Keerpunten in de natuurwetenschappen hoe ontdekken we hoe Leven werkt...? roel van driel Swammerdam...
-
Upload
veerle-hendrickx -
Category
Documents
-
view
216 -
download
3
Transcript of Keerpunten in de natuurwetenschappen hoe ontdekken we hoe Leven werkt...? roel van driel Swammerdam...
keerpuntenin de natuurwetenschappen
hoe ontdekken we hoe Leven
werkt...?
roel van drielSwammerdam Inst.
voor LevenswetenschappenUniversiteit van Amsterdam
keerpunten 5-04 #2
is d
it iets
anders
…?
elementaire deeltjes
atomen, moleculen
zonnestelsels
sterrenstelsels
big bang
evolutie
aarde, ecologie
keerpunten 5-04 #3
hoe g
aan w
e
begri
jpen h
oe
het
werk
t…?
elementaire deeltjes
atomen, moleculen
zonnestelsels
sterrenstelsels
big bang
evolutie
aarde, ecologie
keerpunten 5-04 #4
de levende cel
keerpunten 5-04 #5
de levende cel
keerpunten 5-04 #6
de levende cel
keerpunten 5-04 #7
genetische informatie:de basis
een gen bevat de informatie voor de aminozuur-volgorde van een eiwit• aminozuurvolgorde
bepaalt de opvouwing van het eiwit
• opvouwing van het eiwit bepaalt de functie
dus: een gen codeert voor een functie in de cel
DNA
eiwit
functiein de cel
keerpunten 5-04 #8
de DNA taal
genetische code is simpele taal met slechts vier letters• A, T, G, C
keerpunten 5-04 #9
eiwitten kunnen bijna alles
elk gen bevat de informatie voor één bepaald eiwit
keerpunten 5-04 #10
wat maakt eiwitten zo bijzonder
elk eiwit is lange onvertakte keten van aminozuren• 20 verschillende
aminozuren heel breed scala van
functies specificiteit
• heel precies herkennen, binden en chemisch veranderen van andere moleculen
keerpunten 5-04 #11
eiwitten en genen werken samen in netwerken netwerken van
samenwerkende componenten in de cel• eiwitten en enzymen• genen
speciale systeem- eigenschappen geselecteerd tijdens evolutie• robuustheid• efficientie• aanpassen aan
omgeving ‘leven’ is een netwerk
van chemische en fysische netwerken
keerpunten 5-04 #12
eiwitten en genen: samenspel is alles...!
genen in DNA coderen voor eiwitten
eiwitten bepalen de eigenschappen van de cel
eiwitten zetten genen aan en uit• die genen coderen weer
voor weer voor eiwitten• die eiwitten geven weer
nieuwe eigenschappen aan een cel
• eiwitten zetten genen aan en uit
DNA
eiwit
functiein de cel
keerpunten 5-04 #13
de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag
kijken naar moleculen in de levende cel
gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen
keerpunten 5-04 #14
- GFP is een eiwit met ~225 aminozuren van de kwal Aequorea victoria
- gen dat codeert voor GFP is gecloneerd
zichtbaar maken van eiwitten in de levende cel met de hulp van een kwal...green fluorescent protein (GFP)
keerpunten 5-04 #15
GFP fusie-eiwittenextreem handig
koppel eiwit waarin je geinteresseerd bent aan GFP eiwit
je eiwit wordt dan lichtgevend
danzichtbaar in microscoop
keerpunten 5-04 #16
GFP-fusie eiwit
uitvoerbaar voor elk eiwit
gen voor GFP eiwit gen voor histon eiwit
gen voor GFP-histon fusie eiwit
+
keerpunten 5-04 #17
bijvoorbeeld: zichtbaar maken van het menselijk genoom in de levende cel
DNA verpakkings-eiwit koppelen aan GFP• GFP-histon H2B
gen dat codeert voor dit eiwit in cel brengen
cel maakt het juiste GFP-gekoppelde eiwit
keerpunten 5-04 #18
preparaat bestralen in microscoop met blauw licht
GFP absorbeert blauw licht
GFP zendt groen licht uit
GFP is een fluorescerend eiwit:zichtbaar maken in een fluorescentie-microscoop
keerpunten 5-04 #19
fluorescentie microscopie voor 3-dimensionale beelden
microscoop
keerpunten 5-04 #20
menselijk genoom in levende cel zichtbaar gemaakt
keerpunten 5-04 #21
een andere toepassing van GFP fusie eiwitten
hoe overleef ik mijn zonnebank, of een dagje aan
het strand…?
keerpunten 5-04 #22
zonlicht bevat UV
DNA schade na een uurtje in de zon of op de zonnebank door UV licht• vele duizenden DNA
beschadigingen in elke huidcel...!
toch maar kleine kans op bijv. kanker
we hebben heel efficiënte systemen om DNA schade te repareren
keerpunten 5-04 #23
pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct
cyclobutane pyrimidine dimer
ultraviolet licht induceert chemische reacties in DNA
DNA beschadiginggeeft mutaties
stukje onbeschadigd DNA
keerpunten 5-04 #24
mutaties
mutatie is verandering van nucleotiden-volgorde in DNA• resulteert in andere
aminozuurvolgorde van eiwit waarvoor gen codeert
• meestal verlies van functie van eiwit
• meestal verlies van eigenschap van cel
mutaties kunnen ziekten veroorzaken• bijvoorbeeld kanker
X
X
X
keerpunten 5-04 #25
DNA reparatie systeem
verschillende DNA reparatie-eiwitten binden aan beschadigd DNA• samen repareren ze
de DNA schade onderzoek hoe dit
werkt in de levende cel
laat cel GFP-repair fusie-eiwitten maken
keerpunten 5-04 #26
onderzoek naar hoe DNA reparatie werkt
maak één van de reparatie eiwitten fluorescent mbv GFP• zichtbaar mbv
microscoop in celkern celkern lokaal
bestralen met UV licht• in rode cirkel• lichtgevende
reparatie-eiwit bindt aan het beschadigde DNA
• hopen zich op in beschadigd gebied
keerpunten 5-04 #27
een zonnebank voor cellen in een microscoop
glaasje metlevende cellen
masker met kleine gaatjes(1/200 mm)
cel met lokale DNA schade
keerpunten 5-04 #28
masker met heel kleine gaatjes in de microscoop
masker
gaatjes van 5 micrometer(1/200 millimeter)
keerpunten 5-04 #29
masker bovenop laagje levende cellenmasker
keerpunten 5-04 #30
fluorescerende GFP-reparatie eiwit in cel
masker
filter bovenop laagje levende cellen
keerpunten 5-04 #31
precies meten hoe het reparatie- eiwit aan beschadigd DNA bindt
ERCC1-GFP accumulation at UV damage
0
50
100
0 100 200 300
Time (s)
Inte
ns
ity
37 C
keerpunten 5-04 #32
XPB-EGFP accumulation at UV damage
-5
0
5
10
15
20
25
0 200 400 600 800 1000 1200
Time (sec)
% a
ccu
mu
lati
on
in
sp
ot
37 C27 C
ERCC1-GFP accumulation at UV damage
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 100 200 300 400 500 600
Time (s)
% a
ccu
mu
lati
on
in s
po
t
27 C
37 C
zelfde metingen voor verschillende reparatie eiwitten
keerpunten 5-04 #33
resultaten samenbrengen in een computermodel
expe
rim
ente
ncom
pute
r m
odel
len
keerpunten 5-04 #34
kijken naar moleculen in de levende cel
gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen
de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag
keerpunten 5-04 #35
gentherapie made simpel
gen eiwit functie• mutatie defect gen
defect eiwit verlies functie
concept van gentherapie is simpel• DNA in cel brengen met
goed-functionerend gen• defect gerepareerd...!
DNA
eiwit
functiein de cel
keerpunten 5-04 #36
boodschappenlijst gentherapie
gen vinden bij specifieke ziekte
kloneren van dat gen geschikte vector om gen
in de cel te brengen target cellen
identificeren target cellen bereiken
met vector ingebrachte gen stabiel
in cel integreren ingebrachte gen stabiel
tot expressie brengen
keerpunten 5-04 #37
problemen en denkbare oplossingen…?
hoe breng je het gen in de juiste cel…?• selectief of alle cellen die bereikt
worden...? genetisch veranderen buiten
het lichaam...?• haal te veranderen cellen uit het
lichaam en breng nieuw gen in• plaats de veranderde cellen
terug in lichaam gebruik van stamcellen...?
• genetisch veranderen en dan terugplaatsen in lichaam
• bijv. stamcellen in beenmerg voor alle bloedcellen
keerpunten 5-04 #38
waar richt gentherapie zich op clinical trials
kanker-therapie is favoriet
keerpunten 5-04 #39
het succesverhaal van SCID
ADA gentherapie• defect gen voor enzym
adenosine deaminase (ADA)• severe combined immune
deficiency (SCID) syndroom• eerste klinische testen in
1990 ander SCID syndroom
(SCID-X1)• succesvolle gentherapie
sinds 2000 17 van 18 SCID patiënten
na gentherapie goede expressie van ingebracht gen• zeer succesvol• maar...!
keerpunten 5-04 #40
bloed-stamcellen isoleren uit beenmerg
buiten het lichaam het gen inbrengen
overgebleven beenmergcellen in lichaam doden
genetisch veranderde cellen in bloedbaan • nestelen zich in
beenmerg• produceren
genetisch veranderde bloedcellen
gentherapie voor SCID
keerpunten 5-04 #41
2002: gentherapie veroorzaakt leukemie in twee patiënten• SCID-X1 gentherapie bij 3
jonge kinderen• na 3 jaar krijgen 2
kinderen leukemie• door toeval(??) insertie
van ingebrachte gen in een oncogen
• totale verrassing• FDA verbiedt SCID-X1
gentherapie tenzij er geen enkele andere optie is
• moeilijke keuzes, etisch probleem
wat genetisch mis kan gaan bij gentherapie
X
X
keerpunten 5-04 #42
problemen en oplossingen…?
meeste virussen integreren hun DNA in genrijke gebieden in genoom• risico...!
sturen van transgen in DNA• maar hoe...?
denkbaar alternatief• ingebrachte gen niet laten
integreren in DNA van cel• DNA van sommige virussen
blijft als los stukje DNA in de celkern (episoom)
• repliceert gelijktijdig met cel DNA tijdens celdeling
X
X?
keerpunten 5-04 #43
hoe wordt het DNAin de cel gebracht...?
meestal m.b.v. virus
keerpunten 5-04 #44
virussen vaak gebruikt om DNA binnen te brengen bij gentherapie
Thomas et al., 2003
keerpunten 5-04 #45
gentherapie met adenovirus is efficientmaar sterke afweerreacties
veel succesvol genetisch veranderde cellen in lever m.b.v. adenovirus
heel veel cellen van afweersysteem infiltreren lever
leverweefsel
keerpunten 5-04 #46
wat immunologisch mis kan gaan bij gentherapie
1999: adenovirus vector veroorzaakt dood van patiënt• vrijwilliger Jesse Gelsinger,
18 jaar, Philadelphia• leed aan milde vorm
ornithine decarboxylase deficientie
– productie van giftig NH3
• hyper immuunreactie op ingespoten adenovirus (zeldzaam...!!)
– na 4 dagen overleden
• injectie van grote hoeveelheid (inactieve) virusdeeltjes nu onveilig geacht door FDA
keerpunten 5-04 #47
toekomst van gentherapie
onderzoek gaat onvermoeibaar verder...!
2004
keerpunten 5-04 #48
kijken naar moleculen in de levende cel
gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen
de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag
keerpunten 5-04 #49
een droom-experiment
in één enkel experiment bij een cel vaststellen welke genen wel en welke genen niet aan staan• mens: 35.000 genen
het is mogelijk...! DNA micro-arrays
• DNA chips
keerpunten 5-04 #50
hoe meet je de activiteit van een gen...?
alleen genen die aan staan produceren RNA
hoe meer RNA hoe groter de aktiviteit van een gen
RNA van gen 1
RNA van gen 2
RNA van gen 3
keerpunten 5-04 #51
genexpressie meten aan de hand van RNA concentratie in de cel
celtype 1 celtype 2
vier mogelijkheden• genen even actief in beide
celtypen• genen aktiever in één van de
celtypes• genen actief in slechts één
celtype• genen inactief in beide celtypen
keerpunten 5-04 #52
duizenden spotjes op aan glaasje
elk spotje heeft stukjes DNA van een specifiek gen
35.000 spotjes genoeg voor alle menselijke genen• in principe...
componenten van de DNA microarray technologie
123456
A B C D E F
keerpunten 5-04 #53
123456
A B C D E F
microarray technologie
****
*** *
referentie cellen te analyseren cellen
isoleer RNA en maakhet fluorescerend GROEN
isoleer RNA en maakhet fluorescerend ROOD
* ** **
*
keerpunten 5-04 #54
123456
A B C D E F
microarray technologie
****
*** *
referentie cellen te analyseren cellen
* ** **
*
keerpunten 5-04 #55
123456
A B C D E F
****
*** *
* ** **
** *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #56
123456
A B C D E F
*** *
**** * *
* ***
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #57
123456
A B C D E F
*** *
* **
*** * ***
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #58
123456
A B C D E F
*** *
* **
*** * ***
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
specifieke binding van alleen de juiste nucleotiden volgorde via dubbelstrengs DNA: A-T en G-C...!
keerpunten 5-04 #59
123456
A B C D E F
* **
*** * ***
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
alleen RNA van referentie cellen: dus spot is GROEN
keerpunten 5-04 #60
123456
A B C D E F
* ** **
****
** *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #61
123456
A B C D E F
* **
***
***
*
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #62
123456
A B C D E F
* **
***
***
*
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #63
123456
A B C D E F
* **
**** *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
alleen RNA van te analyseren cellen: dus spot is ROOD
keerpunten 5-04 #64
123456
A B C D E F
** * **
* * *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #65
123456
A B C D E F
**
* *
**
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #66
123456
A B C D E F
**
**
* *
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #67
123456
A B C D E F
**
** * *
* *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
keerpunten 5-04 #68
123456
A B C D E F
*** *
microarray technologie
referentie cellen te analyseren cellen
RNA van referentie cellen en van te analyseren cellen: GROEN plus ROOD is GEEL
keerpunten 5-04 #69
verband genexpressie enfluorescentiesignaal
A B C D E F G
123456
celtype 1 celtype 2
Genexpressie
gen 1F - ++++
gen 3E ++++ ++++
gen 5C ++++ -
gen 5B - -
-
++
++
-
keerpunten 5-04 #70
microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis
keerpunten 5-04 #71
microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis
keerpunten 5-04 #72
DNA microarray om genen te vinden in relatie tot een ziekte
spotjes meten
data extractie + analyseidentificatie van genen met andere activiteit bij
ziekte
binden aan microarray
microarraygezond
ziek isolatie en
labelling
isolatie en
labelling
keerpunten 5-04 #73
voorbeerd toepassing microarray voor diagnostiek van borstkanker door NKI
tijd (jaren)
overl
even
den ~30% patiënten overlijdt
aan borstkanker binnen 10 jaar
~70% overleeft 10 jaar of meer
traditionele diagnostiek
iedereen krijgt chemotherapie...!
keerpunten 5-04 #74
analyse van 78 humane borsttumoren
34 metastase-positief binnen 5 jaar• slechte
prognose 44 metastase-
negatief gedurende 5 jaar• goede prognose
identificatie van genen waarvan de activiteit verandert bij borstkanker
tijd (jaren)
overl
even
den
keerpunten 5-04 #75
analyse borstkanker microarrays
78 borsttumoren geanalyseerd 34 ‘slecht’
vergeleken met 44 ‘goed’
microarray met 24.000 genen
5.000 genen vertoonde veranderde expressie in tumoren• verschillende
klassen borsttumoren...!
keerpunten 5-04 #76
70 genen geïdentificeerd die verloop van het ziekte goed kunnen voorspellen
70 geselecteerde genen
78 t
um
ore
n goede prognose
slechte prognose
rangorde
metastases
(wit =
+)
keerpunten 5-04 #77
microarray classificatie vs. NIH classificatie
classificatie van 158 borstkanker-tumoren
minder onnodige chemo-therapie
identificatie van genen die een rol spelen bij borstkanker
klassieke NIH classificatie
59%
74%
5 % laag risico95 % hoog risico
96%
50%
classificatie op basis van microarray
39 % laag risico61 % hoog profiel
keerpunten 5-04 #78
kijken naar moleculen in de levende cel
gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen
de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag
keerpunten 5-04 #79
PCR: een brilliant idee
polymerase chain reaction• PCR
brain wave van Kary Willis• nobelprijs 1997
uit een heel klein beetje DNA veel DNA maken• precieze kopie
extreem belangrijk in onderzoek • bijv. microarray analyse• bijv. forensisch
onderzoek
Kary Mullisnobelprijs 1997
keerpunten 5-04 #80
PCR: een simpele truc
amplificeren van een specifiek deel van het DNA
maak twee korte stukjes DNA met zelfde nucleotiden-volgorde als aan beide kanten van te amplificeren stuk DNA• twee primers
het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd
techniek om stukken DNA te scheiden op basis van verschil in grootte
keerpunten 5-04 #81
PCR: een simpele truc
amplificeren van een specifiek deel van het DNA
maak twee korte stukjes DNA met zelfde nucleotiden-volgorde als aan beide kanten van te amplificeren stuk DNA• twee primers
het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd
techniek om stukken DNA te scheiden op basis van verschil in grootte
keerpunten 5-04 #82
PCR is efficiente methode om DNA van verschillende individuen te onderscheiden
DNA van verschillende personen verschilt op veel plaatsen in genoom
ook vaak verschil tussen beide homologe chromosomen in een individu
verschillen worden doorgegeven aan nakomelingen
keerpunten 5-04 #83
over PCR
PCR cartoon
PCR in juridisch onderzoek
keerpunten 5-04 #84
hoe g
aan w
e
begri
jpen h
oe
het
werk
t…?
elementaire deeltjes
atomen, moleculen
zonnestelsels
sterrenstelsels
big bang
evolutie
aarde, ecologie
keerpunten 5-04 #85
is d
it iets
anders
…?
elementaire deeltjes
atomen, moleculen
zonnestelsels
sterrenstelsels
big bang
evolutie
aarde, ecologie
ja en nee
zelfde natuurwette
n,
maar
speciale soorten
moleculen, die
samenwerken in
netwerken