Bloedstolling

Waarom is bloedstollingcomplex?

• Moet snel optreden wanneer nodig• Mag niet optreden wanneer niet

noodzakelijk• Moet lokaal optreden• Daarom : vele regulatie niveau’s

Stolling op 2 niveau’s:

• Cellulaire respons–bloedplaatjes

• Moleculaire respons–stollingsfactoren

OverzichtInjury

Extrinsic PathwayPlatelet Aggregation

Release of Activating Factors

Thrombin Formation

Intrinsic Pathway

Fibrin Formation

Cellular Response

OverzichtInjury

Extrinsic PathwayPlatelet Aggregation

Release of Activating Factors

Thrombin Formation

Intrinsic Pathway

Fibrin Formation

Molecular Response

Cellulaire Respons

• Gezond vasculair endotheel inhibeertcoagulatie:

– Thrombomoduline– Weefsel plasminogeen activator (t-PA)– PG-I2 (prostacycline)– NO (stikstof oxide)

Cellulaire Respons

Beschadiging endotheel veroorzaakt:

• Adhesie bloedplaatjes• Vrijstellingsreacties door plaatjes• Plaatjes aggregatie

Cellulaire Respons

Beschadigd endotheel stelt onderliggendeproteïnen bloot:

• Collageen• Fibronectine• von Willebrand Factor

Deze adhereren aan plaatjes

Plaatjes

• Kleine anucleaire celfragmenten• Ontstaan uit megakaryocyten• Levensduur: ~10 dagen• Normaal: 200-400,000 / microliter• Normaal niet adhererend• Wanneer geactiveerd vormen ze een

oppervlak voor coagulatie reacties

Plaatjes

• Veel oppervlaktereceptoren• Bezitten granules waarin chemische

substanties gestockeerd• Actine & myosine filamenten

veranderen celvorm na activatie

1. Plaatjes adhesie

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

-von Willebrand factor op endotheel bindt GP Ib/IX op plaatjes

-collageen bindt GP IV & GP Ia op plaatjes

-fibronectine bindt op integrine receptoren op plaatjes

• 2. Vrijstellingsreacties• Adhesie catalyseert veranderingen in

plaatjes• Celvorm veranderingen• Granules bewegen naar oppervlak en

stellen inhoud vrij– ADP– serotonine– calcium– Veel andere

-aggregatie wordt autocatalytisch door vrijstelling van ADP en TXA2.

Plaatjes ReceptorenReceptoren voor:• collageen• vWf• epinephrine• ADP• PAF• Thromboxaan• ThrombineActivatie draagt bij tot vrijstellingsreacties

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

Receptor-gecontroleerde vrijstelling

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

Receptor-gecontroleerde vrijstelling

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

Receptor-gecontroleerde vrijstelling

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

3. Plaatjes Aggregatie

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

-Geaggregeerdeplaatjes verstoppencaviteit

-Geaggregeerdeplaatjes voorzien hetoppervlak voormoleculairerespons.

Moleculaire Respons:Historisch & vereenvoudigd beeld

Extrinsic Pathway

Intrinsic Pathway X

Xa

FibrinFibrinogen

ThrombinProthrombin

Terloops: historisch...

• Veel stollingsfactoren aangeduid met Romeinse cijfers

• Niet in numerische volgorde• Factoren I-IV = fibrinogeen, prothrombine,

tissue factor (weefselfactor) & Ca++

• Subscript-a = geactiveerde vorm• geen Factor VI

Algemeen overzichtRood: extrinsieke routeBlauw: intrinsiekZwart: gemeenschappelijk

Extrinsieke Cascade-brengt vorming fibrine prop op gang

- éénstaps proces dat sleutelenzym activeert, factor X → Xa → prothrombine activatie.

- thrombine → fibrine prop

Extrinsieke Cascade• Vasculaire beschadiging stelt bloed bloot aan

weefselfactor (tissue factor=TF) (Factor III), • = receptor voor FVII (Gla- bevattend proteïne)

dat bindt aan TF in aanw. van Ca++.• Factor VII + Factor III + Ca++ vormen complex

Extrinsieke CascadeFVIIa < thrombine inwerking.

beetje FVIIa voortdurend aanwezig maar niet actief bij gebrek aan weefselfactor.

Extrinsieke cascade

Factor VII:• Vitamine K-afhankelijk proteïne…• Inactieve precursor van een protease• Wanneer VII → VIIa, 100 x meer actief• Converteert Factor X → Xa

Extrinsieke cascade(cross-talk met intrinsiek)

Wat activeert VII naar VIIa?• Thrombine• Factor IXa (<intrinsieke cascade)• Factor XIIa (<intrinsieke cascade)• Factor Xa

Extrinsieke cascade

• Rol van Xa is complex

VII VIIa VII (inactive)Xa Xa

Extrinsieke cascade(cross-talk met intrinsiek)

Substraten voor Tissue Factor:VIIa:Ca++• X (serine protease)• Converteert IX to IXa (traditioneel "intrinsiek")

– Vitamine K-afhankelijk– Serine protease

Intrinsieke cascade

• Geïnitiëerd op negatief geladen oppervlakken• In vivo: beschadigd endotheel (anionisch

membraanoppervlak)• In vitro: glas, dextraan sulfaat,…

-FXII bindt op AO

-Prekallikrein en FXI : HMW kininogeen

-FXII: prekallikrein →kallikrein

-kallikrein: XII → XIIa.

-FXIIa : FXI → XIa.

-FXIa activeert FIX

-FIXa + FVIIIa: X → Xa

-Cascadereactie.

12

2

34

5

6

7

Thrombine vorming-FXa-FV complex=prothrombinase.

-vorming V,VII,VIII,XIII(a), -onvoldoende om bloeding te stelpen (extrinsiek)

-belang thrombine : extrinsieke + intrinsieke pathway.

-FXIII (transglutaminase): vormt harde fibrine klonter.

Algemeen schema.

-Xa gevormd door I en E.

-afwijkingen gekend in iedere component van de intrinsieke route.

Intrinsieke cascade

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF"tenase"

Intrinsieke cascade

Kallikrein verknipt HMWK in tweefragmenten:

• Bradykinine (nonapeptide)– vasodilator– Verhoogt capillaire doorlaatbaarheid

• Kininogeen– Vergemakkelijkt accumulatie van

prekallikrein & XI op plaatjesoppervlak

Gemeenschappelijke Cascade

• Factor V komtvoor op plaatjesopp.

• Factor Xa, Factor Va, Ca++, phospholipidevormen eencomplex

vWFGP Ib/IX

ADHESIONto endothelium

R

RR

R

R

epinephrine

ADPthrombin

PAF

throm-boxane

GP IIb/IIIa

fibrinogen

plateletAGGREGATION

SECRETIONPIP2

DAG

IP3

PKC P47

P47-PO4

Ca++

PLC

PLA2

MLC MLC-PO4

MLCK

Phospholipid

Arachidonate

PGG2, PGH2

Thromboxane A2TS

CO

VIIIa

Ca++Ca++

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

COAGULATION

collagen

GP IVGP Ia

vWF

prothrombine

thrombine

fibrinogeen/fibrine:

-2 x αβγ polypeptiden

-3 globulaire domeinen

-N-terminale gebieden αα’ββ’:ladingsafstoting.

-thrombine verwijdert deze peptiden → zachte klonter

-versteviging door XIIIa: vormt isopeptide binding tussen monomeren

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb-4-4

-8

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb-4-4

+5

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb

Fibrine

fibrin

fibrinogenb

a aBB

AAb

Ander proteïne(op endotheel of op plaatjes)

Anticoagulatie fase (↔ procoagulatie fase):

- begint bijna zodra coagulatie zelf begint.

-initieel : concentratie inhibitor complexen = laag (concentratie van de enzymen waarmee ze moeten interageren ook laag).

-complexen dissociëren niet meer → uit bloed verwijderd (lever)

Inhibitie extrinsieke route (TF-VIIa-Ca2+-Xa)

-uniek, door ‘TF pathway inhibitor’ (TFPI) aka anticonvertine-ieder subdomein van TFPI interageert met een onderdeel van het complex-TFPI-Xa complex geïnternaliseerd door endocytose (derde domein)

-meeste inhibitoren < serpine familie (serine proteïnase inhibitor)

-anti-thrombine III = serpine dat thrombine en Xa inhibeert. Heparine versnelt deze inhibitie (9000-17000x efficiënter)

-inhibitie van Xa (alternatieve manier) : proteïne Z* Gla-bevattend proteïne* geen protease activiteit.* In aanw van calcium bindt het de membraan en vormt

complex met Xa → inactivatie.

-a2 macroglobuline inhibeert thrombine & kallikrein

Inactivatie Va en VIIIa: proteïne C pathway

-Proteïne C: * Gla-bevattend. * inactieve precursor van een serine protease

Thrombine/thrombomoduline/Ca2+ activeert proteïne C Dit complex + proteïne S → degradatie Va en VIIIa

Eindresultaat: inhibitie van verdere thrombine vorming direct : Factor V5indirect: Factor 8

!Thrombine : van pro-coagulatie naar anti-coagulatie!

-C of S deficiëntie,

→ veneuze thrombose

(bloedklonters → bloedcirculatie geblokkeerd).

(ook: puntmutaties in substraten, vb factor V)

• Plasminogeen: precursor, hoge affiniteit voor fibrine via Kringle domeinen.

• weefsel plasminogeen activator (t-PA): activeert plasminogeen proteolytisch.

• plasmine → lyse fibrine klonters • t-PA wordt op zijn beurt gereguleerd door

plasminogeen activator inhibitoren (PAI’s).

Fibrinolyse

• Start/stop van de stolling volgt zelfde patroon: – eiwit-eiwit interacties– vorming multi-enzym complexen– proteolyse.

De processen zijn unidirectioneel →nieuwsynthese noodzakelijk.

Rol van Gla residuen/domeinen in coagulatie factoren

Gla=γ-carboyl glutaminezuur• Post-translationele modificatie• excellente chelatoren van calcium• tweevoudige rol Ca2+:

– complexeren met Gla → ∆conformatie →interactie met membraanreceptoren,

– binden op (andere plaatsen in) eiwitten →catalytische activiteit ↑.

NH

O

OO

NH

O

O

γ-carboxylglutaminezuur

γ

Structuur Gla proteinen:

Proteolytische activatie :

ter hoogte van residuen gelegen binnen een S-S brug.

(enkel bij prothrombine wordt Gla fragment afgesplitst).

Vitamine K(‘Coagulatie vitamine’)

• Co-factor voor post-translationele modificatievan factoren VII, IX, X; prothrombin; proteïnen C, Z en S

• Glutamaat zijketens gemodificeerd in γ-carboxy-glutamaat

• gebeurt tijdens synthese in het lumen van RER.

• Vitamine K is een essentiële co-factor voor het carboxylase.

Vitamine K

O-

O

O-

O

O-O

strong attractionweak attraction

Enzyme vitamin K

Ca++Ca++

Glu Gla

• Prothrombine Gla peptiden: verwijderd via de lever

• Deze peptiden stimuleren de novo synthese van eiwitten die Gla-gemodificeerd moeten worden.

Ca++ chelering

• Ca++ chelatoren (citrate, oxalate, fluoride, EDTA) verhinderen coagulatievan bloed

• Vitamine K antagonisten (dicumarol, warfarin) inhiberen bloedstolling

Hemophilias

Hemophilie A (Classic Hemophilia)• Defect: Factor VIII• X-linked• 1/10,000 males

Hemophilias

Hemophilia B • Defect: Factor IX• X-linked• 1/50,000 males

Hemophilias

von Willebrand disease• Defect: von Willebrand factor• Not X-linked• 1/1,000,000• Looks like Factor VIII deficiency• Recall that vWF binds VIII