1

Решения на базе

MALDI-TOF масс-спектрометрии

для экспресс идентификации микроорганизмов

Виктор Сергеевич Казаков

Sales Manager Bruker Daltonics Russia

Масс-спектрометрия - аналитический метод измерения массы молекул или атомов анализируемого вещества по их поведению в электрических и/или магнитных полях (молекулярные весы)

Масс-спектрометр -

это инструмент, способный в условиях вакуума разделять находящийся в газовой фазе пучок заряженных частиц на фракции с одинаковым отношением массы к заряду и определять массу иона (m/z ratio).

Некоторые определения

3

MALDI-TOF масс-спектрометр

MALDI источник

ионов

Time-of-Flight (TOF)

анализатор

детек

тор

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

Первичная ионизация

M+hν → MH+, M+˙, MNa+, M+˙

Вторичная ионизация

M-˙ + A → M + A-˙

M+˙ + A → M + A+˙

MH+˙ +A → M + AH+

MNa+ + A → M + ANa+

M – матрица А – анализируемое вещество

МАЛДИ - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация,—метод «мягкой» ионизации твердого вещества, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом.

• Используется для анализа белков, пептидов, олигонуклеотидов, жирных кислот, полимеров • При MALDI ионизации образуются, как правило, однозарядные ионы, захватившие протон либо иной катион

Нобелевская премия 2002 Коичи Танака

По

вер

хно

сть

MA

LDI-

чип

а

анализатор

Источник ионов

Идентификация МО на MALDI-TOF MS

• MALDI Biotyper – программно-аппаратный комплекс, предназначенный для быстрой идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-TOF масс-спектрометров серии FLEX

• Метод выявляет уникальный набор белков исследуемых микроорганизмов – своеобразный «отпечаток пальца»

• Идентификация происходит в основном по рибосомальным белкам, которые встречаются во всех микроорганизмах

• Биоинформационная модель основанная на анализе белков позволяет надёжно и точно проводить идентификацию конкретного микроорганизма до вида путём сопоставления получаемых масс-спектров белков с обширной базой данных

5

4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z

200

400

600

800

1000

1200

1400

a.i.

MALDI Biotyper Принцип определения

«Протеомная дактилоскопия» - надежный экспресс-метод идентификации микроорганизмов с минимальными трудовыми и финансовыми затратами на пробоподготовку и анализ

Неизвестный микроорганизм Нанесение образца Получение масс-спектра

Результат идентификации через несколько минут

Один метод подготовки для любых микроорганизмов

7

Представление результатов

Вид отчета (10 штаммов)

9

Основная база данных

10

База Данных 6903

Статистика пополнения базы данных

11

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

MSP

Общее кол-во MSPs

Годы

12

Содержание

• Каждая запись MSP содержит больше 25

спектров

• Каждая запись подтверждена методом

секвенирования НК

• База данных содержит как клинически-

значимые микроорганизмы, так и

ветеринарные, промышленные и очень редкие.

MSP Род Вид

Грам - 2838 203 1015

Грам + 3289 151 1211

Дрожжи 711 45 193

Миц. грибы 65 25 42

Всего 6903 424 2461

13

Основные изменения в новой базе данных

•938 новых записей

777 записей для улучшения идентификации видов, уже присутствующих в базе данных 161 запись для новых видов

• 15 новых родов и 96 новых видов

• Улучшена дифференциация Candida haemuloni/duobushaemuloni

• Улучшена дифференциация Haemophilus haemolyticus/influenza

MSP Род Вид

Грам - 2838 203 1015

Грам + 3289 151 1211

Дрожжи 711 45 193

Миц. грибы 65 25 42

Всего 6903 424 2461

Идентификация

ID гемокультур

ID спор, токсинов и вирусов

Субтипирование

Эпидемиология

Вирулентность

Резистентность

Другие технологии

&

14

Система MALDI Biotyper

Возможности

SNP

Система MALDI Biotyper

Резистентность

15

MBT STAR-BL

Модуль определения бета-лактамазной активности

Уже реализован

MBT RESIST

Модуль определения чувствительности к антибиотикам с

помощью изотопно-меченых аминокислот

В стадии разработки и тестирования

MBT ASTRA

Модуль определения чувствительности к антибиотикам с

помощью количественного мониторинга роста клетки

В стадии разработки и тестирования

Модуль STAR-BL Определение бета-лактамазной активности

16

+ 18 Da - 44 Da

Используя MALDI-TOF масс-спектрометрию появилась возможность наблюдать напрямую за реакцией на антибиотик внутри бактериальной клетки

17

Группы Антибиотики*

Производные

пенициллина

Ampicillin

Piperacillin

Цефалоспорины

Cefotaxime

Ceftazidime

Монобактамы Aztreonam

Карбапенемы

Ertapenem

Meropenem

Imipenem

Различные ß-лактамные антибиотики

* примеры

Модуль STAR-BL

Система MALDI Biotyper

Субтипирование микроорганизмов

18

Автоматический программный модуль MBT

Subtyping Module

Уже реализован

Субтипирование микроорганизмов с помощью

программного обеспечения FlexAnalysis и

биоинформатических алгоритмов

(кластерный анализ, корреляционный индекс и пр.)

Проводится вручную

Система MALDI Biotyper

Субтипирование микроорганизмов

19

Автоматический программный модуль

Система MALDI Biotyper

MBT Suptyping Module

20

Типирование Staphylococcus aureus

для определения MRSA

Типирование Listeria monocytogenes

Типирование Mycobacterium chimerae/intracellulare

Типирование Klebsiella pneumoniae для определения

карбапенемазной устойчивости

Типирование Bacteroides fragilis для определения

карбапенемазной устойчивости

Система MALDI Biotyper

MBT Suptyping Module

21

Типирование Staphylococcus aureus

MRSA (= Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) – группа Staphylococcus aureus, которые устойчивы к метицилину и другим антибиотикам MSSA (= Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus) – группа Staphylococcus aureus, которые чувствительны к различным антибиотикам

Система MALDI Biotyper

MBT Suptyping Module

22

Важность определения MRSA

Percentage of Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistant (MRSA), by country (most recent year, 2011–14)

Система MALDI Biotyper

MBT Suptyping Module

23

Принцип детекции MRSA

Модуль субтипирования определяет наличие пептида PSM-mec, который связан с типами II, III and VIII SCCmec кассет, присутствующие в геномах MRSA штаммов:

Если PSM-mec присутствует: MRSA (с очень высокой вероятностью) Если нет, это не значит, что MRSA

Встречаемость этого пептида варьируется от <10-90% в зависимости от региона

Результат в ПО MBT Compass

24

Система MALDI Biotyper

MBT Suptyping Module

25

Примеры возможных добавлений

Streptococcus agalactiae ST1, ST17 Propionibacterium acnes И др.

Система MALDI Biotyper

Субтипирование микроорганизмов

26

Субтипирование микроорганизмов с помощью

программного обеспечения FlexAnalysis

0

2000

4000

6000

8000

Inte

ns. [

a.u.

]

9600 9650 9700 9750 9800 9850m/z

Система MALDI Biotyper

Субтипирование микроорганизмов

27

Alfa Streptococcus – 12 штаммов

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [a

.u.]

9350 9400 9450 9500 9550 9600 9650 9700m/z

Система MALDI Biotyper

Субтипирование микроорганизмов

28

Биоинформационные алгоритмы (MSP дендрограмма)

1002003004005006007008009001000

2031

83-89

2069

807

703

1597

939-952

145

151

153

213

4044

4052

160

MSP Dendrogram

Distance Level

Система MALDI Biotyper

Субтипирование микроорганизмов

29

Биоинформационные алгоритмы (псевдогель)

• Поскольку принцип MALDI Biotyper основан на сравнение «паттерна» пиков из полученного неизвестного MALDI-TOF спектра с паттерном пиков в референсной библиотеке, возможность применения системы не ограничена только микробиологией.

• Есть возможность идентифицировать любой объект, который может ионизироваться в MALDI-TOF и дает возможность получить воспроизводимые и специфичные спектры.

30

Система MALDI Biotyper

Идентификация других объектов

Система MALDI Biotyper

Идентификация других объектов

31

Идентификация вирусов

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-

TOF) mass spectrometry applied to virus identification

Adriana Calderaro и др. Department of Clinical and Experimental Medicine, Unit of Microbiology and Virology, University of Parma, Italy.

Идентификация спор бактерий и грибов

Identification of bacteria and spores suitable as biological warfare

agents by the MALDI Biotyper

Идентификация токсинов

Evolution of Botulinum Neurotoxin Detection from Mouse to MALDI

Идентификация липополисахаридов - эндотоксинов

Соматические антигены клеточной стенки бактерий имеют

липополисахаридную природу (например О-антиген)

• Каждый вид Trichinella удается различить с высоким коэффициентом достоверности

• Таким образом, MALDI-TOF технология может быть успешно использована в пищевой паразитологии

32

Экстракция личинки (легкая пробоподготовка!)

Mayer-Scholl A, Murugaiyan J, Neumann J, Bahn P, Reckinger S, Nöckler, K (2016). Rapid Identification of the Foodborne Pathogen Trichinella spp. by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. PLoS One 11

Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Идентификация Trichinella spp.

Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Идентификация комаров

33

Identification of European mosquito species by

MALDI-TOF MS

ARTICLE in PARASITOLOGY RESEARCH · APRIL 2014 Ae. cinereus Luleå, Sweden [1.978–1.999] Ae. vexans Camargue, France [2.106–2.357] Gotland, Sweden [2.015] Marseille, France [1.855] Ae. caspius Camargue, France [1.762–2.239] An. claviger Uppsala, Sweden [1.908–2.252] An. hyrcanus Camargue, France [2.111–2.272] An. maculipennis Camargue, France [2.042–2.090] Cq. richiardii Uppsala, Sweden [1.628–2.096] Cx. pipiens Camargue, France [1.837–1.936] Cx. modestus Camargue, France [1.795–2.016] Ae. rusticus Gotland, Sweden [2.218–2.378] Ae. excrucians Luleå, Sweden [2.124–2.212] Cs. longiareolatab Aix en Provence/France [1.315–1.351]

34

Identification of flea species using MALDI-TOF/MS

Amina Yssoufa, Cristina Socolovschia, Hamza Leulmia, Tahar Kernifb,

Idir Bitamc, Gilles Audolya, Lionel Almerasa, Didier Raoulta.

Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Идентификация блох

Poster 2015: Identification of animal species from meat using MALDI-TOF MS. Stoll, P., Rau, J. CVUA Stuttgart, Germany

• Определение состава мясных изделий в последнее время становится важной задачей. На сегодняшний день основными методами являются молекулярные, иммунологические и органолептические методы идентификации.

• На данный момент уже разработана библиотека видов мяса для системы MALDI Biotyper и она доступна онлайн

• Посмотреть актуальное состояние можно по ссылке http://www.maldi-up.ua-bw.de Статус Сентябрь 12 2016 г.: 144 записи

Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Определение видовой принадлежности мяса

35

Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Определение видовой принадлежности мяса

36

Система MALDI Biotyper Идентификация многоклеточных организмов Определение видовой принадлежности мяса

37

38

Вопросы?