4/09/18

1

Achter de schermen van het IVF-laboratorium

Bijscholing Vlaamse Ziekenhuisapothekers 4 september 2018

De Croo Ilse

Afdeling voor Reproductieve Geneeskunde

4/09/18

2

Administratie

IVF-labo

Artsen

Vroedvrouwen

Research

Afdeling voor Reproductieve Geneeskunde

Andrologie-labo

4 Subfertiliteit » 15% van de koppels 4 verminderde vruchtbaarheid na een termijn van één jaar onbeschermde coïtus

4 Oorzaken4 Vrouwelijke factor: verstopte eileiders, vroege menopauze, hormonale oorzaken, …4 Mannelijke factor

• afwezige spermatogenese • verminderde spermatogenese

4 Gecombineerde mannelijke/vrouwelijke factoren4 Onverklaarde of idiopathische infertiliteit

4/09/18

3

State of the ART in 2017

~6.000.000 kinderen (waarvan ~2.000.000 na terugplaatsing van ingevroren embryo’s)

Het concept In Vitro Fertilisatie

Laboratorium technologische hulp bij het samenbrengen van eicellen en zaadcellen met het oog op bevruchting en embryo ontwikkeling

Bron : hln.be

4/09/18

4

1978 klassieke In Vitro Fertilisatie (IVF)1 eicel + duizenden beweegelijke zaadcellengeboorte Louise Brown (25 juli 1978)

Historiek

2010 : Nobelprijs voor geneeskunde

1992 eerste ICSI-baby UZ-Brussel

Intracytoplasmatische Sperma Injectie (ICSI)1 eicel + 1 zaadceldoorbraak voor behandeling mannelijke onvruchtbaarheid

Historiek

4/09/18

5

Verloop IVF behandeling

4 Consultatie en klinische onderzoeken infertiliteit (man, vrouw, beiden)

4 Diagnose stellen en behandeling bepalen (IVF/ ICSI)

4 Stimulatie eierstokken en punctie om eicellen te bekomen

4 Collectie van eicellen en zaadcellen

4 Vorming van embryo’s IVF-labo

4 Terugplaatsing van embryo’s

4 Vaststellen zwangerschap

Eicel: laboratoriumpraktijk

4Punctie van follikels in gestimuleerd ovarium net vóór ovulatie

4Overbrengen follikelvocht naar IVF-lab

4/09/18

6

Eicel: laboratoriumpraktijkOpzoeken eicel onder de stereomicroscoop

corona radiataeicel

cumulus

Eicel: laboratoriumpraktijk

4 Denudatie - enzymatische digestie door hyaluronidase- mechanische denudatie

4 onderscheid mature /immatuur eicel• GV reductiedeling nog niet op gang immatuur• MI eerste reductiedeling aan gang immatuur• MII uitgestoten eerste poollichaam matuur

GV MI MII

4/09/18

7

Zaadcel: laboratoriumpraktijkMacroscopische analyse

-Vervloeiing : - 30 min bij kamertemperatuur of 20 min op 37°C

- Uitzicht : - normaal :grijs – opaque- helder : lage sperma concentratie- rood-bruin : bloed- geel : geelzucht of voedingssupplementen

- Volume - wegen en het volume berekenen via densiteit van semen 1g/ml- ondergrens : 1.5 ml

- op 37°C- minimum 200 zaadcellen - vier categorieën

- A : snel progessief (> 25 µm/sec)- B : traag progressief ( 5-25 µm/sec)- C : niet progressief - D : onbeweeglijk

Zaadcel: laboratoriumpraktijkMicroscopische analyse

4/09/18

8

Zaadcel: laboratoriumpraktijk

Microscopische analyse Concentratie : - 400 x vergroting

- telkamer ( bv. Improved Neubauer)

- automatische systemen (CASA)

Zaadcel: laboratoriumpraktijkMicroscopische analyse Morfologie

-Kop : - ovaal - 4.1 µm lang (95%CI 3.7-4.7)- 2.8 µm breed (95% CI 2.5-3.2)

-Acrosoom : - 40-70% - geen vacuolen

-Middenstuk : - 0.6 µm breed (95%CI 0.5-0.7)- 4.4 µm lang (95%CI 3.3-5.2)- geen cytoplasmatische druppel

- Staart : - 45 µm lang

4/09/18

9

Parameter Lower reference limit

Semen volume (ml) 1.5 Sperm concentration (106 per ml) 15 Total motility (PR + NP, %) 40 Progressive motility (PR, %) 32 Sperm morphology (normal forms, %) 4

Referentienormen

WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen FIFTH EDITION

4/09/18

10

Nomenclatuur semenvariabelen

Normozoöspermie : normale semenvariabelen

Oligozoöspermie : conc < 15 milj/ml

Asthenozoöspermie : < 40% beweeglijkheid

Teratozoöspermie : < 4% zaadcellen met normale vormen

OAT : combinatie van de drie

Azoöspermie : afwezigheid van zaadcellen in het ejaculaat

Azoospermie :

* testiculaire oorzaken (niet-obstructief)- maturatie arrest- hypospermatogenese- Sertoli-Cel-Only- Klinefelter- ....

* post-testiculaire oorzaken (obstructief)- congenitaal (CBAVD)- verworven (post vasectomie, post-traum/infectieus)- ...

4/09/18

11

MESA

M icrochirurgischeE pididymaireS permaA spiratie

MESA-TESE

MESA-TESE

TESE

TE sticulaireS permaE xtractie

4/09/18

12

4/09/18

13

+

IVF

4/09/18

14

+

ICSI

4/09/18

15

4/09/18

16

4Evaluatie pronuclei4 Timing : 16-20 h post fertilisatie

4 Aantal• 2PN• >2PN• 1 PN• 0 PN

Bevruchting

4/09/18

17

IVF / ICSI: bevruchting

Evaluatie pronucleiTiming : 16-20 h post fertilisatie

Delingssnelheid

D2

D3

2cel 3cel 4cel 5cel

6cel 7cel 8cel

2 cel

cel2

Dag 2

Dag 3

4/09/18

18

4Grootste uitdaging in IVF is om het aantal zwangerschappen te doen stijgen en daarbij meerlingzwangerschappen te beperken

Belgische wetgeving juli 2003

Birth of a single healthy child is the ultimate objective

• single embryo transfer (SET) : most efficient approach

• for a majority of patients : SET is golden standard

• embryo quality : major predictor of implantation

• selecting the embryo with the highest implantation potential

4/09/18

19

4Waarom scoort blastocyst transfer beter?

• Betere synchronisatie ontwikkelingsstadium embryo en endometrium

Blastocyst transfer

• Mechanisme van self selectie

4/09/18

20

Trophectoderm (TE)Inner cell mass (ICM)

Blastocyst transferB

LAS

TOC

YS

T MO

RP

HO

LOG

Y: G

ardn

er et al

Blastocyst morphology : Gardner et al. 4 Expansion and hatching status

1 Blastocoel cavity less than half the volume of the embryo

2 Blastocoel cavity more than half the volume of the embryo

3 Full blastocyst, cavity completely filling the embryo

4 Expanded blastocyst, cavity larger than the embryo, with thinning of the shell

5 Hatching out of the shell

6 Hatched out of the shell

4/09/18

21

BLASTOCYST MORPHOLOGY

4 Inner cell mass (ICM) score

A Many cells, tightly packedB Several cells, loosely groupedC Very few cells

4 Trophectoderm (TE) score

A Many cells, forming a cohesive layerB Few cells, forming a loose epitheliumC Very few large cells

Score of 4DA

The ICM is hardly evident in this embryo, while the trophectoderm is clearly formed and functional.

Score of 4AA

The ICM is tightly packed with many cells, and the surrounding cells have formed a cohesive epithelium of many cells.

4/09/18

22

Scored as blastocyst 2, as the cavity (blastocoel) is not fully expanded.

Score of 3BA

The ICM has not formed a tightly packed group, nor does it appear to have many cells.

The trophectoderm is well formed.

Score of 3CC

Neither the ICM or trophectoderm have many cells. The right hand side of the embryo consists of just one cell.

The blastocoel however is fully formed, hence the score of 3.

4/09/18

23

Time-lapse video fragment vroege deling van zygote tot blastocyst

IVF ICSI

Dag 1

Dag 2 Dag3 Dag 5Dag 4

Dag 0

4/09/18

24

Embryotransfer

Blastocyten van voldoende morfologische kwaliteit kunnen worden ingevroren

Cryopreservatie

4/09/18

25

Het inbanken van eicellen kan een uitkomst bieden voor verschillende groepen van vrouwen:

Ø vrouwen die voor een behandeling staan die hun eierstokken kan beschadigen (bv. Chemotherapie radiotherapie), in het bijzonder jonge vrouwen die nog geen partner hebben

Ø vrouwen die eicellen willen doneren

Vitrificatie van eicellen

Vitrificatie van eicellen

Øalleenstaande vrouwen die willen wachten op een partner voor de vervulling van hun kinderwens

Øvrouwen (in het algemeen) die de vervulling van hun kinderwens wensen uit te stellen.

4/09/18

26

Pre-implantatie genetische testing (PGT)

•Wat?

Heel vroeg opsporen van afwijkingen in embryo’s voor ze in de baarmoeder worden geïmplanteerd

•Wie?

Patiënten die een vruchtbaarheidsbehandeling willen ondergaan en :• ofwel erfelijke belast zijn• ofwel verhoogde kans hebben op abnormale embryo’s

PGT-S : preimplantation genetic testing – structural abnormalities

Voor chromosomale afwijkingen of geslachtsgebonden ziekten:

• X-gebonden ziekten• Translocaties (specifieke merkers)• PGT-A : preimplantation genetic testing – aneuploidy screening

(leeftijd – herhaald miskraam- RIF)

PGT-M : preimplantation genetic testing - monogenetic disorders

• Voor >50 monogene ziekten (Cystic Fibrosis, Fragile X, BRCA etc…..)

4/09/18

27

Pre-implantie genetische diagnose (PGD)

Embryo 5: normaal

4/09/18

28

Embryo 6: abnormaal(monosomie 16)