Voor akkoord verklaring - ScriptieBank...UGT Uridine difosfoglucuronosyl transferase uPA...

Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van

het in vivo chimeer uPA+/+-SCID muismodel en in vitro humane lever microsomen

1

Voor akkoord verklaring

Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de

eindwerkverdediging of erna werden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in

publicaties is toegelaten na goedkeuring van de promotor en eindwerkbegeleider (van de

stageplaats).

Dr. Sc. Leen Lootens Prof. Dr. Peter Van Eenoo

Stagementor Stagegever

Dr. Sc. Griet Vanbillemont

Promotor



2

Woord vooraf

Bij het beëindigen van deze bachelorproef wil ik graag enkele personen bedanken die

hebben bijgedragen bij het tot stand brengen van dit eindwerk en zo mijn bachelor

opleiding af te sluiten. Zonder de hulp en steun van bepaalde personen kon dit niet

gerealiseerd worden.

Eerst en vooral en in het bijzonder wil ik mijn stagementor Dr. Sc. Leen Lootens

bedanken, niet alleen voor het aanreiken van het boeiend onderwerp, maar vooral voor de

uitstekende begeleiding vol enthousiasme gedurende mijn ganse stageperiode en om mij

met raad en daad bij te staan in het verwezenlijken van deze thesis. Eveneens wil ik haar

bedanken voor haar flexibiliteit en voor de vele tijd die zij voor mij vrijmaakte door het

veelvuldig nalezen, bijsturen en aanbrengen van verbeteringen in deze bachelorproef. Ik

wens haar ook te bedanken voor alle praktische ondersteuning en het doorgeven van

kennis.

Daarnaast wil ik mijn stagegever Prof. Dr. Peter Van Eenoo bedanken om mij de kans te

geven mijn stage en aansluitend mijn bachelorproef in het DoCoLab uit te voeren, waar ik

ook altijd bij terecht kon voor vragen.

Mijn promotor, Dr. Sc. Griet Vanbillemont, wil ik bedanken voor het advies, het lezen en

corrigeren van mijn bachelorproef en voor het opstellen van goede deadlines.

Alle medewerkers van het DoCoLab wil ik ook graag bedanken voor hun praktische hulp

en de fijne sfeer in het labo, maar ook de medestudenten Mieke, Lisa, Jasper en Stijn voor

de aangename en ontspannende momenten tijdens mijn stage. In het bijzonder wil ik ook

Lore Geldof bedanken voor de praktische ondersteuning en tips bij deze thesis.

Verder wil ik zeker nog mijn ouders bedanken voor de mogelijkheid die ze me gaven om

deze opleiding te volgen. Ik wil hen en daarnaast ook mijn vrienden bedanken voor de

steun en motivatie tijdens deze periode.



3

Samenvatting

Dopinggerelateerde producten worden veelvuldig gebruikt in de sportwereld door hun

prestatie bevorderend effect en bovendien worden er telkens ook nieuwe producten op de

markt gebracht om zo de dopingcontroles te kunnen omzeilen. Hierdoor is het

noodzakelijk om methoden te ontwikkelen, zodat detectie van deze producten mogelijk

wordt. In dit onderzoek wordt de metabolisatie van twee anabole androgene steroïden,

namelijk methyldienolone en methyltrienolone, nagegaan. De metabolieten van beide

dopinggerelateerde producten zijn weinig tot niet gekend en zouden op deze manier

kunnen opgenomen worden in de routine screening ter detectie. De detectie van de

steroïden zelf gebeurt in beperkte mate, want na inname worden ze omgezet in het lichaam

tot metabolieten. Deze metabolieten laten een langere detectie van het misbruik toe dan het

eigenlijk steroïde. Hierdoor is het dus belangrijk dat het metabolisme gekend is. De

voornaamste detectiemethoden die hiervoor worden gebruikt zijn GC-MS en LC-MS.

De studie van de metabolisatie wordt uitgevoerd via in vivo en in vitro technieken. In vitro

gaat men een metabolisatiestudie uitvoeren aan de hand van humane lever microsomen,

om hierdoor het aantal dierproeven te reduceren en dus de vervanging toe te passen van de

3V’s voor verantwoorde proefdierexperimenten. In vivo maakt men gebruik van het

uPA+/+-SCID muismodel, waarbij de excretie-urine wordt onderzocht van chimere muizen

op zoek naar gevormde humane metabolieten. Er wordt eerst en vooral gebruik gemaakt

van niet-chimere muizen om een dosisbepaling uit te voeren en ter controle van de excretie

studie, waarna overgeschakeld wordt op het uPA+/+-SCID chimeer muismodel.

Het humaan metabolisme wordt bevestigd door het verkrijgen van dezelfde metabolieten in

de humane lever microsomen als in het chimeer muismodel. Via analyse op GC-MS van

methyldienolone wordt een metaboliet gedetecteerd die gevormd wordt door de mens en

ook wordt bevestigd via detectie op LC-MS2. Bij de analyse van methyltrienolone, die

enkel wordt gedetecteerd via LC-MS2, wordt eveneens een metaboliet gedetecteerd die

wordt verkregen door het humaan metabolisme. Als metabolisatiereactie vinden

hydroxylaties plaats van methyldienolone en methyltrienolone. Hierbij is het belangrijk om

in een verder onderzoek de structuur van de metabolieten te achterhalen om

methyldienolone en methyltrienolone specifieker te kunnen identificeren in de urine.



4

Summary

Doping related substances are often used in sports because of their performance-enhancing

effects. Furthermore, new products, especially developed to circumvent doping control, are

continuously brought on the market. Therefore it is necessary to optimize the screening

methods in order to detect these products. In this case, the metabolism of two anabolic

androgenic steroids is investigated, for which the metabolism was previously not

described, namely methyldienolone and methyltrienolone. Because the steroids are

intensively metabolized after administration, the parent compounds have limited diagnostic

value and the metabolites need to be identified. These metabolites allow a longer detection

of the abuse than the actual steroid itself. Therefore it is important that the metabolism is

known.

The study of the metabolism is performed by in vivo and in vitro techniques. The in vitro

technique uses human liver microsomes. In vivo the uPA+/+-SCID mouse model

transplanted with human hepatocytes is used. The excretion urine of these chimeric mice is

analyzed to detect the formed human metabolites. Prior to this, non-chimeric mice are used

to determine a sufficient dose and to verify the excretion study.

An indication of the human metabolism is confirmed by obtaining the same metabolites in

the human liver microsomes as in the chimeric mouse model. Through analysis on GC-MS

a metabolite of methyldienolone was detected in both models, and this was also confirmed

through detection on LC-MS2. In the analysis of methyltrienolone, which can only be

detected through LC-MS2, a metabolite was detected that was obtained by the human

metabolism. As metabolic reaction, hydroxylations of methyldienolone and

methyltrienolone take place. The metabolism is known and in further research it’s

important that the structure of the metabolites is determined, so that methyldienolone and

methyltrienolone can be identified more specifically in the urine and could be taken up in

the routine screening to detect their presence.



5

Lijst met afkortingen en symbolen

α Alfa β Bèta

°C Graden Celcius AAS Anabole androgene steroïden

ADME Absorptie, distributie, metabolisatie en excretie AR Androgeenreceptor

C-atomen Koolstofatomen CEVAC Centrum voor vaccinologie aan de UGent

CYP Cytochroom P450 DHT Dihydrotestosteron

DNA Desoxyribonucleïnezuur DoCoLab DopingControleLaboratorium aan de UGent

E. coli Escherichia coli ECD Ethische Commissie Dierproeven

EI Elektron ionisatie EIC Extracted ion chromatogram

ER Oestrogeenreceptor ESI Elektrospray ionisatie

GC Gaschromatografie H-atomen Waterstofatomen

HDL High-density lipoprotein HDS Hydroxysteroïd dehydrogenase

HLM Humane lever microsomen IOC Internationaal Olympisch Comité

IS Inwendige standaard ISO Internationale organisatie voor standaardisatie

LC Vloeistofchromatografie LDL Low-density lipoprotein

LLE Vloeistof-vloeistof extractie M Moleculair ion

m/z Massa-ladingsverhouding MD Methyldienolone



6

min Minuten mRNA Messenger ribonucleïnezuur

MS Massaspectrometrie MS2 Tandem massaspectrometrie

MSTFA N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide MT Methyltrienolone

N2 Stikstofgas NADP+ Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat

NADPH Gereduceerde nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat NPLC Normal phase liquid chromatography

OFN Zuurstofvrije stikstofgas PBS Phosphate buffered saline RNA Ribonucleïnezuur

RPLC Reversed phase liquid chromatography rpm Toeren per minuut

RRT Relatieve retentietijd RT Retentietijd

SCID Severe Combined Immune Deficiency syndrome SIM Selected ion monitoring

SOP Standard operating procedure SRM Single reaction monitoring

ST Sulfotransferase TMS Trimethylsilyl

u Uur UGT Uridine difosfoglucuronosyl transferase

uPA Urokinase-type plasminogeen activator WADA Wereld Anti-Doping Agentschap



7

Verklarende woordenlijst

Abdominaal Met betrekking tot de buik Chimeer Levend wezen die cellen bevat met verschillende genetische

achtergrond Chronisch Langdurig

Co-factor Een stof die naast een enzym noodzakelijk is voor het plaatsen van bepaalde biochemische reacties

Farmacokinetiek Beschrijft de processen waaraan een werkzame stof in het lichaam wordt onderworpen

First-pass effect Eerste leverpassage via de leverpoortader van een stof na opname in de darmen

Hepatische sinusoïden

Haarvatennetwerk waar zuurstofrijk bloed uit de slagader gemengd wordt met het zuurstofarme maar voedselrijk bloed uit de poortader.

Hepatocyten Levercellen

Hepatoxiciteit Toxiciteit voor de lever Heterozygoot Twee verschillende allelen van een gen voor een bepaalde

eigenschap Homozygoot Twee identieke allelen van een gen voor een bepaalde eigenschap

Immunodeficiënt Immuunsysteem is onderdrukt Immunologische tolerantie

Als lichaamseigen door het immuunsysteem herkend worden

Impotentie Erectiestoornissen

Intestinaal Met betrekking tot de darm Intramusculair In de spieren

Kwantitatief Uitgedrukt in getallen Lipofiel Vetminnend

Mono-oxygenasen Groep van enzymen die een hydroxylgroep zullen incorporeren in het substraat

Oraal Via de mond Orale gavatie Toediening via een sonde door de slokdarm

Oscillerend Periodiek herhaalde omkering van de bewegingsrichting Overexpressie Het gen wordt meer tot expressie gebracht dan normaal

Parenchym Hepatocyt weefsel in de lever Parenteraal Om de darm heen



8

Precursor Voorloper Regenereren Vernieuwen



9

Lijst van tabellen en figuren

Lijst van tabellen

Tabel 1: Reacties van het fase I metabolisme [10]. .......................................................................................... 22

Tabel 2: Reacties van het fase II metabolisme [10]. ......................................................................................... 25

Tabel 3: Gradiëntprogramma. ........................................................................................................................... 37

Tabel 4: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra referentiestandaard methyldienolone. ................................................................................................................................ 44

Tabel 5: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyldienolone. ............................................................................................................................................................ 45

Tabel 6: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyltrienolone. ............................................................................................................................................................ 46

Tabel 7: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra positieve controle. ...................... 54

Tabel 8: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra HLM. ......................................... 56

Tabel 9: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra positieve controle. ........................... 58

Tabel 10: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyldienolone. ................ 61

Tabel 11: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyltrienolone. ................ 62

Tabel 12: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra excretie-urine niet-chimere en chimere muis. ..................................................................................................................................... 65

Tabel 13: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyldienolone. ... 67

Tabel 14: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyltrienolone chimere muis. ..................................................................................................................................... 70

Tabel 15: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via GC-MS. .............. 71

Tabel 16: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2. ............. 72

Tabel 17: Relatieve retentietijden van methyltrienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2. ............. 72

Tabel 18: Overzicht metabolieten methyldienolone in HLM en excretie-urines via detectie op GC-MS (bovenaan) en LC-MS2 (onderaan). ................................................................................................... 73

Tabel 19: Overzicht metabolieten methyltrienolone in HLM en excretie-urines via detectie op LC-MS2. ..... 73



10

Lijst van figuren

Figuur 1: Basisstructuur van steroïden [10]. .................................................................................................... 19

Figuur 2: Structuurformule van testosteron [10]. ............................................................................................. 19

Figuur 3: Werkingsmechanisme van testosteron of AAS [18]. ........................................................................ 20

Figuur 4: A-ring metabolisme met 5α- en 5β-reductie gevolgd door 3α- en 3β-hydroxy-reductie [10]. ......... 23

Figuur 5: D-ring metabolisme met 17-oxidatie en de reacties 17α- en 17β-hydroxylatie [10]. ....................... 24

Figuur 6: A-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 3-hydroxylgroep [10]. .......................... 25

Figuur 7: D-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 17β-hydroxylgroep [10]. ...................... 26

Figuur 8: Structuurformule methyldienolone. .................................................................................................. 26

Figuur 9: Structuurformule methyltrienolone. .................................................................................................. 26

Figuur 10: Schematische voorstelling van de gaschromatograaf [32]. ............................................................ 28

Figuur 11: Methyldienolone na derivatisatie. ................................................................................................... 29

Figuur 12: Methyltrienolone na derivatisatie. .................................................................................................. 29

Figuur 13: Quadrupool analysator [36]. .......................................................................................................... 30

Figuur 14: Analysemethoden triple quadrupool MS. ....................................................................................... 31

Figuur 15: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS en derivatisatieprobleem (MD”, zie verder) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC. .......................................................................... 42

Figuur 16: Full scan massaspectrum van methandiënon (IS). .......................................................................... 43

Figuur 17: Full scan massaspectrum van methyldienolone (MD). ................................................................... 43

Figuur 18: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van methyldienolone (MD”). ................. 43

Figuur 19: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2. .......................... 45

Figuur 20: Massaspectrum van methandiënon (IS). ......................................................................................... 45

Figuur 21: Massaspectrum van methyldienolone (MD). .................................................................................. 45

Figuur 22: Chromatogram referentiestandaard methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2. .......................... 46

Figuur 23: Massaspectrum van methyltrienolone (MT). .................................................................................. 46

Figuur 24: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op GC-MS. ........................................................................................................................................... 47

Figuur 25: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC. ......... 47



11

Figuur 26: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op LC-MS2. ........................................................................................................................................... 48

Figuur 27: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met m/z 287. .................................................................................................................................................. 48

Figuur 28: Massaspectrum van onbekende component. ................................................................................... 49

Figuur 29: Full scan massaspectrum van onbekende component. .................................................................... 49

Figuur 30: Overlaid chromatogram HLM incubatieperiode van de metaboliet van methyldienolone op GC-MS gebruik gemaakt van EIC. ........................................................................................................ 50

Figuur 31: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyldienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2. ...................................................................................................................................... 51

Figuur 32: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyltrienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2. ...................................................................................................................................... 52

Figuur 33: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 6β-hydroxymethandiënon als metaboliet, met IS’ op GC-MS. ................................................................................................................................. 53

Figuur 34: Full scan massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’). ........................................................... 54

Figuur 35: Full scan massaspectrum van 6β-hydroxymethandiënon. .............................................................. 54

Figuur 36: Overlaid chromatogram HLM ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”, zie verder) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS. ............................................................ 55

Figuur 37: Full scan massaspectrum van metaboliet M1. ................................................................................ 56

Figuur 38: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van de metaboliet M1 (M1”). ................ 56

Figuur 39: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 17-methyl-6β,16,17-trihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on (PCM1), 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) en x-hydroxymethandiënon (PCM3) als metabolieten, met IS’ op LC-MS2. .................................................................................................. 57

Figuur 40: Massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’). .......................................................................... 57

Figuur 41: Massaspectrum van metaboliet PCM1. .......................................................................................... 58

Figuur 42: Massaspectrum van metaboliet PCM2, daar het massaspectrum van metaboliet PCM3 gelijkaardig is. ..................................................................................................................................................... 58

Figuur 43: Chromatogram negatieve controle met IS op LC-MS2. .................................................................. 59

Figuur 44: Chromatogram blanco controle, methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2. ............................... 59

Figuur 45: Chromatogram HLM methyldienolone (MD) en M1’, M2’, M3’, M4’, M5’, M6’ als metabolieten, met IS op LC-MS2. .......................................................................................................................... 60

Figuur 46: Massaspectrum van metaboliet M1’, daar de massaspectra van metabolieten M2’, M3’ en M4’ gelijkaardig zijn. .............................................................................................................................. 60

Figuur 47: Massaspectrum van metaboliet M5’, daar het massaspectrum van metaboliet M6’ gelijkaardig is. ......................................................................................................................................................... 60



12

Figuur 48: Chromatogram blanco controle, methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2. ............................... 61

Figuur 49: Chromatogram HLM methyltrienolone (MT) en A1, A2 als metabolieten, met IS op LC-MS2. ... 62

Figuur 50: Massaspectrum van metaboliet A1, daar het massaspectrum van metaboliet A2 gelijkaardig is. . 62

Figuur 51: Overlaid chromatogram excretie-urine niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS. ........................................................................................................................... 64

Figuur 52: Chromatogram systeem blank met IS op LC-MS2. ........................................................................ 66

Figuur 53: Chromatogram negatieve urine methyldienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) met IS op LC-MS2. ........................................................................................................ 66

Figuur 54: Chromatogram excretie-urines metabolieten methyldienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een m/z 303. ................................................................................................................ 67

Figuur 55: Chromatogram negatieve urine methyltrienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) met IS op LC-MS2. ........................................................................................................ 69

Figuur 56: Chromatogram excretie-urine metabolieten methyltrienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een m/z 301. .............................................................................................................................. 70

Inhoudsopgave

13

Inhoudsopgave

Voor akkoord verklaring .................................................................................................... 1

Woord vooraf ....................................................................................................................... 2

Samenvatting ........................................................................................................................ 3

Summary .............................................................................................................................. 4

Lijst met afkortingen en symbolen ..................................................................................... 5

Verklarende woordenlijst ................................................................................................... 7

Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................... 9

Inhoudsopgave ................................................................................................................... 13

1 Inleiding, probleemstelling en situatieschets ............................................................. 16

1.1 Doping ................................................................................................................................. 16 1.2 Anabole androgene steroïden (AAS) ................................................................................ 18

1.2.1 Inleiding ....................................................................................................................... 18 1.2.2 Structuur ....................................................................................................................... 19

1.2.3 Werkingsmechanisme .................................................................................................. 19 1.2.4 Effecten ........................................................................................................................ 20

1.3 Metabolisatie van anabole androgene steroïden ............................................................. 21

1.3.1 Fase I metabolisme ....................................................................................................... 21 1.3.1.1 A-ring metabolisme ............................................................................................................ 22 1.3.1.2 B-ring metabolisme ............................................................................................................ 23 1.3.1.3 C-ring metabolisme ............................................................................................................ 23 1.3.1.4 D-ring metabolisme ............................................................................................................ 23

1.3.2 Fase II metabolisme ..................................................................................................... 24 1.4 Methyldienolone en methyltrienolone ............................................................................. 26

1.5 Detectie van anabole androgene steroïden ...................................................................... 27

1.5.1 Gaschromatografie (GC) .............................................................................................. 27 1.5.2 Vloeistofchromatografie (LC) ...................................................................................... 29

1.5.3 Massaspectrometrie (MS) ............................................................................................ 30 1.6 In vivo en in vitro technieken ............................................................................................ 32

1.6.1 In vivo: het muismodel ................................................................................................. 32

1.6.2 In vitro: humane lever microsomen (HLM) ................................................................. 33

1.6.3 Voor- en nadelen .......................................................................................................... 34

Inhoudsopgave

14

2 Materiaal en methoden ............................................................................................... 35

2.1 Producten en reagentia ..................................................................................................... 35 2.2 Instrumentatie .................................................................................................................... 35

2.2.1 Indamptoestellen .......................................................................................................... 35

2.2.2 Incubatietoestellen ........................................................................................................ 36 2.2.3 Centrifuges ................................................................................................................... 36

2.2.4 Overige ......................................................................................................................... 36

2.2.5 GC-MS ......................................................................................................................... 36 2.2.6 LC-MS2 ........................................................................................................................ 37

2.3 Referentiestandaarden ...................................................................................................... 37

2.4 Supplement methyldienolone ............................................................................................ 38 2.5 Staalvoorbereiding humane lever microsomen .............................................................. 38

2.6 Staalvoorbereiding excretie-urines .................................................................................. 39 2.7 Analyse met GC-MS .......................................................................................................... 41 2.8 Analyse met LC-MS2 ......................................................................................................... 41

3 Resultaten en discussie ................................................................................................ 42

3.1 Analyse van referentiestandaarden ................................................................................. 42

3.1.1 Referentiestandaard van methyldienolone op GC-MS ................................................. 42 3.1.2 Referentiestandaarden van methyldienolone en methyltrienolone op LC-MS2 ........... 44

3.1.2.1 Referentiestandaard van methyldienolone op LC-MS2 ...................................................... 44 3.1.2.2 Referentiestandaard van methyltrienolone op LC-MS2 ..................................................... 45

3.2 Analyse van het supplement methyldienolone ................................................................ 46 3.3 Analyse van de incubatieperiode van humane lever microsomen ................................ 50

3.3.1 HLM incubatieperiode van methyldienolone op GC-MS ............................................ 50

3.3.2 HLM incubatieperiode van methyldienolone op LC-MS2 ........................................... 51

3.3.3 HLM incubatieperiode van methyltrienolone op LC-MS2 ........................................... 52

3.4 Analyse van humane lever microsomen .......................................................................... 53

3.4.1 HLM methyldienolone op GC-MS .............................................................................. 53 3.4.1.1 Positieve controle ............................................................................................................... 53 3.4.1.2 Negatieve controle .............................................................................................................. 54 3.4.1.3 Blanco controle ................................................................................................................... 55 3.4.1.4 HLM ................................................................................................................................... 55

3.4.2 HLM methyldienolone op LC-MS2 .............................................................................. 57 3.4.2.1 Positieve controle ............................................................................................................... 57 3.4.2.2 Negatieve controle .............................................................................................................. 59 3.4.2.3 Blanco controle methyldienolone ....................................................................................... 59

Inhoudsopgave

15

3.4.2.4 HLM methyldienolone ....................................................................................................... 60 3.4.3 HLM methyltrienolone op LC-MS2 ............................................................................. 61

3.4.3.1 Blanco controle methyltrienolone ...................................................................................... 61 3.4.3.2 HLM methyltrienolone ....................................................................................................... 62

3.5 Analyse van excretie-urines .............................................................................................. 63

3.5.1 Excretie-urines methyldienolone op GC-MS ............................................................... 63 3.5.1.1 Toedieningsoplossing ......................................................................................................... 63 3.5.1.2 Controles ............................................................................................................................ 63 3.5.1.3 Excretie-urines .................................................................................................................... 64

3.5.2 Excretie-urines methyldienolone op LC-MS2 .............................................................. 65 3.5.2.1 Toedieningsoplossing methyldienolone ............................................................................. 65 3.5.2.2 Systeem blank ..................................................................................................................... 65 3.5.2.3 Negatieve urine methyldienolone ....................................................................................... 66 3.5.2.4 Excretie-urine methyldienolone ......................................................................................... 67

3.5.3 Excretie-urines methyltrienolone op LC-MS2 .............................................................. 68 3.5.3.1 Toedieningsoplossing methyltrienolone ............................................................................. 68 3.5.3.2 Negatieve urine methyltrienolone ...................................................................................... 69 3.5.3.3 Excretie-urine methyltrienolone ......................................................................................... 69

3.6 Overzicht ............................................................................................................................ 71

4 Besluit ........................................................................................................................... 74

Literatuurlijst ..................................................................................................................... 76

Inleiding, probleemstelling en situatieschets

16

1 Inleiding, probleemstelling en situatieschets

Het dopingcontrolelaboratorium (DoCoLab) is gevestigd te Zwijnaarde (Gent) en is

verbonden aan de faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen van de

Universiteit Gent. Aan het hoofd van het laboratorium staat Professor Dr. Van Eenoo.

DoCoLab staat in voor de dopingcontrole van urine- en bloedstalen van atleten en paarden,

door deze te analyseren op de aanwezigheid van verboden middelen. Hiernaast worden er

ook nieuwe methoden ontwikkeld voor het opsporen van verboden middelen. DoCoLab is

opgenomen in de lijst van de 32 geaccrediteerde laboratoria van het Wereld Anti-Doping

Agentschap (WADA) voor het uitvoeren van dopingcontrole analyses en maakt gebruik

van ISO 17025 geaccrediteerde methoden om zo de kwaliteit te waarborgen [1,2].

Binnen dit onderzoek wordt de metabolisatie nagegaan van dopinggerelateerde producten

en meer bepaald van anabole androgene steroïden (AAS). De componenten die worden

onderzocht zijn methyldienolone en methyltrienolone. De metabolieten van het steroïde

laten een langere detectie van het misbruik toe dan het eigenlijke steroïde, waardoor het

dus belangrijk is dat het metabolisme gekend is. Daarnaast is het ook van belang dat de

structuur van de metabolieten achterhaald wordt om methyldienolone en methyltrienolone

specifieker te kunnen identificeren in de urine. De studie naar de metabolisatie van deze

AAS componenten wordt aan de hand van in vivo en in vitro technieken onderzocht.

Hiervoor wordt er op zoek gegaan naar humane metabolieten door het analyseren van

excretie-urines van niet-chimere en chimere muizen en via incubaties met behulp van

microsomen. De metabolieten worden opgespoord aan de hand van detectiemethoden.

Hierbij zijn de voornaamste detectiemethoden voor steroïden gaschromatografie (GC) en

vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS).

1.1 Doping

Doping wordt gedefinieerd als het overtreden van een of meerdere anti-doping regels die

beschreven staan in De Code van het WADA. Dit houdt onder andere in het verhandelen,

het in bezit zijn of het gebruik van een prestatie bevorderend middel die gebruikt wordt in

de sportwereld. Ook fraude gedurende de dopingcontrole kan als doping beschouwd

worden. Uit statistieken van het WADA is gebleken dat de anabole middelen de meest

voorkomende substanties zijn die gebruikt worden als doping [3-5].


17

Het WADA is een onafhankelijke internationale organisatie die werd opgericht in 1999 om

een strijd te voeren tegen doping. De doelstellingen hiervan zijn om de gezondheid,

eerlijkheid en wereldwijde gelijkheid voor atleten te bevorderen. Elk jaar stelt het WADA

een vernieuwde lijst op van substanties en methoden die verboden zijn binnen en buiten de

competitie, genaamd de Verboden Lijst. Deze lijst vormt een internationale standaard met

als doel het wereldwijd harmoniseren van het anti-doping beleid. Opdat een substantie of

methode tot de Verboden Lijst behoort, moet het voldoen aan minimaal twee van volgende

drie criteria: (1) de substantie is een prestatie bevorderend middel; (2) er bestaat een

mogelijks gevaar voor de gezondheid van de atleet; en (3) indien het de geest van de sport

schendt [3,6-8].

De verboden middelen en methoden worden onderverdeeld in verschillende klassen:

S0. Niet goedgekeurde substanties;

S1. Anabole middelen;

S2. Peptide hormonen, groeifactoren en verwante stoffen;

S3. Bèta-2 agonisten;

S4. Hormoon- en metabole modulatoren;

S5. Diuretica en andere maskerende middelen;

S6. Stimulantia;

S7. Narcotica;

S8. Cannabinoïden;

S9. Glucocorticosteroïden;

P1. Alcohol;

P2. Bèta-blokkers;

M1. Manipulatie van bloed en bloedcomponenten;

M2. Chemische en fysische manipulatie;

M3. Genetische doping [8].

Er wordt een onderscheid gemaakt tussen binnen en buiten wedstrijdverband. De klassen

S0 tot S5 zijn substanties en M1 tot M3 methoden die zowel binnen als buiten de

competitie verboden zijn. De klassen S6 tot S9 zijn substanties die enkel binnen

wedstrijdverband verboden zijn. Bij bepaalde sporten behoren de klassen P1 en P2 ook tot

de verboden middelen. De AAS behoren tot de S1 klasse van de anabole middelen [8].


18

1.2 Anabole androgene steroïden (AAS)

1.2.1 Inleiding

Testosteron is het meest gekende voorbeeld van een AAS die in de Verboden Lijst van het

WADA is opgenomen. Het is een androgeen steroïde die bij mannen hoofdzakelijk

geproduceerd wordt in de tussencellen van Leydig in de testis. Testosteron is in mindere

mate aanwezig bij vrouwen en wordt vooral geproduceerd in de eierstokken. In beide

geslachten komt testosteron in kleine hoeveelheden voor in de bijnieren. Het hormoon

werd in 1935 voor het eerst ontdekt en gesynthetiseerd met medische doeleinden, maar al

gauw werd ook het misbruik ervan in de sport vastgesteld. Bij toediening van testosteron

via orale of parenterale weg wordt deze zeer vlug opgenomen in het bloed, waarna er een

snelle afbraak in de lever zal plaatsvinden door het first-pass metabolisme. Om het first-

pass effect te vermijden, worden chemische modificaties uitgevoerd om de AAS oraal en

parenteraal actief te maken. Alkylering op C-17α zal het first-pass metabolisme in de lever

vertragen door het sterisch hinderen van de 17β-hydroxylgroep, waardoor het steroïde

oraal actief wordt. Methyldienolone en methyltrienolone zijn voorbeelden van oraal

actieve steroïden met een 17α-methylgroep. Om parenterale preparaten actief te maken via

intramusculaire injectie wordt de 17β-hydroxylgroep veresterd door een carbonzuur,

hierbij zal het steroïde lipofiele eigenschappen vertonen en oplossen in vetweefsel. Door

hydrolyse zal het steroïde geleidelijk aan worden vrijgesteld, waardoor de werkingsduur

verlengd wordt [8-12].

De AAS zijn synthetisch vervaardigde stoffen die afgeleid zijn van het mannelijk

geslachtshormoon testosteron met een spieropbouwend effect. Door veranderingen aan te

brengen in de ringstructuur van het steroïde probeert men de ongewenste androgene

effecten (zie 1.2.4) zoveel mogelijk te reduceren en de gewenste anabole effecten (zie

1.2.4) te stimuleren. De AAS werden op de Olympische Spelen in Montreal van 1976 voor

het eerst opgespoord in humane urine via GC-MS, waarna het gebruik ervan onmiddellijk

werd verboden door het Internationaal Olympisch Comité (IOC). De AAS worden

geclassificeerd in twee groepen, namelijk de endogene en exogene steroïden. Endogene

steroïden zijn lichaamseigen steroïden, waarbij testosteron het belangrijkste voorbeeld is.

Exogene steroïden zijn AAS die van buitenaf in het lichaam zijn terechtgekomen en dus

van nature niet in het lichaam voorkomen. Methyldienolone en methyltrienolone zijn


19

voorbeelden van exogene steroïden die in de bachelorproef verder zullen bestudeerd

worden [9-11,13].

Designer steroïden werden tot voor kort geïntroduceerd in voedingssupplementen. Dit zijn

gemodificeerde steroïden, vertrekkend uit testosteron die structurele veranderingen hebben

ondergaan met eenzelfde werking waardoor ze niet meer gedetecteerd zullen worden via

specifieke anti-doping methoden. Prohormonen zijn precursors van hormonen, waarbij

deze door enzymen in het lichaam zullen worden omgezet tot hormonen of substanties met

een hormonale werking die tot de verboden middelen behoren. Door het ontwikkelen van

deze substanties probeert men de dopingcontroles te omzeilen [7,12,14,15].

1.2.2 Structuur

Steroïden hebben als basisstructuur een perhydrocyclopentanofenantreen ringsysteem die

bestaat uit drie cyclohexaanringen (A-, B- en C-ring) en een cyclopentaanring (D-ring),

waarbij een specifieke nummering geldt van het koolstofskelet (Figuur 1). Op basis van

deze nummering kunnen de posities van de zijketens met functionele groepen aangegeven

worden. Deze kunnen zich zowel onder als boven het vlak van het koolstofskelet bevinden,

waardoor respectievelijk een α- of β-positie wordt verkregen. Testosteron (17β-hydroxy-4-

androsteen-3-on) is het model van de AAS en wordt gekenmerkt door zijn androstaanskelet

met twee β-methylgroepen op C-10 en C-13, respectievelijk C-19β en C-18β (Figuur 2)

[10,16,17].

Figuur 1: Basisstructuur van steroïden [10].

Figuur 2: Structuurformule van testosteron [10].

1.2.3 Werkingsmechanisme

Het werkingsmechanisme van AAS is vergelijkbaar met dat van testosteron. Hierbij zal het

steroïde diffunderen in het cytoplasma van de cel van het doelweefsel, waar het zal binden

aan receptoren. Testosteron kan in zijn oorspronkelijke vorm of na omzetting door het


20

enzym 5α-reductase tot 5α-dihydrotestosteron (DHT) binden aan de androgeenreceptor

(AR), waarbij DHT een veel hogere affiniteit vertoont voor de AR in vergelijking met

testosteron. Afhankelijk van het doelorgaan zullen AAS ook binden met een verschillende

affiniteit voor de AR. Testosteron kan alsook worden omgezet door het enzym aromatase

tot de vrouwelijke geslachtshormonen oestradiol en oestron, die zullen binden aan de

oestrogeenreceptor (ER). Hierdoor ontstaat er een steroïdereceptorcomplex die langs de

poriën van de kernmembraan, de celkern binnentreedt om zijn effect uit te oefenen. In de

celkern zal het steroïdereceptorcomplex binden aan de regulerende sequentie van het

DNA-fragment en zo genactivatie induceren, wat resulteert in transcriptie en translatie om

de eiwitsynthese te stimuleren. Bij transcriptie zal het DNA in de nucleus van de cel door

RNA-polymerase vertaald worden in RNA en meer bepaald in mRNA. Het mRNA zal de

celkern verlaten om zo in het cytoplasma terecht te komen en het proces van translatie te

starten. Hierbij zal het mRNA door ribosomen vertaald worden tot aminozuren, die

coderen voor specifieke eiwitten (Figuur 3) [7,9,11,18,19].

Figuur 3: Werkingsmechanisme van testosteron of AAS [18].

1.2.4 Effecten

AAS hebben zowel androgene als anabole effecten (zie 1.2.1). De androgene werking

zorgt voor de ontwikkeling van mannelijke kenmerken zoals een verlaging van de stem,

het typisch mannelijk beharingspatroon, verhoging van de talgproductie en agressiviteit.

Dit laatste kan een verhoogde staat van concentratie teweegbrengen. De anabole effecten

zorgen voor de toename van de spiermassa en weefselopbouw van botten. Dit wordt


21

verwezenlijkt door enerzijds de eiwitopbouw te stimuleren en anderzijds de eiwitafbraak te

remmen. Omwille van deze anabole eigenschappen worden steroïden als een prestatie

bevorderend middel gebruikt in de sportwereld [9,11].

Het veelvuldig gebruik en het toedienen van hoge doseringen van AAS kunnen echter heel

wat ongewenste effecten op de gezondheid teweegbrengen. Als algemene nevenwerkingen

gelden een toegenomen libido, acne en een vettigere huid door een verhoogde

talgproductie, beschadiging van de lever met leverfunctiestoornissen tot gevolg door de

afbraak van AAS en agressiviteit kan ook als een neveneffect beschouwd worden.

Daarnaast bestaat er een verhoogd risico op hart- en vaatziekten door een stijging van het

LDL-cholesterolgehalte en een daling van het HDL-cholesterolgehalte. Bij vrouwen kan er

bij het gebruik van AAS een verstoring van de menstruele cyclus optreden en kunnen er

zich mannelijke kenmerken ontwikkelen zoals mannelijke lichaamsbeharing,

borstverkleining en stemverlaging. Bij mannen zal de endogene productie onderdrukt

worden waardoor er borstvorming en testikelvermindering, met een afname van de

zaadproductie, wordt verkregen. Alsook behoren impotentie, vergroting van de prostaat en

prostaatkanker tot de nevenwerkingen bij de man [7,9,11,12].

1.3 Metabolisatie van anabole androgene steroïden

De afbraak van AAS door metabolisatie vindt hoofdzakelijk plaats in de lever en heeft als

doel om steroïden te inactiveren en de excretie te bevorderen. Desondanks er ook andere

organen betrokken zijn bij de biotransformatie, is de lever hierbij het belangrijkste orgaan.

Het metabolisme van AAS is verwant aan dat van testosteron, waarbij de metabolische

pathway van testosteron de basis vormt van AAS met een gelijkaardige structuur. Het

metabolisme wordt onderverdeeld in twee fasen, namelijk het fase I en het fase II

metabolisme, waarbij er metabolische veranderingen zullen plaatsvinden in de

ringstructuur van het steroïde [10,20].

1.3.1 Fase I metabolisme

Tijdens het fase I metabolisme zullen er zich modificaties voordoen aan de structuur van

het steroïde door enzymatisch gekatalyseerde reacties zoals oxidaties, reducties of

hydroxylaties. Hierdoor zullen AAS omgezet worden in meer polaire verbindingen,


22

waarbij deze geïnactiveerd worden om zo de excretie te bevorderen. Een samenvattende

tabel van de fase I reacties aan de ringstructuur worden weergegeven in Tabel 1. Hiernaast

kunnen er ook hydroxylaties plaatsvinden op C-18 of C-19 [10,21].

Tabel 1: Reacties van het fase I metabolisme [10].

A-ring B-ring C-ring D-ring 5α- en 5β-reductie 3α- en 3β-hydroxy-reductie 1,2-hydrogenatie 1,2-dehydrogenatie

6β-hydroxylatie 6,7-dehydrogenatie

12-hydroxylatie 16-oxidatie 17-oxidatie 17α- en 17β-hydroxylatie 16α- en 16β-hydroxylatie 17-epimerisatie

Cytochroom P450 (CYP) enzymen zijn enzymen die deze reacties katalyseren en spelen

dus een centrale rol in de metabolisatie als fase I enzymen, waarbij deze talrijk aanwezig

zijn in de lever. Zowel in vivo als in vitro wordt het CYP systeem gebruikt. Dit is een

groep van enzymen, de mono-oxygenasen die instaan voor de oxidatie van vele stoffen en

omvatten meerdere isovormen, waaronder CYP3A4. CYP3A4 komt in de lever en het

gastro-intestinaal stelsel voor en is betrokken bij de metabolisatie van de meeste stoffen

(>50%). De metabolische reacties die plaatsvinden door CYP3A4 zijn hydroxylaties met

als voorbeeld de C6-β-hydroxylatie van testosteron [20-24].

1.3.1.1 A-ring metabolisme

5α- en 5β-reductie van 3-keto-4-een steroïden is de initiële en snelheidsbepalende stap in

het metabolisme van testosteron. Hierbij zal er reductie plaatsvinden van de dubbele

binding tussen C-4 en C-5 door het 5α- en 5β-reductase met NADPH als co-factor,

waardoor er twee isomeren worden gevormd met een 5α- en 5β-configuratie. Zoals eerder

vermeld zal het enzym 5α-reductase testosteron omzetten in DHT. Deze irreversibele

reactie wordt gevolgd door de 3α- en 3β-hydroxy-reductie, waarbij de ketofunctie op C-3

van het 5α- of 5β-isomeer gereduceerd wordt door 3α- of 3β-hydroxysteroïd

dehydrogenase tot een 3α- of 3β-hydroxy structuur (Figuur 4) [9,10].


23

Figuur 4: A-ring metabolisme met 5α- en 5β-reductie gevolgd door 3α- en 3β-hydroxy-reductie [10].

Bovendien kunnen er ook reacties zoals 1,2-dehydrogenatie van 3-keto-4-een steroïden tot

3-keto-androsta-1,4-dien steroïden optreden. Alsook behoort hydrogenatie van de C-1,2

dubbele binding in 3-keto-androsta-1,4-dien steroïden tot een van de reacties van het fase I

metabolisme in de A-ring [10].

1.3.1.2 B-ring metabolisme

Ter hoogte van de B-ring is 6β-hydroxylatie de voornaamste metabolisatiereactie bij de

AAS. Het metabolisme van de B-ring is het meest uitgesproken bij steroïden met een 17β-

hydroxy-17α-methyl structuur, waar de reductie in de A-ring gehinderd wordt door de

aanwezigheid van een dubbele bindingen tussen C-1 en C-2. Naast de hydroxylatie op C-

6β behoort ook 6,7-dehydrogenatie tot een van de reacties van het fase I metabolisme in de

B-ring, maar is weinig voorkomend in de metabolische pathway van AAS [10].

1.3.1.3 C-ring metabolisme

De reacties in het metabolisme van de C-ring zijn beperkt tot een 12-hydroxylatie, waarbij

er hydroxylatie op C-12α of C-12β zal plaatsvinden [10].

1.3.1.4 D-ring metabolisme

17-oxidatie van de 17β-hydroxylgroep is de meest gekende metabolisatieweg van 17β-

hydroxy steroïden zoals testosteron, waar de 17β-hydroxylgroep enzymatisch geoxideerd


24

wordt door 17β-hydroxysteroïd dehydrogenase (17β-HDS) tot een 17-keto structuur.

Ditzelfde enzym (17β-HDS) kan eveneens de 17-keto groep terug converteren in een 17β-

hydroxylgroep bij de 17β-hydroxylatie reactie van 17-keto steroïden. Bovendien kan er uit

de 17-keto groep ook 17α-hydroxy steroïden gevormd worden door het enzym 17α-

hydroxysteroïd dehydrogenase (17α-HDS), waarbij 17α-hydroxylatie van 17-keto

steroïden als reactie geldt (Figuur 5) [10].

Figuur 5: D-ring metabolisme met 17-oxidatie en de reacties 17α- en 17β-hydroxylatie [10].

Hydroxylatie van C-16α en C-16β behoort alsook tot een van de reacties van het fase I

metabolisme in de D-ring van AAS, waaruit 16-oxidatie als volgende reactie kan optreden.

Hierbij zullen 16-keto steroïden gevormd worden door enzymatische oxidatie uit de

overeenkomstige C-16α- of C-16β-hydroxy steroïden. Alsook kan er 17-epimerisatie van

de D-ring plaatsvinden [10].

1.3.2 Fase II metabolisme

Bij het fase II metabolisme treden er conjugatiereacties op waarbij steroïden of hun

metabolieten gekoppeld worden met een glucuronzuur of sulfaatgroep. Deze

conjugatiereacties zullen de polariteit van AAS verhogen waardoor excretie via de nieren

bevorderd wordt. De fase II reacties worden enzymatisch gekatalyseerd door de fase II

enzymen die hoofdzakelijk aanwezig zijn in de lever. Hierbij zijn co-factoren noodzakelijk

voor het katalyserend effect van deze enzymen. De voornaamste fase II enzymen zijn

uridine difosfoglucuronosyl transferase (UGT), sulfotransferase (ST), N-acetyl transferase

en glutathion S-transferase. UGT is het belangrijkste enzym bij de glucuronidatie, daar ST

voornamelijk sulfatatiereacties katalyseren. Een samenvattende tabel van de belangrijkste

fase II reacties aan de ringstructuur worden weergegeven in Tabel 2 [10,20,25].


25

Tabel 2: Reacties van het fase II metabolisme [10].

A-ring D-ring sulfatatie en glucuronidatie 3-hydroxylgroep

glucuronidatie en sulfatatie secundaire 17β-hydroxylgroep glucuronidatie en sulfatatie tertiaire 17β-hydroxylgroep 17-epimerisatie

Uit de 3α- en 3β-hydroxy-reductie van het fase I metabolisme volgt de conjugatiereactie

aan de A-ring, waar sulfatatie en glucuronidatie van de 3-hydroxylgroep zal optreden.

Hierbij zullen 3α-hydroxy steroïden geconjugeerd worden met glucuronzuur die zal binden

aan de vrije hydroxylgroep op C-3α, waarbij 3α-O-β-glucuronides zullen gevormd worden.

Bij 3β-hydroxy steroïden zal er een sulfaatgroep gebonden worden op de vrije

hydroxylgroep van C-3β met vorming van 3β-sulfaat (Figuur 6) [10].

Figuur 6: A-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 3-hydroxylgroep [10].

Als conjugatiereacties in de D-ring vinden er glucuronidaties of sulfataties plaats in

secundaire en tertiaire 17β-hydroxy steroïden, zoals testosteron. Hierbij zal de glucuronide-

of sulfaatgroep binden aan de vrije hydroxylgroep op C-17β tot vorming van 17β-O-β-

glucuronide of 17β-sulfaat (Figuur 7). Alsook kan er 17-epimerisatie van de D-ring

plaatsvinden [10].


26

Figuur 7: D-ring conjugatie met glucuronidatie en sulfatatie van de 17β-hydroxylgroep [10].

1.4 Methyldienolone en methyltrienolone

Methyldienolone (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9-dien-3-on) en methyltrienolone of

ook wel metribolone genoemd (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9,11-trien-3-on) zijn oraal

actieve exogene AAS die afgeleid zijn van 19-nortestosteron, waarbij het anabole effect bij

beide steroïden veel hoger ligt dan het androgene. De orale activiteit van deze steroïden

wordt bekomen door de 17α-methyl substitutie. Bij deze substitutie bestaat er echter wel

een risico op leverschade, waarbij methyldienolone en methyltrienolone de hoogste

hepatoxiciteit vertonen van alle 17α-gemethyleerde AAS. Beide AAS vertonen structurele

gelijkenissen en worden gekenmerkt door een ketofunctie op C-3, een β-methylgroep op

C-13 en een α-methylgroep en β-hydroxylgroep op C-17. Methyldienolone en

methyltrienolone zijn niet-gearomatiseerde steroïden die geconjugeerde dubbele bindingen

bevatten, waarbij er een dubbele binding gelokaliseerd is in de A- en B-ring van

methyldienolone en in de A-, B- en C-ring van methyltrienolone. De structuurformule van

methyldienolone en methyltrienolone wordt weergegeven in Figuur 8 en 9, waarbij deze

steroïden een moleculair gewicht hebben met respectievelijk een massa-ladingsverhouding

(m/z) van 286 en 284. Beide AAS staan vermeld in de Verboden Lijst van het WADA,

maar over het metabolisme is weinig tot niets gekend [7,8,12,26,27].

Figuur 8: Structuurformule methyldienolone.

Figuur 9: Structuurformule methyltrienolone.

H

H

O

CH3OHCH3

H

H

O

CH3OHCH3


27

Er werd al sinds 1960 onderzoek gedaan naar de mogelijkheid tot een farmaceutisch

preparaat van beide steroïden, maar deze werden uiteindelijk nooit geproduceerd voor

medische doeleinden door het hoog toxisch effect. Methyldienolone werd voor een korte

tijd als voedingssupplement op de markt gebracht onder de naam M-DIEN, maar is

momenteel niet meer verkrijgbaar. Methyltrienolone werd daarentegen niet geïntroduceerd

als supplement [12,26,27].

1.5 Detectie van anabole androgene steroïden

Voor de detectie van AAS en hun metabolieten wordt voor een urine matrix geopteerd in

de plaats van bloed, aangezien deze in een hogere concentratie voorkomen in urine en de

urine collectie minder invasief is dan een bloedafname. Om exogene AAS, met name

methyldienolone en methyltrienolone, op te sporen is er enkel een kwalitatieve bepaling

vereist doordat ze van nature niet in het lichaam voorkomen. De detectie van AAS gebeurt

meestal aan de hand van GC-MS waar een harde ionisatietechniek, elektron ionisatie (EI),

van toepassing is. Hierdoor treedt een sterke fragmentatie op, daar deze fragmenten ervoor

zorgen dat er bijkomende structurele informatie wordt verkregen over de te analyseren

component. Daarnaast wordt er ook gebruik gemaakt van vloeistofchromatografie

gecombineerd met tandem massaspectrometrie (LC-MS2), waarbij geen derivatisatie meer

vereist is en zo een snellere staalvoorbereiding toelaat. Bovendien wordt hierbij een zachte

ionisatietechniek, elektrospray ionisatie (ESI), gebruikt waardoor er minder fragmentatie

zal optreden en er informatie over het moleculair gewicht gewonnen zal worden. Bij deze

ionisatie zal er een verlies of winst van een H+ optreden, wat zich resulteert in een

positieve of negatieve modus van detectie. GC-MS en LC-MS2 zijn analytische technieken,

waarbij GC en LC zorgen voor de scheiding van de componenten en MS instaat voor de

detectie [28-30,33].

1.5.1 Gaschromatografie (GC)

GC is een scheidingstechniek waar de componenten zich zullen verdelen over twee fasen,

namelijk de mobiele fase en de stationaire fase. Het staal wordt via de mobiele fase, het

draaggas, over de stationaire fase geleid waarbij de componenten zich zullen verplaatsen

met een verschillende snelheid doorheen de kolom. De scheiding is gebaseerd op het

verschil in interactie met de stationaire fase en de vluchtigheid van de stof, wat resulteert in


28

verschillende retentietijden. Hoe groter de affiniteit voor de stationaire fase, hoe trager de

componenten van de kolom zullen elueren. Stoffen met eenzelfde affiniteit voor de

stationaire fase zullen worden gescheiden op basis van vluchtigheid, hierbij zal deze met

het laagste kookpunt eerst over de kolom geleid worden. Als draaggas wordt meestal het

inert gas helium gebruikt, dit is vrij van onzuiverheden zodat er geen interactie optreedt

met de componenten of de stationaire fase. De stationaire fase bij capillaire GC bestaat uit

een dunne vloeistoffilm gecoat op de binnenwand van een capillaire kolom van fused

silica. Naargelang de aard van de te scheiden componenten wordt een polaire of apolaire

kolom gebruikt [31,32].

De GC maakt gebruik van een temperatuurgradiënt, waarbij de injectietemperatuur,

kolomtemperatuur en detectortemperatuur geregeld zal worden in de oven van de GC.

Hierdoor zal men een optimale scheiding en verkorte analysetijd verkrijgen door de

temperatuur geleidelijk aan te verhogen. Bij de injectie van het staal vindt onmiddellijke

verdamping plaats in de liner, gelokaliseerd in een warme verdampingsruimte, waar een

hoge initiële temperatuur geldt. Het verdampte staal zal hierna door het draaggas worden

meegenomen naar de kolom onder een hoge druk, waarna de componenten zich zullen

verdelen tussen de stationaire en mobiele fase en gescheiden van de kolom komen. Deze

zullen door de detector omgevormd worden tot elektrische signalen en daarna door het

dataverwerkend systeem verwerkt worden tot een chromatogram (Figuur 10). De detector

die gebruikt zal worden is de massaspectrometer [31,32].

Figuur 10: Schematische voorstelling van de gaschromatograaf [32].

Derivatisatie van AAS met trimethylsilyl (TMS) op GC is nodig om chromatografische

eigenschappen van steroïden te verbeteren, waar binding van TMS zal plaatsvinden op

zowel hydroxyl- als ketogroepen. Hierdoor worden stoffen vluchtiger en thermisch

stabieler gemaakt, maar alsook zullen betere fragmenten worden verkregen. Door binding


29

van TMS (m/z 73) aan de ringstructuur van het steroïde zal het moleculair gewicht

wijzigen, waarbij er telkens een verlies van H+ zal optreden. Na derivatisatie met TMS van

methyldienolone en methyltrienolone worden moleculaire ion bekomen met respectievelijk

een m/z 430 (m/z 286 + (2 * m/z 72)) en een m/z 428 (m/z 284 + (2 * m/z 72)) (Figuur 11-

12) [28,33].

Figuur 11: Methyldienolone na derivatisatie.

Figuur 12: Methyltrienolone na derivatisatie.

1.5.2 Vloeistofchromatografie (LC)

LC is net zoals GC een scheidingstechniek waar de componenten zich zullen verdelen over

twee fasen, namelijk de mobiele fase en de stationaire fase. De mobiele fase is hierbij een

vloeistof. De scheiding berust op het verschil in interactie van de componenten met de

stationaire fase, waarbij de stationaire fase geadsorbeerd is in het poriënsysteem van het

poreus dragermateriaal, silica. De LC maakt gebruik van een verdelingsgradiënt die de

samenstelling zal wijzigen van de mobiele fase tijdens de scheiding. Hierdoor zullen de

componenten die gebonden zijn aan de stationaire fase deze interactie verliezen en van de

kolom zullen elueren met de mobiele fase [32,34,35].

Er wordt een onderscheid gemaakt tussen normale fase-chromatografie (NPLC) en

omgekeerde fase-chromatografie (RPLC) op basis van het verschil in polariteit van de

mobiele en stationaire fase. Bij NPLC is de stationaire fase meer polair dan de mobiele

fase, waar bij RPLC het omgekeerde geldt. RPLC is de meest gebruikte

vloeistofchromatografische scheidingstechniek bestaande uit een apolaire stationaire fase

van silica gemodificeerd met lange C-ketens zoals C-18 en een mobiele fase van

water/methanol [32,35].

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

Si

Si O

CH3 O

H

H

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

Si

Si O

CH3 O

H

H


30

1.5.3 Massaspectrometrie (MS)

MS is een detectiemethode die gebaseerd is op de ionisatie van componenten, waardoor

scheiding van ionen volgens hun m/z wordt verkregen [32,33]. Om de koppeling te maken

tussen de scheidingstechniek en de massaspectrometer is een interface nodig die de flow

van de mobiele fase en zo het drukverschil aanpast aan de capaciteit van de

massaspectrometer, waar vacuüm omstandigheden gelden. Daarna komen de componenten

in de ionenbron terecht, waarbij ionisatie zal plaatsvinden. Hierbij zullen ionen gevormd

worden door deze te bombarderen met elektronen. Op deze manier wordt een elektron uit

de molecule geslagen, waardoor positief geladen ionen bekomen worden [33].

De massa-analysator komt na de ionenbron, waar de scheiding van ionen zal plaatsvinden.

Hierbij worden de ionen gesorteerd volgens hun m/z verhouding door middel van een

elektromagnetisch veld binnenin de quadrupool. De quadrupool analysator bestaat uit vier

evenwijdige cilindrische staven, waar in elk paar tegenoverliggende staven een spanning

wordt aangebracht. Over het ene paar staven wordt een gelijkspanning aangelegd en over

het andere paar een wisselspanning. Afhankelijk van de spanning van dit elektrisch veld

worden ionen geselecteerd met een bepaalde m/z waarde en zullen deze in stabiele

oscillerende bewegingen getransporteerd worden naar de detector. De ionen die minder

stabiel bewegen in het elektrisch veld zullen de detector niet bereiken. De spanning op de

staven kan men variëren in de tijd waardoor een breed spectrum aan m/z waarden wordt

verkregen (Figuur 13). De quadrupool massa-analysator kan op twee manieren werken

namelijk in full scan of selected ion monitoring (SIM). In de full scan mode wordt het

volledig m/z gebied geanalyseerd en bij SIM worden enkel geselecteerde ionen

gedetecteerd [33,36].

Figuur 13: Quadrupool analysator [36].


31

De gescheiden ionen zullen aan de hand van een elektron multiplier gedetecteerd worden.

Hierbij zullen de ionen invallen op een fotokathode waardoor elektronen vrijgemaakt

worden. Deze zullen zo op een tweede oppervlak invallen en opnieuw elektronen

vrijmaken die tot een signaal omgezet worden. Dit is een herhaaldelijk proces om het

signaal te versterken. Dit verkregen signaal is evenredig met het aantal ionen die de

detector bereiken [33].

Een tandem MS (MS2) of triple quadrupool kan ook gebruikt worden als

massaspectrometer. Deze bestaat uit drie quadrupolen die na elkaar geplaatst worden, twee

massaspectrometer quadrupolen en een collisie cel die zich tussen de twee andere

quadrupolen bevindt. In de eerste quadrupool worden precursorionen geselecteerd met een

bepaalde m/z. De collisie cel die hierop volgt zal de geselecteerde ionen fragmenteren door

botsing met het collisiegas. De derde quadrupool laat enkel de geselecteerde productionen

door voor detectie in het geval van single reaction monitoring (SRM) en precursor ion

scan. Hierbij zullen ionen met een m/z 77, 91 en 105 geselecteerd worden, daar deze ionen

in alle anabole steroïden voorkomen. Afhankelijk van de gekozen scan mode worden

quadrupool 1 en quadrupool 3 in full scan of SIM gezet, zodat respectievelijk alle

geïoniseerde moleculen worden doorgelaten of enkel de ionen met een welbepaalde m/z

waarde. Bij de product ion scan worden precursorionen geselecteerd in de eerste

quadrupool, waarna alle fragmentionen die gevormd werden in de collisie cel gedetecteerd

worden (Figuur 14) [35,37,38].

Figuur 14: Analysemethoden triple quadrupool MS.


32

1.6 In vivo en in vitro technieken

Zoals beschreven (zie 1.3) is de lever een van de belangrijkste organen die

verantwoordelijk is voor de metabolisatie van AAS. Dit orgaan is voornamelijk betrokken

bij de farmacokinetiek en wordt bepaald door ADME (absorptie, distributie, metabolisatie

en eliminatie) waar in dit onderzoek de nadruk ligt op de metabolisatie. De componenten

worden na omzetting in de lever uitgescheiden in de urine. Omwille van ethische redenen

is het gebruik van gezonde menselijke vrijwilligers uitgesloten, waardoor men op zoek

gaat naar alternatieven zoals in vivo en in vitro technieken [24,39].

1.6.1 In vivo: het muismodel

Als diermodel wordt er gebruik gemaakt van chimere muizen die een gehumaniseerde

lever bevatten, namelijk homozygote urokinase-type plasminogen activator/severe

combined immunodeficiency (uPA+/+-SCID) muizen. Deze zijn afkomstig van het centrum

voor vaccinologie (CEVAC) en werden oorspronkelijk als model voor de evaluatie van

vaccins tegen hepatitis B en C virus gebruikt. In voorgaande in vivo studies met dit in vivo

model werden specifieke humane metabolieten van steroïden teruggevonden, waardoor

deze gebruikt wordt om de humane metabolisatie na te bootsen in het kader van doping

bestrijding [23,24,40].

Heterozygote uPA+/--SCID muizen, in dit onderzoek niet-chimere muizen genoemd,

bevatten geen getransplanteerde humane hepatocyten, waardoor deze dienen als

controlegroep. Ze worden binnen hun generatie gekruist om tot homozygote uPA+/+-SCID

te komen [23,39].

De uPA+/+-SCID muizen zijn drager van het muis urokinase-type plasminogeen activator

(uPA) gen dat onder de controle staat van de muis albumine promotor. Deze homozygote

muizen zijn immunodeficiënte muizen (SCID) die lijden aan een chronische leverziekte,

veroorzaakt door een specifieke overexpressie in de lever van het uPA gen. Dit kan leiden

tot sterfte indien er fatale intestinale en abdominale bloedingen optreden. De aangetaste

parenchymcellen van de lever kunnen tot 90% vervangen worden met humane hepatocyten

door deze te transplanteren in de uPA+/+-SCID muizen, waardoor de leverziekte geheeld

wordt. Door de SCID mutatie van deze muizen zullen de getransplanteerde humane


33

hepatocyten niet afgestoten worden en dus immunologische tolerantie vertonen. De

humane hepatocyten zullen in de tweede week worden geïnjecteerd in de milt van

pasgeboren muizen. Deze worden via de bloedstroom van de milt naar de leverpoortader

gebracht, om in de lever terecht te komen waar verspreiding via diffusie in de hepatische

sinusoïden zal optreden. Hierna zal vermenigvuldiging plaatsvinden om zo de normale

leverfunctie te herstellen [14,23,39-41].

De concentratie aan humaan albumine die gemeten wordt in het plasma van de muis, is een

maat voor de hoeveelheid humane hepatocyten in de chimere lever. Hoe groter het gehalte

aan humaan albumine, hoe meer aangetaste parenchymcellen in de lever vervangen zijn

door humane hepatocyten en hoe meer het in vivo model de humane metabolisatie nabootst

[24,39].

1.6.2 In vitro: humane lever microsomen (HLM)

Als toepassing van een in vitro techniek worden HLM gebruikt in de studie om het

metabolisme van steroïden na te gaan. Deze levermicrosomen zijn membraanproteïnen

verpakt in vesikels afkomstig van het endoplasmatisch reticulum die CYP enzymen

bevatten en wordt bekomen na ultracentrifugatie van gehomogeniseerd leverweefsel. CYP

enzymen zijn grotendeels verantwoordelijk voor de fase I metabolisatie (zie 1.3.1). Alsook

is UGT als fase II enzymen (zie 1.3.2) aanwezig in de microsomen. Deze enzymen spelen

een belangrijke rol bij de biotransformatie. Om de metabolische activiteit van de CYP

enzymen te behouden, worden de microsomen bewaard op een lage temperatuur van -80°C

[20-22].

De enzymen in de HLM worden geactiveerd met een co-factor. NADPH is een

noodzakelijke co-factor voor de CYP activiteit, vandaar dat het NADPH regenererend

systeem wordt toegevoegd. Dit bestaat uit β-NADP, glucose-6-fosfaat en glucose-6-

fosfaat dehydrogenase. Hierbij zal NADPH gevormd worden uit NADP+ door gebruik te

maken van een enzymatische reactie van namelijk, glucose-6-fosfaat dehydrogenase in de

aanwezigheid van glucose-6-fosfaat als substraat [20-22,42].


34

1.6.3 Voor- en nadelen

De grootste voordelen van microsomen zijn hun lage kostprijs, eenvoud in gebruik en het

is een goedgedefinieerde in vitro techniek voor het onderzoek naar de metabolisatie van

stoffen. Door gebruik te maken van pooled HLM, afkomstig van verschillende individuen

als donoren, kan men de variatie in metabolisatie tussen mensen opvangen. Als nadeel

geldt dat microsomen echter niet geschikt zijn voor kwantitatieve metingen, doordat HLM

een aanrijking van CYP en UGT enzymen bevatten. Hierdoor zal er geen competitie

optreden tussen andere enzymen, wat zich wel in vivo voordoet. Hierdoor zal er een hogere

metabolisatie plaatsvinden in de microsomen dan in de in vivo situatie [20,22].

Het voordeel van proefdierexperimenten is dat de humane in vivo situatie meer wordt

nagebootst dan in vitro, waarbij er een onvolledige representatie geldt van de in vivo

situatie. Proefdierexperimenten worden uitgevoerd als vervanger van of model voor de

mens. Hierbij zijn er enkele bezwaren tegen in vivo studies, namelijk ethische,

economische als wetenschappelijke bezwaren. Als ethisch bezwaar geldt dat het proefdier

niet zomaar mag misbruikt worden voor de mens, daarvoor heeft men goedkeuring nodig

van de Ethische Commissie Dierproeven (ECD). In vivo studies hebben alsook een hoge

kostprijs, met name de aankoop, verzorging en infrastructuur van proefdieren. En de vraag

of het gevonden effect bij een proefdier hetzelfde is als bij de mens, ligt aan de basis van

het wetenschappelijk bezwaar. Dit laatste bezwaar kan weerlegd worden door gebruik te

maken van een muismodel met getransplanteerde humane levercellen [20,43].

Materiaal en methoden

35

2 Materiaal en methoden

2.1 Producten en reagentia

Referentiestandaard voor methyldienolone (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9-dien-3-on)

werd aangekocht bij het National Measurement Institute (Pymble, Australië).

Referentiestandaard voor methyltrienolone (17β-hydroxy-17α-methylestra-4,9,11-trien-3-

on) werd aangekocht bij Perkin Elmer (Waltham, Verenigde Staten). Als inwendige

standaard (IS) wordt 17α-methyltestosteron gebruikt die bekomen werd via Organon (Oss,

Nederland), alsook methandiënon (17β-hydroxy-17α-methylandrosta-1,4-dien-3-on) die

verkregen werd bij het National Measurement Institute (Pymble, Australië). Het enzym β-

glucuronidase afkomstig van Escherichia coli K12 is van de leverancier Roche Diagnostics

(Mannheim, Duitsland). N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) komt van

Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland) en ethaanthiol (C2H6S) is afkomstig van Acros

(Geel, België). Diethylether (C4H10O), methanol (CH3OH), aceton (C3H6O) en

natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) komen van Fisher Scientific (Loughborough, UK).

NADPH regeneratie systeem oplossing A en B, HLM pool en fosfaatbuffer pH 7,4 werden

aangekocht bij BD Biosciences (Franklin Lakes, Verenigde Staten). Phosphate buffered

saline (PBS) komt van GIBCO invitrogen (Gent, België). Natriumsulfaat (Na2SO4),

kaliumcarbonaat (K2CO3), dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat (Na2HPO4.2H2O),

natriumdiwaterstoffosfaat dihydraat (NaH2PO4.H2O), ammoniumiodide (NH4I) en

azijnzuur (HAc) zijn afkomstig van Merck (Darmstadt, Duitsland). Ethanol (C2H5OH) en

ammoniumacetaat (NH4Ac) werden aangekocht bij Biosolve (Valkenswaard, Nederland).

Methanol HPLC grade (CH3OH) en water HPLC grade (H2O) komen van J.T. Baker

(Center Valley, Verenigde Staten). Supplement methyldienolone, M-DIEN is van

Underground Laboratories (onbekend).

De gassen die gebruikt worden zijn helium α-gas en zuurstofvrije stikstofgas (OFN) van de

leverancier Air Liquide (Aalter, België).

2.2 Instrumentatie

2.2.1 Indamptoestellen

Reacti-Therm IIITM Heating Module (Triple block) van Pierce (Rockford, Verenigde

Staten) bevat drie verwarmde aluminium blokken bij een temperatuur van 40°C en aan de


36

hand van zuurstofvrije stikstofgas (N2) worden de stalen ingedampt. Bij de TurboVap LV

van Caliper Life Sciences (Hopkinton, Verenigde Staten) worden de stalen ingedampt met

OFN in een warmwaterbad van 60°C. De Concentrator 5301 van Eppendorf (Rotselaar,

België) is een uitdampcentrifuge, daar de Eppendorftubes stalen worden ingedampt onder

vacuüm bij een temperatuur van 60°C.

2.2.2 Incubatietoestellen

Met behulp van de Thermomixer comfort van Eppendorf (Rotselaar, België) worden de

Eppendorftubes verwarmd bij een temperatuur van 37°C. In de Heraeus Oven van Thermo

Scientific (Aalst, België) worden de stalen geïncubeerd bij een temperatuur van 80°C ±

5°C. In de Heraeus Oven van Thermo Electron Corporation (Waltham, Verenigde Staten)

worden de stalen geïncubeerd bij een temperatuur van 56°C ± 5°C.

2.2.3 Centrifuges

De Universal 32R van Hettich (Tuttlingen, Duitsland) is een microcentrifuge, daar de

Eppendorftubes gecentrifugeerd worden bij 12800 rpm op een temperatuur van 4°C

gedurende vijf minuten. Bij de Centrifuge 5810 van Eppendorf (Rotselaar, België) worden

de stalen gecentrifugeerd bij 4000 rpm gedurende vijf minuten.

2.2.4 Overige

Als roltoestel wordt de RM5 gebruikt van CAT (Paso Robles, Verenigde Staten). De

Vortex mixer SI-100 is afkomstig van MRC-Laboratory Equipment (Holon, Israël). De

bovenweger PB1502-L komt van Mettler-Toledo (Zaventem, België).

2.2.5 GC-MS

De gebruikte gaschromatograaf 6890 GC is van Agilent Technologies (Palo Alto,

Verenigde Staten) met een 15m J&W HP Ultra 1 capillaire kolom bestaande uit

dimethylsilicone van Agilent. De capillaire kolom heeft een interne diameter van 250µm

en een filmdikte van 0,25µm. Als draaggas wordt helium gebruikt met een constante flow

van 1mL/min. De GC is gekoppeld aan de MS en is uitgerust met een autosampler, waarbij

het injectievolume 1µL bedraagt via splitless methode. Als oventemperatuur wordt als

initiële temperatuur 120°C ingesteld gedurende 0,10 min, waarna de temperatuur toeneemt


37

met 70°C/min tot 210°C en wordt aangehouden gedurende 0,10 min. Er wordt opgewarmd

met 7°C/min tot 260°C om vervolgens tot een finale temperatuur van 320°C te komen met

een snelheid van 30°C/min, waarbij deze temperatuur 0,50 min wordt aangehouden. Hierna

daalt de temperatuur tot 50°C. De totale run duurt telkens 11,13 min. Bij de analyse wordt

een full scan massaspectra opgenomen.

2.2.6 LC-MS2

FinniganTM TSQ Quantum Discovery MAXTM van Thermo Electron Corporation

(Waltham, Verenigde Staten) wordt als vloeistofchromatograaf gebruikt. Deze maakt

gebruik van een C-18 kolom van SunFireTM met als interne diameter 3,5µm, lengte 50mm

en breedte 2,1µm. Als mobiele fase wordt HAc 0,1% 1mM NH4Ac in H2O (A) en HAc

0,1% 1mM NH4Ac in CH3OH (B) gebruikt met een constante flow van 250µL/min. Het

gradiëntprogramma wordt als volgt ingesteld (Tabel 3).

Tabel 3: Gradiëntprogramma.

Solvent A Solvent B 0,0 min 70% 30% 1,5 min 70% 30% 8,0 min 45% 55% 15,0 min 45% 55% 29,5 min 5% 95% 30,5 min 5% 95% 31,0 min 70% 30% 35,0 min 70% 30%

De totale run duurt telkens 35,0 min. De LC is gekoppeld aan de triple quadrupool MS en

is eveneens uitgerust met een autosampler, waarbij het injectievolume 25µL bedraagt. Het

collisiegas in de collisie cel is stikstofgas. Als scan modus wordt geopteerd voor precursor

ion scan.

2.3 Referentiestandaarden

Er wordt 10µL van de zuivere referentiestandaarden met een concentratie van 100µg/mL,

die opgelost zijn in methanol, overgebracht in een kleine sovirelbuis. Hieraan wordt er

100µL methandiënon toegevoegd als IS met een concentratie van 1µg/mL, die fungeert als


38

controle voor de extractie. Deze worden drooggedampt onder een stikstofstroom en

vervolgens worden de stappen analyse met GC-MS (zie 2.7) of LC-MS2 (zie 2.8) gevolgd.

2.4 Supplement methyldienolone

Het labo beschikt over M-DIEN, het voedingssupplement dat volgens het label

methyldienolone zou bevatten. Er worden vijf capsules ad random van het supplement M-

DIEN van Underground Laboratories gekozen om hieruit 1g van het poeder uit de capsules

af te wegen in een proefbuis en te homogeniseren. Hierna wordt er 5mL methanol

toegevoegd om vervolgens de proefbuis 1 uur te laten rollen en te centrifugeren. Er wordt

100µL van de methanolfase in een proefbuis overgebracht en hieraan 100µL methandiënon

(IS) toegevoegd met een concentratie van 1µg/mL. Dit staal werd geanalyseerd en alsook

na een extractiestap (zie 2.5) om de inhoud van het supplement na te gaan.

2.5 Staalvoorbereiding humane lever microsomen

Een batch van HLM, blanco, negatieve en positieve controle (microsomen aangerijkt met

een gekend bestudeerd steroïde) wordt uitgevoerd. Er wordt 50µL van het anabool steroïde

met een concentratie van 100µg/mL in de HLM en blanco controle Eppendorftube

overgebracht, waarna de stalen worden drooggedampt in de uitdampcentrifuge. Aan de

reeks wordt er 226µL 0,5M fosfaatbuffer pH 7,4 toegevoegd. Vervolgens wordt er 2,5µL

ethanol toegevoegd aan de HLM, blanco en negatieve controle en 2,5µL methandiënon

(4mg/mL) toegevoegd aan de positieve controle. 12,5µL oplossing A en 2,5µL oplossing B

van het NADPH regenererend systeem wordt toegevoegd aan de batch. Vervolgens worden

de stalen geïncubeerd bij 37°C gedurende 5 minuten. De microsomen worden ondertussen

op ijs ontdooid, waarna deze gevortexd worden om 6,5µL microsomen over te brengen aan

de HLM, negatieve en positieve controle. Aan de blanco controle wordt er 6,5µL

fosfaatbuffer pH 7,4 toegevoegd. Vervolgens worden de stalen goed gevortexd en

geïncubeerd bij 37°C gedurende 4u. Als stopreactie wordt er aan de stalen 250µL ijskoude

methanol toegevoegd, waarna deze gevortexd en in een ijsbad geplaatst worden gedurende

15 minuten om vervolgens te centrifugeren. Na centrifugatie wordt 400µL van het

supernatans afgenomen en in een proefbuis overgebracht. Aan alle stalen wordt er 100µL

methandiënon (IS) toegevoegd met een concentratie van 1µg/mL, met uitzondering van de

positieve controle waar er 50µL 17α-methyltestosteron 2µg/mL als IS wordt toegevoegd


39

die fungeren als controle voor de extractie. De stalen worden vervolgens drooggedampt

onder een stikstofstroom. Indien de reeks niet onmiddellijk kan verder gezet worden,

worden de stalen na deze stap bewaard in de koelkast. Nadat de stalen zijn ingedampt

wordt er 1mL carbonaatbuffer pH 9,5 toegevoegd. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE)

wordt uitgevoerd met 5mL diethylether door de proefbuizen 20 minuten te laten rollen en

vervolgens te centrifugeren. Na centrifugatie wordt de organische (bovenste) fractie

afgenomen en in een kleine proefbuis overgebracht. Deze organische fractie wordt

gedroogd door toevoegen van een schep Na2SO4 en vervolgens drooggedampt onder een

stikstofstroom. Hierna worden de stappen analyse met GC-MS of LC-MS2 gevolgd. Indien

de reeks niet onmiddellijk geanalyseerd kan worden op GC-MS of LC-MS2, worden de

stalen na deze stap bewaard in de koelkast.

2.6 Staalvoorbereiding excretie-urines

De urinestalen zijn afkomstig van excretie studies met muizen, waarbij het gebruik van

proefdieren voor onderzoek in het DoCoLab werd goedgekeurd door de ECD van de

Universiteit Gent (ECD 06/09). 24u tot 48u voor de toediening van de anabole steroïden

wordt de urine gecollecteerd, daar dit fungeert als blanco urinestaal. Na toediening aan de

muizen via orale gavatie wordt 24u tot 48u muizenurine verzameld, zodat alle eventueel

aanwezige metabolieten uitgescheiden zijn in de urine. De muizen worden hiervoor in

metabole kooien geplaats om een continue opvang van hun urine te garanderen. Er wordt

slechts om de 24u urine gecollecteerd, doordat slechts een beperkte hoeveelheid urine

wordt geproduceerd door de muizen.

Om de dosis te bepalen van methyldienolone en methyltrienolone werd op internetfora van

bodybuilders een dagelijkse hoeveelheid voor de mens nagegaan, waarbij 3mg/dag voor

methyldienolone en 0,5mg/dag voor methyltrienolone werd teruggevonden. Er wordt

hierbij rekening gehouden met het verschil in gewicht tussen de mens met een gemiddeld

gewicht van 70kg en een muis van 20g. Door de snelle metabolisatie bij muizen wordt de

dosis met een factor tien vermenigvuldigd, om een voldoende hoge dosis te kennen.

Methyldienolone Methyltrienolone

!!"/!"#!""""!/!"!

× 10 = 8,57 × 10-3mg/dag

8,57µg/dag

!,!!"/!"#!""""!/!"!

× 10 = 1,43 × 10-3mg/dag

1,43µg/dag


40

Aan de hand van trial and error werd de dosis telkens verhoogd gaande van 10µg/muis

voor methyldienolone en 1,6µg/muis voor methyltrienolone tot een detecteerbaar niveau

van het steroïde en de gevormde metabolieten. De finale dosisbepaling voor

methyldienolone bedraagt 200µg/muis en voor methyltrienolone 160µg/muis, waarbij

telkens 200µL van de toedieningsoplossing werd toegediend. De toedieningsoplossing

voor methyldienolone en methyltrienolone wordt bekomen door respectievelijke 500µL

methyldienolone (1mg/mL) en 4mL methyltrienolone (100µg/mL) droog te dampen,

waarna 100µL ethanol (20%) wordt toegevoegd en aangelegd tot 500µL met 400µL PBS

(80%) waar tussendoor wordt gevortexd. De toedieningsoplossingen worden bewaard in de

koelkast.

Eens alle excretie-urines bekomen zijn, is een extractie stap vereist om de eventueel

aanwezige AAS te detecteren. Hiervoor wordt 0,5mL van de urinestalen in een proefbuis

overgebracht. Bij elke reeks wordt telkens ook een systeem blank en toedieningsoplossing

meegenomen ter controle. Aan de systeem blank wordt er 0,5mL gedemineraliseerd water

toegevoegd in een proefbuis. Alsook wordt 200µL van de toedieningsoplossing

overgebracht in een proefbuis ter controle van de aanwezigheid van het steroïde. Aan alle

stalen wordt er 100µL methandiënon (IS) toegevoegd met een concentratie van 1µg/mL,

die fungeert als controle voor de extractie. Hierna wordt er 1mL fosfaatbuffer pH 7,0

toegevoegd. Enzymatische hydrolyse van glucuronide-groepen wordt uitgevoerd met

50µL β-glucuronidase (E. coli) gedurende 1u30 bij 56°C ± 5°C. Na de stalen te laten

afkoelen tot kamertemperatuur wordt er 1mL carbonaatbuffer pH 9,5 toegevoegd. LLE

wordt uitgevoerd met 5mL diethylether door de proefbuizen 20 minuten te laten rollen en

vervolgens te centrifugeren. Na centrifugatie wordt de organische (bovenste) fractie

afgenomen en in een kleine proefbuis overgebracht. Deze organische fractie wordt

gedroogd door toevoegen van een schep Na2SO4 en vervolgens drooggedampt onder een

stikstofstroom. Hierna worden de stappen analyse met GC-MS of LC-MS2 gevolgd (zie 2.7

of 2.8). Indien de reeks niet onmiddellijk geanalyseerd kan worden op GC-MS of LC-MS2,

worden de stalen na deze stap bewaard in de koelkast.


41

2.7 Analyse met GC-MS

Voor de analyse met GC-MS worden de stalen gederivatiseerd met 100µL TMS-

derivatiseringsoplossing (REA19). De TMS-derivatiseringsoplossing bevat MSTFA,

ammoniumiodide (NH4I) en ethaanthiol. De stalen worden goed gevortexd en geïncubeerd

bij 80°C ± 5°C gedurende 1u. Na incubatie wordt 50µL van de gederivatiseerde oplossing

overgebracht in een glazen vial met insert en afgesloten met een cap. Bij elke batch wordt

er telkens ook een spoel meegenomen voor en na de reeks, bestaande uit 150µL TMS-

derivatiseringsoplossing. Na analyse worden de vials bewaard in de koelkast, indien

heranalyse nodig is.

2.8 Analyse met LC-MS2

Voor de analyse met LC-MS2 worden de stalen opgelost in 100µL solvent, methanol/water

(50:50) en goed gevortexd. De oplossing wordt volledig overgebracht in een plastieken

vial en afgesloten met een cap, waarna tegen de vial wordt getikt om de lucht onderaan te

verwijderen. Na analyse worden de vials bewaard in de koelkast, indien heranalyse nodig

is.

Resultaten en discussie

42

3 Resultaten en discussie

3.1 Analyse van referentiestandaarden

3.1.1 Referentiestandaard van methyldienolone op GC-MS

Door analyse van de referentiestandaard wordt het massaspectrum en de retentietijd (RT)

van methyldienolone bepaald. Figuur 15 geeft het chromatogram weer van de

referentiestandaard van methyldienolone met IS, waaruit de RT afgeleid kan worden. In

Figuur 16 en 17 worden de massaspectra weergegeven. De RT van de verschillende

pieksignalen in de referentiestandaard methyldienolone met bijhorende ionen worden

weergegeven in Tabel 4.

De full scan spectra worden beoordeeld voor kwalitatieve analyse aan de hand van het

moleculair ion (M) en fragmentionen, waarbij gebruik gemaakt wordt van extracted ion

chromatogram (EIC). Fragmentionen ontstaan door afsplitsing van een methylgroep (M-

15) en door het verlies van TMS-OH ((CH3)3SiOH) (M-90), hierbij zijn alsook

fragmentionen met M-15-90 waarneembaar in de massaspectra. Deze fragmenten worden

veelal waargenomen bij de detectie van steroïden. Het ion m/z 73 komt overeen met TMS

afkomstig van de derivatisatie, waardoor deze niet specifiek is voor een bepaalde

component. Door de aanwezigheid van een 17-methylgroep in TMS gederivatiseerde 17-

hydroxysteroïden ontstaat er een fragmention met m/z 143. Methandiënon (m/z 444), die

gebruikt wordt als IS, heeft bovendien een 1,4-dien-3-on structuur waardoor het

fragmention met m/z 206 duidelijk waarneembaar is in het massaspectrum [29]. Dit is van

toepassing op alle massaspectra bekomen via GC-MS.

Figuur 15: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS en derivatisatieprobleem (MD”, zie verder)

op GC-MS gebruik gemaakt van EIC.

IS

MD

MD”


43

Figuur 16: Full scan massaspectrum van methandiënon (IS).

Figuur 17: Full scan massaspectrum van methyldienolone (MD).

Figuur 18: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van methyldienolone (MD”).

Op het chromatogram van de referentiestandaard methyldienolone (Figuur 15) is er na de

piek van methyldienolone (MD) een signaal (MD”) aanwezig m/z 428 en met als

fragmentionen m/z 413, 338 en 323 (Figuur 18). Door het geconjugeerd systeem van

methyldienolone (m/z 430) op GC-MS wordt door derivatisatie alsook een piek verkregen

met m/z 428. Verder in de bachelorproef wordt het derivatisatieprobleem ook bij de

metaboliet van de component vastgesteld. Dit derivatisatieprobleem, waar een

vermindering van m/z 2 optreedt bij het moleculair ion en de fragmentionen, geldt bij alle

bekomen resultaten van methyldienolone op GC-MS en werd reeds eerder beschreven [44].

415

340

429

413

338

354

73

206

339

444

73

143

325

430

73

143

323

428


44

De m/z 428 kan ook overeenkomen met het moleculair ion van methyltrienolone. Er werd

geprobeerd om de referentiestandaard van methyltrienolone te analyseren op GC-MS (m/z

428) na derivatisatie, waarbij detectie niet mogelijk was door de aanwezigheid van een

sterk geconjugeerd systeem. Uit verdere analyse met LC-MS2 is gebleken dat de

referentiestandaard voor methyldienolone zuiver is, waardoor besloten kan worden dat het

te wijten is aan de derivatisatie.

Tabel 4: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra referentiestandaard methyldienolone.

Steroïde Retentietijd (min) Moleculair ion (m/z) Fragmentionen (m/z) Methandiënon (IS) 8,074 444 429- 354- 339

Methyldienolone (MD) 8,184 430 415- 340- 325 3.1.2 Referentiestandaarden van methyldienolone en methyltrienolone op LC-MS2

Naast methyldienolone wordt alsook methyltrienolone gedetecteerd op LC-MS2. De

analyse verloopt in positieve modus, waarbij het moleculair ion geprotoneerd wordt

[M+H]+. Hierdoor zullen methyldienolone (m/z 286) en methyltrienolone (m/z 284)

gedetecteerd worden op LC-MS2 in positieve mode met een m/z van respectievelijk 287 en

285. Zoals eerder vermeld wordt de analyse beoordeeld op drie niveaus van scan events,

waarbij de ionen m/z 77, 91 en 105 worden geselecteerd ter detectie van steroïden. Het

pieksignaal moet in het chromatogram op elk niveau van m/z aanwezig zijn op eenzelfde

RT om als steroïde of metaboliet beschouwd te worden en niet in het chromatogram van de

blanco controle voorkomen. Dit is van toepassing op alle analyses via LC-MS2.

3.1.2.1 Referentiestandaard van methyldienolone op LC-MS2

Door analyse van de referentiestandaard wordt het massaspectrum en de RT van

methyldienolone bepaald, waarbij de relatieve retentietijd (RRT) meer van belang is op

LC-MS2 doordat de RT verschillend is bij iedere analyse. De RRT zal verder in de

bachelorproef worden bestudeerd (zie 3.6). Figuur 19 geeft het chromatogram weer van de

referentiestandaard van methyldienolone met IS, waaruit de RT afgeleid kan worden. In

Figuur 20 en 21 worden de massaspectra weergegeven. De RT van de verschillende

pieksignalen in de referentiestandaard methyldienolone met bijhorend ion worden



45

Figuur 19: Chromatogram referentiestandaard methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2.

Figuur 20: Massaspectrum van methandiënon (IS).

Figuur 21: Massaspectrum van methyldienolone (MD).

Tabel 5: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyldienolone.

Steroïde Retentietijd (min) Moleculair ion (m/z) Methandiënon (IS) 11,62 301

Methyldienolone (MD) 11,42 287 3.1.2.2 Referentiestandaard van methyltrienolone op LC-MS2

Door analyse van de referentiestandaard wordt het massaspectrum en de RT van

methyltrienolone bepaald. Figuur 22 geeft het chromatogram weer van de

referentiestandaard van methyltrienolone met IS, waaruit de RT afgeleid kan worden. In

Figuur 23 wordt het massaspectrum weergegeven van methyltrienolone, daar in Figuur 20

reeds het massaspectrum van de IS werd geïllustreerd. De RT van de verschillende

D:\RESEARCH\...\refmethyldienolone 3/31/2014 5:33:03 PM refmethyldienolone

RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0

50

10011.42

11.62

26.3612.35

3.36 10.48 15.12 26.779.97 20.38 28.6615.64 21.77 31.9024.1017.635.10 6.081.5811.41

12.31 13.7110.53 20.5715.08 17.499.933.38 22.44 24.35 26.06 31.6028.867.915.271.7511.40

11.9710.47 15.08 17.489.95 26.8318.29 21.26 31.2124.5023.02 29.423.37 5.52 8.091.90

NL: 3.62E7TIC F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS refmethyldienolone



refmethyldienolone #1323 RT: 11.42 AV: 1 SB: 110 9.72-11.07 , 11.83-13.32 NL: 2.01E7F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000]

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

287.45

288.67

291.18

292.69295.84269.31 340.00319.40273.92 359.01334.66261.46 347.55305.95

D:\RESEARCH\...\refmethanedienone 3/20/2014 2:14:09 PM refmethanedienone

RT: 0.00 - 33.02

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100R

elat

ive

Abu

ndan

ce

0

50

10012.10

26.73

12.9327.205.32 16.123.37 28.8624.37 31.4121.13 22.115.47 13.60 16.38 19.479.607.892.20

12.09

12.9215.073.36 22.91 27.895.54 21.2216.08 26.00 31.9228.915.67 18.949.52 11.131.991.18

12.03

12.9616.153.35 26.04 27.16 31.495.22 30.7724.4322.365.46 16.3915.97 21.509.486.91 9.84

1.62

NL: 1.50E7TIC F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS refmethanedienone



refmethanedienone #1395 RT: 12.07 AV: 1 SB: 330 12.31-16.23 , 7.13-11.77 NL: 6.08E6F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000]

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

301.36

302.35

303.47

304.44283.36

307.51285.49 333.85263.53 344.54322.21299.24 367.99279.39 382.35253.21 389.26

D:\RESEARCH\...\refmethyldienolone 3/31/2014 5:33:03 PM refmethyldienolone

RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0

50

10011.42

11.62

26.3612.35

3.36 10.48 15.12 26.779.97 20.38 28.6615.64 21.77 31.9024.1017.635.10 6.081.5811.41

12.31 13.7110.53 20.5715.08 17.499.933.38 22.44 24.35 26.06 31.6028.867.915.271.7511.40

11.9710.47 15.08 17.489.95 26.8318.29 21.26 31.2124.5023.02 29.423.37 5.52 8.091.90




refmethyldienolone #1323 RT: 11.42 AV: 1 SB: 110 9.72-11.07 , 11.83-13.32 NL: 2.01E7F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000]

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

287.45

288.67

291.18

292.69295.84269.31 340.00319.40273.92 359.01334.66261.46 347.55305.95

IS

MD

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)

Abu

ndan

ce (%

)


46

pieksignalen in de referentiestandaard methyltrienolone met bijhorend ion worden


Figuur 22: Chromatogram referentiestandaard methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2.

Figuur 23: Massaspectrum van methyltrienolone (MT).

Tabel 6: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra referentiestandaard methyltrienolone.


Methyltrienolone (MT) 11,30 285

3.2 Analyse van het supplement methyldienolone

Voorafgaand aan het protocol beschreven in 2.4 werden verscheidene experimenten

uitgevoerd naargelang het verkregen resultaat om de inhoud van het M-DIEN supplement

na te gaan. Hierbij werd eerst en vooral een bepaalde hoeveelheid methanolfase

geanalyseerd, waarna de hoeveelheid van de toegevoegde methanolfase verhoogd werd.

Bijkomend werd een extractie hierop uitgevoerd en alsook een dubbele extractie om het

staal extra op te zuiveren. Bij dit laatste werden de ionen van de hoofdcomponent niet meer

waargenomen in het chromatogram. Tot slot werd een standard operating procedure

(SOP) gevolgd die specifiek geldt voor voedingssupplementen (ANAL-90.G: Kwalitatieve

bepaling van anabolica in voedingssupplementen met behulp van GC-MS). De ionen van

de hoofdcomponent werden hierbij alsook niet waargenomen in het chromatogram, waarbij

D:\RESEARCH\...\refmethyltrienolone 3/31/2014 6:08:55 PM refmethyltrienolone

RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0

50

10011.29

11.6826.40

12.43 26.663.37 3.55 27.6412.95 20.616.28 15.29 30.8321.967.21 24.408.85 17.520.7011.28

11.67

12.483.36 14.013.49 6.32 15.336.50 20.868.76 21.87 27.6125.4019.36 30.8529.712.640.5911.30

11.743.36 12.544.55 6.39 15.37 26.877.20 8.83 22.98 28.35 31.4725.3419.9718.102.400.94

NL: 2.26E7TIC F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS refmethyltrienolone



refmethyltrienolone #1304 RT: 11.28 AV: 1 SB: 143 9.49-10.98 , 11.95-14.15 NL: 1.42E7F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000]

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

285.41

286.60

287.57288.69

290.98267.19 275.06 300.04 311.07 318.19256.42 353.85330.47 379.45

D:\RESEARCH\...\refmethyltrienolone 3/31/2014 6:08:55 PM refmethyltrienolone

RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

50

10011.29

11.6826.40

12.43 26.663.37 3.55 27.6412.95 20.616.28 15.29 30.8321.967.21 24.408.85 17.520.7011.28

11.67

12.483.36 14.013.49 6.32 15.336.50 20.868.76 21.87 27.6125.4019.36 30.8529.712.640.5911.30

11.743.36 12.544.55 6.39 15.37 26.877.20 8.83 22.98 28.35 31.4725.3419.9718.102.400.94




refmethyltrienolone #1304 RT: 11.28 AV: 1 SB: 143 9.49-10.98 , 11.95-14.15 NL: 1.42E7F: + c ESI Full pr 91.000 [250.000-400.000]

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

285.41

286.60

287.57288.69

290.98267.19 275.06 300.04 311.07 318.19256.42 353.85330.47 379.45

Abu

ndan

ce (%

) MT

IS A

bund

ance

(%)


47

het best verkregen resultaat werd bekomen door 100µL van de methanolfase te extraheren.

Door analyse van het supplement op GC-MS en LC-MS2 wordt de aanwezigheid van

methyldienolone nagegaan.

Figuur 24: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op GC-MS.

Figuur 25: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op GC-MS gebruik gemaakt van EIC.

Op het chromatogram van het supplement methyldienolone (Figuur 24) zijn veel andere

pieken aanwezig dan de eigenlijke component. Hierbij hebben verschillende studies reeds

aangetoond dat wat vermeld staat op het label van het supplement veelal niet overeenstemt

met de inhoud ervan, waardoor vele andere stoffen en vulmiddelen worden waargenomen

in het chromatogram. Het supplement kan hierdoor verboden middelen bevatten, die niet

op het label vermeld staan [45]. De IS werd bij herhaaldelijke experimenten in het

chromatogram niet waargenomen, daar deze wordt verdrongen door de aanwezigheid van

de vele andere stoffen. Door de hoge achtergrond van de capsules wordt methyldienolone

(MD), als hoofdcomponent van het supplement, op een RT van 8,205 min moeilijk

gedetecteerd in het chromatogram en bevat een uiterst lage abundantie in vergelijking met

de andere pieksignalen (Figuur 25). De RT van methyldienolone is door de hoge

achtergrond alsook opgeschoven. In Figuur 17 werd het massaspectrum van

MD

MD


48

methyldienolone reeds weergegeven, waarbij er alsook een lagere abundantie geldt in het

massaspectrum van het supplement methyldienolone.

Figuur 26: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) met onbekende component (pijl, zie verder) op LC-MS2.

Figuur 27: Chromatogram supplement methyldienolone (MD) op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met m/z 287.

Op het chromatogram na LC-MS2 analyse van het supplement methyldienolone (Figuur

26) is methyldienolone (MD), als hoofdcomponent van het supplement, op een RT van

13,18 min moeilijk waarneembaar in het chromatogram (Figuur 26-27). De IS is hierbij

alsook niet zichtbaar in het chromatogram en wordt dus mogelijks verdrongen door de

aanwezigheid van de vele andere stoffen. Op het chromatogram in Figuur 27 is er alsook

een piek aanwezig op een RT van 8,36 min met als ion m/z 287, waarbij dit signaal niet

dezelfde piekverhouding en massaspectrum vertoont als de referentie methyldienolone en

dus niet wordt gezien als de hoofdcomponent. In Figuur 21 werd het massaspectrum van

methyldienolone reeds weergegeven.

In Figuur 26 wordt op het chromatogram van het supplement methyldienolone op LC-MS2

een intens pieksignaal waargenomen op een RT van 15,70 min die werd aangeduid met een

pijl, waarbij het ion met m/z 317 wordt weergegeven in het massaspectrum (Figuur 28).

Deze piek komt alsook in het chromatogram op GC-MS voor op een RT van 7,559 min die

werd aangeduid met een pijl (Figuur 24), waarbij het moleculair ion met m/z 532 wordt

capsulmethyldie100extract 3/13/2014 12:24:31 PM capsulmethyldie100extract

RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0

50

10015.70

27.6424.9416.40 22.377.55 12.227.24 12.79 28.7521.499.843.37 4.62 17.39 30.053.1415.74

24.9612.227.54 16.477.28 22.369.36 12.79 28.7721.489.83 19.074.533.36 26.49 28.98 32.200.1415.68

24.95

28.7612.21 16.107.56 24.6422.829.357.27 14.286.16 21.5219.6011.904.26 26.513.48 29.10 30.840.08

NL: 1.51E8TIC F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS capsulmethyldie100extract



capsulmethyldie100extract #1815 RT: 15.70 AV: 1 SB: 198 12.62-15.07 , 16.23-18.94 NL: 5.60E7F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000]

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

317.43

318.58

319.61281.31 334.37320.57321.49282.38 335.47

299.35284.58 324.32 337.33313.08265.47253.31 345.51 367.38271.61 358.48 377.79 392.30


RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

50

10024.89

13.1828.78

24.738.36 24.4015.62

28.9423.3015.9415.55 27.6122.24 30.1312.228.77 20.246.053.48 6.361.3224.9813.18

28.8024.62

8.32 24.2815.7423.19 29.0825.3021.1716.11 30.6212.24 13.544.71 9.187.053.833.36

28.7425.0013.14

24.87 28.7928.898.34 24.04

22.87 29.2325.2415.87 21.0812.96 32.095.90 16.079.667.875.723.610.08

NL: 1.75E6Base Peak m/z= 286.50-287.50 F: + c ESI Full pr 77.000 [250.000-400.000] MS capsulmethyldie100extract




250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

287.32

288.31

289.35

291.50

292.85331.58327.08279.49 350.85300.40261.93 357.88 384.94363.41 377.70345.93256.65 269.25 393.79

Abu

ndan

ce (%

)

MD

Abu

ndan

ce (%

)

MD


49

weergegeven in het full scan massaspectrum met als fragmentionen m/z 517, 442 en 427

(Figuur 29).

Figuur 28: Massaspectrum van onbekende component.

Figuur 29: Full scan massaspectrum van onbekende component.

Deze component zou op basis van het bekomen resultaat op LC-MS2 als hoofdcomponent

beschouwd worden in het supplement, aangezien deze in een veel hogere concentratie

voorkomt dan methyldienolone en waarbij de aanwezigheid hiervan met een hoge

abundantie wordt bevestigd op GC-MS. Bij de analyse van humane lever microsomen (zie

3.4) wordt de metabolisatie van methandiënon nagegaan als positieve controle, met onder

andere een hydroxylatie als metabolisatiereactie. Hierbij worden dezelfde ionen

waargenomen in het massaspectrum van de onbekende component als in het

massaspectrum van de 6β-hydroxymethandiënon metaboliet, maar waarbij de component

met een andere RT van de kolom komt en het massaspectrum verschillend is. Hierdoor

wordt 6β-hydroxymethandiënon uitgesloten als onbekende component. Er werd niet verder

ingegaan op de onbekende component, doordat deze niet relevant is in de bachelorproef.

Op basis van de verkregen resultaten is de aanwezigheid van methyldienolone in het

supplement niet voldoende om mee verder te werken voor de uitvoering van verdere


RT: 0.00 - 33.01

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

1000

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

50

10015.70

27.6424.9416.40 22.377.55 12.227.24 12.79 28.7521.499.843.37 4.62 17.39 30.053.1415.74

24.9612.227.54 16.477.28 22.369.36 12.79 28.7721.489.83 19.074.533.36 26.49 28.98 32.200.1415.68

24.95

28.7612.21 16.107.56 24.6422.829.357.27 14.286.16 21.5219.6011.904.26 26.513.48 29.10 30.840.08





250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100R

elat

ive

Abu

ndan

ce317.43

318.58

319.61281.31 334.37320.57321.49282.38 335.47

299.35284.58 324.32 337.33313.08265.47253.31 345.51 367.38271.61 358.48 377.79 392.30

Abu

ndan

ce (%

)

532 442

73

143 427

517


50

experimenten op microsomen of voor toediening aan de muizen. Dit doordat de vermelde

component op het label, methyldienolone, nauwelijks detecteerbaar is in het supplement en

vele andere stoffen aanwezig zijn.

3.3 Analyse van de incubatieperiode van humane lever microsomen

Methyldienolone en methyltrienolone werden gedurende verschillende perioden

geïncubeerd met de HLM om de metabolisatie na te gaan. Hierbij worden de extracties van

de HLM geanalyseerd op GC-MS en LC-MS2 na verschillende incubatietijdstippen van 2u,

4u, 6u en 18u. Alsook werd de positieve, negatieve en blanco controle telkens

meegenomen in de analyse op de verschillende tijdstippen. Zo kon geëvalueerd worden

welke incubatietijd optimaal is voor dit onderzoek.

3.3.1 HLM incubatieperiode van methyldienolone op GC-MS

In Figuur 30 wordt de evolutie gedurende de verschillende incubatietijdstippen

geïllustreerd aan de hand van de abundantie van de metaboliet van methyldienolone. De

vorming van deze metaboliet via de HLM werd nagegaan op basis van het EIC van m/z

518, bij een RT van 8,95 min. Deze metaboliet moet afwezig zijn in de blanco en negatieve

controle, waar aan deze voorwaarde wordt voldaan. In het overlaid chromatogram zijn de

chromatogrammen van de verschillende incubatieperioden van de metaboliet gelijklopend,

waardoor er weinig invloed van de incubatieduur geobserveerd wordt. Hieruit wordt

afgeleid dat het enzym die instaat voor de metabolisatie al snel verzadigd wordt bij een

korte incubatie, doordat geen verschil in abundantie wordt waargenomen op GC-MS.

Figuur 30: Overlaid chromatogram HLM incubatieperiode van de metaboliet van methyldienolone op GC-MS gebruik

gemaakt van EIC.

Blanco en negatieve controle

18u 4u 2u 6u


51

3.3.2 HLM incubatieperiode van methyldienolone op LC-MS2

Figuur 31 geeft de chromatogrammen weer van de gevormde metabolieten van

methyldienolone via HLM onderworpen aan verschillende incubatietijden, waarbij de

incubatieperioden van 2u, 4u en 6u gelijklopend zijn in abundantie met telkens eenzelfde

massaspectrum. Bij de incubatie gedurende 18u wordt een van de zes metabolieten minder

gevormd.

Figuur 31: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyldienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2.

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)

2u incubatieperiode

4u incubatieperiode

6u incubatieperiode

18u incubatieperiode


52

3.3.3 HLM incubatieperiode van methyltrienolone op LC-MS2

Figuur 32 geeft de chromatogrammen weer van de metabolieten van methyltrienolone na

verschillende incubatietijden met HLM, waarbij de incubatieperioden van 4u en 6u

gelijklopend zijn in abundantie met telkens eenzelfde massaspectrum. Bij de korte

incubatieduur van methyltrienolone gedurende 2u worden de metabolieten namelijk

minder gevormd, doordat een lage abundantie wordt vastgesteld. Bij een incubatie

gedurende 18u worden beide metabolieten in mindere mate geobserveerd.

Figuur 32: Chromatogrammen HLM incubatieperioden van methyltrienolone met metabolieten (omkaderd) op LC-MS2.

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)

2u incubatieperiode

4u incubatieperiode

6u incubatieperiode

18u incubatieperiode


53

Op basis van de bekomen resultaten, en in combinatie met praktische overwegingen, wordt

voor beide componenten geopteerd voor een optimale HLM incubatietijd van 4u. Alle

resultaten hierna besproken zijn dus bekomen na 4u incubatie van het desbetreffende

steroïde met de HLM.

3.4 Analyse van humane lever microsomen

3.4.1 HLM methyldienolone op GC-MS

3.4.1.1 Positieve controle

Een positieve controle wordt meegenomen in de analyse om na te gaan of metabolisatie

heeft plaatsgevonden. Het metabolisme van het exogeen anabool steroïde, methandiënon

werd reeds veelvuldig bestudeerd, waardoor dit steroïde als positieve controle werd

gekozen. Dit is ook van toepassing op LC-MS2. Methandiënon heeft een moleculair

gewicht van m/z 300, waar na derivatisatie met TMS m/z 444 wordt bekomen. In Figuur

33 wordt het chromatogram weergegeven van de positieve controle waar methandiënon, de

metabolieten en 17α-methyltestosteron als inwendige standaard (IS’) gedetecteerd worden.

Het massaspectrum van methandiënon werd reeds weergegeven in Figuur 16, waarbij er

een hogere abundantie geldt in het massaspectrum van methandiënon in de positieve

controle door een grotere concentratie en hierbij niet fungeert als IS. In Figuur 34 en 35

worden de massaspectra weergegeven van de IS’ en de metaboliet 6β-

hydroxymethandiënon van methandiënon. De RT van de verschillende pieksignalen in de

positieve controle met bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 7.

Figuur 33: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 6β-hydroxymethandiënon als metaboliet, met IS’ op GC-

MS.

Methandiënon

IS’

6β-hydroxymethandiënon


54

Figuur 34: Full scan massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’).

Figuur 35: Full scan massaspectrum van 6β-hydroxymethandiënon.

Tabel 7: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra positieve controle.

Steroïde Retentietijd

(min) Moleculair ion (m/z) Fragmentionen (m/z)

17α-methyltestosteron (IS’) 8,196 446 431- 356- 341 Methandiënon 8,087 444 429- 354- 339

6β-hydroxymethandiënon 9,169 532 517- 442- 427 Als metabolisatiereactie treedt een hydroxylatie op van methandiënon, waardoor een

moleculair ion m/z 532 wordt verkregen op GC-MS. Aan de hand van het massaspectrum

werd deze metaboliet in de literatuur beschreven als 6β-hydroxymethandiënon [30].

Hierbij wordt aangetoond dat de enzymactiviteit van de HLM werkzaam is.

3.4.1.2 Negatieve controle

De negatieve controle, bestaande uit microsomen met een afwezigheid van het steroïde,

geeft het matrix-effect weer van de geïncubeerde HLM. Bijgevolg zullen geen

metabolieten worden waargenomen in het chromatogram en kunnen eventuele

interferenties opgemerkt worden. Dit is ook van toepassing op LC-MS2. De negatieve

341

73

143

356

431

446

73

143

427 442

532

517


55

controle wordt weergegeven in het overlaid chromatogram HLM, waar dus enkel de IS

zichtbaar is (Figuur 36).

3.4.1.3 Blanco controle

Tijdens de incubatie kunnen eventuele omzettingen van het steroïde plaatsvinden. Aan de

hand van de blanco controle wordt de stabiliteit van het steroïde nagegaan. Hierbij is enkel

het steroïde en geen microsomen aanwezig, waardoor normaal geen metabolisatie zal

plaatsvinden en geen metabolieten in het chromatogram worden waargenomen. Dit is ook

van toepassing op LC-MS2. De blanco controle wordt weergegeven in het overlaid

chromatogram HLM, waar dus methyldienolone en de IS zichtbaar zijn (Figuur 36).

3.4.1.4 HLM

Figuur 36 geeft het overlaid chromatogram weer, waarbij de eventueel gevormde

metabolieten gedetecteerd worden door de aanwezigheid van een pieksignaal in het

chromatogram van HLM methyldienolone en de afwezigheid van dit signaal in de blanco

en negatieve controle. Figuur 37 illustreert het massaspectrum van de metaboliet M1 van

methyldienolone in HLM, daar in Figuur 16 en 17 de massaspectra werden weergegeven

van respectievelijk de IS en methyldienolone. De RT van de verschillende pieksignalen

met bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 8.

Figuur 36: Overlaid chromatogram HLM ter detectie van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”, zie verder)

van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS.

IS

MD

M1

M1”

Blanco controleHLM methyldienolone

Negatieve controle


56

Figuur 37: Full scan massaspectrum van metaboliet M1.

Figuur 38: Full scan massaspectrum van het derivatisatieprobleem van de metaboliet M1 (M1”).

Zoals eerder vermeld werd het derivatisatieprobleem reeds vastgesteld bij

methyldienolone, waarbij dit alsook geldt bij de metaboliet van het steroïde. In het overlaid

chromatogram op het chromatogram van HLM methyldienolone (Figuur 36) is er na de

piek van de metaboliet (M1) een signaal (M1”) aanwezig m/z 516 en met als

fragmentionen m/z 426 en 411 (Figuur 38).

Tabel 8: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra HLM.


Methyldienolone (MD) 8,187 430 415- 340- 325 Metaboliet M1 8,953 518 503- 428- 413

Als metabolisatiereactie treedt een hydroxylatie op van methyldienolone, waardoor een

moleculair ion m/z 518 van M1 wordt verkregen op GC-MS. Hierbij is het onmogelijk om

te bepalen op welke plaats de metabolisatiereactie heeft plaatsgevonden, waar in dit

onderzoek slechts detectie van metabolieten mogelijk is en geen identificatie. Dit geldt bij

alle bekomen resultaten waarbij metabolisatie optreedt, met uitzondering van de positieve

controle daar het metabolisme gekend is.

518

503

428

413

143

73

516

426

411

73


57

3.4.2 HLM methyldienolone op LC-MS2

3.4.2.1 Positieve controle

Figuur 39 toont het chromatogram van de positieve controle geanalyseerd op LC-MS2, die

methandiënon en zijn metabolieten bevat samen met 17α-methyltestosteron als inwendige

standaard (IS’). Methandiënon (m/z 300) wordt op LC-MS2 in positieve mode gedetecteerd

met een m/z 301. Het [M+H]+ van de IS’ en de metabolieten PCM1, PCM2 en PCM3 van

methandiënon worden geïllustreerd in de massaspectra (Figuur 40-42), daar het

massaspectrum van methandiënon reeds werd weergegeven in Figuur 20. De RT van de

verschillende pieksignalen in de positieve controle met bijhorend ion worden weergegeven

in Tabel 9. De positieve controle voor de HLM studie met methyltrienolone op LC-MS2 is

dezelfde zoals hier beschreven.

Figuur 39: Chromatogram positieve controle, methandiënon en 17-methyl-6β,16,17-trihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on (PCM1), 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) en x-hydroxymethandiënon (PCM3) als metabolieten, met IS’ op LC-MS2.

Figuur 40: Massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS’).

Abu

ndan

ce (%

)

IS’

Methandiënon

PCM1

PCM2

PCM3

Abu

ndan

ce (%

)


58

Figuur 41: Massaspectrum van metaboliet PCM1.

Figuur 42: Massaspectrum van metaboliet PCM2, daar het massaspectrum van metaboliet PCM3 gelijkaardig is.

Tabel 9: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra positieve controle.

Steroïde Retentietijd (min) Moleculair ion (m/z) 17α-methyltestosteron (IS’) 14,50 303

Methandiënon 11,84 301 Metaboliet PCM1 6,15 333 Metaboliet PCM2 7,80 317 Metaboliet PCM3 8,82 317

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methandiënon, waardoor een

moleculair ion m/z 317 wordt verkregen op LC-MS2. Aan de hand van de massaspectra

werden de metabolieten in de literatuur beschreven als 6β-hydroxymethandiënon (PCM2)

en x-hydroxymethandiënon (PCM3). Alsook treedt een dihydroxylatie van methandiënon

op, die in de literatuur werd beschreven als 17-methyl-6β,16,17-trihydroxyandrosta-1,4-

dien-3-on (PCM1) met m/z 333 [30]. In vergelijking met de resultaten bekomen op GC-

MS wordt enkel 6β-hydroxymethandiënon (PCM2) via GC-MS gedetecteerd. Dit kan te

wijten zijn aan de gevoeligheid van de methodes of aan de derivatisatie. Uit een verdere

analyse op LC-MS2 is hierbij alsook gebleken dat meerdere metabolieten worden

gedetecteerd bij de HLM studie met methyldienolone dan bij de detectie via GC-MS,

waardoor voorgaand besluit bevestigd wordt.

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)


59

3.4.2.2 Negatieve controle

Figuur 43 illustreert het chromatogram van de negatieve controle, waarbij de achtergrond

en de IS worden weergegeven. Methandiënon (IS) is aanwezig op een RT van 11,85 min

met als [M+H]+ m/z 301 (Figuur 20) en toont aan dat de extractie goed verlopen is. De

negatieve controle voor de HLM studie met methyltrienolone op LC-MS2 is dezelfde zoals

hier beschreven.

Figuur 43: Chromatogram negatieve controle met IS op LC-MS2.

3.4.2.3 Blanco controle methyldienolone

In Figuur 44 wordt het chromatogram weergegeven van de blanco controle, waar

methyldienolone en de IS zichtbaar zijn. De RT van methyldienolone en de IS benaderen

de RT in het chromatogram van HLM methyldienolone, waardoor verwezen wordt naar

Tabel 10 voor de RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Zoals verwacht

worden geen metabolieten in de geanalyseerde blanco controle gedetecteerd, wat de

stabiliteit van methyldienolone gedurende de incubatie van 4u bij 37°C aantoont.

Figuur 44: Chromatogram blanco controle, methyldienolone (MD) met IS op LC-MS2.

Abu

ndan

ce (%

)

IS

IS

MD

Abu

ndan

ce (%

)


60

3.4.2.4 HLM methyldienolone

De gevormde metabolieten worden gedetecteerd door de aanwezigheid van pieksignalen in

het chromatogram van HLM methyldienolone (Figuur 45) te vergelijken met de

afwezigheid van deze signalen in de blanco en negatieve controle. Figuur 46 en 47

illustreren de massaspectra van de metabolieten M1’, M2’, M3’, M4’, M5’ en M6’ van

methyldienolone in HLM bekomen na LC-MS2 analyse, daar in Figuur 20 en 21 de

massaspectra weergegeven werden van respectievelijk de IS en methyldienolone. De RT

van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 10.

Figuur 45: Chromatogram HLM methyldienolone (MD) en M1’, M2’, M3’, M4’, M5’, M6’ als metabolieten, met IS op

LC-MS2.

Figuur 46: Massaspectrum van metaboliet M1’, daar de massaspectra van metabolieten M2’, M3’ en M4’ gelijkaardig

zijn.

Figuur 47: Massaspectrum van metaboliet M5’, daar het massaspectrum van metaboliet M6’ gelijkaardig is.

Abu

ndan

ce (%

)

MD

IS

M1’

M2’

M3’

M4’

M6’

M5’

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)


61

Tabel 10: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyldienolone.


Methyldienolone (MD) 11,62 287 Metaboliet M1’ 6,70 303 Metaboliet M2’ 6,95 303 Metaboliet M3’ 7,93 303 Metaboliet M4’ 8,78 303 Metaboliet M5’ 9,78 275 Metaboliet M6’ 10,56 275

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyldienolone, waardoor een

moleculair ion m/z 303 van M1’, M2’, M3’ en M4’ wordt verkregen op LC-MS2. Alsook

wordt een moleculair ion m/z 275 van M5’ en M6’ verkregen, met een metabolisatiereactie

die geen verklaring kent. Een oxidatie met demethylatie is hierbij de enige mogelijke

reactie, maar werd in de literatuur nog niet voorheen gerapporteerd voor anabole steroïden.

3.4.3 HLM methyltrienolone op LC-MS2

De positieve en negatieve controle werden reeds besproken in 3.4.2, waardoor deze niet

opnieuw vermeld worden.

3.4.3.1 Blanco controle methyltrienolone

In Figuur 48 wordt het chromatogram weergegeven van de blanco controle, waar

methyltrienolone en de IS zichtbaar zijn. De RT van methyltrienolone en de IS benaderen

de RT in het chromatogram van HLM methyltrienolone, waardoor verwezen wordt naar

Tabel 11 voor de RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Hierbij worden

ook geen metabolieten gedetecteerd in de blanco controle afkomstig van methyltrienolone.

Figuur 48: Chromatogram blanco controle, methyltrienolone (MT) met IS op LC-MS2.

Abu

ndan

ce (%

)

MT

IS


62

3.4.3.2 HLM methyltrienolone

De gevormde metabolieten worden gedetecteerd door de aanwezigheid van pieksignalen in

het chromatogram van HLM methyltrienolone (Figuur 49) te vergelijken met de

afwezigheid van deze signalen in de blanco en negatieve controle. Figuur 50 illustreert de

massaspectra van de metabolieten A1 en A2 van methyltrienolone in HLM bekomen na

LC-MS2 analyse, daar in Figuur 20 en 23 de massaspectra weergegeven werden van

respectievelijk de IS en methyltrienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met

bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 11.

Figuur 49: Chromatogram HLM methyltrienolone (MT) en A1, A2 als metabolieten, met IS op LC-MS2.

Figuur 50: Massaspectrum van metaboliet A1, daar het massaspectrum van metaboliet A2 gelijkaardig is.

Tabel 11: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra HLM methyltrienolone.


Methyltrienolone (MT) 11,43 285 Metaboliet A1 7,87 301 Metaboliet A2 8,71 301

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyltrienolone, waardoor een

moleculair ion m/z 301 van A1 en A2 wordt verkregen op LC-MS2.

MT

IS

A2

A1

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)


63

3.5 Analyse van excretie-urines

Bij de analyse van de excretie-urines van niet-chimere en chimere muizen wordt er geen

correctie uitgevoerd op de hoeveelheid geproduceerde urine, aangezien ongeveer eenzelfde

hoeveelheid muizenurine werd bekomen. Het toevoegen van een IS maakt het mogelijk om

te corrigeren voor variaties in de staalvoorbereiding en om de RRT te berekenen (zie 3.6).

Niet-chimere muizen worden bij de analyse gebruikt ter controle voor het uitvoeren van

excretie-experimenten om het muismetabolisme van de toegediende steroïden na te gaan

en zo het aandeel van de humane hepatocyten in de chimere muizen te bepalen.

3.5.1 Excretie-urines methyldienolone op GC-MS

3.5.1.1 Toedieningsoplossing

De toedieningsoplossing wordt meegenomen in de analyse om na te gaan of de

hoofdcomponent effectief aanwezig is en dus werd toegediend aan de muizen. Hierbij kan

ook de respons van de parent worden afgeleid en indien andere componenten aanwezig

zijn die als eventuele metabolieten gezien kunnen worden. Dit is alsook van toepassing op

LC-MS2. In de toedieningsoplossing (met een dosis van 200µg/muis) wordt de

hoofdcomponent methyldienolone gedetecteerd op een RT van 8,221 min en de IS op een

RT van 8,082 min. De RT van methyldienolone is opgeschoven door de grote oppervlakte

ten gevolg van de hoge abundantie van dit pieksignaal.

3.5.1.2 Controles

Bij de te analyseren stalen wordt telkens een systeem blank en een negatief urinestaal van

de niet-chimere of chimere muis meegenomen om de resultaten achteraf op een correcte

manier te kunnen evalueren. Deze worden weergegeven in het overlaid chromatogram

excretie-urines, waar bij deze controles enkel de IS zichtbaar is (Figuur 51).

Aan de hand van de systeem blank, bestaande uit water, kan eventuele interferentie van de

gebruikte solventen en reagentia gedetecteerd worden. De pre-administratie urines, met een

afwezigheid van het steroïde (methyldienolone of methyltrienolone) geeft het matrix-effect

weer van de muizenurine. Bovendien is de endogene productie van de muizen niet

detecteerbaar met de gebruikte methodes, waardoor de pre-administratie urines van de


64

muizen als negatieve urine kunnen beschouwd worden. Bijgevolg zullen geen metabolieten

worden waargenomen in het chromatogram, daar de urine voor de toediening van het

steroïde werd gecollecteerd. Dit alles is ook van toepassing op LC-MS2.

3.5.1.3 Excretie-urines

Figuur 51 geeft het overlaid chromatogram van de excretie-urines van de niet-chimere en

de chimere muis weer, waarbij de gevormde metabolieten gedetecteerd worden door de

aanwezigheid van een pieksignaal in het chromatogram van de excretie-urine

methyldienolone en de afwezigheid van dit signaal in de negatieve urine en systeem blank.

Het derivatisatieprobleem is zoals eerder besproken ook van toepassing bij de excretie-

urines. In Figuur 37 werd het massaspectrum reeds geïllustreerd van de metaboliet M1 van

methyldienolone, daar in Figuur 16 en 17 de massaspectra weergegeven werden van

respectievelijk de IS en methyldienolone. De RT van de verschillende pieksignalen met

bijhorende ionen worden weergegeven in Tabel 12.

Figuur 51: Overlaid chromatogram excretie-urine niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan) ter detectie

van de metaboliet (M1) en derivatisatieprobleem (M1”) van methyldienolone (MD) met IS op GC-MS.

Excretie-urine methyldienolone

Negatieve urine

IS

MD

M1

M1” Systeem blank

M1”

M1

Systeem blank

Excretie-urine methyldienolone

Negatieve urine

IS

MD


65

Tabel 12: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en full scan spectra excretie-urine niet-chimere en chimere muis.


Methyldienolone (MD) 8,185 430 415- 340- 325 Metaboliet M1 8,953 518 503- 428- 413

Als metabolisatiereactie treedt een hydroxylatie op van methyldienolone in de niet-chimere

en chimere muis, waardoor een moleculair ion m/z 518 van M1 wordt verkregen op GC-

MS. In de toedieningsoplossing is dit pieksignaal in mindere mate aanwezig, waar na

toediening van het steroïde aan de muizen de piek meer wordt gevormd en dus beschouwd

wordt als een metaboliet.

Hierbij is de metaboliet van methyldienolone in de excretie-urine van de niet-chimere muis

dezelfde als van de chimere muis, doordat eenzelfde RT wordt verkregen. Deze stemt

overeen met de RRT van de metaboliet (M1) bekomen in het chromatogram van HLM

methyldienolone (Figuur 36). Aangezien dezelfde metabolisatie heeft plaatsgevonden als

bij de HLM studie met methyldienolone op GC-MS, wordt eenzelfde benaming en

massaspectrum van de metaboliet M1 bekomen (Figuur 37).

3.5.2 Excretie-urines methyldienolone op LC-MS2

3.5.2.1 Toedieningsoplossing methyldienolone

In de toedieningsoplossing is methyldienolone (met een dosis van 200µg/muis) als

hoofdcomponent aanwezig op een RT van 11,67 min en de IS op een RT van 11,96 min.

Door de hoge abundantie en grote oppervlakte van het pieksignaal van methyldienolone is

de IS moeilijk detecteerbaar, waarbij deze onder de piek van methyldienolone valt.

3.5.2.2 Systeem blank

Figuur 52 illustreert het chromatogram van de systeem blank, waarbij eventuele

interferenties en de IS worden weergegeven. Methandiënon (IS) is aanwezig op een RT

van 11,88 min met als [M+H]+ m/z 301 (Figuur 20). De systeem blank voor de excretie

studie met methyltrienolone op LC-MS2 is dezelfde zoals hier beschreven.


66

Figuur 52: Chromatogram systeem blank met IS op LC-MS2.

3.5.2.3 Negatieve urine methyldienolone

Figuur 53 illustreert de chromatogrammen van de negatieve urine methyldienolone van

respectievelijk de niet-chimere en chimere muis, waarbij de achtergrond en de IS worden

weergegeven. De RT van de IS benadert de RT in het chromatogram van de excretie-urine

methyldienolone, waardoor verwezen wordt naar Tabel 13 voor de RT van de

verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Zoals verwacht worden geen metabolieten

gedetecteerd in de geanalyseerde negatieve urine, daar dit ook geldt bij de excretie studie

met methyltrienolone op LC-MS2.

Figuur 53: Chromatogram negatieve urine methyldienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan)

met IS op LC-MS2.

Abu

ndan

ce (%

)

IS

IS

IS

Abu

ndan

ce (%

) A

bund

ance

(%)


67

3.5.2.4 Excretie-urine methyldienolone

Figuur 54 geeft het chromatogram van de metabolieten in de excretie-urines van de niet-

chimere en de chimere muis weer, waarbij de gevormde metabolieten gedetecteerd worden

door de aanwezigheid van pieksignalen in het chromatogram van de excretie-urine

methyldienolone te vergelijken met de afwezigheid van deze signalen in de systeem blank

en negatieve urine. Metaboliet M0’ vertoont een gelijkaardig spectrum aan dat van M2’,

waardoor Figuur 46 de massaspectra illustreert van de metabolieten M0’ en M2’ van

methyldienolone in excretie-urines bekomen na LC-MS2 analyse. In Figuur 20 en 21

werden de massaspectra respectievelijk weergegeven van de IS en methyldienolone. De

RT van de verschillende pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 13.

Door het detecteren van de hoofdcomponent in de excretie-urines worden de ionen

opgevraagd van de metabolieten bekomen bij de HLM studie met methyldienolone op LC-

MS2, doordat andere eventuele metabolieten moeilijk detecteerbaar zijn door hun lage

signalen. Hierbij worden de metabolieten met een m/z 303 weergegeven, daar m/z 275 niet

wordt gedetecteerd in het chromatogram van de excretie-urines.

Figuur 54: Chromatogram excretie-urines metabolieten methyldienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een

m/z 303.

Tabel 13: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyldienolone.


Methyldienolone (MD) 11,64 287 Metaboliet M0’ 5,77 303 Metaboliet M2’ 6,97 303

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyldienolone in de niet-chimere

en chimere muis, waardoor een moleculair ion m/z 303 van M0’ en M2’ wordt verkregen

M0’

M2’

Abu

ndan

ce (%

)


68

op LC-MS2. In de toedieningsoplossing zijn deze pieksignalen in mindere mate aanwezig,

waar na toediening van het steroïde aan de muizen de pieken meer worden gevormd en dus

beschouwd worden als metabolieten. Hierbij komt het signaal op een RT van 8,72 min in

dezelfde piekverhouding voor als in de toedieningsoplossing, waardoor dit pieksignaal niet

beschouwd wordt als een metaboliet (Figuur 54).

Er worden opnieuw meerdere metabolieten gedetecteerd op LC-MS2 bij de excretie-studie

met methyldienolone dan bij de detectie via GC-MS, waardoor zoals eerder vermeld dit te

wijten is aan de gevoeligheid van de methodes of aan de derivatisatie. Fracties werden

opgevangen van de metabolieten op LC-MS2 om deze op GC-MS te kunnen detecteren,

waarbij enkel metaboliet M2’ gedetecteerd werd en overeenkomstig is met metaboliet M1

van bij de excretie studie met methyldienolone op GC-MS (zie 3.5.1.3).

Hierbij zijn de metabolieten van methyldienolone in de excretie-urine van de niet-chimere

muis dezelfde als van de chimere muis, doordat eenzelfde RT wordt verkregen. Metaboliet

M2' stemt overeen met de RRT van de metaboliet (M2’) bekomen in het chromatogram

van HLM methyldienolone (Figuur 45). Aangezien dezelfde metabolisatie heeft

plaatsgevonden als bij de HLM studie met methyldienolone op LC-MS2, wordt eenzelfde

benaming en massaspectrum van de metaboliet M2’ bekomen (Figuur 46). Metaboliet M0’

wordt enkel bij excretie-urines gevormd, daar deze niet zichtbaar is bij humane lever

microsomen.

3.5.3 Excretie-urines methyltrienolone op LC-MS2

De systeem blank werd reeds besproken in 3.5.2, waardoor deze niet opnieuw vermeld

wordt.

3.5.3.1 Toedieningsoplossing methyltrienolone

In de toedieningsoplossing is methyltrienolone (met een dosis van 160µg/muis) als

hoofdcomponent aanwezig op een RT van 11,46 min en de IS op een RT van 11,91 min.

Door de hoge abundantie en grote oppervlakte van het pieksignaal van methyltrienolone is

de IS moeilijk detecteerbaar, waarbij deze onder de piek van methyltrienolone valt.


69

3.5.3.2 Negatieve urine methyltrienolone

Figuur 55 illustreert de chromatogrammen van de negatieve urine methyltrienolone van

respectievelijk de niet-chimere en chimere muis, waarbij de achtergrond en de IS worden

weergegeven. De RT van de IS benadert de RT in het chromatogram van de excretie-urine

methyltrienolone, waardoor verwezen wordt naar Tabel 14 voor de RT van de

verschillende pieksignalen met bijhorend ion. Aangezien andere muizen gebruikt werden

dan bij de methyldienolone studie worden deze resultaten hier geïllustreerd.

Figuur 55: Chromatogram negatieve urine methyltrienolone niet-chimere muis (bovenaan) en chimere muis (onderaan)

met IS op LC-MS2.

3.5.3.3 Excretie-urine methyltrienolone

Figuur 56 geeft het chromatogram van de metabolieten in de excretie-urine van de chimere

muis weer, waarbij de gevormde metabolieten gedetecteerd worden door de aanwezigheid

van pieksignalen in het chromatogram van de excretie-urine methyltrienolone te

vergelijken met de afwezigheid van deze signalen in de systeem blank en negatieve urine.

Metaboliet A0 vertoont een gelijkaardig spectrum aan dat van A2, waardoor Figuur 50 de

massaspectra illustreert van de metabolieten A0 en A2 van methyltrienolone in excretie-

urines bekomen na LC-MS2 analyse. In Figuur 20 en 23 werden de massaspectra

Abu

ndan

ce (%

)

IS

IS

Abu

ndan

ce (%

)


70

respectievelijk weergegeven van de IS en methyltrienolone. De RT van de verschillende

pieksignalen met bijhorend ion worden weergegeven in Tabel 14.

Door het detecteren van de hoofdcomponent in de excretie-urines worden de ionen

opgevraagd van de metabolieten bekomen bij de HLM studie met methyltrienolone op LC-

MS2, doordat andere eventuele metabolieten moeilijk detecteerbaar zijn door hun lage

signalen. Hierbij worden de metabolieten met een m/z 301 weergegeven, waarbij deze niet

worden gedetecteerd in de excretie-urine van de niet-chimere muis.

Figuur 56: Chromatogram excretie-urine metabolieten methyltrienolone op LC-MS2 met selectie van [M+H]+ met een

m/z 301.

Tabel 14: Overzicht RT en ionen uit het chromatogram en massaspectra excretie-urine methyltrienolone chimere muis.


Methyltrienolone (MT) 11,42 285 Metaboliet A0 7,24 301 Metaboliet A2 8,76 301

Als metabolisatiereactie treden hydroxylaties op van methyltrienolone in de chimere muis,

waardoor een moleculair ion m/z 301 van A0 en A2 wordt verkregen op LC-MS2. In de

toedieningsoplossing zijn deze pieksignalen niet aanwezig en kunnen dus beschouwd

worden als een metabolieten. Metaboliet A2 stemt overeen met de RRT van de metaboliet

(A2) bekomen in het chromatogram van HLM methyltrienolone (Figuur 49). Aangezien

dezelfde metabolisatie heeft plaatsgevonden bij de HLM studie met methyltrienolone op

LC-MS2, wordt eenzelfde benaming en massaspectrum van de metaboliet A2 bekomen

(Figuur 50). Metaboliet A0 wordt enkel bij excretie-urines gevormd, daar deze niet

zichtbaar is bij humane lever microsomen en dus enkel in het muismetabolisme voorkomt.

Abu

ndan

ce (%

)

A0

A2


71

Op basis van de bekomen resultaten bestaat de mogelijkheid dat een humane metaboliet

van methyltrienolone (A2) aanwezig is in de excretie-urines bij de chimere muis, daar deze

niet wordt waargenomen bij de niet-chimere muis en wel in HLM via detectie op LC-MS2.

Hierbij wordt niet uitgesloten dat de gedetecteerde metabolieten alsook kunnen verkregen

worden bij het muismetabolisme. Dit kan niet met zekerheid besloten worden, aangezien

bij een tweede analyse de hoofdcomponent bij de niet-chimere muis niet gedetecteerd werd

en bijgevolg dus ook geen metabolieten kunnen gedetecteerd worden door een te lage

concentratie, ten gevolge van een weinig volume aan muizenurine.

3.6 Overzicht

Op basis van de RRT worden pieksignalen in de verschillende analyses van de

componenten in de humane lever microsomen en excretie-urines gekoppeld aan elkaar

door het verkrijgen van dezelfde RRT voor eenzelfde piek (Tabel 15-17). Bij de HLM

studie van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2 bestaat er tussen de

twee reeksen een maximale opschuiving van RRT 0,02, waardoor deze als dezelfde

componenten beschouwd kunnen worden. De RRT wordt bekomen door de RT van de

component te delen door de RT van de IS.

Tabel 15: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via GC-MS.

RRT Reeks 1 RRT Reeks 2 HLM HLM Methyldienolone 1,01 1,01 Metaboliet M1 1,11 1,11 Niet-chimere muis Niet-chimere muis Methyldienolone 1,01 1,01 Metaboliet M1 1,11 1,11 Chimere muis Chimere muis Methyldienolone 1,01 1,01 Metaboliet M1 1,11 1,11


72

Tabel 16: Relatieve retentietijden van methyldienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2.

RRT Reeks 1 RRT Reeks 2 HLM HLM Methyldienolone 0,97 0,98 Metaboliet M1' 0,55 0,57 Metaboliet M2' 0,57 0,59 Metaboliet M3' 0,65 0,67 Metaboliet M4' 0,71 0,73 Metaboliet M5' 0,80 0,82 Metaboliet M6' 0,87 0,89 Niet-chimere muis Niet-chimere muis Methyldienolone 0,98 0,98 Metaboliet M0’ 0,48 0,49 Metaboliet M2’ 0,59 0,59 Chimere muis Chimere muis Methyldienolone 0,98 0,98 Metaboliet M0’ 0,49 0,49 Metaboliet M2’ 0,59 0,59 Tabel 17: Relatieve retentietijden van methyltrienolone en metabolieten gedetecteerd via LC-MS2.

RRT Reeks 1 RRT Reeks 2 HLM HLM Methyltrienolone 0,96 0,97 Metaboliet A1 0,67 0,67 Metaboliet A2 0,73 0,74 Niet-chimere muis Niet-chimere muis Methyltrienolone 0,96 - Metaboliet A0 - - Metaboliet A1 - - Metaboliet A2 - - Chimere muis Chimere muis Methyltrienolone 0,97 0,96 Metaboliet A0 0,61 0,62 Metaboliet A2 0,74 0,74 In Tabel 18 wordt een overzicht van de metabolieten van methyldienolone gegeven

gedetecteerd via GC-MS en LC-MS2 in HLM en excretie-urines, waar in Tabel 19 een

overzicht van de metabolieten van methyltrienolone wordt gegeven gedetecteerd via LC-

MS2 in HLM en excretie-urines. Zoals eerder vermeld werden fracties opgevangen van de

metabolieten op LC-MS2 om deze op GC-MS te detecteren, waarbij metaboliet M2’

overeenkomstig is met metaboliet M1 op GC-MS aangeduid in Tabel 18.


73

Tabel 18: Overzicht metabolieten methyldienolone in HLM en excretie-urines via detectie op GC-MS (bovenaan) en LC-MS2 (onderaan).

HLM Excretie-urines GC-MS Metaboliet M1 x x

LC-MS2

Metaboliet M0’ x Metaboliet M1' x Metaboliet M2' x x Metaboliet M3' x Metaboliet M4' x Metaboliet M5' x Metaboliet M6’ x

Tabel 19: Overzicht metabolieten methyltrienolone in HLM en excretie-urines via detectie op LC-MS2.

HLM Excretie-urines Metaboliet A0 x Metaboliet A1 x Metaboliet A2 x x

Besluit

74

4 Besluit

In dit onderzoek werd de metabolisatie nagegaan van de anabole androgene steroïden

methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van in vivo en in vitro technieken,

doordat het niet toegestaan is om onderzoek uit te voeren op gezonde menselijke

vrijwilligers omwille van ethische redenen. De kennis van het metabolisme van

dopinggerelateerde producten is noodzakelijk voor de detectie ervan in de urine, doordat

de metabolieten van het steroïde een langere detectie van het misbruik toelaten. Er werd op

zoek gegaan naar humane metabolieten door het analyseren van excretie-urines van niet-

chimere en chimere muizen en via incubaties met behulp van microsomen (HLM). Bij de

gedetecteerde metabolieten van methyldienolone en methyltrienolone in HLM en excretie-

urines treden hydroxylaties op als metabolisatiereactie.

Eerst en vooral werd de referentiestandaard van methyldienolone en methyltrienolone

geanalyseerd op GC-MS en LC-MS2. Hierbij kon methyltrienolone niet worden

gedetecteerd via GC-MS doordat het steroïde een sterk geconjugeerd systeem bevat, maar

wel via detectie op LC-MS2. Beide referentiestandaarden werden dus zuiver bevonden,

desondanks het optredende derivatisatieprobleem bij de detectie van methyldienolone via

GC-MS. Door analyse van de referentiestandaarden werd het massaspectrum en de

retentietijd van beide componenten bepaald, waardoor de steroïden in verdere analyses

gedetecteerd en geïdentificeerd konden worden.

Bij de analyse van de HLM experimenten werd eerst de optimale incubatietijd van de

steroïden in de microsomen bepaald via GC-MS en LC-MS2. Hierbij werd de mate van

vorming van de metabolieten geobserveerd na verschillende incubatieperiodes en op basis

van de bekomen resultaten werd geopteerd voor een 4u incubatie. Via analyse op GC-MS

van methyldienolone werd er een gehydroxyleerde metaboliet (m/z 518) vastgesteld, daar

bij de analyse via LC-MS2 zes metabolieten (m/z 303 en 275) van methyldienolone in

HLM werden gedetecteerd. Hiervan vertonen twee metabolieten (m/z 275) een ongekende

metabolisatiereactie. Het verschil in detectie van het aantal metabolieten is te wijten aan de

gevoeligheid van de methodes of aan de derivatisatie en is alsook geldig bij de analyse van

excretie-urines. Via de LC-MS2 analyse van methyltrienolone werden er twee

gehydroxyleerde metabolieten (m/z 301) gedetecteerd.

Besluit

75

Bij de excretie studie werd een dosisbepaling uitgevoerd waarbij de dosis steeds werd

opgevoerd tot een detecteerbaar niveau van het steroïde of de metabolieten. Deze

toegediende dosis van methyldienolone (200µg/muis) en methyltrienolone (160µg/muis) is

bijgevolg de laagste dosis waarbij componenten werden gedetecteerd.

Via analyse op GC-MS van methyldienolone werd er opnieuw een metaboliet (m/z 518)

vastgesteld in zowel de niet-chimere als chimere muis. Door het verkrijgen van dezelfde

metaboliet van bij de in vitro HLM wordt het humaan metabolisme bevestigd in het in vivo

uPA+/+-SCID chimeer muismodel. Bij de analyse via LC-MS2 werden twee metabolieten

(m/z 303) van methyldienolone in zowel de excretie-urines van de niet-chimere als van de

chimere muis gedetecteerd. Hierbij komt slechts een van de twee metabolieten van

methyldienolone zowel in de HLM als in het chimeer muismodel voor. Deze metaboliet is

overeenkomstig met de metaboliet die via GC-MS gedetecteerd werd.

Via de LC-MS2 analyse van methyltrienolone werden er twee metabolieten (m/z 301)

gedetecteerd bij de chimere muis, die niet werden vastgesteld in de excretie-urines van de

niet-chimere muis. Hierbij wordt slechts een van de twee metabolieten gedetecteerd in

zowel HLM als in het chimeer muismodel, waardoor deze metaboliet door het humaan

metabolisme wordt gevormd. Hoewel hier wel een verschil werd opgemerkt met de niet-

chimere muizen wordt niet uitgesloten dat de verkregen metabolieten alsook door het

muismetabolisme gevormd worden.

Binnen dit onderzoek werden metabolieten gedetecteerd van methyldienolone en

methyltrienolone, maar daarnaast is het ook van belang om hun structuur te achterhalen om

deze steroïden specifieker te kunnen identificeren. Een hogere dosis kan alsook worden

toegediend aan het muismodel om eventuele metabolieten met een laag signaal te kunnen

detecteren. De robuustheid kon aan de hand van de relatieve abundantie niet bepaald

worden door een beperkt aantal metingen. Hierdoor zou men in een later onderzoek

meerdere metingen moeten uitvoeren om de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid na te

gaan. Het einddoel van dit onderzoek is om de steroïden methyldienolone en

methyltrienolone op te nemen in de routinescreening ter detectie.



76

Literatuurlijst

[1] VAN EENOO, P. (2005). Doping Control Laboratory [on line]. Universiteit Gent.

http://www.docolab.ugent.be [datum van opzoeking: 09/03/2014].

[2] World Anti-Doping Agency (WADA) (2014). Accredited Laboratories For Doping

Control Analysis [on line].

http://www.wada-ama.org/Documents/Science_Medicine/Anti-

Doping_Laboratories/WADA_Accredited_Laboratories_EN.pdf [datum van

opzoeking: 09/03/2014].

[3] MORENTE-SÁNCHEZ, J., ZABALA, M. (2013). Doping in Sport: A Review of Elite

Athletes’ Attitudes, Beliefs, and Knowledge. Sports Medicine, 43(6), 395-411.

[4] World Anti-Doping Agency (WADA) (2012). Anti-Doping Testing Figures Report [on

line].

http://www.wada-ama.org/Documents/Resources/Testing-Figures/WADA-2012-Anti-

Doping-Testing-Figures-Report-EN.pdf [datum van opzoeking: 16/03/2014].

[5] World Anti-Doping Agency (WADA) (2009). World Anti-Doping Code [on line].

http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-The-

Code/WADA_Anti-Doping_CODE_2009_EN.pdf [datum van opzoeking:

02/04/2014].

[6] World Anti-Doping Agency (WADA) (2009). WADA History [on line].

http://www.wada-ama.org/en/About-WADA/History/WADA-History/ [datum van

opzoeking: 16/03/2014].

[7] DUNTAS, L.H., POPOVIC, V. (2013). Hormones as doping in sports. Endocrine,

43(2), 303-13.

[8] World Anti-Doping Agency (WADA) (2014). The 2014 Prohibited List International

Standard [on line].

http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-

Prohibited-list/2014/WADA-prohibited-list-2014-EN.pdf [datum van opzoeking:

16/03/2014].

[9] KICMAN, A.T. (2008). Pharmacology of anabolic steroids. British Journal of

Pharmacology, 154, 502-521.

[10] SCHÄNZER, W. (1996). Metabolism of anabolic androgenic steroids. Clinical

Chemistry, 42:7, 1001-1020.



77

[11] HARTGENS, F., KUIPERS, F. (Eds.) (2000). Verboden middelen in de sport. Bohn

Stafleu Van Loghum, Houten/Diegem, 266p. (ISBN 90-313-2778-6)

[12] FRAGKAKI, A.G., ANGELIS, Y.S., KOUPPARIS, M., TSANTILI-KAKOULIDOU,

A., KOKOTOS, G., GEORGAKOPOULOS, C. (2009). Structural characteristics of

anabolic androgenic steroids contributing to binding to the androgen receptor and to

their anabolic and androgenic activities. Applied modifications in the steroidal

structure. Steroids, 74, 172-197.

[13] SCHÄNZER, W., DONIKE, M. (1993). Metabolism of anabolic steroids in man:

synthesis and use of reference substances for identification of anabolic steroid

metabolites. Analytica Chimica Acta, 275, 23-48.

[14] LOOTENS, L., MEULEMAN, P., POZO, O.J., VAN EENOO, P., LEROUX-ROELS,

G., DELBEKE, F.T. (2009). uPA+/+-SCID Mouse with Humanized Liver as a Model

for In Vivo Metabolism of Exogenous Steroids: Methandienone as a Case Study.

Clinical Chemistry, 55:10, 1783-1793.

[15] DE GROOT, A., KOERT, W. (2007). Prohormonen [on line]. Ergogenics.

http://www.ergogenics.org/anabolenboek/index15.html [datum van opzoeking:

02/04/2014].

[16] MOSS, G.P. (1989). Nomenclature Of Steroids. Pure and Applied Chemistry, 61:10,

1783-1822.

[17] DE GROOT, A., KOERT, W. (2006). De Structuurformule van Testosteron [on line].

Ergogenics.

http://www.ergogenics.org/anabolenboek/index4.html [datum van opzoeking:

07/04/2014].

[18] Pharmacology Education Partnership (PEP) (2003). Steroids and athletes: Genes work

overtime [on line].

http://www.thepepproject.net/Load/teacher/PEP_M6.pdf [datum van opzoeking:

08/04/2014].

[19] DEMEYERE, M. (2012). De genexpressie. De Hogeschool West-Vlaanderen,

Brugge, 188p.

[20] BRANDON, E.F.A., RAAP, C.D., MEIJERMAN, I., BEIJNEN, J.H., SCHELLENS,

J.H.M. (2003). An update on in vitro test methods in human hepatic drug



78

biotransformation research: pros and cons. Toxicology and Applied Pharmacology,

189, 233-246.

[21] LEE, J., XIAODONG, L. (2007). The Conduct of Drug Metabolism Studies

Considered Good Practice (II): In Vitro Experiments. Current Drug Metabolism, 8(8),

822-829.

[22] FASINU, P., BOUIC, P.J., ROSENKRANZ, B. (2012). Liver-Based In Vitro

Technologies for Drug Biotransformation Studies. Current Drug Metabolism, 13, 000-

000.

[23] EMOTO, C., IWASAKI, K., MURAYAMA, N., YAMAZAKI, H. (2011). Drug

Metabolism and Toxicity in Chimeric Mice with Humanized Liver. Journal of Health

Science, 57(1), 22-27.

[24] KATOH, M., TATENO, C., YOSHIZATO, K., YOKOI, T. (2008). Chimeric mice

with humanized liver. Toxicology, 246, 9-17.

[25] JANCOVA, P., ANZENBACHER, P., ANZENBACHEROVA, E. (2010). Phase II

Drug Metabolizing Enzymes. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the

University Palacky Olomouc Czech Republic, 154(2), 103-116.

[26] Mind and Muscle (2011). Prohormones: Methyldienolone [on line].

http://www.mindandmuscle.net/articles/prohormones-methyldienolone/ [datum van

opzoeking: 21/04/2014].

[27] Mind and Muscle (2011). Anabolic Steroids: Methyltrienolone [on line].

http://www.mindandmuscle.net/articles/anabolic-steroids-methyltrienolone/ [datum

van opzoeking: 21/04/2014].

[28] KICKMAN, A.T. GOWER, D.B. (2003). Anabolic steroids in sport: biochemical,

clinical and analytical perspectives. Annals of clinical biochemistry, 40, 321-356.

[29] THEVIS, M., SCHÄNZER, W. (2007). Mass Spectrometry In Sports Drug Testing:

Structure Characterization And Analytical Assays. Mass Spectrometry Reviews, 26,

79-107.

[30] POZO, O.J., LOOTENS, L., VAN EENOO, P., DEVENTER, K., MEULEMAN, P.,

LEROUX-ROELS, G., PARR, M.K., SCHÄNZER, W., DELBEKE, F.T. (2009).

Combination of liquid-chromatography tandem mass spectrometry in different scan

modes with human and chimeric mouse urine for the study of steroid metabolism.

Drug Testing and Analysis, 1, 554-567.



79

[31] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G., MAASKANT,

J., SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1996). Chromatografie in

de praktijk. Gaschromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN

90-71694-34-8)

[32] SALLIAU, S. (2012). Instrumentele technieken. Chromatografie. De Hogeschool

West-Vlaanderen, Brugge, 104p. [33] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G.,

SCHOENMAKERS, P., TIJSSEN, R., VONK, N. (Eds.) (1997). Chromatografie in de

praktijk. Gaschromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig. (ISBN 90-

71694-35-6)

[34] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G.,


praktijk. Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig.

(ISBN 90-71694-35-6)

[35] LIPSCHITZ, C., BAARS, B., VAN DEN BERG, J., JANSSEN, H.G.,


praktijk. Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, losbladig.

(ISBN 90-71694-35-6)

[36] GATES, P. (2009). Quadruple & Triple Quadrupole (QQQ) Mass Analysis [on line].

University of Bristol.

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html [datum van opzoeking:

24/04/2014].

[37] POZO, O.J., DEVENTER, K., VAN EENOO, P., DELBEKE, F.T. (2008). Efficient

Approach for the Comprehensive Detection of Unknown Anabolic Steroids and

Metabolites in Human Urine by Liquid Chromatography-Electrospray-Tandem Mass

Spectrometry. Analytical chemistry, 80(5), 1709-1720.

[38] GATES, P. (2004). Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) [on line]. University of

Bristol.

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tandem-ms.html [datum van opzoeking:

24/04/2014].

[39] LOOTENS, L., VAN EENOO, P., MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G.,

DELBEKE, F.T. (2009). The uPA (+/+)-SCID Mouse with Humanized Liver as a



80

Model for in Vivo Metabolism of 4-Androstene-3,17-dione. Drug Metabolism and

Disposition, 37(12), 2367-2374.

[40] MEULEMAN, P., LEROUX-ROELS, G. (2008). The human liver-uPA-SCID mouse:

A model for the evaluation of antiviral compounds against HBV and HCV. Antiviral

research, 80(3), 231-238.

[41] MEULEMAN, P., LIBBRECHT, L., DE VOS, R., DE HEMPTINNE, B., GEVAERT,

K., VANDEKERCKHOVE, J., ROSKAMS, T., LEROUX-ROELS, G. (2005).

Morphological and Biochemical Characterization of a Human Liver in a uPA‐SCID

Mouse Chimera. Hepatology, 41(4), 847-856.

[42] BD Biosciences (2012). NADPH Regenerating System Solution A & B. BD Gentest,

Woburn, 2p.

[43] COTTYN, A., VAN OOSTVELDT, K. (2013). In vivo en in vitro technieken.

Proefdierkunde en weefselkweek. De Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge, 86p.

[44] FRAGKAKI, A.G., ANGELIS, Y.S., TSANTILI-KAKOULIDOU, A., KOUPPARIS,

M., GEORGAKOPOULOS, C. (2009). Statistical analysis of fragmentation patterns of

electron ionization mass spectra of enolized-trimethylsilylated anabolic androgenic

steroids. International Journal of Mass Spectrometry, 285(1), 58-69.

[45] GEYER, H., PARR, M.K., KOEHLER, K., MARECK, U., SCHÄNZER, W.,

THEVIS, M. (2008). Nutritional supplements cross‐contaminated and faked with

doping substances. Journal of mass spectrometry, 43(7), 892-902.

Voor akkoord verklaring - ScriptieBank...UGT Uridine difosfoglucuronosyl transferase uPA...

Documents

Transcript of Voor akkoord verklaring - ScriptieBank...UGT Uridine difosfoglucuronosyl transferase uPA...