1

SNELLE (MOLECULAIRE) SNELLE (MOLECULAIRE) DIAGNOSTIEK VAN KLEINE DIAGNOSTIEK VAN KLEINE (GEVAARLIJKE) BEESTJES(GEVAARLIJKE) BEESTJES

Dr. J. FransDr. J. FransKlinisch LaboratoriumKlinisch LaboratoriumIpodium, 15/03/2008Ipodium, 15/03/2008

van high tech tot Senseovan high tech tot Senseo

2

WAT IS SNEL IN WAT IS SNEL IN MICROBIOLOGIE? (kweek)MICROBIOLOGIE? (kweek)

VROEGER (sputumkultuur): 3 dagenMaandag: bodems maken, enten, gramkleuring

Dinsdag: aflezen primaire bodem en inzetten identificatiereeks en antibiogram

Woensdag: identificatiereeks en antibiogram aflezen; antwoorden (per brief)

NU (sputumkultuur): 1,5 dagenMaandag: bodems nemen, enten, gramkleuring

Dinsdag: aflezen primaire bodem en om 8:00u inzetten op automaat (VITEK); ‘s middags rond 15:00u zijn er al afgewerkte resultaten (online)

3

WAT IS SNEL IN MICROBIOLOGIE? (antigen)

Via snelle antigendetectie, heel wat betrouwbare diagnostiek beschikbaar op primaire staal, binnen het kwartier:

Bloed: Malaria, (Mycoplasma IGM), EBV IgG en IgM, Paul&Bunnel

Feces: Adenovirus 40-41, Clostridium toxines, Helicobacter pylori, Rotavirus, Cryptosporidium, Giardia

Naso-pharyngeale wisser: Influenza, RSV

Urine: Legionella, S. pneumoniae

Probleem: kost

4

WAAROM MOLECULAIRE?

Probleem: heel wat organismen zijn zeer moeilijk (langzaam) kweekbaar of aanvankelijk in heel kleine getallen aanwezig

Bv. Hepatitisvirussen, C. trachomatis, P. jirovecii

1983: Kary Mullis: PCR (idee tijdens nachtelijke rit langs Highway 1 na feestje)

1993 Nobelprijs chemie

http://www.virusmyth.net/aids

5

MOLECULAIRE: EXTRACTIEComplex

biologisch staal

Zuivernucleïnezuur

Elutiebuffer4.Opvangen in klein

volume

Silica

Silica2.

Binden van NZ

Staal + Lysisbuffer

Nucleïnezuur1.

Vrijkomen van NZStabilisatie

Functie:

Proteïnenen Lipiden

Wasbuffer

3.

Zuiverenverwijderen van

inhibitorenProteïnen

en Lipiden

Wasbuffer

3.

Zuiverenverwijderen van

inhibitoren

1 m

6

MOLECULAIRE: AMPLIFICATIE

7

MOLECULAIRE: DETECTIE

F

Q

0 10 20 30 40 50 60

Time (minutes)

No

rma

lize

d f

luo

res

ce

nc

e

Fluorescent signaal (real-time)

NASBA reactie20 µl

QF

QF

F

Q

8

MOLECULAIRE: VOLAUTOMATISCH?

GeneXpert Technology (Cepheid)“Sample in, Answer out”

TAT < 60 min, all inclusiveBiohazard Detection System

United States Postal ServiceAnthrax testing in mail sorting facilities

Uitbreiding Y. pestis, F. tularensis

KlinischMRSA (Imelda)

28,80 EUR reagenskostEnterovirus

67,70 EUR reagenskostTumordetectie peroperatief

http://www.cepheid.com/mrsa/video.html

9

MOLECULAIRE: SEQUENCING

Principe: Het 16 S ribosomaal RNA gen is sterk bewaardBinnen eenzelfde species en tussen species van hetzelfde genusKunnen we dit stuk amplificeren, in stukken knippen, sequentie bepalen en de uitkomst vergelijken met een “genbank”?

Nieuwe “gouden standaard” voor identificatie van bacteriën tot op species niveau

Op gegroeide kolonies bacteriënRechtstreeks op staal!!

Casus: jongedame met pleura-empyeem door S. pyogenesCasus: Histoplasma capsulatum bijnieren

Samenwerking labo VJZ-Hasselt (Dr. R. Cartuyvels): bacteriënSamenwerking labo H-Hart Roeselare (Dr. E. Delaere): fungiVoorlopig niet mogelijk voor virusdiagnostiek

10

MOLECULAIRE: MICRO-ARRAY

11

MOLECULAIRE: DAGELIJKSE PRAKTIJK

Chlamydia pneumoniae (BA, BAL, NP)Chlamydia trachomatis (O, U, W)CMV (A, B, O, U)EBV (B)Enterovirus (B, CSV, F, W)HBV (S)HCV (S)HIV (B)hMPV (NP)HPV (+mRNA) (W)HSV (BA, BAL, CSV, O, S, W)Mycobacterium tuberculosis (Sp)Mycoplasma pneumoniae (BA, BAL, NP)Norovirus (F)Parvo B19 (A)Pneumocystis jirovecii (BA, BAL)Polyomavirus (CSV, U)Toxoplasma (A, CSV, O)VZV (CSV, O, W)

A: AmniosvochtB: Bloed (EDTA)BA: BronchusaspiraatBAL: Broncho Alveolaire LavageCSV: Cerebrospinaal VochtF: FaecesNP: Nasopharyngeale wisserO: OogS: SerumbubeSp: SputumU: UrineW: WisserReeds uitgevoerd in Imelda