keerpuntenin de natuurwetenschappen

hoe ontdekken we hoe Leven

werkt...?

roel van drielSwammerdam Inst.

voor LevenswetenschappenUniversiteit van Amsterdam

keerpunten 5-04 #2

is d

it iets

anders

…?

elementaire deeltjes

atomen, moleculen

zonnestelsels

sterrenstelsels

big bang

evolutie

aarde, ecologie

keerpunten 5-04 #3

hoe g

aan w

e

begri

jpen h

oe

het

werk

t…?

elementaire deeltjes

atomen, moleculen

zonnestelsels

sterrenstelsels

big bang

evolutie

aarde, ecologie

keerpunten 5-04 #4

de levende cel

keerpunten 5-04 #5

de levende cel

keerpunten 5-04 #6

de levende cel

keerpunten 5-04 #7

genetische informatie:de basis

een gen bevat de informatie voor de aminozuur-volgorde van een eiwit• aminozuurvolgorde

bepaalt de opvouwing van het eiwit

• opvouwing van het eiwit bepaalt de functie

dus: een gen codeert voor een functie in de cel

DNA

eiwit

functiein de cel

keerpunten 5-04 #8

de DNA taal

genetische code is simpele taal met slechts vier letters• A, T, G, C

keerpunten 5-04 #9

eiwitten kunnen bijna alles

elk gen bevat de informatie voor één bepaald eiwit

keerpunten 5-04 #10

wat maakt eiwitten zo bijzonder

elk eiwit is lange onvertakte keten van aminozuren• 20 verschillende

aminozuren heel breed scala van

functies specificiteit

• heel precies herkennen, binden en chemisch veranderen van andere moleculen

keerpunten 5-04 #11

eiwitten en genen werken samen in netwerken netwerken van

samenwerkende componenten in de cel• eiwitten en enzymen• genen

speciale systeem- eigenschappen geselecteerd tijdens evolutie• robuustheid• efficientie• aanpassen aan

omgeving ‘leven’ is een netwerk

van chemische en fysische netwerken

keerpunten 5-04 #12

eiwitten en genen: samenspel is alles...!

genen in DNA coderen voor eiwitten

eiwitten bepalen de eigenschappen van de cel

eiwitten zetten genen aan en uit• die genen coderen weer

voor weer voor eiwitten• die eiwitten geven weer

nieuwe eigenschappen aan een cel

• eiwitten zetten genen aan en uit

DNA

eiwit

functiein de cel

keerpunten 5-04 #13

de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag

kijken naar moleculen in de levende cel

gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen

keerpunten 5-04 #14

- GFP is een eiwit met ~225 aminozuren van de kwal Aequorea victoria

- gen dat codeert voor GFP is gecloneerd

zichtbaar maken van eiwitten in de levende cel met de hulp van een kwal...green fluorescent protein (GFP)

keerpunten 5-04 #15

GFP fusie-eiwittenextreem handig

koppel eiwit waarin je geinteresseerd bent aan GFP eiwit

je eiwit wordt dan lichtgevend

danzichtbaar in microscoop

keerpunten 5-04 #16

GFP-fusie eiwit

uitvoerbaar voor elk eiwit

gen voor GFP eiwit gen voor histon eiwit

gen voor GFP-histon fusie eiwit

+

keerpunten 5-04 #17

bijvoorbeeld: zichtbaar maken van het menselijk genoom in de levende cel

DNA verpakkings-eiwit koppelen aan GFP• GFP-histon H2B

gen dat codeert voor dit eiwit in cel brengen

cel maakt het juiste GFP-gekoppelde eiwit

keerpunten 5-04 #18

preparaat bestralen in microscoop met blauw licht

GFP absorbeert blauw licht

GFP zendt groen licht uit

GFP is een fluorescerend eiwit:zichtbaar maken in een fluorescentie-microscoop

keerpunten 5-04 #19

fluorescentie microscopie voor 3-dimensionale beelden

microscoop

keerpunten 5-04 #20

menselijk genoom in levende cel zichtbaar gemaakt

keerpunten 5-04 #21

een andere toepassing van GFP fusie eiwitten

hoe overleef ik mijn zonnebank, of een dagje aan

het strand…?

keerpunten 5-04 #22

zonlicht bevat UV

DNA schade na een uurtje in de zon of op de zonnebank door UV licht• vele duizenden DNA

beschadigingen in elke huidcel...!

toch maar kleine kans op bijv. kanker

we hebben heel efficiënte systemen om DNA schade te repareren

keerpunten 5-04 #23

pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct

cyclobutane pyrimidine dimer

ultraviolet licht induceert chemische reacties in DNA

DNA beschadiginggeeft mutaties

stukje onbeschadigd DNA

keerpunten 5-04 #24

mutaties

mutatie is verandering van nucleotiden-volgorde in DNA• resulteert in andere

aminozuurvolgorde van eiwit waarvoor gen codeert

• meestal verlies van functie van eiwit

• meestal verlies van eigenschap van cel

mutaties kunnen ziekten veroorzaken• bijvoorbeeld kanker

X

X

X

keerpunten 5-04 #25

DNA reparatie systeem

verschillende DNA reparatie-eiwitten binden aan beschadigd DNA• samen repareren ze

de DNA schade onderzoek hoe dit

werkt in de levende cel

laat cel GFP-repair fusie-eiwitten maken

keerpunten 5-04 #26

onderzoek naar hoe DNA reparatie werkt

maak één van de reparatie eiwitten fluorescent mbv GFP• zichtbaar mbv

microscoop in celkern celkern lokaal

bestralen met UV licht• in rode cirkel• lichtgevende

reparatie-eiwit bindt aan het beschadigde DNA

• hopen zich op in beschadigd gebied

keerpunten 5-04 #27

een zonnebank voor cellen in een microscoop

glaasje metlevende cellen

masker met kleine gaatjes(1/200 mm)

cel met lokale DNA schade

keerpunten 5-04 #28

masker met heel kleine gaatjes in de microscoop

masker

gaatjes van 5 micrometer(1/200 millimeter)

keerpunten 5-04 #29

masker bovenop laagje levende cellenmasker

keerpunten 5-04 #30

fluorescerende GFP-reparatie eiwit in cel

masker

filter bovenop laagje levende cellen

keerpunten 5-04 #31

precies meten hoe het reparatie- eiwit aan beschadigd DNA bindt

ERCC1-GFP accumulation at UV damage

0

50

100

0 100 200 300

Time (s)

Inte

ns

ity

37 C

keerpunten 5-04 #32

XPB-EGFP accumulation at UV damage

-5

0

5

10

15

20

25

0 200 400 600 800 1000 1200

Time (sec)

% a

ccu

mu

lati

on

in

sp

ot

37 C27 C

ERCC1-GFP accumulation at UV damage

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 100 200 300 400 500 600

Time (s)

% a

ccu

mu

lati

on

in s

po

t

27 C

37 C

zelfde metingen voor verschillende reparatie eiwitten

keerpunten 5-04 #33

resultaten samenbrengen in een computermodel

expe

rim

ente

ncom

pute

r m

odel

len

keerpunten 5-04 #34

kijken naar moleculen in de levende cel

gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen

de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag

keerpunten 5-04 #35

gentherapie made simpel

gen eiwit functie• mutatie defect gen

defect eiwit verlies functie

concept van gentherapie is simpel• DNA in cel brengen met

goed-functionerend gen• defect gerepareerd...!

DNA

eiwit

functiein de cel

keerpunten 5-04 #36

boodschappenlijst gentherapie

gen vinden bij specifieke ziekte

kloneren van dat gen geschikte vector om gen

in de cel te brengen target cellen

identificeren target cellen bereiken

met vector ingebrachte gen stabiel

in cel integreren ingebrachte gen stabiel

tot expressie brengen

keerpunten 5-04 #37

problemen en denkbare oplossingen…?

hoe breng je het gen in de juiste cel…?• selectief of alle cellen die bereikt

worden...? genetisch veranderen buiten

het lichaam...?• haal te veranderen cellen uit het

lichaam en breng nieuw gen in• plaats de veranderde cellen

terug in lichaam gebruik van stamcellen...?

• genetisch veranderen en dan terugplaatsen in lichaam

• bijv. stamcellen in beenmerg voor alle bloedcellen

keerpunten 5-04 #38

waar richt gentherapie zich op clinical trials

kanker-therapie is favoriet

keerpunten 5-04 #39

het succesverhaal van SCID

ADA gentherapie• defect gen voor enzym

adenosine deaminase (ADA)• severe combined immune

deficiency (SCID) syndroom• eerste klinische testen in

1990 ander SCID syndroom

(SCID-X1)• succesvolle gentherapie

sinds 2000 17 van 18 SCID patiënten

na gentherapie goede expressie van ingebracht gen• zeer succesvol• maar...!

keerpunten 5-04 #40

bloed-stamcellen isoleren uit beenmerg

buiten het lichaam het gen inbrengen

overgebleven beenmergcellen in lichaam doden

genetisch veranderde cellen in bloedbaan • nestelen zich in

beenmerg• produceren

genetisch veranderde bloedcellen

gentherapie voor SCID

keerpunten 5-04 #41

2002: gentherapie veroorzaakt leukemie in twee patiënten• SCID-X1 gentherapie bij 3

jonge kinderen• na 3 jaar krijgen 2

kinderen leukemie• door toeval(??) insertie

van ingebrachte gen in een oncogen

• totale verrassing• FDA verbiedt SCID-X1

gentherapie tenzij er geen enkele andere optie is

• moeilijke keuzes, etisch probleem

wat genetisch mis kan gaan bij gentherapie

X

X

keerpunten 5-04 #42

problemen en oplossingen…?

meeste virussen integreren hun DNA in genrijke gebieden in genoom• risico...!

sturen van transgen in DNA• maar hoe...?

denkbaar alternatief• ingebrachte gen niet laten

integreren in DNA van cel• DNA van sommige virussen

blijft als los stukje DNA in de celkern (episoom)

• repliceert gelijktijdig met cel DNA tijdens celdeling

X

X?

keerpunten 5-04 #43

hoe wordt het DNAin de cel gebracht...?

meestal m.b.v. virus

keerpunten 5-04 #44

virussen vaak gebruikt om DNA binnen te brengen bij gentherapie

Thomas et al., 2003

keerpunten 5-04 #45

gentherapie met adenovirus is efficientmaar sterke afweerreacties

veel succesvol genetisch veranderde cellen in lever m.b.v. adenovirus

heel veel cellen van afweersysteem infiltreren lever

leverweefsel

keerpunten 5-04 #46

wat immunologisch mis kan gaan bij gentherapie

1999: adenovirus vector veroorzaakt dood van patiënt• vrijwilliger Jesse Gelsinger,

18 jaar, Philadelphia• leed aan milde vorm

ornithine decarboxylase deficientie

– productie van giftig NH3

• hyper immuunreactie op ingespoten adenovirus (zeldzaam...!!)

– na 4 dagen overleden

• injectie van grote hoeveelheid (inactieve) virusdeeltjes nu onveilig geacht door FDA

keerpunten 5-04 #47

toekomst van gentherapie

onderzoek gaat onvermoeibaar verder...!

2004

keerpunten 5-04 #48

kijken naar moleculen in de levende cel

gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen

de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag

keerpunten 5-04 #49

een droom-experiment

in één enkel experiment bij een cel vaststellen welke genen wel en welke genen niet aan staan• mens: 35.000 genen

het is mogelijk...! DNA micro-arrays

• DNA chips

keerpunten 5-04 #50

hoe meet je de activiteit van een gen...?

alleen genen die aan staan produceren RNA

hoe meer RNA hoe groter de aktiviteit van een gen

RNA van gen 1

RNA van gen 2

RNA van gen 3

keerpunten 5-04 #51

genexpressie meten aan de hand van RNA concentratie in de cel

celtype 1 celtype 2

vier mogelijkheden• genen even actief in beide

celtypen• genen aktiever in één van de

celtypes• genen actief in slechts één

celtype• genen inactief in beide celtypen

keerpunten 5-04 #52

duizenden spotjes op aan glaasje

elk spotje heeft stukjes DNA van een specifiek gen

35.000 spotjes genoeg voor alle menselijke genen• in principe...

componenten van de DNA microarray technologie

123456

A B C D E F

keerpunten 5-04 #53

123456

A B C D E F

microarray technologie

****

*** *

referentie cellen te analyseren cellen

isoleer RNA en maakhet fluorescerend GROEN

isoleer RNA en maakhet fluorescerend ROOD

* ** **

*

keerpunten 5-04 #54

123456

A B C D E F

microarray technologie

****

*** *

referentie cellen te analyseren cellen

* ** **

*

keerpunten 5-04 #55

123456

A B C D E F

****

*** *

* ** **

** *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #56

123456

A B C D E F

*** *

**** * *

* ***

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #57

123456

A B C D E F

*** *

* **

*** * ***

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #58

123456

A B C D E F

*** *

* **

*** * ***

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

specifieke binding van alleen de juiste nucleotiden volgorde via dubbelstrengs DNA: A-T en G-C...!

keerpunten 5-04 #59

123456

A B C D E F

* **

*** * ***

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

alleen RNA van referentie cellen: dus spot is GROEN

keerpunten 5-04 #60

123456

A B C D E F

* ** **

****

** *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #61

123456

A B C D E F

* **

***

***

*

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #62

123456

A B C D E F

* **

***

***

*

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #63

123456

A B C D E F

* **

**** *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

alleen RNA van te analyseren cellen: dus spot is ROOD

keerpunten 5-04 #64

123456

A B C D E F

** * **

* * *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #65

123456

A B C D E F

**

* *

**

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #66

123456

A B C D E F

**

**

* *

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #67

123456

A B C D E F

**

** * *

* *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

keerpunten 5-04 #68

123456

A B C D E F

*** *

microarray technologie

referentie cellen te analyseren cellen

RNA van referentie cellen en van te analyseren cellen: GROEN plus ROOD is GEEL

keerpunten 5-04 #69

verband genexpressie enfluorescentiesignaal

A B C D E F G

123456

celtype 1 celtype 2

Genexpressie

gen 1F - ++++

gen 3E ++++ ++++

gen 5C ++++ -

gen 5B - -

-

++

++

-

keerpunten 5-04 #70

microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis

keerpunten 5-04 #71

microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis

keerpunten 5-04 #72

DNA microarray om genen te vinden in relatie tot een ziekte

spotjes meten

data extractie + analyseidentificatie van genen met andere activiteit bij

ziekte

binden aan microarray

microarraygezond

ziek isolatie en

labelling

isolatie en

labelling

keerpunten 5-04 #73

voorbeerd toepassing microarray voor diagnostiek van borstkanker door NKI

tijd (jaren)

overl

even

den ~30% patiënten overlijdt

aan borstkanker binnen 10 jaar

~70% overleeft 10 jaar of meer

traditionele diagnostiek

iedereen krijgt chemotherapie...!

keerpunten 5-04 #74

analyse van 78 humane borsttumoren

34 metastase-positief binnen 5 jaar• slechte

prognose 44 metastase-

negatief gedurende 5 jaar• goede prognose

identificatie van genen waarvan de activiteit verandert bij borstkanker

tijd (jaren)

overl

even

den

keerpunten 5-04 #75

analyse borstkanker microarrays

78 borsttumoren geanalyseerd 34 ‘slecht’

vergeleken met 44 ‘goed’

microarray met 24.000 genen

5.000 genen vertoonde veranderde expressie in tumoren• verschillende

klassen borsttumoren...!

keerpunten 5-04 #76

70 genen geïdentificeerd die verloop van het ziekte goed kunnen voorspellen

70 geselecteerde genen

78 t

um

ore

n goede prognose

slechte prognose

rangorde

metastases

(wit =

+)

keerpunten 5-04 #77

microarray classificatie vs. NIH classificatie

classificatie van 158 borstkanker-tumoren

minder onnodige chemo-therapie

identificatie van genen die een rol spelen bij borstkanker

klassieke NIH classificatie

59%

74%

5 % laag risico95 % hoog risico

96%

50%

classificatie op basis van microarray

39 % laag risico61 % hoog profiel

keerpunten 5-04 #78

kijken naar moleculen in de levende cel

gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen

de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag

keerpunten 5-04 #79

PCR: een brilliant idee

polymerase chain reaction• PCR

brain wave van Kary Willis• nobelprijs 1997

uit een heel klein beetje DNA veel DNA maken• precieze kopie

extreem belangrijk in onderzoek • bijv. microarray analyse• bijv. forensisch

onderzoek

Kary Mullisnobelprijs 1997

keerpunten 5-04 #80

PCR: een simpele truc

amplificeren van een specifiek deel van het DNA

maak twee korte stukjes DNA met zelfde nucleotiden-volgorde als aan beide kanten van te amplificeren stuk DNA• twee primers

het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd

techniek om stukken DNA te scheiden op basis van verschil in grootte

keerpunten 5-04 #81

PCR: een simpele truc

amplificeren van een specifiek deel van het DNA

maak twee korte stukjes DNA met zelfde nucleotiden-volgorde als aan beide kanten van te amplificeren stuk DNA• twee primers

het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd

techniek om stukken DNA te scheiden op basis van verschil in grootte

keerpunten 5-04 #82

PCR is efficiente methode om DNA van verschillende individuen te onderscheiden

DNA van verschillende personen verschilt op veel plaatsen in genoom

ook vaak verschil tussen beide homologe chromosomen in een individu

verschillen worden doorgegeven aan nakomelingen

keerpunten 5-04 #83

over PCR

PCR cartoon

PCR in juridisch onderzoek

keerpunten 5-04 #84

hoe g

aan w

e

begri

jpen h

oe

het

werk

t…?

elementaire deeltjes

atomen, moleculen

zonnestelsels

sterrenstelsels

big bang

evolutie

aarde, ecologie

keerpunten 5-04 #85

is d

it iets

anders

…?

elementaire deeltjes

atomen, moleculen

zonnestelsels

sterrenstelsels

big bang

evolutie

aarde, ecologie

ja en nee

zelfde natuurwette

n,

maar

speciale soorten

moleculen, die

samenwerken in

netwerken