1Bij ons leer je dewereldkennen
DNA veranderen met revolutionaire precisie
Sylvia de Pater | Lunteren 13-1-2017
2Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas in de mediade Volkskrant sept 2016
Nobelprijs
3Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas in de mediaDe Volkskrant 31-12-2016
Dankzij CRISPR/Cas kunnen we alles genetisch veranderen
Malariamug
Doodeng
4Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Presentatie overzicht
1.Wat is CRISPR/Cas?2.Historie nucleasen3.DNA herstel in eukaryoten
•NHEJ•HR
4.Mutagenese mbv CRISPR/Cas in praktijk
5.Voorbeelden6.Gene drive
6Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas• CRISPR/Cas: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats
(CRISPR) / CRISPR associated (Cas) proteins• Adaptief immuun systeem in bacteriën en archaea tegen vreemd DNA dat de
bacteriecel binnendringt
•Biotechnologie toepassing: - maken van dubbelstrengs breuken op bijna elke willekeurige plek- Herstel kan verandering van DNA volgorde veroorzaken
7Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas in bacteriënA. Faag DNA komt
bacterie binnen
B. DNA wordt herkend en geprocessed door aantal Cas eiwitten
C. en ingebouwd
D. in CRISPR array
E. CRISPR array RNA en TRACR RNA worden overgeschreven en geprocessed
F. RNAs vormen complex met Cas9
G. Faag DNA met dezelfde volgorde als het CR RNA wordt herkend
H. en wordt gekniptRatner et al.CSH protocols 2016
8Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Evolutie CRISPR/Cas
Nishimasu (2016) Curr Opin Struc Biol
9Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Evolutie CRISPR RNP complexen
Mohanraju et al. Science 2016;353:aad5147
Klasse 1
Klasse 2
10Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Type II Cas9 effector complexen
Nishimasu (2016) Curr Opin Struc Biol
Verschillende typen uit verschillende bacteriën:• Cas9 type II uit
Streptococcus pyogenes heeft 3’PAM NGG
• Cpf1 type II uit Francisella novicida heeft 5’PAM TTN
11Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Cas9 domeinen
Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.https://sites.tufts.edu/crispr/ (2-3-2017)
12Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
sgRNA
Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.https://sites.tufts.edu/crispr/ (2-3-2017)
13Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Cas9-sgRNA• Interactie met sgRNA geeft een
conformatieverandering in Cas9
Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.https://sites.tufts.edu/crispr/ (2-3-2017)
14Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Cas9-sgRNA-DNA
Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.https://sites.tufts.edu/crispr/ (2-3-2017)
• Cas9-sgRNA zoekt homologie in ds-DNA
• DSB wordt gemaakt 3bp van PAM
16Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
DSB-geïnduceerde mutaties• Maken van DSB-en op specifieke plekken in genoom was al langer mogelijk
• Specifieke nucleasen maken is lastig en/of duur• Vaak niet zo actief of specifiek
• CRISPR/Cas is erg makkelijk, goedkoop en snel• Zeer efficient
17Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Nucleasen• Mega-nucleasen
- Microbiele DNA nucleasen die 20-40 bp herkennen
- Selfish DNA elementen
- Tijdrovend en duur om specificiteit van DNA binding te veranderen
• Zink-vinger nucleasen- 3-6 ZF domein dat 9-18 bp herkent
- gekoppeld aan FokI nuclease domein
• TALE-nucleasen- 15-20 TALE repeat domein dat 15-20 bp herkent
- gekoppeld aan FokI nuclease domein
• CRISPR/Cas nucleasen- Cas9-sgRNA complex dat 20 bp herkent
- Zeer eenvoudig om 20bp in sgRNA te veranderen
- Enorme toename van onderzoek en toepassingen
Baltes (2015) Trends in Biotech 33, 120–131
18Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas variaties• Twee nuclease domeinen: RuvC
en HNH
• Beide DNA strengen worden geknipt
• Mutatie in nuclease domein geeft enkelstrengsbreuk
Barrangou (2012) Nature Biotech 30: 836
19Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Verbeteren specificiteit
Komor et al. Cell (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.044
20Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Veranderen epi-genetische informatie
Komor et al. Cell (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.044
Activatie genexpressie Repressie genexpressie
22Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
DNA schade en herstel
Hakem (2008) EMBO J 27, 589
23Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Reparatie van dubbelstrengsbreuken
(geinduceerd) DSBChromosoom
HRHomoloog DNANHEJ
variabele deleties en inserties exacte mutaties
24Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Eiwitten voor herstel van DSBen
geen foutenspecifieke mutaties
veel foutenweinig fouten
Wood (2016) DNA Repair 44, 22–32
26Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Mutaties maken in planten
1. Plek kiezen in genoom waar je mutaties wilt maken
2. Voorwaarden: - PAM (NGG, onderstreept) moet aanwezig zijn naast deze DNA volgorde
- Restrictie site (ROOD) in de buurt van de knipplaats
AGGAGACTATCTGCAGCATGAGG of TTGCTGTTGAACTACATTGGCGG
3. On line oligo-nucleotiden bestellen
4. Kloneren in plasmide (2 stappen) en in Agrobacterium transformeren
5. (Agrobacterium) transformatie van bv Arabidopsis (zandraket)
6. Analyse van gemuteerde planten
7. In de volgende generatie planten zoeken die in alle cellen dezelfde mutatie hebben
27Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Transgene planten• Agrobacterium transformatie• Selectie van transgene planten• Nakomelingen opgroeien• Protoporphyrinogenoxidase (PPO) is
essentieel gen
veel mutaties weinig mutaties
Shen et al (2017) doi:10.1534/g3.116.035204
28Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Analyse van mutaties• DNA isolatie uit 1 of meerdere
planten• Polymerase chain reaction (PCR)
rond de te verwachtte mutaties• Knippen met restrictie enzym
• Resistent banden isoleren en kloneren
• DNA volgorde (laten) bepalen van PCR producten die resistent zijn voor restrictie enzym
Mutaties 100% 75% 25% 0%Gel -
+
29Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Mutaties in Arabidopsis (zandraket)WT (Cas9-CRU)
WT CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCAGCATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT PstI -3 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA---TGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT (3) -4 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCT----CATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -4+1 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATC--C-GCATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATC------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -7 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTAT-------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -10 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGAC----------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -14 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGAC--------------GGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -14+6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA----TTTTAT----GAGAACATTGACGACCCTGCT (2) -18+6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTG-------ACGTGT-----GAACATTGACGACCCTGCT -22+1 CCACAGGGCAACGG-----------A----------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT -41 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA--------------------------------GAC WT (Cas9-PPO) WT CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACATTGGCGGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
FauI/PAM -2 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACATT--CGGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -4 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT----GGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -5 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT-----GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -6 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTAC------GGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -7 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTAC-------GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -11 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAA-----------GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -14 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT--------------ACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -14 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA--------------AACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA (2) -17 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTA-----------------ACACCGGAGTTCTGTCCAAGGTAAAAA -17 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAAC-----------------AAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA (3) -18 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT------------------CGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -18 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA------------------CCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -30 CGG------------------------------GTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA -89+26 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA---GCTTTATTCAACCACGTACACCTAAA------AACTGAT
Aantal mutaties is zeer variabel: <1% tot 100%
Shen et al (2017) doi:10.1534/g3.116.035204
30Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Volgende generatie• Kleine plantjes met mutatie in PPO gen:• Allemaal ‘T’ insertie: Mutant plant. CRISPR/Cas construct uitkruisen
WT TTGCTGTTGAACTACATTGGCGGCas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGGCas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGGCas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGG
32Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas expressie in planten• Agrobacterium transformatie met T-DNA met CRISPR/Cas gen• DNA transformatie met plasmide DNA met CRISPR/Cas gen• Virale infectie met plantenvirus met CRISPR/Cas gen• Tijdelijke expressie van CRISPR/Cas zonder integratie in genoom
• Transfectie met gezuiverd Cas9 eiwit en sgRNA
Lengte en gewicht van tarwekorrel veranderen.Zhang et al 2016 Nat. Comm. 7,12617
Mutaties in Arabidopsis, tabak, rijstWoo et al 2015 Nat. Biotech. 33, 1162
33Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Droogte-tolerant mais
Droogte-tolerant dmv CRISPR/Cas• ARGOS8 is negatieve regulator van ethyleen respons (stress hormoon).• Verhoogde expressie van ARGOS8 maakt planten minder gevoelig voor ethyleen en
geeft verhoogde opbrengst onder droogte stress.
• Mbv CRISPR/Cas is de promoter uitgewisseld met andere (activere) promoter.Shi et al (2016) Plant Biotech J doi:10.1111/pbi.12603.
droogte-tolerant droogte-gevoelig
34Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Zetmeel veranderen in aardappel• Aardappelzetmeel bestaat uit amylose en amylopectine. • Voor sommige doeleinden wordt alleen amylopectine gebruikt.• Aardappel heeft 4 genomen; mutatie van 4 genes noodzakelijk.• Transient expressie CRISPR/Cas: amylose-vrije aardappels.
Wild type 3 mutant allelles GBSS 4 mutant allelles GBSS
amylose amylose NO amylose
Andersson et al Plant Cell Rep 2016
35Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Mutagenese in druif• Tartaarzuur (wijnsteenzuur) is belangrijk voor de smaak,
mondgevoel en de bewaarcapiciteit van wijn.• CRISPR/Cas mutagenese van tartaarzuur biosynthese gen
in Chardonnay celsuspensie.
Ren, C. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 32289; doi: 10.1038/srep32289.
36Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas testen in muizen• Toedienen dmv virus (adenovirus,
AAV lentivirus), nanodeeltjes (sgRNA met Cas9 eiwit of mRNA) of injectie met plasmide DNA of RNA
• Voorbeelden waarbij mutaties in genen zijn aangebracht:
• Green Fluorescent Protein (GFP)• Genen gerelateerd aan ziekten zoals
kanker, hoog cholesterol, spierziekte
Komor et al. Cell (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.044
37Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas therapie voor spierziekte• Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een dodelijke spierziekte • Mutations in the dystrophin gen • Adenovirus voor toediening van CRISPR/Cas9 in mdx muizen• Verwijderen van exon 23 uit het dystrophin gen • Expression (gedeeltelijk) functional dystrophin gen• Verbetering van spierontwikkeling
Nelson et al. Science 2016;351:403-407
38Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas therapie voor longkanker• Bepaal welke genetische afwijking
een kanker patient heeft (bv in epidermal growth factor receptor; EGFR)
• Ontwerp CRISPR/Cas om gen te herstellen of te compleet uit te schakelen
• Toediening dmv virus
Tang et al; EMBO Molecular Medicine (2016) DOI 10.15252/emmm.201506006 emmm.201506006
39Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR testen in mens• Wedloop USA en China• China heeft als eerste
gemodificeerde cellen ingespoten in longkanker patiënten
Cyranovski 2016) Nature 539, 479
Uitschakelen van het PD-1 gen in immuun cellen (rond) zodat ze kanker cellen beter kunnen aanvallen.
40Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
CRISPR/Cas therapie in varkens
• Bescherming tegen porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
• Receptor CD163 is nodig voor het binnenkomen van het virus in de cel
• Varkens worden niet meer ziek na uitschakeling van receptor CD163 dmv CRISPR/Cas
Whitworth, et al; Nature Biotechnology 34, 20–22 (2016) doi:10.1038/nbt.3434
Wild type CRISPR/Cas
41Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Malariamug met CRISPR Gene Drive
Jim Gathany/CDC Anopheles stephensi mug, verspreider van malaria in Azie, die een mens steekt.
42Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Malariabestrijding
• Uitschakelen van genen waardoor vrouwtjes muggen onvruchtbaar worden, waardoor populaties muggen kleiner worden en malaria niet verspreidt.
(Hammond et al; Nature Biotechnology (2016) DOI:doi:10.1038/nbt.3439)
• Verspreiden van antimalaria-gen, waardoor malaria parasiet niet kan verspreiden.
(Gantz et al; PNAS (2015) DOI/10.1073/pnas.1521077112)
Mutaties snel verspreiden door populatie: gene drive
Bloedcel geinfecteerd met Plasmodium vivax
44Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Wat is een gene drive?• Toepassing in de biotechnologie gebaseerd op CRISPR-Cas9. • Snel en efficiënt verspreiden van een genetische eigenschap in een populatie. • Verspreiding in organismen die een korte generatietijd hebben. • Toepassing in organismen die zich geslachtelijk kunnen voortplanten.
Mutatie verspreiding via wetten van Mendel
Mutatie verspreiding dmv Gene Drive: alle nakomelingen krijgen mutatie
Omar S. Akbari et al. Science 2015;349:927-929
45Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Gene drive of mutatie-kettingreactie (MCR) • A-C Insertie van CRISPR/Cas in locus• D-E kopieëren naar andere chromosoom
Gantz and Bier (2015) Science;348:442-444
Dicarlo et al (2015) Nature Biotech 33, 1250–1255
• DSB in homoloog chromosoom• DNA herstel via homologe recombinatie
46Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Gene drive in gist en fruitvlieg• Ade mutatie geeft rode kleur gist kolonie
Gantz and Bier (2015) Science;348:442-444
Dicarlo et al (2015) Nature Biotech 33, 1250–1255
• Yellow mutatie geeft gele kleur aan vlieg
47Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Veiligheid gene drive experimenten• Geen regelgeving over gene drive• Gene drive experimenten nu alleen in labcondities in het buitenland
Akbari et al. (2015) Science 349:927-929
48Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Anti-CRISPR• Bacteriofaag anti-CRISPR eiwit
inactiveren Listeria monocytogenes CRISPR-Cas9
• Deze eiwitten voorkomen binding van Cas9 aan de DNA target
• Inhibitie van genome editing in E.coli en menselijke cellen
Rauch et al., 2017, Cell 168, 1–9
49Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
Regelgeving en politiek• Discussie over GMO regelgeving (methode (EU) vs product (USA)).• CRISPR/Cas technologie vraagt om debat over aanpassing van regelgeving.• CRISPR/Cas gemodificeerde organismen (bv landbouw gewas) zijn niet of moeilijk te
onderscheiden van planten die op een andere manier veredeld zijn.
Montage van DNA neemt hoge vlucht De ‘verbeterde mens’ is er in 2017 nog niet, maar het debat over crispr-cas, een genetische modificatietechniek, kan losbarsten.
Wim KöhlerNRC 6 januari 2017
50Universiteit Leiden.Bij ons leer je dewereldkennen
SchoolTV video en lesbrief• NTR heeft video over CRISPR/Cas gemaakt (spierziekte FSHD). • Link naar video en lesbrief komen ter beschikking op website.• http://schooltv.nl/video/de-kennis-van-nu-in-de-klas-gentechnologie/#autoplay
Top Related