République Algérienne Démocratique et PopulaireMinistère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN

FACULTE DES SCIENCESDEPARTEMENT DE CHIMIE

MémoirePour l’obtention du Diplôme de

MAGISTER

Option : chimie organique

Contribution à l’étude phytochimique de la plante Tetraclinisarticulata

Activité biologique et biochimique de la plante

Présenté par

Mme NAAS née ZERROUKI NAWEL

Soutenue le : 15 / avril / 2009

Devant la commission d’examen :

Mme A. DJAFRI Professeur Université d’Oran Es-sénia PrésidentMr O. YEBDRI Professeur Université d’Oran Es-sénia Examinateur

Mr A. MAROUF Professeur Université d’Oran Es-sénia ExaminateurMme A. DERDOUR Professeur Université d’Oran Es-sénia RapporteurMr B. MERAH Professeur Université d’Oran Es-sénia Co-rappoteur

Année Universitaire 2008-2009

1

Table des matières Introduction.................................................................……10 Chapitre I : Généralités sur la plante rappels bibliographiques I-Description botanique de la plante Tetraclinis articulata……13

1- Place de Tetraclinis articulata dans la systématique .…………….13 2- Description de la famille des Cupressacées……………………........13 3- Principale espèces du genre……………………………………………………..13 4- Description botanique de Tetraclinis articulata…………………………13 5- Nom vernaculaire………………………………………………………………………14 6- Synonyme………………………………………………………………………………….14 7- Répartition géographique et habitat………………..………………………15 8-

II-Etude chimique……………………………………………………………………………16 I-Présentation de quelques métabolites secondaires………..16 1- Les polyphénols……………………………………………………………………16 1-1 Les coumarines…………………………………………………………………..16

1-1-a Définition………….……………………………………………………………16 1-1-b Structure chimique………………………………………………………16 1-1-c Propriétés……………………………………………………………………….17 1-2 les flavonoïdes……………………………………………………………………17

1-2-a Définition……………………………………………………………………….17 1-2-b Structure chimique………………………………………………………18

Ø Les flavones………………………………………………………………18 Ø Les flavonols………………………………………………………………18 Ø Les flavanones. …………………………………………………………18 Ø Les isoflavones………………………………………………………….18 Ø Les chalcones et les aurones…………………………………….18 Ø Les hétérosides flavoniques………………………………………18

1-2-c Propriétés………………………………………………….……………………20 1-3 Les Anthocyanes……………………………………………………………………20

1-3-a Définition……………………………………………………………………….20 1-3-b Structure………………………………………………………………………..20 1-4 Les quinones………………………………………………………………………21 1-4-aDéfinition………………………………………………………………………..21 1-4-b Structure……………………………………………………………………….21 1-4-c Propriétés……………………………………………………………………….22 1-5 Les tanins……………………………………………………………………………..22 1-5-a Définition………………………………………………………………………22 1-5-b Structure chimique……………………………………………………..22

Ø Tanins hydrolysables……………………………………………..23 Ø Tanins condensés ou proanthocyanidoles………………24

1-5-c Propriétés……………………………………………………………………...25 1-6 Acides phénoliques……………………………………………………………….25

1-6-a Définition……………………………………………………………………….25 1-6-b structure chimique……………………………………………………….25

Ø Composés en C6C1………………………………………………….25 Ø Composés en C6C3 ………………………………………………….26

2

2- Les saponines…………………………………………………………….26 2-1 Définition………………………………………………………………………….26 2-2 Constitution chimique et structure…………………………………26

Ø Les génines …………………………………………………………….26 Ø Les oses …………………………………………………………………26 Ø Autres constituants ……………………………………………….27

2-2-1 Saponosides à génines tritérpéniques……………………28 2-2-2 Saponosides à génines stéroïdiques …………………….29 2-2-3 Saponines à génines stéroïdiques alcaloïdes………29 3- Les Alcaloïdes……………………………………………………29

3-1 Définition…………………………………………………………………………..30 3-2 Structure…………………………………………………………………………..30 3-3 Propriétés…………………………………………………………………………30 4- Les huiles essentielles (HE)………………………………30 4-1 Définition…………………………………………………………………………..30 4-2 Production et extraction des huiles essentielles……………31 4-2-1 Extraction par distillation…………………………………………..31

Ø Hydrodistillation…………………………………………………………31 Ø Entraînement à la vapeur ………………………………………..31 Ø Extraction aux solvants organiques…………………………32 Ø Extraction aux solvants volatils……………………………….32 Ø Extraction au gaz carbonique supercritique……………32

4-2-2 L’Enfleurage …………………………………………………………….32 4-2-3 L’expression……………………………………………………………..33 4-2-4 L’incision …………………………………………………………………..33

4-3 Répartition, localisation, formation………………………………..33 4-4 Conservation des huiles essentielles …………………………….33 4-5 Rendement de l’extraction des H.E ……………………………..33 4-6 Propriétés physico-chimiques………………………………………..34 4-7 Composition chimique…………………………………………………….34

4-7-1 Composés d’origine variée…………………………………..34 4-7-2 Composés aromatiques……………………………………….34 4-7-3 Les terpènes ou terpénoïdes ………………………………36

A-Classification…………………………………………………………..36 B- Règle isoprènique………………………………………………….36 C- Constitution terpéniques des huiles essentielle…….37 1-Les monoterpénes ……………………………………….37

1-1 Les hydrocarbures ……………………………………37 1-2 Les alcools……………………………………………………37 1-3 les dérivés carbonylés………………………………..37 1-4 les esters acycliques et monocycliques………37 1-5 Les Dérivés phénoliques et autres…………….37

2-Les sesquiterpènes ……………………………………..38 4-8 Variabilité………………………………………………………………………..39

4-8-1 Facteurs dus à l’origine géographique de la plante…….39 4-8-2 Facteurs écologiques ………………………………………………….39 4-8-3 Facteurs d’origine botanique………………………………………. 40

4-8-4 Facteurs dus à la conservation du matériel végétal……40 4-8-5 Facteurs technologiques……………………………………………...40 III-Etude chimique de la plante Tetraclinis articulata………..40

3

IV- Etude biologique……………………………………………………………………..43 1-Propriétés biologique et pharmacologique des Coumarines……..43 2-Propriétés biologique et pharmacologique des flavonoïdes……….43 3-Propriétés biologique et pharmacologique des anthocyanes......44 4-Propriétés biologique et pharmacologique des quinones…………..44 5-Propriétés biologique et pharmacologique des tanins………………..44 6-Propriétés biologique et pharmacologique des saponines………….45 7-Propriétés biologique et pharmacologique des alcaloïdes………….45 8-Propriétés biologique et pharmacologique des Huiles essentielles……..…………………………………………………………………………45 V- Travaux antérieurs et utilisations médicinales traditionnelles……………………………………………………………………………46 VI- Étude biologique de Tetraclinis articulata………………………….47 Chapitre II : Matériel et méthodes I-Tests phytochimiques préliminaires……………………………………….50

1- Matériel végétal utilisé…………………………………………………………50 2- Tests phytochimiques préliminaires …………………………………50

3- Préparation de la poudre végétale …………………………………….50 4- Préparation des échantillons………………………………………………..50 5- Réactions utilisées ……………………………………………………………….50

5.1 Recherche des polyphénols………………………………………….50 A- COUMARINE ………………………………………………………………..50 B- FLAVONOIDE………………………………………………………………..51 C-ANTHOCYANES …………………………………………………………….52 D- QUINONES ………………………………………………………………….52

Ø Quinones libres…………………………………………………………52 Ø Quinones combinées ………………………………………………52

E- LES TANINS ………………………………………………………………..52 F-ACIDES PHENOLIQUES LIBRES…………………………………….53

5.2 Recherche des saponines …………………………………………….53 5.3 Recherche des alcaloïdes …………………………………………….54 5.4 Recherche des glycosides cardiotoniques……………………56 5.5 Recherche des dérivés anthracéniques ………………………58 5.6 Recherche des sesquiterpène lactones ……………………….58

II-Fractionnement et isolement des composés……………………….59

1- Extraction au SOXHLET………………………………………………………….59 2- Schéma de l’extraction …………………………………………………………60 3- Séparation par CCM analytique …………………. ………………………61

4_séparation par chromatographie sur colonne ouverte ………61 5-Extraction Wagner et Bladt……………………………………………….61

6-séparation par filtration sous vide …………………………………...64

III- L’huile essentielle…………………………………………………………………67 1- Matériel végétal utilisé………………………………………………………….67 2- Mode d’extraction………………………………………………………………….67

4

3- Caractéristiques organoleptiques………………………………………….67 4- Calcul du rendement d’extraction………………………………………..67 5- Densité……………………………………………………………………………………67 6- Pouvoir rotatoire ………………………………………………………………….68 7- Indice de réfraction………………………………………………………………68 8- Principes et techniques ……………………………………………………….68

IV-Dosages ………………………………………….........................69

11-- DDoossaaggee ddeess ppoollyypphhéénnoollss ttoottaauuxx…………………………………………………………………………………………....6699 22-- DDoossaaggee ddeess ffllaavvoonnooïïddeess ttoottaauuxx…………………………………………………………………………………………....7711 33-- L’activité antioxydante …………………………………………………………..73

3-1 Les antioxydants ……………………………………………………………..73 3-1-a Définition, propriétés et rôle des antioxydants……….73

3-1-b Test de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH par bioautographie……………………………………………………………..74

3-1-c Dosage de l’activité antioxydante…………………………….75 3-1-d Test de l’activité anti-radicalaire du radical stable

DPPH………………………………………………………………………………………………75

Chapitre III : Résultats et Discussion I-Tests phytochimiques préliminaires………………………………77

1- les Polyphénols ……………………………………………………………………….77 A- COUMARINE ……………………………………………………………………….77 B- FLAVONOIDE……………………………………………………………………….77 C-ANTHOCYANES ……………………………………………………………………77 D- QUINONES …………………………………………………………………………77 E- LES TANINS ……………………………………………………………………….77 F-ACIDES PHENOLIQUES LIBRES…………………………………………..78

2- Les Saponines……………………………………………………………………………78 3- Les Alcaloïdes………………………………………………………………………….78 4- Les glycosides cardiotoniques ………………………………………………78 5- Les dérivés anthracéniques ……………………………………………………78 6- Les sesquiterpènes lactones ………………………………………………78 7-

II-Fractionnement et isolement des composés………………..80 1-Séparation par CCM………………………………………………………………………….80 2-Simplification de l’extrait acétate d’éthyle……………………………………….80 3-résultats de l’extraction Wagner et Bladt……………………………………….80 4-CCM préparative ………………………………..……………………………………………80 III- L’huile essentielle…………………………………………………..81

1- Aspect ……………………………………………………………………………………..81 2- Rendement ……………………………………………………………………………….81 3- Solubilité de l’huile essentielle………………………………………………….81 4- Densité, indice de réfraction, pouvoir rotatoire……………………..82 5- Analyse par chromatographie sur couche mince CCM ………….82 6- Analyse par chromatographie en phase gazeuse

CG et CG/MS…………………………………………………………………………….82

5

IV-Dosage……………………………………………………………………..85 1-Teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes……………………………85 2-Tests de l’activité antioxydante ………………………………………………………86 2-1 par la Méthode bioautographique ………………………………………….86 2-2 Dosage de l’activité antioxydante ………………………………………….86

3-1 Test de l’activité anti-radicalaire par la méthode

du DPPH………………………………………………………………………………87

Conclusion………………………………………………………………………89 Références bibliographiques……………………………………………..90 Annexes…………………………………………………………………………96

6

Table des figures et tableaux

Figures Figure 1 : Rameaux et fruits de Tetraclinis articulata Figure 2 : Photo plante entière de Tetraclinis articulata Figure 3 : Quelques structures de coumarines Figure 4 : Squelette de base des flavonoïdes Figure 5 : Principale classes structurales des flavonoïdes Figure 6 : Exemple de structure de tanins hydrolysables Figure 7 : Exemple de structure de tanins condensés Figure 8 : Quelque structure d’acides phénoliques en C6-C1 Figure 9 : Quelque structure d’acides phénoliques en C6-C3 Figure 10 : Principaux monosaccharides rencontrés dans les saponines Figure 11 : Acides organiques couramment rencontrés dans les saponines Figure 12 : Structure des principaux squelettes des génines triterpénique Figure 13 : Principaux types de saponines stéroidiques Figure 14 : Principaux types de sapogénines stéroïdes alcaloïdiques Figure 15 : Structure chimique de quelques alcaloïdes Figure 16 : Quelque exemple de composés aromatiques Figure 17 : Quelque exemple de monoterpènes Figure 18 : Quelque exemple de sesquiterpènes Figure 19 : Structure des composés 1-11 extraite de la plante Tetraclinis articulata Figure 20 : Schéma d’extraction des alcaloïdes en milieu acide Figure 21 : Schéma d’extraction des glycosides cardiotoniques Figure 22 : Schéma de l’extraction des feuilles de Tetraclinis articulata par soxhlet Figure 23 : Schéma d’extraction de WAGNER et BLADT, 1996 Figure 24 : Schéma d’isolement de A et B Figure 25 : Dosage des polyphénols par la méthode du Folin Ciocalteu Figure 26 : Dosage de l’extrait méthanolique par la méthode du Folin Ciocalteu Figure 27 : Méthode de dosage des flavonoïdes Figure 28 : Structure chimique du DPPH Figure 29 : Structures chimiques des composés majoritaires de l’huile essentielle de Tetraclinis articulata Figure 30 : Courbe d'étalonnage des polyphénols totaux Figure 31 : Courbe d'étalonnage des flavonoides Figure 32 : Activité antioxydante de l’extrait méthanolique. Figure 33 : Pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration de l’extrait méthanolique Tableaux Tableau 1 : Exemple d’anthocyanes 3, 5,7 hydroxylés Tableau 2 : Quelques exemples de quinones Tableau 3 : Rendements de l’essence des rameaux de quelques échantillons de Tetraclinis articulata du Maroc Tableau 4 : Composition chimique de l’essence des rameaux de Tetraclinis articulata de l’Oued Cherat E1 Tableau 5 : Principaux composés de l’huile essentielle du bois de Tetraclinis ariculata

7

Tableau 6 : Récapitulatif des résultats des tests phytochimiques Tableau 7 : Rendement des HE obtenues par hydrodistillation. Tableau 8 : Solubilité d’HE de Tetraclinis ariculata dans quelques solvants. Tableau 9 : caractéristiques physique de l’huile essentielle de Tetraclinis articulata. Tableau 10 : Couleurs et facteurs de Rétention Rf des spots des HE de Tetraclinis articulata Tableau 11 : Composition chimique de l’huile essentielle Des feuilles de Tetraclinis articulata de l’extraction pendant 3 heures Tableau 12 : Composition chimique de l’huile essentielle Des feuilles de Tetraclinis articulata de l’extraction pendant 4 heures Tableau 13 : Résultats de l’activité anti-radicalaire par la méthode bioautographique des extraits de Tetraclinis articulata.

Tableau 14 : Concentrations inhibitrices de 50% des radicaux DPPH libres.

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Lexique des abréviations et symboles chimiques

AcOEt : Acétate d’éthyle AcOH : Acide acétique AgNO3 : Nitrate d’argent CC : Chromatographie sur colonne ouverte CCM : Chromatographie sur couche mince CHCl3 : Chloroforme CH2Cl2 : Dichlorométhane Cm : Centimètre d20 : Densité DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil EtOH : Ethanol FeCl3 : Chlorure ferrique g: Gramme GC : Chromatographie en phase gazeuse h: Heure HCl : Acide chlorhydrique HCOOH : Acide formique H2SO4: Acide sulfurique H.E : Huile essentielle Kg : Kilogramme IC50 : Concentration d’antioxydant nécessaire pour piéger 50% du radical libre IR : Infra rouge L: Litre nt

D : Indice de réfraction NaOH : Hydroxyde de sodium NH4OH : Ammoniaque nm : Nanomètres m: Masse MeOH: Méthanol mg: Milligramme min: Minute ml: Millilitre mm: Millimètre MS : Spectrométrie de masse µm: Micromètre µl: Micro litre Rdt: Rendement Rf : Facteur de rétention RP : Phase inverse PEG: Polyéthylène glycol TFA : Acide trifluoroacétique UV : Ultraviolet

9

V: Volume v/m : Volume par masse v/v : Volume par volume. % : Pourcentage αt

D : Pouvoir rotatoire

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Introduction

Les plantes médicinales occupent une place importante dans la santé des populations et rendent d’inestimables services dans quelques cas d’urgence et dans de nombreuses affections chroniques. Ces plantes possèdent bien des vertus thérapeutiques démontrées par l’expérience. Cependant, les possibilités de thérapie par les végétaux, qu’elles soient affirmées ou potentielles, méritent d’être justifiées par l’étude scientifique. Une plante médicinale répond aussi à la définition du médicament. Elle est à la fois un produit fini destiné à la consommation et une matière première pour l’obtention des préparations galéniques ou de substances actives. Pour vérifier ce critère d’activité, on a recourt au dosage des principes actifs quand ils sont connus. Pour les plantes dont la composition chimique n’est pas connue, on doit d’abord identifier ses constituants. Parmi les grandes familles de métabolites secondaires des plantes, douées d’activités pharmacologiques et toxicologiques, on trouve les flavonoïdes, les alcaloïdes, les saponosides, les tanins, les huiles essentielles, etc.….. Dans le cadre de la valorisation du potentiel aromatique et médicinal des plantes algériennes, nous nous sommes intéressés à l’étude d’une plante très utilisée par la pharmacopée traditionnelle, le THUYA « AARAAR ». Dans un premier temps nous avons tenté de mettre en évidence les phytoconstituants des rameaux de Tatraclinis articulata, leur séparation et identification par des méthodes chromatographiques, spectroscopiques et chimiques, puis une évaluation de la quantité des polyphénols et des flavonoïdes, et enfin une étude de l’activité antioxydante.

Notre travail est devisé en trois chapitres :

v Chapitre I : Porte sur la description botanique de la

plante Tetraclinis articulata, l’étude chimique avec la présentation de quelques métabolites secondaires et enfin une étude biologique.

v Chapitre II : mise en évidence des phytoconstituants

Huile essentielle et autres métabolites secondaires, une analyse biochimique et biologique est également effectuée.

v Chapitre III : Porte sur l’interprétation et la

discussion des résultats.

11

v Nous terminerons par une conclusion et les perspectives intéressantes à ce travail.

Enfin en annexe, nous présenterons quelques réactifs qui ont été utilisés pour la mise en évidence des phytoconstituants.

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Chapitre I

Généralités sur la plante Rappels bibliographiques

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I-Description botanique de la plante Tetraclinis articulata

1-Place de Tetraclinis articulata dans la systématique : [1]

Classe Pinopsida Règne Plantae Division Pinophyta Ordre Pinales Famille Cupressaceae Sous famille Callitroide Genre Tetraclinis Espèce articulata Tetraclinis du grec tettara = 4, kliné = lit

2- Description de la famille des Cupressacées : [2]

Famille de 18 genres vivants et 130 espèces ; c’est une famille très ancienne qu’on rencontre surtout dans l’hémisphère Nord. Arbre ou arbuste, il se caractérise par des rameaux longs et courts peu distincts et des feuilles en écusson ou aiguille, décussées ou verticillées. Les appareils reproducteurs des Cupressacées sont monoïques ou dioïques ou les deux. L’appareil reproducteur male est en petits cônes (fleurs) solitaires, le plus souvent terminaux, axillaires, entourés d’une enveloppe d’écailles communes. L’appareil reproducteur femelle est en cônes très réduits, habituellement terminaux, ayant la structure fondamentale des autres conifères, mais très diverse dans les détails.

3- Principale espèces du genre :

Son nom commun thuya (thuja) vient du grec thuia qui désigne déjà le genre et vient de thuos mot qui fait référence au bois qui brûle en dégagent une odeur (encens). Autrefois son véritable nom était Biota qui vient du grec Bios qui signifie vie, d’où son nom « arbre de vie ». Ce genre comprend 6 espèces: T. articulata, T. koraiensis, T. occidentalis, T. orientalis, T. standishii et T. plicato. 4- Description botanique de Tetraclinis articulata : [3] Arbre s’élevant rarement à plus de 15 m; branches érigées, rameaux et ramilles verts, dichotomes, aplatis articulés. Feuilles persistantes, linéaires et verticillées chez les jeunes sujets, puis opposées mais paraissant verticillées par 4, en forme de petites écailles coriaces, à portion inférieure longuement unie à la pousse, et pointe libre. Fleurs au printemps, unisexuées, monoïques, en cônes solitaires terminaux; chaque cône male (6 mm de long), comporte 12 à 15 étamines, chaque cône femelle comporte 4 écailles ovulifères ovales (4 mm de long) après fécondation, ce dernier ne mûrit et donne ses grains qu’à la fin de l’année suivante.

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5- Nom vernaculaire : En arabe : « Aaraar », « Ahrar Berhouch ». En français : thuya de Berbérie En latin : Tetraclinis articulata. 6- Synonyme : Thuja ariculata Vahl, Tetraclinis quadrivalvis, Callitris quadrivalvis.

Figure 1 : Rameaux et fruits de Tetraclinis articulata

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Figure 2 : photo plante entière de Tetraclinis articulata

7- Répartition géographique et habitat : La distribution entière est basée au nord de l’Afrique : Algérie (16000 ha), Maroc (725000 ha), Tunisie (30000 ha) et nord-est de la Libye. Ailleurs, on ne trouve qu’une petite station dans la province de Carthagène en Espagne et une autre à Malte. [4] Distribution en Algérie : Dans les collines et basses montagnes, elle est très commune dans le secteur oranais, sous secteur des sahels littoraux, des plaines littorales et le sous secteur de l’atlas tellien. Assez commune dans le sous secteur des hauts plateaux algérois et oranais, très rare dans la grande Kabylie. [5] C’est une plante liée à l’étage thermo-méditerranéen et reste indifférente à la nature des substrats édaphiques. Elle pousse partout (sol calcaire et siliceux) et est peu exigeante du point de vue pluviométrique. Elle constitue l’une des espèces ligneuses les plus stables et les plus précieuses d’Afrique du nord. [6 ,7]

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II-Etude chimique I Présentation de quelques métabolites secondaires Les produits des métabolites secondaires se trouvent dans toutes les plantes, depuis les racines jusqu'aux fruits, ce qui signifie qu'ils n'exercent pas de fonction directe au niveau des activités fondamentales de l'organisme végétal, comme la croissance ou la reproduction. Ce sont des composés organiques qui, à la différence des métabolites primaires, ne sont pas présents de façon permanente chez les plantes. Ils constituent, souvent, les principes actifs des végétaux.

1- Les polyphénols :

Les polyphénols constituent un ensemble de molécules très largement répandues dans le règne végétal, C’est une classe constituée d’environ 6000 composés. [8] Ils regroupent une très large gamme de composés naturels : les coumarines, les flavonoïdes, les dérivés anthocyaniques et les polymères phénoliques connus sous le nom de tanins.

1-1 Les coumarines : 1-1-a Définition :

Le nom coumarine tire son origine de « coumarou », nom vernaculaire de la Fève Tonka (Coumarouna odorata) d’où fut isolée en 1820, la coumarine.

1-1-b Structure chimique :

Les coumarines sont des composés aromatiques dérivant de l’acide O-hydroxy-Z-cinnamique. Connue dans la nomenclature internationale comme 1-benzopyrane-2-one ou 1, 2-benzopyrone. Elles sont très répandues chez de nombreuses Apiacées et Rutacées au niveau des feuilles, racines et écorces. [9]

Les coumarines sont des composés phénoliques ayant un squelette de base

en C6-C3

1

2

3

45

7

6

8coumarine

En dehors de la coumarine elle-même, la plupart d’entre elles sont hydroxylées en position 7, en 6 et 7 ou en 6, 7, 8. Il existe trois types de coumarines naturelles :

• Les hydroxycoumarines. • Les furanocoumarines

17

• Les pyranocoumarines.

O OHO O O

OCH3

O

O OHO

Glu-O

umbelliférone Bergaptène

Esculoside

Figure 3 :Quelques structures de coumarines 1-1-c Propriétés : Les coumarines sont solubles dans les solvants organiques tels que l’éther, les solvants chlorés et les alcools. Leurs formes hétérosidiques sont plus ou moins solubles dans l’eau. Elles ont une absorption caractéristique en UV vue leurs structures aromatiques.

1-2 Les flavonoïdes : 1-2-a Définition :

Leur fonction principale semble être la coloration des plantes (au-delà de la chlorophylle, des caroténoïdes et des bétalaïnes). Le terme flavonoïde (du latin flavus, jaune) rassemble une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols. [10]

Ils sont présents dans toutes les parties supérieures des végétaux : tiges, fleurs, pollen, fruits, graines….et pratiquement absents chez les algues. Ce sont des pigments, largement distribués chez les végétaux, avec plus de 4000 composés à propriétés pharmacologiques.

Les flavonoïdes sont connus principalement pour leur activité antioxydante.

1-2-b Structure chimique : A l’exception des chalcone et des aurones, le squelette carboné de base des flavonoïdes contient 15 carbones arrangés sous forme C6-C3-C6, deux noyaux aromatiques liés entre eux par un hétérocycle oxygéné central (cycle pyranique) de 3 atomes de carbone [11,12]

18

O

7

6

5

3

2

1

6'

5'

4'3'

2'

4

81`

Figure 4: Squelette de base des flavonoides Les différentes classes de flavonoïdes représentent un nombre limité de structures (figure 5), différant par le degré d’insaturation de l’hétérocycle et par le degré et la position des hydroxylations des noyaux benzéniques , la présence de différents substituants (méthoxyle et glycosyle) .

Ø Les flavones : Dans cette famille on peut citer l’apigénine et la lutéoline. Les flavones connus sous le nom d’anthoxanthines sont des pigments jaunes qui se trouvent naturellement à l’état libre ou sous forme de glycosides ou associés à des tanins. [13]

Ø Les flavonols : Dans cette famille, on peut citer la quercétine, la myricétine, et le kaempférol. Ils se différencient des flavones par l’existence d’un hydroxyle en position 3. [14]

Ø Les flavanones: Dans cette famille on peut citer le naringétol et l’ériodictyol. Ils dérivent des flavones et possèdent un carbone asymétrique C2 ils peuvent exister sous la forme de deux isomères optiques.

Ø Les isoflavones : Ce sont des isomères des flavones ; le noyau benzénique latéral est fixé en position 3 et non pas en position 2.

Ø Les chalcones et les aurones Les chalcones sont différentes des structures précédentes par la présence d’un chaînon tricarboné, cétonique alpha - béta insaturé au lieu de l’hétérocycle oxygéné qui relie les deux cycles benzéniques. Pour les aurones, il existe un hétérocycle à cinq chainons au lieu de celui à six chainons. Ø Les hétérosides flavoniques :

Les flavonoïdes existent souvent, dans la nature sous forme héterosidique. Les sucres qui interviennent dans la structure des hétérosides phénoliques sont surtout les aldoses, plus fréquemment le D-glucose. La liaison entre la génine et le sucre (ose) peut se faire par l’un des hydroxyles phénoliques de la génine et surtout l’hydroxyle en 7 des flavones et en 3 des flavonols.

19

O

OH

HO OHO

OH

OH

OO

C

O

OH

OH

HO

O

R

OH

1'

2' 4'

5'

6'3

2

456

7

8

ROH

O

OH

HO

O

R

OH

1'

3'2' 4'

5'

6'3

456

7

8

H

2

C

HO

OH O

ROH

4

56

1

32

5'6'

3'

4'

2'

1'

OHO

OH O OH

Flavone

ChalconeFlavanone

Flavonol

Isoflavone Aurone

3'

Figure 5 : Principale classe structurale des flavonoides

1-2-c Propriétés: Généralement, les hétérosides sont hydrosolubles et solubles dans l’eau et les alcools. Les génines sont solubles dans les solvants organiques apolaires quand ils ont au moins un groupe phénolique libre. [15] Les flavonoïdes lipophiles des tissus superficiels des feuilles sont directement extraits par des solvants moyennement polaires.

20

L’extraction des flavonoïdes s’effectue le plus souvent à chaud et est basée sur leur solubilité dans les alcools (éthanol, méthanol) ou dans l’acétone additionné d’eau (20 à 50 %) selon qu’il s ‘agisse de matériel frais ou sec. Après élimination du solvant, il faut mettre en œuvre une série d’extraction liquide - liquide par des solvants qui ne sont pas miscibles dans l’eau tel que l’éther de pétrole qui élimine les lipides et les chlorophylles, le diéthyl éther qui extrait les génines libres, l’acétate d’éthyle qui entraîne la majorité des hétérosides. Ils restent dans la phase aqueuse les sucres libres. La séparation et la purification des différents flavonoïdes sont fondées sur les techniques chromatographiques (sur polyamide, cellulose, gel de Sephadex, ....). La technique de la phase inverse C8 ou C18 est aussi souvent utilisée avec des solvants du type eau ou acétonitrile ; le mélange Tétrahydrofuranne (THF) - méthanol - acide acétique.[16 ]

1-3 Les Anthocyanes : 1-3-a Définition:

Les anthocyanes du grec antos fleur et kuanos bleu violet, molécules faisant partie de la famille des flavonoïdes, capables d’absorber la lumière visible, colorent les plantes en bleu, rouge, rose ou orange. [17, 18,19]. Les anthocyanes sont habituellement caractéristiques des pétales des fleurs, des fruits et des baies rouges ou bleues. Elles sont généralement localisées dans les vacuoles des cellules épidermiques qui sont de véritables poches remplies d’eau. [20,21]

1-3-b Structure : Les anthocyanes ont une structure de base commune : le cation flavylium ou le 2-phényl-1-benzopyrilim. [20,21] Quelques exemples d’anthocyanes 3, 5, 7 hydroxylés sont donnés dans le tableau suivant :

Tableau 1 : Exemples d’Anthocyanes 3, 5, 7 hydroxylés

+OHO

OHOH

7

6

5

3

2

1

6'

5'

4'3'

2'

4

8

anthocyane 3 4 5 pélargonidine

H

OH

H

cyanidine

OH

OH

H

malvidine

OCH3

OH

OCH3

21

1-4 Les quinones : 1-4-a Définition :

Les quinones sont des composés du benzène dans lequel deux atomes d’hydrogène du noyau sont remplacés par deux atomes d’oxygène. [22] Elles sont très répandues dans les fleurs, les champignons et les algues à l’état libre ou sous forme d’hétérosides. [23]

1-4-b Structure : La benzoquinone ou la quinone est l’un des deux isomères du cyclohexadienedione de formule moléculaire C6H4O2. L’orthobenzoquinone est le dione 1,2, tandis que la parabenzoquinone est le dione 1,4. La quinone est également le nom donné à la classe des composés contenant l’un ou l’autre des isomères de la benzoquinone. Les quinones ne sont pas aromatiques, mais sont des diènes.

O

12

3

45

6

O

O1

2

3

45

6

OParaquinone (1,2) Orthoquinone (1,4)

Les quinones sont classées en benzoquinones, naphtoquinones, anthraquinones, anthracyclinones selon le noyau présent dans la molécule. [23]

Tableau 2 : Quelques exemples de quinones.

O

O

R2

R1

R3

Quinone R1 R2 R3 Plumbagone

OH

H

CH3

Juglone

OH

H

H

Lawsone

H

H

OH

22

1-4-c Propriétés : Les quinones libres sont solubles dans les solvants organiques et insolubles dans l’eau. Leurs hétérosides sont solubles dans l’eau et les solutions hydro alcooliques et absorbent dans le domaine UV. [24]

1-5 Les tanins : 1-5-a Définition :

Les tanins sont des composés phénoliques de poids moléculaires compris entre 500 et 3000. En plus des réactions classiques des phénols, ils ont la propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et de rendre la peau imputrescible en se fixant sur les protéines [25, 26]. Les tanins sont des composés qui ne sont pas présents dans les tissus végétaux à l’état libre ou sous forme de combinaison simple (hétérosides ou esters), mais sous forme de polymères ayant des structures plus ou moins complexes. [27] L’expression tanin groupe sous ce nom un ensemble de corps qui possèdent certaines propriétés communes, mais qui n’ont pas forcement des analogies de structure.

1-5-b Structure chimique :

Il existe deux groupes de tanins différents par leur structure aussi bien que par leur origine biosynthétique : Les tanins hydrolysables sont caractéristiques des dicotylédones, rencontrés notamment chez les Rosidae, dans tous les organes (racine, tige, feuille, fruit avant maturité). Les tanins condensés rencontrés chez l’ensemble de végétaux: des fougères aux plantes à fleurs. [28]

ü Tanins hydrolysables : Les tanins hydrolysables donnent par hydrolyse un ose et un nombre variable de molécules d’acide phénolique, acide gallique ou acide ellagique. [29] Les tanins hydrolysables sont des esters de glucides et d’acides phénols, ou de dérivés d’acides phénols. La molécule glucidique est en général du glucose mais dans certains cas des polysaccharides ont été identifiés. Ces tanins se différencient en tanins galliques (ou gallotanins) qui donnent uniquement de l’acide gallique par hydrolyse et en tanins ellagiques (ou ellagitanins) qui, dans les mêmes conditions, donnent à coté de l’acide gallique, différents dérivés de l’acide gallique, parmi lesquels l’acide ellagique est le plus important. [31]

23

HO

HO

HO

COOH

O

O

HO

HO OH

OH

O

O

Acide gallique Acide ellagique

Les tanins galliques sont constitués d’un noyau central -le glucose- et de chaînes latérales (en position 1, 2, 3, 4, ou 6 du glucose) comprenant 1 à n monomères d’acide gallique. Les tanins ellagiques sont des molécules complexes et rigides, constituées par des liaisons carbone-carbone entre les noyaux benzéniques de l’acide gallique et une molécule de glucose. [32]

OH

HO

HO

HO

HO

OH

HO

HO OH HO OH

OH

O OO O

O

OO

OO

OH

Pédunculagine

Figure 6 : Exemple de structure de tanins hydrolysables

24

ü Tanins condensés ou proanthocyanidoles :

Ce sont des polymères constitués par des unités de flavan-3-ols (catéchol, épicatéchol,…) liées entre elles par des liaisons carbone – carbone le plus souvent 4 → 8 ou 4 → 6. Ils ont un faible degré de polymérisation (<50). Les dimères appelés procyanidoles sont très répandus. [32]

OHO

OH OHO

OH

OHOH

OHOH

OH

OH

A C

B

Figure 7: Exemple de structure de tanins condensés

1- 5-b Propriétés : Les tanins se dissolvent dans l’eau sous forme de solutions colloïdes, mais leur solubilité varie selon le degré de polymérisation. Ils sont solubles dans les alcools et l’acétone. [32] En plus des réactions classiques des phénols c'est-à-dire leur coloration en noir ou en vert, en présence de sels de fer, ils ont la propriété de précipiter les alcaloïdes d’ou leur utilisation en cas d’empoisonnement (sauf pour la cocaïne, la morphine et la nicotine). Ils précipitent aussi la gélatine et rend la peau imputrescible en se fixant sur les protéines. [33,34]

1-6 Acides phénoliques :

1-6-a Définition : Les acides phénoliques sont tous des composés organiques possédant au moins une fonction carboxylique et un hydroxyle phénolique, dérivés de l’acide benzoïque (C6 – C1) ou de l’acide cinnamique (C6 – C3). 1-6-b structure :

• Composés en C6C1 :

Dérives de l’acide benzoïque exemple : acide p-hydroxybenzoique, acide gallique, acide syringique ainsi les acides salicyliques et gentisiques qui possèdent un groupement OH en ortho par rapport à la fonction acide. [35 a,b]

25

COOHHO

HO

HO

H3CO

COOH

H3CO

OH

H

COOH

OH

HO

COOH

Acide syringique Acide gallique

Acide gentisique Acide salicyliqueFigure 8: Quelques structures d'acide phénolique en C6C1

• Composés en C6C3 :

Ce sont des dérivés de l’acide cinnamique. Les composés les plus fréquents sont l'acide p-coumarique, l'acide t-caféique et l'acide t-sinapique.

CH

HO CH

COOHCH

CH

COOH

HO

HOHC

H3CO

HO

H3CO

CH

CHC

HCOOH COOH

Acide cinnamique Acide p-coumarique

Acide caféique Acide sinapique

Figure 9: Quelques structures d'acide phénolique enC6C3

26

2- Les saponines : 2-1 Définition :

Les saponines du latin sapo= savon, appelées aussi saponosides, sont des glycosides stéroïdiques ou triterpéniques, de poids moléculaire élevé. Elles ont la propriété de former des solution moussantes en présence d’eau et de précipiter le cholestérol.[36 a, b]

2-2 Constitution chimique et structure :

ü Les génines : Elles appartiennent à trois types structuraux : les triterpènes en C30, les stéroïdes et les stéroïdes alcaloïdes. Ces aglycones portent généralement un groupe carboxyle en C3 susceptible de former une liaison hémiacétalique avec un ose ou un oside.

ü Les oses : Ce sont principalement des pentopyranoses (D-xylose, D-ribose, L-arabinose) des hexopyranoses (D-glucose, D-galactose) ou des acides uroniques (acide D-glucuronique ou acide D-galacturonique ). Quelques sucres rares entrent aussi dans la composition des saponosides : le 2-amino-2-desoxyglucose, le D-mannose, le D-allose ....etc La partie glucidique peut être mono- ou oligosidique, linéaire ou ramifiée. La majorité des saponines contient une courte chaîne linéaire de 3 à 5 résidus osidiques.

27

OO OHO

HO

OH

OH

HO

HO

OH

OH

HO

HO

OH

HOOC

OHOHOH

OO O

HO

HOOH

OH

HO

OH

HO

HO

OH

H3C

OHOHOH

D-glycopyranose D-galactopyranose Acide D-glucoronique

D-xylopyranose L-arabinopyranose D-fucopyranose

Figure 10: Principaux monosaccharides rencontrés dans les saponines

ü Autres constituants :

Des acides organiques aliphatiques ou cinnamiques estérifiant les groupes hydroxyles libres de la génine ou des sucres peuvent être libérés par hydrolyse alcaline. Parmi ces acides, on trouve les acides:acétique, angélique, anilique, benzoïque, butyrique, p-coumarique, férulique, formique, gallique, ....etc.

COOHHO

HO

OH

H

CH3

CH3

COOH

COOH

CH CH COOH

OH

OCH3

Acide gallique Acide angélique

Acide benzoique Acide férulique

Figure11: Acides organiques couramment rencontrés dans les saponines

28

2-2-1 Saponosides à génines tritérpéniques : Les plus fréquents sont des molécules pentacycliques (oléananes et ursanes). Elles comportent des insaturations, des fonctions carbonylées, et méthylées. [37]

3 5

101

1312

15

18 22

2120

19

28

29

2625

23

HO

30

27

24

A B

C D

HO

29 30

22

2119

HO

2030

29

Type -amyrane(ursanes) Type B-amyrine(oléananes)

Type lupéol (lupane)

Figure 12: structures des principaux squelettes des génines triterpéniques

α

2-2-2 Saponosides à génines stéroïdiques : La plupart des glycosides stéroïdiques sont des dérivés du spirostane due à la nature spiro du C22, possédant un squelette à 27 atomes de carbones et provenant du furostanol. [37]

29

OO

2126

A B

C D

F

E

25

27

23

2220

O

21

26

27

E

DC

BA

20 22

23

24 25

Molécule de spirostane Molécule de dioscine Figure13: principaux types de sapogénines stéroidiqes

2-2-3 Saponines à génines stéroïdiques alcaloïdes :

Ils sont capables d’incorporer un atome d’azote (issu de l’arginine) dans leur chaîne latérale.

N

Solinidane Spiroslane

Figure14: principaux types de sapogénines stéroides alcaloidiques 3-Les Alcaloïdes

3-1 Définition :

Un alcaloïde est une substance organique hétérocyclique azotée, à caractère alcalin et présente une structure complexe. Ce sont pour la plupart des poisons végétaux très actifs, ayant des propriétés thérapeutiques et toxiques. Par exemple, la caféine, la mescaline, la nicotine, l’atropine, la cocaïne. [38] Ils ont longtemps été catégorisés et nommés en fonction du végétal dont ils étaient isolés. Mais, la classification adoptée le plus souvent, est basée soit sur leur activité biologique, soit en fonction de leur structure chimique.

3-2 Structure : On peut diviser les alcaloïdes en plusieurs groupes :

§ groupe des pyridines : pipérine, conicine, guvacine. § groupe des pyrolidines : hygrine, nicotine, cuscohygrine. § groupe des tropanes : tropine, cocaïne, scopolamine.

30

§ groupe des quinolines : quinine, quinidine, dihydroquinine. § groupe des isoquinolines : les alcaloïdes de l’opium (morphine,

codéine, papavérine). § groupe des indoles : tryptamines, ergolines, β-carboline. § groupe des purines : xanthines (caféine, théobromine,

théophylline).

N

CH3

N

CH3

COOCH3

OCOC6H5

N

N N

NH3C

CH3

CH3O

O

Nicotine Cocaine Caféine Figure 15: Structures chimiques de quelques alcaloides

3-3 Propriétés :

Les alcaloïdes sont biosynthétisés à partir d’acides aminés (histidine, tryptophane, tyrosine,...) sauf pour les cas des pseudoalcaloïdes ou les alcaloïdes terpéniques. Les alcaloïdes ont des masses moléculaires variables, mais relativement faibles.[39] Ils sont insolubles dans l’eau et solubles dans les solvants organiques sauf la morphine et la cincochine.[40] Ils jouent un rôle de défense contre les herbivores grâce à leurs goûts amers caractéristiques et leurs toxicités. [41]

4- Les huiles essentielles (HE) :

4-1 Définition :

On appelle huile essentielle le liquide concentré et hydrophobe des composés aromatiques volatils d’une plante. Contrairement à ce que suppose la dénomination, ces extraits ne sont pas forcément huileux.

Elles sont connues sous différentes dénominations : • Essences. • Essences végétales. • Huiles ou essences aromatiques. • Huiles volatiles. • Parfums.

Les botanistes, chimistes, industriels, parfumeurs et pharmacologues ont donnés aux huiles essentielles diverses significations.

31

ü Ce sont des produits généralement odoriférants résultant de l’entraînement à la vapeur d’eau de matériaux végétaux qui peuvent être des fleurs, des fruits, des feuilles, des racines. [42,43,44]

ü Ce sont des produits huileux, volatils et odorants de composition assez complexe qu’on tire des végétaux soit par distillation à la vapeur, soit par expression, soit par incision ou parfois même par séparation à l’aide de la chaleur ou du solvant, soit encore par enfleurage. [44,45,46]

4-2 Production et extraction des huiles essentielles : L’obtention des huiles essentielles se fait, soit par entraînement à la vapeur d’eau dans une opération de distillation, soit par expression et dans ce cas il s’agit d’une essence. La quantité d’HE contenue dans les plantes est toujours faible, parfois très faible, voire infime. Ceci explique le coût élevé des H.E. Il est lié à la rareté et non au procédé d’extraction qui reste le même pour la plupart des plantes. Il existe différents procédés d’extraction mais, pour l’aromathérapie, seuls quelques-uns assurent une bonne qualité finale. 4-2-1 Extraction par distillation : La plupart des huiles essentielles est obtenue par distillation. La distillation est un procédé de séparation de substances, mélangées sous forme liquide. Elle consiste à vaporiser un liquide (eau, solvant organique) qui va entraîner avec lui les substances volatiles. Les vapeurs formées sont condensées par un système de réfrigération par courant d’eau froide. Ø Hydrodistillation :

Le matériel végétal broyé ou pas est placé dans un alambic et immergé directement dans l’eau qui est ensuite portée à l’ébullition. Ø Entraînement à la vapeur :

Le matériel végétal est placé dans un ballon traversé par un courant de vapeur d’eau. Dans les deux cas, les principes volatils peu solubles dans l’eau, sont alors entraînés par la vapeur d’eau du fait de leur point d’ébullition relativement bas et de leur caractère hydrophobe. Après condensation, ils sont séparés par décantation. Ø Extraction aux solvants organiques :

Certaines huile essentielle ont une densité voisine de l’eau ce qui exclut l’utilisation du procédé par distillation à la vapeur d’eau. Pour les extraire on faire macérer la plante dans le solvant à froid afin de faire passer les substances odorantes dans le solvant.

32

Ø Extraction aux solvants volatils : L’extraction se fait à l’aide de solvants organiques volatils (pentane, hexane, éther de pétrole) ou aromatique (benzène, xylène) dans des appareils appelés extracteurs de Soxhlet.

Ø Extraction au gaz carbonique supercritique :

L’originalité de cette technique repose sur le solvant utilisé. A l’état supercritique, le CO2 n’est ni liquide, ni gazeux et cela lui confère un bon pouvoir d’extraction modulable à volonté en jouant sur la température de mise en œuvre. Les fluides supercritiques comme le CO2 sont de bons solvants à l’état supercritique et de mauvais solvant à l’état gazeux. Les avantages de ce procédé sont les suivants :

• le CO2 est inerte chimiquement, naturel, non toxique et bon marché. • on utilise des faibles températures pour la mise en œuvre. • la séparation entre le solvant et l’extrait est facile (simple détente qui

ramène le CO2 à l’état gazeux), quasi-totale et peu coûteuse. L’extraction au CO2 supercritique est une technique intéressante qui apporte de nouvelles notes olfactives, cependant son installation reste coûteuse et l’appareillage est encore encombrant. [48]

4-2-2 L’Enfleurage :

Cette opération est très ancienne. Elle concerne l’extraction des parfums des fleurs par contact avec une matière grasse. Pratiquement, on dépose délicatement et manuellement les pétales de fleurs une à une sur des plaques de verre couvertes d’une mince couche de graisse et l’on superpose ces plaques sur des châssis de bois. Les substances volatiles sont absorbées sur la couche de graisse. Au bout de quelques jours, la graisse utilisée est saturée en essence végétale. On renouvelle périodiquement les fleurs 10 à 15 fois jusqu’à saturation du corps gras, puis on recueille la graisse parfumée. On la fond au bain-marie, on la décante et on la filtre. Après refroidissement, on obtient une pommade florale qu’on épuise à l’alcool. Ce procédé a tendance à disparaître car il nécessite une importante main d’œuvre.

4-2-3 L’expression : Cette technique est spécifique aux fruits, particulièrement les agrumes (Hespéridés : citron, orange). Le mode opératoire consiste à extraire les huiles essentielles en soumettant les fruits à de fortes pressions à chaud ou à froid, à la main ou mécaniquement.

4-2-4 L’incision :

Méthode rarement utilisée, spécifique à l’écorce des arbres.

33

4-3 Répartition, localisation, formation : Les huiles essentielles sont rencontrées dans diverses familles botaniques. Elles se trouvent en quantité appréciable chez environ 2000 espèces réparties en 60 familles.[49] Les H.E se localisent dans toutes les parties vivantes de la plante et se forment dans le cytoplasme de cellules spécialisées.

• Fleurs (pétales de rose). • Ecorces (cannelier) • Graines (anis) • Feuilles (eucalyptus) • Rhizomes (quinquina) • Bois (santal)

En principe, toutes les parties de la plante contiennent des HE, mais elles sont souvent majoritairement dans l’une d’elles. La composition chimique peut varier selon la localisation dans la plante. Par exemple dans l’oranger amer, le zeste donne l’essence de Curaçao et la fleur, l’essence de Néroli. [50] ; dans le citronnier, la fleur et le fruit donnent des essences de composition chimique différente. [51]

4-4 Conservation des huiles essentielles :

Une huile de bonne qualité se conserve parfaitement durant plusieurs années si on l’entrepose de façon correcte. La première précaution à prendre est de systématiquement bien visser le bouchon parce que les H.E sont très volatiles. Le lieu idéal pour entreposer sera frais et sombre afin d’empêcher les huiles essentielles de s’oxyder et de se transformer en résine. Les huiles essentielles ont la faculté de « ronger » le plastique donc il faut garder les flacons debout, afin de protéger le bec bouchon, souvent en matière plastique.

4-5 Rendement de l’extraction des H.E : La teneur des plantes en huile essentielle est faible de l’ordre de 1 à 5 % par rapport à la masse végétale, à l’exception de quelques plantes exemples :

• clou de girofle (14 à 19%) • noix de muscade (8 à 9 %) • cardamone (4 à 10 %).

4-6 Propriétés physico-chimiques :

Les huiles essentielles sont appréciées pour leurs propriétés organoleptiques (odeur, goût, couleur et aspect), d’où leurs usages comme matières aromatisantes et parfumantes. Les propriétés physico-chimiques (densité, indice de réfraction, pouvoir rotatoire, solubilité dans l’alcool, indice d’acide, d’ester….) sont exigées pour leurs évaluations commerciales. [52] Elles sont généralement incolores ou faiblement colorées (jaune pale) ; il existe même des H.E colorées comme l’essence de camomille qui est d’une couleur bleue. Leur indice de réfraction est élevé car les H.E contiennent des molécules asymétriques. Les HE sont solubles dans les solvants organiques

34

tels que l’alcool, l’éther, l’hexane, le benzène, …. et dans les huiles grasses, mais très peu solubles dans l’eau.

4-7 Composition chimique :

La composition chimique des huiles essentielles est très complexe par le nombre élevé de constituants et par leur diversité de structure.

4-7-1 Composés d’origine variée :

On distingue divers hydrocarbures aliphatiques (la chaîne peut être linéaire ou ramifiée) ou cycliques saturés ou pas et qui peuvent porter différentes fonctions.

4-7-2 Composés aromatiques :

Appelés « phényl-propanoïdes » composés en C6-C3 souvent des allyles et propénylphénols. Certaines huiles essentielles contiennent des composés en C6-C1 comme la vanilline. Dans d’autres essences, les acides benzoïques et cinnamiques sont présents. La figure 16 illustre la diversité structurale des composés aromatiques.

35

Figure 16 : Quelques exemples de composés aromatiques

36

4-7-3 Les terpènes ou terpénoïdes : Ils constituent une classe de composés d’origine naturelle présents dans le règne végétal. Ce sont des hydrocarbures de structures très diverses acyclique, cyclique soit mono, bi ou tricyclique.

A- Classification :

Les molécules sont formées par l’assemblage de deux ou plusieurs unités isopréniques. 2-méthyle-1,3 butadiène (C5H8)n , n étant le nombre d’unités isopréniques . [53]

1

2

3

4

Selon la valeur de n on aura plusieurs types de composés :

n Nombre de C Nom 1 C5 hémiterpènes. 2 C10 monoterpènes 3 C15 sesquiterpènes 4 C20 Diterpènes 5 C25 Sesterpènes 6 C30 Triterpènes 8 C40 caroténoides ∞ C>40 polyterpènes

B- Règle isoprénique :

Etablie par O.Wallach, cette règle consiste à couper les composés terpéniques en unités isopréniques. Quelques années plus tard, Robinson a indiqué que ces unités isopréniques se rattachent entre elles par des liaisons tête- queue (1-4). [54]

C4 C3 C2 C1 C1C2C3C4

TêteQueue TêteQueue Selon cette règle la plupart des terpènes peuvent être déconnectés virtuellement en unités isopréniques. [53] comme le montrent les exemples suivants :

37

Ocimène Basilic

Géraniol

CH2OH

Ingold remarque qu’il existe des exceptions à cette règle dans certaines substances ou l’enchaînement était irrégulier liaison type queue-queue ou des liaisons particulières de type artémisyl (4-2), lavandulyl (4-3)…..

C- Constitution terpéniques des huiles essentielles : Les huiles essentielles contiennent principalement des terpènes, surtout des monoterpènes (C10), quelques sesquiterpènes (C15) et rarement des diterpènes (C20 )

1-Les huiles monoterpéniques :présentent des variations structurales : hydrocarbures, alcools, dérivés carbonylés,…..

1.1 Les hydrocarbures : peuvent être

§ Acycliques (myrcène, ocimène, …..) § Monocycliques (p-cymène, α-terpinè,……. ) § Bicycliques ( α-β-pinène, camphène, …….)

1.2 Les alcools : peuvent être aussi

• Acycliques (linalol, géraniol, …..) • Monocycliques (menthol, α-terpinéol,……. ) • Bicycliques ( bornéol, fenchol, ……)

1.3 les dérivés carbonylés :

• Acycliques (néral, citronellal, …..) • Monocycliques (menthone, carvonel,……. ) • Bicycliques ( camphre, fenchone, ……)

1.4 les esters acycliques et monocycliques 1.5 Les Dérivés phénoliques et autres :

Exemples : le thymol, le carvacrol, le cinéol, etc,….

38

OH

OH

CH2OHO

CH2OH

OH

Géraniol Menthol α térpinéol Camphre

Myrcène Citronellol Thymol Camphène

Figure17 : Quelques exemples de monoterpène

2- Les sesquiterpènes :

Comme les monoterpènes, les sesquiterpènes sont aussi de structures très diverses : le plus souvent des hydrocarbures, des alcools et des cétones. La figure 18 montre des exemples de monoterpènes et de sesquiterpènes caractéristiques des huiles essentielles.

39

OH CH2OH

O

O

Trans, trans farnésol β− santalol

α− vétivone β− vétivone

Figure 18: Quelqes exemples de sesquiterpène

4-8 Variabilité : La teneur et la composition chimique d’une huile essentielle varient en fonction d’un grand nombre de paramètres. On se limitera à quelques facteurs influant la quantité et la qualité d’une essence.

4-8-1 Facteurs dus à l’origine géographique de la plante : Les rendements des huiles essentielles ainsi que leur composition diffèrent suivant l’origine géographique de la plante. Ainsi les feuilles et fleurs d’un même type de plante d’Ajowan poussant dans différents pays fournissent une essence dont le rendement d’extraction est de 4.97 % pour l’Algérie, 4.4-8.9 % pour l’Egypte et 0.5 % pour le Pakistan. [55] 4-8-2 Facteurs écologiques : Ils exercent une influence directe sur la production et la quantité de l’essence, car la durée d’exposition au soleil, les températures nocturnes et diurnes, l’humidité, le régime des vents, la pluviométrie, etc,.. sont des paramètres responsables de ces modifications. C’est ainsi que la nature du sol (calcaire, siliceux, …), l’apport d’engrais, le nombre de récoltes par an et l’alimentation en eau affectent la quantité des huiles essentielles et leur rendement.

40

4-8-3 Facteurs d’origine botanique : Le rendement et la composition d’une huile essentielle sont fonction respectivement de la famille et de l’espèce de la plante, ainsi que du site producteur. L’âge de la plante influe également sur la composition de l’huile essentielle, par exemple chez le coriandre la teneur en linalol est de 50% plus élevée chez les fruits murs que chez le fruit vert. [56]

4-8-4 Facteurs dus à la conservation du matériel végétal : Le séchage ainsi que le stockage du matériel végétal entraîne de profondes modifications sur le rendement en huile essentielle.

4-8-5 Facteurs technologiques: Le mode d’extraction d’une huile essentielle (hydrodistillation, distillation par solvant organique..) influe sur la qualité et la quantité de l’essence.

III-Etude chimique de la plante Tetraclinis articulata

Travaux antérieurs :

Tetraclinis articulata a bénéficié de plusieurs études chimiques qui ont porté sur la séparation et l’identification d’une diversité de substances naturelles obtenues à partir de la sciure du bois, des rameaux et des feuilles par hydrodistillation de cette espèce de la région du Maroc

• L’huile essentielle de la sciure du bois (100g) obtenue par hydrodistillation pendant 3h a donné un rendement de 3.75 % de l’espèce de la région de Aoulouz (600 km au sud de Rabat Maroc) et 1.90 % de l’espèce de la région de Khémisset (80 km nord du Rabat Maroc).Vingt cinq produits ont été identifiés dont les principaux composés sont :

Le carvacrol (21.3-36.4 %), oc-cédrène (10.1-13.1 %), et terpinen-4-ol (2.8-6 %).[57]

• Une autre étude chimique des huiles essentielles des

rameaux et du bois de Tetraclinis articulata a été faite. Les huiles essentielles ont été obtenues à partir des extrémités des rameaux d’une part et de la sciure de bois d’autre part. Un (1) kg de matière séchée à l’ombre a été soumis dans chaque cas à l’entraînement à la vapeur d’eau pendant 4 h. Les produits ont été isolés par CPG préparative et identifié par IR et RMN 1H. [58] L’ensemble de ces études est résumé aux tableaux 3 et 4.

41

Tableau 3 : Rendements de l’essence des rameaux de quelques échantillons de Tetraclinis articulata du Maroc.

Echantillon Lieu de récolte Altitude (m)

Rendement

E1 Oued Cherat 5 0.25 E2 Essaouria* 10 0.30 E2 Essaouria** 10 0.45 E3 Oued Mellah 20 0.30 E4 Khorifla 60 0.52 E5 Oued Beht 90 0.54 E6 Mechraa benabou 400 0.63 E7 Beni Mellal* 600 0.63 E7 Beni Mellal** 600 0.80

* : rameaux adultes ** : rameaux jeunes Remarque : Ce tableau montre que le rendement augmente avec l’aridité et l’altitude du milieu et diminue avec l’âge des rameaux. Tableau 4:Composition chimique de l’essence des rameaux de Tetraclinis articulata de l’Oued Cherat E1

composé % α -thuyéne 0.1 α -pinène 1.4 Camphène 0.5 β -pinène 0.4 myrcène 1.2 limonène 8.6

γ -terpinène 0.1 tyuyone Traces Térpinolène 0.5 Linalol 0.6 Fenchol 0.3 camphre 18.6 Citronellal 2.4 Bornéol 10.2

Terpinène-1ol1-4 5.8 α -terpinéol 2.5

Acétate de bornyle 30.5 Acétate α terpinyle 2.4

α cédrène 0.3 β caryophyllène 0.5

γ cadinène 1.5 β bisabolène 0.6

Cuparène 1.5 Cédrol 0.6

Le camphre et l’acétate de bornyle constituent les principaux composés de l’ensemble des échantillons étudiés. Ils représentent environ 50 % de l’huile

42

essentielle. On note aussi la présence, à un degré moindre, de bornéol (5.5-13 %), de limonène (5.5-8.5 %) et de α pinène (1.4-9.7 %). Remarque : On note cependant l’absence de thuyone, composé majoritaire des autres espèces de thuya. [59] L’hydrodistillation du bois de la région d’Oued Cherat a fourni 2 % d’huile essentielle.

Tableau 5 : Principaux composés de l’huile essentielle du bois de Tetraclinis articulata.

Composé %

α –pinène 3.8 β –pinène traces Myrcène traces Limonène 1.5 terpinène-1ol-4 5.4 Carvacrol 28.0 β cédrène 0.8 α cédrène 3.6 p.methoxythymol 22.1 Cuparène 1.9 Cédrol 7.2 thymohydroquinone 16.1

Les produits majoritaires sont le carvacrol (28%), le para méthoxythymol (22.1%) et le thymohydroquinone (16.1%). On note l’absence de thymoquinone.

• Une étude récente [60] sur la production et la qualité des huiles

essentielles des feuilles et des rameaux de Tetraclinis articulata de la région d’Essaouira (Maroc). Le rendement en huiles essentielles varie en fonction de la partie de l’arbre. Le meilleur rendement est obtenu au niveau des rameaux (0.32 %).

La composition chimique des huiles essentielles des échantillons étudiés a été analysée par GC et GC/MS.Trente cinq composés ont été identifiés dans l’huile essentielle des feuilles contre trente trois composés dans les rameaux. L’huile essentielle des feuilles est caractérisée par la prédominance du camphre (31.60%) et l’acétate de bornyle (25.38%), alors que l’α pinène (37.1%) et le limonène (23.31%) ont été identifiés comme composés majoritaires de l’huile essentielle des rameaux. [60]

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IV- Etude biologique

1- Propriétés biologiques et pharmacologiques des Coumarines :

La drogue de l’esculoside qui est une coumarine présente dans l’écorce du marronnier de l’Inde est un hétéroside considéré comme vasculoprotecteur. Traditionnellement, les phytomédicaments à base de tige du marronnier étaient utilisés dans le traitement des troubles circulatoires et dans le traitement des troubles fonctionnels de la fragilité capillaire cutanée. L’Umbelliférone, sous sa forme hétérosidique, est un bactériostatique d’où son utilisation traditionnelle dans le traitement de la brucellose en médecine vétérinaire.

La visnadine, qui est un vasodilatateur coronarien, a été utilisée en prévention de l’angine de poitrine. [61]

Les coumarines ont des propriétés cancérogènes et mutagènes d’où leur toxicité. Certaines d’entre elles comme les furanocoumarines tel que le bergaptène qui est présent dans le Citrus bergamia, sont employées en cosmétologie et en pharmacie comme photosensibiliseurs du bronzage.[62]

2- Propriétés biologique et pharmacologique des flavonoïdes : La principale activité attribuée aux flavonoïdes est une propriété « vitaminique P », ils diminuent la perméabilité des capillaires sanguins et renforcent leur résistance. Les flavones et flavonols sont deux classes de flavonoïdes protecteurs de cellules végétales contre les effets nocifs des radiations ultraviolettes excessives, et contre les rayons γ et l’ozone. Certains flavonoïdes ont des effets antioestrogéniques comme la génistéine ou la biochanine. Consommés à forte dose, ils provoquent l’avortement chez les brebis [63] Ils ont des propriétés anti-inflammatoires. Ils peuvent être antiallergiques, hépathoprotecteurs, anti-spasmodiques, hypocholestérolémiants, diurétiques, anti-bactériens, antiviraux et cytostatiques.[64]

Leur action contre les radicaux libres est expliquée par de nombreuses propriétés mises en évidence in vitro. En général, les flavonoïdes sont des piégeurs de radicaux libres formés dans diverses circonstances. Cette capacité des flavonoïdes à piéger les radicaux libres leur confère ont un effet antioxydant. Les flavonoïdes contribuent à la couleur particulièrement celle des fleurs. C’est par la couleur que la plante exerce un effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs

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3- Propriétés biologiques et pharmacologiques des anthocyanes : Les anthocyanes augmentent la solidité des capillaires et inhibent les enzymes protéolytiques de dégradation. Ils sont utilisés en ophtalmologie en cas de troubles oculaires et pour l’amélioration de la vision crépusculaire. Ils sont peu utilisées dans l’industrie alimentaire et cosmétique du fait de leur instabilité vis-à-vis des facteurs physico-chimiques incontournables (lumière, température et pH), ainsi que leur sensibilité aux sulfites (souvent utilisés comme conservateurs), aux métaux (présents dans les boites de conserves).

4-Propriétés biologique et pharmacologique des quinones : Les quinones sont des composés irritants qui possèdent un effet fréquemment répulsif. C’est le cas de dérivés anthraquinones (emodol) qui ont des propriétés laxatives d’où leur emploi en pharmacie. Certaines ont des propriétés phytotoxiques (la juglone). La shikonine, synthétisé par culture de cellules in vitro, est utilisé comme colorant dans les rouges à lèvre au Japon.

5-Propriétés biologique et pharmacologique des tanins :

La plupart des propriétés biologiques des tanins sont dues à leur pouvoir de se combiner avec les macromolécules, en particulier les protéines. Les tanins exercent un effet antidiarrhéique et antiseptique. Ils favorisent la régénération des tissus en cas de blessures superficielles ou de brûlures. Ils ont la propriété de coaguler les protéines de la salive, ce qui rend les tissus riches en tanins peu consommables par les herbivores. De même la teneur élevée en tanins rencontrée chez les plantes parasitées joue un rôle de défense contre les bactéries et les champignons en précipitant les enzymes extracellulaires sécrétées par les microorganismes. [65] Les procyanidols sont utilisés en pharmacie dans l’insuffisance veineuse. Ce sont des inhibiteurs enzymatiques.[66]

Les tanins sont des corps utilisés en tannerie car ils transforment les peaux animales fraîches en cuirs imputrescibles et peu perméables et de coaguler les protéines du derme (tannage des peaux). On peut en outre les utiliser en cas d’empoisonnement par les alcaloïdes car ils les précipitent et les rendent inoffensifs sauf la cocaïne, la morphine et la nicotine.

6-Propriétés biologique et pharmacologique des saponines

Les saponines ont des activités anti-allergiques, antivirales, hypoglycémiantes, antifongiques et antitumorales. Elles ont aussi une action sur le système cardiovasculaire, le système nerveux central et le système endocrinien [35(a),67]

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7-Propriétés biologique et pharmacologique des alcaloïdes Les alcaloïdes ont une forte activité pharmaceutique qui se manifeste dans plusieurs domaines : [68, 69, 70]

Ø Morphine : antalgique majeur. Ø Quinine : antipaludéen Ø Colchicine : pour combattre l’excès d’acide urique Ø Cocaïne, mescaline : stupéfiant Ø vinblastine : anticancéreux. Ø réserpine : antihypertenseur. 8-Propriétés biologique et pharmacologique des Huiles

Essentielles : Les huiles essentielles sont des antiseptiques pulmonaires, intestinaux, urinaires.... Par exemple les essences d’eucalyptus ont une action antiseptique des voies respiratoires ; l’huile essentielle du thym est employée pour détruire la flore microbienne de la bouche. [71] De nombreuses essences ont un effet analgésique tels que la camomille, le clou de girofle. La verveine et la lavande ont des propriétés antispasmodiques Un effet apéritif chez le persil et le carvi. Le thym et la menthe facilitent la digestion. Les essences de citron, de carvi, de thym et d’origan sont des vermifuges. Le thym et le romarin ont un effet cicatrisant ; tandis que l’ail est connu pour ces vertus hypotensives. L’eucalyptus, l’origan et le géranium ont des vertus antidiabétiques Les vertus antiseptiques et les propriétés aromatisantes des essences entraînent leurs utilisations quotidiennes dans les préparations culinaires (thym, ail, laurier.) Actuellement l’industrie agro-alimentaire utilise des essences dans la préparation surgelés non seulement pour rehausser le goût mais aussi pour empêcher les contaminants alimentaires.[72,73] Par ailleurs, le pouvoir antioxydant de certaines essences permet la conservation des aliments en évitant les moisissures [72]

Elles s’emploient pour leurs propriétés aromatisantes en pharmacie pour masquer l’odeur désagréables des médicaments destinés à la voie orale.

Les propriétés odoriférantes des huiles essentielles leurs confèrent une consommation importante en parfumerie et en cosmétique (extrait de vanille, les concrètes de rose et de jasmin, et les résinoïdes des mousses de chêne.[74]

Les huiles essentielles émises par les plantes sous forme de vapeur ont des fonctions multiples dans la nature. Actuellement, il est souvent difficile de les

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préciser dans tous les cas, mais il semble probable qu’elles ont un rôle écologique. D’autres servent à la défense des plantes contre les prédateurs (herbivores, insectes…). Elles peuvent paralyser les muscles masticateurs des agresseurs par les propriétés toxiques et inappétantes des substances quelles contiennent. Elles protègent les cultures en inhibant la multiplication des bactéries et des champignons, de même qu’elles inhibent la germination et la croissance.

Les vapeurs de l’huile entour la plante maintient une certaine humidité qui va empêcher la température d’augmenter d’une manière excessive pendant le jour et de baisser au cours de la nuit surtout pour les plantes des régions désertiques.

Expérimentalement, il a été établi qu’elles exercent des interactions sur les végétaux et les animaux. Ainsi, elles constituent un moyen de communication appelé langage chimique. [75]

V-Travaux antérieurs et utilisations médicinales traditionnelles : Les feuilles du thuya dégagent une forte odeur balsamique agréable. Elles sont utilisées en compresses chez les enfants dans le traitement des fièvres et en boisson avec du lait contre les fortes diarrhées. [76]

La résine aromatique du Tetraclinis Articulata, de couleur jaune pâle, à saveur amère, est recueillie en pratiquant des incisions sur le tronc. Les gouttes obtenues deviennent vitreuses au contact de l’air. Elle est appelée gomme de sandaraque. Elle entre dans la composition de vernis, pour les peintures à l’huile enluminures et certains siccatifs pour les céruses. La plante est utilisée dans le traitement de l’hypertension artérielle et /ou le diabète. [77] Son bois est utilisé dans l’artisanat, en menuiserie et en ébénisterie

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VI- Étude biologique de Tetraclinis articulata : -Les tiges feuillées de Tertaclinis Articulata sont utilisées pour traiter les maladies infectieuses. L’étude a porté sur un certains nombre de germes impliqués dans ces différentes maladies, il s’agit de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundi, Proteus mirabilis.[78] -L’extrait aqueux du bois de thuya Tetraclinis articulata présentent des effets toxiques sur des larves de moustiques culcidés.l’activité insecticide de cet extrait a été étudiée sur des larves des stades 2 et 4 de Culexpipens (Linné), Aedes caspius (Pallas), Culiseta longiareolata (Aitken) et Anophelesmaculipennis (Meigen).Cet extrait peut être utilisé comme des biocides naturels [79] - La signification de la chemotaxonomie des feuilles recouvert de cire est le nombre d’alcane n-alcane qui sont étudiés pour 112 espèces parmi ces espèces les cupréssaceae. Généralement le n-alcane de cette espèce s’espace entre 18 à 34 carbones. Les cupressaceae ont une composition moyenne de n-alcane caractériser par un pourcentage modéré de C31 518.31%+-2.32)et un C33(5.36%+-1.07).[80] -Dix diterpènes ont été isolé à partir des rameaux et du bois de Tetraclinis articulata. Leurs structures 1-10 ont été établies en utilisant les techniques spectroscopiques ainsi que la RMN 2D. Ces composés sont des inhibiteurs de différents leucocytes humains. Les composés 1-2 sont extraits à partir de l’extrait hexanique. Les composés 4-8 sont extraits à partir de l’extrait acétate d’éthyle. Les composés 3, 9,10 ont été isolés à partir de l’extrait chloroformique du bois Le composé 11 qui est le méthyle 12 β- hydroxysandaracopimarate est aussi isolé à partir de cette plante. La figure 19 montre les structures des composés 1-11 qui ont été utilisés comme inhibiteurs de différents leucocytes humains. [81]

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O

O

OHOH

OH

OH

OH

OH

OH

R

OR

COOMe

O

OMe

OH

OMe

OHOH

COOMe

OH

11: methyl 12 -hydroxysandaracopi-marate

1:8 -Hydroxy-13-epi-pimar-16-ene-6,18-olide

2:13-epi-pimar-16-ene-6 ,8 ,18-triol

3:13-epi-pimara-8,16-diene-6,18-diol

R=CH2OH 4 : 13-epi-Pimar-16-ene-8 , 18-diolR=CH2OAc 5: 8 -Hydroxy-13-epi-pimar- 16- en-18-yl acetateR=CHO 6: 8 -Hydroxy-13-epi-pimar- 16-en-18-al

R=H 7: Methyl 12 - hydroxysandaracopimarateR=Ac 8: Methyl 12 - acetoxysandaracopimarate

9: 6-methoxy-2-[(6-methoxymenttha-1,3,5-trien-3-yl)oxy]-mentha-1,3,5trien-3-ol

10:1 ,3 -Dihydroxytotarol

Figure 19 : structures des composés 1-11 extraits de la plante Tetraclinis articulata

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Chapitre II

Matériels et méthodes

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I-Tests phytochimiques préliminaires 1-Matériel végétal utilisé :

Le matériel végétal utilisé est constitué des feuilles récoltées en juin près de Misserghin.(Oran Algerie).

2- Tests phytochimiques préliminaires :

Ces tests sont généralement réalisés sur une plante de composition inconnue. Ces premiers essais sont nécessaires dans la mesure où ils permettent d’orienter les études chimiques ultérieures par la mise en évidence de certains principes actifs ou non, mais caractéristiques de l’espèce.

3- Préparation de la poudre végétale :

Tous les essais ont porté sur du matériel végétal séché à l’air libre et à l’obscurité, pendant plusieurs jours. Le matériel végétal est ensuite finement broyé à l’aide d’un broyeur à couteaux.

4- Préparation des échantillons

La recherche de composés organiques est réalisée, sur différents extraits préparés à partir des feuilles par des tests chimiques et / ou des examens chromatographiques, par CCM sur gel de silice 60 F254, après révélation par des réactifs spécifiques des substances recherchées et examen des résultats à la lumière visible et/ou UV. Les techniques s’inspirent de celles décrites par Paris et Nothis (1969), Dubois-Lacaille (1983) et Wagner et Bladt (1996) [82].

5-Réactions utilisées :

5-1 Recherche des polyphénols :

A- COUMARINES :

ü Tests :

1. Quelques gouttes d’extrait méthanolique (MeOH) sont additionnées à quelques gouttes de solution de soude (NaOH) concentrée puis examiné sous lumière UV à 365 nm. Une fluorescence bleue oriente vers la présence de coumarines. Le filtrat est évaporé à environ 1ml pour la CCM.

2. Quelques gouttes d’extrait dichlorométhanique (CH2Cl2 ) sont additionnées à quelques gouttes de toluène puis examinées sous UV. On dépose quelques microlitres sur une plaque CCM.

ü CCM : Support : gel de silice 60 F254, pour les systèmes 1 à 3

Systèmes de solvants :

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1-toluène-éther (1 :1), saturé par l’acide acétique (AcOH) à 10 % : 50 ml toluène + 50 ml éther sont agités pendant 5 mn avec 50 ml d’acide acétique dans une ampoule à décanter. La phase supérieure est utilisée.

2-toluène – Acétate d’Ethyle (8 : 1). 3-hexane - Acétate d’Ethyle (8 : 2).

ü Détection : UV-254 : extinction. UV-365 :

Fluorescence Bleue intense ou bleu-vert Coumarines simples Jaune ou brune furano- et pyranocoumarines Réactifs de pulvérisation : 1- KOH 5-10 % dans l’éthanol : Chauffer jusqu’à apparition des couleurs ▬► intensification de la

fluorescence. 2- Réactif de NEU* ▬► intensifie et stabilise la fluorescence

existante. Les acides phénoliques carboxyliques apparaissent fluorescents en bleu ou bleu-vert (ex : acides caféique, chlorogénique, etc.). B- FLAVONOÏDES :

La recherche des flavonoïdes se fait par plusieurs méthodes :

1- Méthode 1 Dans un tube à essai, on ajoute à quelques gouttes d’extrait méthanolique, de la poudre de zinc et une goutte de solution d’acide chlorhydrique (HCl) 5 N. La coloration rouge pourpre prononcée en rouge fraise implique la présence de dihydroflavonols ; la couleur rosâtre ou brunâtre implique la présence de flavanones ou dihydrochalcones ou autres flavonoïdes.

2- Méthode 2 (réaction à la cyanidine ): On ajoute à 3 ml d’une solution méthanolique, 3 ml d’alcool chlorhydrique (alcool éthylique 50° + HCl concentré 2/1 v/v), quelques copeaux de magnésium et quelques gouttes d’alcool isoamylique ; une coloration rouge se développe en présence de flavonoïdes. C-ANTHOCYANES :

La mise en évidence des anthocyanes repose sur l’apparition d’une couleur rouge en milieu acide et bleue violacée en milieu alcalin.

A 2 ml d’extrait méthanolique, on ajoute quelques gouttes de HCl 2N ; il se développe une coloration rose à rouge si la réaction est positive. La coloration est bleue - violacée si on ajoute une solution d’ammoniaque NH4OH à la place de la solution acide.

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D- QUINONES :

v Quinones libres :

La mise en évidence des quinones libres est effectuée directement sur la drogue par la réaction de Bornträger. Extraite par un solvant organique non miscible en milieu acide, les quinones libres donnent une coloration rose en milieu ammoniacal.

2 g de drogue pulvérisée sont humectés par 2 ml de HCL ; 20 ml de CHCl3

sont alors ajoutés. Après quelques heures de contact, le mélange est filtré. Le filtrat est ensuite agité avec 5 ml d’une solution NH4OH diluée a moitié; la phase aqueuse se colore en rouge en présence de quinones extraites par CHCl3.

v Quinones combinées :

Sont caractérisées par la réaction de Bornträger effectuée après hydrolyse. Les génines sont extraites par un solvant organique non miscible en milieu acide.

2 g de drogue pulvérisée et 50 ml de H2SO4 2N sont portés à ébullition sous réfrigérant à reflux pendant 2h. La solution extractive, après filtration, est épuisée par 20 ml de CHCl3.

La phase chloroformique est récupérée et évaporée à sec. Le résidu est repris par quelques gouttes de NH4OH diluée à moitié ; après agitation, une coloration rouge se développe en présence de quinones libérées par l’acide et extraites par CHCl3.

E- LES TANINS :

La présence de tanins hydrolysables (galliques et ellagiques) est mise en évidence par l’apparition d’une couleur bleue - noire après addition d’une solution de FeCl3. La différenciation entre tanins hydrolysables et tanins condensés se fait par addition du réactif de Stiasny* qui précipite sélectivement les tanins condensés.

v 15 ml de décocté aqueux sont additionnés de 7 ml de réactif de Stiasny* (HCHO/HCl 2 :1) et portés 30 mn au bain-marie à température inférieure à l’ébullition ; un précipité orange à rouge se forme en présence de tanins condensés. Après filtration du précipité, le filtrat est saturé d’acétate de sodium, puis additionné de quelques gouttes d’une solution de FeCl3 à 2 % ; une coloration bleue - foncée se développe en présence de tanins hydrolysables.

v quelques gouttes d’une solution de FeCl3 à 5 % dans l’éthanol (solution

préparée extemporanément) sont ajoutées à quelques ml de décocté aqueux à 5 % ; une coloration bleue - noirâtre se développe en

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présence de tanins galliques. La coloration est brune -verte en présence de tanins catéchiques.

F-ACIDES PHENOLIQUES LIBRES :

ü Tests : Dans une plaque CCM on met l’extrait méthanolique avec trois témoins les acides : cinnamique, férulique, sinnapique

ü CCM :

Support : gel de silice 60 F254 Système : benzène- AcOH (9 : 1). La séparation est conduite sous exposition U.V. (365 nm) pour provoquer l’isomérisation des formes trans en cis et éviter ainsi l’apparition de double tache pour chaque composé.

ü Révélation : réactif de Folin-Ciocalteu*. Pulvériser, attendre 1-2 mn et noter les taches. Mettre la plaque dans une cuve contenant un bécher rempli d’une solution d’ammoniaque concentrée jusqu’à ce que le fond jaune se décolore. Noter toute tache apparaissant.

ü Détection : Tâches bleues - noires. Celles formées immédiatement possèdent des groupements para ou ortho dihydrobenzène ; celles formées après fumigation de l’ammoniaque, n’en possèdent pas. Les tâches sont stables à l’obscurité.

5-2 Recherche des saponines : Cinq systèmes de migration des saponines ont été utilisés en vue de choisir le système le mieux adapté à leur séparation. Système S-1: n- BuOH – AcOH – eau (80 :20 :100), phase inférieure.

Système S-2: AcOEt – AcOH – HCOOH – eau (100 :11 :11 :26). Système S-3: CHCl3 – MeOH – AcOH – eau (150 :80 :30 :20). Système S-4: CHCl3 – MeOH – eau (64 :40 :8). Système S-5: CHCl3 – MeOH – eau (65: 35: 10) phase INF. Après migration, les plaques sont révélées par la pulvérisation du réactif (Vanilline –H2SO4), ou par le réactif de Komarowski.

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5-3 Recherche des alcaloïdes :

Après extraction en milieu acide d’une part, en milieu alcalin d’autre part, les alcaloïdes sont mis en évidence par le réactif de Dragendorff*qui donne un précipité rouge à orange.

En solution aqueuse acide, ce sont les sels d’alcaloïdes qui sont solubles et donc extraits, alors qu’en milieu alcalin, ce sont les alcaloïdes à l’état de bases.

ü Extraction en milieu acide :

5 g de drogue séchée et pulvérisée sont additionnés de 25 ml de solution d’acide chlorhydrique HCl diluée au 1/20. Après 24h de macération, avec agitation de temps à autre, le mélange est filtré Quelques gouttes du réactif de Dragendorff sont ajoutées au filtrat ; un précipité rouge orangé indique la présence d’alcaloïdes (formation d’iodobismutate)

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Fig 20 : Schéma d’extraction des alcaloïdes en milieu acide

ü Extraction en milieu alcalin :

5 g de drogue séchée et réduite en poudre fine sont humectés par 5 ml de solution aqueuse d’ammoniaque (NH4OH à 10 % ou par 5 ml d’une solution de carbonate de sodium (Na2CO3), puis additionnés de 25 ml de méthanol sont mis au bain marie pendant 10 mn sous reflux.

Le mélange est alors filtré puis concentré sous pression réduite puis lixivié par l’éther éthylique (une dizaine de fois). Les solutions organiques sont épuisées par l’acide chlorhydrique (une dizaine de fois). Les solutions

24h macération, agitation Mélange filtration

+ Réactif Dragendorff

Précipité rouge orangé présence d’alcaloïdes

5 g drogue

+25ml HCl 1/20

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aqueuses acides sont réunies, alcalinisées par l’ammoniaque et épuisées par l’éther éthylique (10 fois), puis par le dichlorométhane (8 à 10 fois). Les solutions organiques séchées sur sulfate de sodium anhydre et filtrées, sont distillées. Les résidus bruts d’alcaloïdes totaux obtenus par épuisement par l’éther, le dichlorométhane et par le méthanol sont gardés séparément.

L’alcalinisation de la phase aqueuse et son passage aux phases organiques apolaires permet de purifier la solution d’alcaloïdes en éliminant les impuretés tant hydrosolubles (sucres, sels minéraux et organiques) que lipophiles (graisses, terpènes, stérols, résines, chlorophylle).

Les réactions de Dragendorff* sont réalisées sur la phase acide

ü CCM :

Le contrôle de ces extraits est fait sur gel de silice 60 F254 (adapté pour la majorité des alcaloïdes), dans les solvants suivants :

Solvant 1 : toluène – AcOEt – Et2NH (70 :20 :10).

Ce système convient pour les alcaloïdes majoritaires

(quinolizidines, alcaloïdes indoliques, alcaloïdes tropaniques) de

la plupart des drogues.

Solvant 2 : n-BuOH – AcOH glacial - H2O (40 :10 :10).

Ce système convient pour les alcaloïdes indoliques.

Solvant 3 : AcOEt – HCOOH – AcOH glacial - H2O

(100 :11 :11 :26).ce système convient pour les alcaloïdes

tropaniques.

ü Détection :

UV-254 : - extinction prononcée de certains types d’alcaloïdes tels que

les indoles, les quinolines, les isoquinolines et les purines.

- extinction légère pour les alcaloïdes tropaniques.

UV-365 : fluorescence bleue, bleue-verte, violette ou jaune.

Réactif de Dragendorff* : les alcaloïdes apparaissent bruns ou oranges à brunâtres, immédiatement après pulvérisation. La fixation et l’intensification de la coloration peuvent être réalisées par pulvérisation d’une solution de nitrite de sodium à 10% ou d’une solution d’acide sulfurique éthanolique à 10%.

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5-4 Recherche des glycosides cardiotoniques :

ü Tests : 2 à 10 g de poudre végétale sont extraits sous reflux pendant 15 mn avec 30 ml d’éthanol à 50 % +10 ml d’acétate de plomb (II) à 10 %. Après refroidissement et filtration, la solution est extraite par agitation douce avec 3 x 15 ml de dichlorométhane/isopropanol (3 :2). Les phases inférieures combinées sont filtrées à travers du sulfate de sodium Na2SO4 anhydre et évaporées à sec. Le résidu est dissous dans 1ml de mélange de dichlorométhane / isopropanol (3 : 2) et utilisé pour la CCM.

ü CCM : Se fait sur gel de silice 60 F 254 (Merck)

Solvant 1 : AcOEt – MeOH - H2O (100 :13,5 :10).

Solvant 2 : AcOEt – EtOH – MeOH - H2O (81 :11 :4 : 8).

L’adition de l’éthanol augmente les valeurs de Rf des composés fortement polaires.

Solvant 3 : CHCl3 – MeOH - H2O (35 :25 :10).

Phase inférieure

ü Détection :

UV254: légère extinction pour tous les glycosides cardiotoniques. UV 365 : pas de fluorescence. Révélation sous hotte : Pulvérisation des plaques avec 15 à 20 ml de chlorure d’antimoine (III) 20 % dans le chloroforme ou l’éthanol. Chauffage 8 à 10 mn à 110 °C Observation en visible et en UV. A 365 nm. En lumière visible, les glycosides cardiotoniques apparaissent verts, violet ou bruns. En U.V.365, les fluorescences sont variables selon les composés (Wagner et Bladt,1996). Remarque : Ce révélateur révèle aussi certaines saponines. Les di- et triterpènes donnent une coloration rouge à bleu.

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3 g de poudre

+ 30 ml de EtOH à 50%+ 10 ml Acétate Pb (I) à 10% Sous Reflux 15 mn

Mélange:Refroidissement, Filtration

+ 3 fois 15 ml de CH2Cl2 / Isopropanol (3:2)

Phase Supérieure Phase Inférieure

Résidu

Utilisation pour CCM

Filtration sur Na2SO4 anhydre Evaporation à sec

Solution:Agitation douce

+ 1 ml de CH2Cl2 / Isopropanol (3:2)

Fig 21: Schéma d'Extraction de Glycosides Cardiotoniques

5-5 Recherche des dérivés anthracéniques :

ü Tests : 1 g de poudre de drogue est extrait par ébullition au bain-marie pendant 10 mn avec 10 ml de méthanol.

ü CCM : Dépôt de 5 à 20 µl du filtrat sur une plaque de gel de silice 60 F254. Solvant : acétate d’éthyle-méthanol-H2O (100 :13.5 : 10). Ce système convient à tous les dérivés anthracéniques, excepté ceux du Senna (Wagner et Bladt, 1996).

ü Révélation : UV-254 : tout les dérivés anthracéniques présentent une extinction. UV-365 : tous les dérivés anthracéniques présentent une fluorescence jaune ou rouge-brunâtre.

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KOH 5 ou 10 % dans l’éthanol : les anthraquinones apparaissent rouge en visible et fluorescent en rouge sous UV365 nm. NEU* : les anthrones et anthranols donnent une fluorescence jaune intense sous UV 365 nm. Une fluorescence à UV-365 avant et après révélation nous permet de dire que les feuilles sont dépourvues de tout dérivés anthracéniques.

5-6 Recherche des sesquiterpène lactones :

ü Tests : L’extraction est conduite par l’une des deux méthodes : Méthode 1 : 30 ml d’eau bouillante sont ajoutés à 2,5 g de poudre végétale. Après 5 mn, le mélange est filtré à travers un filtre humide puis lavé par 10 ml d’eau. 15 ml de chloroforme sont ensuite ajoutés à l’extrait aqueux. Agitation plusieurs fois. La phase chloroformique est récupérée et séchée. Le résidu est dissous dans 0,5 ml de CHCl3 puis déposé sur plaque de CCM. Méthode 2 : 2.5 g de poudre de drogue sont extraits avec 30 ml de méthanol pendant 15 mn sous reflux. Le filtrat est réduit sous vide à 1-1,5 ml.

ü Enrichissement : L’extrait méthanolique est évaporé à sec puis dissous dans 3 ml d’eau et 10 ml de n-butanol saturé d’eau. Après agitation pendant 3 à 5 mn, la phase butanolique est retirée et évaporée à 1 ml.

ü CCM :

Support : gel de silice 60 F254.

Systèmes de solvants :

Solvant 1 : AcOEt – HCOOH – AcOH - H2O (100 :11 :11 : 26).

Solvant 2 : Toluène – AcOEt (97 :3) → (92 : 8).

Solvant 3 : Acétone – Hexane (4 :1).

Solvant 4 : AcOEt – MeOH - H2O (77 :15 :8).

59

ü Détection :

UV –254 : les composés à doubles liaisons conjuguées présentent une extinction. UV –365 : pas de fluorescence caractéristique Réactif de Zimmermann : Pulvériser la plaque par la solution A puis par la solution B et observer en lumière visible. Les sesquiterpènes apparaissent colorées en violet - grisâtre. (Wagner et Bladt, 1996). II-Fractionnement et isolement des composés.

1- Extraction au SOXHLET : Les extraits de la plante sont réalisés par une extraction solide - liquide. Cette méthode consiste à extraire les constituants d’un solide par simple contact avec un solvant à l’aide d’un extracteur de type Soxhlet.

Presque 1000g de poudre végétale sont déposés dans la cartouche du Soxhlet (utilisation du papier filtre comme cartouche). Le ballon est rempli de 3 litres de solvant organique, puis surmonter par un réfrigérant. Le solvant vaporisé du ballon est condensé puis traverse par percolation le lit de solide pour donner une solution qui s’écoule périodiquement dans le ballon par un siphon. La solution contenue dans le ballon s’enrichit de plus en plus en solutés au fur à mesure que l’extraction progresse.

Aussi l’extraction au Soxhlet est faite par l’utilisation de différents solvants de polarité croissante. L’hexane, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle et enfin le méthanol. On obtient quatre extraits végétaux en fonction du solvant utilisé (hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle et méthanol). Les extraits sont concentrés à l’aide d’un évaporateur rotatif sous pression réduite puis peser.

60

2- schéma de l’extraction

Fig.22: Schéma de l’extraction des feuilles de Tetraclinis articulata par le Soxhlet

1000g de poudre végétale

Extrait hexanique M=82.29g Résidu

Résidu

Extrait dichlorométhani- que M=51.14

Extrait acétate d’éthyle M= 10.25 Résidu

Extrait méthanolique M=110.42

Hexane 3L

Acétate d’éthyle 3L

Méthanol 3L

Dichloro-méthane 3L

61

3- Séparation par CCM analytique : La chromathographie sur couche mince est une méthode qualitative de séparation des constituants d’un produit. La chromatographie sur couche mince CCM met en jeu des phénomènes physico-chimiques, basés sur le pouvoir d’adsorption.[83] La CCM est une méthode permettant de contrôler la pureté d’une substance, de séparer les constituants d’un mélange et éventuellement de les identifier.

Expérience : Les premiers tests sont faits sur les quatres extraits du Soxhlet : extraits méthanolique, dichlorométhaniqe, d’acétate d’éthyle et hexanique dans deux systèmes de façon à pouvoir choisir l’extrait le plus riche en produits et le meilleur système de révélation

Système 1 : AcOEt-AcOH- HCOOH-H2O (100 :11 :11 :26) Système 2 : CHCl3-MeOH-AcOH-H2O (60 :32 :12 :8). Les révélateurs sont : la vanilline et le NEU

4- Séparation par chromatographie sur colonne ouverte :

Expérience : Simplification de l’extrait à l’acétate d’éthyle

Phase stationnaire : gel de Sephadex LH-20 (100g) Phase mobile : Elution par le solvant binaire : CHCl3-MeOH (1 :1) Dimension de la colonne : 56 cm x 3cm. Les fractions obtenues sont analysées par CCM dans le but de:

- réunir des fractions identiques - déterminer le nouveau couple support chromatographique/solvant,

susceptible de séparer les composés et ainsi de suite. Système de migration : CHCl3-MeOH-H2O (64 : 40 :8) Les fractions : 122-138 139-150 plaques CCM phase inverse Rp 18 systèmes 160-164 Acétonitrile – méthanol (50 :50).

5- Extraction de Wagner et Bladt :

Prendre 5g de poudre végétale, ajouter 75ml d’éthanol à 45% mettre sous reflux pendant 1heure filtrer puis évaporer à 20 ml. Dans une ampoule à décanter mélanger le résidu avec 30 ml de CH2Cl2 et 2 ml d’éthanol, agiter pendant 5min

62

La phase supérieure est lavée deux fois avec 20ml de CH2Cl2 puis évaporer à 10 ml puis additionnée de 5g de polyamide pour remplir une colonne en verre (1cm x 15 cm).

Le polyamide a été préalablement lavé avec : 1- EtOH - H2O (50 :50) 2- 50ml EtOH

L’élution se fait en trois étapes : Fraction1 : élution par 300 ml d’éthanol (flavonoïdes) Fraction2 : élution par 100 ml d’éthanol – acétone – eau (80 :16 : 4) (procyanidines dimériques et oligomériques ) Fraction3 : élution par 120 ml d’acétone – eau (7 :3) (procyanidines polymériques) Chaque fraction est évaporée à sec puis dissoute dans 5 ml d’EtOH pour la CCM. Système pour la CCM : AcOEt-AcOH-HCOOH- H2O (100 :11 :11 :26) pour les flavonoïdes. AcOEt-AcOH- H2O (100:20 :30) phase supérieure, pour les procyanidines. Révélation : Détection sous UV à 365 nm et 254 nm, pulvérisation avec le réactif de NEU ou AlCl3 et vanilline –H3PO4.

63

50 g de poudre végétale

75 ml EtOH à 40%

+ 20 ml CH2Cl2 Agiter

Extrait EtOH Filtration Evaporation Ampoule à décanter

+ 30 ml CH2Cl2 + 2 ml EtOH Agiter 5 mn

Phase Inférieure à jeter

Phase Supérieure

Phase Inférieure à jeter Phase Supérieure

+ 20 ml CH2Cl2 Agiter

Phase Inférieure à jeter Phase Supérieure

Evaporation à 10 ml+ 5 g de PolyamideMELANGE: Remplir Colonne

Fraction Mère (F)

Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3

Elution par 300 ml de EtOH

Elution par 100 ml EtOH - Acétone - Eau (80 : 16 : 4)

Elution par 120 ml Acétone - Eau (7 : 3)

Fig. 23 Schéma d'Extraction Wagner et Bladt, 1996.

64

6- Séparation par filtration sous vide :

Utilisation de verre fritté de porosité 4 rempli de silice 60 (0,040–0,063 mm, Merck) ; la masse de la silice est définie selon les dimensions du verre fritté. Après le dépôt de l’échantillon, l’élution se fait par un gradient de solvant.

Expérience : simplification de l’extrait méthanolique 10g d’extrait méthanolique filtré sous vide dans un verre fritté de porosité 4 rempli de 250 g de silice (0.040 - 0.063 mm). L’élution est faite par un gradient de 100 ml de solvant : CHCl3 - AcOEt (0 – 100), AcOEt –MeOH (0-100) jusqu’au MeOH + une goutte AcOH. CCM sur plaques de gel de silice 60 F254 (Merck), les systèmes de migration utilisés sont :

CHCl3-MeOH –H2O (65 :35 :10) phase inférieure CHCl3-MeOH –H2O (64 : 40 :8) révélé par AlCl3

AcOEt – AcOH -HCOOH- H2O (100 :11 :11 :26) révélé par le NEU et la vanilline-H2SO4 Cinq fractions ont été obtenues, la fraction A,B, C, D et E

• La fraction A : Hydrolyse acide du produit A : L’hydrolyse acide a pour but de libérer l’aglycone (ou sapogénine) de la partie glucidique, en rompant les liaisons osidiques, esters ou éthers. Un échantillon (quelque mg) d’extrait brut de saponines est dissous dans 2 ml d’acide trifluoroacétique (TFA) 2 N, dans un tube en verre scellé. Le tube est porté à l’étuve à 120°C pendant 2-3 heures. Après refroidissement et addition d’eau (5ml), l’extraction des sapogénines est réalisée par partage liquide-liquide contre du dichlorométhane (CH2Cl2) (3 x 5 ml) dans une ampoule à décanter.

ü Identification des génines :

La phase organique résultante est ensuite évaporée à sec puis reprise par quelques ml de méthanol, réduite au minimum, elle est déposée sur une plaque de silice 60 F254 dans le système de solvant binaire : toluène-acétone (8 :2), en parallèle à des témoins de génines authentiques : acide oléanolique, hédéragénine (Extrasynthèse-Lyon). La révélation est faite à l’aide du réactif de Komarowsky* suivi d’un chauffage au pistolet thermique.

65

ü Identification des sucres :

La phase aqueuse, contenant les composés polaires dont les glucides, neutralisée par évaporations successives (3 fois) en présence de MeOH, servira à l’analyse des sucres sur une plaque de silice 60 F254 dans le système de solvant : chloroforme-méthanol-eau (64 :40 :8 ). Des témoins de sucres (D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, D-xylose, L-arabinose, acide glucuronique, acide galacturonique, D-fucose) sont également déposés. La révélation est faite à l’aide du réactif au DPAP suivi d’un chauffage.

• La fraction B : Colonne à petite échelle silice greffée Si C18 Phase mobile : MeOH-H2O 100-0 0-100 Systèmes : AcOEt-AcOH-HCOOH- H2O (100 :11 :11 :26) CHCl3-MeOH –AcOH –H2O (60 :32 :12 :8 ) La révélation se fait par le NEU et la vanilline, H2SO4 Les fractions C,D : sont riche en produits mais ils sont de faible quantité d’où la difficulté de faire des analyses pour leurs identification

• La fraction E : est de quantité importante et contient beaucoup de produits mais qu’ils sont proche l’un de l’autre d’où l’utilisation de CCM préparative pour son fractionnement Séparation par CCM préparative :

La chromatographie sur couches minces préparative est une méthode permettant d’obtenir des produits purs. Nous avons utilisés des plaques en verres couvertes de gel de silice 60 F254,

20 x 20 cm, 0,5 mm d’épaisseur (Merck), lavées préalablement au dichlorométhane pur. On dépose l’échantillon sur toute la longueur de la plaque.

Système de migration : Recherche du meilleur système : Système 1 : AcOEt-AcOH- HCOOH-H2O (100 :11 :11 :26) Système 2 : CHCl3-MeOH-H2O (64 : 40 :8 ) Système 3 : CHCl3-MeOH-H2O (65 : 35 :10 ) phase inferieure Système 4 : CHCl3-MeOH-H2O (130: 10 : 20 )

Après le dépôt de l’échantillon et le choix du meilleur système qui est le système 4, on fait l’élution des plaques par le mélange CHCl3-MeOH-H2O (65 : 35 :10) pour les cinq premières plaques. Ensuite, pour les cinq autres plaques, on utilise le mélange AcOEt – MeOH (25 :75) pour éviter le problème des traces d’eau. Trois produits purs sont obtenus. Ils sont analysés par IR et RMN H1 et C13.

66

Fig 24 : Figure d’isolement des produits

10g de poudre végétale

Filtration sous vide Verre fritté n°4 Si60 (0.04-0.063) CHCl3-AcOEt100-0ml AcOEt-MeOH0-100ml MeOH 100%+1gtteAcOH

Fraction A Fraction B

SiC18 MeOH-H2O

Fr1 Fr2

Fraction D Fraction E Fraction C

Fr3

UV, hydrolyse acide

Faible quantité CCM préparative

Faible quantité

67

III- L’huile essentielle.

1- Matériel végétal utilisé : Nous avons travaillé sur les feuilles de la plante fraîche récoltée de la région de Misserghine (ORAN).

2- Mode d’extraction :

L’huile Essentielle du thuya est obtenue par hydrodistillation. On introduit 100 g de plante dans un ballon de 1 litre contenant environ 500 ml d’eau distillée. Le ballon est surmonté d’une colonne reliée à un réfrigérant. Le mélange est porté au reflux pendant 3 heures, puis pendant 4 heures. Les principes volatils sont entraînés par la vapeur d’eau. Les vapeurs chargées d’huile essentielle sont condensées dans le réfrigérant et récupérées dans un erlen. L’Huile Essentielle est ensuite lavée 3 fois par le diéthyle éther. A chaque fois, on récupère la phase inférieure et l’on jette la phase aqueuse. Le lavage s’effectue dans une ampoule à décanter. Puis on sèche sur du sulfate de sodium anhydre pour éliminer toute trace d’eau.

3- Caractéristiques organoleptiques :

Les propriétés organoleptiques des huiles essentielles sont l’aspect, la couleur et l’odeur.

4- Calcul du rendement d’extraction :

Les rendements d’extraction exprimés en pourcentage sont calculés par le rapport de la masse d’huile essentielle extraite sur la masse de la plante.

5- Densité : La densité de l’huile essentielle est déterminée par le rapport entre la masse d’un certain volume de l’essence et la masse du même volume d’eau distillée pris à la même température. La détermination de la densité de l’huile essentielle est réalisée à l’aide d’une seringue d’une capacité de 1ml au lieu du pycnomètre. Le volume prélevé est de 0.20 ml pour l’huile ainsi que pour l’eau distillée. Elle est calculée par la relation suivante :

d20 = m2-m0 /m1-m0 Avec : m1 masse en g de la seringue contenant 0.20 ml d’essence. m0 masse en g de la seringue vide. m2 masse en g de la seringue contenant 0.20 ml d’eau distillée

68

6- Pouvoir rotatoire :

Le pouvoir rotatoire [α]tD est la propriété que possèdent certains corps de

faire tourner le plan de polarisation de la lumière polarisée. Le pouvoir rotatoire spécifique est exprimé par la loi de Biot :

α [α]t

D = L. c

Avec :

α : Valeur de l’angle de déviation de la lumière polarisée lue sur le

polarimètre.

L : Longueur de la cellule exprimée en décimètres (dm).

c : Concentration de la solution à examiner en g/ ml.

On a utilisé un polarimètre avec une lampe de sodium et une cellule de 1 dm de longueur remplie d’une solution éthanolique d’H.E à raison de 0.2g dans 100 ml de solvant.

7- Indice de réfraction :

L’indice de réfraction d’une substance est le rapport entre le sinus de l’angle d’incidence et le sinus de l’angle de réfraction d’un rayon lumineux monochromatique (raie D du sodium) qui traverse la sustance à une température de 20°C. On détermine l’indice de réfraction nD

20 de notre huile essentielle par la lecture directe à l’aide d’un réfractomètre classique.

8- Principes et techniques :

ü La chromatographie :

La chromatographie est une méthode physique de séparation d’espèces chimiques, basée sur la différence d’affinités de ces espèces à l’égard de deux phases : l’une dite stationnaire ou fixe, l’autre dite mobile.

Les différentes techniques chromatographiques : Chromatographie sur couche mince CCM Chromatographie sur colonne (CC), CCM : Système de migration : Toluène - AcOEt (90 :10) Toluène - AcOEt (93 :7) Toluéne (100%) La révélation des tâches est effectuée par :

La lumière UV Une solution de vanilline sulfurique à 2 % Une solution d’aldéhyde anisique

69

ü Les méthodes spectroscopiques : (UV, IR, RMN)

ü Chromatographie en phase gazeuse CPG : La chromatographie en phase gazeuse est la méthode la plus importante dans la séparation, l’identification et le dosage des huiles essentielles. C’est une technique qui peut être réalisée en utilisant des colonnes classiques ou capillaires. L’échantillon à analyser est introduit dans l’injecteur préalablement chauffé ou il est volatilisé et entraîné par un gaz vecteur (N2, H2 , He). Le mélange traverse la colonne à l’intérieur de laquelle s’opère une séparation entre les différents constituants. A la sortie, ils sont décelés et quantifiés par un détecteur. On enregistre un chromatogramme qui résulte d’une succession de pics se caractérisent par leurs temps de rétention et leur surface. Ces paramètres permettent de déterminer l’identité des substances séparées et d’évaluer leur concentration.

Analyse par CPG/MS 1ère analyse : GC/MS

Ø Appareil : PERKINELMER CLARUS 500 Ø Détecteur : MS CLARUS 500. Ø Colonne : ELITE 5MS 60m

Conditions opératoires : Four 90° pendant 5 min

10°/min jusqu`à 100° pendant 10 min 20°/min jusqu’à 150° pendant 10 min 20°/min jusqu`à 180° pendant 5 min

T injecte 250°C et T source 220°C Débit gaz 1.5 ml , Source EI 70ev Analyseur Quadripôle Gaz vecteur : HELIUM

Les constituants de l’huile essentielle ont été identifiés par comparaison de leurs spectres de masse obtenus par ionisation d’électrons (EI+) et de leurs indices de rétention avec ceux des bases de données spectrales de Willey , NIST, NBS, et NSI intégrées à l’appareil.

2ème analyse :

Cette analyse a été réalisée à l’aide d’un chromatographe Ø Appareil : Agilent Ø Détecteur : Agilent 5973N Ø Colonne : Length 25m, Film Thickness 0.22mm

Dans les mêmes conditions

70

IV-Dosages :

- des polyphénols totaux

- des flavonoïdes

- de l’activité antioxydante

11-- DDoossaaggee ddeess ppoollyypphhéénnoollss ttoottaauuxx :: [[8844]]

En milieu alcalin, les polyphénols réduisent l’acide phosphomolybdique du réactif de Folin Ciocalteu (Catalano et al, 1999) [85]

PPoouurr ppoouuvvooiirr ddéétteerrmmiinneerr llaa ccoonncceennttrraattiioonn ddeess ppoollyypphhéénnoollss,, oonn eeffffeeccttuuee uunnee lleeccttuurree ddee llaa ddeennssiittéé ooppttiiqquuee àà 730 nm en se référant à une courbe d’étalonnage dressée à partir d’une série de solutions standard de l’acide gallique.

•• CCoouurrbbee dd’’ééttaalloonnnnaaggee ::

PPrrééppaarraattiioonn ddee llaa ssoolluuttiioonn ggaalllliiqquuee àà ddiifffféérreenntteess ccoonncceennttrraattiioonnss.. AA ppaarrttiirr dd’’uunnee ssoolluuttiioonn mmèèrree ddee 5500 mmgg//ll.. oonn ooppèèrree ppaarr ddiilluuttiioonnss ppoouurr pprrééppaarreerr cciinnqq éécchhaannttiilllloonnss àà 1100,, 2200,, 3300,, 4400 eett 5500 mmgg//ll.. llee ddoossaaggee ddeess ppoollyypphhéénnoollss eesstt rrééaalliisséé ppaarr llaa mméétthhooddee ddee FFoolliinn CCiiooccaalltteeuu ((ffiigg..2255 ))..

100 µl d'Acide Gallique

2 mn

+ 2 ml de Solution de Na2CO3 à 2%

Fig.25 Dosage des Polyphénols par la Méthode de Folin Cocalteu.

+ 100 µl de Réactif de Folin Ciocalteu à 50%

Lecture sur Spectromètre à 720 nm

30 mn à l'obscurité

Dans un tube à essai, mettre:

71

•• TTeenneeuurr eenn ppoollyypphhéénnoollss ddee ll’’eexxttrraaiitt mméétthhaannoolliiqquuee :: DDaannss uunnee ffiioollee ddee 1100 mmll,, oonn mmeett 11gg dd’’eexxttrraaiitt ppuuiiss oonn aajjuussttee jjuussqquu’’aauu ttrraaiitt ddee jjaauuggee.. DDee cceettttee ssoolluuttiioonn oonn pprreenndd 1100 µµll eett oonn ddiilluuee ddaannss 1100 mmll ddee mméétthhaannooll.. OOnn ffiillttrree llaa ssoolluuttiioonn.. LLaa ffiigguurree 2266 pprréésseennttee llaa mméétthhooddee dduu ddoossaaggee ddee ll’’eexxttrraaiitt mméétthhaannoolliiqquuee ppaarr llaa mméétthhooddee dduu FFoolliinn CCiiooccaalltteeuu..

100 µl de cette solution

2 mn

+ 2 ml de Solution de Na2CO3 à 2%

+ 100 µl de Réactif de Folin Ciocalteu à 50%

Lecture sur Spectromètre à 720 nm

30 mn à l'obscurité

Fig 26: Dosage de l'Extrait Méthanolique par la méthode de Folin Ciocalteu

Les teneurs en polyphénols de notre extrait sont déterminées par interpolation à l’aide d’une courbe étalon réalisée par utilisation de solutions ascendantes d’acide gallique.

22-- DDoossaaggee ddeess ffllaavvoonnooïïddeess ttoottaauuxx ::

Ce dosage spectrophotométrique est réalisé selon la méthode décrite par Kim, Jeong et Lee (2003)[86]

La concentration des flavonoïdes est déterminée par la lecture de la densité optique à 510 nm , en se référant à une courbe étalon dressée à partir d’une série de solutions standard de l’acide catéchine ayant les concentrations suivantes :

10 µg/ml, 20 µg/ml, 30 µg/ml, 40 µg/ml et 50 µg/ml.

72

• Courbe d’étalonnage : Préparation d’une solution de catéchine de 100 µg / ml. Ensuite, faire des dilutions 10 µg /ml , 20 µg/ml , 30 µg /ml , 40 µg/ml et 50 µg/ml. Dans des tubes à essais prendre :

500 µl de Solution de Catéchine de chaque dilution + 1500 µl d'eau distillée

t = 5 mn

+ 150 µl de NaNO 2 à 5%

+ 150 µl de AlCl 3 à 10%

Complexe Couleur Jaune

Fig 27: Méthode de dosage des Flavonoïdes

t = 0 mn

t = 11 mn

+ 500 µl de NaOH 1 M

Changement de Couleur Jaune vers le Rose

Mélanger au Vortex

Lecture sur Spectromètre à 510 nm

• TTeenneeuurr eenn ffllaavvoonnooïïddeess ddee ll’’eexxttrraaiitt mméétthhaannoolliiqquuee DDaannss uunnee ffiioollee ddee 1100 mmll mmeettttrree 11gg dd’’eexxttrraaiitt mméétthhaannoolliiqquuee ppuuiiss aajjuusstteerr jjuussqquu’’aauu ttrraaiitt ddee jjaauuggee.. DDee cceettttee ssoolluuttiioonn pprreennddrree 1100 µµll eett llaa ddiilluueerr ddaannss 1100 mmll ddee mméétthhaannooll.. PPrreennddrree 550000 µµll ddee cceettttee ssoolluuttiioonn,, ssuuiivvrree llee mmêêmmee pprroottooccoollee ((rrééppéétteerr ll’’ooppéérraattiioonn ttrrooiiss ffooiiss ppuuiiss pprreennddrree llaa mmooyyeennnnee))

73

3- L’activité antioxydante :

3-1 Les antioxydants :

3-1-a Définition, propriétés et rôle des antioxydants :

Un antioxydant est toute substance qui, lorsqu’elle est présente en faible concentration comparée à celle du substrat oxydable, retarde ou prévient de manière significative l’oxydation de ce substrat L'oxydation fait partie d'une réaction d'oxydoréduction qui transfère des électrons d'une substance vers un agent oxydant. Cette réaction peut produire des radicaux libres qui entraînent des réactions en chaîne destructrices. Les radicaux libres sont des atomes ou groupes d’atomes contenant un ou plusieurs électrons non appariés. Les radicaux libres sont très instables et réagissent rapidement avec d’autres composants, essayant de capturer l’électron nécessaire pour acquérir sa stabilité. Le danger vient des dommages qu’ils peuvent provoquer lorsqu’ils réagissent avec des composants cellulaires importants, tels que l’ADN ou la membrane cellulaire. [87] Les radicaux libres présents dans l’organisme sont produites par divers mécanismes physiologiques. Il a été démontré que l'excès de radicaux libres dans le corps résultant parfois de phénomènes toxiques exagérés peut avoir des conséquences graves sur la santé telles que l’apparition de cancer et le vieillissement prématuré. Pour se défendre de ces excès, l’organisme va devoir se protéger par différents systèmes antioxydants.[88] En effet, Le caractère antioxydant des flavonoïdes contenus dans les fruits, les légumes et le thé contribue à la prévention de certaines pathologies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ce sont des piégeurs efficaces de radicaux libres Le stress oxydatif est un terme général utilisé pour décrire une situation de dommage causé par les radicaux libres. Il a été mis en cause dans la pathogenèse de nombreuses maladies humaines. L'utilisation des antioxydants en pharmacologie est donc beaucoup étudiée pour traiter notamment les accidents vasculaires cérébraux et les maladies neuro dégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Parkinson. [89] Il existe deux types d’antioxydants :

- Les antioxydants naturels : enzymatiques, fabriqués par l’organisme. [89], ou d’origines alimentaires [90]

- Les antioxydants synthétiques : tels que le BHT butylhydroxytoluène , le BHA butylhydroxyanisole, et des esters de l’acide gallique [ 91 ] Les antioxydants sont aussi beaucoup utilisés par l'industrie comme conservateurs pour les aliments, les cosmétiques, ou encore pour éviter le durcissement du caoutchouc ou en métallurgie pour protéger les métaux de l’oxydation . Les antioxydants les plus connus sont le ß-carotène (provitamine A), l'acide ascorbique (vitamine C), le tocophérol (vitamine E) et les polyphénols. Ceux-

74

ci incluent les flavonoïdes (très répandus dans les végétaux), les tanins (dans le cacao, le café, le thé, le raisin, etc.), les anthocyanes (notamment dans les fruits rouges) et les acides phénoliques (dans les céréales, les fruits et les légumes). Plusieurs méthodes ont été développées afin de quantifier ce pouvoir.

3-1-b Test de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH par bioautographie :

Le DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil) est un radical stable qui présente en solution une absorption caractéristique à 517 nm qui lui confère une coloration violette.

N N.

O2N

NO2

O2N

Figure 28: structure chimique du DPPH

Cette couleur disparaît lorsque le DPPH est réduit en diphenylpicrylhydrazine par un capteur de radicaux libres.

Ainsi, en chromatographie sur couche mince (CCM), les composés actifs sont visualisables sous forme de taches jaunes sur fond violet.

Experience:

L’activité antioxydante des extraits a été évaluée sur couche mince par

le DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle) en suivant un protocole adapté de Takao et al. (1994)[92]. Les échantillons ont été déposés sur une plaques Silicagel 60 F254 sur feuille d’aluminium (Merck), et celles-ci développées dans le système d’élution approprié : AcOEt-AcOH-HCOOH-H2O (100:11:11:26) et révélée par une solution méthanolique de DPPH à 0.2%.

Le DPPH est un radical stable qui en le réduisant par des capteurs de radicaux passe du pourpre au jaune et c’est ainsi que sont révélés les composés avec une activité antioxydante.

L’activité antioxydante des extraits est confirmée par révélation avec du β-Carotène.

Les plaques de chromatographie sur couche mince CCM après migration dans les solvants appropriés sont pulvérisées par une solution chloroformique à 0.05% puis observées à UV254nm.

75

La présence d’une activité anti-radicalaire se confirme par l’apparition de spot jaune sur fond blanc.

3-1-c Dosage de l’activité antioxydante :

Pour pouvoir mesurer le pouvoir réducteur de l’extrait méthanolique, on opère comme suit en utilisant la méthode de Yen et Chen, 1995 [93,94] On mélange 1ml d’extrait contenant (0,25 - 0,5 - 0,75 ou 1 mg/l) à 2,5 ml de tampon phosphate (0,2 M, pH 6,6) et 2,5 ml de ferrocyanure de potassium à 1%. Le mélange est incubé à 50 °C pendant 20 minutes. La réaction est arrêtée en ajoutant 2,5 ml d’une solution de TCA (10 %). On centrifuge le tout à 10 000 tr/min pendant 10 min. 2,5 ml du surnageant sont alors mélangés à 2,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml de chlorure ferrique (0.1 %).

L'absorption de la solution résultante est mesurée à 700 nm. Un témoin négatif renfermant de l’eau distillée, au lieu de l’extrait, est traité dans les mêmes conditions. Un témoin positif renfermant du BHT (butylhydroxytoluène) est utilisé dans les mêmes conditions.

3-1-d Test de l’activité anti-radicalaire du radical stable DPPH :[95]

Pour évaluer l’activité anti-radicalaire et antioxydante, nous avons utilisé la méthode du DPPH [96 ].

Dans des tubes secs, on introduit 50 µl de la solution à tester, on ajoute 1950 µl de la solution au DPPH à 6.10-5 M.

Après agitation par un vortex, les tubes sont placés à l’obscurité à la température ambiante pendant 60 min. Pour chaque concentration diluée dix 00fois ; le test est répété 3 fois.

La lecture est effectuée par la mesure de l’absorbance à 517 nm par un spectrophotomètre, le contrôle négatif est composé de 1950 µl de la solution au DPPH à 6.10-5 M et de 50 µl de MeOH.

76

Chapitre III

Résultats et Discussion

77

I-Tests phytochimiques préliminaires Les tests phytochimiques préliminaires effectués sur les feuilles de Tetraclinis articulata ont permis de mettre en évidence les différents groupes phytochimiques présents dans la plante.

1-Polyphénols :

A- COUMARINES :

Sous UV-365 nm : l’extrait méthanolique ne donne pas de fluorescence bleue, par contre une légère fluorescence est observée pour l’extrait dichlorométhanique. Soumis à une chromatographie d’adsorption sur gel de silice, une légère extinction UV à 254 nm et une fluorescence bleue pour l’extrait dichlorométhanique, avant et après révélation avec le KOH dans le système 1 Pour le système 2 et 3 : une fluorescence bleue avant et après révélation pour l’extrait dichlorométhanique à un Rf de 0,11 et une fluorescence jaune après révélation au KOH à un Rf de 0,26.

B- LES FLAVONOÏDES :

- coloration brunâtre d’où l’existence soit de flavanones soit de hydrochalcones ou d’autres flavonoïdes.

- la réaction à la cyanidine ne donne pas de couleur rouge donc pas de flavonoïdes.

C- LES ANTHOCYANES

La réaction de mise en évidence a été négative, aussi bien en milieu acide qu’en milieu alcalin.

D- LES QUINONES

Les réactions de mise en évidence des quinones, libres ou combinées, ont été toutes négatives.

E- LES TANINS L’apparition d’un précipité orange (réaction de Stiasny) indique la présence de tanins condensés. La réaction au chlorure ferrique donne un précipité bleu - noirâtre qui caractérise les tanins galliques.

78

F- LES ACIDES PHENOLIQUES LIBRES :

Pas de tâches formées immédiatement donc pas de groupement p- ou dihydroxybenzène. Par contre après fumigation il existe une tâche mais qui ne correspond pas aux témoins (acide cinnamique et l’acide férulique

2- Les Saponines :

Les CCM, réalisées sur les quatre extraits dans différents systèmes, ont révélé que les feuilles de la plante contiennent des saponines. 3- Les Alcaloïdes :

Résultat négatif en milieu acide et alcalin. 4- Glycosides cardiotoniques :

UV 254 : un quenching et à UV 365 une fluorescence bleue. Le meilleur système est: AcOEt – EtOH – MeOH - eau (81 :11 :4 :8). Pour le système AcOEt – MeOH - eau (100 :13.5 : 10), il y a une traînée au départ. Pour le système CHCl3 – MeOH – eau (35 :25 :10) phase inférieure tous les composés sont montés au front. Après révélation on observe : En lumière visible une couleur brun - orange. En UV365 : existence de différentes fluorescences selon les composés :

- Fluorescence bleu-vert, fluorescence jaune - vert et une fluorescence orange. D’après Wagner et Bladt (1996). Fluorescence bleu-verte, bleu exemple les cardénolides.

- Fluorescence jaune - vert exemple les glycosides de la scille (Scilla ebulbus).

5-Les dérivés anthracéniques :

La présence d’extinction sous UV-254 et de fluorescence rouge brunâtre à UV-365, avant et après révélation, nous permet de dire que les feuilles sont riches en dérivés anthracéniques. 6-Les sesquiterpènes lactones : L’absence de coloration violet-grisâtre caractéristique des sesquiterpènes [97] dans les extraits soumis à la CCM et colorés par le réactif de Zimmermann est en faveur de l’absence de ces composés dans ces extraits obtenus par extraction à l’eau ou au méthanol.

79

Les résultats expérimentaux relatifs aux tests phytochimiques de détection des phytoconstituants de Tetraclinis articulata sont rassemblés dans le tableau 6

TTaabblleeaauu 66 :: rrééccaappiittuullaattiiff ddeess rrééssuullttaattss ddeess tteessttss pphhyyttoocchhiimmiiqquueess ((++ pprréésseennccee,, -- aabbsseennccee))

PPhhyyttooccoonnssttiittuuaannttss MMéétthhooddeess uuttiilliissééeess TTeettrraacclliinniiss AArrttiiccuullaattaa

((ffeeuuiilllleess))

Acides phénoliques CCCCMM ++

AAnntthhooccyyaanneess HHCCll --

NNHH44OOHH --

TTaanniinnss

FFeeCCll33 ++ GGaalllliiqquuee

RRééaaccttiiff SSttiiaassnnyy ++ CCoonnddeennsséé

FFiillttrraatt ++ HHyyddrroollyyssaabbllee

FFllaavvoonnooïïddeess ++

AAllccaallooïïddeess MMiilliieeuu aacciiddee --

MMiilliieeuu aallccaalliinn --

QQuuiinnoonneess LLiibbrreess --

CCoommbbiinnééeess --

CCoouummaarriinneess EExxttrraaiitt mméétthhaannoolliiqquuee --

EExxttrraaiitt ddiicchhlloorroomméétthhaanniiqquuee ++ FFaaiibbllee qquuaannttiittéé

SSaappoonniinneess GGéénniinnee ++

SSuuccrree ++

DDéérriivvééss aanntthhrraaccéénniiqquueess CCCCMM ++

GGllyyccoossiiddeess ccaarrddiioottoonniiqquueess CCM ++

SSeessqquuiittéérrppèènneess llaaccttoonneess CCCCMM --

Les tests préliminaires ont révélé la présence de flavonoïdes, acides phénoliques, glycosides cardiotoniques, saponines, dérivés anthracéniques et les tanins et l’absence d’alcaloïdes, d’anthocyanes, de quinones (libre ou combinées) et de sesquiterpènes lactones.

80

II-Fractionnement et isolement des composés.

1-Séparation par CCM.

CCM analytique :

Le système AcOEt- AcOH- HCOOH-H2O (100 :11 :11 :26) est le meilleur système car il a donné une bonne séparation pour les extraits acétate d’éthyle et méthanolique qui sont les plus riche en produits.

2-Simplification de l’extrait AcOEt :

La plaque CCM phase inverse Rp 18 des trois fractions a révélé des produits fluorescents proches l’un de l’autre 3-Résultat de l’extraction de Wagner et Bladt : Fraction1 : deux produits un bleu et l’autre bleu pale donc des flavonoïdes. Fraction 2: plusieurs produits Fraction3 : un seul produit, c’est un produit pur mais de très faible quantité

4-CCM préparative :

Fraction A :

le produit A n’est pas un produit glycosilé parce qu’il ne contient pas de sucre.

Spectre UV du produit A on a (λ nm) est :300.5 nm

La fraction B : Par colonne sur silice greffe SiC18 donne trois fractions : fr1 jaune, fr2, fr3 bleue qui sont de faible quantité Trois produits purs sont obtenus 1,2 et 3.nous avons essayé de les analysés par IR et RMN H1 et C13 mais ces deux méthodes sont avérer insuffisante pour avoir des structures sans ambiguïté il faudrait RMN de corrélation ce qui est en cours.

81

III-L’HUILE ESSENTIELLE :

1- Aspect : L’extraction de l’huile de Tetraclinis Articulata par hydrodistillation conduit à un liquide huileux de couleur jaune pale , d’odeur et de saveur caractéristique.

2- Rendement : Les rendements des l’HE obtenues par hydrodistillation durant 3 heures et 4 heures sont rapportés dans le tableau 8 Tableau 7 : Rendement des HE obtenues par hydrodistillation.

Durée (heure)

Rendement % Plante Fraiche

3 0,23 4 0,45

Il apparaît à la lumière de ces résultats que le rendement augmente avec le temps, et qu’il est comparable à celui de la littérature

3- Solubilité de l’huile essentielle

Tableau 8 : Solubilité de l’huile essentielle de Tetraclinis ariculata dans quelques solvants. Solvant Solubilité de HE de Tetraclinis articulata Eau -

Cyclohexane +

Dichlorométhane +

Méthanol +

Ethanol +

+ : soluble, - : pas soluble Notre huile est insoluble dans l’eau et est soluble dans le cyclohexane, le dichlorométhane, le méthanol et l’éthanol.

82

4- Densité, indice de réfraction, pouvoir rotatoire :

Les résultats du calcul des caractéristiques physiques de l’huile essentielle de Tetraclinis articulata obtenue par hydrodistillation pendant 4 heures à partir du matériel végétal sec sont regroupés dans le tableau 10. Ces résultats expérimentaux sont comparés à ceux de différentes essences de la même espèce de la région du Maroc. Tableau 9 : caractéristiques physiques de l’huile essentielle de Tetraclinis articulata.

H.E

C. physiques

Tetraclinis

articulata

(feuilles

Région du

Maroc)[58 ]

Tetraclinis

articulata

(Feuilles

ORAN

Algérie)

Tetraclinis

articulata

(bois)[58 ]

Densité

relative d20

- 0.876 0.9755

Pouvoir

rotatoire

+(16°-28°)+_10° +22° +10°

Indice

réfraction

1.4600-1.4765 1.4682 1.4675

5- Analyse par chromatographie sur couche mince CCM :

Tableau 10 : Couleurs et facteurs de Rétention Rf des spots des HE de Tetraclinis articulata

Spots Rf UV 254nm UV 365 nm Vanilline H2SO4

anisaldehyde

1 0.38 Quenching - Rose Orange 2 0.42 - 0.48 Quenching - Orange Brun 3 0.62 - Bleu-violet Bleu Orange 4 0.71 - Bleu-vert Bleu Brun 5 0.85 - bleu bleu rouge

5-Analyse par chromatographie en phase gazeuse CG et CG/MS : Les tableaux 12 et 13 présentent les résultats de l’analyse CG et CG/MS de l’extraction de l’huile essentielle des feuilles de Tetraclinis articulata pendant 3 heures et 4 heures réalisée dans deux appareils dans les mêmes conditions Résultats de l’extraction pendant 3 heures :

83

TTaabblleeaauu 1111 :: CCoommppoossiittiioonn cchhiimmiiqquuee ddee ll’’hhuuiillee eesssseennttiieellllee ddeess ffeeuuiilllleess ddee TTeettrraacclliinniiss aarrttiiccuullaattaa ddee ll’’eexxttrraaccttiioonn ppeennddaanntt 33 hheeuurreess..

ccoommppoossééss %%11eerr aannaallyyssee %%22èèmmee aannaallyyssee αα --ppiinnèènnee 33..66 33..88 ΒΒ--ppiinnèènnee 00..55 00..44 BBoorrnnééooll 1100..44 1100..77 LLiinnaallooll 00..88 00..77 AAccééttaattee ddee bboorrnnyyllee 3300..11 3300..22 αα --tteerrppiinnééooll 22..66 22..55 CCaammpphhoorr 1177..22 1177..44 AAccééttaattee ddee tteerrppiinnyyllee 22..33 -- CCaarryyoopphhyyllèènnee ooxxyyddee 00..55 00..55 TTrraannss ppiinnooccaarrvveeooll 11..44 -- TTrraannss vveerrbbééooll 00..33 -- AAccééttaattee ddee αα --ssaattoollyyll 00..22 -- PPaarraaccyymmèènnee 88--ooll 00..11 -- CCaarrvvééooll 00..11 -- MMyyrrccèènnee 11..55 --

Résultats donnés par l’extraction pendant 4 heures : Tableau 12 : composition chimique de l’huile essentielle Des feuilles de Tetraclinis articulata de l’extraction pendant 4 heures

composés 1er analyse 2ème analyse αα --ppiinnèènnee 33..66 33..88 ββ--ppiinnèènnee 00..55 00..44 BBoorrnnééooll 1100..44 1100..77 LLiinnaallooll 00..88 00..77 AAccééttaattee ddee bboorrnnyyllee 3300..11 3300..22 αα --tteerrppiinnééooll 22..66 22..55 CCaammpphhoorr 1177..22 1177..44 AAccééttaattee ddee tteerrppiinnyyllee 22..33 -- CCaarryyoopphhyyllèènnee ooxxyyddee 00..55 00..55 TTrraannss ppiinnooccaarrvveeooll 11..44 -- TTrraannss vveerrbbéénnooll 00..33 -- AAccééttaattee ddee αα --ssaattoollyyll 00..22 -- PPaarraaccyymmèènnee 88--ooll 00..11 -- CCaarrvvééooll 00..11 -- MMyyrrccèènnee 11..55 -- Υ- cadinène 0.2 - αα --ffaarrnnaaccèènnee 0.1 - ββ--oocciimmmmeennooll 0.3 - thymol 0.1 0.1 limonène 8.4 - Thujol 0.1 -

84

L’examen des tableaux 11 et 12 permet de formuler les remarques suivantes : ü La composition chimique des huiles essentielles de Tetraclinis articula

de l’extraction pendant 4 heures donne d’autres produits qui n’apparaissent pas dans l’extraction pendant 3 heures.

ü Le camphor et l’acétate de bornyle constituent les principaux composés, ils représentent environ 50% de l’huile essentielle. On note aussi à un degré moindre, le bornéol (10.4-10.7%), le limonène (8.4%), l’αα --ppiinnèènnee (3.6-3.8%), α-terpinéol et le myrcène (1.5%)

ü Enfin on note l’absence de thuyone. Structure chimique des composés majoritaires :

OO C

O

CH3

Acétate de bornyle Camphre bornéol

Limonène α -pinène

OH

Figure 29: structures chimiques des composés majoritaires de l'huile essentielle de Tertaclinis articulata

OH

α− terpinéol

85

IV-Dosages : 1-Teneur en polyphénols totaux et flavonoïdes :

Notre objectif est de déterminer la teneur des polyphénols totaux et des flavonoïdes de l’extrait méthanolique

Les figures 30 et 31 représentent les courbes d’étalonnage qui ont été tracées pour cet objectif.

Les teneurs en polyphénols totaux et en flavonoïdes de l’extrait méthanolique de l’espèce Tetraclinis articulata ont été obtenues par extrapolation des valeurs des densités optiques obtenues à 730 nm pour les polyphénols totaux et à 510 nm pour les flavonoïdes, en utilisant les courbes d’étalonnage. Elles sont exprimées en milligrammes d’équivalents d’acide gallique pour les polyphénols totaux et en milligramme d’équivalents de catéchine pour les flavonoïdes par gramme d’extrait méthanolique

Figure 30 : courbe d'étalonnage des polyphénols totaux.

Figure 31 : courbe d'étalonnage des flavonoïdes

courbe d'étalonnage des polyphénols

y = 0,0003x - 0,0152R2 = 0,9831

-0,10

0,10,20,30,4

0 500 1000 1500

concentration mg/ml

DO

DOLinéaire (DO)

courbe d'étallonnage des flavonoides

y = 0,0014x + 0,04R2 = 0,9545

0

0,2

0,4

0,6

0 100 200 300

concentration µg/ml

DO

DOLinéaire (DO)

86

La teneur en polyphénols des feuilles de Tetraclinis articulata calculée est de l’ordre de 65.58 mg/ml pour 1g de poudre sèche. Celle des flavonoïdes est de l’ordre de 39.03 μg/ ml pour 1g de poudre sèche

2-Tests de l’activité antioxydante : 2-1 par la Méthode bioautographique : On remarque une activité anti-radicalaire importante des deux extraits. Tableau 13 : Résultats de l’activité anti-radicalaire par la méthode bioautographique des extraits de Tetraclinis articulata.

Extraits DPPH ΒΒ -carotène

MeOH + +

H2O + +

2-2 Dosage de l’activité antioxydante :

La figure 32 présente Les activités antioxydantes des différentes concentrations de l’extrait méthanolique et celle du BHT inversé en valeurs de densités optiques afin de pouvoir les comparer

0

0,5

1

1,5

2

DO

0,25 0,5 0,75 1

Concentration mg/ml

BHTextrait MeOH

Figure 32 : activité antioxydante de l’extrait méthanolique. De l’histogramme on déduit que l’extrait méthanolique possède une activité antioxydante presque équivalente à celle du BHT pour les faibles concentrations (0.25-0.50 mg/ml), par contre l’activité antioxydante de l’extrait méthanolique est nettement plus importante pour les fortes concentrations 1mg/ml

87

2-3 Test de l’activité anti-radicalaire par la méthode du

DPPH :

Les valeurs des densités optiques obtenues par spectrophotomètre à 510 nm sont converties en valeurs de pourcentage d’inhibition en utilisant la formule suivante : Abs (témoin) – Abs (antioxydant) P.I% = ____________________________ X 100 [ 97 ] Abs (témoin) Soit :

Abs : Absorbance de la longueur d’onde à 510 nm.

Les valeurs obtenues ont permis de tracer la courbe qui présente la variation du pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration de l’extrait méthanolique.

Figure 33 : pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration

de l’extrait MeOH

La valeur d’IC50, déterminée pour extrait méthanolique, est définie comme étant la concentration de substrat qui cause la perte de 50 % de l’activité de DPPH.

La valeur IC50 est calculée par les régressions linéaires où l’abscisse est représentée par la concentration de l’extrait testé et l’ordonnée par l’activité antioxydante en pourcentage. Cette valeur est comparée à celle trouvée pour les composés de référence (BHA, Acide ascorbique, Quercétine).

PI% en fonction [extrait MeOH]

y = 7,052x + 1,7333R2 = 0,9747

0

20

40

60

0 2 4 6

concentration µg/ml

PI

%

PI%

Linéaire (PI%)

88

Tableau 14 : concentrations inhibitrices de 50% des radicaux DPPH.

Extraits I.C50 (µg/ml)

Extrait méthanolique

Quercétine

Acide ascorbique

BHA

7.630

1.495

1.945

2.167

L’extrait méthanolique possède une capacité de réduction du radicale libre, la concentration requise pour la neutralisation et la stabilité de 50% de la concentration du DPPH est de l’ordre de 7µg/ml.

89

Conclusion

Dans ce travail, nous avons étudié une plante médicinale et aromatique

très utilisée dans la pharmacopée traditionnelle Algérienne appelée Tetraclinis

articulata (ARAAR).

Les études phytochimiques montrent que cette plante est riche en

flavonoïdes et en tanins et est dépourvue de toute substance toxique :

sesquiterpènes lactones, quinones et alcaloïdes

L’huile essentielle de cette plante extraite par hydrodistillation est

obtenue avec un rendement comparable à celui des autres plantes qui

appartiennent à la même famille ( 0.45%)

La composition chimique de cette huile révèle qu’elle est conforme à celle

de la littérature. Constitué principalement d’acétate de bornyle, du

camphre, du bornéol, du limonène et de l’alpha-pinène.

Il a également été démontré par l’étude biologique et biochimique que

les extraits de cette plante sont riches en polyphénols et en flavonoïdes

L’étude du pouvoir antioxydant de cette plante par différentes méthodes

révèle que cette plante Tetraclinis ariculata possède un grand pouvoir de

piéger les radicaux libres.

L’ensemble des résultats enregistrés lors de cette étude pourrait

contribuer à valoriser le potentiel de Tetraclinis articulata (Araar) plante

déjà, très largement utilisée dans la médicine traditionnelle.

Par le biais de ce travail, nous espérons avoir apporté notre modeste

contribution à la valorisation de la médicine traditionnelle.

Il serait toutefois intéressant de faire un fractionnement plus pousse pour

élucider du point de vue structurales les composés mis en évidence, une

étude de la toxicité de la plante vue que à forte concentration son pouvoir

antioxydant est très intéressant et d’approfondir les investigations

biologiques in vivo pour fournir un fondement scientifique aux applications

traditionnelles de cette plante (diabète et hypertension )

ce qui permettra d’élargir l’arsenal thérapeutique des médicaments à

base de plantes, à moindre cout

90

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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91

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95

ANNEXE

96

FORMULE DES REACTIFS ü Alcaloïdes (Réactif de Dragendorff):

• Composition du réactif :

Solution acide d’iodobismuthate de potassium

A : 10 ml d’acide acétique glacial.

40 ml d’eau.

0,85 g de nitrate de bismuth basique.

Chauffer et filtrer si nécessaire.

B: 20 ml d’eau.

8 g d’iodure de potassium.

Mélanger 5 ml de solution A et 5 ml de solution B avec 20 ml d’acide

acétique glacial et 100 ml d’eau.

Conserver à l’abri de la lumière .Pulvériser et chauffer jusqu’à

l’apparition des couleurs

ü Saponines

1-Réactif de Vanilline –H2SO4 :

• Composition du réactif :

Solution (I) : Vanilline 1% dans éthanol.

Solution (II) : Acide sulfurique 10% dans éthanol.

97

Pulvériser avec Sol (I) puis par Sol (II), puis chauffer à 110 С° avec

un pistolet thermique pendant 5 à 10 minutes.

2-Réactif de Komarowsky :

• Composition du réactif :

Mélange (5 :1, v/v) de p-hydroxybenzaldéhyde (2 % p/v dans MeOH) et H2SO4 50% dans éthanol. ü Les Sucres (Réactif de DPAP acide

diphénylaminophosphorique) :

• Composition du réactif :

2 g de diphénylamine et 2 g d’aniline sont ajoutés à 10 ml d’acide

ortho-phosphorique 85 % puis complétés à 100 ml de méthanol.

ü Tanins (Réactif de Stiasny) :

• Composition du réactif :

Mélange de formol à 30 % - HCl concentré (2 : 1 V/V).

ü Flavonoïdes (Réactif de NEU) :

• Composition du réactif :

Solution A : 2-aminoéthyle diphényle borinate 1 % dans le méthanol.

Solution B : PEG 4000 (5 %) dans l’éthanol.

Après pulvérisation du réactif (mélange de 10 ml de solution A et

de 8 ml de solution B), on chauffe la plaque à l’aide d’un sèche cheveux.

ü Sesquiterpènes lactones (Réactif de Zimmermann) :

• Composition du réactif :

A : 10 g de dinitrobenzéne + 90 ml de toluène.

B : 6 g de NaOH + 25 ml H2O + 45 ml méthanol.

La plaque est d’abord pulvérisée avec (A) puis avec (B) puis

observée en lumière visible. Les sesquiterpènes apparaissent colorés en

violet–grisâtre.

ü Acides phénoliques libres (Réactif de Folin-Ciocalteu) :

• Composition du réactif :

98

Dans un ballon à fond rond de 1 litre, placer 700 ml d’eau déminéralisée,

100 g de tungstate de sodium, 25 g d’acide phosphomolybdique, 100 ml

d’acide chlorhydrique et 50 ml d’acide orthophosphorique à 85 %. Bouillir

sous reflux pendant 10 h, refroidir puis ajouter 150 g de sulfate de

lithium. Ajouter quelques gouttes de brome liquide jusqu’à ce que le

réactif soit jaune (non vert). Eliminer le brome en excès par ébullition

sous hotte (flacon ouvert). Ajuster le volume à 1 l avec de l’eau

déminéralisée

ü Révélateurs des H.E :

• Une solution de vanilline sulfurique à 2 % : ce révélateur

est préparé en ajoutant, goutte à goutte, 2 ml d’acide sulfurique

concentré dans 100 ml de solution de vanilline à 1 % dans l’alcool à 96

%. Ce réactif doit être utilisé 48 heures après la préparation.

• Une solution d’aldéhyde anisique : l’anisaldéhyde est

obtenue en mélangeant, dans l’ordre, 0,5 ml d’aldéhyde anisique avec

10 ml d’acide acétique glacial, 85 ml de méthanol et 5 ml d’acide

sulfurique.

• Une solution d’acide phosphomolybdique : Dissoudre 20g

d’acide phosphomolybdique dans 100 ml d’éthanol

ü Dosage des polyphénols totaux :

Ø Préparation des réactifs :

- 10 ml du réactif Folin Ciocalteu dilué dans 10 ml d’eau distillée.

- 2 g de carbonate de sodium (Na2CO3) dilué dans 100 ml d’eau distillée

Tableau I: Densités optiques accordées aux différentes concentrations de l’acide gallique.

[]Acide

gallique

(mg/ml)

0

250

500

750

1000

1250

D.O

0 0.0380 0.1185 0.1554 0.2336 0.3232

99

ü Dosage des Flavonoïdes:

Ø Préparation des réactifs :

- Solution de NaNO2 à 5%

5g de nitrate de sodium, dissous dans une fiole de 100ml.

- Solution d’AlCl3 à 10%

10g de chlorure d’aluminium, dissous dans une fiole de 100ml

Tableau II : Densités optiques accordées aux différentes

concentrations de l’acide catéchine.

[]Acide

catéchine

(µg/ml)

0

55.55

111.11

166.66

222.22

277.77

D.O

0 0.1244 0.2357 0.3016 0.3429 0.3974

ü Dosage des antioxydants :

Ø Préparation de la solution tampon phosphate:

Solution tampon :

La solution tampon est une solution permettant de conserver un PH à peu près constant. Le tampon utilisé est le tampon phosphate à PH (5.6-8.0) :

Préparer une solution de di-hydrogénophosphate de potassium à 0,2 M (soit 9.08g de KH2PO4 par litre) et une solution de di-sodium hydrogénophosphate 0,2 M (9.07g de Na2HPO4 par litre)

Préparation du tampon phosphate à PH=6.6 :

PH Na2 HPO4 à 0.2 M KH2 PO4 à 0.2 M

6.6 74.5 ml 125.5 ml

Ø Préparation des réactifs :

Solution de K3Fe (CN)6 à 1% :

1 g de ferricyanure de potassium, dissous dans une fiole de 100 ml.

Solution de FeCl3 à 0.1% :

0.1g de chlorure ferrique, dissous dans une fiole de 100ml.

100

Tableau III: Densités optiques accordées aux différentes

concentrations de l’extrait méthanolique et le BHT.

Concentration (mg/ml) 0.25 0.5 0.75 1

D.O

BHT 0.5763 0.5835 0.6800 0.7032

Extrait

MeOH

0.4168 0.4871 0.7657 1.7309

ü Dosage de l’activité antioxydante par la méthode du DPPH :

Les résultats du pourcentage d’inhibition du radical DPPH par

l’extrait méthanolique est représenté dans le tableau suivant.

Tableau IV : Pourcentage d’inhibition du radical DPPH de

l’extrait méthanolique

Concentration

µg/ml

1 2 3 4 5

D.O

0.526

0.523

0.522

0.504

0.494

0.492

0.463

0.476

0.467

0.427

0.429

0.429

0.356

0.382

0.355

Moyenne 0.524 0.497 0.468 0.428 0.364

PI % 11.85 16.44 21.17 27.98 38.74

101