NIEUWE INZICHTEN IN DE GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN (NIER)AANDOENINGEN

Plaats en beperkingen van next generation sequencing

Anniek Corveleyn - CME

achondroplasia cystic fibrosis Rasopathy deafnessintellectual

disabilityLQTS

1 mutation 1 gene 10 genes 50 genes >500 genes75 genes

1 disease1 (single) mutation

1 disease1 gene

different diseases1 (single) gene

1 diseasefew genes

different diseasesmany genes

Etiology of Genetic Disorders

Classical molecular diagnosticsClinical investigationNMR scanEye investigation Array-CGH COL4A3

COL4A4COL4A5

ACTN4

Kidney biopsy

LMX1B

INF2

LAMB2

CLCN5Causal

INF2 mutation

nephropathy

Sanger sequencing

Massive parallel sequencing

Illumina PacificBiosciences

OxfordNanopore

Massive parallel sequencing (MPS)

Gene paneltarget => specific clinical diseases, limited genes

Mendeliometarget => exons of all genes for known (mono)genic diseases ~5000

Whole exometarget => coding sequences of all genes (exons) ~20.000

Whole genomecomplete genome, coding (exons) and non-coding sequences (introns)

MPS workflow: targeted capture

nephropathy genes : coding regions (exons)

NGS workflow: targeted capture

Patiënt DNA

Capture probes

hybridisation

washing steps

MPS workflow: targeted capture

Captering

Massive parallelsequencing

millions of “reads” = short readsfor selected genes

DNA of selected genes

MPS workflow: targeted capture

Mapping

Etc.

INF2

COL4A3

LMX1B

UMOD

millions of “reads” = short readsfor selected genes

Limitations of targeted captureINF2

ATG TAA

No readsfor 3’ UTR:

GAP

No readsfor introns:

GAP

No readsfor part of exon:

(fixed) GAP

Sanger sequencing

No single or multipleexon deletions

MLPA / array / better algorithms

Clinical exome = mendeliome

Nephropathy genes

WGS

SUMMARY- Limited to genes present in the panel/mendeliome

• No access to novel genes• No re-analysis in targeted panels

- Limited to exons and flanking intron regions• No deep intronic variants• No variants in promotor or UTR

- GAPS > sequencing on request / core genes- No quantitative CNV results

• MLPA / array in addition

Limitations

WES versus WGS

Mendeliome - WES WGS

+ - cheaper- interpretation- higher depth

- complete sequence (coding/non coding)- more uniform coverage of genome- longer reads > better determination of CNVs, rearrangements,…

- - enrichment steps- limited to coding regions- incomplete capture of target region- bias towards certain regions- short reads

- IT issues / storage- expensive- troughput- challenging data management and analysis

Strategy for genetic heterogeneous disorders

Numberof genes

Numberof

patientsTAT

COSTpooling coverage

SNVand/orCNV

Re-analysisresearch

SingleTrio

Etiology of Genetic disorders

one or a few genes (1-5)

PCR + Sanger sequencingLightcycler, fragment analysis,

amplicon based NGS, …

panel of genes (5-100)

targeted capture - gene panelsamplicon based NGS, mendeliome,

…

> 100 genes

mendeliome(exome)

Remgeld voor de patiënt = 8,68 Euro

achondroplasia cystic fibrosis Rasopathy deafnessintellectual

disabilityLQTS

1 mutation 1 gene 10 genes 50 genes >500 genes75 genes

Strategy for genetic heterogeneous disorders

Others:metabolic, MCA,

developmental disorders

Single Case

-Large gene

Single Case

-Gene panel

Trio-

Gene panel

Trio-

De Novo/AR

AD AR

De novo

X-linked

nephrogenetics immunogeneticsthrombogenetics

neurogeneticscardiogenetics oncogenetics

mendeliome ( exome / WGS )

capture Amplicon based

targeted panels

Others:metabolic, MCA,

developmental disorders…

Strategy for genetic heterogeneous disorders

metabolic, MCA,developmental disordersnephrogenetics immunogenetics

thrombogeneticsneurogenetics

cardiogeneticsoncogenetics

mendeliome ( exome / WGS )

capture Amplicon based

targeted panels

Others:metabolic, MCA,

developmental disorders…

Targeted panel Mendeliome WES WGS

Number of genes / variantsEase of interpretation

Diagnosis Technology Sequencer Number of genes

Numberof patients

Cardiogenetics Targeted capture Hiseq 2500 92 24/month

CDG Targeted capture Hiseq 2500 79 8/months

Rasopathy Haloplex Miseq 13 11-22/month

Hypercholesterolemia Agilent Miseq 4 120/month

NephrogeneticsPIDNeurogeneticsMCA- ID…

Mendeliome Hiseq 2500 >6200 96/month

Strategy for genetic heterogeneous disorders

Workflow in the laboratoryExtraction facility

Registration blood sample‘NGS gene panel’

DNA extraction

Molecular Diagnostics

+Manuel Classification

Discussion with our clinicalgeneticists and medical

experts

Protocol

Lab geneticist

Medical specialist Clinical geneticist

Laboratory wet work

± 2µg DNA

NGS ‘wet work’Preparation for sequencing

- Library preparation- Capture en amplification HiSeq 2500

Bio-informatics

Variant Calling File(VCF)

1. quality control: % CS1 calls2. Sample tracking: SNP check 3. Excel file with gaps

Collection of 24-48 Samples / batch

QC - VALIDATION - SOPs

Variantinterpretatie: in silico, in vivo en in vitro

NIEUWE INZICHTEN IN DE GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN (NIER)AANDOENINGEN

Koenraad Devriendt CME, Leuven

Next generation sequencing :van variant detectie

naar variant interpretatie

JuistFout

DNA sequentie patient “normale” DNA sequentieATTGTACGTGATGACCAGTGGAATACCGTAAGGTAAAGTACCGTGTACTTGGTTGGAACGTAGACTGAATGCCAACCCTGGTATTGGTGTCCCGTGTACAAGGTTAGTAATGTACCATTGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACCTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTGTGGTGCAGTACAGATACAGTACAGATTAGCAGAAATGCAGATTTAGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTG

ATTGTACGTGATGACCAGTGGAATACCGTAAGGTAAAGTACCGTGTACTTGGTTGGAACGTAGACTGAATGCCAACCCTGGTATTGGTGTCCCGTGTACAAGGTTAGTAATGTACCATTGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACTTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTGTGGTGCAGTACAGATACAGTACAGATTAGCAGAAATGCAGATTTAGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTG

FOUT ? JUIST

hoofdstukken (CNV’s): 150 verschillen

genetischeverschillen ?

A TA G CA AT T GCT G G CAT T

A TA G CA T T GCT G G CAT TC

letters (SNV’s): +/- 3 miljoen (1/1000)

gen 1gen 2gen 3

gen 1gen 2gen 3

gen 1gen 2gen 3

3 miljard nucleotiden

30.000 à 60.000 in exons400 potentieel pathogene varianten 2 - 5 ziekte-veroorzakende mutaties

Hoe het koren van het kaf scheiden ?

Wanneer is een “variant”de pathogene mutatie?

dé normale DNA sequentie bestaat nietREFERENTIE sequentie

In silico

In vivo

In vitro

benignpathogeen ??

+ verklaart de varianthet fenotype?

classificatie en interpretatie van genetische varianten

ACM

G

Pathogenic

Likelypathogenic

VOUS

Likely benign

Benign

5

4

3

2

1

CLASS

Genetische Variatie – classificatie in 5 klasses

In silico

* Normale varianten : variant is te frequent aanwezig in de normale populatie

DATABANKEN

Telenti et al. PNAS, 2016;113:11901–11906

- elk nieuw gesequeneerd genoom: gemiddeld 8,579 nieuwe varianten- elk genoom : gemiddeld 700.000 bp afwezig in het referentie genoom

Europa7,215

Africa13,539

In silico

* Gekende pathogene mutaties : beschreven bij personen met de aandoening

DATABANKEN

In silico

PREDICTIETOOLS

?

• Lading aminozuur• Bewaring aminozuur• Eiwit domeinstructuur• Effect op splicing• proteine interacties• …

In silico

14819 missensevarianten in CLINVAR

BENIGN n = 7346

PATHOGEEN n = 7473

CORRECTECONCORDANTIE ?

18/18 3/3 tools freq.

tools*

*3 frequente gebruikte tools : Polyphen, SIFT,CADD

VALSECONCORDANTIE ?

18/18 3/3 tools freq.

tools*

PREDICTIETOOLS

0,8% 18,2%

0,003% 2,1%

5,2% 46,2%

39,2% 84,9%

Ghosh et al., Genome Biology, 2017

Gouden regel :

Zo veel mogelijk klinische gegevens – nefrologische diagnose

⇒ prioritisering van welke genen geanalyseerd wordenwelk subpanel?

⇒ zo minder “vals” positieve resultaten

Beperken van aantal varianten te classificeren ?

Genomic Variation – filtering gene panels

304 genen > verschillende nefropathieën

14 subpanels gedefinieerd,⇒ prioritisering welke genen voor analyse⇒ geen incidental findings

ProteinurieCongenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract (CAKUT)NefronofthiseRenale cysten en ciliopathieën, incl. Bardet-Biedl en nefronofthise(excl. PKD1 en PKD2) Renale Cysten op volwassen leeftijd en autosomaal dominante tubulointerstitiële nierziekte (ADTKD)(excl. PKD1, PKD2, VHL, TSC1, TSC2 en MUC1)

Jong Nierfalen, CKD-YZiekte van DentElektrolytenstoornis - Renaal Fanconi syndroomHyperuricemie - uricosurieNefrocalcinosis - NefrolithiasisRenale fosfaat handlingRenale Tubulaire AcidoseRenale tubulaire dysgenesieRenale amyloïdosis

Familie onderzoek en variant interpretatie

genotype-fenotype correlaties in de familie

Klasse 3 variantvariant of unknown significance

In vivoWT/WT

WT/WT

WT/WT

WT/WT

MT/WT

+/- zeker pathogeen

de novo mutatie in een gen gelinkt aan de aandoening

bij sporadische patiënt (dwz familiaal negatief)

Maar … de novo SNPs :

* exoom : 1 à 2* genoom : +/- 60

WT = wild-type= normaal

MT = mutant

In vivo

WT/WTMT/WT

MT/WT

Segregeert met de ziektein de familie MAAR :

elke variant heeft 50% kans om overgeërfd te wordenvan de aangedane ouder

door toeval

*

*

50% 50%

WT = wild-type= normaal

MT = mutant

enkel nuttig in grote familiesmet meerdere aangedane personen

In vivoMT/WT

WT/WT

WT/WT

MT/WT

MT/WT

MT/WT

maar:- verminderde penetrantie- late onset

WT = wild-type= normaal

MT = mutant

Segregeert niet (volledig) met de aandoening in de familie

In vivo

MT/WT

WT/WT

WT/WT

MT/WT

MT/WT

> segregeert niet met de ziektein de familie

NIET de pathogene mutatie

ER MOET EEN ANDERE MUTATIE ZIJN VERMOEDELIJK IN EEN ANDER GEN

WT = wild-type= normaal

MT = mutant

GOUDEN REGEL

Variant analyse is gemakkelijker als er klinische en genetische informatie is van de familie

REEDS VOOR DE DNA TEST ! • welk overervingsmechanisme ?• parallele analyse van meerdere aangedane familieleden

vergelijking maakt analyse véél gemakkelijker

GOUDEN REGEL

Segregatie analyse is zinloos indien géén goede klinische gegevens

ZILVEREN REGEL

Segregatie analyse : vaak veel moeite voor niets …

In vitroMEESTAL RESEARCH !

SYNTHESE VAN CLASSIFICATIE ?

In silicoIn vivo

In vitro

nefroloog

klinischgeneticus

laboratoriumgeneticus patient

Expertise – teamTijd: veel hersenen-werk

I have a dream ….

genoom sequentieen

fenotype informatie

variant classificatie

artificial intelligence

ACM

GPathogenic

Likelypathogenic

VOUSLikelybenignBenign

5

4

3

2

1

CLASS

in het laboratorium rapport, actionablenaar clinicus

Genetisch rapport

NIET gerapporteerd

N v

aria

nts

> cu

ratio

n~

ACM

G

PathogenicLikely

pathogenicVOUSLikelybenignBenign

5

4

3

2

1

CLASS

Meestal ‘NIET’ gerapporteerdunclassified variants

Class 5: pathogeen > 99% Class 4: waarschijnlijk pathogeen 95 tot 99%Class 3: unclassified variant 5 - 94.9% Class 2: waarschijnlijk niet pathogeen 1-0.49%Class 1: geen functionele effecten <1%

probabiliteit

RESEARCH SEGREGATIONSoms toch

Genetisch rapport

Genetische diagnostiek Nog steeds tijdrovend en arbeidsintensief

Gouden regel :