine

en uit de junctionele adhesie molecules (JAMs) (1, 2, 5). Claudines zijn een familie van

transmembranaire eiwitten (20-24 kDa) waarvan er 24 isovormen geïdentificeerd zijn en ze zijn

het primaire barrière vormend onderdeel van de TJs (1, 5). In de bloedhersenbarrière zijn claudine

-3 en -5 de belangrijkste voor de vorming van de TJ structuur (1, 2). Occludine was het eerste

junctionele eiwit dat ontdekt werd (1), maar in contrast met claudines is het niet nodig voor de

vorming van het junctionele complex (1, 5). Desalniettemin is occludine expressie geassocieerd

met TJ sluiting en gecorreleerd met verhoogde elektrische weerstand (1, 5). Occludine wordt ook

vooral gevonden bij BHB endotheel en veel minder perifeer. Mature BHB ECn gebruiken

occludine vooral om hun barrière eigenschappen te reguleren i.p.v. ze tot stand te brengen (1). De

JAMs zijn een derde familie van transmembranaire eiwitten (1, 2, 5) die homo- en heterofiele

interacties mediëren in de TJ regio en zo de vroege aaneenhechting van naburige celmembranen

verwezenlijken (1). De oorzaak van de hoge elektrische weerstand van de BHB komt doordat de

TJs het ionentransport verhinderen. Dit benadrukt tevens hun effectiviteit die geregeld wordt door

de intracellulaire scaffold eiwitten ZO-1, ZO-2 en ZO-3 die de junctionele eiwitten occludine en

claudine linken via cingulin aan actine en het cytoskelet (2). Dit kan door directe interactie met

actine of indirect via binding met secundaire adapter eiwitten. Deze associatie is niet alleen

belangrijk voor stabilisatie van de juncties, maar ook voor de dynamische regulatie van junctie

opening en sluiting (1). In de AJs vormen cadherine eiwitten de intercellulaire brug en zijn ze in

het cytoplasma van de cel gelinkt aan de scaffolding eiwitten α, β en γ catenine die zelf gelinkt zijn

8

aan het actine cytoskelet en zo de het AJ complex stabiliseren (2, 5). De AJs houden de cellen

samen en geven het weefsel zo structurele stabiliteit. Ze zijn essentieel in de vorming van TJs (2,

13) en disruptie kan leiden tot BHB disruptie (2, 5). Verandering in intracellulaire en extracellulair

Ca2+ concentratie kan de AJ/TJ vorming moduleren en kan de elektrische weerstand over de cellaag

veranderen en de effectiviteit van de TJs als barrière verminderen (2, 13). De cellen van de NGVU

stellen vasoactieve agentia, cytokines (2) en MMPs (13) vrij die de vorming van de TJs en de

permeabiliteit van de BHB kunnen beïnvloeden.

1.2.3 De rol van Calcium in de regulatie van de BHB

Calcium ionen (Ca2+) spelen een belangrijke rol in de permeabiliteit van de BHB. Wanneer de

extracellulaire concentratie (~ 1 mM - 1,5 mM ) (23) verlaagt of de intracellulaire Ca2+ concentratie

([Ca2+]i; ~ 50-100 nM ) (23) verhoogt leidt dit tot verhoogde permeabiliteit (13). [Ca2+]i kan op

drie manieren worden verhoogd. Een eerste mechanisme is de vrijstelling van Ca2+ uit het

endoplasmatisch reticulum (ER), die 70 % van de celreserve aan Ca2+ bevat. Dit gebeurt wanneer

verschillende triggers zoals o.a. glutamaat (24), thrombine (25) of bradykinine (26) bindt op een

G-eiwit-gekoppelde receptor op het celmembraan van de cel. Deze activeert PLC, DAG en IP3 en

die laatste bindt op de IP3-receptor van het ER. Deze binding leidt dan tot de vrijstelling van Ca2+

uit het ER (27). Een tweede mechanisme waardoor de [Ca2+]i stijgt is door de influx van Ca2+

vanuit het extracellulair milieu via ionotrope receptoren (28). Deze mechanismen leiden tot een

verhoogde permeabiliteit of een daling van de TEER van hersenendotheelcellen zowel in vivo als

in vitro (13). Verder speelt de balans tussen de hechte intercellulaire juncties enerzijds en het

contractiele cytoskelet anderzijds een cruciale rol in de regulatie van de BHB permeabiliteit. Elke

verstoring van dit evenwicht zorgt voor een verhoogde diffusie over de barrière. Zo leidt de

verhoogde [Ca2+]i ook tot de activatie van een aantal effector eiwitten van signalisatiewegen die

een invloed hebben op deze intercellulaire juncties en/of op het cytoskelet en beïnvloeden ze zo

dus de BHB permeabiliteit. Bijvoorbeeld de myosin light chain (MLC), deel van het myosine motor

eiwit dat op zijn beurt deel uitmaakt van het cytoskelet, is in staat gefosforyleerd te worden.

Wanneer deze gefosforyeerd wordt door een MLC kinase op een Ca2+-afhankelijke manier leiden

de actine-myosine interacties tot een verhoogde contractiliteit van het cytoskelet en de vorming

van stress vezels en verhoogde BHB permeabiliteit (29). Een ander voorbeeld is dat de ROS-

productie geassocieerd is met een CaM-afhankelijke activatie van het mitogen activated protein

kinase (MAPK), wat leidt tot de redistributie van occludine en ZO-1 (30). Naast de [Ca2+]i speelt

9

ook de extracellulaire [Ca2+] concentratie een rol in de permeabiliteit van de BHB (31, 32). Zo zou

een daling van extracellulaire [Ca2+] een directe invloed hebben op de TJs en de endotheliale

permeabiliteit verhogen in een [Ca2+]i-onafhankelijke manier. Echter is dit effect wel secundair

aan de disruptie van de cadherines. Een daling van extracellulair [Ca2+] daling leidt tot disruptie

van de cadherines waardoor de TJs losser zijn. Belangrijk is dat de extracellulaire concentratie aan

Ca2+ minder belangrijk is dan [Ca2+]i m.b.t. de BHB permeabiliteit. Wanneer intracellulaire

effectormoleculen worden geïnhibeerd, dan doet dit de verhoogde permeabiliteit t.g.v. de daling

aan extracellulaire Ca2+ concentratie teniet (13). Toch is het onwaarschijnlijk dat enkel korte

termijn [Ca2+]i elevaties voldoende zouden zijn voor lange termijn BHB alteraties. Herhaalde

[Ca2+]i spike activiteit zijnde [Ca2+]i oscillaties zijn meer geneigd om langere effecten te

veroorzaken in de functie van de BHB (6). Zo zijn [Ca2+]i oscillaties aangetoond in BHB

endotheelcellen in respons tot bradykinine, ATP, hypoxie, endotheel-leukocyt interacties of invasie

van bacteriën (6).

1.3 Connexines

1.3.1 Structuur en functie

In het junctionele complex is er naast de TJs en AJs nog een 3e junctionele partner die vaak niet

vermeld wordt omdat deze juncties niet als functie hebben paracellulaire diffusie te verhinderen,

maar vooral betrokken zijn in de directe communicatie tussen naburige cellen (1) (zie 1.4.2). Het

betreft hier de Cx eiwitten die behoren tot een superfamilie met 21 isovormen (1, 7, 9, 12, 33).

Deze worden geëxpresseerd in een weefsel-specifieke manier (1, 7, 33) en krijgen hun naam

volgens hun moleculair gewicht (1, 7, 11, 12). Cxs hebben sterk geconserveerde transmembranaire

en extracellulaire regio’s en ze delen allemaal dezelfde architectuur. Ze bestaan uit 4

transmembranaire hydrofobe aminozuurregio’s, twee extracellulaire lussen en drie

cytoplasmatische componenten (een N-terminale regio, een C-terminale regio en een

cytoplasmatische lus) (7, 9, 33) (Fig2). Cxs komen voor in een hexamere configuratie in het

plasmamembraan, maar in tegenstelling tot TJ en AJ vormen deze geen dichte afsluiting tussen de

cellen (1). Ze verzorgen een directe communicatieroute tussen de cellen door het vormen van GJ

kanalen die het cytoplasma van naburige cellen verbinden. GJ kanalen zijn grote, zwak selectieve,

waterige poriën die ontstaan door de interactie van 2 halve GJ kanalen of hemikanalen (HK) (HK

docking), elk afkomstig van één van de partner cellen (1, 7-12, 34). HK bestaan elk uit 6 Cx eiwitten

10

geschikt rond een centrale porie die de passage mogelijk maakt van stoffen die kleiner zijn dan

~1,5kDa (1, 7, 11). Deze stoffen omvatten o.a. adenosine trifosfaat (ATP), ADP, glutamaat,

glutathione en boodschapper moleculen zoals cAMP en inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP3) (11, 12).

Fig 2. Structuur Connexines. Een Cx eiwit bestaat uit 2 extracellulaire lussen en één intracellulaire lus. Tevens bevat

het een N- en C- terminaal deel die zich ook intracellulair bevinden. Zes Cx eiwitten vormen samen 1 hemikanaal

(HK) dat de intracellulaire ruimte verbindt met de extracellulaire ruimte. Een GJ wordt gevormd tussen twee HKn van

naburig gelegen cellen.

CxHK docking gebeurt in gespecialiseerde regio’s in de plasma membraan die men GJ plaques

noemt en die gevonden worden in bijna elk celtype van zoogdieren (1). CxHK zelf vormen een

strikt gereguleerde verbinding tussen het cytoplasma en het extracellulair milieu. Men dacht

oorspronkelijk dat CxHK gesloten bleven tot interactie met een naburig HK en vorming van een

GJ. Dit zou celdood verhinderen die ontstaat door het verlies van essentiële metabolieten, energie

substraten en diffundeerbare boodschapper moleculen en door het verlies van ionische gradiënten.

Echter, korte en gecontroleerde opening van de CxHK leidt niet tot celdood, wat impliceert dat

cellen tot op een bepaalde hoogte kunnen omgaan met een opening van de CxHK (1). Vandaag is

bekend dat CxHK kunnen geactiveerd worden door inflammatoire omstandigheden (12) en door

verschillende extra- en intracellulaire triggers zoals veranderingen in de intra- en extracellulaire

Ca2+ concentratie (10, 13), metabole inhibitie of ischemie (8), vrije radicalen, de intracellulaire

redox potentiaal, en mechanische stimulatie zoals bijvoorbeeld fluid flow shear stress (1, 11). Waar

GJs een directe route van communicatie vormen tussen cellen en zo elektrische (10) en metabole

activiteit coördineren, zorgen CxHK voor de communicatie tussen intra- en extracellulaire

compartimenten en verzorgen ze een diffusieweg voor ionen en kleine moleculen (1, 12). CxHK

kunnen bijdragen aan autocriene en paracriene signalisatie via de vrijstelling van extracellulaire

boodschappermoleculen zoals ATP en glutamaat (1, 11, 12). Samen coördineren GJs en HKn

11

verschillende functies gaande van het cellulair tot orgaan niveau zoals ontwikkeling, differentiatie,

oncogenische transformatie en groeicontrole, celdood, inflammatie en intercellulaire

signaaltransmissie (33, 35). Cxs komen voor in het CZS waar ze vooral in gliale en vasculaire

cellen connecties maken, maar ze kunnen ook gevonden worden in neuronen (1, 35). Er zijn elf

subtypes in het CZS en hun expressie hangt af van celtype en stadia van ontwikkeling. Cxs zijn

betrokken bij essentiële functies van het CZS en aberrante Cx expressie kan bijdragen tot CZS

aandoeningen (1).

1.3.2 Cx43

Cx43 heeft een massa van 43kDa en is het meest abundante Cx in het menselijk lichaam (34). Zo

komt het o.a. sterkt tot expressie in het hart (16, 17), de huid en het het oog (7). Cx43 is tevens het

predominante GJ eiwit in het CZS waar het tot expressie komt in pre-mitotische, radiale gliale

cellen, mature astrocyten en vasculaire cellen (1) en een belangrijke rol speelt in vele aspecten van

de ontwikkeling en fysiologie van het CZS (7). Defecten in zowel Cx43 expressie als functie leiden

tot ernstige problemen. Homozygote Cx43 knockout (KO) muizen sterven bij geboorte, doch

voornamelijk door cardiovasculair falen (7). Specifieke endotheliale Cx43 KO veroorzaakt

hypotensie en bradycardie bij muizen (36). Een mutatie in het gap junction alpha 1 (GJA1) gen dat

codeert voor Cx43 leidt tot oculodentodigitale dysplasie (ODDD) dat naast de uiterlijke kenmerken

ook verscheidene defecten in het CZS met zich meebrengt (34). Zo zijn veranderingen in Cx43

expressie geassocieerd met neuronaal verlies, astrogliose, ischemie en autoimmune inflammatie

(7). Tenslotte speelt Cx43 een rol in een proces dat men bystander celdood noemt, waarbij er

verspreiding is van celdood van apoptotische cellen naar gezonde naburige cellen (7, 11, 12).

Hoewel een totale afwezigheid van GJ slecht zou zijn tijdens een ischemische beroerte, kan een

tijdelijke blokkade tijdens en na de beroerte gunstig zijn (7). Het is ook belangrijk te vermelden dat

naast het negatief effect van bystander celdood, Cx43 ook neuroprotectief kan zijn na een

neuropathologie (7). Zo kan bijvoorbeeld bij epilepsie de GJC bijdragen aan de verspreiden van

neuronale schade, maar tevens essentieel zijn voor bescherming van weefsel door de aanvoer van

energetische moleculen en de afvoer van toxische componenten (10).

1.3.3 De rol van connexines in endotheliale Ca2+ signalisatie en BHB permeabiliteit

Zoals hierboven beschreven wordt een stijging van [Ca2+]i in het BHB endotheel bewerkstelligd

door de activatie van G-eiwit gekoppelde receptoren op het membraan die o.a. glutamaat (24),

12

thrombine (25) en bradykinine (BK) (26) als agonist hebben. Stroomafwaarts van de Ca2+-

geactiveerde signaalcascaden wordt het actine/mysosine cytoskelet beïnvloedt wat aanleiding geeft

tot reorganisatie van TJ/AJs en de BHB permeabiliteit verhoogt (13). De BHB wordt niet beïnvloed

door een eenmalige stijging in [Ca2+]i maar door het ontstaan van Ca2+-oscillaties en Ca2+-golven

(37). De golven propageren over cellen op twee manieren. Enerzijds gebeurt het door directe

communicatie via GJs. Dit wordt bewerkstelligd door de diffusie van IP3 of Ca2+ zelf door de GJs.

Anderzijds kunnen de golven propageren via paracriene signalisatie. Hierbij diffundeert een Ca2+

mobiliserende boodschapperstof (voornamelijk ATP) naar het extracellulair milieu via geopende

HK en bindt het de G-eiwit gekoppelde receptoren van een naburige cel waardoor daar de [Ca2+]i

stijgt (13). Verhoogde [Ca2+]i en membraan depolarisatie leiden ook tot HK opening en vrijstelling

van ATP in de extracellulaire ruimte. Autocriene signalisatie van ATP kan ook [Ca2+]i verhogen

wat bijdraagt tot BHB dysfunctie. Ca2+ en IP3 kunnen zelf rechtstreeks diffunderen tussen naburige

cellen via GJs en zou verder [Ca2+]i en IP3 verhogen en de vrijstelling van ATP bevorderen bij

naburige cellen. Dit type van Ca2+ wave kan gestopt worden door GJ blokkers (10). BK is een

inflammatoir peptide dat [Ca2+] oscillaties en een verhoogde endotheliale permabiliteit veroorzaakt

(6). Deze oscillaties kunnen kunnen verhinderd worden door te interfereren met Cx kanalen door

gebruik te maken van carbenoxolone, Gap27, een peptide dat Cx37 en Cx43 mimeert en zo Cx

kanalen blokkeert en Cx37/43 down reguleren. Gap27 inhibitie van de oscillaties is snel (binnen

minuten) en werk met Cx hemikanaal (HK)-permeabele kleurstoffen toonde HK opening en

purinerge signalisatie aan in respons tot stimulatie met BK. Verder inhibeerde Gap27 de BK-

getriggerde verhoging van endotheliale permeabiliteit zowel in vitro als in vivo (6). Daar Ca2+ een

belangrijke rol speelt in regulatie van de BHB permeabiliteit en dat deze Ca2+ signalisatie sterk

gelinkt is aan Cxs (38, 39) kunnen we hieruit afleiden dat de Cxs een belangrijke rol spelen in

regulatie van de BHB permeabiliteit.

1.4 Regulatie van BHB en Ca2+ kanalen in inflammatoire omstandigheden

Inflammatie is een complexe reactie op beschadiging van weefsel waarbij plasma eiwitten,

leukocyten en bloedvaten betrokken zijn (40). In het CZS gaan inflammatie en neurodegeneratie

hand in hand bij talrijke neurodegeneratieve ziektes zoals Alzheimer (12, 41), Parkinson (12, 41)

en Huntington (12) waar pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL-1β bijdragen aan

neuronale celdood. De inflammatoire trigger kan afkomstig zijn uit de periferie (bv. bij infectie) of

uit het CZS zelf (bv. door neurodegeneratie) en in beide instanties speelt de BHB speelt hierin een

13

belangrijke rol omdat ze een belangrijke cellulaire component bevat die aangetast wordt door pro-

inflammatoire agentia afkomstig van het bloed of het hersenparenchym (12). Het inflammatoire

fenotype van het BHB endotheel leidt vervolgens tot het verlies van barrière eigenschappen, wat

verder bijdraagt tot verstoorde neuronale functie (13). Wanneer de BHB integriteit aangetast is

zullen inflammatoire cellen (zoals leukocyten) en water de hersenen binnentreden wat leidt tot

neuronale celdood en oedeem (40). De inflammatoire mediatoren zijn cytokines, chemokines en

complement adhesiemoleculen die verder leiden tot de rekrutering en activatie van leukocyten (40).

Zo kan de leukocyt invasie in de hersenen bijdragen aan de pathofysiologie van epilepsie (42).

Leukocyten zijn op hun beurt in staat reactive oxygen species (ROS) te activeren die het cytoskelet

verstoren en cellulaire eiwitten oxideren (40). Cellen van het CZS zijn zeer gevoelig aan oxidatieve

stress door hun hoge zuurstof consumptie en lage antioxidante bescherming. Oxidatieve stress

treedt op tijdens herseninflammatie door blootstelling aan pathogenen en ischemische periodes.

Verhoogde reactieve stikstof spiegels zijn neurotoxisch en stijgen bij cellen onder metabole stress.

Verder leidt verhoogde ROS productie tot meer oxidatieve stress en verhoogde reactieve

stikstofverbindingen tijdens veroudering en in neurodegeneratieve ziekten (12). ROS is ook in staat

om MMPs te activeren (13, 43). Deze proteïnasen komen tot expressie tijdens inflammatie en

kunnen zo ook bijdragen aan verschillende neuropathologiën (44). Microglia, die ~12 % uitmaken

van de totale hersencellen zijn de residente macrofagen van het CZS. Hun activatie treed snel op

na hersenschade en ze spelen een belangrijke en gunstige rol in de aangeboren immuunrespons,

maar overactiviteit kan tevens neurotoxisch zijn (12). Ze kunnen communiceren met andere

hersencellen via extracellulaire signalen zoals cytokines en neurotransmitters maar zijn ook in staat

te direct te communiceren met elkaar via Cx43 GJs , die slechts tot expressie komen na blootstelling

aan inflammatoire triggers (45). Deze kunnen ook de [Ca2+]i verhogen en zo bijdragen aan de BHB

dysfunctie (13). Cx43 speelt ook een rol in de aangeboren immuniteit. Zo leidt de blootstelling van

pulmonaire endotheelcellen aan lipopolysaccharide (LPS) tot expressie en activatie van Cx43 die

bijdragen aan de rekrutering en aanhechting van neutrofielen (46).

14

1.5 Matrix metalloproteinasen

MMPs bestaan uit een familie van zink-bevattende endopeptidasen (4, 13, 40, 44). Ze zijn

voornamelijk gekend voor hun eigenschap om de ECM te klieven (17, 40). Er zijn meer dan 25

verschillende MMPs beschreven. Naast hun eigenschap van degradatie van de ECM eiwitten zoals

cytokines, chemokines, cel oppervlakte receptoren, groeifactoren en andere proteasen te activeren

en zo bij te dragen aan fundamentele processen zoals cel-proliferatie, differentiatie, adhesie,

migratie en apoptose (40, 44) zijn ze ook in staat een aantal bioactieve moleculen te processen (44).

Zo zijn ze bijvoorbeeld in staat om niet-matrix substraten te klieven zoals serpins, insulin-like

growth factor binding proteins, galectine-3, tachykinine peptiden, IL1, tissue factor pathway

inhibitor en FGF type I receptor (47). Tenslotte is nu ook bekend dat MMPs intracellulaire targets

hebben. Onderzoek naar hoe MMP-2 activatie leidt tot myocardiale dysfunctie zorgde voor de

ontdekking van intracellulaire substraten zoals troponine I (TnI) en myosin light chain-1 (MLC-1)

die belangrijk zijn voor de contractie van de hartspier (48). MMPs spelen ook een rol in

verschillende fysiologische processen zoals reproductie (49), embryogenese (50), angiogenese

(51), weefsel remodulering (52) en verschillende aspecten van immuniteit en inflammatie (40, 53).

Op basis van hun substraatspecificiteit worden MMPs ingedeeld in 5 groepen: collagenasen (MMP-

1,-8 en -13) (51), gelatinasen (MMP-2 en -9), stromelysines (MMP-3,-10 en -11), matrilysines

(MMP-7 en MMP-26) en membraan-geassocieerde (MT-MMPs) (40, 44, 48) (Fig3). Alle MMPs

delen 3 dezelfde domeinen. Ze bevatten een N-terminaal signaal peptide die instaat voor de secretie

van het enzym uit het endoplasmatisch reticulum (ER) en transport uit de cel. Naast het

signaalpeptide ligt een hydrofobisch propeptide domein dat een regulatorische functie heeft en zich

afschermt via cysteine van het naburig Zn2+ bevattend katalytisch domein. Het katalytisch domein

van de gelatinasen verschilt van andere MMPs omdat ze 3 fibronectine type 2-achtige domeinen

hebben die een collageen-bindend domein vormen, wat de binding en vervolgens klieving toelaat

van type 4 collageen of gedenatureerd collageen (gelatine). De matrilysines zoals MMP-7 bevatten

enkel de 3 basisdomeinen, namelijk het predomein, het prodomein en het katalytisch domein (48)

(Fig 3).

15

Fig 3. Structuur van MMPs. MMPs worden typisch ingedeeld volgens het substraat dat ze klieven. N-terminaal

bezitten ze een N-terminaal signaalpeptide (grijs) dat transport uit de cel mogelijk maakt. Alle MMPs die zich in de

latente fase bevinden bezitten tevens een cysteine domein die zich tussen het propetide (groen) en het katalisch domein

(roze) bevindt. Het katalytisch domein bevat een Zn2+ ion. Het katalytisch domein van de gelatinases is uniek omdat

het 3 fibronectine repeats bevat. Buiten de matrilysines hebben alle MMPs een flexibele scharnier regio die ook een

haemopexine domein bevat gelinkt aan een C-terminaal domein (48).

De transcriptie van MMPs wordt geregeld door cytokines en groeifactoren zoals interleukines (IL-

1, IL-4 en IL-6), transforming growth factor beta (TGFβ), tumor necrosis factor alpha (TNFα)

(54) en NFkβ (17). Hoewel ze het product zijn van verschillende genen hebben ze toch

gelijkaardige structurele en functionele elementen. MMPs komen tot expressie in zeer lage

hoeveelheid en in een latente vorm worden ze pro-MMPs genoemd (54). Door hun potentieel

destructieve eigenschappen als proteases worden MMPs oorspronkelijk gesynthetiseerd en

gesecreteerd in de extracellulaire ruimte als inactieve zymogenen, met een propeptide domein dat

gekliefd moet worden door andere proteasen zoals plasmine, weefsel plasminogeen activator (t-

PA) en urokinase-type plasminogeen activator (u-PA) of door MMPs zelf alvorens het enzym actief

is (40, 44). Men spreekt van een zogenaamde cysteine switch, die de interactie tussen cysteine in

het prodomein en het Zn2+ ion in de actieve site verstoord. Proteolytische verwijdering van het

doelwit in het prodomein door serine proteinases, furine of MMPs destabiliseert het propeptide en

verbreekt de Zn2+-cysteine interactie (40). De katalytische activiteit van de MMPs is gereguleerd

op verschillende niveaus zoals transcriptie, secretie, activatie en inhibitie (44). Inhibitie van MMPs

wordt gereguleerd door leden van de tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) familie die 4

16

eiwitten omvat: TIMP-1 , TIMP-2, TIMP-3 en TIMP-4 (44, 55). MMPs in het CZS hebben ook

een duale rol. Het is zo dat ze schadelijk zijn bijvoorbeeld in de acute fase van een beroerte, maar

tijdens de herstel fase zouden ze een positieve rol kunnen vervullen. Dit kan verklaard worden door

hun oorspronkelijke functie tijdens de hersenontwikkeling waar ze de ECM modificeren om de

uitgroei van nieuwe cellen, waaronder neuronen met hun axonen en dendrieten mogelijk te maken

(4, 40).

1.5.1 Regulatie van BHB permeabiliteit door MMPs

MMPs worden vrijgesteld in het hersenweefsel en het bloed tijdens perifere en centrale inflammatie

(51, 56, 57). Tevens wordt de BHB opening vooral gemedieerd door de MMPs in neuroinflammatie

(53) . Bijvoorbeeld, de BHB ontregeling bij een beroerte of tijdens hersenschade wordt tot stand

gebracht door degradatie van ECM substraten die essentieel zijn voor een normale signalisatie en

homeostase binnen de NGVU (4, 44). In de context van neurovasculaire schade zullen MMPs de

basale lamina degraderen, de bloedvaten verzwakken en ze blootstellen aan lekken en scheuren.

Na een beroerte en in vele experimentele modellen van cerebrale ischemie zijn MMPs significant

verhoogd (44). Tevens is de eerste behandeling bij een beroerte trombolyse, wat als bijwerking

intracraniale bloedingen kan veroorzaken. De trombolyse met intraveneus recombinante t-PA zou

via activatie van MMPs aanleiding kunnen geven tot die zware bloedingen (4, 44). Zo kwam men

op het idee om de thrombolye via t-PA te combineren met een breed spectrum MMP-inhibitor

minocycline (44, 58), die makkelijk door de BHB kan. De resultaten zijn gunstig en twee

succesvolle eerste fase klinische trials zijn reeds afgerond (58). Men moet hierbij wel voorzichtig

zijn en de potentieel positieve effecten van de MMPs in gedachten houden. De mechanismen van

MMP-gemedieerde hersenschade zijn divers en komen ofwel direct door degradatie van hersen

matrix substraten of indirect door activatie van andere bioactieve moleculen (44). MMPs verhogen

de BHB permeabiliteit via de degradatie van endotheliale matrix eiwitten (15, 16, 59) zoals

laminine, heparan sulfaat en fibronectine (53) en door het klieven van TJs (13, 15, 59). Breed

spectrum MMP inhibitie verhinderd BHB permeabiliteit en oedeem vorming na een ischemische

periode door het verhinderen van ECM degradatie en TJs klieving (40, 59). Buiten de vasculaire

schade en lekken op zich, leidt de MMP gemedieerde proteolyse van de neurovasculaire matrix

ook tot verstoring van de architectuur en homeostatische signalisatie tussen de verschillende

celtypes van de NVGU. Zo is de matrix signalisatie via integrines vitaal voor een optimale normale

celfunctie in rust. Wanneer MMPs de ECM degraderen interfereren ze ook met trofische stoffen

17

zoals FGF en BDNF die belangrijk zijn voor de neuroprotectie tegen hypoxie, oxidatieve stress en

zelf amyloid-beta. Zo dragen ze dus ook bij aan pathofysiologie van ziektes zoals beroerte en

hersentrauma’s (4). Wanneer de cellen hun interactie verliezen met de ECM komen ze los en

worden ze minder levensvatbaar. Deze vorm van celdood is gekend als anoikis (40). Dit treedt op

in neuronen en cerebrale endotheelcellen tijdens disruptie van de ECM door MMPs (4). De MMPs

die het sterkst bijdragen aan BHB schade zijn de gelatinases A en B , namelijk MMP-2 en MMP-

9 respectievelijk (53). Zo toont een studie aan dat amyloid-β in cerebrale amyloid angiopathie

(CAA) verantwoordelijk is voor verhoogde BHB permeabiliteit door vermindering van TJ

proteïnes claudin-1 en claudin-5 wat geassocieerd is met een verhoogde expressie van MMP-2 en

MMP-9 (60). Ze zijn ook belangrijk in cardiovasculaire ziekten, waaronder atherosclerose,

beroerte, hartfalen, ischemie of een aneurysma (48). MMP-2 zorgt voor de initiële BHB opening

door klieving van claudine-5 (40, 53, 59) en occludine (40) wat leidt tot structurele veranderingen

in TJs. Hierdoor zijn de TJs minder hecht, maar ze blijven wel nog tussen de endotheelcellen zitten

en het proces is reversibel (40). Pro-MMP-2 expressie is geassocieerd met een verhoogde BHB-

permeabiliteit 3 en 48 uur na middel coronaire arterie occlusie (61). MMP-2 is ook in staat om de

vasculaire druk te beïnvloeden door zijn proteolytische invloed op vasoactieve peptides zoals big

endothelin-1 (ET-1), calcitonin gene-related peptide en adrenomedllin (48). MMP-2 kan de

leukocyt invasie beïnvloeden door het reguleren van signalisatie cascaden die verantwoordelijk

zijn voor de expressie van adhesiemoleculen. Bijvoorbeeld door het knippen van ET-1 kan MMP-

2 de expressie van integrine beïnvloeden omdat ET-1 de expressie van integrine beïnvloed via de

binding op de endotheliale A receptor op het oppervlakte van de neurtrofielen via de MAPK kinase

signalisatieweg. Zo draagt MMP-2 dus bij aan de leukocyt-endotheliale celadhesie en neutrofiel

transport naar de site van inflammatie (62). Echter de rol van MMP-2 in ischemische

hersenaandoeningen is controversieel aangezien MMP-2 deficiënte muizen niet beschermd zijn

tegen een beroerte. Zo zou MMP-9 het dominante protease zijn aangezien MMP-9 deficiënte

muizen weinig verlies van BHB permeabiliteit hebben en een beperkte hersenschade vertonen (40).

Tijdens de secundaire BHB opening is de opregulatie van MMP-9 geassocieerd met de volledige

degradatie van TJs in de interendotheliale spleet (40). MMP-9 verstoort de BHB door disruptie

van de TJs via degradatie van occludine en ZO-1 (40, 60). MMP-9 wordt opgereguleerd in zowel

ischemishe als inflammatoire condities. Endotheel cellen, microglia en astrocyten brengen MMP-

9 tot expressie, maar ook neutofielen die het latente MMP-9 bevatten brengen het in de hersenen

18

tijdens inflammatie (53). MMP-9 zou ook een belangrijke rol spelen in de leukocyt invasie

doorheen de BHB (63, 64). Zo ziet men bij MMP-9 KO muizen een gedaalde leukocyt infiltratie

in de BHB en een verminderde adhesie van de leukocyten aan de endotheelcellen in vergelijking

met de WT muizen (64). Dit wordt bevestigd door de leukocyt infiltratie naar de hersenen tijdens

meningoencephalitis veroorzaakt door A.cantonensis bij muizen, wat geassocieerd is met een

verhoogde BHB permeabiliteit (63). Een verminderde cardiale functie met volume overload en

endocardiale endotheliale apoptose is ook geassocieerd met MMP-9 activatie (65). Bij honden met

canine visceral leishmaniasis is MMP-9 ook verhoogd wat leidt tot BHB disruptie (63). Tijdens

subarachnoidale bloeding gaat MMP-9 zorgen voor de degradatie van collageen type 4 wat leidt

tot een verhoogde BHB permeabiliteit (63). Er wordt hierboven vooral gefocust op de rol van

MMP-2 en MMP-9 m.b.t. tot de BHB permeabiliteit. Maar MMP-7 zou ook capabel zijn om

eiwitten te klieven die essentieel zijn voor BHB integriteit en immuunsupressie. In vitro, kan MMP-

7 ECM substraten klieven zoals collageen type 4, laminine en fibronectine en ook bioactieve

moleculen zoals TNFα en andere MMPs waaronder MMP-2 en MMP-9 (16). Er is ook aangetoond

in het hart dat het C-terminaal uiteinde van Cx43 een substraat is van MMP-7 (16). Verder is

gebleken bij experimentele autoimmuunencephalitis (EAE) bij muizen, een model voor MS dat

MMP-7 een rol zou spelen in de facilitatie van immuuncel penetratie in de perivasculaire ruimte.

Op deze manier is er naast MMP-9 ook een rol weggelegd voor MMP-7 in deze ziekte, wat nieuwe

therapeutische mogelijkheden biedt (66). MMP-9, MMP-2 en MMP-7 spelen dus alle 3 een rol in

de leukocyt invasie in de hersenen en dragen ook op deze manier bij tot BHB dysfunctie want de

leukocyten produceren glutamaat wat de BHB permeabiliteit verhoogt. Ook stellen inflammatoire

cellen zoals neutrofielen proteolytische enzymes vrij tijdens inflammatie. Er ontstaat dan een

onevenwicht tussen de proteases en de protease inhibitors. MMPs dragen bij aan dit onevenwicht

doordat ze in staat zijn de protease inhibitoren te inactiveren. Zo kan bijvoorbeeld MMP-9 de serine

elastase inhibitor, serpin α1-proteinase inactiveren (67). Verder is het belangrijk op te merken dat

BHB dysfunctie zich niet beperkt tot een open of toe fenomeen maar dat er gradaties zijn in de

BHB permeabiliteit die zich weerspiegelen in de cel-cel signalisatie binnen de NGVU (4). Deze

resultaten tonen mooi aan dat MMPs de BHB permeabiliteit verhogen door het klieven van de

ECM eiwitten en de TJs. Maar over de invloed van de MMPs op de Cxs in de BHB is nog zeer

weinig geweten. Daarom moet er onderzocht worden wat de rol is van de MMPs op de Cx-

gemedieerde regulatie van de BHB permeabiliteit.

19

1.6 Doel van de studie

Zowel Cxs als MMPs zijn belangrijke componenten in de regulatie van BHB permeabiliteit in

inflammatoire omstandigheden. Bovendien tonen recente studies aan dat Cx43 een substraat kan

zijn van MMPs. Deze data zijn echter vooral afkomstig van studies in het hart. Zo zou MMP-7 in

staat zijn Cx43 te klieven (16). Van een familie van meer dan 20 MMPs zijn MMP-2 en MMP-9

het sterkst aanwezig in de vroege en late stadia van chronisch hart falen (65). Resultaten in het hart

tonen aan dat Cx43 expressie gedaald zou zijn in TIMP-2 KO muizen in vergelijking met wild-

type muizen (55). In een hond model van ventriculair falen is Cx43 expressie eveneens gedaald en

is deze daling geassocieerd met een daling in TIMP-2 expressie (18). MMP-9 zou ook een

belangrijke rol spelen in renale vasculaire remodulering in muizen met diabetes (43). Renale Cxs

zouden de bloeddruk reguleren en zouden bijdragen aan de diabetische renale remodelering. Het

exacte mechanisme hoe ze dit doen is echter nog niet gekend (43). Hypoxie zou ook Cx43

dysreguleren door modulatie van MMPs via MAPK signalisatie (17). In deze thesis onderzoeken

we of Cx43 dat tot expressie komt in het BHB endotheel, een substraat is van MMP en of de

interactie tussen MMPs and Cx43 aanleiding geeft tot verhoogde endotheliale [Ca2+]i, wat leidt tot

BHB dysfunctie.

20

2. MATERIALEN EN METHODEN

2.1 Celcultuur

RBE4 cellen zijn rat brain endothelial cellen die groeien op collageen gecoate falcons bij 37°C en

5% CO2 en onderhouden worden in α-minimum essential medium (αMEM)/Ham’s F10 (1:1) dat

aangelengd is met 10% foetaal kalfserum, glutamine en geneticine, en 1µL/mL humaan

recombinant basische fibroblast groei factor. Cultuurmedia hebben als doel voldoende

voedingsstoffen en energie te leveren zodat de cellen buiten het organisme kunnen overleven en

delen. Het cultuurmedium bestaat uit 2 delen: een basaal medium, welke alle essentiële stoffen

bevat voor het cellulair metabolisme (fysiologische zoutoplossing, buffersysteem, energiebronnen,

aminozuren en vitaminen), en supplementaire componenten (eiwitten, serum en antibiotica) om

aan andere eisen te voldoen zoals deling en differentiatie. Aan media is meestal ook nog een pH

indicator toegevoegd (fenolrood) welke oranje-geel wordt bij een zure pH en paars in alkalisch

milieu. De cellen worden gegroeid in een CO2 incubator bij 37°C. Het doel van de incubator is een

omgeving te creëren waarin de pH, temperatuur en vochtigheid gecontroleerd zijn en ideaal voor

de cellen.

Materiaal

cultuurflesjes (TPP, Novolab, Geraardsbergen, België)

15 en 50 ml buisjes (Novolab)

multidish 4-wells (NuncTM, Nunclon delta Si, Roskilde, Denemarken),

Trypsine-EDTA (Invitrogen)

RBE4 Cultuurmedium (zie addendum)

DMSO (Dimethylsulfoxide) (Sigma-aldrich, Bornem, België)

2.1.1 Cellen splitsen en uitzaaien

Methode

- Laat de cellen groeien in een 5 ml cultuurflesje tot een confluente monolaag.

- Warm media en Trypsine-EDTA op in een warmwaterbad tot 37°C.

- Verwijder het medium boven de cellen.

- Breng 1.5 ml Trypsine-EDTA op de cellen.

- Incubeer 2 min bij 37°C.

21

- Controleer of de cellen zijn losgekomen onder de microscoop.

- Neutraliseer de Trypsine-EDTA door 3.5 ml medium toe te voegen en pipetteer op en neer.

- Splits volgens de gewenste densiteit

2.1.2 Celcultuur opstarten

- Haal de ampules uit de stikstoftank en ontdooi in een warmwaterbad bij 37°C.

- Breng alles uit de ampule over in 10 ml medium.

- Centrifugeer gedurende 1 min (500g).

- Zuig het bovenstaand medium af en voeg 5 ml vers medium toe aan de cellen.

- Breng de cellen over in een 25 cm2 cultuurflesje.

- Bewaar de cellen in de CO2 incubator

2.1.3 Invriezen van cellen

Methode

- Groei de cellen tot een confluente monolaag in twee grote cultuurflessen (75 cm2) gevuld

met 15 ml celmedium.

- Verwijder het celmedium door aspiratie.

- Maak de cellen los met 3 ml trypsine-EDTA.

- Inactiveer het trypsine door 12 ml medium toe te voegen.

- Voeg de inhoud van de cultuurflessen samen.

- Breng de cellen in een 15 ml buisje en centrifugeer (1 min aan 500g).

- Resuspendeer de cellen in 900 µl celmedium per ampule en voeg 100 µl DMSO toe.

- Incubeer de buisjes overnacht in isopropanol bij -80°C en breng ze vervolgens over in

vloeibare stikstof (-196°C).

2.1.4 Geconditioneerd medium aanmaken

Om het effect van MMPs op Cx expressie en Cx kanaalfunctie te onderzoeken worden levende

cellen rechtsreeks blootgesteld aan LPS of aan geconditioneerd medium (CM). Het CM is het

geïsoleerde medium gecollecteerd van cellen die aan bepaalde condities werden blootgesteld. Hier

gaat het om medium van cellen die op verschillende tijdspunten (3h, 6h en 24h) zijn blootgesteld

aan LPS (resp. LPS-CM(3h); LPS-CM(6h); LPS-CM(24h)). Vervolgens worden MMPs (samen

met alle andere componenten met een MW > 9kDa) geconcentreerd met behulp van de Pierce

22

Protein Concentrator. Dit is een 7mL kolom waarin er een cellulose membraan zit met een MW

cut-off van 9kDa. Wanneer deze kolom wordt gecentrifugeerd bij 4°C en 400g gedurende 5min

wordt meer dan 90 % van de eiwitten > 9kDa gescheiden van de kleinere.

Methode

- cellen uitzaaien tot ze confluent zijn

- het medium vervangen door serumvrij medium

- de cellen incuberen met LPS gedurende verschillende tijdspunten (3h, 6h en 24h) of vehikel

(controle).

- het CM na de incubatieperiode overbrengen in de Pierce Protein Concentrator

- het medium centrifugeren in de kolom gedurende 5min bij 4°C en met 400 g om het medium te

scheiden van het overgebleven celpellet.

2.2 Hemikanaal assay

Hiervoor worden EC gebruikt die subconfluent zijn om te vermijden dat de opgenomen kleurstof

wordt doorgegeven naar naburige cellen via GJs. De cellen worden geïncubeerd met de kleurstof

propidium iodide (PI, 2mM) die kan opgenomen worden door open HKn omdat de kleurstof een

MW < 1 kDa heeft. Daarna wordt PI weggewassen met HBSS-HEPES en wordt een kernkleuring

uitgevoerd met Hoechst. De stalen worden vervolgens geanalyseerd onder de

fluorescentiemicroscoop. Er kan nu een verhouding gemaakt worden tussen de PI gekleurde cellen

en het totaal aantal cellen. Er wordt gebruik gemaakt van een kwiklamp voor excitatie van de

kleurstoffen. Hoechst wordt belicht met UV licht (excitatie maximum is 350 nm) en PI wordt

gevisualiseerd met excitatiegolflengte 535 nm (TRITC).

Materialen

HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) - HEPES (zie addendum)

Propidium iodide (PI) (Invitrogen)

Hoechst (Invitrogen)

Epifluorescentiemicroscoop (Nikon Eclips TE2000, Analis, Gent, België)

Met een fluorescentiemicroscoop is het mogelijk om fluorochromen te visualiseren. Dit zijn

moleculen die in staat zijn om licht van een bepaalde golflengte te absorberen en vervolgens terug

uit te zenden met een langere golflengte. De fluorescentiemicroscoop verschilt enkel van een

lichtmicroscoop doordat de lichtbron een kwiklamp is (Nikon S Fluor). Bij de

23

epifluorescentiemicroscoop komt het exciterende licht van opzij en wordt het met behulp van een

dichroïsche spiegel gefocust op het preparaat. Op die manier kan het exciterende licht, wat vaak

heel sterk is, de waarneming van het emissielicht niet bemoeilijken. Er wordt gebruik gemaakt van

2 filters, een excitatiebandpassfilter en een emissiebandpassfilter.

Methode

- 3 x wassen met HBSS-HEPES

- 10min incuberen met 2 mM PI in HBSS-HEPES


- Hoechst-tegenkleuring doen in HPSS-HEPES (1/1000)

- Hoechst 10 min laten rusten in het donker

- Analyse onder fluorescentiemicroscoop (objectief x10)

2.3 Gap junctie koppeling studie

Bij Scrape Loading and Dye Transfer (SLDT) wordt er een scratch gemaakt met een naald in het

membraan van verschillende cellen waardoor die cellen permeabel worden voor een kleurstof die

aan de cellen wordt toegevoegd. Eerst worden de EC gewassen met een Ca2+-vrije buffer waardoor

de GJs openen. Vervolgens wordt de kleurstof 6–carboxyfluoresceine (0,4 mM) toegevoegd.

Daarna wordt een scratch gemaakt. De kleurstof heeft een laag MW (< 1 kDa) en kan dus

doorgegeven worden aan naburige cellen via GJs. Dit kan geanalyseerd worden onder de

fluorenscentiemicroscoop. Langs elke zijde van de scratch worden 7 opnames gemaakt met behulp

van de omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een x10 objectief en filters voor

excitatie (492 nm) en emissie (517 nm) van 6-carboxyfluoresceine. Deze spreiding volgt een

exponentieel verloop waaruit de spatiale constante (1/K), een maat voor de spreiding, kan afgeleid

worden. Deze is representatief voor de mate van gap junctionele koppeling (GJC).

Fig 4. Beeldje van SLDT genomen

met een fluorescentiemicroscoop. Beeldje toont de verspreiding van de

fluorescente kleurstof langs de zijde

waar de scratch is gemaakt. De

fluorescentie wordt dan uitgezet tov

de afsand waaruit de spatiale

constante (1/K) kan berekend

worden. Dit is een maat voor GJC.

Scale bar is 100 µm (68).

24

Materialen

HBSS-HEPES (zie addendum)

SLDT Buffer (zie addendum)

SLDT Solution: SLDT buffer met 6–carboxyfluoresceine (0,4 mM; Invitrogen)

Epifluorescentiemicroscoop (zie hierboven)

Methode

- we laten de cellen groeien tot ze volledig confluent zijn en er GJs gevormd zijn

- 3 x wassen met SLDT buffer

- SLDT solution op de cellen brengen en de cellen 1min incuberen in deze oplossing

- Scratch maken met naald in de cultuur en de cellen 1min laten incuberen met SLDT solution


- cellen 10 min laten rusten

- Analyse onder de fluorescentiemicroscoop

2.4 Immuunkleuring

Via immuunkleuring wordt gekeken naar de expressie en lokalisatie van Cxs. Cellen worden

uitgezaaid in multidish 4-wells. Wanneer de cellen confluent zijn worden ze 4h geïncubeerd met

LPS-CM. Daarna worden de cellen gefixeerd met 4% formol om het metabolisme stil te leggen.

Vervolgens wordt met behulp van de detergent 0,2 % Triton X100 het membraan van de cellen

gepermeabiliseerd. Dit is noodzakelijk opdat de antilichamen via de poriën in het membraan hun

doelwit kunnen bereiken. Aspecifieke bindingen worden verhinderd door gelatine. Vervolgens

worden de Cx43 (1/2000, Sigma Aldrich), Cx40 (1/50, Merck) en Cx37 (1/50, Gentaur) primaire

antilichamen (AL) toegevoegd. Het gebiotinyleerd secundair antilichaam (1/5) opgelost in gelatine

wordt hierna toegevoegd. Streptavidine (30 µg⁄ml) (1/400, Invitrogen) wordt toegevoegd voor de

visualisatie van de antilichamen onder de fluorescentiemicroscoop. Streptavidine is in staat

gebiotinyleerde biomoleculen zoals de antilichamen te binden voor de detectie onder de

fluorescentiemicroscoop. Finaal wordt DAPI (4’,6-diamidino-2-fenylindool) (1µg/ml) opgelost in

PBSD+ toegevoegd. DAPI is een membraan permeabele kleurstof die in staat is om alle kernen

van de cellen aan te kleuren.

25

Materialen

PBSD+ (phosphate buffered saline; zie addendum)

4% formaldehyde (Sigma-Aldrich)

0.2% Triton X100 in PBSD+ (Sigma-Aldrich)

Blokbuffer 2% gelatine (Sigma-Aldrich) in PBSD+

Alexa Fluor® 488 Streptavidine (Invitrogen)

DAPI (Life Technologies, excitatie max:350 nm, emissie max:470 nm)

Methode

- cellen spoelen met PBSD+

- 20 min incuberen met formol


- 10 min cellen permeabiliseren met 0,2 % Triton X100, opgelost in PBSD+


- cellen blokken met 2% gelatine (1/5), opgelost in PBSD+

- Primair AL toevoegen, 2uur


- Secundair AL toevoegen, 2uur


- Streptavidine (1/400) toevoegen, opgelost in PBSD+


- DAPI toevoegen

- cellen spoelen met PBSD+ en erop laten staan

- visualisatie met BD pathway 435 microscoop (20x)

2.5 Gelelektroforese en Western Blotting

We gebruiken Western Blotting om na te gaan welke MMPs tot expressie komen in cellysaten en

CM. We gebruiken het ook om Cx43 te detecteren. De detectie gebeurt door gebruik te maken van

C-terminale polyclonale antilichamen geproduceerd in konijn (Sigma Aldrich; MMPs 1/1000;

Cx43 1/10000). De secundaire antilichamen zijn gekoppeld aan alkalisch fosfatase. Het maken

van cellysaten gebeurt m.b.v. RIPA lysebuffer. Daarna worden de lysaten gesonificeerd om de

eiwitten te fragmenteren. Dan wordt er voor het cellysaat (evenals het CM) per laantje een zelfde

26

hoeveelheid eiwit ingebracht (20-50 µg/laantje). Hiervoor moet eerst de concentratie van het eiwit

bepaald worden. Dit gebeurt aan de hand van de BioRad DC protein assay. Dit is een

colorimetrische methode waarbij de reactie gelijkaardig is aan de lowry assay. Deze assay is

gebaseerd op een reactie tussen de eiwitten, een alkalisch koper tartraat oplossing en foline reagens.

Koper wordt door tyrosine, tryptofaan en in mindere mate door cystine, cysteïne en histidine in het

lysaat gereduceerd, dit leidt vervolgens tot de reductie van het foline reagens met vorming van een

blauwe kleur. Deze blauwe kleur kent een maximale absorbantie bij 750 nm en een minimale

absorbantie bij 405 nm. Gelijktijdig met de lysaten meet men de absorbantie van een

standaardreeks met gekende concentratie van bovine serum albumin (BSA) in de gebruikte

lysebuffer. Dit laat toe een standaardcurve op te stellen, waarbij de absorbantie wordt uitgezet in

functie van de BSA-concentratie. De ongekende eiwitconcentratie van het lysaat kan uiteindelijk

met behulp van de standaardcurve en de gemeten absorbantie worden afgeleid. Nu de gewenste

eiwitconcentraties verkregen zijn kunnen de verschillende laantjes geladen worden en kan de

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gestart worden. SDS in

de polyacrylamide gel zorgt voor denaturatie van de eiwitten en zorgt ervoor dat ze een uniforme

negatieve lading krijgen waardoor enkel scheiding zal plaatsvinden op basis van MW. Na het lopen

van de gel gebeurt de transfer naar een nitrocellulose membraan (Blotting). Daarna worden de

primaire en secundaire antilichamen toegevoegd aan het membraan. Deze secundaire antilichamen

zijn gekoppeld aan alkalisch fosfatase. De detectie gebeurt met behulp van 5-Bromo-4-Chloro-3-

Indolyl phosphate (BCIP)/Nitroblue tetrazolium salt (NBT) (1:10 in dH2O; Invitrogen). BCIP is

een onoplosbaar substraat voor alkalisch fosfatase, dat na defosforylatie door NBT geoxideerd

wordt, resulterend in een donkerblauwe indigo neerslag op het membraan.

2.5.1 Cellysaten maken

Materialen

PBSD+ (zie addendum)

RIPA (radioimmunoprecipitation assay) buffer (zie addendum)

Celschrapers (Greiner, Sigma-aldrich)

Sonicator (LabsonicU, B.Braun, Bethlehem, PA, USA)

Methode

- verwijder medium

27

- was 3 x met PBSD+

- voeg 200 µL RIPA buffer toe aan de cellen die groeien in een 25 cm2 falcon

- schraap de cellen met de celschrapers en breng de cellen terug in een epje

- soniceer 30x (30 pulsen)

- bewaar lysaten bij -20°C

2.5.2 Eiwitconcentratie bepalen

Materialen

RIPA buffer (zie addendum)

BSA (Bovine Serum Albumin) stock: 20 mg/ml (Sigma-aldrich)

Eiwitlysaat (zie eerder)

BioRad DC Protein assay kit (BioRad, Hercules, CA, USA)

Reagens A: alkalische koper tartraat oplossing; Reagens B: Foline reagens; Reagens S: SDS

Microtiterplaat (Nunclon delta Si)

Plaatlezer VICTOR (Perkin Elmer)

Methode

Om een ijklijn te maken, wordt een standaardreeks gemaakt van BSA opgelost in RIPA.

Om de eiwitconcentratie te bepalen wordt de absorbantie gemeten bij

509 nm. Deze mengsels bevatten:

- 5 µl van één van de concentraties uit de standaardreeks of 5 µl eiwitlysaat.

- 25 µl A’ (A’ = 1 ml A + 20 µl S)

- 200 µl B

De plaatlezer VICTOR is in staat absorbantie, luminescentie en fluorescentie te meten. De well-

plaat zal 5 seconden schudden en absorbanties worden na 15 minuten incubatie uitgelezen.

Concentraties worden bepaald via de ijklijn die de absorbanties voor gekende concentraties BSA

weergeeft

2.5.3 SDS-PAGE

Materialen

RIPA buffer (zie addendum)

Reducerend agens (10x) (Invitrogen)

28

NuPAGE LDS (loading solution) sample buffer (5x) (Invitrogen)

NuPAGE precast gel (Invitrogen)

Gelhouder (Invitrogen)

Elektroforesecasette (Novex, Invitrogen)

Elektroforesetoestel (X Cell Sure Lock TM, Novex, Invitrogen)

NuPAGE MES SDS running buffer (20x) (Invitrogen)

NuPAGE antioxidans (Invitrogen)

Merker: See Blue Plus 2 (Invitrogen)

Centrifuge (Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland)

Methode

- verdun het eiwit in een mengsel van reducerend agens, RIPA, en LDS

- de eiwitten 5min laten koken

- centrifugeer gedurende enkele seconden

- plaats de gel in de gelhouder en vul het binnenste compartiment met running buffer aangelengd

met antioxidans (500μL/200mL). Het buitenste compartiment wordt gevuld met de rest van de

running buffer

- breng de stalen aan in de slotjes van de gel

- leg de spanning aan. De elektroforese gebeurt op ijs opdat het gel niet zou smelten

2.5.4 Western Blot en immunodetectie

Materialen

Blotbuffer (zie addendum)

Blothouder (Invitrogen)

Sponsen (Invitrogen)

1 MM Whatmann papier (Biorad)

Nitrocellulose membraan Hybond C (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)

Blotcassette (X cell II TM Blot Module, Noves, Invitrogen)

Blotapparaat (X cell Sure Lock, Novex, Invitrogen)

Blokbuffer (zie addendum)

Antilichamen, verdund in blokbuffer.

BCIP/NBT Kit (invitrogen)

29

Methode

- Maak de volgende opstelling van anode (+) naar kathode (-):

sponsje/2 whatman papiertjes/ nitrocellulosemembraan/ gel/ 2 whatman papiertjes/sponsje

Zorg dat alles doordrenkt is met blotting buffer en klem tussen de 2 elektroden.

- Leg spanning aan (30V) gedurende 1h à 1h30. Ook de blotting gebeurt op ijs om de gel niet

te doen smelten.

- Incubeer het nitrocellulosemembraan gedurende 1h in blokbuffer bij kamertemperatuur.

- Incubeer het membraan met het primaire antilichaam gedurende 1h bij kamertemperatuur tot

overnacht bij 4°C.

- Was het membraan 3x met blokbuffer gedurende 15 min.

- Incubeer met het secundaire antilichaam 1 h bij kamertemperatuur.

- Was het membraan 3x gedurende 15 min met blokbuffer zonder melk.

- Incubeer het membraan in de substraatoplossing tot de bandjes zichtbaar worden

- Stop de reactie door de blots in dH20 te wassen

- Neem een foto en voer de procedure opnieuw uit met anti-Tubuline antilichaam,

- De analyse gebeurt via het programma ImageJ, waarmee de intensiteit van elk bandje gemeten

kan worden

- Finaal wordt er een verhouding gemaakt tussen de intensiteit van het eiwit van interesse met het

totaal aantal geladen eiwit (tubuline)

2.6 Zymografie

Gelatine zymografie wordt gebruikt om lysaten te analyseren op de aanwezigheid van MMPs. Bij

gelatine zymografie kunnen de verschillende gelatinase-MMPs bepaald worden door hun

onderling verschil in MW en afbraakcapaciteit voor gelatine. De eiwitstalen (15µL) plus een

merker (SeeBLue Plus2 Pre-stained Protein Standard) worden op een gelatine-bevattende gel

geladen en gelopen in het gel-elektroforese toestel op een gelijkaardige manier als voor Western

Blotting. Echter, nu wordt de gel niet geblot. Na het lopen van de gelatine gel wordt deze in

TritonX100 (TX100) geïncubeerd wat zorgt voor renaturatie van MMPs die vervolgens gelatine

zullen klieven. Hierna wordt de gel gefixeerd met behulp van een Developing buffer. Deze fixeert

gelatine dat gekliefd is in het membraan. Tenslotte wordt Coomassie blauw toegevoegd, gevolgd

door ontkleuring in azijnzuur/methanol om zo de gekliefde gelatine in de gel in beeld te brengen.

30

Aan de hand van de merker kunnen we de locatie van de bandjes analyseren en bepalen om welke

MMP het gaat.

Materialen

Running gel (zie addendum)

Stacking gel (5mL) (zie addendum)

Tris glycine SDS ladingsbuffer bromophenol Blue (Biorad)

Tris glycine SDS running buffer (10x) (zie addendum)

Renaturatie buffer (TritonX100) 2,5 % (Sigma Aldrich)

De gel wordt gelopen in het Novex systeem (zie boven)

Developing buffer (10x) (zie addendum)

Staining solution (zie addendum)

Destaining oplossing (zie addendum)

Methode

- Running gel gieten

- Isobutanol toevoegen om bubbels uit de gel te krijgen

- Stacking gel gieten wanneer de running gel gestold is

- Kammetje erin plaatsen en opnieuw laten stollen

- Stalen voorbereiden : staal + ladingbuffer 50/50 (max 15µL laden in totaal)

- Stalen centrifugeren

- Running buffer toevoegen in gel-ektroforese toestel

- Stalen en merker laden

- Gel laten lopen (90-125V)

- Eiwitten in de gel laten renatureren in TX100 (2,5%) gedurende 30min

- Renaturatie buffer vervangen door developing buffer gedurende 30min

- Developing buffer opnieuw vervangen voor 4u tot overnacht bij 37°C

- Developing buffer weggieten en 3 x wassen met dH20

- Kleuren met Coomassie Blauw voor 30min

- Ontkleuren met destaining oplossing tot de bandjes zichtbaar worden

- De visualisatie gebeurt met het blote oog en de klieving van gelatine door MMPs is duidelijk

zichtbaar als een wit bandje op de blauwe achtergrond

31

2.7 Ca2+ -metingen

De EC groeien op plastieke petridishes tot de gewenste confluentie. Daarna worden ze 4h

geïncubeerd met CM > 9 kDa die verschillende periodes werd blootgesteld aan LPS (1µg/mL). Het

laatste uur van incubatie met CM worden ze geladen met een mengsel van 10 µM fluo-4AM , 1mM

probenecid en 0,01% pluronic acid in HBSS-Hepes gedurende 1h bij KT. Daarna worden de cellen

gewassen met HBSS-Hepes/probenecid en gedurende 15 min bij KT in het donker gezet om te

deësterificeren. De cellen worden dan gevisualiseerd onder een omgekeerde epifluorescentie

microscoop, voorzien van een superfusie systeem die het mogelijk maakt om na ~1min het medium

te verversen met een Ca2+-vrije buffer om direct het effect van MMPs aanwezig in CM op de Ca2+

huishouding te bestuderen. Er wordt elke sec een beeldje genomen met een 40x water immersie

objectief en een elektron mutiplier CCD camera (Quantem 512SC;Photometrics, Tucson, AZ,

USA). Er wordt gebruik gemaakt van een Lambda DG-4 filterswitch om een excitatie van 482nm

te geven en om het geëmitteerd licht te vangen via een 505nm dichroïstische spiegel en een 535nm

bandpass filter. Opnemen en analyse gebeurt met een custum made QuantEMframes en Fluoframes

programma geschreven in Microsoft Visual C** 6.0. Ca2+ golven en oscillaties worden

gevisualiseerd in een 10 minuten observatie periode. De analyse gebeurt door een verhouding te

maken tussen het aantal oscillerende cellen (minstens 2 oscillaties) en de totaal aantal cellen

gedurende de observatie periode en door het tellen van het aantal golven.

Materialen

Plastic petridishes (Novolab, Geraardsbergen, België)

DMSO (Dimethylsulfoxide) (Sigma-aldrich, Bornem, België)

epifluorescentie microscoop (Eclips TE 300, Nikon Belux, Brussel)

40x water immersie objectief (NA 0,8)

HBSS-Hepes (zie addendum) + probenecid (1 mM) (Invitrogen)

Fluo-4AM (Life Technologies, Merelbeke, België)

0,01% pluronic acid (Invitrogen)

Methode

- Cellen 4h incuberen met CM (1/100) > 9kDa

- Na 3h cellen wassen met HBSS-HEPES-Probenecid

32

- Cellen 1h laden met mengsel 10 µM fluo-4AM , 1mM probenecid, 0,01% pluronic acid en CM

(1/100) opgelost in HBSS-HEPES

- Cellen wassen met HBSS-HEPES-Probenecid

- Cellen visualiseren onder microscoop

- Na 1min Ca2+-vrije buffer (zie addendum) toevoegen via perfusie systeem

- Gedurende 10min beeldjes opnemen

- Analyse gebeurt nadien met zelfgeschreven programma fluoframes

- Door middel van puntanalyse wordt elke cel geselecteerd en wordt de fluorescentieverandering

gedurende de volledig opname periode weergegeven

Een oscillerende cel wordt gedefinieerd als een cel die ten minste twee Ca2+ transiënten vertoont

na applicatie van de stimulus. Het aantal oscillerende cellen wordt uitgedrukt ten opzichte van het

totaal aantal cellen. Een Ca2+ golf wordt gedefinieerd als een stijging in de [Ca2+]i die tenminste

naar 1 naburige cel wordt doorgegeven. Bij een paracriene golf hoeven dit niet noodzakelijk twee

aan elkaar grenzende cellen te zijn. In dit geval wordt ook gekeken naar het tijdsinterval tussen de

[Ca2+]i stijgingen.

2.8 Statistische analyse

Data worden voorgesteld als het gemiddelde ± S.E.M. met n het aantal observaties. Statistische

significantie wordt bepaald aan de hand van een t-test voor gepaarde observaties of ANOVA

(analyis of variance) met Bonferonni post-test voor statistische vergelijking van meer dan twee

groepen. De data worden verwerkt met GraphPad Instat software. p-waarden < 0.05 worden als

significant aanzien(een symbool voor < 0.05, twee symbolen voor < 0.01, drie symbolen voor <

0.0001).

33

3. RESULTATEN

3.1 Detectie van MMPs na blootstelling aan LPS

3.1.1 Gelatine Zymografie

Als start van het experimenteel onderzoek werd nagegaan of MMPs aanwezig zijn in het lysaat en

het CM van RBE4 cellen die gedurende verschillende periodes (3h, 6h en 24h) werden blootgesteld

aan LPS (1 µg/mL) of vehicle (HBSS-Hepes). MMPs werden in eerste instantie gedetecteerd door

middel van zymografie waarbij er verschillende MMPs tegelijk kunnen worden gedetecteerd en

geïdentificeerd volgens hun moleculaire gewicht (MW) (Fig 5A). Dit is dan ook direct het grote

voordeel van deze techniek. In een gelatine zymogram zullen MMPs die behoren tot de klasse van

de gelatinasen (o.a. MMP-2, MMP-9 ) en het matrilysine MMP-7 in staat zijn gelatine, aanwezig

in de polyacrylamide gel, te klieven en zo een ‘signaal’ te produceren. Dit signaal is zichtbaar als

een wit bandje na aankleuring van de gel met coomassie blauw (Fig 5B-C). We hebben in deze

studie voornamelijk gefocust op de detectie van MMP-2 en MMP-9, twee MMPs die in belangrijke

mate bijdragen tot disruptie van de BHB in inflammatoire omstandigheden (4, 44, 59, 63) en de

detectie van MMP-7, een MMP dat minder wordt besproken in de context van BBB disintegriteit,

maar waarvan gekend is dat het een effect heeft op Cx43 (16). Gelatine zymografie van LPS-CM

toont signaal ter hoogte van 64-98kDa wat de aanwezigheid van (pro-)MMP-2 en (pro-)MMP-9

suggereert (Fig 5B).

Fig 5. Detectie van MMPs d.m.v. gelatine zymografie. A. MWs van de verschillende MMPs die onderzocht worden

in deze thesis. B. Gelatine zymografie van LPS-CM. De gelatine die aanwezig is in de gel vormt een substraat voor

het katalytisch domein van de MMPs. Het klieven van gelatine is zichtbaar als een wit bandje op een coomassie blauw-

aangekleurde gel. Bandjes ter hoogte van 98kDa en 64kDa suggereren de aanwezigheid van (pro)-MMP2 en (pro)-

MMP9 in het CM. C. Het scheiden van <9kDa en >9kDa fracties toont aan dat de MMPs zich concentreren in de

>9kDa fractie.

34

MMP-7 werd nooit gedetecteerd. Hoewel dit MMP wordt geacht gelatine te klieven (69), blijkt een

gelatine gel minder optimaal te zijn voor detectie van hiervan (i.t.t. een caseine gel) (70). Lysaten

die geïncubeerd werden met LPS gedurende verschillende periodes werden ook onderzocht op de

aanwezigheid van MMPs die gelatine klieven. Echter werden er in de lysaten geen MMPs

gedetecteerd d.m.v. zymografie. Het detectieniveau van de MMPs in de lysaten is mogelijks te

laag. Als controle werden moleculen met een MW > 9kDa gescheiden van de kleinere substanties

in het CM en werden beide fracties geanalyseerd d.m.v. gelatine zymografie. Alle MMPs hebben

een massa die groter is dan 9kDa, bijgevolg wordt er in de fractie < 9kDa geen gelatine klieving

gedetecteerd (Fig 5C).

3.1.2 SDS-PAGE en Western Blot

Gelatine zymografie geeft zekerheid over de aanwezigheid van MMPs (mogelijk MMP-2 en -9);

echter, zymografie is minder geschikt voor de kwantitatieve evaluatie van MMPs in de

verschillende samples. SDS-PAGE en Western Blotting laat een veel gevoeligere, specifiekere en

nauwkeurigere analyse toe omdat er met één bepaald antilichaam gewerkt wordt. De aanwezigheid

van MMPs werd nagegaan door gebruik te maken van respectievelijk MMP-2, MMP-9 en MMP-

7 C-terminale, polyclonale antilichamen (1/1000) geproduceerd in konijn (Sigma Aldrich). Het

secundaire antilichaam was anti-konijn (1/1000) gekoppeld aan alkalisch fosfatase. Als

ladingscontrole gebruikten we een antilichaam tegen beta-Tubuline (konijn, 1/5000, Abcam)

(cellysaat) of aankleuring van alle eiwitten op de membraan d.m.v. Sypro kleuring (Invitrogen)

(LPS-CM). Tubuline maakt deel uit van de microtubuli die permanent en abundant aanwezig zijn

in alle cellen. De expressie van MMPs wordt dan ook weergeven relatief ten opzichte van

tubuline/totaal eiwit, om kleine verschillen in lading en blotting efficiëntie te elimineren. In

cellysaten van RBE4 cellen die op verschillende tijdspunten blootgesteld werden aan LPS, lijken

pro-MMP-2, pro-MMP-9 en MMP-9 sterk te stijgen in functie van de tijd, maar MMP-2 lijkt te

dalen (Fig 6A-B, D). De moeilijke detectie van MMP-2 en MMP-9 in cellysaat leidde echter tot

een laag aantal bruikbare experimenten. Meer experimenten zijn nodig om hieruit definitieve

conclusies te kunnen trekken. De expressie van pro-MMP-7 en MMP-7 steeg duidelijk in functie

van de tijd dat de cellen werden blootgesteld aan LPS (Fig 6C,E). Ook CM > 9kDa van cellen

blootgesteld aan LPS werd onderzocht op de aanwezigheid en de expressie van MMP-2, -9 en -7

door middel van SDS-PAGE. Net zoals bij de lysaten is er een stijging van (pro)-MMP-9.

35

Fig 6. Expressie van MMP-2, MMP-9 en MMP-7 in RBE4 cellysaat na blootstelling aan LPS. A-C. Detectie van

(pro-)MMP-9 (A), (pro-)MMP-2 (B) en (pro-)MMP-7 (C) in RBE4 cellen blootgesteld aan LPS toont een sterke

stijging van zowel de pro- a,s de actieve vormen van deze MMPs. D-E. De grafieken tonen de gepoolde data van MMP

expressie voor (pro-)MMP-2 (n=1), (pro-)MMP-9 (n=1) en (pro-)MMP-7 (n=3) op de verschillende tijdspunten na

LPS (1 µg/mL) incubatie. (Pro-)MMP expressie in controle cellen werd gelijkgesteld aan 100% (stippellijn) en

expressie in LPS-behandelde cellen werd vergeleken met deze controle.

Fig 7. Expressie van MMP-2, MMP-9 en MMP-7 in CM > 9kDa van RBE4 cellen na blootstelling aan LPS.

Detectie van (pro-)MMP-2 en (pro-)MMP-9 en MMP-7 in CM > 9 kDa van RBE4 cellen die werden blootgesteld aan

LPS toont een matige stijging van (pro)-MMP-9 op de 3u en 24u tijdspunten en een geringe daling op 6h. (pro)-MMP-

2 lijkt te stijgen na 24h maar daalt eerst op de tijdspunten 3 en 6h (n=2). MMP7 volgt een gelijkaardig patroon als

MMP-2 (n=2).

36

In tegenstelling tot MMP-9 lijkt (pro)-MMP-2 te dalen in het CM. Verder is de aanwezigheid van

MMP-7 duidelijk te zien in LPS-CM(24h) maar niet op de andere tijdspunten. Anders dan in de

cellysaten observeerden we hier ook maar 1 bandje ter hoogte van MMP-7, maar pro-MMP7

(30kDa) kon niet worden gedetecteerd.


aan MMPs

Een van de hypothesen die gesteld worden in deze thesis is dat MMPs een effect hebben op de

expressie van Cx43 in het BHB endotheel. Om dit te testen werd de aanwezigheid van Cx43

nagegaan in lysaten van RBE4 cellen die werden blootgesteld aan LPS (1 µg/mL) of aan LPS-CM.

Confluente RBE4 culturen werden gedurende verschillende tijdspunten (3h, 6h en 24h)

geïncubeerd met LPS of 4h geïncubeerd met geconcentreerd LPS-CM (1/100) verdund in serum-

vrij medium. Foetaal kalfsserum bevat immers zelf MMPs die de resultaten kunnen beïnvloeden.

Cxs, waaronder ook Cx43, hebben een zeer kort halfleven (1-3h) (71) en 4h incubatie is bijgevolg

voldoende om een eventuele daling in Cx43 expressie door toedoen van MMPs op te pikken. De

expressie van Cx43 werd geëvalueerd d.m.v. SDS-PAGE en Western blotting (konijn anti-Cx43

C-terminus, Sigma Aldrich, 1/10,000) op de verschillende tijdspunten (3h, 6h en 24h) na toediening

van LPS of 4h na toediening van LPS-CM. De algemene trend, zowel in RBE4 cellen blootgesteld

aan LPS als in RBE4 cellen blootgesteld aan LPS-CM, was een chronologische daling van de Cx43

expressie over de verschillende tijdspunten (resp. n=5 en n=2) (Fig 8). Cx43 is een sterk

gefosforyleerd eiwit met het merendeel van de fosforylatie sites gelokaliseerd in het C-terminale

domein (72). Fosforylatie van Cx43 kan gedetecteerd worden op western blots door kleine

verschillen in migratiesnelheid in de polyacrylamide gel. Dit vertaalt zich in 3 laantjes: P0

vertegenwoordigt de niet-gefosforyleerde fractie Cx43; P1 en P2 vertegenwoordigen

respectievelijk de mid- en hoog-gefosforyleerde vormen van Cx43. Incubatie van RBE4 cellen met

LPS of LPS-CM lijkt geen effect te hebben op de fosforylatie status van Cx43 (Fig 8). Er werd ook

gekeken naar de expressie van Cx43 door gebruikt te maken van een antilichaam tegen de N-

terminus (konijn anti-Cx43 N-terminus, Sigma aldrich 1/5000). Dit werd uitgevoerd om te

controleren of het verminderde signaal met het C-terminale antilichaam het gevolg was van een

algemene daling in Cx43 expressie, dan wel een post-translationele modificatie of klieving van de

C-terminus door protease activiteit, zoals gesuggereerd in (16). De resultaten toonden een

gelijkaardige daling van de Cx43 expressie met het N-terminale antilichaam wanneer cellen

37

worden geïncubeerd met LPS, wat een indicatie is voor het feit dat de expressie van Cx43 globaal

daalt. Echter, wanneer cellen geïncubeerd worden met LPS-CM lijkt Cx43 expressie, geanalyseerd

met behulp van het N-terminale antilichaam, niet-significant gestegen. Dit suggereert een

modificatie van het C-terminale domein.

Fig 8. Expressie van Cx43 na blootstelling aan LPS en LPS-CM. A. De figuur toont de expressie van Cx43 over de

verschillende tijdspunten blootstelling aan LPS (n=5) of na 4h incubatie met LPS- CM van de verschillende tijspunten

(n=2). Beiden tonen een geringe daling. B. De expressie van Cx43 door middel van een N-terminaal antilichaam wordt

gevolgd over de verschillende tijdspunten dat lysaten werden blootgesteld aan LPS. De resultaten tonen een daling

t.o.v. de controle. In tegenstelling daarmee vertoont Cx43 een stijging in cellen behandeld met LPS-CM.

3.3 LPS-CM stimuleert gap junctionele koppeling en hemikanaal activiteit in RBE4 cellen.

3.3.1 Effect van LPS-CM op gap junctionele koppeling

GJC werd bestudeerd aan de hand van scrape loading and dye transfer (SLDT). In deze techniek

wordt gekeken naar de spreiding van de fluorescente en GJ-permeabele kleurstof, 6-

carboxyfluoresceine (6-CF, 376.3 Da ), vanuit de scrape-loaded cellen naar de daarmee

gekoppelde cellen. Deze spreiding volgt een exponentieel verloop waaruit de spatiale constante

(1/K), een maat voor de spreiding, afgeleid wordt. Deze is representatief voor de mate van GJC.

Confluente RBE4 culturen werden gedurende 4h geïncubeerd met geconcentreerd LPS-CM

gecollecteerd van RBE4 cellen die gedurende 3h, 6h of 24h werden blootgesteld aan LPS (1

38

µg/mL) (1/100 in serum-vrij medium). Incubatie van RBE4 culturen met dit CM, versterkt GJC.

Het geconcentreerde LPS-CM bevat alle componenten die groter zijn dan 9kDa, inclusief LPS zelf

(10-20 kDa) en pro-inflammatoire moleculen zoals TNF (17 kDa) en IL1 (17 ka) die

geproduceerd worden in respons op LPS en welke allen zelf een effect hebben op Cx expressie en

GJC (35). Om eventuele effecten van LPS-CM op de functionaliteit van GJs toe te schrijven aan

de daarin aanwezige MMPs maakten we daarom gebruik van 10 µM batimastat, een breed

spectrum inhibitor van MMPs. Analyse van SLDT toont een duidelijke stijging van de GJC in

cellen behandeld met LPS-CM(6h) en LPS-CM(24h) (n=4). Deze stijging wordt volledig teniet

gedaan in aanwezigheid van batimastat, wat aantoont dat MMPs verantwoordelijk zijn voor de

stijging in GJC (Fig 9A). Opmerkelijk is de vaststelling dat deze verhoogde functionaliteit van GJs

gepaard gaat met een licht gedaalde Cx43 expressie (zie 3.2).

3.3.2 Effect van LPS-CM op hemikanaal activiteit

Subconfluente RBE4 culturen waarin cellen niet aan elkaar grenzen en waarin dus geen GJs

gevormd kunnen worden werden gebruikt voor de evaluatie van HK activiteit. Cellen werden

behandeld met LPS-CM zoals beschreven in 3.3.1. HK opening werd bestudeerd d.m.v. dye uptake.

Propidium iodide (PI; 2mM), een fluorescente kleurstof met moleculaire massa van 668 Da wordt

toegevoegd in aanwezigheid van LPS-CM (10 min) om de opening van HKn waar te nemen. Het

is zo dat de HKn meestal dicht zijn onder normale fysiologische omstandigheden en dat ze openen

onder impuls van inflammatoire triggers (9, 12, 33). Om het aantal PI-positieve cellen uit te

drukken als fractie van het totale aantal cellen worden alle cellen aangekleurd met de membraan

permeabele kleurstof Hoechst, die net zoals PI intercaleert in het DNA en de celkern aankleurt.

Vier uur incubatie met LPS-CM (1/100) in serum-vrij medium (zie 3.3.1) leidt tot een stijging

van de HK opening t.o.v. controle-CM met een significante stijging bij LPS-CM(6h) en LPS-

CM(24h) (n=2). Dit effect werd teniet gedaan wanneer batimastat (10 µM) werd gepreïncubeerd

wat een rol aantoont voor MMPs in het CM (Fig 9B). Dye uptake wordt eveneens geïnhibeerd door

Carbenoxole (Cbx, 25µM), een breed spectrum Cx kanaal blokker. Dit toont aan dat de PI werd

opgenomen door open HKn en niet door disruptie van de celmembraan wat optreedt bij celdood

(Fig 9C).

39

Fig 9. Effect van LPS-CM en MMPs op gap

junctionele koppeling en hemikanaal opening in

RBE4 endotheel. A. GJC, geëvalueerd volgens SLDT,

wordt significant versterkt na incubatie met LPS-

CM(6h) en LPS-CM(24h). Deze potentiatie wordt teniet

gedaan wanneer de breed spectrum MMP inhibitor

batimastat (10µM) wordt gepreïncubeerd, wat een rol

voor MMPs in het LPS-CM aantoont. N=4

onafhankelijke experimenten, * significant verschillend

van controle, ^ significant verschillend van het

corresponderende tijdspunt zonder batimastat. B.

Incubatie van RBE4 cellen aan LPS-CM leidt tot een verhoogd aantal PI-positieve cellen. Batimastat reduceert deze

potentiatie weer. n=2 onafhankelijke experimenten, * significant verschillend van kleurstofopname in cellen behandeld

met Ctrl-CM en ^ significant verschillend van het corresponderende CM zonder batimastat. C. Carbenoxolone (25µM,

30min preïncubatie) verhindert eveneens de stijging in PI-positieve cellen teweeggebracht door LPS-CM.

3.4 LPS-CM stimuleert Ca2+ dynamiek in RBE4 cellen

Cx kanalen zijn in belangrijke mate betrokken bij intra- en intercellulaire Ca2+ signalisatie, zo

ondersteunen GJs de directe communicatie van Ca2+ golven, dragen HKn bij tot de paracriene

propagatie van Ca2+ golven en dragen deze laatste ook bij tot intracellulaire Ca2+ oscillaties.

Aangezien de Ca2+ dynamiek ook een belangrijke determinant is voor BHB functie zal nu gekeken

worden wat het effect is van de gevonden MMPs op de Ca2+ dynamiek van deze cellen. Voor dit

experiment werden EC geïncubeerd met CM > 9kDa (1/100 in serum-vrij medium) die

verschillende periodes werd blootgesteld aan LPS. Vervolgens werd de Ca2+-dynamiek bestudeerd

door de cellen te laden met fluo-4 (10µM) en te visualiseren onder de fluorescentiemicroscoop. De

Ca2+ golven werden getriggerd door het verlagen van de extracellulaire Ca2+ concentratie. Dit is

een gekende trigger van HK opening in RBE4 cellen en stimuleert Ca2+ golven, waarschijnlijk door

de loslating van ATP langs open HKn dat vervolgens G-eiwit gekoppelde receptoren op naburige

cellen activeert (6).

40

Fig 10. Effect van LPS-CM op Ca2+ dynamiek in RBE4 cellen. Incubatie van confluente RBE4 culturen met LPS-

CM leidt tot een verhoogd aantal Ca2+ golven en een verhoogd aantal oscillerende cellen in Ca2+-vrij medium. n=3, *

significant t.o.v. Ctrl-CM.

De resultaten tonen een stijging van het aantal oscillerende cellen met LPS-CM ten opzichte van

cellen blootgesteld aan Ctrl-CM. Ook het aantal Ca2+ golven dat optreedt in de 10min durende

observatieperiode neemt toe in aanwezigheid van LPS-CM (Fig 10). Op basis van de beelden kan

ook geconcludeerd worden dat het merendeel van de Ca2+ golven paracrien is, wat duidt op een rol

voor HKn (data niet getoond). Deze data, samen met de dye uptake en SLDT data geven aanleiding

tot het besluit dat MMPs HK opening en GJC versterken wat leidt tot verhoogde Ca2+ golf activiteit.

Het gebruik van batimastat is echter noodzakelijk om de rol van MMPs hierin definitief te

bevestigen.

3.5 Effect van LPS-CM op expressie en lokalisatie van Cx43, Cx37 en Cx40

Het effect van LPS-CM op Cx43 expressie werd reeds nagegaan d.m.v. SDS-PAGE en Western

blotting, maar deze techniek zegt niets over de eventuele redistributie van Cxs in de cel. Daarom

keken we ook naar Cx43 expressie met behulp van immunokleuring. Daarenboven gebruikten we

deze techniek ook om de expressie van de andere endotheliale Cxs, Cx37 en Cx40, na te gaan. De

expressie van Cx43 leek te dalen net zoals het geval was bij Western Blotting. De immuunkleuring

met het C-terminale antilichaam bevestigt dus de resultaten van de WB (Fig 11). Ondanks de

dalende expressie konden in elk van de condities wel nog GJ plaques waargenomen worden. Samen

met expressie van Cx43 blijkt ook de expressie van Cx37 te dalen (Fig 11). Daarentegen stijgt de

expressie van Cx40 sterk in aanwezigheid van LPS-CM(3h) en LPS-CM(6h) (Fig 11). Cx40 kan

dus eventueel verantwoordelijk zijn voor de verhoogde GJC en toegenomen HK opening die wordt

waargenomen met dalende Cx37 en Cx43 expressie in aanwezigheid van LPS-CM.

41

Fig 11. Effect van LPS-CM op Cx expressie. Representatieve beeldjes van een immunokleuring tegen Cx43, Cx40

en Cx37 toont dat blootstelling aan LPS-CM leidt tot een progressieve daling van Cx43 en Cx37, en een stijging van

Cx40 welke zich lijken te herstellen bij LPS-CM(24h). De pijltjes wijzen op de aanwezigheid van gap junctionele

plaques. Scale bar is 25µm.


blootstelling aan LPS

We evalueerden eveneens het effect van directe exposie aan LPS (1 µg/mL) op GJC en HK

opening. De rol van MMPs werd daarbij opnieuw onderzocht door middel van batimastat.

Opmerkelijk genoeg zijn de resultaten hierbij volledig tegengesteld aan de resultaten die we

behaalden met LPS-CM. Een lichte, doch niet significante stijging van de GJC werd gezien t.o.v.

de controle (n=3) maar deze stijging is veel geringer dan wanneer er gewerkt wordt met LPS-CM.

Nog frappanter is dat wanneer de inhibitor batimastat toegevoegd wordt een toename in GJC

optreedt. Gelijkaardige resultaten werden behaald voor dye uptake studies. Dit suggereert dat

MMPs in deze experimentele opzet een eerder inhiberende rol spelen, tegengesteld aan wat

geobserveerd wordt in cellen die werden blootgesteld aan geconcentreerd LPS-CM waarin enkel

componenten > 9kDa aanwezig zijn. Verdere studies naar de expressie en lokalisatie van Cx37,

Cx40 en Cx43 zullen hierover meer uitsluitsel kunnen geven.

42

Fig 12. Effect van LPS op gap junctionele koppeling en

hemikanaal opening in RBE4 endotheel. A. GJC,

geëvalueerd volgens SLDT, wordt mild, doch niet

significant, versterkt na incubatie met LPS (1µg/mL) op 6h

en 24h na blootsteling. Incubatie met de breed spectrum

MMP inhibitor batimastat (10µM) potentieert dye

koppeling wat een inhiberende rol voor MMPs aantoont,

tegengesteld aan hun rol in LPS-CM . N=3 onafhankelijke

experimenten B-C. Exposie van RBE4 cellen aan LPS leidt

tot een verhoogd aantal PI-positieve cellen. Ook hier

stimuleert batimastat dye uptake verder (n=3

onafhankelijke experimenten); * significant verschillend van kleurstofopname in cellen behandeld met vehicle en ^

significant verschillend van het corresponderende tijdspunt zonder batimastat. Carbenoxolone (25µM, 30min

preïncubatie) verhindert de stijging in PI-positieve cellen teweeggebracht door LPS, behalve op 24h na LPS

behandeling, wat zou kunnen ijzen op een lichte mate van celdood.

43

4. DISCUSSIE

4.1 Doel van de studie

Zoals beschreven in de inleiding, hebben Cxs een invloed op de permeabiliteit van de BHB en

speelt Ca2+ hierin een belangrijk rol speelt (6, 13). Het doel van deze studie was om na te gaan of

MMPs, via een invloed op Cxs, BHB permeabiliteit kunnen beïnvloeden in inflammatoire

omstandigheden. Het idee voor deze studie kwam voort van resultaten uit het hart, waar men voor

het eerst kon aantonen dat Cx43 een substraat is van MMPs. Zo zou het gating particle (de C-

terminus) van Cx43 een substraat zijn van MMP-7. Verder speelt MMP-7 een belangrijke rol in de

GJC koppeling in het hart aangezien MMP-7 knockout leidt tot een verhoogde elektrische

conductie na een myocard infarct (16). Van een familie van 25 MMPs zijn de gelatinasen MMP-2

en MMP-9 het sterkst aanwezig in de vroege en late stadia van chronisch hartfalen (65). Tijdens

perifere en centrale inflammatie worden deze zelfde MMPs ook vrijgesteld in het hersenweefsel

en het bloed (51, 56, 57) en zijn het ook de gelatinasen die het meest bijdragen tot BHB disruptie

(53). In deze thesis onderzoeken we of Cx43, dat tot expressie komt in het BHB endotheel, een

substraat is van MMP-2, MMP-9 en MMP-7 en of de interactie tussen deze MMPs en Cx43

aanleiding geeft tot verhoogde endotheliale [Ca2+]i, wat een mediator is van BHB dysfunctie.

4.2 LPS activeert en verhoogt MMP expressie

De resultaten tonen een verhoogde expressie en activatie van MMPs in inflammatoire

omstandigheden. Dit komt overeen met talrijke studies over neurologische aandoeningen waar er

in combinatie van neuroinflammatie een verhoogde expressie en activiteit is van MMPs (73, 74).

Inflammatie werd in vitro nagebootst door de toediening van LPS, een component van gram-

negatieve bacteriën waarvan geweten is dat het MMPs activeert (75), aan RBE4 cellen. Van deze

cellen werden de lysaten en het CM gecontroleerd op de aanwezigheid van MMPs. De initiële

detectie gebeurde door gebruik te maken van gelatine zymografie. Hier zagen we duidelijk de

aanwezigheid van de gelatinases in het CM, welke op basis van hun MW, als MMP-2 of MMP-9

geïdentificeerd konden worden. MMP-7 kon via de zymografie niet gedetecteerd worden. Hoewel

dit protease geacht wordt gelatine te klieven (69), blijkt een caseine gel meer optimaal te zijn voor

de detectie ervan (70). Net door deze moeilijke detectiemogelijkheid in gelatinegels en zelfs in

caseinegels werd een heparin-enhanced zymography ontwikkeld voor de detectie van MMP-7 (76)

en deze techniek kan in de toekomst ook in deze studie gebruikt worden. In lysaten van RBE4

44

cellen blootgesteld aan LPS werden geen MMPs gedetecteerd d.m.v. gelatine zymografie.

Mogelijks is het detectieniveau van de MMPs te laag in de lysaten. De expressie van de

verschillende MMPs werd eveneens nagegaan door gebruik te maken van gel electroforese en

Western blotting. Hiermee zagen we in de lysaten wel een duidelijke stijging van alle (pro)-MMPs

in functie van de periode van blootstelling aan LPS. Deze detectie zal echter nog een aantal maal

herhaald moeten worden om een statistisch significante conclusie te geven. Ook m.b.v. Western

blotting bleef het echter erg moeilijk om MMPs te detecteren, de reden waarom is helaas nog

onduidelijk. Net als in de zymogram, toont het CM een matige stijging van (pro)-MMP-9 op de 3h

en 24h tijdspunten (en een geringe daling op 6h). (Pro)-MMP-2 en MMP-7 lijken te stijgen na 24u

maar dalen eerst op 3h en 6h. Zoals hierboven vermeld is MMP-9 het dominante gelatinase wat

betreft de BHB schade (40). De reden dat (pro)-MMP-2 daalt na 3 en 6h en dan weer stijgt na 24h

kan zijn doordat het prominenter aanwezig is in ruststadia en nadien ook in de fase van

weefselherstel. MMP-2 draagt bij aan de initiële schade, maar het verder verloop wordt vooral

gemedieerd door MMP-9. MMPs hebben een duale rol omdat ze kunnen bijdragen tot

neurovasculaire schade en herstel. Zo is MMP-2 expressie vooral gestegen de eerste 2-5 dagen na

een beroerte en ziet men op subcellular niveau in herseninfarct regio’s dat vooral MMP-9 en TIMP-

2 opgereguleerd zijn in cerebrale bloedvaten (44). De expressie van TIMPs moet in toekomst nog

in rekening worden gebracht en er moet verder gezocht worden naar een verklaring voor het

verschil in expressiepatronen van intra- en extracellulaire MMPs.


aan MMPs

Ons baserend op het onderzoek in het hart, weten we dat Cx43 een substraat vormt van MMPs

(16). Daarom wilden we deze hypothese eveneens testen in BHB endotheel. Uit bovenstaande

experimenten hebben we zekerheid over de aanwezigheid van MMPs in cellen blootgesteld aan

LPS (lysaten) en LPS-CM. De invloed van MMPs op de expressie van Cx43 in RBE4 cellen werd

vervolgens getest door cellen bloot te stellen aan LPS of LPS-CM. De algemene trend, zowel in

RBE4 cellen blootgesteld aan LPS als aan LPS-CM is een chronologische daling van de Cx43

detectie over de verschillende tijdspunten. Dit bevestigt dat de MMPs aanwezig tijdens inflammatie

de expressie van Cx43 kunnen down-reguleren. Opmerkelijk echter, is dat bij de cellen blootgesteld

aan LPS het volledige eiwit (gedetecteerd met een N- en C-terminaal antilichaam) een lagere

expressie vertoont terwijl in LPS-CM enkel de detectie met het C-terminale antilichaam een daling

45

vertoont, terwijl N-terminale detectie een stijging vertoont. Dit wijst mogelijk op een post-

translationele modificatie of afbraak het het Cx43 C-terminale domein door de proteasen waardoor

het C-terminale antilichaam zijn target niet meer herkent. Toekomstige experimenten met de MMP

inhibitor batimastat zullen moeten uitwijzen of de down-regulatie/modificatie volledig en enkel te

wijten is aan MMPs, dan wel aan andere componenten aanwezig tijdens inflammatie. Het feit dat

in CM geen componenten zitten kleiner dan 9kDa kan alleszins de verschillende expressiepatronen

tussen LPS en LPS-CM verklaren. Tevens kunnen we ook niet weten of de verlaagde expressie

met zekerheid te wijten is aan de gedetecteerde MMPs, met name MMP-2, MMP-9 en MMP-7. Ze

zijn zeker en vast de prominente MMPs aanwezig tijdens herseninflammatie (53), maar er zijn ook

andere MMPs (oa. MMP-3 en MMP-13) actief aanwezig (44). Ook werd via een oppervlakte

resonantie techniek aangetoond dat in het hart, Cx43 mogelijk geen substraat is van MMP-2 (16).

Een toekomstperspectief is om alle betrokken MMPs te identificeren en cellen rechtstreeks te

incuberen met deze MMPs om hun individuele rol op Cx43 expressie te achterhalen.

4.4 LPS-CM stimuleert gap junctionele koppeling en hemikanaal activiteit in RBE4 cellen.

BHB opening, gemedieerd door MMPs in neuroinflammatie (53), gebeurt vnl. via afbraak van de

ECM en TJs, maar Cxs spelen ook een rol in de BHB opening door stabilisatie van de juncties en

ook door hun bijdrage aan [Ca2+]i. De intrinsieke gating eigenschappen van Cxs, die veelal omvat

zijn in het C-terminale domein en gevoelig zijn aan [Ca2+]i (77) zelf, pH (77) en fosforylatie-status

(72) zijn hierbij essentieel. Of MMPs direct een invloed uitoefenen op de gating, en dus op Cx

kanaal functie, is nog niet geweten. Daarom werden functionele testen uitgevoerd die aangeven of

GJC en HK opening wijzigen in aanwezigheid van MMPs. De stijging van GJC en HK activiteit

in cellen behandeld met LPS-CM(6h) en LPS-CM(24h) werd volledig teniet gedaan door de

aanwezigheid van batimastat wat aantoont dat MMPs verantwoordelijk zijn voor de stijging in GJC

en HK activiteit. GJC en HK opening wordt beïnvloed op twee verschillende manieren; enerzijds

is er de lange termijn regulatie, zijnde het aantal Cxs of GJ plaques aanwezig in de membraan, en

anderzijds is er de korte termijn regulatie zijnde de gating eigenschappen van het kanaal (78). In

LPS-CM speelt duidelijk de korte termijn regulatie een rol. Aangezien detectie met het N-terminale

antilichaam erop wijst dat niet het volledige eiwit wordt gedownreguleerd moet er sprake zijn van

protease activiteit die de C-terminus klieft of van post-translationele modificaties in dit domein die

een invloed hebben op de gating en waardoor detectie met het C-terminale antilichaam niet meer

mogelijk is. Fosforylatie is een voorbeeld van een post-translationele modificatie. Fosforylatie is

46

niet nodig voor de vorming van GJs aangezien Cx26, het Cx met de kortste C-terminus zonder

fosforylatiesites toch nog functionele GJs kan vormen (72). De fosforylatie-status bepaalt wel in

belangrijke mate de sterkte van GJC. Het C-terminale antilichaam is gericht tegen een deel van de

C-terminus, zijnde de laatste 19 aminozuren, waar zich residuen bevinden die gefosforyleerd

worden door verscheidene kinasen en aanleiding geven tot een gewijzigde GJC (72). Fosforylatie

is ook betrokken bij het ball-and-chain mechanisme, een interactie tussen de intracellulaire lus (IL)

en de CT van Cxs die normaliter GJs sluit (79). Fosforylatie zorgt voor de insertie van negatieve

ladingen in de CT waardoor die kan interageren met de positieve ladingen van de IL. Wanneer de

IL reageert met de CT zijn de GJs dicht. Echter, fosforylatie van serine residuen door bv. PKA die

GJC verhogen of een verandering van IL-CT interactie door gewijzigde fosforylatie is mogelijk

niet betrokken bij MMPs aangezien we geen veranderingen zagen in de fosforylatiestatus van Cx43

(zie Fig 8A). Een andere verklaring voor de verhoogde functionaliteit en gedaalde Cx43 C-

terminale detectie is de verhoogde protease activiteit, bv. MMPs die het C-terminale domein

verwijderen, zoals aangetoond in het hart (16), hierdoor zal IL-CT interactie niet kunnen doorgaan

en blijven GJs open. Finaal tonen immuunkleuringen samen met een daling van Cx43 (C-terminale

detectie) ook een daling van Cx37. Deze gecoördineerde regulatie werd reeds eerder beschreven

(6). Belangrijker nog is dat Cx40 expressie stijgt wat een andere, mogelijke verklaring is voor de

gestegen GJC. Verder onderzoek zal dit, alsook de invloed van MMPs op de andere endotheliale

Cxs, verder moeten aantonen.

4.5 LPS-CM stimuleert Ca2+ dynamiek in RBE4 cellen

In BHB endotheel veroorzaken lage extracellulaire [Ca2+] condities intercellulaire Ca2+-golven die

de BHB permeabiliteit verhogen. Deze Ca2+ golven zijn gebaseerd zijn op de beweging van IP3

en/of Ca2+ via GJs of op paracriene signalisatie waarbij HKn functioneren als een ATP

vrijstellingskanaal (13). Via hun bijdrage aan de endotheliale Ca2+-dynamiek dragen Cxs zo bij tot

de alteratie van de BHB permeabiliteit. Daarom is het verlagen van extracellaire [Ca2+] een ideale

manier om de invloed van de MMPs (aanwezig in het CM) op Cxs en daarmee geassocieerde

verandering in BHB permeabiliteit te bestuderen. Het resultaat toont een stijgend aantal repetitieve

Ca2+ oscillaties en een stijgend aantal, veelal paracriene, Ca2+ golven in aanwezigheid van LPS-

CM. Dit toont aan dat de MMPs een invloed kunnen hebben op de Ca2+ dynamiek (batimastat moet

echter in de toekomst bevestiging brengen) en bijgevolg op de BHB permeabiliteit. Dit experiment

47

suggereert dat de hypothese van deze thesis, dat de MMPs de BHB permeabiliteit kunnen verhogen

op een Cx- en Ca2+ gemedieerde manier, bevestigd kan worden.


blootstelling aan LPS

SLDT en Dye Uptake werden herhaald in RBE4 cellen die rechtstreeks geïncubeerd werden met

LPS. Tegengesteld aan wat verwacht werd, ziet men net een stijging in GJC en HK opening in

aanwezigheid van batimastat. Dit doet vermoeden dat er andere mechanismen betrokken zijn. LPS

leidt inderdaad tot een volledige downregulatie van Cx43 want ook detectie met het N-terminale

antilichaam toont een daling. Toekomstig onderzoek van de expressie van andere Cxs zal mogelijks

een verklaring geven waarom de GJC toch lichtjes stijgt. Andere Cxs kunnen immers de negatieve

regulatie van Cx43 opvangen. Een mogelijke verklaring voor de verschillen tussen LPS en LPS-

CM is dat de LPS en MMP concentraties hoger zijn in het geconcentreerde CM. Andere

componenten die in de <9kDa fractie zitten worden tevens uitgesloten bij exposie aan LPS-CM,

maar zijn nog aanwezig bij LPS incubatie. Intracellulaire werking van MMPs kan verschillen van

extracellulaire werking of er kunnen andere MMPs in de cel aanwezig zijn in vergelijking met

extracellulaire MMPs. Het is inderdaad zo dat batimastat een breed spectrum inhibitor is die

activatie van MMP-1, MMP-3, MMP-2, MMP-9 en MMP-7 verhindert. Maar de aanwezigheid van

MMP-1 en MMP-3 werd niet nagegaan in de cellysaten en het LPS-CM. De aan of afwezigheid

van deze MMPs kan dus ook een invloed hebben op de GJC.

REFERENTIES

1. De Bock M, Vandenbroucke RE, Decrock E, Culot M, Cecchelli R, Leybaert L. A new angle on blood-CNS

interfaces: A role for connexins? Febs Lett. 2014;588(8):1259-70.

2. Abbott NJ, Patabendige AAK, Dolman DEM, Yusof SR, Begley DJ. Structure and function of the blood-brain

barrier. Neurobiol Dis. 2010;37(1):13-25.

3. Abbott NJ, Friedman A. Overview and introduction: The blood-brain barrier in health and disease. Epilepsia.

2012;53:1-6.

4. Seo JH, Guo SZ, Lok J, Navaratna D, Whalen MJ, Kim KW, et al. Neurovascular Matrix Metalloproteinases and

the Blood-Brain Barrier. Curr Pharm Design. 2012;18(25):3645-8.

5. Hawkins BT, Davis TP. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev.

2005;57(2):173-85.

6. De Bock M, Culot M, Wang N, Bol M, Decrock E, De Vuyst E, et al. Connexin channels provide a target to

manipulate brain endothelial calcium dynamics and blood-brain barrier permeability. J Cerebr Blood F Met.

2011;31(9):1942-57.

7. Danesh-Meyer HV, Green CR. Focus on Molecules: Connexin 43-Mind the gap. Exp Eye Res. 2008;87(6):494-5.

48

8. Davidson JO, Green CR, Nicholson LFB, Bennet L, Gunn AJ. Connexin hemichannel blockade is neuroprotective

after, but not during, global cerebral ischemia in near-term fetal sheep. Exp Neurol. 2013;248:301-8.

9. Robertson J, Lang S, Lambert PA, Martin PE. Peptidoglycan derived from Staphylococcus epidermidis induces

Connexin43 hemichannel activity with consequences on the innate immune response in endothelial cells. Biochem J.

2010;432:133-43.

10. Yoon JJ, Green CR, O'Carroll SJ, Nicholson LFB. Dose-dependent protective effect of connexin43 mimetic peptide

against neurodegeneration in an ex vivo model of epileptiform lesion. Epilepsy Res. 2010;92(2-3):153-62.

11. Decrock E, De Vuyst E, Vinken M, Van Moorhem M, Vranckx K, Wang N, et al. Connexin 43 hemichannels

contribute to the propagation of apoptotic cell death in a rat C6 glioma cell model. Cell Death Differ. 2009;16(1):151-

63.

12. Orellana JA, Saez PJ, Shoji KF, Schalper KA, Palacios-Prado N, Velarde V, et al. Modulation of Brain

Hemichannels and Gap Junction Channels by Pro-Inflammatory Agents and Their Possible Role in Neurodegeneration.

Antioxid Redox Sign. 2009;11(2):369-99.

13. De Bock M, Wang N, Decrock E, Bol M, Gadicherla AK, Culot M, et al. Endothelial calcium dynamics, connexin

channels and blood-brain barrier function. Prog Neurobiol. 2013;108:1-20.

14. Haorah J, Ramirez SH, Schall K, Smith D, Pandya R, Persidsky Y. Oxidative stress activates protein tyrosine

kinase and matrix metalloproteinases leading to blood-brain barrier dysfunction. J Neurochem. 2007;101(2):566-76.

15. Jin R, Yang GJ, Li GH. Molecular insights and therapeutic targets for blood-brain barrier disruption in ischemic

stroke: Critical role of matrix metalloproteinases and tissue-type plasminogen activator. Neurobiol Dis.

2010;38(3):376-85.

16. Lindsey ML, Escobar P, Mukherjee R, Goshorn DK, Sheats NJ, Bruce JA, et al. Matrix metalloproteinase-7 affects

connexin-43 levels, electrical conduction, and survival after myocardial infarction. Circulation. 2006;113(25):2919-

28.

17. Wu XH, Huang W, Luo G, Alain LA. Hypoxia induces connexin 43 dysregulation by modulating matrix

metalloproteinases via MAPK signaling. Mol Cell Biochem. 2013;384(1-2):155-62.

18. Wang J, Li JS, Liu HZ, Yi SL, Su GY, Zhang Y, et al. Dynamic alterations of connexin43, matrix

metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 during ventricular fibrillation in canine. Mol

Cell Biochem. 2014;391(1-2):259-66.

19. De Bock M, Decrock E, Wang N, Bol M, Vinken M, Bultynck G, et al. The dual face of connexin-based astroglial

Ca2+ communication: A key player in brain physiology and a prime target in pathology. Bba-Mol Cell Res.

2014;1843(10):2211-32.

20. Abbott NJ, Ronnback L, Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci.

2006;7(1):41-53.

21. Wolburg H, Noell S, Mack A, Wolburg-Buchholz K, Fallier-Becker P. Brain endothelial cells and the glio-vascular

complex. Cell Tissue Res. 2009;335(1):75-96.

22. Bauer HC, Bauer H. Neural induction of the blood-brain barrier: Still an enigma. Cell Mol Neurobiol.

2000;20(1):13-28.

23. Somjen GG. The regulation of ions in the brain. Oxford University Press. 2004:13-62.

24. Collard CD, Park KA, Montalto MC, Alapati S, Buras JA, Stahl GL, et al. Neutrophil-derived glutamate regulates

vascular endothelial barrier function. J Biol Chem. 2002;277(17):14801-11.

25. Kim YV, Di Cello F, Hillaire CS, Kim KS. Differential Ca2+ signaling by thrombin and protease-activated

receptor-1-activating peptide in human brain microvascular endothelial cells. Am J Physiol-Cell Ph. 2004;286(1):C31-

C42.

26. Raslan F, Schwarz T, Meuth SG, Austinat M, Bader M, Renne T, et al. Inhibition of bradykinin receptor B1 protects

mice from focal brain injury by reducing blood-brain barrier leakage and inflammation. J Cerebr Blood F Met.

2010;30(8):1477-86.

27. Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Bio.

2000;1(1):11-21.

28. Kuhlmann CRW, Gerigk M, Bender B, Closhen D, Lessmann V, Luhmann HJ. Fluvastatin prevents glutamate-

induced blood-brain-barrier disruption in vitro. Life Sci. 2008;82(25-26):1281-7.

29. Verin AD, Cooke C, Herenyiova M, Patterson CE, Garcia JGN. Role of Ca2+/calmodulin-dependent phosphatase

2B in thrombin-induced endothelial cell contractile responses. Am J Physiol-Lung C. 1998;275(4):L788-L99.

30. Fischer S, Wiesnet M, Renz D, Schaper W. H2O2 induces paracellular permeability of porcine brain-derived

microvascular endothelial cells by activation of the p44/42 MAP kinase pathway. Eur J Cell Biol. 2005;84(7):687-97.

31. Wilhelm I, Farkas AE, Nagyoszi P, Varo G, Balint Z, Vegh GA, et al. Regulation of cerebral endothelial cell

morphology by extracellular calcium. Phys Med Biol. 2007;52(20):6261-74.

49

32. De Bock M, Culot M, Wang N, da Costa A, Decrock E, Bol M, et al. Low extracellular Ca2+ conditions induce an

increase in brain endothelial permeability that involves intercellular Ca2+ waves. Brain Res. 2012;1487:78-87.

33. Chandrasekhar A, Bera AK. Hemichannels: permeants and their effect on development, physiology and death. Cell

Biochem Funct. 2012;30(2):89-100.

34. De Bock M, Kerrebrouck M, Wang N, Leybaert L. Neurological manifestations of oculodentodigital dysplasia: a

Cx43 channelopathy of the central nervous system? Frontiers in pharmacology. 2013;4:120.

35. Eugenin EA, Basilio D, Saez JC, Orellana JA, Raine CS, Bukauskas F, et al. The Role of Gap Junction Channels

During Physiologic and Pathologic Conditions of the Human Central Nervous System. J Neuroimmune Pharm.

2012;7(3):499-518.

36. Liao Y, Day KH, Damon DN, Duling BR. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension

and bradycardia in mice. P Natl Acad Sci USA. 2001;98(17):9989-94.

37. Decrock E, Krysko DV, Vinken M, Kaczmarek A, Crispino G, Bol M, et al. Transfer of IP3 through gap junctions

is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 2012;19(6):947-57.

38. Kawano S, Otsu K, Kuruma A, Shoji S, Yanagida E, Muto Y, et al. ATP autocrine/paracrine signaling induces

calcium oscillations and NFAT activation in human mesenchymal stem cells. Cell Calcium. 2006;39(4):313-24.

39. Verma V, Hallett MB, Leybaert L, Martin PE, Evans WH. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates

calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur J Cell Biol. 2009;88(2):79-90.

40. Dejonckheere E, Vandenbroucke RE, Libert C. Matrix metalloproteinases as drug targets in ischemia/reperfusion

injury. Drug Discov Today. 2011;16(17-18):762-78.

41. Zlokovic BV. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 2008;57(2):178-

201.

42. Zattoni M, Mura ML, Deprez F, Schwendener RA, Engelhardt B, Frei K, et al. Brain Infiltration of Leukocytes

Contributes to the Pathophysiology of Temporal Lobe Epilepsy. J Neurosci. 2011;31(11):4037-50.

43. Kundu S, Pushpakumar SB, Tyagi A, Coley D, Sen U. Hydrogen sulfide deficiency and diabetic renal remodeling:

role of matrix metalloproteinase-9. Am J Physiol-Endoc M. 2013;304(12):E1365-E78.

44. Morancho A, Rosell A, Garcia-Bonilla L, Montaner J. Metalloproteinase and stroke infarct size: role for anti-

inflammatory treatment? Ann Ny Acad Sci. 2010;1207:123-33.

45. Eugenin EA, Eckardt D, Theis M, Willecke K, Bennett MVL, Saez JC. Microglia at brain stab wounds express

connexin 43 and in vitro form functional gap junctions after treatment with interferon-gamma and tumor necrosis

factor-alpha. P Natl Acad Sci USA. 2001;98(7):4190-5.

46. Sarieddine MZR, Scheckenbach KEL, Foglia B, Maass K, Garcia I, Kwak BR, et al. Connexin43 modulates

neutrophil recruitment to the lung. J Cell Mol Med. 2009;13(11-12):4560-70.

47. Butler GS, Overall CM. Updated Biological Roles for Matrix Metalloproteinases and New "Intracellular"

Substrates Revealed by Degradomics. Biochemistry-Us. 2009;48(46):10830-45.

48. Chow AK, Cena J, Schulz R. Acute actions and novel targets of matrix metalloproteinases in the heart and

vasculature. Brit J Pharmacol. 2007;152(2):189-205.

49. Hulboy DL, Rudolph LA, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases as mediators of reproductive function. Mol

Hum Reprod. 1997;3(1):27-45.

50. Vu TH, Werb Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology. Gene Dev.

2000;14(17):2123-33.

51. Roy R, Zhang B, Moses MA. Making the cut: Protease-mediated regulation of angiogenesis. Exp Cell Res.

2006;312(5):608-22.

52. Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat Rev

Mol Cell Bio. 2007;8(3):221-33.

53. Gurney KJ, Estrada EY, Rosenberg GA. Blood-brain barrier disruption by stromelysin-1 facilitates neutrophil

infiltration in neuroinflammation. Neurobiol Dis. 2006;23(1):87-96.

54. Kupai K, Szucs G, Cseh S, Hajdu I, Csonka C, Csont T, et al. Matrix metalloproteinase activity assays: Importance

of zymography. J Pharmacol Toxicol. 2010;61(2):205-9.

55. Givvimani S, Kundu S, Narayanan N, Armaghan F, Qipshidze N, Pushpakumar S, et al. TIMP-2 mutant decreases

MMP-2 activity and augments pressure overload induced LV dysfunction and heart failure. Arch Physiol Biochem.

2013;119(2):65-74.

56. Montaner J, Alvarez-Sabin J, Molina C, Angles A, Abilleira S, Arenillas J, et al. Matrix metalloproteinase

expression after human cardioembolic stroke - Temporal profile and relation to neurological impairment. Stroke.

2001;32(8):1759-66.

57. Montaner J, Alvarez-Sabin J, Molina CA, Angles A, Abilleira S, Arenillas J, et al. Matrix metalloproteinase

expression is related to hemorrhagic transformation after cardioembolic stroke. Stroke. 2001;32(12):2762-7.

50

58. Fagan SC, Cronic LE, Hess DC. Minocycline Development for Acute Ischemic Stroke. Transl Stroke Res.

2011;2(2):202-8.

59. Yang Y, Estrada EY, Thompson JF, Liu WL, Rosenberg GA. Matrix metalloproteinase-mediated disruption of

tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia

in rat. J Cerebr Blood F Met. 2007;27(4):697-709.

60. Hartz AMS, Bauer B, Soldner ELB, Wolf A, Boy S, Backhaus R, et al. Amyloid-beta Contributes to Blood-Brain

Barrier Leakage in Transgenic Human Amyloid Precursor Protein Mice and in Humans With Cerebral Amyloid

Angiopathy. Stroke. 2012;43(2):514-23.

61. Chang DI, Hosomi T, Lucero J, Heo JH, Abumiya J, Mazar IP, et al. Activation systems for latent matrix

metalloproteinase-2 are upregulated immediately after focal cerebral ischemia. J Cerebr Blood F Met.

2003;23(12):1408-19.

62. Le NTV, Xue ML, Castelnoble LA, Jackson CJ. The dual personalities of matrix metalloproteinases in

inflammation. Front Biosci. 2007;12:1475-87.

63. Chiu PS, Lai SC. Matrix metalloproteinase-9 leads to blood-brain barrier leakage in mice with eosinophilic

meningoencephalitis caused by Angiostrongylus cantonensis. Acta Trop. 2014;140:141-50.

64. Gidday JM, Gasche YG, Copin JC, Shah AR, Perez RS, Shapiro SD, et al. Leukocyte-derived matrix

metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral

ischemia. Am J Physiol-Heart C. 2005;289(2):H558-H68.

65. Ovechkin AV, Tyagi N, Rodriguez WE, Hayden MR, Moshal KS, Tyagi SC. Role of matrix metalloproteinase-9

in endothelial apoptosis in chronic heart failure in mice. J Appl Physiol. 2005;99(6):2398-405.

66. Buhler LA, Samara R, Guzman E, Wilson CL, Krizanac-Bengez L, Janigro D, et al. Matrix metalloproteinase-7

facilitates immune access to the CNS in experimental autoimmune encephalomyelitis. Bmc Neurosci. 2009;10.

67. Banda MJ, Rice AG, Griffin GL, Senior RM. Alpha-1-Proteinase Inhibitor Is a Neutrophil Chemoattractant after

Proteolytic Inactivation by Macrophage Elastase. J Biol Chem. 1988;263(9):4481-4.

68. De Vuyst E, Decrock E, De Bock M, Yamasaki H, Naus CC, Evans WH, et al. Connexin hemichannels and gap

junction channels are differentially influenced by lipopolysaccharide and basic fibroblast growth factor. Mol Biol Cell.

2007;18(1):34-46.

69. Woessner JF, Taplin CJ. Purification and Properties of a Small Latent Matrix Metalloproteinase of the Rat Uterus.

J Biol Chem. 1988;263(32):16918-25.

70. Hu X, Beeton C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of visualized

experiments : JoVE. 2010(45).

71. Solan JL, Lampe PD. Specific Cx43 phosphorylation events regulate gap junction turnover in vivo. Febs Lett.

2014;588(8):1423-9.

72. Lampe PD, Lau AF. The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communication. Int J Biochem

Cell B. 2004;36(7):1171-86.

73. Anthony DC, Ferguson B, Matyzak MK, Miller KM, Esiri MM, Perry VH. Differential matrix metalloproteinase

expression in cases of multiple sclerosis and stroke. Neuropath Appl Neuro. 1997;23(5):406-15.

74. Clark AW, Krekoski CA, Bou SS, Chapman KR, Edwards DR. Increased gelatinase A (MMP-2) and gelatinase B

(MMP-9) activities in human brain after focal ischemia. Neurosci Lett. 1997;238(1-2):53-6.

75. Chang CC, Tien CH, Lee EJ, Juan WS, Chen YH, Hung YC, et al. Melatonin inhibits matrix metalloproteinase-9

(MMP-9) activation in the lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 and BV2 cells and a mouse model of

meningitis. J Pineal Res. 2012;53(2):188-97.

76. Yu WH, Woessner JF. Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal Biochem.

2001;293(1):38-42.

77. Peracchia C, Wang XG. Connexin domains relevant to the chemical gating of gap junction channels. Braz J Med

Biol Res. 1997;30(5):577-90.

78. Peracchia C. Chemical gating of gap junction channels; roles of calcium, pH and calmodulin. Biochimica et

biophysica acta. 2004;1662(1-2):61-80.

79. Zhou L, Kasperek EM, Nicholson BJ. Dissection of the molecular basis of pp60(v-src) induced gating of connexin

43 gap junction channels. J Cell Biol. 1999;144(5):1033-45.

51

ADDENDUM: SAMENSTELLING BUFFERS EN MEDIA

RBE4 cultuurmedium

α-minimum essentieel medium (αMEM)/Ham’s F10 (Invitrogen)

10% foetaal kalfserum (Invitrogen)

Glutamine (Life Technologies, Merelbeke, België)

Geneticine (Life Technologies, Merelbeke, België)

humaan recombinant basische fibroblast groei factor (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)

Trypsine-EDTA (Invitrogen)

Trypsine is een protease dat cel-cel en cel-substraat contacten verbreekt. Gecombineerd met

EDTA (een calciumchelator) zorgt dit voor het loskomen van de cellen

HBSS-HEPES

MgSO4.7H2O 0.81 mM (VWR international)

CaCl2.2H2O 0.95 mM (VWR international)

NaCl 137 mM (VWR international)

Na2HPO4.2H2O 0.18 mM (VWR international)

KCl 5.36 mM (Merck)

KH2PO4 0.44 mM (VWR international)

D-glucose 5.55 mM (VWR international)

HEPES 25 mM (Sigma-Aldrich)

in dH2O; pH = 7.4

Ca2+ vrije buffer

KCl (5,36 mM)

KH2PO4 (0,44 mM)

NaCl (137 mM)

Na2HPO4.2H20 (0,18 mM)

EGTA (4,47 mM)

HEPES (25 mM)

52

Glucose (5,55 mM)

In dH2O; op pH 7,4 brengen

SLDT buffer


KCl 5.36 mM (Merck)

MgCl2 0.81 mM (VWR international)

D-glucose 5.55 mM (VWR international)

HEPES 25 mM (Sigma-Aldrich)

in dH2O; pH = 7.4

PBSD+


KCl 2,68 mM (VWR international)

CaCl2 0,90 mM (VWR international)

MgCl2.6H20 0,334 mM (VWR international)

KH2PO4 1,47 mM (VWR international)

Na2HPO4.2H2O 6,46 mM (VWR international)

in dH2O; pH = 7,4

RIPA buffer

Tris (pH 8,2) 25 mM ( Sigma-aldrich, Bornem België)


NP40 0,5 % (Sigma-aldrich)

Deoxycholaat 0,5% (Sigma-aldrich)

SDS 0,1% (Sigma-aldrich)

Toevoegen vlak voor gebruik:

- 20 µL van een mini-EDTA free protease tablet (Roche Diagnostics) opgelost in dH2O

- 0,055 g/ml β glycerolfosfaat (sigma-aldrich)

- 1µL/mL 1M DTT (eindconcentratie is 1mM) (Sigma-aldrich)

- 20 µL/mL Standaard fosfatase inhibitor cocktail (Sigma-aldrich)

53

Blotbuffer

Methanol 200mL (VWR international)

Tris 25 mM (Sigma Aldrich)

Glycine 192 mM (Sigma Aldrich)

20% SDS 1,75 ml (BioRad)

Aanlengen met 1L dH20

Blokbuffer

5% melkpoeder (Nestlé, Vevey, Nieuw-Zeeland) of 3% BSA (Sigma Aldrich)

0,1% Tween20 (Sigma Aldrich)

10x TBS (Tris buffered saline)

50 mM Tris (Sigma Aldrich)

150 mM NaCl (VWR international)

Geheel aanlengen met dH20; pH 7,6

Running gel (20 mL)

dH20 7,9mL

30% PAA 6,7 mL (Biorad)

1,5M Tris (pH 8,8) 5,0 mL (Sigma)

10% SDS 0,2 mL (Biorad)

10% APS 0,2 mL (Sigma)

TEMED 0,008 mL (Biorad)

10 mg/mL gelatine 2,0 mL

Stacking gel (5mL)

dH20 3,4 mL

30% PAA 0,83 mL

1,5 m Tris (pH 6,8) 0,63 mL

10% SDS 0,05 mL

10% APS 0,05 mL

TEMED 0,005 mL

54

Tris-Glycine SDS running buffer Zymogram (10x)

Tris 29 g

Glycine 144 g

SDS 10 g

aanlengen in 1L dH20

Developing buffer Zymogram (10x)

Tris 12,1g

Tris-HCl 63g

NaCl 117 g

CaCl2 7,4 g

Brij35 0,2 %

aanlengen in 1L dH20

Staining solution Zymogram

Coomassie Blauw 0,2%

Methanol 450 mL (UCB S.A., Belgium)

Azijnzuur 100 mL (Sigma aldrich)

dH20 400 mL

Destaining solution Zymogram

Methanol 450 mL

Azijnzuur 100 mL

dH20 400 mL

55

ADDENDUM: STRUCTUUR CHEMISCHE AGENTIA

Propidium iodide (Invitrogen)

Is een membraan-impermeabele, fluorescente molecule met moleculaire massa van 668,4 Da.

Wanneer PI bindt aan nucleïnezuren in de celkern heeft het een excitatie fluorescentie maximum

van 535 nm en een emissie maximum van 617 nm.

Hoechst (Invitrogen)

Hoechst is een fluorescente kleurstof die geëxciteerd wordt met UV licht rond 350 nm en een blauw

licht uitzend met een emissie maximum rond 461 nm. Hoechst is een celpermeabele kleurstof die

dubbelstrengig DNA kan binden in levende of gefixeerde cellen.

6-carboxyfluoresceïne (Teflabs, Austin, TX, USA)

6-Carboxyfluoresceïne (6-CF) is een fluorescente kleurstof welke geëxciteerd wordt door

56

licht in het blauwe golflengtegebied (λ=494 nm) en daarbij groen emissielicht (λ=518 nm)

uitstraalt. Het moleculair gewicht (MW) van deze molecule is 376.322 Da, klein genoeg dus

om door gap juncties te kunnen worden doorgegeven.

Probenecid (Invitrogen)

Probenecid is een efflux blokkerende agent die ervoor zorgt dat multidrug resistance transporters

zoals p-glycoproteïne die sterk aanwezig zijn in BHB endotheel fluo-4AM niet uit te cel kan

transporteren alvorens AM afgekliefd wordt.

fluo-4AM (Life Technologies, Merelbeke, België)

Fluo-4AM is een Ca2+ indicator omdat het een verhoogde fluorescentie intensiteit vertoont wanneer

het bindt aan Ca2+. Omdat fluo-4 op zichzelf de cel niet kan penetreren wordt de acetoxymethyl

(AM) ester toegevoegd die wel in staat is de cel te penetreren. Eenmaal binnen de cel wordt AM

geknipt door onspecifieke esterasen waardoor fluo-4 in de cel vastzit.

Cel-cel communicatie in de neuro-glio- vasculaire eenheid tijdens...

Documents

Transcript of Cel-cel communicatie in de neuro-glio- vasculaire eenheid tijdens...