NIEUWE INZICHTEN IN DE GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN … · DATABANKEN. In silico. PREDICTIETOOLS? •...
Transcript of NIEUWE INZICHTEN IN DE GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN … · DATABANKEN. In silico. PREDICTIETOOLS? •...
NIEUWE INZICHTEN IN DE GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN (NIER)AANDOENINGEN
Plaats en beperkingen van next generation sequencing
Anniek Corveleyn - CME
achondroplasia cystic fibrosis Rasopathy deafnessintellectual
disabilityLQTS
1 mutation 1 gene 10 genes 50 genes >500 genes75 genes
1 disease1 (single) mutation
1 disease1 gene
different diseases1 (single) gene
1 diseasefew genes
different diseasesmany genes
Etiology of Genetic Disorders
Classical molecular diagnosticsClinical investigationNMR scanEye investigation Array-CGH COL4A3
COL4A4COL4A5
ACTN4
Kidney biopsy
LMX1B
INF2
LAMB2
CLCN5Causal
INF2 mutation
nephropathy
Sanger sequencing
Massive parallel sequencing
Illumina PacificBiosciences
OxfordNanopore
Massive parallel sequencing (MPS)
Gene paneltarget => specific clinical diseases, limited genes
Mendeliometarget => exons of all genes for known (mono)genic diseases ~5000
Whole exometarget => coding sequences of all genes (exons) ~20.000
Whole genomecomplete genome, coding (exons) and non-coding sequences (introns)
MPS workflow: targeted capture
nephropathy genes : coding regions (exons)
NGS workflow: targeted capture
Patiënt DNA
Capture probes
hybridisation
washing steps
MPS workflow: targeted capture
Captering
Massive parallelsequencing
millions of “reads” = short readsfor selected genes
DNA of selected genes
MPS workflow: targeted capture
Mapping
Etc.
INF2
COL4A3
LMX1B
UMOD
millions of “reads” = short readsfor selected genes
Limitations of targeted captureINF2
ATG TAA
No readsfor 3’ UTR:
GAP
No readsfor introns:
GAP
No readsfor part of exon:
(fixed) GAP
Sanger sequencing
No single or multipleexon deletions
MLPA / array / better algorithms
Clinical exome = mendeliome
Nephropathy genes
WGS
SUMMARY- Limited to genes present in the panel/mendeliome
• No access to novel genes• No re-analysis in targeted panels
- Limited to exons and flanking intron regions• No deep intronic variants• No variants in promotor or UTR
- GAPS > sequencing on request / core genes- No quantitative CNV results
• MLPA / array in addition
Limitations
WES versus WGS
Mendeliome - WES WGS
+ - cheaper- interpretation- higher depth
- complete sequence (coding/non coding)- more uniform coverage of genome- longer reads > better determination of CNVs, rearrangements,…
- - enrichment steps- limited to coding regions- incomplete capture of target region- bias towards certain regions- short reads
- IT issues / storage- expensive- troughput- challenging data management and analysis
Strategy for genetic heterogeneous disorders
Numberof genes
Numberof
patientsTAT
COSTpooling coverage
SNVand/orCNV
Re-analysisresearch
SingleTrio
Etiology of Genetic disorders
one or a few genes (1-5)
PCR + Sanger sequencingLightcycler, fragment analysis,
amplicon based NGS, …
panel of genes (5-100)
targeted capture - gene panelsamplicon based NGS, mendeliome,
…
> 100 genes
mendeliome(exome)
Remgeld voor de patiënt = 8,68 Euro
achondroplasia cystic fibrosis Rasopathy deafnessintellectual
disabilityLQTS
1 mutation 1 gene 10 genes 50 genes >500 genes75 genes
Strategy for genetic heterogeneous disorders
Others:metabolic, MCA,
developmental disorders
Single Case
-Large gene
Single Case
-Gene panel
Trio-
Gene panel
Trio-
De Novo/AR
AD AR
De novo
X-linked
nephrogenetics immunogeneticsthrombogenetics
neurogeneticscardiogenetics oncogenetics
mendeliome ( exome / WGS )
capture Amplicon based
targeted panels
Others:metabolic, MCA,
developmental disorders…
Strategy for genetic heterogeneous disorders
metabolic, MCA,developmental disordersnephrogenetics immunogenetics
thrombogeneticsneurogenetics
cardiogeneticsoncogenetics
mendeliome ( exome / WGS )
capture Amplicon based
targeted panels
Others:metabolic, MCA,
developmental disorders…
Targeted panel Mendeliome WES WGS
Number of genes / variantsEase of interpretation
Diagnosis Technology Sequencer Number of genes
Numberof patients
Cardiogenetics Targeted capture Hiseq 2500 92 24/month
CDG Targeted capture Hiseq 2500 79 8/months
Rasopathy Haloplex Miseq 13 11-22/month
Hypercholesterolemia Agilent Miseq 4 120/month
NephrogeneticsPIDNeurogeneticsMCA- ID…
Mendeliome Hiseq 2500 >6200 96/month
Strategy for genetic heterogeneous disorders
Workflow in the laboratoryExtraction facility
Registration blood sample‘NGS gene panel’
DNA extraction
Molecular Diagnostics
+Manuel Classification
Discussion with our clinicalgeneticists and medical
experts
Protocol
Lab geneticist
Medical specialist Clinical geneticist
Laboratory wet work
± 2µg DNA
NGS ‘wet work’Preparation for sequencing
- Library preparation- Capture en amplification HiSeq 2500
Bio-informatics
Variant Calling File(VCF)
1. quality control: % CS1 calls2. Sample tracking: SNP check 3. Excel file with gaps
Collection of 24-48 Samples / batch
QC - VALIDATION - SOPs
Variantinterpretatie: in silico, in vivo en in vitro
NIEUWE INZICHTEN IN DE GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN (NIER)AANDOENINGEN
Koenraad Devriendt CME, Leuven
Next generation sequencing :van variant detectie
naar variant interpretatie
JuistFout
DNA sequentie patient “normale” DNA sequentieATTGTACGTGATGACCAGTGGAATACCGTAAGGTAAAGTACCGTGTACTTGGTTGGAACGTAGACTGAATGCCAACCCTGGTATTGGTGTCCCGTGTACAAGGTTAGTAATGTACCATTGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACCTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTGTGGTGCAGTACAGATACAGTACAGATTAGCAGAAATGCAGATTTAGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTG
ATTGTACGTGATGACCAGTGGAATACCGTAAGGTAAAGTACCGTGTACTTGGTTGGAACGTAGACTGAATGCCAACCCTGGTATTGGTGTCCCGTGTACAAGGTTAGTAATGTACCATTGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACTTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTGTGGTGCAGTACAGATACAGTACAGATTAGCAGAAATGCAGATTTAGTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTGGTAGCTAGTCAAGTCGTAGCTGTCGTGACGTAACGTATATGACACACGTCAGTACGGTCAGTACACACATGCTTCCGTAATACGTGTGGCGCGTGCGTAACACACTGACTGACCATCCTG
FOUT ? JUIST
hoofdstukken (CNV’s): 150 verschillen
genetischeverschillen ?
A TA G CA AT T GCT G G CAT T
A TA G CA T T GCT G G CAT TC
letters (SNV’s): +/- 3 miljoen (1/1000)
gen 1gen 2gen 3
gen 1gen 2gen 3
gen 1gen 2gen 3
3 miljard nucleotiden
30.000 à 60.000 in exons400 potentieel pathogene varianten 2 - 5 ziekte-veroorzakende mutaties
Hoe het koren van het kaf scheiden ?
Wanneer is een “variant”de pathogene mutatie?
dé normale DNA sequentie bestaat nietREFERENTIE sequentie
In silico
In vivo
In vitro
benignpathogeen ??
+ verklaart de varianthet fenotype?
classificatie en interpretatie van genetische varianten
ACM
G
Pathogenic
Likelypathogenic
VOUS
Likely benign
Benign
5
4
3
2
1
CLASS
Genetische Variatie – classificatie in 5 klasses
In silico
* Normale varianten : variant is te frequent aanwezig in de normale populatie
DATABANKEN
Telenti et al. PNAS, 2016;113:11901–11906
- elk nieuw gesequeneerd genoom: gemiddeld 8,579 nieuwe varianten- elk genoom : gemiddeld 700.000 bp afwezig in het referentie genoom
Europa7,215
Africa13,539
In silico
* Gekende pathogene mutaties : beschreven bij personen met de aandoening
DATABANKEN
In silico
PREDICTIETOOLS
?
• Lading aminozuur• Bewaring aminozuur• Eiwit domeinstructuur• Effect op splicing• proteine interacties• …
In silico
14819 missensevarianten in CLINVAR
BENIGN n = 7346
PATHOGEEN n = 7473
CORRECTECONCORDANTIE ?
18/18 3/3 tools freq.
tools*
*3 frequente gebruikte tools : Polyphen, SIFT,CADD
VALSECONCORDANTIE ?
18/18 3/3 tools freq.
tools*
PREDICTIETOOLS
0,8% 18,2%
0,003% 2,1%
5,2% 46,2%
39,2% 84,9%
Ghosh et al., Genome Biology, 2017
Gouden regel :
Zo veel mogelijk klinische gegevens – nefrologische diagnose
⇒ prioritisering van welke genen geanalyseerd wordenwelk subpanel?
⇒ zo minder “vals” positieve resultaten
Beperken van aantal varianten te classificeren ?
Genomic Variation – filtering gene panels
304 genen > verschillende nefropathieën
14 subpanels gedefinieerd,⇒ prioritisering welke genen voor analyse⇒ geen incidental findings
ProteinurieCongenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract (CAKUT)NefronofthiseRenale cysten en ciliopathieën, incl. Bardet-Biedl en nefronofthise(excl. PKD1 en PKD2) Renale Cysten op volwassen leeftijd en autosomaal dominante tubulointerstitiële nierziekte (ADTKD)(excl. PKD1, PKD2, VHL, TSC1, TSC2 en MUC1)
Jong Nierfalen, CKD-YZiekte van DentElektrolytenstoornis - Renaal Fanconi syndroomHyperuricemie - uricosurieNefrocalcinosis - NefrolithiasisRenale fosfaat handlingRenale Tubulaire AcidoseRenale tubulaire dysgenesieRenale amyloïdosis
Familie onderzoek en variant interpretatie
genotype-fenotype correlaties in de familie
Klasse 3 variantvariant of unknown significance
In vivoWT/WT
WT/WT
WT/WT
WT/WT
MT/WT
+/- zeker pathogeen
de novo mutatie in een gen gelinkt aan de aandoening
bij sporadische patiënt (dwz familiaal negatief)
Maar … de novo SNPs :
* exoom : 1 à 2* genoom : +/- 60
WT = wild-type= normaal
MT = mutant
In vivo
WT/WTMT/WT
MT/WT
Segregeert met de ziektein de familie MAAR :
elke variant heeft 50% kans om overgeërfd te wordenvan de aangedane ouder
door toeval
*
*
50% 50%
WT = wild-type= normaal
MT = mutant
enkel nuttig in grote familiesmet meerdere aangedane personen
In vivoMT/WT
WT/WT
WT/WT
MT/WT
MT/WT
MT/WT
maar:- verminderde penetrantie- late onset
WT = wild-type= normaal
MT = mutant
Segregeert niet (volledig) met de aandoening in de familie
In vivo
MT/WT
WT/WT
WT/WT
MT/WT
MT/WT
> segregeert niet met de ziektein de familie
NIET de pathogene mutatie
ER MOET EEN ANDERE MUTATIE ZIJN VERMOEDELIJK IN EEN ANDER GEN
WT = wild-type= normaal
MT = mutant
GOUDEN REGEL
Variant analyse is gemakkelijker als er klinische en genetische informatie is van de familie
REEDS VOOR DE DNA TEST ! • welk overervingsmechanisme ?• parallele analyse van meerdere aangedane familieleden
vergelijking maakt analyse véél gemakkelijker
GOUDEN REGEL
Segregatie analyse is zinloos indien géén goede klinische gegevens
ZILVEREN REGEL
Segregatie analyse : vaak veel moeite voor niets …
SYNTHESE VAN CLASSIFICATIE ?
In silicoIn vivo
In vitro
nefroloog
klinischgeneticus
laboratoriumgeneticus patient
Expertise – teamTijd: veel hersenen-werk
I have a dream ….
genoom sequentieen
fenotype informatie
variant classificatie
artificial intelligence
ACM
GPathogenic
Likelypathogenic
VOUSLikelybenignBenign
5
4
3
2
1
CLASS
in het laboratorium rapport, actionablenaar clinicus
Genetisch rapport
NIET gerapporteerd
N v
aria
nts
> cu
ratio
n~
ACM
G
PathogenicLikely
pathogenicVOUSLikelybenignBenign
5
4
3
2
1
CLASS
Meestal ‘NIET’ gerapporteerdunclassified variants
Class 5: pathogeen > 99% Class 4: waarschijnlijk pathogeen 95 tot 99%Class 3: unclassified variant 5 - 94.9% Class 2: waarschijnlijk niet pathogeen 1-0.49%Class 1: geen functionele effecten <1%
probabiliteit
RESEARCH SEGREGATIONSoms toch
Genetisch rapport
Genetische diagnostiek Nog steeds tijdrovend en arbeidsintensief
Gouden regel :