CARACTERIZAÇÃO DE INTUMESCIMENTO E DEGRADAÇÃO DE

MEMBRANAS DE COLÁGENO VISANDO À APLICAÇÃO COMO

BIOMATERIAL

Ana C. M. Nozaki1, Rodrigo F. C. Marques2, Lígia M. Manzine1, Mariselma Ferreira1, Juliana

Marchi1

1Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André (SP), Brasil 2Universidade Federal de Alfenas (MG), Brasil

E-mail: ana.nozaki@ufabc.edu.br

Resumo. Os biomateriais são materiais destinados à interface com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo. O colágeno é um biomaterial que vem sendo muito utilizado para o tratamento de lesões de diversos tecidos, pois apresenta muitas vantagens como a formação de fibras com muita força e estabilidade através de auto-agregação e de ligações cruzadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento de intumescimento e degradação in vitro de membranas de colágeno visando à aplicação como biomaterial no tratamento de lesões de diferentes tecidos, tais como pele, ossos e cartilagem. O ensaio de intumescimento foi realizado para análise do comportamento das membranas em solução fisiológica, com pH 7.4, durante vários períodos, até 24 horas. O ensaio de degradação foi realizado em solução fisiológica, com pH 7.4, para avaliação da degradação em até 12 semanas. Após cada período de análise, as membranas foram pesadas para avaliação da perda de massa e foram analisadas através de espectroscopia de FTIR-ATR para análise da ligações intermoleculares e da estrutura do colágeno. Através do ensaio de intumescimento, foi possível observar que a membrana monocamada apresentou comportamento adequado em solução fisiológica, apresentando alta estabilidade no período de análise. O teste de degradação mostrou que, apesar da degradação observada através da redução de massa das amostras, não houve mudanças nas interações intermoleculares e nem na estrutura secundária do colágeno. A membrana de colágeno apresentou alta estabilidade em solução fisiológica, tanto no ensaio de intumescimento quanto no ensaio de degradação, mostrando-se como material promissor à aplicação biológica.

Palavras chave: Intumescimento, Degradação, Colágeno, Biomateriais

1. INTRODUÇÃO

Os atletas constituem um grupo de pacientes fortemente susceptíveis a lesões ortopédicas de diferentes tecidos devido ao contato físico com outros atletas, o impacto, o esforço repetitivo, a sobrecarga, entre outros.

O colágeno é o principal constituinte protéico do corpo dos mamíferos, estando presente em diferentes tecidos, como a pele, a cartilagem, os ossos e os tendões. Atualmente a família dos colágenos é composta por mais de vinte tipos geneticamente diferentes, dentre os quais, os mais bem caracterizados são os colágenos formadores de fibras longas (tipos I, II, III, V e XI), os colágenos associados a fibrilas (tipos IX, XII e XIV), o colágeno que forma rede (tipo IV) e o colágeno de ancoragem (tipo VII) [Junqueira et al, 2004].

O colágeno pode ser utilizado com a estrutura original do tecido de onde foi retirado, para uso em suturas, válvulas cardíacas ou próteses ligamentares; ou como biomateriais

preparados com o colágeno purificado em associação ou não com outras macromoléculas, podendo ser preparado em diferentes formatos como esponjas, géis, tubos, esferas, membranas, entre outros, dependendo da aplicação desejada [Chevallay et al, 2000].

Os materiais à base de colágeno para regeneração tecidual devem reproduzir a estrutura e as propriedades do tecido humano para direcionar o processo de formação do novo tecido. Este material deve apresentar as seguintes características: 1) uma extensiva rede de poros interconectados para que as células possam migrar, se multiplicar e se fixar profundamente; 2) canais através dos quais oxigênio e nutrientes são levados às células e resíduos possam ser retirados; 3) biocompatibilidade com uma alta afinidade para as células aderirem e proliferarem; 4) forma específica, como desejado pelo cirurgião; 5) força mecânica apropriada; 6) perfil biodegradável [Liu et al, 2007].

Os biomateriais à base de colágeno têm sido estudados há muitos anos e sua aplicação no tratamento de diversos tecidos lesados, tais como pele, nervos, tendões e cartilagem, tem apresentado ótimos resultados [Carvalho et al, 2009; Delistoianov et al, 2008, Tovar, 2009; Mimura et al, 2008; Frenkel et al, 1997].

A avaliação dos biomateriais envolve diversos ensaios in vitro, in vivo e estudos clínicos, para que se possa avaliar a interação dos materiais com ambientes biológicos e os riscos possíveis relacionados à sua aplicação.

Os testes de intumescimento e degradação in vitro permitem verificar por antecipação a perspectiva de degradação, a qual está relacionada ao grau de hidratação do sistema [Van Den Mooter et al, 1994]. Estes testes são importantes para verificar se o material apresenta estabilidade estrutural durante o período necessário à formação do novo tecido de regeneração.

Além da avaliação físico-química, os biomateriais devem ser avaliados quanto ao seu comportamento biológico. A norma ISO 10993 indica os testes de biocompatibilidade necessários para avaliação de respostas biológicas relacionadas à aplicação de materiais e dispositivos médicos. Inicialmente devem ser realizados testes de citotoxicidade in vitro para pré avaliação dos materiais, excluindo-se aqueles que não são adequados à aplicação in vivo. Esta triagem permite minimizar a exposição de animais experimentais.

Os testes in vivo, ou seja, com animais, são necessários para prever quando um dispositivo médico apresenta risco potencial para os pacientes. Para isto, os animais devem ser selecionados de acordo com a aplicação do dispositivo, considerando-se a anatomia e a bioquímica semelhante à situação de aplicação humana. Além disso, o protocolo de ensaio deve ser determinado com base em leis que regem o uso de animais em laboratório, garantindo assim que os mesmos sejam tratados eticamente [Ratner et al, 2004].

Após a aplicação em animais, os materiais que apresentarem toxicidade aceitável, passam então à avaliação clínica em humanos, dividida em diversas fases, para avaliação da efetividade, da segurança, dos efeitos adversos, etc.

Tendo em vista a avaliação inicial da membrana de colágeno, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização fisico-química deste material após os testes de intumescimento e degradação in vitro.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Ensaio de intumescimento

Para o ensaio de intumescimento, foram cortadas 3 amostras de membrana de 5mm x 5mm, as quais foram pesadas e, em seguida, imersas em solução PBS com pH= 7.4.

Todas as amostras permaneceram em incubadora a 37°C, sendo retiradas para pesagem após 1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h e 24h. Para a realização da pesagem, as

membranas foram retiradas das soluções, colocadas em papel de filtro úmido para remover o excesso de líquido e, então, pesadas. Após a pesagem, as membranas foram colocadas novamente na solução e voltaram para a incubadora a 37ºC.

Ao término do experimento, os dados de pesagem foram comparados entre os diferentes períodos.

2.2 Ensaio de degradação

O teste de degradação in vitro foi realizado de acordo com a norma ISO 10993-13 (1998), a qual avalia a degradação química de biomateriais poliméricos.

Para este teste, foram utilizadas 3 amostras de membrana para cada período. As amostras foram cortadas em 5mm x 5mm e foram secas por 4 horas em estufa a vácuo, com sílica gel, a 37°C e em seguida foram pesadas. Então, as membranas foram colocadas individualmente em frascos com 3mL de solução PBS, pH= 7.4, e incubadas a (37+/-1)°C por 2 dias, 1, 2, 4 e 12 semanas.

Após o ensaio de degradação em diferentes períodos, as amostras foram avaliadas quanto à variação de massa e caracterizadas por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), como descrito a seguir.

Análise da variação da massa das membranas. Após cada período de análise, as amostras foram separadas da solução por filtragem. Os papéis de filtro utilizados, com porosidade de 14µm, foram previamente secos por 4 horas, em estufa a vácuo, com sílica gel, a 37ºC e em seguida foram pesados. Após a filtragem, as amostras foram lavadas 3 vezes com 1mL de água ultrapura e secas juntamente com o filtro, em estufa a vácuo, com sílica gel, por 24 horas, a 37°C. Após este período as amostras foram pesadas juntamente com o filtro e a perda de massa em relação à massa inicial foi determinada através da Eq. (1):

( ( M filtro+M amostra )−(M filtro' +M amostra

' )M amostra

) x100=M perdida (%)

Sendo Mfiltro a massa do filtro seco antes da filtragem; Mamostra a massa da amostra seca antes da degradação; M’filtro e M’amostra as massas do filtro e da amostra, respectivamente, secos após a degradação; Mperdida a massa perdida pela amostra no ensaio de degradação, em porcentagem.

A média dos dados das perdas de massa foi calculada e então foram levantadas curvas de degradação das membranas em função do tempo.

Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). Após a pesagem, as membranas foram analisadas através de Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy – FTIR) com acessório de ATR (Attenuated Total Reflectance) com cristal de seleneto de zinco, ZnSe (Varian Espectrômetro FT-IR 660, Varian Inc., EUA). A resolução utilizada foi de 4cm-1 e foram realizadas 200 varreduras por ponto amostral. Foram avaliadas duas amostras de cada período e três pontos por amostra, sendo um ponto central e dois nas extremidades. Os espectros obtidos foram normalizados através da divisão dos valores de absorbância pela soma das áreas abaixo dos picos das amidas primária (I), secundária (II) e terciária (III). Após a normalização, foi plotado o gráfico das médias dos espectros das amostras em cada período analisado (2 dias, 1, 2, 4 e 12 semanas).

(1)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Ensaio de intumescimento

Os dados de pesagem obtidos no ensaio de intumescimento foram analisados e foram levantadas curvas de variação de peso para todas as amostras.

A Tabela 1 mostra os dados obtidos no ensaio de intumescimento para as membranas de colágeno. Como pode ser observado, a variação do peso foi maior entre o tempo inicial e a primeira hora do que entre as horas subseqüentes, mostrando que a maior absorção de água ocorreu na primeira hora e se manteve estável após este período, sugerindo que a membrana estabilizou a absorção de solução após a primeira hora e não apresentou degradação, ou perda de massa para a solução, até o final do ensaio.

Tabela 1 – Média, desvio padrão dos pesos e porcentagem de absorção de água pelas membranas monocamada em solução PBS de pH 7.4 após todos os períodos de imersão.

Membrana Monocamada

Tempo Peso médio (mg) Desvio Padrão do peso % variação do peso*

0 0,0012 0,0003 -1h 0,00847 0,0006 605,832h 0,0054 0,0007 3503h 0,0093 0,0003 6754h 0,01003 0,00005 735,836h 0,01107 0,00125 822,58h 0,00903 0,0009 652,510h 0,00943 0,0003 685,8312h 0,01017 0,0006 747,524h 0,01 0,0012 733,33

*Porcentagem de variação de peso em relação ao peso inicial (tempo 0).

Os dados de peso médio e desvio padrão das membranas imersas em solução PBS de pH 7.4, após todos os períodos de imersão podem ser observados no gráfico da Fig. 1.

Figura 1 – Variação do peso das membranas monocamada durante o teste de intumescimento.

3.2 Ensaio de degradação

Análise da variação da massa das membranas. Os resultados da análise de variação de massa das membranas após 2 dias, 1, 2, 4 e 12 semanas podem ser observados na Fig. 2.

Neste ensaio, esperava-se que a massa das membranas reduziria com o passar do tempo devido à degradação da mesma, porém, houve um pequeno aumento de massa das membranas em relação à massa inicial, até a 4ª semana de análise, seguido de uma redução de massa em 12 semanas. Este comportamento pode ter sido resultado de três fatores: 1) a presença de água residual nas amostras após a secagem; 2) deposição de sais da solução PBS; 3) a retenção de resíduos das membranas, maiores que a porosidade do papel filtro.

Durante todo o período de análise, as membranas podem ter sofrido degradação e perda de massa, porém a secagem das mesmas após a imersão em solução PBS, pH=7.4, pode não ter sido eficiente, havendo ainda a presença de água residual nas amostras. Com o passar do tempo de ensaio, um maior número de moléculas de água pode ter se ligado à matriz de colágeno e permanecido na estrutura da membrana como água residual, resultando assim no aumento de massa das amostras proporcionalmente ao tempo de ensaio.

O segundo fator diz respeito ao aumento na deposição de sais da solução PBS. Tal deposição pode ter ocorrido em maior proporção com o passar do tempo. Estes sais podem ter sido retidos pelo papel filtro, refletindo assim um aumento de massa com o passar dos períodos de análise.

Desta maneira, a água residual e a deposição dos sais de PBS podem ter mascarado a perda de massa até a 4ª semana de análise. Porém, após 12 semanas de ensaio, as membranas de colágeno apresentaram uma redução de massa de 2,67%. Esta redução de massa após 12 semanas possivelmente ocorreu porque até a 4ª semana, o material pode ter sofrido degradação, com liberação de resíduos da membrana para a solução, porém, estes resíduos

possuíam tamanho maior que a porosidade do papel de filtro (14µm), ficando assim retidos durante o processo de filtragem. Neste caso, a retenção dos resíduos da membrana colaborou apenas para a manutenção do peso das amostras e não pelo aumento de massa até 4 semanas. Porém, após 12 semanas, estes resíduos podem ter sido degradados e reduzidos a um tamanho suficiente para passar pelos poros do papel de filtro e, portanto, a massa retida na filtragem foi menor neste período, resultando em redução de massa medida ao final do ensaio.

Figura 2 – Variação de massa das membranas de colágeno durante o ensaio de degradação.

Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). A partir dos espectros de FTIR obtidos foi calculada a área abaixo dos picos das amidas I e II (entre 1487,96 e 1716,96cm-1) e da amida III (entre 1213,81 e 1270,43cm-1). Os espectros foram divididos pela soma das áreas dos picos das amidas para obtenção dos espectros normalizados. A Fig. 3 mostra a média dos espectros de FTIR normalizados das membranas após os diferentes períodos de análise. É possível observar que todas as amostras apresentaram os picos máximos característicos das amidas I, II e III em aproximadamente 1630 cm-1, 1545 cm-1 e 1236 cm-1, respectivamente.

Figura 3 – Espectros de FTIR das membranas de colágeno após os diferentes períodos de degradação.

As bandas das amida I, II e III presentes nos espectros de FTIR são características do colágeno devido às aminas ricas em resíduos de glicina e prolina [Mandal et al, 2012] e estão diretamente relacionadas à conformação peptídica [Chang et al, 2002]. Segundo Chang et al (2002), a banda da amida I, com freqüências características entre 1600 e 1700 cm-1 é associada principalmente com as vibrações de estiramento de grupos carbonila (C=O). Há também contribuições em menor escala das vibrações de estiramento de C-N e de flexão de N-H. As freqüências de vibração de cada ligação C=O dependem da força das ligações de hidrogênio com o oxigênio da carbonila, bem como das interações entre as unidades de amidas, ambas influenciadas pela conformação peptídica local relacionada com a estrutura secundária. Na região da amida II há bandas entre 1540-1550cm-1, 1620-1530cm-1 e entre 1520-1545cm-1. Estas bandas vibracionais estão relacionadas a uma combinação fora de fase de flexão de ligações N-H e estiramento de ligações C-N. Na amida III, as bandas estão localizadas entre 1270-1300cm-1, 1229-1235cm-1 e entre 1243-1253cm-1 e são relacionadas com as vibrações de estiramento C-N e deformação N-H.

Muyonga et al (2004) relatam que as mudanças nos picos destas amidas para menores comprimentos de onda, o aumento na intensidade de absorbância da amida III e a ampliação do pico da amida I estão associados ao aumento de interações intermoleculares (através de ligações de hidrogênio) no colágeno. Por outro lado, a denaturação do colágeno leva à redução na intensidade dos picos das amidas I, II, III e redução da frequência da banda da amida II, indicando uma mudança estrutural [Fries et al, 1996]. Porém, é possível observar nos espectros obtidos que não houve diferenças nem na intensidade, nem na frequência de absorbância dos picos referentes às amidas I, II e III entre os diferentes períodos de análise, indicando que, apesar da degradação observada através da redução de massa das amostras,

bem como com a maior quantidade de colágeno na solução após 12 semanas, não houve mudanças nas interações intermoleculares e nem na estrutura secundária do colágeno.

A análise da degradação dos biomateriais é importante para avaliação da estabilidade do material em ambiente fisiológico por um tempo compatível à cinética de reparação tecidual. A degradação de um arcabouço deve permitir que as células cultivadas proliferem e secretem sua própria matriz extracelular (1-12 semanas), enquanto o arcabouço polimérico desaparece gradualmente deixando espaço suficiente para o crescimento do novo tecido [Hutmatcher, 2000].

O ensaio de degradação realizado com as membranas de colágeno em solução fisiológica permitiu prever o comportamento de degradação in vitro das membranas de colágeno em até 3 meses, mostrando que as mesmas apresentam alta estabilidade no período analisado. Porém, extrapolações dos dados obtidos in vitro para a condição in vivo devem ser realizadas com cuidado, pois o organismo vivo interage com o biomaterial de maneira muito mais complexa, envolvendo inúmeros fatores químicos, físicos, mecânicos e biológicos.

4. CONCLUSÕES

Os dados de intumescimento e degradação permitiram a previsão do comportamento das membranas de colágeno em solução fisiológica tanto nas primeiras 24 horas como também até 12 semanas, mostrando que tais membranas apresentam boa estabilidade em PBS, apresentando perda de massa, mas com manutenção da estrutura secundária do colágeno. Outros estudos em relação ao comportamento biológicos destas membranas permitirão uma análise complementar quanto à potencial aplicação deste biomaterial para regeneração de diferentes tecidos.

AGRADECIMENTOS

À UFABC, FAPESP e CNPq pela estrutura e apoio financeiro. Ao mestrando Thiago Revers Dreyer pela ajuda na caracterização das membranas por FTIR.

REFERÊNCIAS

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CHARACTERIZATION OF SWELLING AND DEGRADATION OF A COLLAGEN MEMBRANE AIMING AT THE APPLICATION AS

BIOMATERIAL

Ana C. M. Nozaki1, Rodrigo F. C. Marques2, Lígia M. Manzine1, Mariselma Ferreira1, Juliana Marchi1

1Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André (SP), Brasil 2Universidade Federal de Alfenas (MG), Brasil

E-mail: ana.nozaki@ufabc.edu.br

Abstract. The biomaterials are materials intended to interface with biological systems to assess, treat or replace any tissue, organ or body function. The collagen is considered a biomaterial which is extensively used for treatment of injuries of different tissues, such as skin, bone and cartilage. The objective of this study was to evaluate the in vitro swelling and degradation behavior of a collagen membrane, aiming the application as a biomaterial for the treatment of lesions in different tissues. The swelling test was performed to analyze the behavior of the membrane in saline solution, during several periods, up to 24 hours. At the end of the experiment, the weight data were compared between the different periods of analysis. The degradation test was performed to evaluate the degradation of the membrane in saline solution until 12 weeks. After each period of analysis, the membranes were weighed to assess weight loss and were analyzed by FTIR spectroscopy for the analysis of intermolecular bonds and the structure of collagen.  Through the swelling test, it was possible to observe that the monolayer membrane showed an appropriate behavior in saline with great stability during all the period of analysis. The degradation test showed the mass reduction of the membranes, but with maintenance of the secondary structure of the collagen in the membrane. The collagen membrane showed high stability in saline solution in both swelling and degradation test, showing as a promising material for biological application.

Keywords: Swelling, Degradation, Collagen, Biomaterials.