Abstract

De hoge dosissen fijn stof (PM) die we dagelijks inademen hebben een zeer nadelig effect op onze gezondheid.

Microbiele endotoxines in dat fijn stof zouden mee verantwoordelijk zijn voor deze gezondheidseffecten. Om een

beter beeld te krijgen van de interactie tussen deze endotoxines en fijn stof in de atmosfeer onderzochten wij de

activiteit van vrije endotoxines en endotoxines gebonden op fijn stof. Er werd gebruik gemaakt van een bio-assay

om endotoxine activiteit te kwantificeren, namelijk de Limulus Amoebocyt Lysaat (LAL) test. Ook hebben we

onderzocht of het mogelijk was om vrije endotoxines en PM-gebonden endotoxines te neutraliseren door middel

van fotokatalyse met TiO2 en UV licht.

Uit onze resultaten bleek duidelijk dat de aanwezigheid van fijn stof de endotoxine activiteit in de LAL test

verminderde. Daarnaast bleek fijn stof een beschermend effect te hebben tegen een korte behandeling met enkel

TiO2 en tegen een korte en lange behandeling met enkel UV licht. Een lange behandeling met TiO2 in combinatie

met UV licht bleek het meest efficient om zowel vrije als PM-gebonden endotoxines te neutraliseren.

Als bindingsmodel tussen PM en endotoxines wordt voorgesteld dat de endotoxines met hun hydrofoob lipide-A

deel naar de PM-deeltjes toe gebonden zijn. De vraag is dan of dit model kan veralgemeend worden voor andere

vormen van PM en endotoxine dan de onderzochte vormen en ook naar andere fasen dan de vloeibare fase waarin

het onderzoek gebeurde.

Tijdens de experimenten werd ook de LAL test in vraag gesteld en werden een aantal experimenten uitgevoerd

om de validiteit ervan te controleren. Als belangrijkste resultaat werd gevonden dat de LAL test gevoelig is voor

inhibitie door op dit moment nog ongeıdentificeerde stoffen in de atmosfeer, en dat het voldoende verdunnen van

luchtstalen essentieel is om deze inhibitie weg te werken.

Een beter inzicht in de interacties tussen endotoxines en fijn stof kan op termijn leiden tot het ontwikkelen van

efficientere neutralisatietechnieken voor PM-gebonden endotoxines, en tot een beter begrip van de gezondheids-

effecten van endotoxines als component van PM.

KERNWOORDEN: Endotoxine - Fijn stof - Neutralisatie - Fotokatalyse - LAL test

I

Inhoudsopgave

Abstract I

Inhoudsopgave II

Lijst met afkortingen en symbolen IV

Lijst van figuren V

Lijst van tabellen VI

1 Inleiding 1

2 Bespreking van de literatuur 2

2.1 Fijn stof . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2.1.1 Definitie en opbouw . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2.1.2 Classificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2.1.3 Gezondheidseffecten van fijn stof . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2.1.4 Wetgeving . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.2 Endotoxines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2.1 Definitie en structuur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2.2 Meten van endotoxines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2.3 Gezondheidseffecten van endotoxines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.3 Neutralisatie, detoxificatie en inactivatie van endotoxines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3.1 Algemeen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3.2 Neutralisatie met UV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3.3 Neutralisatie door aluminium hydroxide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3.4 Neutralisatie door fotokatalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3 Doelstellingen 12

4 Materiaal en methode 13

4.1 Materiaal LAL test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4.1.1 Buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4.1.2 Stopreagens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4.1.3 Microplaatlezer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.1.4 LAL kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.1.5 Glaswerk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.1.6 Laminaire flow kast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.2 Methode LAL test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.3 Materiaal TiO2 proef . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.3.1 Titaniumdioxide (TiO2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.3.2 PM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.3.3 LPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

II

4.3.4 Glaswerk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.4 Methode TiO2 proef . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.5 Materiaal staalname . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.5.1 Coreolis air sampler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5 Resultaten en bespreking 18

5.1 Zoektocht naar een geschikte buffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

5.2 Neutralisatie van LPS en PM met TiO2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

5.3 Wordt de LAL test geınhibeerd? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

5.4 Problemen met het LAL protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

6 Discussie 25

6.1 De interactie tussen endotoxines en fijn stof . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

6.2 Is de veelgebruikte LAL test betrouwbaar? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

6.2.1 Interferentie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

6.2.2 Belang van het meten bij de juiste golflengte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

6.2.3 Gevolgen van verdamping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

6.3 Endotoxinevrij werken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

6.4 Sociaal-economisch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

6.4.1 Problematiek omtrent luchtvervuiling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

6.4.2 Belang van het meten van fijn stof en endotoxinegehalte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

6.4.3 Fijn stof, endotoxines en sociale ongelijkheid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

6.5 Ingenieur-technisch deel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

7 Toekomstperspectieven 33

Nawoord 35

Referenties 39

Bijlage 40

Bijlage 1: Overzicht van de meetwaarden voor PM, PM en Black Carbon jaar en daggemiddelden. . . . 40

Bijlage 2: Bronnen van geselecteerde luchtverontreinigende polluenten in 2008 voor EER-32 en de landen

van de Westelijke Balkan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Bijlage 3: Protocol Lonza voor LAL test uit te voeren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Bijlage 4: Nieuw opgesteld protocol voor LAL test uit te voeren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

III

Lijst met afkortingen en symbolen

WHO World Health Organisation

EU Endotoxin Unit: een maat om de endotoxineconcentratie weer te geven

LAL Limulus amoebocyt lysaat

LPS Lipopolysachariden

PM Particulate matter

rFC Recombinant factor C

TiO2 Titaniumdioxide

IV

Lijst van figuren

1 Overzicht van de verschillende componenten van lipopolysachariden (LPS) [1]. . . . . . . . . . . . . 5

2 De degenkrab (Limulus polyphemus) [2]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3 Verkort schematisch overzicht van de LAL-cascade, die leidt tot verschillende bio-assays om het

endotoxinegehalte te bepalen in een staal [3]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

4 De activatie van macrofagen door LPS [4]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

5 Vereenvoudigde voorstelling van het verschil tussen metaal, halfgeleider en isolator op elektronisch

niveau [5]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

6 Werking van fotokatalyse met TiO2 als katalysator [6]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

7 Overzicht van de proefopstelling. Onder de doos bevinden zich de schaaltjes die niet met UV

belicht mogen worden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

8 Coreolis air sampler [7]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

9 Resultaten van de LAL testen na 0 uur en 14 uur behandeling met TiO2 korrels (a), UV licht (b)

en TiO2 in combinatie met UV (c). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

10 Absorptie van p-nitro alanine bij golflengtes van 350 tot 450 nm. Als blanco werd de zuivere buffer

genomen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

V

Lijst van tabellen

1 Richtlijn 1999/30/EG [8]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 Richtlijnen WHO [9]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

3 Overzicht gebruikte stoffen voor bereiding PBS buffer. De af te wegen massa’s komen uit het

elabprotocol. De fabrikant en batch nummer werd op de verpakking van de stoffen terug gevonden

[10]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4 Gebruikte microplaatlezers. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

5 Gebruikte LAL kit van Lonza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

6 Gebruikte testprocedure voor de LAL test, met modificaties t.o.v. van het protocol van de fabrikant

(Lonza) dat zich in bijlage 3 bevindt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

7 Eigenschappen van de gebruikte PM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

8 Eigenschappen van de gebruikte LPS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

9 Overzicht staalname 1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

10 Endotoxine activiteit van de buffers voor en na staalname. Er werd telkens ook gespiked met

0.49 EU/mL om te testen voor inhibitie. Voor de luchtstalen werd de LAL test niet in dubbel

uitgevoerd, daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden. 19

11 Overzicht staalname 2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

12 Endotoxine activiteiten van oplossingen met LPS, PM, LPS+PM en een negatieve controle (buffer).

De reactie met TiO2 en UV werd getest, maar ook met enkel UV en enkel TiO2. Activiteiten werden

gemeten voor de reactie, na een uur van de reactie en na veertien uur van de reactie. Bij de controle

meting van 14u geen behandeling, lagen de dubbels heel ver uit elkaar. Alle activiteiten zijn in

EU/mL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

13 De gemeten endotoxine activiteit na verdunning, en de verwachte activiteit na verdunning op basis

van de verdunningsfactor. Alle activiteiten zijn in EU/mL. De onverdunde stalen werden niet

in dubbel getest, daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend

worden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

14 Het aantal keer dat 35 µL water kon gepipetteerd worden uit bakjes met 1.400 mL (het maximum

was dus 40 keer). De helft van de bakjes werd een half uur beschenen door de lamp van de laminaire

flow kast, de andere helft werd bedekt door aluminium folie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

VI

1 Inleiding

Het onderwerp van deze bachelorproef is endotoxines in de lucht en de relatie ermee tot fijn stof. De term fijn

stof hangt nauw samen met luchtvervuiling. Luchtvervuiling zelf heeft daarnaast zeer directe socio-economische

gevolgen op het dagelijkse leven. Zo wordt bijvoorbeeld in een artikel uit de krant “De Morgen” [11], door de

woordvoerder van de Europese Kamer van Koophandel in China, geconstateerd dat tal van mensen wegtrekken

door luchtvervuiling. Daarnaast wordt hierin ook geschreven dat luchtvervuiling, alleen al in China, gezorgd heeft

voor 1.2 miljoen doden in het jaar 2010. Deze resultaten zijn afkomstig van een studie die werd uitgevoerd door

de Universiteit van Washington, gepubliceerd in het Britse tijdschrift The Lancet. Dit artikel illustreert dus dat

luchtvervuiling niet alleen beperkt is tot gezondheidsnadelen, maar dat het ook ernstige economische en sociale

gevolgen kan hebben op een samenleving. Door dergelijke artikels en het vele gebruik van de term fijn stof in

bijvoorbeeld de media, klinken termen als luchtvervuiling en fijn stof voor veel mensen steeds banaler. Daarom

is het van belang om dieper in te gaan op de impact ervan. In deze bachelorpaper wordt daarom de classificatie,

de gezondheidsaspecten en de wetgeving omtrent fijn stof besproken. Vervolgens wordt ingegaan op een tot nu

toe weinig onderzochte component ervan, namelijk endotoxines. Deze microbiele endotoxines kunnen ongunstig

gezondheidseffecten veroorzaken. Naast de structuur en hoe endotoxines worden gemeten, worden ook de reeds

onderzochte neutralisatie technieken besproken.

In de huidige literatuur is veel informatie over zowel fijn stof als endotoxines te vinden. Echter wanneer het om

de interactie en/of de chemische binding tussen fijn stof en endotoxines gaat, blijven de resultaten uit. Daarom

is het primaire doel van deze bachelorproef om de interactie van endotoxines met fijn stof te bekijken. Zo kan de

vraag gesteld worden of de verschillende componenten van fijn stof een invloed hebben op de endotoxines. Het

zou namelijk kunnen dat de binding van endotoxines op fijn stof ervoor zorgt dat de endotoxines hun toxiciteit of

pro-inflammatoire karakter verliezen. Ook de vraag of de LAL test deze gebonden endotoxines kan meten wordt

gesteld.

Zoals besproken zal worden in de literatuurstudie kunnen endotoxines bijdragen tot tal van negatieve gezondheids-

aspecten. Hierdoor is het belangrijk dat er een effectieve methode gevonden wordt om endotoxines te neutrali-

seren. Een reeds geteste neutralisatietechniek bestaat uit titaniumdioxide (TiO2) dat onder invloed van ultra-

violet licht endotoxines kan afbreken. Deze techniek wordt ook in deze bachelorproef gebruikt. Om nog in lijn te

lopen met de eerste topic van de bachelorproef, zal er dus een experiment opgesteld worden waarbij neutralisatie

centraal staat en waarbij gekeken wordt naar de effecten ervan op fijn stof, endotoxines en beide gecombineerd.

Hierdoor kan er inzicht verkregen worden in de interactie tussen de twee, en ook hoe de LAL test hierop reageert.

De bredere doelstelling van dit bachelorproject is dus een meerwaarde te bieden aan het verhaal van endo-

toxines in samenhang met fijn stof. Niet alle vragen vanuit deze inleiding kunnen beantwoord worden, maar wel

wordt er geprobeerd om een literaire basis te leggen voor verder onderzoek tussen endotoxines en fijn stof. Door

een efficiente manier te vinden om endotoxines te neutraliseren kan er al een krachtige stap vooruit gezet worden

om de problematiek omtrent luchtvervuiling tegen te gaan. Door verder onderzoek van endotoxines in fijn stof

kan het gevaar hiervan beter ingeschat worden.

1

2 Bespreking van de literatuur

2.1 Fijn stof

2.1.1 Definitie en opbouw

Fijn stof is vandaag de dag een ingeburgerde term. Echter, om de impact van fijn stof op milieu en gezondheid

beter te kunnen inschatten, moet er nog veel wetenschappelijk onderzoek gebeuren.

Volgens de “United States Environmental Protection Agency” (EPA) wordt de term fijn stof gedefinieerd als

“the generic term for a broad class of chemically and physically diverse substances that exist as discrete particles

(liquid droplets or solids) over a wide range of sizes [12].” De samenstelling van fijn stof kan varieren van deeltje

tot deeltje. Meestal worden de volgende componenten onderscheiden: metalen, koolwaterstoffen, ionen en orga-

nische componenten zoals endotoxines [13]. Fijn stof in het algemeen, bestaat hoofdzakelijk uit sulfaat, nitraat,

ammonium, natrium, chloriden, koolstof (zowel elementair als organisch) als water [14].

2.1.2 Classificatie

Er bestaan tal van onderverdelingen om fijn stof te karakteriseren. Zo deelt men fijn stof voornamelijk in volgens

de grootte en de oorsprong ervan. Als er in de literatuur over de grootte gesproken wordt, komen volgende termen

aan bod: “Particulate Matter10” (PM10) en “Particulate Matter2.5” (PM2.5).

PM10, die ook wel “coarse particles” genoemd worden, zijn deeltjes met een grootte tussen 2.5 en 10 µm. Deze

deeltjes worden voornamelijk gevormd door mechanische processen zoals erosie van het aardoppervlak [12].

PM2.5 of “fine particles” zijn deeltjes kleiner dan 2.5 µm.

Verder zijn er nog tal van andere onderverdelingen zoals: “Aitken en ultrafine”. De term “ultrafine particles” slaat

op deeltjes die kleiner zijn dan 0.1 µm. Door hun grootte hebben ze een aanzienlijke invloed op de gezondheid.

Het is namelijk zo dat hoe kleiner het deeltje is, hoe groter de gezondheidsrisico’s zijn [15].

Fijn stof wordt daarnaast ook onderverdeeld op basis van de oorsprong. Hiervoor worden termen zoals natuur-

lijk en antropogeen aangewend. Onder de term “natuurlijk fijn stof”, vallen bijvoorbeeld deeltjes die afkomstig

zijn van vulkaan uitbarstingen. Antropogeen duidt op deeltjes afkomstig van een menselijke input zoals emissie

van motoren.

Een laatste classificatie van fijn stof is de opdeling primair/secundair. Primair fijn stof zijn deeltjes die recht-

streeks worden uitgestoten in de atmosfeer afkomstig van natuurlijke en antropogene bronnen [14]. Secundaire

deeltjes zijn deze die gevormd worden via chemische processen in de atmosfeer afkomstig uit gasvormige emissie

van polluenten [14]. De vorming van sulfaten en nitraten uit SO2, NOx en NH3 zijn hiervan een voorbeeld [14].

2.1.3 Gezondheidseffecten van fijn stof

Het kunnen inschatten van de gezondheidseffecten van fijn stof wordt steeds belangrijker. Hiervoor moet echter

eerst een onderscheid gemaakt worden tussen korte en lange termijn effecten. Een verschil tussen deze laatsten is

bijvoorbeeld de onderzoeksmethode. Studies die het aantal doden meten in korte termijn blootstelling aan PM,

zullen namelijk alleen die individuen opnemen die toch zouden gestorven zijn binnen een paar dagen. In een korte

termijn studie kan daarom het lange termijn effect van een dagelijkse blootstelling aan hoge concentraties PM

niet onderzocht worden. De lange termijn studies focussen zich dan weer op de algehele gezondheidseffecten. Ook

de effecten van langdurige blootstelling aan lage concentraties PM zijn hierin dus opgenomen [16].

2

Korte termijn gezondheidseffecten

De korte termijn studies kijken naar veranderingen in het aantal dagelijkse overlijdens die geassocieerd zijn met

korte termijn veranderingen in PM en luchtvervuiling. Vooral bij hoge concentraties speelt dit een belangrijke

rol. Resultaten van dergelijke onderzoeken suggereren dat een toename van 10 µg/m3 in PM10 gerelateerd is aan

een stijging van 0.5% tot 1.5% in het aantal dagelijkse overlijdens [16].

Een ander onderzoek wijst uit dat astma en chronische obstructieve longziekten bij mensen ouder dan 65 jaar

toenemen met 1.0% voor elke stijging van 10 µg/m3 in de PM10 concentratie. Tot slot concludeert hetzelfde

onderzoek dat de opnames voor hart- en vaatziekten met zowat 0.5% stijgen per µg/m3toename in PM10 [16].

Lange termijn gezondheidseffecten

Naast de korte termijn effecten is het ook relevant om te weten wat de gevolgen zijn van cummulatieve blootstelling

aan lage concentratie van PM op lange termijn. Studies wijzen uit dat lange termijn blootstelling aan fijn stof

gekoppeld is aan een vermindering van de longfunctie, chronische bronchitis, een toename in de kans op longkanker

en cardio-pulmonale sterfte. Ook blijkt dat fijne en ultrafijne deeltjes, afkomstig van de uitlaat van voertuigen, een

invloed hebben op hartslagvariabiliteit, bloedviscositeit, bloed coagulatie, hartritmestoornissen, atherosclerose,

et cetera [16].

2.1.4 Wetgeving

De opbouw, classificatie en gezondheidseffecten van fijn stof zijn hierboven kort besproken. Daarnaast is het ook

belangrijk om te weten hoe de politiek op deze kennis inspeelt. Dit uit zich in richtlijnen die worden opgesteld

en opgelegd binnen de Europese Unie, om de concentratie aan fijn stof in de lucht te verlagen. Het is van belang

om te weten dat er geen grenswaarden voor het fijn stof gehalte bestaan die de gezondheidseffecten volledig eli-

mineren; er zijn altijd mensen die effecten ondervinden van zelfs zeer lage concentraties. Toch zijn er richtlijnen

opgesteld om de gezondheidseffecten minimaal te houden [17].

De richtlijnen (grenswaarden) die de Europese Unie heeft opgesteld waaraan de lidstaten zich moeten houden

worden weergegeven in tabel 1. Ze zijn onderverdeeld op basis van dag en jaar. Dit is van belang omdat onderzoek

uitwijst dat er gezondheidseffecten zijn op zowel korte als lange termijn [18].

Ook in Vlaanderen wordt dit opgevolgd. Zo worden er overzichtstabellen opgesteld van de PM10, PM2.5 en “Black

Carbon” (BC) waarden in µg/m3. Deze tabellen zijn weergegeven in bijlage 1. Voor bijvoorbeeld PM10 worden

de verschillende meetstations weergegeven waarbij het PM10 jaargemiddelde wordt voorgesteld vanaf 1997 (zie

bijlage 1a). De overschrijdingen zijn gebaseerd op de EU richtlijn 1999/30/EG. Zo worden waarden die hoger zijn

dan 40 µg/m weergegeven in het oranje en vanaf 2005 in het rood.

De“World Health Organisation”(WHO) heeft andere streefwaarden opgesteld. In figuur 2 worden deze voorgesteld

voor zowel PM10 als PM2.5 . De waarden van PM10 komen overeen met deze uit bijlage 1a voor 2010.

Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat er geen optimale waarde bestaat. Zelfs bij de PM-waarden

van WHO zullen er mensen zijn die negatieve gezondheidseffecten zullen ondervinden. WHO expliceert dit in

als volgt “it is unlikely that any standard or guideline value will lead to complete protection for every individual

against all possible adverse health effects of particulate matter [9].”

3

Tabel 1: Richtlijn 1999/30/EG [8].

Tabel 2: Richtlijnen WHO [9].

4

2.2 Endotoxines

2.2.1 Definitie en structuur

Volgens het volgende handboek Microbiology: an evolving science, wordt een endotoxine gedefinieerd als “een

celcomponent die onschadelijk is zolang de pathogeen intact blijft; maar wanneer vrijgesteld door een lyserende

cel, overstimuleren de endotoxines de verdedigingsmechanismen van de gastheer, wat zo een mogelijke letale endo-

toxische shock kan veroorzaken [19].” Lipopolysachariden (LPS) zijn hiervan het best gekende voorbeeld. Dit zijn

componenten die terug te vinden zijn in de celwand van gramnegatieve bacterien.

Een LPS molecule is opgebouwd uit drie basisdelen: een lipide-A, een kerngedeelte en een O-antigeen gedeelte.

Figuur 1 geeft een overzicht van de verschillende componenten. Het lipide-A gedeelte is sterk geconserveerd en

is daarnaast verantwoordelijk voor de biologische activiteit [20]. Het O-antigeen gedeelte daarentegen kan sterk

verschillen tussen LPS moleculen.

Figuur 1: Overzicht van de verschillende componenten van lipopolysachariden (LPS) [1].

LPS wordt in tal van studies onderzocht en deze molecule staat er om bekend om luchtwegontstekingen te

veroorzaken. Dit wordt later uitgewerkt in 2.2.3.

Daarnaast wordt LPS ook vaak onterecht als synoniem voor endotoxines gebruikt. Endotoxines beslaan namelijk

een bredere definitie. Zo stelt het boek Microbiology: an evolving science dat een concreet verschil tussen deze

twee is dat endotoxine naast LPS, ook lipoteichoınezuur van grampositieve bacterien omvat.

Opvallend in de literatuur is dat wanneer er gesproken wordt over fijn stof, er vaak geen notie wordt gemaakt

van endotoxines. Dit is echter iets dat niet zomaar vergeten mag worden aangezien biologische componenten

voor 20% deel uitmaken van atmosferische aerosolen in de lucht. Deze biologische componenten zijn ondermeer:

pollen, sporen, planten resten, algen, bacterien, protozoa en virussen [21].

5

2.2.2 Meten van endotoxines

Algemeen

Vandaag de dag zijn er verschillende mogelijkheden om het endotoxinegehalte te bepalen. De oudste methode is de

pyrogeentest op konijnen. Een meer recente, en meer gebruikte methode, is het gebruik van de bio-assays. Hiervan

zijn de verschillende soorten “Limulus Amoebocyt Lysaat” (LAL) testen en de recombinant factor C test (rFC)

de belangrijkste. Daarnaast kunnen ook chemische analysetechnieken gebruikt worden om het endotoxinegehalte

te bepalen. Dit verloopt dan ofwel via gas-vloeistof chromatografie, ofwel via gaschromatografie gevolgd door

massaspectrometrie [3]. Hieronder worden de verschillende soorten LAL testen toegelicht.

LAL test

De LAL test is momenteel de meest gebruikte test om endotoxinegehaltes in stalen te bepalen. Dit is een bio-

assay die gebaseerd is op LAL enzymes geproduceerd door de degenkrab (Limulus polyphemus, zie figuur 2). Deze

LAL enzymes ontstaan in de bloedcellen (amoebocyten) van de krab als primitief immuunsysteem. Wanneer het

immuunsysteem van de krab in contact komt met indingende endotoxines, komt er een inactivatie tot stand zoals

links weergegeven in figuur 3 (’gel clot’ LAL test). De eerste stap is dat het factor C enzym geactiveerd wordt

door binding met endotoxine. Zo ontstaat er een actief factor C enzym, dat op zijn beurt het proclotting enzym

activeert. De laatste stap is dat het geactiveerde clotting enzym coagulogeen omzet tot coaguline, wat zorgt voor

clotvorming (stolling). Deze stolling zorgt ervoor dat verdere infectie wordt tegengehouden. De opeenvolgende

reacties van enzymen die geactiveerd worden tot en met de clotvorming, worden ook wel de LAL cascade genoemd

[3, 22].

Figuur 2: De degenkrab (Limulus polyphemus) [2].

Er bestaan verschillende varianten van de LAL test:

� ’gel clot’ LAL test

� kinetische turbidimetrische LAL test

� eindpunt chromogenische LAL test

� kinetische chromogenische LAL test

� eindpunt fluorescerende LAL test (recombinant factor C test)[23].

6

Figuur 3: Verkort schematisch overzicht van de LAL-cascade, die leidt tot verschillende bio-assays om het endo-toxinegehalte te bepalen in een staal [3].

Het verschil in de verschillende LAL testen ligt in het feit van wat en hoe er wordt gemeten. Zo wordt bij de

gel clot LAL test gekeken of er, na toevoeging van LAL enzymes aan een sample, clotvorming is of niet. Dit is

bijgevolg een kwalitatieve test.

Een variant op de gel clot LAL test is de kinetische turbidimetrische LAL test. Dit is een kwantitatieve test die

de turbiditeit of troebelheid van de oplossing meet in functie van de tijd. De gevoeligheid van deze test bedraagt

0.01 - 100.0 EU/mL.

Een ander soort LAL testen zijn de chromogenische LAL testen (eindpunt of kinetische). Hierbij wordt de

activi-

teit van een serine protease gemeten door het coagulogeen in de LAL cascade te vervangen met een kleurloos

synthetisch peptide substraat (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) dat p-nitroaniline (pNA) vrijstelt na proteolyse. Deze

stof heeft een gele kleur, die met behulp van een spectrofotometer gemeten kan worden [24, 25]. Wanneer enkel

op het eindpunt de absorptie wordt bepaald, spreekt men van de eindpunt chromogenische LAL test. Indien

gedurende de hele test de toename (absorptie) van gele kleur wordt gemonitord, gaat het over de kinetische chro-

mogenische LAL test. Beide testen zijn kwantitatief, maar hebben wel een verschillend bereik. Zo is het bereik

van de eindpunt chromogenische test 0.1 - 1.0 EU/mL. De kinetische chromogenische LAL test is de gevoeligste

van alle LAL testen met een bereik van 0.005 - 50.0 EU/mL.

Bij alle voorgaande testen moet ook rekening worden gehouden met mogelijke interferenten zoals glucaan, voor-

namelijk β-1,3-D-glucaan [22]. Deze kunnen ook de LAL cascade initieren, maar moeten in vergelijking met de

endotoxineconcentratie wel 1000 keer meer aanwezig zijn om dezelfde reactie te veroorzaken.

7

Een laatste test die besproken moet worden is de eindpunt fluorescerende LAL test of recombinant factor C test.

De recombinant factor C (rFC) test brengt verbetering in zowel specificiteit als reproduceerbaarheid t.o.v de

andere LAL testen. Deze assay is namelijk gebaseerd op hetzelfde reactiemechanisme als de LAL test, maar hier

wordt een genetisch gemodificeerd reagens gebruikt (rFC i.p.v. factor C) om de LAL cascade in gang te zetten.

Wanneer er endotoxine bindt aan dit rFC reagens, wordt dit geactiveerd tot een actief rFC enzym. Dit actief

rFC enzym, splitst dan vanzelf een synthetisch substraat af, wat resulteert in de toename van een fluorescente

verbinding die met een fluorescente microplaatlezer gemeten kan worden. Binnen het 0.005 - 5 EU/mL bereik

kan vervolgens kwantitatief het endotoxinegehalte bepaald worden. Een groot voordeel van deze test is dat vals

positieve testen vermeden worden omdat er geen interferentie van glucaan mogelijk is. Dit genetisch gemodificeerd

reagens (rFC reagens) werd verkregen uit het cDNA van de mangrove degenkrab (Carcinoscorpius rotundicauda)

[3].

Omdat de rFC test geen reagens van levende dieren gebruikt (in tegenstelling tot bij de LAL testen) is er

daarnaast ook geen verschil in reactiviteit v.h. lysaat uit verschillende kitten met endotoxine. Bij de LAL test is

dit wel omwille van de natuurlijke variatie in limulus lysaat [3, 23].

2.2.3 Gezondheidseffecten van endotoxines

Het onderzoek naar de gezondheidseffecten van endotoxines dat tot nu toe is gebeurd, kan ingedeeld worden in

drie verschillende categorieen: het effect van endotoxines die in de bloedbaan terecht komen door een infectie

met gramnegatieve bacterien, de korte en lange termijn effecten van het inademen van vrije endotoxines, en het

inademen van endotoxines als component van fijn stof.

Aangezien lipopolysachariden in alle gramnegatieve bacterien voorkomen zijn ze voor ons lichaam ideale“pathogen-

associated molecular patterns” (PAMPS): ze worden gebruikt als signaalmoleculen voor een bacteriele infectie.

Ons aangeboren immuunsysteem herkent de LPS moleculen als afkomstig van gramnegatieve bacterien en lanceert

een lokale ontstekingsreactie om ofwel de bacterien volledig uit te schakelen, of om hun groei te beperken tot er een

specifieke immuunrespons ontwikkeld is. In sommige gevallen van LPS-blootstelling kan er echter een systemische

ontstekingsreactie optreden met soms zelfs de dood als gevolg. Er wordt dan gesproken van een septische shock.

Omwille van deze reden is het van vitaal belang dat al het materiaal dat gebruikt wordt in de geneeskunde, denk

maar aan injecties, endotoxinevrij is. Het mechanisme waarlangs de ontstekingsreactie verloopt is vrij goed ge-

kend [26, 4, 27, 28, 29]. Centraal bij de herkenning van LPS staan de moleculen LBP, CD14, MD-2 en TLR4. LPS

komt voor ofwel als een integraal deel van de celmembraan van een gramnegatieve bacterien, ofwel in aggregaten.

Door te binden aan LPS moleculen katalyseert het eiwit LBP (LPS binding protein) de overgang van de LPS

moleculen in de membraan of de aggregaten naar vrije LPS moleculen. Deze LPB:LPS associatie bindt vervolgens

aan een mCD14 molecule, die via een GPI anker vastzit aan de celmembraan van macrofagen of monocyten. In

het serum komen ook vrije sCD14 moleculen voor waar LPB:LPS op kan binden. Op die manier kunnen ook

endo- en epitheelcellen, die mCD14 niet bevatten, geactiveerd worden door LPS. In de volgende stap draagt

CD14 de LPS molecule over aan het TLR4/MD-2 complex. Dit complex zet de signaaltransductie in gang, met

als uiteindelijke gevolg de productie van een aantal cytokines zoals TNF-α en de interleukines IL-1,6,8,12. Deze

zorgen dan voor de ontsteking.

8

Figuur 4: De activatie van macrofagen door LPS [4].

Negatieve gezondheidseffecten door het inademen van vrije endotoxines in de lucht zijn vooral gedocumenteerd

bij werkplaatsen waar de endotoxineconcentratie door de beroepsactiviteit enorm hoog is, zoals bijvoorbeeld in

de landbouw en textielindustrie [30]. Zowel acute als chronische effecten door endotoxineblootstelling op de

werkplaats werden al vastgesteld [31]. Acute effecten zijn onder meer ODTS (organisc dust toxicity syndrome;

een aantal griep-achtige symptomen) en een vermindering in het “forced expiratory volume” (FEV) tijdens de

werkuren. Blootstelling voor een langere periode kan leiden tot koorts, hoofdpijn en ontsteking van de luchtwegen

en vergroot de kans op chronische bronchitits. Een groot aantal studies concentreert zich op de vraag of endo-

toxineblootstelling de kans op atopie (verhoogde gevoeligheid voor allergieen) en astma verhoogt, of net verlaagt.

Een Zwitserse studie uit 2002 bij schoolgaande kinderen van 6 tot 13 jaar vond een omgekeerde relatie tussen

endotoxineblootstelling en atopie en astma [32]. Inademing van endotoxines bleek dus een beschermend effect te

hebben tegen het ontwik-

kelen van allergieen en astma. Sindsdien hebben echter niet alle studies deze vaststelling kunnen repliceren, en

sommigen vonden zelfs het omgekeerd verband [33]. Een review over de relatie tussen endotoxines en atopie uit

2009 concludeert dat wanneer je ook de genetische aanleg in rekening brengt, de meeste studies redelijk conse-

quent volgende hypothese bevestigen: endotoxineblootstelling heeft een beschermend effect tegen atopie, maar

alleen bij mensen met een specifieke SNP (single nucleotide polymorphism) mutatie in het CD14 gen [34]. Verder

onderzoek is hier echter nog noodzakelijk om de rol van genetische aanleg beter te begrijpen.

Over de rol die endotoxines spelen in de gezondheidseffecten van fijn stof is al redelijk wat onderzoek gebeurd.

De meeste studies gaan als volgt te werk. Eerst worden luchtstalen op een aantal verschillende plaatsen genomen.

Vervolgens worden de concentraties van de verschillende bestanddelen van fijn stof gemeten. Daarna worden de

stalen aan ratten/muizen of aan cellijnen toegediend, en ten slotte wordt nagegaan of er een verband is tussen

een of meerdere van de componenten en de productie van cytokines [35, 36, 13, 37]. Een review studie over de

rol van endotoxines in de toxiciteit van fijn stof door Degobbi et al. [21] concludeert dat de meeste (maar niet

alle) studies de pro-inflammatoire effecten van fijn stof toeschrijven aan de endotoxinecomponent, en dan vooral

in PM10. Endotoxines spelen dus hoogstwaarschijnlijk een belangrijke rol in de negatieve gezondheidseffecten van

fijn stof.

9

2.3 Neutralisatie, detoxificatie en inactivatie van endotoxines

2.3.1 Algemeen

Nu de gezondheidsaspecten van zowel fijn stof als endotoxine zijn besproken, is het interessant om te weten hoe

deze toch wel schadelijke stoffen, geneutraliseerd kunnen worden. Enkel de neutralisatie en detoxificatie van

endotoxines wordt hier kort toegelicht.

2.3.2 Neutralisatie met UV

In het wetenschappelijk artikel Endotoxin Inactivation in Water by Using Medium-Pressure wordt aangetoond dat

bestraling met UV effectief is voor de inactivatie van endotoxines in water. Dit artikel stelt ook dat er verscheidene

gevallen bekend zijn waarbij endotoxines hebben geleid tot sterftegevallen. Een voorbeeld hiervan is het onbewuste

gebruik van met endotoxine gecontamineerd water, voor verdunning voor intraveneuze medicatie [38]. Dit is een

van de redenen waarom endotoxines vermeden moeten worden in de medische wereld. De resultaten van dit

artikel illustreren dat inactivatie van endotoxines proportioneel is met de UV dosis. De inactiveringssnelheid is

ongeveer 0.55 EU/ml voor elke mJ/cm2 van bestraling.

2.3.3 Neutralisatie door aluminium hydroxide

Er is ook onderzoek bekend waarbij endotoxines worden gedetoxificeerd door middel van aluminiumhydroxide [39].

Hierbij adsorberen de endotoxines irreversibel aan het oppervlak van aluminiumhydroxide. Adsorptie treedt op

door elektrostatische aantrekking en covalente bindingen. Daarentegen is het te zien dat er bij aluminiumfosfaat

afstoting waargenomen wordt.

Het effect van een toediening van aluminiumhydroxide en een 15 mg/kg toeding van endotoxines is getest geweest

op ratten. Dit effect kon bepaald worden door meting van tumor necrose factor-alfa (TNF-α) en interleukine-6

(IL-6). De resultaten van deze proef vermelden dat TNF-α en IL-6 waargenomen is in groepen die enkel een

endotoxine of endotoxine en aluminiumfosfaat ontvingen. Er is wel niets gedetecteerd bij de groep die endotoxine

en aluminiumhydroxide ontvingen. Hierdoor kan er dus gesteld worden dat aluminiumhydroxide endotoxines

detoxificeert door irreversibele adsorptie.

Verder kunnen ook alkalinfosfatase [40], Tiratricol [41], titaniumdioxide (TiO2, zoals later besproken zal worden)

en nog enkele andere stoffen gebruikt worden om endotoxines te neutraliseren.

2.3.4 Neutralisatie door fotokatalyse

In deze bachelorproef wordt de nadruk gelegd op detoxificatie/neutralisatie van endotoxines d.m.v. fotokata-

lyse. Eerst wordt kort besproken wat fotokatalyse is, erna wordt ingegaan op de reeds uitgevoerde neutralisatie

experimenten met fotokatalyse, met als katalysator titaniumdioxide.

Fotokatalyse

Een manier om endotoxines te neutraliseren is met fotokatalyse. Fotokatalyse maakt gebruik van katalysatoren.

Dit zijn stoffen die deelnemen aan de reactie maar niet verbruikt worden [42]. De meest gebruikte katalysator

voor fotokatalyse is de halfgeleider TiO2. Voor de werking van fotokatalyse is echter eerst wat achtergrond kennis

vereist. In figuur 5 wordt op elektronisch niveau het verschil gegeven tussen een geleider, een halfgeleider en een

isolator. Op de y-as wordt het energieniveau weergegeven. Op deze figuur worden de valentie- en conductiebanden

weergegeven, met daartussen eventueel de “bandgap”. De valentieband is de hoogste energetische toestand waar

nog elektronen zitten en de conductieband stelt de laagst energetische toestand voor waar geen elektronen meer

zitten. Voor een metaal is het zo dat deze twee banden overlappen met elkaar en de elektronen vrij hiertussen

kunnen bewegen. Echter voor zowel een halfgeleider als een isolator is er een “bandgap” of m.a.w. een verschil

10

tussen deze twee banden. Het verschil tussen een halfgeleider en isolator is dat voor een halfgeleider, mits

toevoeging van energie, er toch nog elektronen van de valentieband naar de conductieband geexciteerd kunnen

worden. Dit gaat niet voor isolatoren omdat de “bandgap” te groot is om te kunnen overbruggen [6, 42].

Figuur 5: Vereenvoudigde voorstelling van het verschil tussen metaal, halfgeleider en isolator op elektronischniveau [5].

Wanneer er nu een elektron e- van de valentieband naar de conductieband kan springen door extra energie blijft

er op de valentieband een gat over. Dit gat is een H+, wat ook wel het positief geladen equivalent is van een

elektron. Specifiek voor de halfgeleider TiO2 wordt het volgende verkregen. Om de bandgap te overwinnen is een

energie van minstens 3.2 elektronvolt nodig. Dit komt overeen met licht met een golflengte van 385 nm of lager.

Dit ligt dus in het UV gebied. De gevormde elektron-gat paren kunnen dan elektronen afstaan of opnemen van

bijvoorbeeld water en zuurstof uit de omgeving, zodat er radicalen gevormd worden. Deze radicalen zorgen dan

voor de afbraak van organische componenten zoals endotoxines, of gassen zoals NOx uit de omgeving [6, 42].

Figuur 6: Werking van fotokatalyse met TiO2 als katalysator [6].

Reeds uitgevoerde fotokatalytische neutralisatie experimenten

Als reactief oppervlak bij al deze experimenten werd gebruik gemaakt van TiO2 . Voor verdere verduidelijking

van de werking hiervan, wordt verwezen naar 2.3.4 en 4. In deze sectie wordt er ingegaan op reeds uitgevoerde

experimenten met TiO2 om endotoxines te neutraliseren.

TiO2 kan dienst doen als bactericidaal middel en zorgt ook voor een degradatie van endotoxines [43]. In dit

wetenschappelijk artikel is er onderzoek gedaan naar twee effecten van TiO2 . Enerzijds de fotokatalytische

degradatie van endotoxines en anderzijds de bactericide activiteit. De bactericide activiteit werd bepaald door

het aantal levende cellen, die kolonies vormen op een agar plaat, te tellen. De endotoxineconcentratie kon bepaald

worden a.d.h.v. de LAL test (zie 2.2.2). Uit de resultaten kan opgemaakt worden dat het TiO2, d.m.v. UV be-

handeling, de bacterien doodt en tegelijkertijd zorgt voor een afbraak van endotoxines.

11

Een ander artikel heeft ook de effecten van TiO2 op bacterien onderzocht. Dit gebeurde op het organisme

L.Pneumophila. Dit micro-organisme is heel abundant en veroorzaakt pneumonie bij oudere mensen.

De bactericide effecten werden op drie manieren onderzocht.

Eerst werden de bacteriele celwanden bestudeerd met een “scanning electron miscrope” (SEM).

Vervolgens werd de lekkage van endotoxines gekwantificeerd. Deze is van belang omdat UV straling leidt tot

sterfte van de cel met als gevolg een lekkage van de inhoud. Als laatste werd de “survival rate” bepaald. De resul-

taten van dit onderzoek tonen aan dat volledige degradatie van endotoxines enkel in de aanwezigheid van TiO2

plaatsgrijpt. Daarnaast blijkt UV alleen ook te zorgen voor degradatie van endotoxines, echter wel in mindere

mate.

In dit experiment is er onderscheid gemaakt tussen UV-A (6W black light lamp, wavelength: 365nm) en UV-C

(6W germicidal lamp, wavelength: 254nm). Belangrijk hierbij is dat UV-C een sterker bacteriedodend effect

heeft. De endotoxineconcentratie werd opnieuw bepaald door de LAL test.

3 Doelstellingen

Het hoofddoel van deze paper is inzicht verkrijgen in de interactie van endotoxines en fijn stof. Dit zal gebeuren

door enerzijds de neutralisatie van endotoxines te onderzoeken met TiO2 en vervolgens ook deze van endotoxines

met fijn stof. Hierdoor kan er inzicht verworven worden tussen beide. Ook wordt er achterhaald of er inhiberende

stoffen aanwezig zijn in de lucht. Dit is van essentieel belang om een beter beeld te krijgen over de procedure van

de LAL test.

12

4 Materiaal en methode

4.1 Materiaal LAL test

4.1.1 Buffers

� Tris buffer

Er werd gekozen voor 100 mL Tris buffer te maken van 0.5 M.

mafgewogen = C ×MG× V = 0.5mol L−1x 121, 14 gmol−1x 100.10−3L = 6.057 g

Er werd 5.9994 g Trizma base van fabrikant Sigma afgewogen. Batch number: 066K5454. Dit werd opgelost

in 101 mL milli Q water, waardoor een concentratie van 0.49 M werd bekomen. De pH werd daarna van 11.03

naar 7.44 gebracht door toevoeging van HCl. De buffer werd vervolgens nog geautoclaveerd. Deze werd dan voor

de eigenlijke staalname 10 keer verdund door 10 mL buffer in 90 mL milli Q water te doen.

� PBS buffer

Voor de PBS buffer werd gekozen om 200 mL te maken van de 10x geconcentreerde vorm. Als protocol voor de af

te wegen hoeveelheid, werd gebruik gemaakt van het elabprotocol. Hierop wordt aangegeven hoeveel van welke

stof afgewogen dient te worden om het totaal volume te bekomen met bepaalde concentratie [10].

Tabel 3: Overzicht gebruikte stoffen voor bereiding PBS buffer. De af te wegen massa’s komen uit het elabprotocol.De fabrikant en batch nummer werd op de verpakking van de stoffen terug gevonden [10].

NaCl Na2HPO4 KCl KH2PO4

Theoretische af te wegen massa: m (g) 16 2.88 0.4 0.48Werkelijk afgewogen m (g) 15.9754 2.8889 0.4608 0.4791Fabrikant product GPR Rectapur Pro analysis Fluca analytical FlukaBatch nummer 08B130008 6586.0500 of A94386 BCBC6965 1301664 50807378

Dit werd opgelost in 200 mL. Vervolgens werd de pH van 6.80 met NaOH naar 7.47 gebracht.

� Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)

Deze buffer zou een endotoxinevrije buffer moeten zijn. Het was een 1x geconcentreerde buffer van de firma gibco

by life technologies. De referentienummer is 14040-091 en het lot nummer is 1253023.

4.1.2 Stopreagens

� Sodium dodecyl sulfaat (SDS)

Van het stopreagens sodium dodecyl sulfaat (SDS) werd een concentratie van 10 g / 100 mL gemaakt.

mafgewogen = C × V = 10 g100.10−3L x 50.10−3L = 5.0078 g

Er werd exact 5.0078 g afgewogen en dit werd in 100 mL opgelost.

� 25% azijnzuur

De 96% azijnzuur oplossing die in het labo aanwezig was (fabrikant: Riedel-de Haen), werd 4 keer verdund tot

een finale concentratie van 24% azijnzuur.

13

4.1.3 Microplaatlezer

Er werd gebruik gemaakt van 2 microplaatlezers:

Tabel 4: Gebruikte microplaatlezers.

Microplaatlezer 1 2Naam SynergyTMMx , Multi-Mode Microplate Reader EZ Reader 400 ElizaFabrikant Biotek Instruments, Inc BiochromSerie nummer 7191000 504259

4.1.4 LAL kit

Er werd gekozen om te werken met de eindpunt chromogenische LAL test kit van Lonza.

Tabel 5: Gebruikte LAL kit van Lonza.

LAL test kitSoort kit QCL-1000 , 120 Test kitBeginconcentratie LAL enzyme 28 EU/mLFabrikant LonzaKit nummer 0000 3290 18Lysaat lot nummer 0000 305206

4.1.5 Glaswerk

Al het niet-volumetrische glaswerk werd ingepakt met ziverpapier en vervolgens endotoxinevrij gemaakt door

het gedurende 30 minuten in een oven van 250°C te zetten. Volumetrisch glaswerk werd na reiniging in de

afwasmachine, gespoeld met ethanol en milli Q water, alvorens gebruik.

Er werden microplaten gebruikt die pyrogeenvrij waren. Bij het pipetteren werden ook pyrogeenvrije pipetpunten

gebruikt.

4.1.6 Laminaire flow kast

Gedurende elk experiment werd onder de laminaire flow kast gewerkt (Telstar Bio II advance) om endotoxinecon-

taminatie te beperken. Ook de UV stand van de kast werd gebruikt voor het uitvoeren van het TiO2 experiment.

De UV lampen uit de laminaire flow kast hebben een gemeten intensiteit van 0.21 mW/cm². Dit werd gemeten

over het gebied tussen 178 en 400 nm. De maximale intensiteit werd bij 254 nm bereikt. Deze gegevens werden

bekomen door gebruik te maken van een spectrometer type AvaSpec-3648 van het merk Avantes.

4.2 Methode LAL test

Voor het uitvoeren van de LAL test werd gesteund op het protocol dat bij de kit van de LAL test bij hoort. Deze

is toegevoegd in bijlage 3. Op enkele zaken na, zijn er aanpassingen aangebracht bij het uitvoeren van de LAL

test.

Zo werden de hoeveelheden van toe te voegen LAL enzym, substraat en stopreagens verminderd met 30% waar-

door er uiteindelijk meer testen konden uitgevoerd worden met gegeven aantal LAL enzym. Zie tabel 6.

Bij de LAL testen waarbij de geschiktheid van buffers werd bepaald, werd 35 µL stopreagens toegevoegd. Deze

hoeveelheid is nog net binnen de hoeveelheid stopreagens die zeker toegevoegd moet worden, namelijk bij toevoe-

gen van X µL LAL moet er minstens X µL stopreagens worden toegevoegd. Bij verdere LAL testen werd 70 µL

stopreagens toegevoegd zoals hieronder weergegeven.

14

Tabel 6: Gebruikte testprocedure voor de LAL test, met modificaties t.o.v. van het protocol van de fabrikant(Lonza) dat zich in bijlage 3 bevindt.

SampleTest sample of standaard op 20-25 °C 35 µLLAL 35 µLMix en incubeer op (37±1)°C 10 minutenSubstraat oplossing op (37±1)°C 70 µLMix en incubeer op (37±1)°C 6 minutenStop reagens (SDS of 25%azijnzuur) 70 µLMix onmiddellijkTotaal volume 210 µL

4.3 Materiaal TiO2 proef

4.3.1 Titaniumdioxide (TiO2)

Er werd gekozen voor TiO2 korrels (Aerolyst® 7710 van het merk Evonik) omdat ze makkelijk zijn in gebruik

en ook de mogelijkheid hebben om in de oven te worden gestoken. Dit werd dus ook gedaan om ze endotoxinevrij

te hebben. Hiervoor werden ze gedurende 30 minuten op 250°C verwarmd. Door deze behandeling verdwijnen

echter alle hydroxylgroepen die normaal op het TiO2 oppervlak gebonden zijn. Daarom werden de korrels,

alvorens gebruikt in de proef, terug in pyrogeenvrij milli Q water gelegd zodat ze terug hydroxylgroepen kunnen

binden.

4.3.2 PM

� Printex 12

De eerste PM bron is Carbon Black Italia S.R.L van evonik. Een andere naam hiervoor is Printex® 12. Hiervan

werd 19.9 mg afgewogen.

� Vlamroet 101

Een tweede PM bron is vlamroet 101 waarvan verdere eigenschappen weergegeven worden in tabel 7. Er werd

exact 20 mg afgewogen.

Tabel 7: Eigenschappen van de gebruikte PM.

Vlamroet 101Kontrolnummer 0086102Fabrikant evonikNaam Carbon Black GmbH

4.3.3 LPS

De eigenschappen van de gebruikte LPS vindt u hieronder terug.

15

Tabel 8: Eigenschappen van de gebruikte LPS.

LPSOrganisme lipopolysachariden van Pseudomonas aeruginosa 10Fabrikant Sigma AldrichSKU-pack size L7018-10 MGZuiveringsproces Gezuiverd door trichlooracetaat zuur extractieOnzuiverheden 1-10% proteınen (Lowry)Prijs 44.30 euro

4.3.4 Glaswerk

Glazen horlogeglazen met een diameter ± 5 cm, die gedurende 30 min op 250°C in een oven hebben gezeten.

4.4 Methode TiO2 proef

Voor de eigenlijke TiO2 proef wordt volgens het volgende protocol gewerkt. Eerst worden bepaalde endotoxinevrije

horlogeglazen gevuld met 1g TiO2. Omdat de TiO2 korrels eerst gehydrateerd moeten worden (nadat ze in de

oven werden gestoken), wordt overal 4 mL milli Q water in gedaan. Dit wordt ook met de glazen gedaan die geen

TiO2 bevatten om de concentraties hetzelfde te houden. Vervolgens wordt ook 4 mL van de te testen samples

toegevoegd. Sommige van deze glazen worden vervolgens met UV belicht. De belichting gebeurt in de laminaire

flow kast door de UV modus aan te schakelen om zo endotoxinecontaminatie te beperken.

De horlogeglazen die niet belicht worden, worden ook in deze kast geplaatst (om steriel te blijven), maar dan

onder een doos, zodat het UV licht er niet aan kan. Vervolgens wordt de belichtingstest gestart en wordt na

1 uur, respectievelijk 14 uur, telkens 2 keer 35 µL gepipetteerd uit het staal in een microplaat. Hiervan kan

vervolgens d.m.v. de LAL test, de endotoxineconcentraties bepaald worden. Dit wordt dan vergeleken met de

begin hoeveelheid endotoxine die in de stalen aanwezig was. In figuur 7 wordt de proefopstelling van de proef

weergegeven.

Figuur 7: Overzicht van de proefopstelling. Onder de doos bevinden zich de schaaltjes die niet met UV belichtmogen worden.

16

4.5 Materiaal staalname

4.5.1 Coreolis air sampler

Om luchtstalen te nemen waarvan de endotoxineconcentratie bepaald kon worden, werd de coreolis air sampler

gebruikt. Dit is een apparaat dat lucht aanzuigt met een bepaald debiet en door een recipient stuurt dat gevuld

is met een vloeistof om staal in te nemen.

Bij het nemen van de stalen werd voor gebruik de gekromde buis en het opzetstuk geautoclaveerd, echter niet

endotoxinevrij gemaakt wegens niet mogelijk. Als recipient werd een bijhorend plastiek opvangbekertje gebruikt

dat voor gebruik met ethanol werd gereinigd. Deze laatste kon ook niet endotoxinevrij gemaakt worden. Er werd

in verschillende buffers (zie 4.1.1) staalgenomen.

Figuur 8: Coreolis air sampler [7].

17

5 Resultaten en bespreking

De eerste doelstelling van dit bachelorproject over microbiele endotoxines als component van fijn stof is een beter

inzicht te krijgen in de interactie tussen endotoxines en fijn stof, en de implicaties daarvan voor onze gezondheid.

De tweede, daarmee samenhangende, doelstelling is om te onderzoeken of endotoxines geneutraliseerd kunnen

worden met behulp van fotokatalyse door TiO2, en of de interactie met fijn stof een invloed heeft op deze mogelijke

neutralisatie. Omdat we endotoxines onderzoeken in de context van hun effect op de gezondheid hebben we gebruik

gemaakt van de LAL test als bio-assay. We zijn namelijk niet zozeer geınteresseerd in aantallen van endotoxines,

maar wel in de activiteit ervan. Deze activiteit wordt gekwantificeerd door middel van de LAL test. Tijdens het

uitvoeren van de experimenten zijn we ons echter vragen beginnen stellen bij de correctheid van de LAL test,

waardoor de derde doelstelling van dit project is om een aantal aspecten van deze test te controleren.

5.1 Zoektocht naar een geschikte buffer

Een geschikte buffer vinden voor de LAL test is niet evident. De buffer moet immers 100% endotoxinevrij zijn

en mag niet interfereren met de enzymes van de test (zie 2.2.2). Ook zijn endotoxines relatief gevoelig voor pH-

wijziging [44], dus zowel voor onze experimenten als voor verder onderzoek rond endotoxines aan de universiteit

Antwerpen, moest een buffer gevonden worden die tijdens staalname de pH wijziging kan opvangen. Omwille van

al deze redenen hebben we redelijk wat tijd besteed aan het vinden van een goede buffer voor de verdere experi-

menten. We hebben van verschillende buffers getest of de pH veranderde tijdens de staalname, of er interferentie

optrad tussen de buffer en de LAL test, en of de buffers endotoxinevrij waren. De buffers die we getest hebben

waren een Tris buffer en een PBS buffer, zoals beschreven bij materiaal en methode. Met elke buffer werden twee

verschillende stalen genomen.

In tabel 9 worden de exacte omstandigheden van de staalname weergegeven, alsook de pH en het volume van

het recipient, zowel voor als na de staalname. Het belangrijkste wat opvalt aan deze tabel is dat de pH door de

staalname maar zeer beperkt verandert. Dit geldt voor beide stalen die genomen werden met de PBS buffer, en

ook voor beide stalen die genomen werden met de Tris buffer.

Tabel 9: Overzicht staalname 1.

Sample PBS1 Tris1 PBS2 Tris2

pH buffer: voor 7.40 7.48 7.40 7.48pH buffer: na 7.36 7.43 7.38 7.44

Volume buffer: voor 15 mL 15 mL 15 mL 15 mLVolume buffer: na 5 - 7.5 mL 5 - 7.5 mL 5 - 7.5 mL 5 - 7.5 mL

Datum 05/03/2013 05/03/2013 05/03/2013 05/03/2013

Locatie

- Coordinaten: (51.17930°NB , 4.4177°OL)- Naast de UA Groenenborger waaronder de Craeybeckxtunnel loopt- In buitenlucht, op grasveld met enkele bomen/struiken- Op 10m afstand is er een fietspad: ± 5 personen/15 minuten passeren- De zon scheen, temp ± 8 °C (schaduw)- Windsterkte ± 5 knopen, staal werd genomen in richting vd wind (Z-O)

Tijd 10:30-10:50 10:56-11:16 11:17-10:37 11:40-12:00Tijdsduur 20 min 20 min 20 min 20 min

Debiet van coreolis air sampler 300 L/min 300 L/min 300 L/min 300 L/minOpmerkingen -De metalen buis was

geautoclaveerd voor gebruik-Er zijn 3 vliegen in het staalgekomen tijdens staalname

18

De resultaten van de LAL testen worden weergegeven in tabel 10. De LAL activiteiten van de negatieve controles

tonen aan dat de Tris buffer in grote mate vervuild was met endotoxines, en dat ook de PBS buffer wat endotoxine

activiteit vertoonde, zij het dan minder dan de Tris buffer. De endotoxine activiteit van de stalen genomen met

Tris buffer bleek veel lager dan de negatieve controle, terwijl we zouden verwachten dat er door de staalname net

endotoxines zijn bijgekomen. Er zijn volgens ons drie mogelijke verklaringen voor deze vaststelling. Ofwel heeft

de procedure van de staalname een groot aantal endotoxines afgebroken, bijvoorbeeld door het heftig mixen van

de buffer tijdens de staalname. Ofwel hebben een aantal stoffen uit de lucht die in het staal terecht zijn gekomen

endotoxines afgebroken of geınactiveerd. Een derde optie is dat stoffen uit de lucht de LAL test zelf sterk hebben

geınhibeerd.

De resultaten van het spiken lijken steun te bieden voor de laatste verklaring, namelijk inhibitie van de LAL test.

Bij het toevoegen van de spike werden de stalen telkens een klein beetje verdund. Deze verdunning werd dan

verrekend na het resultaat van de LAL test, om de gespikete stalen met de ongespikete te kunnen vergelijken.

Eventuele stoffen in het staal met een inhiberende werking werden dus mee verdund, wat in de gespikete stalen

een afname van de inhibitie zou veroorzaken. Een afname van inhibitie betekent dan weer een grotere endotoxine

activiteit volgens de LAL test. Er werd gespiked met 0.49 EU/mL. Bij de buffers waarmee een luchtstaal was

genomen werden na het spiken echter stijgingen van meer dan het dubbele van de verwachte waarde opgemerkt.

De stalen genomen met Tris buffer stegen gemiddeld met 1.83 EU/mL, en de stalen genomen met PBS buffer met

1.4 EU/mL. Deze vaststelling zou dus te wijten kunnen zijn aan de verdunning van de inhiberende stoffen. Om

die reden is onze “inhibitiehypothese” een mogelijke verklaring voor de extra toename in endotoxine activiteit van

de spike.

Tabel 10: Endotoxine activiteit van de buffers voor en na staalname. Er werd telkens ook gespiked met 0.49EU/mL om te testen voor inhibitie. Voor de luchtstalen werd de LAL test niet in dubbel uitgevoerd, daaromkonden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden.

Endotoxine activiteit Endotoxine activiteit Verschil (EU/mL)zonder spike (EU/mL) met spike (EU/mL)

Tris buffer (neg controle) 33 ± 3 34 ± 3 (1 ± 4)PBS buffer (neg controle) 0.19 ± 0.05 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1

Tris buffer staal 1 1.46 3.33 1.87Tris buffer staal 2 3.84 5.64 1.80

gemiddelde 3 ± 1 5 ± 1 1.83 ± 0.04PBS buffer staal 1 3.05 4.73 1.68PBS buffer staal 2 1.06 2.26 1.20

gemiddelde 2 ± 1 3 ± 1 1.4 ± 0.2

Omdat beide geteste buffers vervuild bleken met endotoxines, en een endotoxinevrije buffer cruciaal was voor onze

experimenten, werd besloten een endotoxinevrije DPBS buffer te bestellen. Ook deze buffer werd gecontrolleerd

op pH stabiliteit tijdens de staalname, en ook hier bleek de buffer de pH wijzinging goed op te vangen, zoals te

zien is in tabel 11.

19

Tabel 11: Overzicht staalname 2.

Sample DPBS(staal 1) DPBS (staal 2)

pH buffer: voor 7.13 7.13pH buffer: na 7.054 7.06

Volume buffer: voor 15 mL 15 mLEr is in het midden van de tijdsduur van de staalname terug tot 15 mLaangelengd om grote fluctuaties in pH te vermijden

Volume buffer: na 20 minstaalname

±10 mL ±10 mL

Datum 26/03/2013 26/03/2013

Locatie

- Coordinaten: (51.17930°NB , 4.4177°OL)- Naast de UA Groenenborger waaronder de Craeybeckxtunnel loopt- In buitenlucht, op grasveld met enkele bomen/struiken- Op 10m afstand is er een fietspad: ± 5 personen/15 minuten passeren- De zon scheen, temp ± -1°C (schaduw)- Om er voor te zorgen dat het niet bevroor, werd rond het staal eenbeker met warm water gezet tijdens de staalname.- Windsterkte ± 4-7 knopen (alle richtingen), staal werd genomenin richting (Z-O)

Tijd 10:07-10:27 10:29-10:49Tijdsduur 20 min 20 min

Debiet van coreolis air sampler 300 L/min 300 L/min

Opmerkingen-De metalen buis wasgeautoclaveerd voor gebruik

De resultaten in tabel 10 moeten met een zekere omzichtigheid geınterpreteerd worden, om verschillende redenen.

Ten eerste is de LAL reactie bij deze testen bij een suboptimale temperatuur doorgegaan, namelijk bij 25°C in

plaats van 37°C, door een fout bij het gebruik van het warmteblok. De ijklijn was echter vrij goed, met een

R2 waarde van 0.9895. Ten tweede geeft de LAL test enkel een lineair verband tussen absorptie en endotoxine

activiteit tussen 0.1 en 1 EU/mL. Op een resultaat na vallen al de waarden uit tabel 10 buiten deze lineaire range.

Omwille van deze twee redenen kunnen de resultaten van dit experiment enkel gezien worden als een indicatie.

5.2 Neutralisatie van LPS en PM met TiO2

In dit experiment onderzochten we de hoofdvragen van het project, namelijk of de interactie met fijn stof een

invloed heeft op de toxiciteit van endotoxines, en of endotoxines in zowel de vrije vorm als de PM-gebonden

vorm geneutraliseerd kunnen worden door fotokatalyse met TiO2. We maakten daarvoor gebruik van vlamroet

101 als artificiele PM omdat deze beter in suspensie bleef dan printex 12. Als endotoxine werd LPS gebruikt

van Pseudomonas aeruginosa. Er werden oplossingen gemaakt met PM, met LPS, en met LPS+PM, steeds in

DPBS buffer. Deze oplossingen werden dan op drie verschillende manieren behandeld: bestraling met UV licht,

contact met TiO2 korrels, en de combinatie van beide. Voor de behandeling, na een uur van de behandeling en

na veertien uur werd op de drie oplossingen een LAL test uitgevoerd. Ter controle werd de LPS+PM oplossing

ook gemeten na een uur en na veertien uur zonder behandeling.

De resultaten worden weergegeven in tabel 12 en grafisch voorgesteld in figuur 9. Wanneer we kijken naar

de endotoxine activiteiten voor het doorgaan van de reactie (de rij 0u in de tabel), zien we dat de LPS+PM

oplossing een lagere endotoxine activiteit vertoonde dan de oplossing met enkel LPS, hoewel deze oplossingen

dezelfde concentratie aan LPS bevatten. De PM gebonden endotoxines lijken dus minder reactief te zijn dan

de vrije endotoxines. Na een uur reageren met TiO2 korrels of UV licht had de LPS+PM oplossing ook minder

afbraak ondergaan dan de LPS oplossing, zoals duidelijk te zien is op de grafiek. Ook na veertien uur UV bestra-

ling waren de PM-gebonden LPS moleculen veel minder afgebroken dan de vrije LPS moleculen. Een verklaring

20

hiervoor zou kunnen zijn dat het reactieve lipide-A gedeelte van LPS door PM wordt afgeschermd, wat zowel de

reactiviteit van de LPS moleculen als de mate van afbraak beperkt.

Uit deze resultaten blijkt ook dat na veertien uur zowel de behandeling met TiO2 als met UV licht als met

de combinatie van beiden effectief waren in het neutraliseren van endotoxines. De behandeling met TiO2 en UV

licht had duidelijk het sterktste resultaat. De LPS+PM oplossing vertoonde na een uur van de controle behande-

ling (geen TiO2 en geen UV) een grotere activiteit dan voor de behandeling. Een mogelijke verklaring hiervoor is

dat het in de oven plaatsen van de schaaltjes gedurende 30 minuten bij 250°C niet volstond om alle endotoxines af

te breken en de schaaltjes dus met andere woorden vervuild waren. Wanneer we van deze veronderstelling uitgaan,

waren de behandelingen met TiO2 en UV na een uur ook al effectief, aangezien de hoeveelheden endotoxines na

de meting van 0u nog waren gestegen door het in de schaaltjes gieten van de oplossingen. De resultaten van een

uur behandeling met TiO2 en UV zijn jammer genoeg niet gelukt.

Tabel 12: Endotoxine activiteiten van oplossingen met LPS, PM, LPS+PM en een negatieve controle (buffer).De reactie met TiO2 en UV werd getest, maar ook met enkel UV en enkel TiO2. Activiteiten werden gemetenvoor de reactie, na een uur van de reactie en na veertien uur van de reactie. Bij de controle meting van 14u geenbehandeling, lagen de dubbels heel ver uit elkaar. Alle activiteiten zijn in EU/mL.

Negatieve controle PM LPS LPS+PM0u 0.33 ± 0.07 0.39 ± 0.07 1.2 ± 0.1 0.9 ± 0.11u geen TiO2, geen UV 1.60

enkel TiO2 0.34 ± 0.07 0.37 ± 0.07 0.71 ± 0.09 1.0 ± 0.1enkel UV 0.30 ± 0.07 0.33 ± 0.07 0.9 ± 0.1 1.0 ± 0.1

titaan + UV14u geen TiO2, geen UV (0.43)

enkel TiO2 0.11 ± 0.06 0.15 ± 0.06 0.40 ± 0.09 0.39 ± 0.07enkel UV 0.15 ± 0.06 0.27 ± 0.08 0.52 ± 0.08

titaan + UV 0.12 ± 0.06 0.3 ± 0.1 0.15 ± 0.06 0.18 ± 0.07

Ook bij deze experimenten moeten een aantal zaken in het achterhoofd gehouden worden. Net als bij het vorige

experiment met de verschillende buffers zijn ook hier de LAL reacties doorgegaan bij 25°C in plaats van 37°C.

Maar ook hier was de ijklijn een degelijke fit: de R2 waarde bedroeg 0.9817. Een kwalitatieve interpretatie van de

resultaten is dus zeker mogelijk. Wat ook een moeilijkheid was bij het interpreteren van deze resultaten was het

gebrek aan degelijke controles om mee te vergelijken. Hoewel het sterk lijkt dat de controlebehandeling zonder

TiO2 en zonder UV een afname van het endotoxine activiteit zou veroorzaakt hebben, had het toch interessanter

geweest als we de afbraak door de verschillende behandelingen met een controle behandeling hadden kunnen

vergelijken. Daarom is het heel jammer dat van de twee controles die wel getest werden, er een mislukt is (14u

LPS+PM).

21

a) b)

c)

Figuur 9: Resultaten van de LAL testen na 0 uur en 14 uur behandeling met TiO2 korrels (a), UV licht (b) enTiO2 in combinatie met UV (c).

5.3 Wordt de LAL test geınhibeerd?

De resultaten van de testen met verschillende buffers leken te suggereren dat de LAL test geınhibeerd werd door

stoffen in het staal. We besloten daarom deze “inhibitiehypothese” te testen in een extra experiment. In het

geval dat de LAL test niet geınhibeerd zou worden, verwachten we dat wanneer we een staal met gekende LAL

activiteit verdunnen met een bepaalde factor, de LAL activiteit met diezelfde factor zal afnemen. In het geval

van inhibitie is dat niet het geval: we verdunnen dan niet alleen het aantal endotoxines, maar ook het aantal

inhibitoren. De verdunning van het aantal endotoxines zorgt natuurlijk voor een lager resultaat van de LAL test,

maar het verminderen van de inhibitie door de verdunning zal de LAL reactie dan weer steker doen doorgaan.

Daardoor kan het in principe zelfs zo zijn dat de LAL activiteit door een staal te verdunnen zelfs vergroot.

De resulaten van deze proef staan in tabel 13 samengevat. Ze steunen duidelijk de inhibitiehypothese. De

endotoxine activiteit was na verdunning telkens hoger dan voorspeld was op basis van de verdunningsfactor.

Staal 2 gaf na vier maal te verdunnen zelfs een hogere endotoxine activiteit dan het onverdunde staal. Wat ook

opviel was dat het effect afnam bij verdere verdunning: wanneer het al zes maal verdunde staal 1 nog extra

verdund werd, werd het verschil tussen de voorspelde activiteit en de gemeten activeit kleiner. Het effect van de

verminderde inhibitie door de verdunning bleef echter nog steeds duidelijk zichtbaar.

22

Table 13: De gemeten endotoxine activiteit na verdunning, en de verwachte activiteit na verdunning op basisvan de verdunningsfactor. Alle activiteiten zijn in EU/mL. De onverdunde stalen werden niet in dubbel getest,daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden.

Verdunningsfactor Activiteit (EU/mL) Verwachte activiteitna verdunning (EU/mL)

Staal 1 onverdund 7.4Staal 1 verdund 1/6 4.4 ± 0.1 1.2

Staal 2 onverdund 3.2Staal 2 verdund 1/4 4.4 ± 0.3 0.8Staal 1 verdund 4.4 ± 0.1

Staal 1 extra verdunning 1 6/7 4.1 ± 0.2 3.8 ± 0.1Staal 1 extra verdunning 2 5/7 3.9 ± 0.1 3.2 ± 0.1

5.4 Problemen met het LAL protocol

Tijdens de uitvoering van de LAL testen bij de voorgaande experimenten werden we geconfronteerd met een

aantal problemen die we niet onmiddellijk konden verklaren. Zo kwamen we steeds een hoeveelheid LAL enzymes

en chromogenisch substraat tekort tijdens de uitvoering van de LAL testen, terwijl we het aantal testen dat we

konden doen met de gegeven hoeveelheden telkens nauwkeurig hadden berekend met een vrij grote veiligheids-

marge. Door dit acute gebrek aan enzymes zijn een aantal testen mislukt. Een tweede probleem was dat onze

absorptiewaarden zeer laag waren.

Om een verklaring te vinden voor de grote hoeveelheden LAL reagentia die leken te verdwijnen besloten we

een aantal kleine testjes te doen. Een kleine hoeveelheid reagentia leek volgens een eerste test verloren te gaan

door het overkappen vanuit de flesjes in de pipetteerbakjes en omgekeerd, maar het ging niet om onverwachts

grote hoeveelheden. In een tweede test keken we naar het effect van verdamping. De reagentia bevonden zich

tijdens de LAL testen namelijk steeds gedurende ongeveer een half uur in een pipetteerbakje met een vrij groot

verdampingsoppervlak, en de lampen van de laminaire flow kast stonden steeds aan. Daarom deden we een kort

experiment, waarbij we acht bakjes met water een half uur onder de laminaire flow kast lieten staan. De bakjes

waren verdeeld over twee condities: vier bakjes werden bedekt met aluminiumfolie en vier bakjes niet. Vervolgens

lieten we iemand zo veel mogelijk eenheden van 35 µL pipetteren uit elk bakje, zonder dat die persoon wist

welke bakjes bedekt waren geweest door de folie. De resultaten staan in tabel 14. Een t-test voor ongepaarde

waarnemingen met gelijke varianties gaf aan dat de beide behandelingen significant verschilden (p=0.0027). Er

waren dus op een half uur tijd ongeveer twee LAL testen verdwenen enkel en alleen door verdamping van de

reagentia.

Tabel 14: Het aantal keer dat 35 µL water kon gepipetteerd worden uit bakjes met 1.400 mL (het maximum wasdus 40 keer). De helft van de bakjes werd een half uur beschenen door de lamp van de laminaire flow kast, deandere helft werd bedekt door aluminium folie.

licht donkerresultaten 35 35

37 4036 3938 3935 3936 39

gemiddelde 36.2 38.5

23

Een tweede probleem waar we tijdens de experimenten mee geconfonteerd werden waren lage absorptiewaarden.

De laatste stap van de LAL reactie is de omzetting van een chromogenisch substraat in p-nitroalanine. Deze

laatste stof absorbeert in het zichtbare gebied, met een maximum volgens Lonza bij 405 nm. Omdat wij steeds lage

absoptiewaarden verkregen besloten we zelf eens te onderzoeken wat het absorptiemaximum van p-nitroalanine

was. Volgens een scan bij alle golflengtes van 350 tot 450 nm lag het absorptiemaximum bij 386 nm, zoals

te zien is op figuur 10. Onze lage absorptiewaarden bleken later veroorzaakt te worden door een sub-optimale

reactietemperatuur bij de LAL test, maar de vaststelling dat er niet bij het absorptiemaximum wordt gemeten

bij de LAL test blijft desondanks interessant.

Figuur 10: Absorptie van p-nitro alanine bij golflengtes van 350 tot 450 nm. Als blanco werd de zuivere buffergenomen.

24

6 Discussie

6.1 De interactie tussen endotoxines en fijn stof

De resultaten van ons experiment lijken te suggereren dat fijn stof het aantal endotoxines die de LAL test ini-

tieert reduceert. Dit wil zeggen dat wanneer zowel endotoxines als fijn stof in een staal aanwezig zijn, een aantal

endotoxines zullen binden op fijn stof en mogelijk zo dus ontoegankelijk worden om de LAL enzymes van de

LAL test te stimuleren. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat bij de binding tussen LPS en PM het lipide-A

gedeelte, dat het pro-inflammatoire karakter van LPS bepaalt, zich aan de binnenkant bevindt van het PM-LPS

complex. Daardoor is het lipide-A deel minder toegankelijk voor de enzymes van de LAL test. Thermodynamisch

gezien is dit een logisch model voor de binding, aangezien op die manier het hydrofobe lipide-A deel minder in

contact staat met water. De implicatie van dit soort van binding tussen LPS en PM voor onze gezondheid, is

dat PM-gebonden LPS ons immuunsysteem minder zou activeren en daardoor ook minder schadelijk zou zijn.

Echter een kanttekening die hierbij gemaakt moet worden is dat nog niet goed geweten is hoe fijn stof ons lichaam

binnendringt. Het zou immers kunnen zijn dat net door het binden van endotoxines op fijn stof, en het vlot

doordringen van fijn stof in onze longen, er zo ook meer endotoxines in onze longen kunnen binnendringen. Dit

zou er net voor kunnen zorgen dat het pro-inflammatoire effect van endotoxines toch verhoogd wordt door binding

op fijn stof, ondanks dat de LAL test aangeeft dat het minder pro-inflammatoir is.

Een belangrijke kritische noot die we moeten aanhalen bij het uitvoeren van deze experimenten, is dat we steeds

met oplossingen hebben gewerkt, hoewel we zijn vertrokken van componenten in de lucht. Het is dus zo dat de

conclusies uit ons onderzoek niet zomaar veralgemeend kunnen worden voor componenten in de lucht. We weten

namelijk niet of de binding endotoxine-fijn stof in de lucht gevormd wordt, en als deze gevormd wordt, deze ook

nog hetzelfde blijft wanneer er overgegaan wordt naar de vloeistoffase.

Ook kunnen we ons afvragen of de binding endotoxine op fijn stof altijd dezelfde is en hoe deze er chemisch

juist uitziet. Hiervoor zouden verdere onderzoeken uitgevoerd kunnen worden zoals besproken zal worden in de

toekomstperspectieven. Het zou ook kunnen dat de binding verschilt tussen verschillende soorten fijn stof. In

dit project hebben we gebruik gemaakt van vlamroet als model voor fijn stof. De exacte samenstelling van dit

vlamroet weten we niet, maar we gaan er van uit dat deze voornamelijk bestaat uit elementaire koolstof.

Deze PM bron is dus niet representatief voor echt fijn stof aangezien fijn stof meer heterogeen is qua samen-

stelling. Denk maar aan de metalen of organische componenten die ook aanwezig zijn in fijn stof uit de atmosfeer.

Een betere koolstofbron zou daarom bijvoorbeeld het roet zijn dat afkomstig is van dieselmotoren. Uit een

artikel waarin de samenstelling van dieselroet bekeken wordt, rekening houdend met verschillende parameters

zoals verdunning en belasting, blijkt dat dieselroet namelijk naast elementaire koolstof ook vluchtige organische

componenten en metalen bevat [45]. De samenstelling van dieselroet is dus heterogener dan die van vlamroet,

waardoor dit een betere bron voor fijn stof zou kunnen zijn om experimenten met te doen in het labo. Echter, dit

volstaat niet voor de experimenten met endotoxines. Het is namelijk zo dat om experimenten met endotoxines

uit te voeren, het belangrijk is dat de fijn stof bron endotoxinevrij is, of gemaakt kan worden. Voor elke fijn

stof bron dat dus gebruikt wordt, zou bepaald moeten worden of de bron endotoxinevrij is. Dit is iets wat we

met onze PM bron vlamroet, niet hebben kunnen bepalen waardoor ook dit tot contaminatie zou geleid kunnen

hebben. Echter uit de resultaten kon dit niet significant aangetoond worden.

25

6.2 Is de veelgebruikte LAL test betrouwbaar?

Er zijn verschillende problemen waar we in contact mee zijn gekomen bij het uitvoeren van de LAL test. Hieronder

worden deze kort aangehaald en wordt een mogelijke oplossing voorgesteld.

6.2.1 Interferentie

30 jaar geleden heeft de “U.S. Department of Health and Human Services - Food and Drug Administration”

(FDA), het gebruik van de LAL test aanvaard i.p.v. de pyrogene test op konijnen [46]. Zoals uitgelegd in de

literatuurstudie zijn er verschillende varianten van de LAL test. De richtlijnen van de FDA voor het uitvoeren van

de LAL test, beschrijven dat bij het uitvoeren van de LAL test rekening moet worden gehouden met interferentie.

Het is namelijk zo dat nogal wat componenten kunnen interfereren met de LAL test zoals β-glucaan [3], en

dat de controle op interferenten van gebruikte vloeistoffen, zoals buffers, noodzakelijk is alvorens de LAL test

uit te voeren [46]. Echter β-glucaan is een stof die ervoor zorgt dat we de werkelijke endotoxineconcentratie

overschatten.

Het omgekeerde kan ook voorkomen, namelijk dat er in de lucht zelf ook componenten zitten die de LAL test

negatief kunnen beınvloeden. Dit leek bij onze luchtstalen het geval te zijn. Ook een studie uit Iran uit 1996

ondervond dat hun LAL testen geınhibeerd werden [47]. De onderzoekers schreven de inhibitie toe aan een aantal

kationen uit de lucht. Deze componenten komen tijdens de staalname mee in het staal terecht, waar ze de LAL

enzymes mogelijk (ongunstig) kunnen beınvloeden. We konden jammer genoeg geen volledige tekst van hun artikel

bemachtigen om te weten te komen om welke kationen het juist ging. Interferentie, zowel positief als negatief,

kan enkel opgemerkt worden indien er gespiked wordt. Vandaar dat dit wel een belangrijke procedure is die zeker

en vast altijd moet uitgevoerd worden.

Uitschakelen van interferentie bij LAL test

Uit onze resultaten kon vastgesteld worden dat de LAL test geınhibeerd werd. Opvallend was wel dat deze

inhibitie kleiner werd naarmate er meer verdund werd zie 5.3. Voldoende verdunnen is dus essentieel bij deze

test om de effecten van interferentie (in ons geval inhibitie) weg te werken. Ook de Iraanse onderzoekers die een

inhiberend effect ondervonden wezen op het belang van voldoende verdunnen als oplossing voor deze inhibitie [47].

Andere methoden die gebruikt kunnen worden om deze interferentie weg te werken zijn opwarming en neu-

tralisatie, maar deze methoden zijn nog niet gestandariseerd voor luchtstalen en moeten dus nog gevalideerd

worden. [48].

Daarnaast is ook de recombinant factor C test gebruiken i.p.v. de LAL test een mogelijk oplossing. Deze test

maakt namelijk gebruik van een gemodificeerd substraat dat enkel endotoxine kan triggeren. Hierdoor worden

interferenten zoals β-glucaan uitgeschakeld. Deze test heeft daarnaast ook een breder bereik dan alle LAL testen,

namelijk 0.005 - 5 EU/mL, en maakt geen gebruik van levende krabben waardoor de reactiviteit van het reagens

altijd hetzelfde is. Hierdoor kunnen de gemeten endotoxinegehaltes ook beter met elkaar vergeleken worden.

Er zijn daarnaast ook chemische analysetechnieken mogelijk zoals gaschromatografie en massaspectrometrie om

het endotoxinegehalte te bepalen. Deze zouden tot meer correcte/accurate resultaten kunnen leiden voor en-

dotoxineconcentratie dan de bio-assays. Echter een beperking van te werken met chemische analysemethoden,

is dat er geen rekening meer wordt gehouden met de pro-inflammatoire capaciteit van de endotoxines. Bij de

bio-assay is de reactie die doorgegaan is bij de LAL test een rechtstreekse maat voor het pro-inflammatoire karak-

ter. Ook stelt zich het probleem van hoe er efficiente en goedkope kolommen gemaakt kunnen worden waarover

bij gaschromatografie het staal gestuurd kan worden (onder hoge druk en temperatuur). Er zouden kolommen

gemaakt kunnen worden die interageren met het lipide-A gedeelte, maar in hoeverre dit allemaal mogelijk is zou

26

onderzocht moeten worden. Voor het O-antigeen zou dit te complex worden aangezien dit gedeelte varieert tussen

endotoxines. Er moet ook rekening gehouden worden met het feit dat vele endotoxines aan glaswanden blijven

plakken. Dus moet er verzekerd worden dat al deze endotoxines ook weer uit deze kolom komen.

6.2.2 Belang van het meten bij de juiste golflengte

Een ander probleem waar we mee geconfronteerd werden, was bij het meten van de absorptie na het uitvoeren

van de LAL test. Zo schreef het protocol van de fabrikant Lonza (zie bijlage 3) voor dat dit bij een golflengte

van 405-410 nm moet gebeuren. Wij hebben echter getest waar het optimum van de absorptie bereikt werd, en

deze was bij een lagere golflengte van 386 nm (zie 5.4). De reden waarom niet bij de optimale golflengte gemeten

wordt bij de LAL test is niet onmiddellijk duidelijk. Een mogelijke verklaring is dat andere frequent voorkomende

stoffen in de lucht ook een absorptie vertonen rond 390 nm, en dat het gebruik van een andere golflengte daarom

noodzakelijk is om interferentie bij de absorptie te beperken.

6.2.3 Gevolgen van verdamping

Wanneer er bij het uitvoeren van de LAL test gewerkt wordt onder de laminaire flow kast, is het zo dat er

verdamping van de oplossingen met LAL reagentia optreedt, zoals reeds besproken in 5.4. De consequentie

hiervan is niet enkel dat niet alle geplande LAL testen uitgevoerd konden worden, maar dat dit ook een impact

had op de resultaten van onze proeven. Het is namelijk zo dat zowel in de microplaat als de pipetteerbakjes

verdamping optrad en dat hierdoor de concentratie niet meer dezelfde was als gepland. Aangezien we gewerkt

hebben met zeer kleine hoeveelheden in de microplaat, waar dus ook verdamping bij kan optreden, kan dit enorme

gevolgen hebben met betrekking tot de resultaten. Doordat er niet exact geweten is hoeveel er juist verdampt is,

kan dit ook niet meegenomen worden bij de resultaten. Het belangrijkste dat hieruit geleerd kan worden is dat

hier zeker rekening mee moet worden gehouden bij het uitvoeren van de LAL test. Zoals vermeld zal worden in

het ingenieur-technische deel (zie 6.5), werd er een eigen protocol opgesteld om de LAL test uit te voeren. In dit

protocol wordt rekening gehouden met alle aspecten die volgens ons verbeterd konden worden waaronder deze

verdamping. We stellen in het protocol voor om verdamping tegen te gaan door elke keer de pipetteerbakjes af

te dekken met zilverpapier.

6.3 Endotoxinevrij werken

Met betrekking tot de uitgevoerde experimenten hebben we meerdere keren gemerkt dat endotoxinevrij werken

niet evident is. Niet alleen moet het gebruikte materiaal en al de stoffen endotoxinevrij zijn, maar moet ook de

lucht endotoxinevrij zijn.

Daarom moet er steeds, wanneer er met endotoxines gewerkt wordt, gewerkt worden in een laminaire flow kast

waarvan we weten dat deze pyrogeenvrij is. Wat we niet weten is in hoeverre deze ook endotoxinevrij is. Een

alternatief voor de laminair flow kast zou zijn om te werken in een ’cleanroom’. Dit is een omgeving, die vooral

gebruikt wordt voor industriele productie of wetenschappelijk onderzoek, waarbij een zo laag mogelijke hoeveel-

heid vervuiling, zoals stof, in de lucht aanwezige micro-organismen, fijn stof of chemische dampen aanwezig mag

zijn. Of anders gezegd, een cleanroom heeft een gecontroleerde hoeveelheid vervuiling wat gespecificeerd wordt

door het aantal deeltjes per kubieke meter van een specifieke omvang. Vooral bij fabricatie van geneesmiddelen

of halfgeleiders wordt deze veel gebruikt [49, 50].

Een ander probleem dat typisch is aan endotoxinevrij werken, is dat al het gebruikte glaswerk en materiaal

27

endotoxinevrij moet zijn. Voor niet-volumetrisch glaswerk is dit niet zo moeilijk aangezien dit met zilverpapier

kan ingepakt worden en vervolgens gedurende 30 minuten op 250°C kan gezet worden. Zo zouden alle endotoxines

worden afgebroken. Maar zelfs dan waren er aanwijzingen in onze resultaten dat er nog intacte endotoxines

aanwezig waren op ons glaswerk (zie tabel 12). Echter voor volumetrisch glaswerk mag deze procedure niet ge-

bruikt worden omdat dit glaswerk anders niet meer correct geijkt is. Daarom werd het volumetrische glaswerk

in de afwasmachine gestoken en erna onmiddellijk gebruikt of afgedekt met endotoxinevrij zilverpapier. Om het

experiment te verbeteren zou er gebruik gemaakt moeten worden van pyrogeenvrij wegwerpbaar volumetrisch

glaswerk. Aangezien dit (momenteel) niet bestaat, is het belangrijk voor toekomstige proeven hiervoor een an-

dere oplossing te vinden. Een extra moeilijkheid die werken met endotoxines teweegbrengt, is dat endotoxines de

neiging hebben om overal aan te blijven plakken, voornamelijk aan plastiek en glas. Ook dit maakt het werken

met endotoxines er niet makkelijker op omdat er niet geweten is hoeveel er juist blijft plakken. Zelfs aan het

gebruikte titaniumdioxide zouden er endotoxines kunnen plakken. Om dit te testen of er endotoxines aan de ge-

bruikte titaniumdioxidekorrels geadsorbeerd zijn, zou er een pellet gemaakt kunnen worden van de korrels, waar

vervolgens een infraroodspectrum van kan worden gemaakt. Omwille van een praktisch probleem hebben we dit

niet kunnen uitvoeren. Het is namelijk zo dat we na het experiment de korrels niet droog kregen, wat noodzakelijk

is om een goede pellet te kunnen maken. We zouden de natte titaniumkorrels op een filtreerpapier kunnen leggen,

maar dan zouden de korrels automatisch al endotoxines adsorberen aangezien dit papier niet endotoxinevrij is

en er ook geen endotoxinevrij papier of doekjes te verkrijgen is. Ook de korrels in de oven steken is geen optie,

aangezien de endotoxines dan weer afgebroken kunnen worden.

Een vraag die van belang is voor onze uitgevoerde proeven is natuurlijk of er wel endotoxinevrij gewerkt is.

We hebben op alle mogelijke manieren geprobeerd dat te verwezelijken, maar zeker zijn we nooit. Er werd wel

steeds met handschoenen en onder de laminaire flow gewerkt, maar sommige zaken waren onvermijdbaar.

Bijvoorbeeld voor het afwegen van de TiO2 kon niet onder de laminaire flow gewerkt worden omdat de weegschaal

er niet onder geplaatst kon worden, en deze ook al niet endotoxinevrij zou kunnen gemaakt worden. Ook het

werken met het volumetrisch glaswerk was een hiaat. We weten daarnaast ook niet in hoeverre de proeven geınter-

fereerd zijn door de lucht uit de laminaire flow kast. Is er een beter experimentele methode mogelijk bijvoorbeeld

door de bovenvermelde cleanroom? Deze vragen zijn zeker gesteld tijdens het onderzoek, maar het werken onder

de laminaire flow was voor ons de beste (en enige) mogelijkheid.

6.4 Sociaal-economisch

6.4.1 Problematiek omtrent luchtvervuiling

Wat ook zeker een sociaal aspect is van deze bachelorproef is de grotere problematiek omtrent luchtvervui-

ling. Iedereen op aarde wordt hier immers met geconfronteerd en ademt deze deeltjes in zonder het te beseffen.

Hieronder volgen enkele van de voornaamste bronnen van luchtvervuiling [51]:

� Verbranding van fossiele brandstoffen in elektriciteitscentrales, transport, industrie en huishoudens

� Industriele processen en solvent gebruikt, bijvoorbeeld in de chemische industrie en mineralen

� Landbouw

� Afvalbehandeling

� Vulkaanuitbarstingen, door de wind meegevoerd stof en de uitstoot van organische stoffen uit planten zijn

voorbeelden van natuurlijke emissiebronnen.

28

Hierbij horend wordt een kort overzicht gegeven van de bijdrage van verschillende sectoren tot luchtvervuiling

[52].

� The energiesector is verantwoordelijk voor 70% SOx en 21% NOxemissie in Europa.

� Transport is een belangrijke bron van NOxproductie. Daarenboven zijn personenwagens de voornaamste

bron van zowel CO, NOx, PM2.5 en “non-methane volatile organic compounds” (NMVOCs) in de lucht.

� Het energieverbruik door huishoudens is een belangrijke bron voor de emissie van PM2.5. Dit door de

verbranding van hout en kool.

� De landouw sector draagt voor 94% bij aan de NH3 emissie in Europa.

In de Bijlage 2 is er een overzicht te vinden van verschillende polluenten en het aandeel van verscheidene sectoren

hierop.

Om toch voeling te krijgen met het belang van deze problematiek, worden hieronder enkele feiten over luchtvervui-

ling opgesomd [53]. Deze feiten tonen aan dat er zeker moet ingespeeld worden op dit globaal probleem, zowel

op sociaal, politiek als economisch vlak.

Zonder de werking van de politiek kunnen er immers nooit richtlijnen opgesteld worden en zonder engagement

van industrie en bedrijven is er geen verandering mogelijk. Als sociaal aspect is het belangrijk dat ieder individu

een moreel standpunt inneemt, en beseft hoe hiermee moet worden omgegaan.

� Luchtvervuiling is een groot omgevingsrisico voor de gezondheid. Door de luchtvervuiling te reduceren,

kunnen we landen helpen om de globale ziektenlast van ademhalingsinfecties, hartziekten en longkanker te

verlagen.

� Hoe lager de niveau’s van luchtvervuiling in steden zijn, hoe beter de ademhalings- (zowel lange als korte

termijn) als de cardiovasculaire gezondheid van de populatie zal zijn.

� Er wordt geschat dat luchtvervuiling binnenshuis bij benadering twee miljoen vroegtijdige sterftegevallen

veroorzaakt, meestal in ontwikkelingslanden. Bijna de helft van deze sterftegevallen zijn te wijten aan

longontsteking van kinderen jonger dan vijf jaar.

� Er wordt geschat dat ’outdoor’ stedelijke luchtvervuiling 1.3 miljoen doden wereldwijd per jaar veroorzaakt.

Diegenen die leven in landen met een middelmatig inkomen ervaren deze last.

� De controle aan blootstelling van luchtvervuilende componenten ligt grotendeels buiten het bereik van indi-

viduen en vereisen daarom actie door publieke autoriteiten op zowel nationaal, regionaal als internationaal

vlak.

� De WHO luchtkwaliteitsrichtlijnen representeren de meest wijde overeenkomsten en up-to-date schattingen

van de gezondheidseffecten van luchtvervuiling, welke richtlijnen aanraadt voor luchtkwaliteit waarop de

gezondheidsrisico’s significant gereduceerd worden. Deze richtlijnen geven aan dat door een reductie van

PM10 vervuiling van 70 naar 20 µg/m3, zorgt voor een daling van 15% voor luchtkwaliteitsgerelateerde

overlijdens.

29

6.4.2 Belang van het meten van fijn stof en endotoxinegehalte

Metingen van zowel fijn stof als de endotoxineconcentratie in de lucht is van groot belang voor de gezondheid

van de mens. Voor Nederland is het zo dat momenteel de methode van de verzwakking van β-straling en van

de oscillerende microbalans de meest gebruikte methoden zijn om fijn stof te meten [54]. Deze metingen geven

informatie over de massa van het stof in de lucht, maar niet over de samenstelling ervan.

Voor de samenstelling van fijn stof, meerbepaald secundair anorganisch aerosol, zwarte rook, zware metalen en

benzo[a]pyreen (component PAK’s), zijn er nog maar enkele meetstations in Nederland die dit kunnen bepalen[54].

De manier waarop deze gemeten worden gaat ons te ver leiden. Wel is op te merken dat zo’n meetstations voor

de endotoxinecomponent vandaag de dag nog niet bestaat.

Het is momenteel enkel mogelijk om endotoxinegehaltes van de lucht te meten via de LAL test, rFC test en

chemische analysemethoden. Het probleem hierbij is dat er grote verschillen in resultaten kunnen ontstaan

afhankelijk van wanneer en hoe de staalname is gebeurd. Zo speelt zowel de temperatuur als vochtigheid van

het moment van staalname een belangrijke rol, maar ook of de staalname gebeurd is met filters (meestal de

glasvezelfilter), impingers (zoals coreolis air sampler) of een passieve monstername. Met passieve monstername

wordt bijvoorbeeld een vloerstofmonster in huis bedoeld of passief genomen luchtmonsters met de zogenaamde

“electrostatic dustfall collector”die gebruik maakt van elektrostatische doekjes waarop over een periode van weken

stofdeeltjes worden opgevangen.

Ook is het zo dat de overheid momenteel de totale hoeveelheid van fijn stof bepaalt, maar nog niet genoeg

de samenstelling ervan. Dit is echter wel iets wat in de toekomst verbeterd zou moeten worden aangezien de

endotoxinecomponent toch een belangrijke rol speelt in de gezondheidseffecten van fijn stof en is het belangrijk

om hierop een zicht te krijgen in functie van de tijd. Uit een nieuwsoverzicht van het medisch milieukundig

netwerk uit Belgie blijkt dat de overheid zich er wel al van bewust is dat ook de componenten bepaald moeten

worden, echter in hoeverre dit werkelijk al werkt is nog niet duidelijk [55].

Daarnaast vragen we ons af in hoeverre de manier waarop de overheid momenteel endotoxineconcentraties bepaald,

namelijk via de LAL test, correct is. Deze test heeft namelijk te maken met enkele beperkingen die hierboven

reeds zijn aangehaald waaronder de variatie binnen de LAL enzymes en interferentie van zowel glucaan, ionen als

andere componenten. Daarenboven heeft de LAL test een kleiner bereik dan bijvoorbeelde de recombinant factor

C test. Er bestaan echter wel mogelijkheden om deze interferentie weg te werken zoals ook hierboven besproken

werd, maar bestaat er nog geen gestandaardiseerde procedure voor luchtstalen. Er zou dus volgens ons een ge-

standaardiseerde methode moeten komen, of gebruik gemaakt worden van een andere test zoals bijvoorbeeld de

recombinant factor C test.

Ook is het zo dat het van groot belang is dat de meetstations doelbewust geplaatst worden. Zo zou het in-

teressant zijn om meetpunten te plaatsen op locaties waar veel mensen komen/werken waardoor de risico’s van

endotoxines beter ingeschat kunnen worden. Ook zou het interessant zijn om op plaatsen waar geweten is dat

er een hogere endotoxineconcentratie is (bijvoorbeeld agrarisch gebied of dicht bij textielbedrijven) een meetsta-

tion te zetten om deze waarden met andere plaatsen, waar de endotoxineconcentratie normaalgezien lager is, te

vergelijken.

30

6.4.3 Fijn stof, endotoxines en sociale ongelijkheid

Verschillen in blootstelling aan fijn stof tussen bevolkingsgroepen

In heel deze paper zijn er tal van vragen beantwoord op het gebied van de effecten van blootstelling aan fijn stof

op de gezondheid. Verder meer is er ook kort ingegaan op de effecten van endotoxines. Deze studies zijn uitgegaan

van hele populaties. Daarin is er geen onderscheid gemaakt tussen verschillen binnen een populatie. Hierbij is

het interessant om te onderzoeken of er een verschil zou zijn aan blootstelling van fijn stof tussen verschillende

bevolkingsgroepen, leeftijd en sociaal economische status. Het volgende onderzoek Environmental Inequality in

Exposures to Airborne Particulate Matter Components in the United States van “Environmental health perspec-

tives” (ehp) kaart deze punten aan [56].

Lange termijn blootstelling binnen de jaren 2000-2006 werd geschat voor 215 volkstellingen. Dit werd gedaan

voor PM2.5 en voor veertien componenten van PM2.5 . Vervolgens werd de blootstelling gewogen aan de hand van

de populatie grootte om zo een totale geschatte blootstelling te genereren voor ras/etniciteit, educatie, financiele

status, werkgelegenheid, leeftijd en inkomen. De resultaten van dit experiment tonen aan dat de verschillen voor

de componenten van PM2.5 groter zijn dan voor de totale massa PM2.5 . Voor ras/etniciteit is het te zien dat de

“whites” groep de minste blootstelling vertoont. De “non-hispanic black” daarentegen had een hogere blootstelling

voor dertien van de veertien componenten va PM2.5 . Jongeren tussen 0-19 jaar hadden gelijke of hogere waarden

voor blootstelling in vergelijking met ouderen. Dit geldt wel niet voor de PM-component sulfaat. Personen met

een lagere sociaal-economische status bleken ook een hogere blootstelling te hebben.

Het besluit van deze studie is dat de blootstelling aan PM2.5 componenten verschilt voor ras/etniciteit, leeftijd

en sociaal-economische status. Daarom is het voor de hand liggend dat indien sommige van deze componenten

meer toxisch zijn dan anderen, dit natuurlijk zal resulteren in grotere gezondheidslasten.

Factoren die de blootstelling aan endotoxines bepalen

In de vorige sectie zijn de socio-economische effecten van fijn stof besproken. Vervolgens is het ook interessant

zijn om te weten wat de verschillen zijn enkel en alleen voor endotoxines. Dit is zeker van belang voor de overheid.

Bijvoorbeeld wanneer er een effectieve, gemakkelijk te incorporeren, endotoxine neutralisatietechniek zou bestaan,

is het van belang dat de overheid weet waar deze eerst ingevoerd moet worden. Zo kunnen de groepen die het

meest kwetsbaar zijn, de meeste blootstelling ondervinden, van hun risico ontdaan worden. Aangezien dit verschilt

voor elke soort component van fijn stof, zijn dergelijke studies van groot belang om een beter inschatting te kunnen

maken, zeker voor beleidsvoerders.

Het volgend onderzoeksartikel Predictors of Endotoxin Levels in U.S. Housing wil nagaan welke parameters

de endotoxineconcentratie in huisstof bepaalt. Voorgaande studies zijn meestal beperkt tot een welbepaalde

geografisch gebied, een demografische groep, een type behuizing of een specifieke plaats in huis. De onderzoekers

van dit artikel stellen de representativiteit van dergelijk onderzoek in vraag. Ze gaan er van uit dat een studie

uitgevoerd voor de eetkamer, niet direct veralgemeend kan worden voor elke plaats in huis.

Er zijn namelijk veel meer parameters die belangrijk zijn voor de endotoxineconcentratie. Zo concludeert het

artikel dat de concentratie endotoxine in huisstof afhangt van locatie in huis, regio in het land, aantal kinderen en

meer bewoners, aantal honden, lager opleidingsniveau, armoede, waargenomen voedselresten, aanwezigheid van

kakkerlakken, bewijs dat er gerookt wordt, et cetera [57].

Dit artikel kaart duidelijk ook het socio-economische verhaal aan van endotoxines. Dit is zeker van groot belang.

Door dit nieuw inzicht, dat endotoxine in huisstof veel bredere factoren beslaat, kan er effectiever ingespeeld

31

worden. De overheid kan een soort van sensibiliseringscampagne introduceren om dit probleem op te vangen. Dit

kan gebeuren door allereerst een bewustmaking te creeren van de negatieve effecten bij de bevolking. Vervolgens

kunnen er manieren aangebracht worden die de endotoxineconcentratie in huisstof verlaagt. Dit kan gebeuren

door voedselresten te verwijderen, niet te roken in huis, kakkerlakken verwijderen etc.

6.5 Ingenieur-technisch deel

Echter van toekomstige ingenieurs wordt er verwacht dat ze probleemoplossend kunnen redeneren. Door de er-

varing in het labo werden ook wij met verschillende onverwachte omstandigheden geconfronteerd. Zo kregen we

bij de LAL test te maken met verschillende problemen, waarvan het onverwacht verdwijnen van enzymes een van

de belangrijkste was (zie 6.2.3). Hierdoor konden niet alle geplande LAL testen uitgevoerd worden, waardoor

ook belangrijke resultaten ontbreken. Hoewel dit leidde tot teleurstelling en frustratie op die momenten, werd er

getracht te achterhalen waarom er zoveel enzymen verdwenen waren. Dit bracht ons tot het opstellen van een

verdampingsexperiment waarvan de resultaten toch wel opvallend waren (zoals reeds besproken bij resultaten).

Echter om volgende groepjes te waarschuwen die onder de laminaire flow moeten werken met de LAL test, werd

gezorgd dat er een nieuw en verbeterd protocol opgesteld werd. Dit protocol wordt in bijlage 3 meegegeven.

Hierin wordt duidelijk de ingenieurstechnische kant van het onderzoek belicht. Er wordt meer ingegaan op elke

stap die belangrijk is om dergelijk onderzoek efficienter en beter te kunnen uitvoeren.

Een ander voorbeeld was dat we een luchtstaal moesten nemen op een dag dat het buiten aan het vriezen was.

Normaal gezien kan er dan geen staal genomen worden omdat de buffers waarin staal wordt genomen direct

bevriest. We hebben dit probleem omzeild door het recipient in een beker met warm water onder te dompelen

terwijl er staal werd genomen.

Maar ook bij de uitgevoerde experimenten bleken niet alle resultaten aan onze hypotheses te voldoen. Zo kregen

we bij het uitvoeren van de LAL test bij het neutralisatie experimenten te maken met het feit dat de negatieve

controle (zuivere buffer) een redelijk hoge endotoxineconcentratie had t.o.v. de genomen luchtstalen. Hierdoor

werd er verondersteld dat er inhibitie was en werd er hier ook bij volgende proefopzetten rekening mee gehouden.

Zo werd er zelfs een heel inhibitie-experiment met model opgesteld om dit te verifieren. Dit is reeds besproken

bij resulaten.

Hiermee willen we aantonen dat we door het uitvoeren van dit project al onze kennis uit voorgaande vakken

konden en moesten integreren om telkens een goede proef te kunnen opzetten, uitvoeren en achteraf statistisch te

verwerken. Zo hebben we aspecten van microbiologie (hoe er wordt omgegaan met pyrogeenvrij werken), chemi-

sche analysetechnieken, katalyse, modelleren en simuleren, statistische kennis en de praktische vaardigheden uit

vorige practica allemaal moeten bundelen om dit tot een goed einde te kunnen brengen.

Daarnaast is het ingenieur-technisch ook van belang om te weten hoe we vandaag de dag de bevindingen van dit

project kunnen veralgemenen en welke mogelijke toepassingen hiermee behaald kunnen worden. Hiervoor wordt

verwezen naar de toekomstperspectieven.

32

7 Toekomstperspectieven

Zoals reeds in vorige delen aangehaald, is er nog veel onderzoek omtrent endotoxines en de methode om deze te

meten mogelijk. Denk maar aan de binding van endotoxine en fijn stof die bijvoorbeeld met de Atomic Force

Microscopie (AFM) bepaald kan worden. Dit is een techniek waarbij een tip gelabeld kan worden met specifieke

componenten. Deze tip scant vervolgens een heel oppervlak/structuur af en naargelang de interactie tussen de

tip en het substraat buigt deze tip meer of minder af. D.m.v. een laser kan de buiging bepaald worden en kan

de structuur gevisualiseerd worden. Ook zou via deze atomaire interactie (atomaire krachten) bepaald kunnen

worden hoe sterk bijvoorbeeld de binding endotoxine-PM is. Dit zou verder uitgewerkt kunnen worden in het

labo in Louvain-la-Neuve tesamen met Y. Dufrene. Hij is expert in gebied AFM in micro-organismen en binding

van celwandcomponenten op substraten/liganden. Samen met onze promoter Sarah Lebeer, werden al artikels

verwezenlijkt over de structuur van polysacharide (PS), lipoteıchoınezuren (LTA), peptidoglycaan (PG) en pili

[58, 59, 60].

Ondanks dat dit niet mogelijk was voor ons project, blijft dit zeer zeker een interessant onderzoek omdat hier nog

niets over geschreven is in de huidige literatuur. Niet alleen kan zo bepaald worden hoe deze binding chemisch

in elkaar zit en wat de bindingssterkte is, maar kan ook bepaald worden of endotoxines altijd met hetzelfde

gedeelte binden op fijn stof. Dit zou namelijk een effect kunnen hebben op het pro-inflammatoire karakter van

deze verbinding zoals reeds in de discussie vermeld. Dit pro-inflammatoire karakter zou vervolgens eventueel via

cellijnen bepaald kunnen worden.

Naast onderzoek op laboschaal is het ook belangrijk om de globale impact van endotoxine en fijn stof met

betrekking tot luchtvervuiling te bekijken. Zo zijn er al vele toepassingen omtrent fotokatalyse met TiO2 om

polluenten (voornamelijk NOx en organische componenten) te reduceren uitgevoerd. Zo werd er al in 2004-2005

een pilootproject opgesteld op de Leien (Antwerpen) waarbij 10.000 m2 fotokatalytische straatstenen werden

aangelegd om pollutie te verminderen [61]. Hierbij werd het TiO2 enkel toegevoegd in de slijtlaag van de be-

tonstraatstenen. Verschillende onderzoeken ter bepaling van de luchtzuiverende werking van fotokatalytische

materialen hebben aangetoond dat deze materialen inderdaad de concentratie aan polluenten kunnen laten ver-

minderen en hieruit bleek ook dat verticale oppervlakken beter doen dan horizontale. De duurzaamheid van deze

efficientie is ook aangetoond, zij het wel dat een regelmatige reiniging (door middel van regen) noodzakelijk is

[61]. In deze onderzoeken werd duidelijk gekeken naar NOx , bacterien en virussen, maar in hoeverre dit ook

voor het endotoxinegehalte geldt, werd niet getest. Daarom is het wel van belang dat ook in deze onderzoeken

geprobeerd moet worden om endotoxines te betrekken. Endotoxines bepalen namelijk een belangrijke component

m.b.t. de gezondheidseffecten van luchtkwaliteit.

Een ander recent voorbeeld zijn de testen voor luchtkwaliteit die uitgevoerd werden van 21 januari 2013 tot

maandag 4 februari 2013 in de Brusselse Leopold II-tunnel. Hierbij werd geprobeerd om de zuiverende effecten

van zogenaamd fotokatalytisch cement te meten. Dit proefproject, een primeur voor Belgie, wordt gevoerd door

het Europees consortium PhotoPAQ, in samenwerking met minister Brigitte Grouwels en haar administratie Mo-

biel Brussel. De resultaten van deze testen worden deze zomer verwacht, waardoor we niet weten of hier ook de

invloed van endotoxines wordt meegenomen [62].

Een kanttekening die bij al deze onderzoeken moet gemaakt worden is dat er steeds bacterien kunnen zijn die in

contact komen met dit fotokatalytisch materiaal. Hierdoor komen ook zij in aanraking met de gevormde radicalen.

Echter doordat ze beschikken over mechanismen om tegen de oxidatieve stress [63], verkregen door de radicalen,

in te gaan, kan het zijn dat er adaptatie optreedt van deze mechanismen ten aanzien van de oxidatieve stress.

Zo zou er een selectieve ontwikkeling kunnen onstaan van bacterien die steeds beter met deze stress om kunnen

gaan, en dus ook moeilijker te doden zullen zijn. Het is dus van belang hier ook rekening mee te houden op

sociaal-economisch vlak.

33

Een andere toepassing waar momenteel onderzoek naar wordt gedaan zijn speciale maskers, die componenten uit

de lucht tegen kunnen houden. Dit is een onderzoek van de Artesis hogeschool waarbij Kristof Vaes van pro-

duct ontwikkeling bezig is met de ontwikkeling van zo’n masker [64]. Wanneer deze maskers ook de endotoxines

zouden kunnen weerhouden wil dit zeggen dat mensen minder in contact gaan komen met deze pro-inflammatoire

stoffen. Dit zal dan waarschijnlijk de gezondheid bevorderen. Echter in hoeverre we alle endotoxines mogen

bannen uit onze leefwereld is niet duidelijk. Er moet namelijk ook rekening gehouden worden met de hygiene

hypothese, die stelt dat ons immuunsysteem opgeleid moet worden door bacterien en bacteriele componenten.

Het onderzoek lijkt tot nu toe te suggereren dat ook endotoxines daar een belangrijke rol in spelen.

Kortom tal van onderzoeken zijn momenteel lopende om de luchtkwaliteit te verbeteren. Zoals vermeld in het

sociaal-economische deel is het belangrijk dat zowel sociaal, politiek als economisch terrein samenwerkt. Hier is

momenteel al duidelijk te zien dat de wetenschappelijke wereld zich engageert om verandering te bieden aan de

strijd tegen luchtvervuiling. Zij zorgen voor positieve signalen die een draagvlak bieden voor de economische en

politieke wereld. Daarom is het van belang om te beseffen dat hoe erg de luchtkwaliteit er ook aan toe is, er altijd

-zoals in het project in Brussel- licht achteraan de tunnel zal zijn.

34

Nawoord

Voor de totstandkoming van deze bachelorproef, hebben we mogen rekenen op de steun en kennis van vele per-

sonen. Daarom willen we van de gelegenheid gebruik maken om al de betrokken personen te bedanken.

Allereerst willen we onze promotor Sarah Lebeer graag bedanken voor de goede begeleiding, kennis en opvol-

ging van ons project omtrent endotoxines. Ook doctoraatsstudente Serena Moretti willen we bedanken voor haar

begeleiding en hulp bij het organiseren en opstarten van de praktische proeven met de Limulus Amoebocyt Lysaat

(LAL) test. Birger Hauchecorne stond dan weer steeds paraat om ons de informatie te verlenen die nodig was

om het fotokatalytische experiment correct uit te kunnen voeren, waarvoor dank.

Daarnaast willen we graag de labo verantwoordelijken Hilde en Leen bedanken die steeds zorgde dat er voldoende

proper glaswerk is en voor het vinden van het geschikte benodigde materiaal.

Ook willen we iedereen bedanken van het cel- en gen labo voor hun begrip, en in het bijzonder de groep van Matti

Hofmans, Astrid Reymer, Chloe Cuyvers en Hans Gerstmans, omdat we steeds de laminaire flow kast mochten

gebruiken voor een volledige dag.

Echter zonder de mogelijkheid om te mogen studeren, hadden we dit ook nooit kunnen verwezenlijken. Daarom

willen we graag onze ouders bedanken voor de steun en kansen die we krijgen om volwaardige bio-ingenieurs te

worden.

35

Referenties

[1] D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman, 2008. ISBN 071677108X.

[2] URL http://bronxbohemian.wordpress.com/2008/10/02/on-a-pelham-bay-isle/img_1674/).

[3] R. Saito. Analyses and exposure assessment of bacterial endotoxin in agricultural environments. 2008.

[4] M. Fujihara, M. Muroi, et al. Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by

lipopolysaccharide: roles of the receptor complex. Pharmacol Ther, Nov 2003. 100(2):171–194.

[5] fig. URL http://en.wikibooks.org/wiki/Semiconductors/What_is_a_Semiconductor.

[6] URL http://www.elment.nl/nl/techniek/fotokatalyse.

[7] URL http://bioamerica-inc.com/v3/index.php?main_page=product_info&cPath=66_70&products_

id=215.

[8] URL http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:1999:163:0041:0060:NL:PDF.

[9] W. H. Organization et al. Who air quality guidelines for particulate matter, ozone, nitrogen dioxide and

sulfur dioxide. global update 2005, summary of risk assessment. Geneva: WHO, 2006.

[10] elabprotocol. URL http://www.elabprotocols.com/viewer/?id=234.

[11] F. Obbema. Westerse expats ontvluchten peking door luchtvervuiling, april 2013. URL

http://www.demorgen.be/dm/nl/5397/Milieu/article/detail/1607999/2013/04/03/Westerse-

expats-ontvluchten-Peking-door-luchtvervuiling.dhtml.

[12] R. F. Henderson. Clean Air Scientific Advisory Committee (CASAC) Review of the EPA Staff Recommen-

dations Concerning a Potential Thoracic Coarse PM Standard in the Review of the National Ambient Air

Quality Standards for Particulate Matter: Policy Assessment of Scientific and Technical Information (Final

PM OAQPS Staff Paper, EPA-452-R-05-005, June 2005). US Environmental Protection Agency, Office of

the Administrator, Science Advisory Board, 2005.

[13] C. Guastadisegni, F. J. Kelly, et al. Determinants of the proinflammatory action of ambient particulate

matter in immortalized murine macrophages. Environ Health Perspect, Dec 2010. 118(12):1728–1734.

[14] E. Commission et al. April 2004. Second Position Paper on Particulate Matter, 2002.

[15] C. Terzano, F. Di Stefano, et al. Air pollution ultrafine particles: toxicity beyond the lung. Eur Rev Med

Pharmacol Sci, 2010. 14(10):809–21.

[16] A. Valavanidis, K. Fiotakis, et al. Airborne particulate matter and human health: toxicological assessment

and importance of size and composition of particles for oxidative damage and carcinogenic mechanisms.

Journal of Environmental Science and Health, Part C, 2008. 26(4):339–362.

[17] URL http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/.

[18] URL http://www.vmm.be/lucht/luchtvervuilende-stoffen/fijn-stof.

[19] Slonczewski. Microbiology, An Evolving Science, Loose Leaf edition. WW Norton, 2011. ISBN 0393149560.

[20] M. B. Gorbet and M. V. Sefton. Endotoxin: the uninvited guest. Biomaterials, 2005. 26(34):6811–6817.

[21] C. Degobbi, P. H. N. Saldiva, et al. Endotoxin as modifier of particulate matter toxicity: a review of the

literature. Aerobiologia, 2011. 27(2):97–105.

36

[22] T. Sandle. Glucans and the bacterial endotoxin test, april 2011.

[23] Endotoxin detection assays. URL http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/

endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays.aspx.

[24] Lonza. Limulus amebocyte lysate test handleiding.

[25] URL http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=D194C34E-0292-3CCA-E02C-12652C4A5481.

[26] D. Heumann and T. Roger. Initial responses to endotoxins and gram-negative bacteria. Clin Chim Acta,

Sep 2002. 323(1-2):59–72.

[27] F. Backhed F.hed, L. Meijer, et al. Tlr4-dependent recognition of lipopolysaccharide by epithelial cells

requires scd14. Cell Microbiol, Aug 2002. 4(8):493–501.

[28] E. M. Pallson-McDermott and L. A. J. O’Neill. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor,

toll-like receptor-4. Immunology, Oct 2004. 113(2):153–162.

[29] T. Gutsmann, A. B. Schromm, et al. The physicochemistry of endotoxins in relation to bioactivity. Int J

Med Microbiol, Sep 2007. 297(5):341–352.

[30] V. Liebers, M. Raulf-Heimsoth, et al. Health effects due to endotoxin inhalation (review). Arch Toxicol, Apr

2008. 82(4):203–210.

[31] V. Liebers, T. Bruning, et al. Occupational endotoxin-exposure and possible health effects on humans. Am

J Ind Med, Jun 2006. 49(6):474–491.

[32] C. C. Braun-Fahrlander, C.nder, J. Riedler, et al. Environmental exposure to endotoxin and its relation to

asthma in school-age children. N Engl J Med, Sep 2002. 347(12):869–877.

[33] G. Bolte, W. Bischof, et al. Early endotoxin exposure and atopy development in infants: results of a birth

cohort study. Clin Exp Allergy, Jun 2003. 33(6):770–776.

[34] A. Simpson and F. D. Martinez. The role of lipopolysaccharide in the development of atopy in humans. Clin

Exp Allergy, Feb 2010. 40(2):209–223.

[35] A. R. Osornio-Vargas, J. Serrano, et al. In vitro biological effects of airborne pm2.5 and pm10 from a

semi-desert city on the mexico-us border. Chemosphere, Apr 2011. 83(4):618–626.

[36] A. R. Osornio-Vargas, J. C. Bonner, et al. Proinflammatory and cytotoxic effects of mexico city air pollution

particulate matter in vitro are dependent on particle size and composition. Environ Health Perspect, Aug

2003. 111(10):1289–1293.

[37] N. Manzano-Leon, R. Quintana, et al. Variation in the composition and in vitro proinflammatory effect of

urban particulate matter from different sites. J Biochem Mol Toxicol, 2013. 27(1):87–97.

[38] W. Anderson, P. Huck, et al. Endotoxin inactivation in water by using medium-pressure uv lamps. Applied

and environmental microbiology, 2003. 69(5):3002–3004.

[39] Y. Shi, H. HogenEsch, et al. Detoxification of endotoxin by aluminum hydroxide adjuvant. Vaccine, Feb

2001. 19(13-14):1747–1752.

[40] J. M. Bates, J. Akerlund, et al. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents

inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell host & microbe, 2007. 2(6):371–382.

37

[41] L. Cascales, C. Mas-Moruno, et al. Tiratricol neutralizes bacterial endotoxins and reduces lipopolysaccharide-

induced tnf-α production in the cell. Chemical Biology & Drug Design, 2008. 72(4):320–328.

[42] K. W. Kolasinski. Surface science. WILEY, 2012.

[43] K. Sunada, Y. Kikuchi, et al. Bactericidal and detoxification effects of tio2 thin film photocatalysts. Envi-

ronmental science & technology, 1998. 32(5):726–728.

[44] I. R. P. Clett Erridge, Elliott Bennett-Guerrero. Structure and function of lipopolysaccharides. Microbes

and Infection, 2002.

[45] M. Smits, F. Vanpachtenbeke, et al. Effect of operating and sampling conditions on the exhaust gas compo-

sition of small-scale power generators. PLoS One, 2012. 7(3):e32825.

[46] Guidance for industry, pyrogen and endotoxins testing: Questions and answers, June 2012. URL http://www.

fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM310098.pdf.

[47] M. RafieeTehrani and H. Khoshbooii. Inhibiting effect of various cations on endotoxin assay with the Limulus

amoebocyte lysate chromogenic substrate method. Pharmazeutische Industrie, 1996. 58(11):1042–1045.

[48] P. Duquenne, G. Marchand, et al. Measurement of endotoxins in bioaerosols at workplace: a critical review

of literature and a standardization issue. Ann Occup Hyg, Mar 2013. 57(2):137–172.

[49] URL http://www.gea-airtreatment.com/Halfgeleider-productie.217.0.html?&L=11.

[50] URL http://www.vccn.nl/default.asp?id=1027&cat=Encyclopedie.

[51] URL http://www.eea.europa.eu/themes/air/intro.

[52] M. Adams and A. Lukewille. The European environment: state and outlook 2010 Air pollution. European

Environment Agency, 2010.

[53] URL http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/index.html.

[54] dossier fijn stof: meten, Januari 2013. URL http://www.rivm.nl/Onderwerpen/Onderwerpen/F/Fijn_

stof/Meten.

[55] M. Mampaey. Veelbelovende nieuwe manier om gezondheidseffect luchtvervuiling te bepalen. URL http:

//www.medischmilieukundignetwerk.be/defaultSubsite.aspx?id=29729#.UYKf5fk25RQ.

[56] M. L. Bell and K. Ebisu. Environmental inequality in exposures to airborne particulate matter components

in the united states. Environmental health perspectives, 2012. 120(12):1699.

[57] P. S. Thorne, R. D. Cohn, et al. Predictors of endotoxin levels in us housing. Environmental health perspec-

tives, 2009. 117(5):763.

[58] P. Tripathi, A. Beaussart, et al. Adhesion and nanomechanics of pili from the probiotic lactobacillus rham-

nosus gg. ACS Nano, Apr 2013. 7(4):3685–3697.

[59] G. Francius, D. Alsteens, et al. Stretching polysaccharides on live cells using single molecule force spec-

troscopy. Nat Protoc, 2009. 4(6):939–946.

[60] G. Francius, S. Lebeer, et al. Detection, localization, and conformational analysis of single polysaccharide

molecules on live bacteria. ACS Nano, Sep 2008. 2(9):1921–1929.

[61] D. A. Beeldens. Fotokatalyse: Een toekomsttechniek? Onderzoekscentrum voor de Wegenbouw.

38

[62] Januari 2013. URL http://www.cdenv.be/actua/nieuwe-test-met-luchtzuiverend-cement-

brusselse-leopold-ii-tunnel.

[63] J. R. Elisa Cabiscol, Jordi Tamarit. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen

species (review), 1999.

[64] URL http://www.kristofvaes.be/.

[65] URL http://www.vmm.be/lucht/meetresultaten/fijn-stof.

39

Bijlagen

Bijlage 1: Overzicht van de meetwaarden voor PM10 , PM2.5 en Black Carbon jaar

en daggemiddelden.

Bijlage 1a: Overschrijdingen PM-10 EU-norm [65]. De concentratie niet hoger mag zijn dan 40

µg/m3. Te hoge concentraties worden weergegeven in het oranje en vanaf 2005 in het rood.

40

Bijlage 1b: Daggemiddelde concentraties voor PM10 op verschillende plaatsen in Belgie. De waar-

den worden weergegeven in µg/m3[65].

41

Bijlage 1c: Daggemiddelde concentraties voor PM2.5 op verschillende plaatsen in Belgie.

Bijlage 1d: Daggemiddelde concentraties voor Black Carbon (BC) op verschillende plaatsen in

Belgie. De waarden worden weergegeven in µg/m3[65].

42

Bijlage 2: Bronnen van geselecteerde luchtverontreinigende polluenten

in 2008 voor EER-32 en de landen van de Westelijke Balkan

Deze figuur geeft een overzicht van enkele luchtverontreinigende polluenten in verschillende sectoren [52].

43

Bijlage 3: Protocol Lonza voor het uitvoeren van de LAL test

44

Bijlage 4: Nieuw opgesteld protocol voor het uitvoeren van de LAL

test

45