Post on 23-Aug-2020
Microscopische beeldvorming in biofysisch en biomedisch onderzoek
23.01.2012 M. Ameloot
Interactieve websites
• http://www.olympusmicro.com/index.html
• http://www.microscopyu.com/index.html
• http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html
De microscoop
objectief
oculair
preparaat
De microscoop
De microscoop
Vergroting microscoop
ocobjtot MMM
totM ?
Elektrisch veld l
Licht is een elektromagnetische golf
l golflengte
l
c = lichtsnelheid (=lf)
Animatie: elektromagnetische golf
http://www.walter-fendt.de/ph14e/emwave.htm
Situering golflengten elektromagnetische straling
l
1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm
Afstand
Rood licht
Blauw licht
l
l l
Golfkarakter van het licht
?
l
• http://www.olympusmicro.com/primer/java/diffraction/index.html
Diffractie
Diffractie
Diffractie
d sinq = l
(1e min)
Diffractie ronde opening
d sinq = 1,22 l
(1e min)
d = diameter opening
q
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/imageformation/airydiskbasics/index.html
Diffractiepatronen naburige punten
Diffractie: Rayleigh criterium
Criterium van Rayleigh
Numerieke apertuur
Resolutie d
ld
sin
61,0
n
E. Abbe 1873
2
ld
Resolutie en openingshoek
? Preparaat
Diffractie: conclusies
1. Geometrische optica: punt punt. 2. Golfkarakter van licht:punt vlekje. 3. Opening van het objectief , breedte vlekje. 4. Breedte vlekje , afstand tussen 2 naburige punten om
afzonderlijk te worden waargenomen. 5. Resolutie mede bepaald door golflengte invallend licht
Fundamentele beperking
Diffractielimiet
ld
sin
61,0
n
2
ld
Resolutie versus grootte-orde afmetingen
Dikte hoofdhaar: 0,1 mm = 100 000 nm Diameter RBC: 0,008 mm= 8000 nm HIV virus: 90 nm Dikte biologisch membraan: 5 nm
2
ld nm300250 d
1 nm = 1 miljoenste deel van 1 mm
Optische microscopie versus elektronenmicroscopie
2
ld
1. Elektronenbundel golflengte. 2. Snelheid elektronen golflengte 3. Diffractielimiet evenzeer geldig. 4. Resolutie 0,5 nm. 5. Dunne preparaten vereist. 6. Omgeving niet biologisch vriendelijk.
Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, …?
Celbiologische toepassing
Fluorescentie
FITC Fluorescein-5-isothiocyanaat
Fluorescentie-microscopie
Verschillende fluorescente labels
Detectie van specifieke structuren en moleculen in cellen, weefsels, …
Specifieke fluorescerende merkers
Celbiologische toepassing
Confocale fluorescentiemicroscopie
Scanning galvanometers
x y
Laser in
Laser out
Point Scanning
To
Microscope
X
Y
Sequentially illuminated
sample
Sequentially generated
image
Scanning process
http://www.olympusconfocal.com/java/confocalvswidefield/index.html
Vergelijking widefield en confocale microscopie
XZ
Y
Optical slicing
3D reconstructie
Optische secties
Mitochondria gemerkt met Mitotracker Green
MDCK cellen
A
B
C
onder metabolische inhibitie
Mitochondriale calcium concentratie
• Combinatie van twee fluorescente probes:
Mito Tracker
Green
(200 nM)
1
Calcium probe: Rhod2
Rhod2
(4 mM)
2
MTG masker voor selectie Rhod2mito
X
Binair MTG masker Rhod2 beeld
=
Rhod2mito
MTG beeld
Kleinere afstanden via fluorescentie?
47
Door gebruik te maken:
- twee fluorescerende moleculen
- Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
A A D
Excitatie
Donor fluorescentie Acceptor
fluorescentie
kT
FRET principe
FD FDA
FA
Stralingsloze
koppeling !!!
48
Bij langere golflengte dan voor de donor
D
DA
F
FE 1
D
DA
F
FE 1
1 Å = 0.1 nm
49
50
Spectroscopische meetlat
Ro=30 Å
Ro=50 Å
Ro=70 Å
6
0
66
0
6
0
)(1
1
R
RRR
RE
D
DA
F
FE 1
1 Å = 0.1 nm
Toepassingen FRET
52
Nature Reviews / Molecular Cell Biology
Cyan FP & Yellow FP
53
R0 = 48 Å = 4,8 nm
Cyan FP & Yellow FP
R0 = 48 Å = 4,8 nm
FRET en membraanpotentiaal
55
depolarizatie tot +60 mV
Amelie Perron, Hiroki Mutoh, Walther Akemann, Sunita Ghimire Gautam, Dimitar Dimitrov, Yuka Iwamoto and Thomas Knöpfel
Acceptor
Donor
FRET: indirecte wijze voor afstanden kleiner dan de diffractielimiet
Zijn directe waarnemingen van afstanden kleiner dan de diffractielimiet mogelijk?
Diffractielimiet
Diffractielimiet
Abbe: diffractielimiet 250 - 300 nm
1-molecule detectie Dichtheid gelabelde moleculen voldoende klein!
20 nm
Beweging in membraan
Eiwitten in lipidendubbellaag
SMT = single molecule tracking
Marguet EMBO 2006
Schmidt PNAS 1996
SMT = single molecule tracking
SMT = single molecule tracking
SMT = single molecule tracking
Van microscopie naar nanoscopie: structuren met sub-micro resolutie?
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/stochasticblinking/index.html
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/storm/index.html
Hot topic!
HA-GlyR α3K HA-GlyR α3L
Glycinereceptor
2,5 µm 2,5 µm
Labelvrije metingen mogelijk?
1.Dikkere preparaten moeilijk aan te kleuren. 2.Beïnvloeding door fluorofoor? (stamcellen). 3.In situ? 4.Hogere penetratiediepte. 5.Optische coupes voor 3D reconstructie. 6.Gebruik in vivo (patiënten) 7.Hot topic!
SHG straling (tweede harmonische)
Rayleigh scattering
Hyper-Rayleigh scattering
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
SHG straling: 2 moleculen
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
Constructieve interferentie
Destructieve interferentie
SHG stralingspatroon
Mertz in Handbook of Biomedical nonlinear optical microscopy, ed. Masters, So. 2008
Coherente verstrooiing Vermogen ~ N2
Niet-coherente verstrooiing Vermogen ~ N
– fs-gepulste lasers
– Laser scanning
– Beeldvorming in weefsel (“diepe” indringing)
– Optische coupes
Ultrasnelle lasers
Sarcomeer
Sarcomeer
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
In vivo measurement of sarcomeres
Z-disc mitochondria
TPEF SHG
Myosin
10 mm 10 mm
10 mm
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
1 cm
1000 um 500 um 350 um 1 cm
In vivo bepaling van sarcomeren
25 mm
Micro-endoscoop
Llewellyn et al Nature. 2008 August 7; 454(7205): 784–788.
In vivo measurement of sarcomeres
lateral gastrocnemius (mouse)
Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)
Gestreepte spier (rat)
Gestreepte spier (rat)
Courtesy of Rik Paesen (UHasselt)
1. Vroegtijdige detectie van veranderingen in de extracellulaire matrix bij kwaadaardig gezwel: veranderingen in collageen veranderingen in SHG. 2. Veranderingen in metabolisme veranderingen in autofluorescentie.
Labelvrije micro-endoscopie
Beeldvorming met SHG
Striated muscle Starch
Flax
(Sanen & Paesen)
Rat Tail Tendon Neurons
Cellulose
Cell-matrix interacties (tissue engineering) Staal van Dennis Lambrechts, Prometheus, KUL
hPDC & Col I hydrogel (label vrij)
10 mm
Erkenning
Universiteit Hasselt
Prof. Dr. M. Ameloot
Dr. N. Smisdom
Drs. K. Notelaers
Drs. Ir. B. De Clercq
Drs. Ir. R. Paesen
Dra. K. Saenen
Dra. M. Bacalum
Prof. Dr. JM. Rigo
Dr. Daniel Janssen
Katholieke Universiteit Leuven
Prof. Dr. J. Hofkens
Dra. Susana Rocha
Prof. Dr. M. Roeffaers
Prof. Dr. H. Van Oosterwyck
Drs. D. Lambrechts
Prof. Dr. D. Devos
Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin Prof. Dr. J.C. Meier